JP2014057545A - リガーゼ及びそれを用いたペプチドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】酸性アミノ酸をN末端にもつジペプチド等の種々のペプチドを、発酵法により効率よく製造する方法を提供すること。
【解決手段】ストレプトマイセス・プランベウス由来のPlm2遺伝子をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド等のポリヌクレオチド;ストレプトマイセス・プランベウス由来のPlm2タンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質等のタンパク質;上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター;上記発現ベクターを含む形質転換細胞;上記タンパク質の存在下において、少なくとも1種のアミノ酸からペプチドを生成することを含む、ペプチドの製造方法など。
【選択図】なし
【解決手段】ストレプトマイセス・プランベウス由来のPlm2遺伝子をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド等のポリヌクレオチド;ストレプトマイセス・プランベウス由来のPlm2タンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質等のタンパク質;上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター;上記発現ベクターを含む形質転換細胞;上記タンパク質の存在下において、少なくとも1種のアミノ酸からペプチドを生成することを含む、ペプチドの製造方法など。
【選択図】なし
Description
本発明は、リガーゼ及びそれを用いたペプチドの製造方法などに関する。
L−アミノ酸リガーゼ(Lal、EC 6.3.2.28)は、ATPをエネルギー源として利用することにより、遊離アミノ酸を基質としてペプチドを合成する酵素であり、これまで数種類のLalが報告されている(特許文献1〜5、非特許文献1、2)。また、Lalとしてはジペプチドだけでなく3つ以上のアミノ酸を結合するようなものも知られている(非特許文献3、4)。
しかしながら、Lalの基質特異性によって、蛋白質を構成するアミノ酸20種から組み合わされる400種全てのジペプチドを効率よく製造することができるわけではない。特に、AspやGluという酸性アミノ酸をN末端にもつジペプチドを合成するLalは報告されていない。
しかしながら、Lalの基質特異性によって、蛋白質を構成するアミノ酸20種から組み合わされる400種全てのジペプチドを効率よく製造することができるわけではない。特に、AspやGluという酸性アミノ酸をN末端にもつジペプチドを合成するLalは報告されていない。
Lal遺伝子を発現する遺伝子組換え微生物を用いることで、ペプチドを発酵法によって合成することも可能であり(特許文献1、非特許文献5)、酸性アミノ酸をN末端にもつジペプチドを合成するLalが得られれば、その応用はさらに広がる。
プランベマイシン(plumbemycin)は、ストレプトマイセス・プランベウス(Streptomyces plumbeus)由来のペプチド系抗生物質として知られている化合物であり、バチラス・サチリス(Bucillus subtilis)由来リゾクチシン(rhizocticin)同様、その構造中に2−アミノ−5−ホスホノ−3−ペンテン酸(2−amino−5−phosphono−3−pentenoic acid、APPA)を有するトリペプチドである(非特許文献6、7)。プランベマイシンにはプランベマイシンA(Ala−Asp−APPA)とB(Ala−Asn−APPA)という2種の誘導体が存在する。プランベマイシンAはトリペプヂドの真ん中のアミノ酸がAsp、プランベマイシンBではAsnである。
プランベマイシンはその構造中に二つのペプチド結合を有するが、プランベマイシン生合成遺伝子クラスターは同定されておらず、それらペプチド結合がLalによって形成されているのかは不明であった。
J.Bacteriology,187,5195−5202(2005)
Biosci.Biotechnol.Biochem.,74,415−418(2010)
Biosci.Biotechnol.Biochem.,74,129−134(2010)
Biosci.Biotechnol.Biochem.,74,1572−1577(2010)
Appl.Environ.Microbiol.73,6378−6385(2007)
J.Antibiotics.,48,1043−1045(1995)
Chem.Biol.,17,28−37(2010)
本発明は、酸性アミノ酸をN末端にもつジペプチド等の種々のペプチドを、発酵法により効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討した結果、酸性アミノ酸をN末端にもつジペプチド等の種々のペプチドを効率よく生成できるタンパク質を見出すことに成功し、本願発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔1〕以下(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチド:
(a)配列番号17で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号17で表される塩基配列と70%以上の同一性を示す塩基配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;または
(c)配列番号17で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔2〕リガーゼ活性が、N末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸を有するジペプチドを生成する活性である、〔1〕のポリヌクレオチド。
〔3〕以下(A)、(B)または(C)のタンパク質:
(A)配列番号20で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号20で表されるアミノ酸配列と70%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質;または
(C)配列番号20で表されるアミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質。
〔4〕〔1〕または〔2〕のポリヌクレオチド、または〔3〕のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔5〕〔4〕の発現ベクターを含む形質転換細胞。
〔6〕形質転換細胞が大腸菌である、〔5〕の形質転換細胞。
〔7〕〔5〕または〔6〕の形質転換細胞を培地中で培養して、〔3〕のタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。
〔8〕〔3〕のタンパク質の存在下において、少なくとも1種のアミノ酸からペプチドを生成することを含む、ペプチドの製造方法。
〔9〕〔5〕または〔6〕の形質転換細胞を用いてペプチドが生成される、〔8〕の方法。
〔10〕ペプチドが、N末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸を有するジペプチドである、〔8〕または〔9〕の方法。
〔11〕ペプチドがホモペプチドである、〔8〕〜〔10〕のいずれかの方法。
〔12〕ペプチドがヘテロペプチドである、〔8〕〜〔10〕のいずれかの方法。
〔13〕以下(1)および(2)を含む、ペプチド性化合物の製造方法:
(1)〔3〕のタンパク質の存在下において、少なくとも1種のアミノ酸からペプチドを生成すること;および
(2)生成したペプチドを所定の化合物と反応させてペプチド性化合物を生成すること。
〔1〕以下(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチド:
(a)配列番号17で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号17で表される塩基配列と70%以上の同一性を示す塩基配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;または
(c)配列番号17で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔2〕リガーゼ活性が、N末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸を有するジペプチドを生成する活性である、〔1〕のポリヌクレオチド。
〔3〕以下(A)、(B)または(C)のタンパク質:
(A)配列番号20で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号20で表されるアミノ酸配列と70%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質;または
(C)配列番号20で表されるアミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質。
〔4〕〔1〕または〔2〕のポリヌクレオチド、または〔3〕のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔5〕〔4〕の発現ベクターを含む形質転換細胞。
〔6〕形質転換細胞が大腸菌である、〔5〕の形質転換細胞。
〔7〕〔5〕または〔6〕の形質転換細胞を培地中で培養して、〔3〕のタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。
〔8〕〔3〕のタンパク質の存在下において、少なくとも1種のアミノ酸からペプチドを生成することを含む、ペプチドの製造方法。
〔9〕〔5〕または〔6〕の形質転換細胞を用いてペプチドが生成される、〔8〕の方法。
〔10〕ペプチドが、N末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸を有するジペプチドである、〔8〕または〔9〕の方法。
〔11〕ペプチドがホモペプチドである、〔8〕〜〔10〕のいずれかの方法。
〔12〕ペプチドがヘテロペプチドである、〔8〕〜〔10〕のいずれかの方法。
〔13〕以下(1)および(2)を含む、ペプチド性化合物の製造方法:
(1)〔3〕のタンパク質の存在下において、少なくとも1種のアミノ酸からペプチドを生成すること;および
(2)生成したペプチドを所定の化合物と反応させてペプチド性化合物を生成すること。
本発明によれば、酸性アミノ酸をN末端にもつジペプチド等の種々のペプチドを効率よく製造できる。
本発明は、リガーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号17で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドである。配列番号17で表される塩基配列は、配列番号20で表されるアミノ酸配列をコードする。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号17で表される塩基配列と70%以上の同一性を示す塩基配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。同一性%は、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%、97%、98%または99%以上であってもよい。
本発明では、リガーゼ活性とは、カルボン酸基を有する第1の化合物と、アミノ基を有する第2の化合物とを反応させて、当該カルボン酸基と当該アミノ基との反応から生じるアミド結合を有する目的化合物を生成する活性をいう。この反応は、ATP加水分解反応と共役して進行し得る。
カルボン酸基を有する第1の化合物は、アミノ基をさらに有していてもよい。第1の化合物は、好ましくはアミノ酸である。アミノ基を有する第2の化合物は、さらにカルボン酸基を有していてもよい。第2の化合物は、好ましくはアミノ酸である。アミノ酸中のカルボン酸基およびアミノ基は、それぞれ、未保護であっても保護されていてもよいが、アミノ酸が未保護のカルボン酸基および未保護のアミノ基を有することもまた好ましい。アミノ酸はまた、L−アミノ酸および/またはα−アミノ酸であってもよい。アミノ酸としては、例えば、L−アラニン、L−アスパラギン、L−システイン、L−グルタミン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−アルギニン、L−ヒスチジン、L−リジン、グリシンが挙げられる。第1の化合物および第2の化合物は、同じであっても異なっていてもよい。
アミド結合を有する目的化合物は、少なくとも1個のアミド結合を有するペプチド性化合物である。目的化合物は、好ましくはオリゴペプチド(例、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド)であり、より好ましくはジペプチドである。酸性アミノ酸を基質として用いた場合、N末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸を有するペプチドが生成され得る。
カルボン酸基を有する第1の化合物は、アミノ基をさらに有していてもよい。第1の化合物は、好ましくはアミノ酸である。アミノ基を有する第2の化合物は、さらにカルボン酸基を有していてもよい。第2の化合物は、好ましくはアミノ酸である。アミノ酸中のカルボン酸基およびアミノ基は、それぞれ、未保護であっても保護されていてもよいが、アミノ酸が未保護のカルボン酸基および未保護のアミノ基を有することもまた好ましい。アミノ酸はまた、L−アミノ酸および/またはα−アミノ酸であってもよい。アミノ酸としては、例えば、L−アラニン、L−アスパラギン、L−システイン、L−グルタミン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、L−アルギニン、L−ヒスチジン、L−リジン、グリシンが挙げられる。第1の化合物および第2の化合物は、同じであっても異なっていてもよい。
アミド結合を有する目的化合物は、少なくとも1個のアミド結合を有するペプチド性化合物である。目的化合物は、好ましくはオリゴペプチド(例、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド)であり、より好ましくはジペプチドである。酸性アミノ酸を基質として用いた場合、N末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸を有するペプチドが生成され得る。
好ましくは、リガーゼ活性は、酸性アミノ酸および非酸性アミノ酸(例、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸)から、N末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸、およびC末端側のアミノ酸残基として非酸性アミノ酸(例、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸)からなるジペプチド〔N末端−酸性アミノ酸−非酸性アミノ酸−C末端〕を特異的に生成する活性である。目的ジペプチドの「特異的」な生成とは、目的ジペプチドの生成量が他の各ジペプチドの生成量よりも多いことを意味する。具体的には、基質として2種のアミノ酸(酸性アミノ酸および非酸性アミノ酸)を用いた場合、目的ジペプチド(N末端−酸性アミノ酸−非酸性アミノ酸−C末端)の生成量が、これらのアミノ酸から生成する可能性がある他の各ジペプチド〔i)N末端−非酸性アミノ酸−酸性アミノ酸−C末端、ii)N末端−酸性アミノ酸−酸性アミノ酸−C末端、またはiii)N末端−非酸性アミノ酸−非酸性アミノ酸−C末端〕の生成量よりも多いことが意図され、目的ジペプチドの生成量が他のジペプチド〔上記i)、ii)およびiii)〕の総生成量よりも多いことが好ましい。より好ましくは、リガーゼ活性は、未保護のカルボン酸基および未保護のアミノ基を有する酸性アミノ酸、ならびに未保護のカルボン酸基および未保護のアミノ基を有する非酸性アミノ酸(例、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸)から、N末端側のアミノ酸残基として、未保護のN末端を有する酸性アミノ酸、およびC末端側のアミノ酸残基として、未保護のC末端を有する非酸性アミノ酸からなるジペプチド〔N末端(未保護)−酸性アミノ酸−非酸性アミノ酸−C末端(未保護)〕を特異的に生成する活性である。
塩基配列およびアミノ酸配列の相同性%(例、同一性%、類似性%)は、例えばKarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))、またはPearsonによるFASTA(MethodsEnzymol.,183,63(1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTPおよびBLASTNとよばれるプログラムが開発されているので(http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、塩基配列およびアミノ酸配列の同一性%を計算してもよい。また、相同性%としては、例えば、Lipman−Pearson法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアGENETYX Ver7.0.9を使用し、ORFにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Unit Size to Compare=2の設定でSimilarityまたはidentityをpercentage計算させた際の数値を用いてもよい。相同性%として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
さらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号17で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、高い同一性%を示す実質的に同一のポリヌクレオチド同士、例えば上述した同一性%を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い同一性%を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、6×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中、約45℃でのハイブリダイゼーション、続いて、0.2×SSC、0.1%SDS中、50〜65℃での1または2回以上の洗浄が挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、DNAであってもRNAであってもよいが、DNAであることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、放線菌に由来し得る。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス(Streptomyces)属に属する微生物に由来し得る。より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス・プランベウス(Streptomyces plumbeus)に由来し得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、後述する本発明のタンパク質をコードするものであってもよい。
本発明はまた、リガーゼ活性を有するタンパク質を提供する。リガーゼ活性は、上述したとおりである。
一実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号20で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
別の実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号20で表されるアミノ酸配列と70%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質である。同一性%は、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%、97%、98%または99%以上であってもよい。
さらに別の実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号20で表されるアミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸残基が変異しているアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸残基の変異としては、例えば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入が挙げられる。1個もしくは数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の1つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「1個もしくは数個」は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「1もしくは数個」が示す数は、例えば、1〜100個、好ましくは1〜80個、より好ましくは1〜50個、1〜30個、1〜20個、1〜10個または1〜5個である。本発明のタンパク質は、ヒスチジンタグ等の精製用タグを有していてもよい。
本発明のタンパク質は、目的活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に自明である。具体的には、当業者は、1)同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列(例、配列番号20により表されるアミノ酸配列、および他のリガーゼのアミノ酸配列)を比較し、2)相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、3)相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、リガーゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸(例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β位分岐側鎖を有するアミノ酸(例、スレオニン、バリン、イソロイシン)、芳香族側鎖を有するアミノ酸(例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)、ヒドロキシル基(例、アルコール性、フェノール性)含有側鎖を有するアミノ酸(例、セリン、スレオニン、チロシン)、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸(例、システイン、メチオニン)が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
本発明のタンパク質は、例えば、本発明のタンパク質を産生する形質転換細胞から得ることができる。このような形質転換細胞は、本発明の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製することができる。本発明のタンパク質を産生させるための宿主としては、例えば、エスケリシア・コリ(Escherichia coli)等のエスケリシア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、およびバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピヒア・スティピティス(Pichia stipitis)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)をはじめとする種々の真核細胞が挙げられる。
形質転換される宿主としてE.coliについて詳述すると、E.coliとしては、例えば、E.coli K12株亜種のE.coli JM109株、DH5α株、HB101株、BL21(DE3)株が挙げられる。形質転換方法、および形質転換細胞を選別する方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor press (2001/01/15)などにも記載されている。以下、形質転換されたE.coliを作製し、これを用いて本発明のタンパク質を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
本発明の発現ベクターとしては、例えば、宿主においてタンパク質を産生させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、または組込み型(integrative)ベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、DNAベクターまたはRNAベクターであってもよい。細胞系ベクターとしては、宿主に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌用の発現ベクターとしては、pBR322誘導体に代表されるColE系プラスミド、p15Aオリジンを持つpACYC系プラスミド、pSC系プラスミド、Bac系プラスミドが挙げられる。その他、trcやtac等のトリプトファンプロモーター、lacプロモーター、T7プロモーター、T5プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターも挙げられる。
本発明の発現ベクターでは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の下流に、転写終結配列であるターミネータを連結してもよい。このようなターミネータとしては、例えば、T7ターミネータ、fdファージターミネータ、T4ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌trpA遺伝子のターミネータが挙げられる。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子をE.coliに導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ColE1由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばpUC系のプラスミドやpBR322系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう「改変」とは、変異剤やUV照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
ベクターは、形質転換細胞の選別のため、アンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている(例、pUC系(タカラバイオ社製)、pPROK系(クローンテック製)、pKK233−2(クローンテック製))。
得られた発現ベクターを用いてE.coliを形質転換し、得られたE.coliを培養すると、本発明のタンパク質が発現される。
培地としては、例えば、M9−カザミノ酸培地、LB培地など、微生物を培養するために通常用いる培地が挙げられる。培養および生産誘導等の条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌等の種類に応じて適宜選択することができる。
本発明のタンパク質を回収するには、以下の方法などがある。本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を産生する形質転換細胞を回収した後、形質転換細胞を破砕(例、ソニケーション、ホモジナイゼーション)あるいは溶解(例、リゾチーム処理)することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、本発明のタンパク質を得ることができる。
本発明はまた、ペプチドの製造方法を提供する。このような方法は、本発明のタンパク質の存在下において、少なくとも1種のアミノ酸からペプチドを生成することを含む。生成されるペプチドとしては、例えば、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド等のオリゴペプチドが挙げられる。
一実施形態では、ペプチドを構成するN末端のアミノ酸は、酸性アミノ酸(例、L−グルタミン酸またはL−アスパラギン酸)である。一方、ペプチドを構成するC末端のアミノ酸は、上述したような任意のアミノ酸である。本実施形態では、基質として、少なくとも一種の酸性アミノ酸が用いられる。
別の実施形態では、ペプチドは、同種のアミノ酸から構成されるホモペプチド(例、ホモジペプチド)である。本実施形態では、基質として、一種のアミノ酸を用いることができる。このようなアミノ酸としては、例えば、上述したものが挙げられる。
さらに別の実施形態では、ペプチドは、異種のアミノ酸から構成されるヘテロペプチド(例、ヘテロジペプチド)である。本実施形態では、基質として、二種のアミノ酸を用いることができる。このようなアミノ酸としては、例えば、上述したものが挙げられる。
本発明のペプチドの製造方法は、本発明のタンパク質の存在下で行われる限り特に限定されず、例えば、本発明のタンパク質自体(例、精製タンパク質)を用いる酵素反応系により、または本発明のタンパク質を産生する本発明の形質転換細胞の培養(即ち、発酵法)により行うことができる。好ましくは、本発明の形質転換細胞の培養により行われる。本発明のペプチドの製造方法において本発明の形質転換細胞を用いる場合、ペプチドの原料となるアミノ酸は、本発明の形質転換細胞により培地成分(例、炭素源および窒素源、またはペプチド成分)から生合成されたものであってもよいし、または培養系に添加されたものであってもよい。
酵素反応系によりペプチドが製造される場合、酵素反応は、本発明のタンパク質、および基質(アミノ酸)をそれぞれ適量含む緩衝液(例、Tris−HCl)中で行うことができる。緩衝液のpHは、例えば、中性またはアルカリ性条件に対応するpHに適宜設定される。酵素反応系は、適量のATP(例、1〜100mmol/L)および適量のマグネシウム塩(例、1〜100mmol/Lの硫酸マグネシウム)を含むように調製される。酵素反応系は、好ましくは、酵素安定化剤(例、ジチオスレイトール、グリセロール)を含む。反応温度は、例えば、30〜40℃である。反応時間は、生成されるべきペプチドの量に応じて適宜設定できる。
発酵法によりペプチドが製造される場合、本発明の形質転換細胞の培養培地としては、適切な炭素源および窒素源を含むものが用いられる。炭素源としては、例えば、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物が挙げられる。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素が挙げられる。培養培地はまた、適切なミネラル(例、マグネシウム)、他の栄養源、緩衝液などを含んでいてもよい。培養培地としてはまた、Luria Bertani(LB)ブロス、Sabouraud Dextrose(SD)ブロス、Yeast medium(YM)ブロス等の一般的に市販されている培地を用いることもできる。
本発明の形質転換細胞の培養条件としては、本発明のタンパク質の産生が可能な条件であれば、特に限定されず、標準的な条件を利用することができる。形質転換細胞の培養方法としては、例えば、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法等の公知の発酵法が挙げられる。培養温度は、例えば、20℃〜40℃である。CO2濃度は、例えば、約6%〜約84%である。pHは、例えば、約5〜約9である。
本発明の製造方法において生成されるペプチドは、公知の分離精製手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、溶媒抽出、晶出、再結晶、転溶、活性炭処理、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーなどの処理を必要に応じて組み合せることにより単離精製することができる。本発明の製造方法において、基質として用いられるアミノ酸、および生成されるペプチドは、特に断らない限り、塩の形態であってもなくてもよい。このような塩は、それ自体公知の手段に従い、例えば、アミノ酸またはペプチドに無機酸または有機酸を加えることによって製造することができる。また、アミノ酸またはペプチドは、水和物であってもよく、水和物および非水和物のいずれも本発明の範囲に包含されるものである。塩としては、例えば、アルカリ金属(例、ナトリウム、カリウム、リチウム)塩、アルカリ土類金属(例、カルシウム、マグネシウム)塩などの塩基塩および塩酸塩、硫酸塩、硝酸鉛、リン酸塩などの酸付加塩が挙げられる。本発明の製造方法において生成されるペプチドは、例えば、医薬品、化粧品、食品、試薬もしくは工業製品として、またはそれらの製品の原料として有用である。
本発明はまた、ペプチド性化合物の製造方法を提供する。本発明のペプチド性化合物の製造方法は、以下(1)および(2)を含む:
(1)本発明のタンパク質の存在下において、少なくとも1種のアミノ酸からペプチドを生成すること;および
(2)生成したペプチドを所定の化合物と反応させてペプチド性化合物を生成すること。
上記(1)の工程は、上述した本発明のペプチドの製造方法と同様にして行うことができる。
(1)本発明のタンパク質の存在下において、少なくとも1種のアミノ酸からペプチドを生成すること;および
(2)生成したペプチドを所定の化合物と反応させてペプチド性化合物を生成すること。
上記(1)の工程は、上述した本発明のペプチドの製造方法と同様にして行うことができる。
上記(2)の工程では、(1)で生成したペプチドが所定の化合物と反応される。ペプチドと反応される所定の化合物は、ペプチドに対する反応性を示す官能基(例、カルボン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、またはそれらの誘導体)を有する化合物である限り特に限定されない。このような化合物は、低分子化合物であっても高分子化合物であってもよい。具体的には、このような化合物としては、例えば、アミノ酸、ペプチド(例、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド等のオリゴペプチド)、糖(例、単糖、または二糖等のオリゴ糖)、脂質(例、脂肪酸)、核酸(例、DNA、RNA等の天然核酸、PNA等の人工核酸)が挙げられる。反応は、有機化学的反応(例、固相合成法)であっても生物学的反応(例、酵素法、発酵法)であってもよい。このような反応は、当該分野において公知の方法により行うことができる。
本発明の製造方法において生成されるペプチド性化合物は、(1)で生成したペプチドおよび上述した所定の化合物から生成される化合物である限り特に限定されない。例えば、(1)で生成したペプチドがジペプチドである場合は、ペプチド性化合物は、トリペプチド、テトラペプチド等のオリゴペプチドであってもよい。トリペプチドとしては、例えば、プランベマイシンA(Ala−Asp−APPA)、プランベマイシンB(Ala−Asn−APPA)等のプランベマイシンが挙げられる。プランベマイシンが生成される場合、(1)で生成したペプチドと反応される所定の化合物として、2−アミノ−5−ホスホノ−3−ペンテン酸が用いることができる。
本発明の製造方法において生成されるペプチド性化合物は、公知の分離精製手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、溶媒抽出、晶出、再結晶、転溶、活性炭処理、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーなどの処理を必要に応じて組み合せることにより単離精製することができる。本発明の製造方法において、基質として用いられるペプチドおよび所定の化合物、ならびに生成されるペプチド性化合物は、特に断らない限り、塩の形態であってもなくてもよい。このような塩は、それ自体公知の手段に従い、例えば、ペプチド若しくは所定の化合物、またはペプチド性化合物に無機酸または有機酸を加えることによって製造することができる。また、ペプチドおよび所定の化合物、ならびにペプチド性化合物は、水和物であってもよく、水和物および非水和物のいずれも本発明の範囲に包含されるものである。塩としては、例えば、アルカリ金属(例、ナトリウム、カリウム、リチウム)塩、アルカリ土類金属(例、カルシウム、マグネシウム)塩などの塩基塩および塩酸塩、硫酸塩、硝酸鉛、リン酸塩などの酸付加塩が挙げられる。本発明の製造方法において生成されるペプチド性化合物は、例えば、医薬品、化粧品、食品、試薬もしくは工業製品として、またはそれらの製品の原料として有用である。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
実施例1:プランベマイシン生合成遺伝子クラスターの推定
ストレプトマイセス・プランベウス株(NBRC番号:13708)のプランベマイシン生合成に関与する遺伝子クラスターの推定を行なった。
ストレプトマイセス・プランベウス株(NBRC番号:13708)のプランベマイシン生合成に関与する遺伝子クラスターの推定を行なった。
(1−1)ストレプトマイセス・プランベウスNBRC13708株からのゲノムDNA抽出
ストレプトマイセス・プランベウスNBRC13708株を坂口フラスコ中100 mLのGrowth Medium(peptone:0.5g、yeast extract:0.3g、MgSO4・7H2O:0.1g)で培養28℃、120 rpmで2日間培養し、該培養菌体からPowerMicrobial Maxi DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratory社製)を用い、マニュアルに従いゲノムDNAを調製した。
ストレプトマイセス・プランベウスNBRC13708株を坂口フラスコ中100 mLのGrowth Medium(peptone:0.5g、yeast extract:0.3g、MgSO4・7H2O:0.1g)で培養28℃、120 rpmで2日間培養し、該培養菌体からPowerMicrobial Maxi DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratory社製)を用い、マニュアルに従いゲノムDNAを調製した。
(1−2)ホスホエノールピルビン酸ムターゼ(PepM)遺伝子のコアフラグメントの取得
APPAの生合成の第一段階目の反応である、ホスホエノールピルビン酸からホスホノピルビン酸への変換を触媒するPepM遺伝子のコア配列の取得を行なった。
APPAの生合成の第一段階目の反応である、ホスホエノールピルビン酸からホスホノピルビン酸への変換を触媒するPepM遺伝子のコア配列の取得を行なった。
ストレプトマイセス・ロゼオスポラス(Streptomyces roseosporus)由来PepMのアミノ酸配列(配列番号1)、ストレプトマイセス・ルベロムリヌス(Streptomyces rubellomurinus)由来PepMのアミノ酸配列(配列番号2)、ストレプトマイセス・ルリダス(Streptomyces luridus)由来PepMのアミノ酸配列(配列番号3)、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)由来PepMのアミノ酸配列(配列番号4)、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomycs viridochromogenes)由来PepMのアミノ酸配列(配列番号5)、バチラス・サチリス(Bucillus subtilis)由来PepMのアミノ酸配列(配列番号6)のアライメントを基に、配列間で高度に保存されている領域を4箇所見出した。本保存領域をN末側から領域1から4とし、2段階の縮重PCRにより、領域2と3の間のコア配列の増幅を試みた。
Consensus−Degenerate Hybrid OligonucleotidePrimer(CODEHOP、http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html)を用い、保存領域のアミノ酸配列を塩基配列に変換し、縮重プライマーを作製し、日本バイオサービス社より購入した。縮重プライマーA(配列番号7)および縮重プライマーB(配列番号8)、ならびに鋳型として1−1で調製したゲノムDNAを用いた一段階目のPCRにより、PepM遺伝子の保存領域1と4の間の増幅を行った。縮重プライマーAは、保存領域1の塩基配列を、縮重プライマーBは、保存領域4の配列と相補的な塩基配列を有している。PCRは、Ex Taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用い、マニュアルに従って行った。
続いて、一段階目のPCR産物を鋳型として、二段階目のPCRを行なった。縮重プライマーC(配列番号9)および縮重プライマーD(配列番号10)、ならびに鋳型として一段階目のPCR産物を用いた二段階目のPCRにより、PepM遺伝子の保存領域2と3の間のコア配列の増幅を行なった。縮重プライマーCは、保存領域2の塩基配列を、縮重プライマーDは、保存領域3の配列と相補的な塩基配列を有している。PCRは、Ex Taqポリメラーゼを用い、マニュアルに従って行った。
PCR産物全量をアガロース電気泳動に供し、PepM遺伝子コア断片に相当する約350bpのDNA断片が増幅していることを確認した後、QIAquick Gel Extraction Kit(Quiagen社製)を用いてアガロースゲルからの切り出し精製を行い、10μlのBuffer EBに溶解した。得られたPepM遺伝子を含む約350bpのDNA断片およびT−Vectorの約2.7kbのDNA断片を、TaKaRa Ligation Kit Ver.2.1(タカラバイオ社製)を用いて、16℃で30分間反応させ連結した。該反応液を用いてエシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(タカラバイオ社製)を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換細胞を50μg/mlのアンピシリンを含むLB[10g/Lバクトトリプトン(ディフコ社製)、5g/Lイーストエキス(ディフコ社製)、5g/L塩化ナトリウム(Wako社製)]寒天培地に塗布した後、37℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換細胞のコロニーより、公知の方法によりプラスミドを抽出し、その塩基配列を公知の方法により決定した。塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号11および配列番号12に示す。本アミノ酸配列は他の主由来PepM配列と高い相同性を有しており、PepM遺伝子の一部が得られたものと断定した。
(1−3)PepM遺伝子周辺配列の解読
上記PepM遺伝子のコア配列を基に、ゲノムウォーキング法及びサザンブロッティングによるPepM遺伝子周辺配列の解読を行なった。
上記PepM遺伝子のコア配列を基に、ゲノムウォーキング法及びサザンブロッティングによるPepM遺伝子周辺配列の解読を行なった。
ゲノムウォーキングには、GenomeWalker Universal Kit(Clontech社製)を用いた。マニュアルに従い以下の表に示す鋳型ライブラリーとプライマーを用いてゲノムウォーキングを実施し、PepM遺伝子コア配列の5’末端外側約2.5kb及び3‘末端外側約4.5kbの配列を解読した。それぞれの塩基配列を、配列番号13および14に示す。
3’側の塩基配列をさらに読み進めるため、配列番号14の3‘末端1kbの配列をプローブとしてサザンブロッティングを行なった。プローブの配列を配列番号15に示す。サザンブロッティングには、DIG High Prime DNA Labelling and Detection Starter Kit(Roche社製)を用い、EcoRI及びKpnIにより制限酵素処理したゲノムDNAを鋳型として、マニュアルに従って行なった。その結果、約9kbの断片が得られ、この断片をpUCベクターへとサブクローニングし、新たに約4.5kbのゲノムDNA配列を解読した。新たに解読した塩基配列を配列番号16に示す。
解読した配列をもとに、NCBIのBLASTサーチを行なったところ、以下の表に示すとおり、13の全長遺伝子と、1つの部分長遺伝子が含まれていることが判明した。これらの遺伝子のコードするタンパク質のうち2つ(Plm1、Plm2)はリゾクチシン生合成に関与する既知のリガーゼと高い相同性を示し、また、これらを含めた殆どがリゾクチシン遺伝子クラスター内に存在する遺伝子のコードするタンパク質と高い相同性を有していた。このことから、これら計14つの遺伝子は、プランベマイシンの生合成に関与する遺伝子クラスターの一部であると推定した。
実施例2:エシェリヒア・コリ用発現プラスミドpET−plm2の構築
エシェリヒア・コリ用発現プラスミドpET−plm2を以下の手順で構築した。
エシェリヒア・コリ用発現プラスミドpET−plm2を以下の手順で構築した。
日本バイオサービス社より、実施例1で得られたPlm2遺伝子配列(配列番号17)を基に作製したプライマーE(配列番号18)およびプライマーF(配列番号19)を購入した。プライマーEは、Plm2遺伝子配列の開始コドンの次からを含む領域の5’末端にNdeI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーFは、Plm2遺伝子配列の終止コドンより内側の塩基配列と相補的な塩基配列の5’末端にXhoI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
プライマーEおよびプライマーF、ならびに鋳型としてストレプトマイセス・プランベウスNBRC13708株ゲノムDNAを用いたPCRにより、Plm2遺伝子を含む配列の増幅を行った。PCRは、ストレプトマイセス・プランベウスNBRC13708株ゲノムDNA、0.2μmol/Lの各プライマー、1.0unitのPhusion High−Fidelity DNAポリメラーゼ(FINNZYMES社製)、10μLの5xPhusion HF緩衝液、各2.5mmol/LのdNTP(dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP)を含む反応液50μlを調製し、98℃で30秒間加温した後、98℃で15秒間、60℃で10秒間、72℃で30秒間の工程を30回繰り返し、さらに72℃で1分間加温することにより行った。
PCR後の反応液の5μlをアガロースゲル電気泳動に供し、Plm2遺伝子断片に相当する約1.1kbのDNA断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からMinElute Reaction Cleanup Kitを用いて精製し、42μlのBuffer EBに溶解した。次に、得られたDNA溶液全量を用い、該DNA断片をNdeIおよびXhoIで切断後、MinElute Reaction Cleanup Kitを用いて該DNA断片を精製し、10μlのBuffer EBに溶解した。
1μgの発現プラスミドpET−21a(+)を制限酵素NdeIおよびXhoIで切断後、MinElute Reaction Cleanup Kitを用いて該DNA断片を精製し、15μlのBuffer EBに溶解した。次に、得られたDNA溶液全量を用い、該DNA断片をAlkaline Phosphatase,Calf intestine(CIAP)で脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kitを用いて精製し、10μlのBuffer EBに溶解した。
上記で得られたPlm2遺伝子を含む約1.1kbのDNA断片および上記で取得した発現ベクターpET−21a(+)の約5.4kbのDNA断片を、TaKaRa Ligation Kit Ver.2.1を用いて、16℃で30分間反応させ連結した。該反応液を用いてエシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(タカラバイオ社製)を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換細胞を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、37℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換細胞のコロニーより、公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、その塩基配列を公知の方法により決定した。得られたプラスミドは、3’末端にHisタグ配列をコードする配列が付加されたストレプトマイセス・プランベウスNBRC13708株由来Plm2遺伝子が、T7プロモーター下流に連結されたプラスミドであり、pET−plm2と命名した。なお、ストレプトマイセス・プランベウスNBRC13708株由来plm2遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号17および配列番号20に示す。
続いて、pET−plm2を用いてエシェリヒア・コリBL21(DE3)株コンピテントセルを、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換細胞を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した後、37℃で一晩培養した。生育してきた形質転換細胞のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、pET−plm2が保持されていることを確認した。このpET−plm2を保持するエシェリヒア・コリBL21(DE3)株を、エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET−plm2と命名した。
実施例3:Plm2の精製
実施例2で得られたエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET−plm2を100μg/mlのアンピシリンを含む3mLのLB培地の入った試験管に接種し37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液のうち2mlを100mlのLB培地が入った坂口フラスコに接種した。37℃で2時間振とう培養後、終濃度が0.5mmol/Lになるようにイソプロピル−β―D―チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して、さらに30℃で4時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
実施例2で得られたエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET−plm2を100μg/mlのアンピシリンを含む3mLのLB培地の入った試験管に接種し37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液のうち2mlを100mlのLB培地が入った坂口フラスコに接種した。37℃で2時間振とう培養後、終濃度が0.5mmol/Lになるようにイソプロピル−β―D―チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して、さらに30℃で4時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
該湿菌体を、10mLの抽出バッファー(Tris−HCl、pH8.0 50mM、NaCl 150mM)に懸濁し超音波処理によりタンパク質を抽出した後、遠心分離して得られる上清から、Ni Sepharose 6 Fast Flowを用い、説明書に従いHisタグ付加組換え型Plm2を精製した。続いて、該精製酵素についてPD−10カラム(GE Healthcare社製)を用いて、説明書に従い脱塩を行った。この精製および脱塩されたPlm2を、精製Plm2として以降の実験に用いた。
実施例4:Plm2を用いたホモジペプチドの生成
実施例3で取得した精製Plm2を用い、L−Val、L−Leu、L−Ile、L−Ala及びL−Gluを基質とするホモジペプチド生成を検討した。下記組成の反応液(pH9.5)400μlを調製し、30℃で16時間反応を行った。
実施例3で取得した精製Plm2を用い、L−Val、L−Leu、L−Ile、L−Ala及びL−Gluを基質とするホモジペプチド生成を検討した。下記組成の反応液(pH9.5)400μlを調製し、30℃で16時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製Plm2 160μg/400μl
Tris−HCl(pH9.5) 100 mmol/L
L−アミノ酸 100 mmol/L
アデノシン三リン酸(ATP) 10 mmol/L
硫酸マグネシウム 10 mmol/L
ジチオスレイトール(DTT) 2 mmol/L
グリセロール 15 %(Vol./Vol.)
精製Plm2 160μg/400μl
Tris−HCl(pH9.5) 100 mmol/L
L−アミノ酸 100 mmol/L
アデノシン三リン酸(ATP) 10 mmol/L
硫酸マグネシウム 10 mmol/L
ジチオスレイトール(DTT) 2 mmol/L
グリセロール 15 %(Vol./Vol.)
ネガティブコントロールとして、ATP反応組成よりATPを抜いた反応、熱処理した精製酵素を用いた反応をそれぞれ併せて行なった。
反応終了後、ネガティブコントロールでは生成が確認されなかった反応生成物をHPLCにより分析したところ、各反応生成物のピークはVal−Val、Leu−Leu、Ile−Ile、Ala−Ala及びαGlu−Glu(αは、アミド結合を構成するカルボニル基のグルタミン酸残基中の位置を示す)の標品のピークと保持時間が一致し、それぞれ基質アミノ酸のホモジペプチドであると判断した。定量の結果、Val−Val濃度は10.0mmol/L、Leu−Leu濃度は8.5mmol/L、Ile−Ile濃度は8.9mmol/L、Ala−Ala濃度は9.0mmol/L、αGlu−Glu濃度は4.9mmol/Lであった。
実施例5:Plm2を用いたヘテロジペプチドの生成
実施例3で取得した精製Plm2を用い、各アミノ酸を基質とするヘテロジペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液(pH9.5)400μlを調製し、30℃で16時間反応を行った。
実施例3で取得した精製Plm2を用い、各アミノ酸を基質とするヘテロジペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液(pH9.5)400μlを調製し、30℃で16時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製Plm2 160μg/400μl
Tris‐HCl(pH9.5) 100 mmol/L
L−Asn or L−Asp 100 mmol/L
L−Val or L−Leu or L−Phe 100 mmol/L
アデノシン三リン酸(ATP) 10 mmol/L
硫酸マグネシウム 10 mmol/L
ジチオスレイトール(DTT) 2 mmol/L
グリセロール 15%(Vol./Vol.)
精製Plm2 160μg/400μl
Tris‐HCl(pH9.5) 100 mmol/L
L−Asn or L−Asp 100 mmol/L
L−Val or L−Leu or L−Phe 100 mmol/L
アデノシン三リン酸(ATP) 10 mmol/L
硫酸マグネシウム 10 mmol/L
ジチオスレイトール(DTT) 2 mmol/L
グリセロール 15%(Vol./Vol.)
ネガティブコントロールとして、ATP反応組成よりATPを抜いた反応、熱処理した精製酵素を用いた反応をそれぞれ併せて行なった。
反応終了後、ネガティブコントロールでは生成が確認されなかった反応生成物をHPLCにより分析し、標品を用いて定量を行なった。結果は、以下の表に示されるとおりであった。
配列番号1:ストレプトマイセス・ロゼオスポラス由来のPepMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号2:ストレプトマイセス・ルベロムリヌス由来のPepMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:ストレプトマイセス・ルリダス由来のPepMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号4:ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス由来のPepMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号5:ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のPepMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号6:バチラス・サチリス由来のPepMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号7:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPepM遺伝子を増幅するための縮重フォワードプライマー(プライマーA)
配列番号8:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPepM遺伝子を増幅するための縮重リバースプライマー(プライマーB)
配列番号9:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPepM遺伝子を増幅するための縮重フォワードプライマー(プライマーC)
配列番号10:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPepM遺伝子を増幅するための縮重リバースプライマー(プライマーD)
配列番号11:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPepM遺伝子の部分塩基配列
配列番号12:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPepMタンパク質の部分アミノ酸配列
配列番号13:PepM遺伝子コア配列の5’末端上流の塩基配列
配列番号14:PepM遺伝子コア配列の3’末端下流の塩基配列
配列番号15:サザンブロッティングに用いたプローブの塩基配列
配列番号16:サザンブロッティングにより取得したゲノムDNAの塩基配列
配列番号17:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPlm2遺伝子の塩基配列
配列番号18:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPlm2遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー(プライマーE)
配列番号19:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPlm2遺伝子を増幅するためのリバースプライマー(プライマーF)
配列番号20:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPlm2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号21:PepM遺伝子の5’末端上流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp1−R1)
配列番号22:PepM遺伝子の5’末端上流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp1−R2)
配列番号23:PepM遺伝子の5’末端上流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp4−R1)
配列番号24:PepM遺伝子の5’末端上流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp4−R2)
配列番号25:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp1−F1)
配列番号26:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp1−F2)
配列番号27:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp2−F1−2)
配列番号28:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp2−F2−2)
配列番号29:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp3−F1)
配列番号30:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp1−F1)
配列番号31:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp5−F1)
配列番号32:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp5−F2)
配列番号2:ストレプトマイセス・ルベロムリヌス由来のPepMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:ストレプトマイセス・ルリダス由来のPepMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号4:ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス由来のPepMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号5:ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のPepMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号6:バチラス・サチリス由来のPepMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号7:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPepM遺伝子を増幅するための縮重フォワードプライマー(プライマーA)
配列番号8:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPepM遺伝子を増幅するための縮重リバースプライマー(プライマーB)
配列番号9:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPepM遺伝子を増幅するための縮重フォワードプライマー(プライマーC)
配列番号10:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPepM遺伝子を増幅するための縮重リバースプライマー(プライマーD)
配列番号11:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPepM遺伝子の部分塩基配列
配列番号12:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPepMタンパク質の部分アミノ酸配列
配列番号13:PepM遺伝子コア配列の5’末端上流の塩基配列
配列番号14:PepM遺伝子コア配列の3’末端下流の塩基配列
配列番号15:サザンブロッティングに用いたプローブの塩基配列
配列番号16:サザンブロッティングにより取得したゲノムDNAの塩基配列
配列番号17:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPlm2遺伝子の塩基配列
配列番号18:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPlm2遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー(プライマーE)
配列番号19:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPlm2遺伝子を増幅するためのリバースプライマー(プライマーF)
配列番号20:ストレプトマイセス・プランベウス由来のPlm2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号21:PepM遺伝子の5’末端上流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp1−R1)
配列番号22:PepM遺伝子の5’末端上流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp1−R2)
配列番号23:PepM遺伝子の5’末端上流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp4−R1)
配列番号24:PepM遺伝子の5’末端上流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp4−R2)
配列番号25:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp1−F1)
配列番号26:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp1−F2)
配列番号27:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp2−F1−2)
配列番号28:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp2−F2−2)
配列番号29:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp3−F1)
配列番号30:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp1−F1)
配列番号31:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp5−F1)
配列番号32:PepM遺伝子の3’末端下流に位置する塩基配列の解読に用いたプライマー(Sp5−F2)
Claims (13)
- 以下(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチド:
(a)配列番号17で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号17で表される塩基配列と70%以上の同一性を示す塩基配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;または
(c)配列番号17で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - リガーゼ活性が、N末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸を有するジペプチドを生成する活性である、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 以下(A)、(B)または(C)のタンパク質:
(A)配列番号20で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号20で表されるアミノ酸配列と70%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質;または
(C)配列番号20で表されるアミノ酸配列において1個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつリガーゼ活性を有するタンパク質。 - 請求項1または2記載のポリヌクレオチド、または請求項3記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項4記載の発現ベクターを含む形質転換細胞。
- 形質転換細胞が大腸菌である、請求項5記載の形質転換細胞。
- 請求項5または6記載の形質転換細胞を培地中で培養して、請求項3記載のタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。
- 請求項3記載のタンパク質の存在下において、少なくとも1種のアミノ酸からペプチドを生成することを含む、ペプチドの製造方法。
- 請求項5または6記載の形質転換細胞を用いてペプチドが生成される、請求項8記載の方法。
- ペプチドが、N末端側のアミノ酸残基として酸性アミノ酸を有するジペプチドである、請求項8または9記載の方法。
- ペプチドがホモペプチドである、請求項8〜10のいずれか一項記載の方法。
- ペプチドがヘテロペプチドである、請求項8〜10のいずれか一項記載の方法。
- 以下(1)および(2)を含む、ペプチド性化合物の製造方法:
(1)請求項3記載のタンパク質の存在下において、少なくとも1種のアミノ酸からペプチドを生成すること;および
(2)生成したペプチドを所定の化合物と反応させてペプチド性化合物を生成すること。
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JP2012204861A JP2014057545A (ja) | 2012-09-18 | 2012-09-18 | リガーゼ及びそれを用いたペプチドの製造方法 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
-
2012
- 2012-09-18 JP JP2012204861A patent/JP2014057545A/ja active Pending
Cited By (2)
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WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
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