JP2002153285A - 新規耐熱性アミノトランスフェラーゼ - Google Patents
新規耐熱性アミノトランスフェラーゼInfo
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- JP2002153285A JP2002153285A JP2000357630A JP2000357630A JP2002153285A JP 2002153285 A JP2002153285 A JP 2002153285A JP 2000357630 A JP2000357630 A JP 2000357630A JP 2000357630 A JP2000357630 A JP 2000357630A JP 2002153285 A JP2002153285 A JP 2002153285A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】エアロパイラム・ペルニクスの耐熱性アミノト
ランスフェラーゼ遺伝子を提供するとともに、該遺伝子
によってコードされるアミノトランスフェラーゼを用い
る非天然型Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供する。 【解決手段】エアロパイラム・ペルニクス由来の特定Ｄ
ＮＡの塩基配列によってコードされる蛋白質等であっ
て、６０℃以上１１５℃以下の温度条件下においてアミ
ノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質と、それを用
いる非天然型Ｌ−アミノ酸の製造方法により前記課題を
解決する。
ランスフェラーゼ遺伝子を提供するとともに、該遺伝子
によってコードされるアミノトランスフェラーゼを用い
る非天然型Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供する。 【解決手段】エアロパイラム・ペルニクス由来の特定Ｄ
ＮＡの塩基配列によってコードされる蛋白質等であっ
て、６０℃以上１１５℃以下の温度条件下においてアミ
ノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質と、それを用
いる非天然型Ｌ−アミノ酸の製造方法により前記課題を
解決する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アミノトランスフ
ェラーゼ活性を有する蛋白質（その誘導体を含む）、該
蛋白質をコードする環状ＤＮＡ、前記蛋白質等を用いて
高い光学純度を有するＬ−アミノ酸を生物工学的に製造
する方法等に関するものである。
ェラーゼ活性を有する蛋白質（その誘導体を含む）、該
蛋白質をコードする環状ＤＮＡ、前記蛋白質等を用いて
高い光学純度を有するＬ−アミノ酸を生物工学的に製造
する方法等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】光学活性なＬ−アミノ酸は、食品添加
物、飼料、医薬品又は農薬等の原料として重要であり、
例えばＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−フ
ェニルアラニン等は食品添加物として、例えばＬ−リジ
ン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン等は飼料とし
て、例えばＬ−アスパラギン酸、Ｌ−ＤＯＰＡ、Ｄ−ｐ
−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｄ−フェニルグリシン
等は医薬品として、そして例えばＬ−ホスフィノスリシ
ン等は農薬として、大量に使用されている。また最近で
は、新規な構造を持つペプチドミメティックな医薬品の
合成単位としての重要性も高まっている。
物、飼料、医薬品又は農薬等の原料として重要であり、
例えばＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−フ
ェニルアラニン等は食品添加物として、例えばＬ−リジ
ン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン等は飼料とし
て、例えばＬ−アスパラギン酸、Ｌ−ＤＯＰＡ、Ｄ−ｐ
−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｄ−フェニルグリシン
等は医薬品として、そして例えばＬ−ホスフィノスリシ
ン等は農薬として、大量に使用されている。また最近で
は、新規な構造を持つペプチドミメティックな医薬品の
合成単位としての重要性も高まっている。
【０００３】ペプチドミメティックな医薬品の合成で
は、体内でのタンパク質分解酵素／ペプチド分解酵素に
よる分解を抑え、また、独特の物性（代表例として、例
えば、物理化学的な特性、血漿成分や細胞膜、細胞膜上
に存在する受容体との相互作用の増強等がある）を与え
るために、天然蛋白質を構成する２０種類のアミノ酸と
は異なるアミノ酸を使用することがある。
は、体内でのタンパク質分解酵素／ペプチド分解酵素に
よる分解を抑え、また、独特の物性（代表例として、例
えば、物理化学的な特性、血漿成分や細胞膜、細胞膜上
に存在する受容体との相互作用の増強等がある）を与え
るために、天然蛋白質を構成する２０種類のアミノ酸と
は異なるアミノ酸を使用することがある。
【０００４】このような非天然型アミノ酸（ときとして
異常アミノ酸、非蛋白質系アミノ酸等と称される）のう
ち、例えばＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｄ−
フェニルグリシンは合成ペニシリンの中間体であり、Ｌ
−ＤＯＰＡはパーキンソン病の医薬原体であり、Ｌ−ホ
スフィノスリシンは除草剤の有効成分である。また、近
年になって重要性が増してきている非天然型アミノ酸と
して、糖尿病薬や制がん剤の原料となるＤ−フェニルア
ラニン、ＡＩＤＳ薬や制がん剤の原料となるＬ−ターシ
ャリロイシン、喘息薬や偏頭痛薬の原料となる３−（２
−ナフチル）−Ｌ−アラニン、脳関門通過促進剤や喘息
薬の原料となる３−（２−チエニル）−Ｌ−アラニン、
局所麻酔薬の原料となるＬ−ピペコリン酸、制がん剤の
原料となる３−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン、Ｄ−
トリプトファン等の非天然型アミノ酸がある。
異常アミノ酸、非蛋白質系アミノ酸等と称される）のう
ち、例えばＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｄ−
フェニルグリシンは合成ペニシリンの中間体であり、Ｌ
−ＤＯＰＡはパーキンソン病の医薬原体であり、Ｌ−ホ
スフィノスリシンは除草剤の有効成分である。また、近
年になって重要性が増してきている非天然型アミノ酸と
して、糖尿病薬や制がん剤の原料となるＤ−フェニルア
ラニン、ＡＩＤＳ薬や制がん剤の原料となるＬ−ターシ
ャリロイシン、喘息薬や偏頭痛薬の原料となる３−（２
−ナフチル）−Ｌ−アラニン、脳関門通過促進剤や喘息
薬の原料となる３−（２−チエニル）−Ｌ−アラニン、
局所麻酔薬の原料となるＬ−ピペコリン酸、制がん剤の
原料となる３−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン、Ｄ−
トリプトファン等の非天然型アミノ酸がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記したような、通常
は生体内に存在しないＬ−アミノ酸やそのような残基を
有するＤ−アミノ酸等を製造（合成）するには、発酵物
や天然物といった純生物的な過程で生産された原料を用
いることが困難であるため、化学合成プロセス又は化学
合成と生物工学のハイブリッドプロセスを用いることな
る。
は生体内に存在しないＬ−アミノ酸やそのような残基を
有するＤ−アミノ酸等を製造（合成）するには、発酵物
や天然物といった純生物的な過程で生産された原料を用
いることが困難であるため、化学合成プロセス又は化学
合成と生物工学のハイブリッドプロセスを用いることな
る。
【０００６】例えば前記したような光学活性な非天然型
アミノ酸のうち、Ｌ−体のものについては対応する残基
を有するα−ケト酸と２−オキソ酸からアミノトランス
フェラーゼを用いて製造する方法が知られている。アミ
ノトランスフェラーゼの立体識別能は一般に極めて高
く、光学純度の高いＬ−アミノ酸を得るために有用な方
法である。Ｌ−グルタミン酸やＬ−アスパラギン酸とい
った安価なＬ−アミノ酸をアミノ基の供与体として用い
ることが多いが、入手容易性（価格や物量等）、酵素反
応の効率、後工程での除去容易性等をあまり重要視しな
ければ、原理的には他のアミノ酸を用いることもでき
る。
アミノ酸のうち、Ｌ−体のものについては対応する残基
を有するα−ケト酸と２−オキソ酸からアミノトランス
フェラーゼを用いて製造する方法が知られている。アミ
ノトランスフェラーゼの立体識別能は一般に極めて高
く、光学純度の高いＬ−アミノ酸を得るために有用な方
法である。Ｌ−グルタミン酸やＬ−アスパラギン酸とい
った安価なＬ−アミノ酸をアミノ基の供与体として用い
ることが多いが、入手容易性（価格や物量等）、酵素反
応の効率、後工程での除去容易性等をあまり重要視しな
ければ、原理的には他のアミノ酸を用いることもでき
る。
【０００７】これに対し、２−オキソ酸は得ようとする
Ｌ−アミノ酸の残基に対応する。即ち、Ｌ−アラニンに
対してはピルビン酸（２−オキソプロピオン酸）、Ｌ−
アスパラギン酸に対してはオキザロ酢酸、Ｌ−グルタミ
ン酸に対しては２−オキソグルタル酸、Ｌ−フェニルア
ラニンに対しては３−フェニル−２−オキソプロピオン
酸がそれぞれ対応する。
Ｌ−アミノ酸の残基に対応する。即ち、Ｌ−アラニンに
対してはピルビン酸（２−オキソプロピオン酸）、Ｌ−
アスパラギン酸に対してはオキザロ酢酸、Ｌ−グルタミ
ン酸に対しては２−オキソグルタル酸、Ｌ−フェニルア
ラニンに対しては３−フェニル−２−オキソプロピオン
酸がそれぞれ対応する。
【０００８】アミノ基交換反応に関与している酵素群の
うち、生体内に存在するものについては、数多くの報告
がある。例えば微生物のアミノ酸生合成では、芳香族ア
ミノ酸のうちＬ−フェニルアラニンとＬ−チロシンにつ
いては共通の芳香族アミノトランスフェラーゼが働き、
Ｌ−グルタミン酸をアミノ供与体としてそれぞれ３−フ
ェニル−２−オキソプロピオン酸又は３−（ｐ−ヒドロ
キシフェニル）−２−オキソプロピオン酸から合成され
ることが知られている（この酵素の遺伝子は、大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においてはｔｙ
ｒＢと表記されている）。しかし、医薬品原料として有
用な非天然型Ｌ−アミノ酸を製造するために使用し得る
酵素についての報告はわずかしかない。
うち、生体内に存在するものについては、数多くの報告
がある。例えば微生物のアミノ酸生合成では、芳香族ア
ミノ酸のうちＬ−フェニルアラニンとＬ−チロシンにつ
いては共通の芳香族アミノトランスフェラーゼが働き、
Ｌ−グルタミン酸をアミノ供与体としてそれぞれ３−フ
ェニル−２−オキソプロピオン酸又は３−（ｐ−ヒドロ
キシフェニル）−２−オキソプロピオン酸から合成され
ることが知られている（この酵素の遺伝子は、大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においてはｔｙ
ｒＢと表記されている）。しかし、医薬品原料として有
用な非天然型Ｌ−アミノ酸を製造するために使用し得る
酵素についての報告はわずかしかない。
【０００９】例えば特開平６−１６５６８７号公報に
は、大腸菌Ｚ １１９６／９株の芳香族アミノトランス
フェラーゼがチエニルピルビン酸のエノール形態である
２−ヒドロキシ−３−チエニルアクリル酸を原料として
３−（２−チエニル）−Ｌ−アラニンを合成する触媒活
性を有することが開示されている。しかしながら同公報
によれば、反応を十分に進行させるために基質３０ｇに
対して６ｇ（乾燥重量）もの菌体量が必要であり、酵素
触媒としてはその使用量が極めて多いという重大な課題
がある。
は、大腸菌Ｚ １１９６／９株の芳香族アミノトランス
フェラーゼがチエニルピルビン酸のエノール形態である
２−ヒドロキシ−３−チエニルアクリル酸を原料として
３−（２−チエニル）−Ｌ−アラニンを合成する触媒活
性を有することが開示されている。しかしながら同公報
によれば、反応を十分に進行させるために基質３０ｇに
対して６ｇ（乾燥重量）もの菌体量が必要であり、酵素
触媒としてはその使用量が極めて多いという重大な課題
がある。
【００１０】この課題に対しては、酵素遺伝子（ｔｙｒ
Ｂ）を大腸菌の中で高度に発現させるような遺伝子操作
（例えば前記遺伝子をいったん単離し強力な転写プロモ
ーターによって読まれるような形でベクターＤＮＡにつ
なぎ換えてから大腸菌に戻すという操作等）を行なうこ
とが改善策として例示し得るが、この改善は酵素量をや
すという量的な改善に過ぎず、反応条件や付加価値の高
い非天然型基質に対応させるような質的な改善ではな
い。即ち、異なる酵素を用いるか、又は既存の酵素を蛋
白質工学の手法で改変し、所望の特性を付加又は強化す
るといった改善の必要がある。
Ｂ）を大腸菌の中で高度に発現させるような遺伝子操作
（例えば前記遺伝子をいったん単離し強力な転写プロモ
ーターによって読まれるような形でベクターＤＮＡにつ
なぎ換えてから大腸菌に戻すという操作等）を行なうこ
とが改善策として例示し得るが、この改善は酵素量をや
すという量的な改善に過ぎず、反応条件や付加価値の高
い非天然型基質に対応させるような質的な改善ではな
い。即ち、異なる酵素を用いるか、又は既存の酵素を蛋
白質工学の手法で改変し、所望の特性を付加又は強化す
るといった改善の必要がある。
【００１１】超好熱菌は安定性が高く、工業的に有用な
酵素を探索する上で貴重な生物資源である。実際にいく
つかの酵素については、同様の活性を有する中温菌由来
のものに比べて著しく高い耐熱性を有しており、温度ス
トレスはもとより、温度以外の種々の物理化学的なスト
レスにも耐性が高く、一般的には酵素が失活したり反応
が阻害されるような条件（例えば攪拌によって生じる強
い機械的衝撃や高濃度の基質などの存在下）でも反応を
し得るものと期待される。
酵素を探索する上で貴重な生物資源である。実際にいく
つかの酵素については、同様の活性を有する中温菌由来
のものに比べて著しく高い耐熱性を有しており、温度ス
トレスはもとより、温度以外の種々の物理化学的なスト
レスにも耐性が高く、一般的には酵素が失活したり反応
が阻害されるような条件（例えば攪拌によって生じる強
い機械的衝撃や高濃度の基質などの存在下）でも反応を
し得るものと期待される。
【００１２】超好熱菌に由来するアミノトランスフェラ
ーゼは既に公知の酵素である（例えばスルフォロバス・
ソルファタリカスの酵素（Ｍａｒｉｎｏ，Ｇ．ら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、１２３０５−１２３０
９、１９８８年）、サーモコッカス・リトラリスの酵素
（Ａｎｄｒｅｏｔｔｉ，Ｇ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．２２０、５４３−５４９、１９９４年）、パイ
ロコッカス・フリオサスの酵素（Ａｎｄｒｅｏｔｔｉ，
Ｇ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａ Ａｃｔａ １２４７、９０−９６、１９９５
年）、サーモコッカス・プロファンダスの酵素（Ｋｏｂ
ａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｔｈｅ ５ｔｈ Ａｎｎｉｖｅｒ
ｓａｒｙ Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｅｎｚｙｍｅ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ 要旨集２１−２６、１９９７
年）、パイロコッカス・ホリコシイの酵素（Ｍａｔｓｕ
ｉ，Ｉ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、４８７
１−４８７９、２０００年）。
ーゼは既に公知の酵素である（例えばスルフォロバス・
ソルファタリカスの酵素（Ｍａｒｉｎｏ，Ｇ．ら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、１２３０５−１２３０
９、１９８８年）、サーモコッカス・リトラリスの酵素
（Ａｎｄｒｅｏｔｔｉ，Ｇ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．２２０、５４３−５４９、１９９４年）、パイ
ロコッカス・フリオサスの酵素（Ａｎｄｒｅｏｔｔｉ，
Ｇ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａ Ａｃｔａ １２４７、９０−９６、１９９５
年）、サーモコッカス・プロファンダスの酵素（Ｋｏｂ
ａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｔｈｅ ５ｔｈ Ａｎｎｉｖｅｒ
ｓａｒｙ Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｅｎｚｙｍｅ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ 要旨集２１−２６、１９９７
年）、パイロコッカス・ホリコシイの酵素（Ｍａｔｓｕ
ｉ，Ｉ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、４８７
１−４８７９、２０００年）。
【００１３】これら超好熱菌の中で好気性であるものは
スルフォロバス・ソルファタリカスのみであるが、この
微生物の至適生育温度は８７℃であるが、報告されてい
る好気性超好熱古細菌の中で最も至適生育温度の高いも
のはエアロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ
ｐｅｒｎｉｘ、９５℃）であり、１００℃での生育が
可能である。従って該微生物に由来する酵素はさらに高
い耐熱性を有していることが期待される。実際に１００
℃を至適温度とするプロテアーゼがエアロパイラム・ペ
ルニクスより単離されており（Ｓａｋｏ，Ｙ．ら，ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔ．４１５、３２９−３３４、１９９７
年）、他の酵素についても工業的に有用な安定性を有し
ている可能性が高いが、アミノトランスフェラーゼにつ
いてはこれまでのところ報告されていない。従ってエア
ロパイラム・ペルニクスのアミノトランスフェラーゼの
全容はもとより、該酵素を非天然型Ｌ−アミノ酸の製造
に使用し得るのかどうかは一切不明である。
スルフォロバス・ソルファタリカスのみであるが、この
微生物の至適生育温度は８７℃であるが、報告されてい
る好気性超好熱古細菌の中で最も至適生育温度の高いも
のはエアロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ
ｐｅｒｎｉｘ、９５℃）であり、１００℃での生育が
可能である。従って該微生物に由来する酵素はさらに高
い耐熱性を有していることが期待される。実際に１００
℃を至適温度とするプロテアーゼがエアロパイラム・ペ
ルニクスより単離されており（Ｓａｋｏ，Ｙ．ら，ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔ．４１５、３２９−３３４、１９９７
年）、他の酵素についても工業的に有用な安定性を有し
ている可能性が高いが、アミノトランスフェラーゼにつ
いてはこれまでのところ報告されていない。従ってエア
ロパイラム・ペルニクスのアミノトランスフェラーゼの
全容はもとより、該酵素を非天然型Ｌ−アミノ酸の製造
に使用し得るのかどうかは一切不明である。
【００１４】エアロパイラム・ペルニクスのゲノムＤＮ
Ａの全塩基配列は１９９９年に通産省製品評価センター
がこれを公開しているが、該微生物は古細菌の中でもク
レンアーキオータ（Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）に属
し、大腸菌や枯草菌といったバクテリア（原核生物）は
もとよりパイロコッカス・ホリコシイやサーモコッカス
・プロファンダスといったユーリアーキオータ（Ｅｕｒ
ｙａｒｃｈａｅｏｔａ）に属する古細菌群とは分類学上
大きく離れており、塩基配列情報のみから所望のアミノ
トランスフェラーゼ遺伝子を特定することはできない。
さらに古細菌においては蛋白質の翻訳開始シグナルがＡ
ＴＧである場合に加えてＧＴＧである頻度が高いとされ
ており、このことが遺伝子／機能する蛋白質領域の特定
をさらに困難なものにしている。
Ａの全塩基配列は１９９９年に通産省製品評価センター
がこれを公開しているが、該微生物は古細菌の中でもク
レンアーキオータ（Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）に属
し、大腸菌や枯草菌といったバクテリア（原核生物）は
もとよりパイロコッカス・ホリコシイやサーモコッカス
・プロファンダスといったユーリアーキオータ（Ｅｕｒ
ｙａｒｃｈａｅｏｔａ）に属する古細菌群とは分類学上
大きく離れており、塩基配列情報のみから所望のアミノ
トランスフェラーゼ遺伝子を特定することはできない。
さらに古細菌においては蛋白質の翻訳開始シグナルがＡ
ＴＧである場合に加えてＧＴＧである頻度が高いとされ
ており、このことが遺伝子／機能する蛋白質領域の特定
をさらに困難なものにしている。
【００１５】そこで本発明は、従来提供されていないエ
アロパイラム・ペルニクスの耐熱性アミノトランスフェ
ラーゼ遺伝子を提供するとともに、該遺伝子によってコ
ードされるアミノトランスフェラーゼを用いる非天然型
Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供することを目的とするも
のである。
アロパイラム・ペルニクスの耐熱性アミノトランスフェ
ラーゼ遺伝子を提供するとともに、該遺伝子によってコ
ードされるアミノトランスフェラーゼを用いる非天然型
Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供することを目的とするも
のである。
【００１６】
【課題を解決する手段】本発明者らは、エアロパイラム
・ペルニクスの菌体抽出物を用いることにより、芳香族
非天然型アミノ酸の一種である３−（２−ナフチル）−
Ｌ−アラニンを、３−ナフチル−２−オキソプロピオン
酸とＬ−グルタミン酸との反応により生成することを知
見し、該知見に基づいて前記反応を触媒する酵素遺伝子
を探索した結果、エアロパイラム・ペルニクスの耐熱性
アミノトランスフェラーゼ遺伝子を見出し、本発明を完
成するに到った。
・ペルニクスの菌体抽出物を用いることにより、芳香族
非天然型アミノ酸の一種である３−（２−ナフチル）−
Ｌ−アラニンを、３−ナフチル−２−オキソプロピオン
酸とＬ−グルタミン酸との反応により生成することを知
見し、該知見に基づいて前記反応を触媒する酵素遺伝子
を探索した結果、エアロパイラム・ペルニクスの耐熱性
アミノトランスフェラーゼ遺伝子を見出し、本発明を完
成するに到った。
【００１７】すなわち本願請求項１の発明は、配列番号
１の塩基配列によってコードされる蛋白質又はその一部
のアミノ酸配列が欠失し、一部のアミノ酸残基が他のア
ミノ酸残基に置換され、他のアミノ酸残基が挿入され若
しくは他のアミノ酸残基が付加された蛋白質であって、
６０℃以上１１５℃以下の温度条件下においてアミノト
ランスフェラーゼ活性を有する蛋白質である。本願請求
項２の発明は、請求項１の発明に係り、前記蛋白質が実
質的にエアロパイラム属微生物に由来する他の蛋白質を
含まないことを特徴とする。
１の塩基配列によってコードされる蛋白質又はその一部
のアミノ酸配列が欠失し、一部のアミノ酸残基が他のア
ミノ酸残基に置換され、他のアミノ酸残基が挿入され若
しくは他のアミノ酸残基が付加された蛋白質であって、
６０℃以上１１５℃以下の温度条件下においてアミノト
ランスフェラーゼ活性を有する蛋白質である。本願請求
項２の発明は、請求項１の発明に係り、前記蛋白質が実
質的にエアロパイラム属微生物に由来する他の蛋白質を
含まないことを特徴とする。
【００１８】本願請求項３の発明は、配列番号１の塩基
配列又は配列番号１の塩基配列の一部からなるＤＮＡを
含む染色体外増殖性ＤＮＡであって、適切な宿主細胞に
導入することにより請求項１に記載の蛋白質を生産し得
る環状ＤＮＡである。
配列又は配列番号１の塩基配列の一部からなるＤＮＡを
含む染色体外増殖性ＤＮＡであって、適切な宿主細胞に
導入することにより請求項１に記載の蛋白質を生産し得
る環状ＤＮＡである。
【００１９】本願請求項４の発明は、配列番号１の塩基
配列又は配列番号１の塩基配列の一部からなるＤＮＡを
含む染色体外増殖性ＤＮＡであって、適切な宿主細胞に
導入することにより前記蛋白質を生産し得るＤＮＡによ
って形質転換された宿主細胞である。本願請求項５の発
明は、請求項４の発明に係り、前記宿主細胞が大腸菌Ｋ
１２株又はその誘導体であることを特徴とする。
配列又は配列番号１の塩基配列の一部からなるＤＮＡを
含む染色体外増殖性ＤＮＡであって、適切な宿主細胞に
導入することにより前記蛋白質を生産し得るＤＮＡによ
って形質転換された宿主細胞である。本願請求項５の発
明は、請求項４の発明に係り、前記宿主細胞が大腸菌Ｋ
１２株又はその誘導体であることを特徴とする。
【００２０】本願請求項６の発明は、配列番号１の塩基
配列によってコードされる蛋白質又はその一部のアミノ
酸配列が欠失し、一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残
基に置換され、他のアミノ酸残基が挿入され若しくは他
のアミノ酸残基が付加された蛋白質であって、６０℃以
上１１５℃以下の温度条件下においてアミノトランスフ
ェラーゼ活性を有する蛋白質を用い、前記式１における
Ｌ−アミノ酸（式中ａ）と２−オキソ酸（式中ｂ）から
Ｌ−アミノ酸（式中ｃ）を製造することを特徴とする、
Ｌ−アミノ酸の製造方法である。本願請求項７の発明
は、請求項６の発明に係り、前記式１における（ａ）の
Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸
又はＬ−アラニンのいずれかであることを特徴とする。
本願請求項８の発明は、前記式１における（ｂ）の２−
オキソ酸が３−アリール−２−オキソプロピオン酸であ
り、（ｃ）のＬ−アミノ酸が芳香族Ｌ−アミノ酸である
ことを特徴とする。本願請求項９の発明は、前記請求項
８の発明に係り、前記３−アリール−２−オキソプロピ
オン酸が３−（２−ナフチル）−２−オキソプロピオン
酸であり、前記芳香族Ｌ−アミノ酸が３−（２−ナフチ
ル）−Ｌ−アラニンであることを特徴とする。そして本
願請求項１０の発明は、請求項８の発明に係り、前記３
−アリール−２−オキソプロピオン酸が３−フェニル−
２−オキソプロピオン酸であり、前記芳香族Ｌ−アミノ
酸がＬ−フェニルアラニンであることを特徴とする。以
下、本発明を詳細に説明する。
配列によってコードされる蛋白質又はその一部のアミノ
酸配列が欠失し、一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残
基に置換され、他のアミノ酸残基が挿入され若しくは他
のアミノ酸残基が付加された蛋白質であって、６０℃以
上１１５℃以下の温度条件下においてアミノトランスフ
ェラーゼ活性を有する蛋白質を用い、前記式１における
Ｌ−アミノ酸（式中ａ）と２−オキソ酸（式中ｂ）から
Ｌ−アミノ酸（式中ｃ）を製造することを特徴とする、
Ｌ−アミノ酸の製造方法である。本願請求項７の発明
は、請求項６の発明に係り、前記式１における（ａ）の
Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸
又はＬ−アラニンのいずれかであることを特徴とする。
本願請求項８の発明は、前記式１における（ｂ）の２−
オキソ酸が３−アリール−２−オキソプロピオン酸であ
り、（ｃ）のＬ−アミノ酸が芳香族Ｌ−アミノ酸である
ことを特徴とする。本願請求項９の発明は、前記請求項
８の発明に係り、前記３−アリール−２−オキソプロピ
オン酸が３−（２−ナフチル）−２−オキソプロピオン
酸であり、前記芳香族Ｌ−アミノ酸が３−（２−ナフチ
ル）−Ｌ−アラニンであることを特徴とする。そして本
願請求項１０の発明は、請求項８の発明に係り、前記３
−アリール−２−オキソプロピオン酸が３−フェニル−
２−オキソプロピオン酸であり、前記芳香族Ｌ−アミノ
酸がＬ−フェニルアラニンであることを特徴とする。以
下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】配列番号１の塩基配列によってコードされ
る蛋白質は、本発明によって明らかになったエアロパイ
ラム・ペルニクスのアミノトランスフェラーゼであり、
より具体的には、後述するように配列番号５のアミノ酸
残基配列からなる蛋白質を含むものである。この塩基配
列、即ちエアロパイラム・ペルニクスのアミノトランス
フェラーゼをコードするＤＮＡは、エアロパイラム・ペ
ルニクス染色体ＤＮＡの特定の領域を異種遺伝子発現系
で発現しやすいように改変することによって得ることが
できる。より具体的には、例えば配列番号２及び配列番
号３のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、エ
アロパイラム・ペルニクスの染色体ＤＮＡを材料にＰＣ
Ｒ法を実施して特定領域のＤＮＡを増幅し、これを制限
酵素ＳａｃＩとＰｓｔＩで処理した後に配列番号４のオ
リゴヌクレオチドをその５’末端側に付加することによ
って得ることができる。ここで、配列番号４よりなるオ
リゴヌクレオチドの付加は、予めプラスミド上に該配列
を配置することによって達成することもできる。またこ
の配列番号４よりなるオリゴヌクレオチドは、その５’
末端に位置するＡＴＧ配列が翻訳開始メチオニンとして
認識されやすいように上記プラスミドと連結されている
ことが望ましい。
る蛋白質は、本発明によって明らかになったエアロパイ
ラム・ペルニクスのアミノトランスフェラーゼであり、
より具体的には、後述するように配列番号５のアミノ酸
残基配列からなる蛋白質を含むものである。この塩基配
列、即ちエアロパイラム・ペルニクスのアミノトランス
フェラーゼをコードするＤＮＡは、エアロパイラム・ペ
ルニクス染色体ＤＮＡの特定の領域を異種遺伝子発現系
で発現しやすいように改変することによって得ることが
できる。より具体的には、例えば配列番号２及び配列番
号３のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、エ
アロパイラム・ペルニクスの染色体ＤＮＡを材料にＰＣ
Ｒ法を実施して特定領域のＤＮＡを増幅し、これを制限
酵素ＳａｃＩとＰｓｔＩで処理した後に配列番号４のオ
リゴヌクレオチドをその５’末端側に付加することによ
って得ることができる。ここで、配列番号４よりなるオ
リゴヌクレオチドの付加は、予めプラスミド上に該配列
を配置することによって達成することもできる。またこ
の配列番号４よりなるオリゴヌクレオチドは、その５’
末端に位置するＡＴＧ配列が翻訳開始メチオニンとして
認識されやすいように上記プラスミドと連結されている
ことが望ましい。
【００２２】このような付加を行なうのは、ゲノムＤＮ
Ａの前記領域にあるＯＲＦ（オープン・リーディング・
フレーム）においては開始コドンが「ＧＴＧ」である可
能性があるからである。実際には、エアロパイラム・ペ
ルニクスにおいて開始コドンがＧＴＧであるか否かは不
明だが、ゲノム上でＯＲＦの５’末端として定義される
ＧＴＧの更に５’末端側の配列は大腸菌のリボゾーム結
合配列と相同性がなく、従って大腸菌での発現を期待で
きない。更に、これに続く翻訳開始候補配列である配列
番号２中のＡＴＧもまた、ゲノム上ではその５’末端側
において大腸菌での翻訳開始を指示する配列に連結され
ていない。従って、配列番号２及び３をプライマーＤＮ
ＡとしてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩ
とＰｓｔＩで処理した後、配列番号４である人工的な配
列をエアロパイラム・ペルニクスのゲノムＤＮＡにある
配列に連結させることにより融合蛋白質として発現させ
るように設計し、これらの配列を含む染色体外増殖性Ｄ
ＮＡを宿主大腸菌に導入することが、アミノトランスフ
ェラーゼ活性のある蛋白質を大量に製造するうえで好ま
しいのである。
Ａの前記領域にあるＯＲＦ（オープン・リーディング・
フレーム）においては開始コドンが「ＧＴＧ」である可
能性があるからである。実際には、エアロパイラム・ペ
ルニクスにおいて開始コドンがＧＴＧであるか否かは不
明だが、ゲノム上でＯＲＦの５’末端として定義される
ＧＴＧの更に５’末端側の配列は大腸菌のリボゾーム結
合配列と相同性がなく、従って大腸菌での発現を期待で
きない。更に、これに続く翻訳開始候補配列である配列
番号２中のＡＴＧもまた、ゲノム上ではその５’末端側
において大腸菌での翻訳開始を指示する配列に連結され
ていない。従って、配列番号２及び３をプライマーＤＮ
ＡとしてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩ
とＰｓｔＩで処理した後、配列番号４である人工的な配
列をエアロパイラム・ペルニクスのゲノムＤＮＡにある
配列に連結させることにより融合蛋白質として発現させ
るように設計し、これらの配列を含む染色体外増殖性Ｄ
ＮＡを宿主大腸菌に導入することが、アミノトランスフ
ェラーゼ活性のある蛋白質を大量に製造するうえで好ま
しいのである。
【００２３】上記ようにプラスミドベクターに組み込ん
だＤＮＡは、例えば、配列番号５で示したように４０８
アミノ酸残基からなる蛋白質をコードするＤＮＡであ
る。配列番号５の蛋白質においては、Ｎ末端から５アミ
ノ酸残基に渡って人工的な配列が付加されており、それ
よりＣ末端側に４０３アミノ酸残基に渡ってエアロパイ
ラム・ペルニクスのゲノムＤＮＡがコードする部分が続
いている。このように本発明の蛋白質は、具体的に配列
番号１の塩基配列によってコードされる蛋白質（具体的
には、例えば配列番号５のＮ末端６番目から４０８番目
までのアミノ酸残基からなる蛋白質）を含むものであ
る。また本発明の蛋白質は、これら具体的なアミノ酸残
基配列中の一部のアミノ酸残基が欠失した誘導体、一部
のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された誘導
体、そして他のアミノ酸残基がいずれかの部位に挿入又
は付加された蛋白質を含むものである。
だＤＮＡは、例えば、配列番号５で示したように４０８
アミノ酸残基からなる蛋白質をコードするＤＮＡであ
る。配列番号５の蛋白質においては、Ｎ末端から５アミ
ノ酸残基に渡って人工的な配列が付加されており、それ
よりＣ末端側に４０３アミノ酸残基に渡ってエアロパイ
ラム・ペルニクスのゲノムＤＮＡがコードする部分が続
いている。このように本発明の蛋白質は、具体的に配列
番号１の塩基配列によってコードされる蛋白質（具体的
には、例えば配列番号５のＮ末端６番目から４０８番目
までのアミノ酸残基からなる蛋白質）を含むものであ
る。また本発明の蛋白質は、これら具体的なアミノ酸残
基配列中の一部のアミノ酸残基が欠失した誘導体、一部
のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された誘導
体、そして他のアミノ酸残基がいずれかの部位に挿入又
は付加された蛋白質を含むものである。
【００２４】上記のＤＮＡを組み込んだプラスミドベク
ターで適切な宿主細胞を形質転換し、形質転換宿主を培
養することによって製造される本発明の蛋白質は、実質
的にエアロパイラム属微生物に由来する他の蛋白質を含
まない、という特徴を有するものである。プラスミドベ
クターの構築から形質転換宿主細胞の培養、そして蛋白
質の発現に至る操作は遺伝子工学の分野における常法を
採用することができ、プラスミドの種類、宿主細胞の選
択、蛋白質の発現等は適宜実施可能である。例えば、染
色体外増殖性であるプラスミドベクターとしては、ｐＵ
Ｃ１８／１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４等を例
示することができる。また宿主細胞としては、例えば大
腸菌Ｋ１２株や、その誘導体であるＨＢ１０１、ＪＭ１
０９等を例示できる。
ターで適切な宿主細胞を形質転換し、形質転換宿主を培
養することによって製造される本発明の蛋白質は、実質
的にエアロパイラム属微生物に由来する他の蛋白質を含
まない、という特徴を有するものである。プラスミドベ
クターの構築から形質転換宿主細胞の培養、そして蛋白
質の発現に至る操作は遺伝子工学の分野における常法を
採用することができ、プラスミドの種類、宿主細胞の選
択、蛋白質の発現等は適宜実施可能である。例えば、染
色体外増殖性であるプラスミドベクターとしては、ｐＵ
Ｃ１８／１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４等を例
示することができる。また宿主細胞としては、例えば大
腸菌Ｋ１２株や、その誘導体であるＨＢ１０１、ＪＭ１
０９等を例示できる。
【００２５】前記した本発明の蛋白質は、６０℃以上１
１５℃以下という広い温度条件下でアミノトランスフェ
ラーゼ活性を発現し得るものである。例えば配列番号１
の塩基配列によってコードされる蛋白質では、９５℃に
おける活性半減期が約３０時間と極めて長時間である。
このように高い好熱性と耐熱性を有することにより、一
般的な酵素が失活したり反応が阻害されるような温度以
外の条件、例えば攪拌によって生じる強い機械的衝撃や
高濃度の基質などの存在下等においても、高い耐性が期
待できる。
１５℃以下という広い温度条件下でアミノトランスフェ
ラーゼ活性を発現し得るものである。例えば配列番号１
の塩基配列によってコードされる蛋白質では、９５℃に
おける活性半減期が約３０時間と極めて長時間である。
このように高い好熱性と耐熱性を有することにより、一
般的な酵素が失活したり反応が阻害されるような温度以
外の条件、例えば攪拌によって生じる強い機械的衝撃や
高濃度の基質などの存在下等においても、高い耐性が期
待できる。
【００２６】本発明の蛋白質は、天然型アミノ酸である
Ｌ−フェニルアラニンを生成する活性と、それとほぼ同
等の、非天然型アミノ酸の３−（２−ナフチル）−Ｌ−
アラニンを生成する活性を有している。そこで、本発明
の蛋白質を使用することにより、前記式１のように、Ｌ
−アミノ酸（式中ａ）と２−オキソ酸（式中ｂ）からＬ
−アミノ酸（式中ｃ）を製造することができる。例えば
式１における（ａ）のＬ−アミノ酸としてＬ−グルタミ
ン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニンのいずれかを
用い、式１における（ｃ）のＬ−アミノ酸を製造するこ
とが可能である。
Ｌ−フェニルアラニンを生成する活性と、それとほぼ同
等の、非天然型アミノ酸の３−（２−ナフチル）−Ｌ−
アラニンを生成する活性を有している。そこで、本発明
の蛋白質を使用することにより、前記式１のように、Ｌ
−アミノ酸（式中ａ）と２−オキソ酸（式中ｂ）からＬ
−アミノ酸（式中ｃ）を製造することができる。例えば
式１における（ａ）のＬ−アミノ酸としてＬ−グルタミ
ン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニンのいずれかを
用い、式１における（ｃ）のＬ−アミノ酸を製造するこ
とが可能である。
【００２７】また、式１における（ｂ）の２−オキソ酸
として３−アリール−２−オキソプロピオン酸を用いる
ことにより、（ｃ）として芳香族Ｌ−アミノ酸を製造す
ることもできる。ここで３−アリール−２−オキソプロ
ピオン酸として、具体的に、３−（２−ナフチル）−２
−オキソプロピオン酸を用いることにより、３−（２−
ナフチル）−Ｌ−アラニンを製造できる。また３−アリ
ール−２−オキソプロピオン酸として具体的に３−フェ
ニル−２−オキソプロピオン酸を用いることにより、Ｌ
−フェニルアラニンを製造できる。
として３−アリール−２−オキソプロピオン酸を用いる
ことにより、（ｃ）として芳香族Ｌ−アミノ酸を製造す
ることもできる。ここで３−アリール−２−オキソプロ
ピオン酸として、具体的に、３−（２−ナフチル）−２
−オキソプロピオン酸を用いることにより、３−（２−
ナフチル）−Ｌ−アラニンを製造できる。また３−アリ
ール−２−オキソプロピオン酸として具体的に３−フェ
ニル−２−オキソプロピオン酸を用いることにより、Ｌ
−フェニルアラニンを製造できる。
【００２８】
【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明を更に
詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。
詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。
【００２９】実施例１ エアロパイラム・ペルニクスの
培養 培地（マリンブロス２２１６、Ｄｉｆｃｏ社（製））を
１リットル容のメジュームビンに３７．４ｇ取り、純水
１リットルを加えて溶解して、１２０℃で１０分間の加
圧滅菌処理した。この培地７００ｍｌに、除菌フィルタ
ーを通した１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液を１０ｍｌ
（終濃度０．１％）を加え、これにエアロパイラム・ペ
ルニクスＪＣＭ９８２０株を接種し、好気性環境下、９
０℃で約２４時間培養を行なった。
培養 培地（マリンブロス２２１６、Ｄｉｆｃｏ社（製））を
１リットル容のメジュームビンに３７．４ｇ取り、純水
１リットルを加えて溶解して、１２０℃で１０分間の加
圧滅菌処理した。この培地７００ｍｌに、除菌フィルタ
ーを通した１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液を１０ｍｌ
（終濃度０．１％）を加え、これにエアロパイラム・ペ
ルニクスＪＣＭ９８２０株を接種し、好気性環境下、９
０℃で約２４時間培養を行なった。
【００３０】実施例２ エアロパイラム・ペルニクス菌
体抽出液の酵素活性 培養終了後、室温まで培養液を冷却し、菌体を遠心分離
で集めて秤量し（約０．１５ｇ）、これを０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌに懸濁した。この懸
濁液を超音波破砕機にかけて菌体を破砕し、１２０００
回転、２０分の遠心分離によって不溶性画分を除去して
菌体抽出液約１ｍｌを得た。この抽出液を用い、１０ｍ
Ｍの３−（２−ナフチル）−２−オキソプロピオン酸及
び１０ｍＭのＬ−グルタミン酸を基質として、７０℃、
ｐＨ７．１という条件下で反応を行った場合、１分間に
約０．９μｍｏｌの３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニ
ンを生成する活性を有していた。
体抽出液の酵素活性 培養終了後、室温まで培養液を冷却し、菌体を遠心分離
で集めて秤量し（約０．１５ｇ）、これを０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌに懸濁した。この懸
濁液を超音波破砕機にかけて菌体を破砕し、１２０００
回転、２０分の遠心分離によって不溶性画分を除去して
菌体抽出液約１ｍｌを得た。この抽出液を用い、１０ｍ
Ｍの３−（２−ナフチル）−２−オキソプロピオン酸及
び１０ｍＭのＬ−グルタミン酸を基質として、７０℃、
ｐＨ７．１という条件下で反応を行った場合、１分間に
約０．９μｍｏｌの３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニ
ンを生成する活性を有していた。
【００３１】実施例３ エアロパイラム・ペルニクス染
色体ＤＮＡの調製 実施例１で得られた培養液から実施例２と同様に菌体を
集め（約０．２３ｇ）、これを１ｍｌのＴＮＥ緩衝液
（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍ
ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。これに１０
％ＳＤＳを０．１ｍｌ加えて室温に１０分間静置し、溶
菌させた。
色体ＤＮＡの調製 実施例１で得られた培養液から実施例２と同様に菌体を
集め（約０．２３ｇ）、これを１ｍｌのＴＮＥ緩衝液
（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍ
ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。これに１０
％ＳＤＳを０．１ｍｌ加えて室温に１０分間静置し、溶
菌させた。
【００３２】これに水相と等容のフェノール−クロロフ
ォルム（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌで飽和）を加えて穏
やかに攪拌し、遠心操作によって水相を回収した。この
操作を５回繰り返した後、水相と等容のクロロフォルム
による抽出を２回行なった。得られた水相に２．５容の
エタノールを加え、室温で５分間静置した後、遠心によ
って核酸を回収した。沈殿を７０％エタノールで洗浄し
た後、再度遠心して核酸をペレットとして回収し、これ
を４００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解した。
ォルム（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌで飽和）を加えて穏
やかに攪拌し、遠心操作によって水相を回収した。この
操作を５回繰り返した後、水相と等容のクロロフォルム
による抽出を２回行なった。得られた水相に２．５容の
エタノールを加え、室温で５分間静置した後、遠心によ
って核酸を回収した。沈殿を７０％エタノールで洗浄し
た後、再度遠心して核酸をペレットとして回収し、これ
を４００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解した。
【００３３】この溶液に１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ
（あらかじめＤＮａｓｅを熱処理により除去）を最終濃
度５０μｇ／ｍｌになるように２μｌ加え、３７℃で１
時間保温した。これに２０％ＰＥＧ６０００／２．５Ｍ
ＮａＣｌを２４０μｌ加えてから０℃で２時間静置し
た。これを４℃で遠心し、ペレットを７０％エタノール
で洗浄して再度遠心した。得られたペレットを乾固させ
た後４００μｌのＴＥ緩衝液に溶解してＤＮＡ標品とし
た。これにより７７μｇのＤＮＡが回収された。
（あらかじめＤＮａｓｅを熱処理により除去）を最終濃
度５０μｇ／ｍｌになるように２μｌ加え、３７℃で１
時間保温した。これに２０％ＰＥＧ６０００／２．５Ｍ
ＮａＣｌを２４０μｌ加えてから０℃で２時間静置し
た。これを４℃で遠心し、ペレットを７０％エタノール
で洗浄して再度遠心した。得られたペレットを乾固させ
た後４００μｌのＴＥ緩衝液に溶解してＤＮＡ標品とし
た。これにより７７μｇのＤＮＡが回収された。
【００３４】実施例４ ＰＣＲによる特異的ＤＮＡ配列
の増幅 実施例２で得られた染色体ＤＮＡを鋳型として特定の配
列をもつＤＮＡを以下の手順により増幅した。まずプラ
イマーとしては、増幅させようとするＤＮＡ配列に相当
する配列を２５塩基前後含み、かつその５’側に適当な
制限酵素認識配列と、さらにその５’側に２ないし４塩
基の余分な配列を持つように設計した。この余分な配列
は制限酵素が効率的に働くことを助けるものであり、そ
の配列と長さは用いる制限酵素によって異なる。Ｓａｃ
ＩについてはＡＴＣＣなる４塩基、ＰｓｔＩについては
ＡＡよりなる２塩基が付加することにより制限酵素が十
分に切断活性をもつことが知られているので（ＮＥＢ社
カタログ）、これを用いることにした。すなわち配列番
号３及び配列番号４よりなるＤＮＡ配列をプライマーと
することに決定し、これらのオリゴヌクレオチドを常法
により合成した。
の増幅 実施例２で得られた染色体ＤＮＡを鋳型として特定の配
列をもつＤＮＡを以下の手順により増幅した。まずプラ
イマーとしては、増幅させようとするＤＮＡ配列に相当
する配列を２５塩基前後含み、かつその５’側に適当な
制限酵素認識配列と、さらにその５’側に２ないし４塩
基の余分な配列を持つように設計した。この余分な配列
は制限酵素が効率的に働くことを助けるものであり、そ
の配列と長さは用いる制限酵素によって異なる。Ｓａｃ
ＩについてはＡＴＣＣなる４塩基、ＰｓｔＩについては
ＡＡよりなる２塩基が付加することにより制限酵素が十
分に切断活性をもつことが知られているので（ＮＥＢ社
カタログ）、これを用いることにした。すなわち配列番
号３及び配列番号４よりなるＤＮＡ配列をプライマーと
することに決定し、これらのオリゴヌクレオチドを常法
により合成した。
【００３５】ＰＣＲ反応は市販の酵素（Ｐｙｒｏｂｅｓ
ｔＤＮＡポリメラーゼ、商品名、宝酒造（株）製）を用
い、以下の手順で行なった。すなわち１０×Ｐｙｒｏｂ
ｅｓｔ緩衝液（商品名、宝酒造（株）製）を１０μｌ、
各２．５ｍＭになるように調製されたｄＮＴＰ混合溶液
を８μｌ、鋳型となる染色体ＤＮＡ標品を２４０ｎｇ、
上記プライマーＤＮＡを各々１００ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏ
ｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（商品名、宝酒造（株）
製）を０．５μｌ加えて、全量を１００μｌとした。市
販の装置（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ、Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ製）を用いて、「９４℃・２０秒、６０
℃・６０秒、７２℃・１２０秒」のサイクルを３０回繰
り返し、その後７２℃、１０分の伸長反応を行なって終
了させた。その一部を０．８％アガロースで分析するこ
とにより、約１．３ｋｂｐのＤＮＡが特異的に増幅され
ていることが観察された。この反応によって得られたＤ
ＮＡ量は約１０μｇであった。
ｔＤＮＡポリメラーゼ、商品名、宝酒造（株）製）を用
い、以下の手順で行なった。すなわち１０×Ｐｙｒｏｂ
ｅｓｔ緩衝液（商品名、宝酒造（株）製）を１０μｌ、
各２．５ｍＭになるように調製されたｄＮＴＰ混合溶液
を８μｌ、鋳型となる染色体ＤＮＡ標品を２４０ｎｇ、
上記プライマーＤＮＡを各々１００ｐｍｏｌ、Ｐｙｒｏ
ｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（商品名、宝酒造（株）
製）を０．５μｌ加えて、全量を１００μｌとした。市
販の装置（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ、Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ製）を用いて、「９４℃・２０秒、６０
℃・６０秒、７２℃・１２０秒」のサイクルを３０回繰
り返し、その後７２℃、１０分の伸長反応を行なって終
了させた。その一部を０．８％アガロースで分析するこ
とにより、約１．３ｋｂｐのＤＮＡが特異的に増幅され
ていることが観察された。この反応によって得られたＤ
ＮＡ量は約１０μｇであった。
【００３６】実施例５ 組換え大腸菌の作製 実施例４で得られたＤＮＡを常法に従いフェノール−ク
ロロフォルム（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌで飽和）抽出
で除タンパクし、次いでクロロフォルムによる抽出を行
なった。エタノール沈殿により回収したＤＮＡのうち６
μｇに４０ＵのＳａｃＩと６０ＵのＰｓｔＩによる酵素
消化を各々３７℃で２時間行なった。一方、５μｇのプ
ラスミドｐＵＫ０２−Ａ３（特開平３−１５５７８８号
参照）ＤＮＡを用いて、これを同様に４０ＵのＳａｃＩ
と６０ＵのＰｓｔＩで各々３７℃で２時間酵素消化を行
なった。こうして得られた両方の酵素消化物を０．８％
アガロースで電気泳動させ、ゲルから常法により抽出し
て各ＤＮＡ断片を精製した。
ロロフォルム（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌで飽和）抽出
で除タンパクし、次いでクロロフォルムによる抽出を行
なった。エタノール沈殿により回収したＤＮＡのうち６
μｇに４０ＵのＳａｃＩと６０ＵのＰｓｔＩによる酵素
消化を各々３７℃で２時間行なった。一方、５μｇのプ
ラスミドｐＵＫ０２−Ａ３（特開平３−１５５７８８号
参照）ＤＮＡを用いて、これを同様に４０ＵのＳａｃＩ
と６０ＵのＰｓｔＩで各々３７℃で２時間酵素消化を行
なった。こうして得られた両方の酵素消化物を０．８％
アガロースで電気泳動させ、ゲルから常法により抽出し
て各ＤＮＡ断片を精製した。
【００３７】次に前記ｐＵＫ０２−Ａ３由来の４ｋｂｐ
断片とＰＣＲ産物の１．３ｋｂｐ断片を等モル混合し、
ライゲーション反応に供した。反応物を常法に従って大
腸菌ＨＢ１０１に導入した。形質転換菌は５０μｇ／ｍ
ｌのカルベニシリンを含む寒天培地で選択し、生じたコ
ロニーからプラスミドを常法によって抽出、分析するこ
とにより、約１．３ｋｂｐのＳａｃＩ−ＰｓｔＩ挿入断
片を有するプラスミドを保有する菌株を同定した。これ
をＨＢ１０１／ｐＡＰＡＴ１と呼び、以下の実験に供し
た。
断片とＰＣＲ産物の１．３ｋｂｐ断片を等モル混合し、
ライゲーション反応に供した。反応物を常法に従って大
腸菌ＨＢ１０１に導入した。形質転換菌は５０μｇ／ｍ
ｌのカルベニシリンを含む寒天培地で選択し、生じたコ
ロニーからプラスミドを常法によって抽出、分析するこ
とにより、約１．３ｋｂｐのＳａｃＩ−ＰｓｔＩ挿入断
片を有するプラスミドを保有する菌株を同定した。これ
をＨＢ１０１／ｐＡＰＡＴ１と呼び、以下の実験に供し
た。
【００３８】実施例６ 塩基配列の決定 実施例５で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１／ｐＡＰＡ
Ｔ１よりプラスミドｐＡＰＡＴ１を常法に従って調製
し、前記ｐＵＫ０２−Ａ３のＳａｃＩ−ＰｓｔＩ部位に
挿入された塩基配列及びＳａｃＩ部位の５’末端側（挿
入遺伝子の上流側）をジデオキヌクレオチド鎖終結法に
よって決定した結果、配列番号５の配列が含まれてい
た。
Ｔ１よりプラスミドｐＡＰＡＴ１を常法に従って調製
し、前記ｐＵＫ０２−Ａ３のＳａｃＩ−ＰｓｔＩ部位に
挿入された塩基配列及びＳａｃＩ部位の５’末端側（挿
入遺伝子の上流側）をジデオキヌクレオチド鎖終結法に
よって決定した結果、配列番号５の配列が含まれてい
た。
【００３９】実施例７ 酵素の調製 実施例５で得られた組換え大腸菌ＨＢ１０１／ｐＡＰＡ
Ｔ１を２００ｍｌ容のバッフル付き３角フラスコを用い
５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地（１％
バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキストラ
クト、０．５％ＮａＣｌ）４０ｍｌで３７℃で１５時間
振とう培養を行った。この培養液３０ｍｌを５０μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含むＴＧ培地（５％トリプチケー
スペプトン、３．５％グリセロール、０．７％リン酸２
ナトリウム０、０．３％リン酸１カリウム、０．１％塩
化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０７
４％硫酸マグネシウム７水和物、０．００７３２％硫酸
第一鉄７水和物、０．００４３６％塩化カルシウム２水
和物、ｐＨ７．２）３リットルに植菌し、５リットル容
の発酵槽を用いて３７℃で培養を行った。培養液のＯＤ
６００の吸光度が約１．０になった時点で終濃度が０．
５ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガ
ラクトピラノシド）を加えさらに約１６時間培養した。
この培養物を常法に従って菌体を集めると２１９ｇであ
った。集めた菌体を５００ｍｌの５０ｍＭのトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．８）で洗浄後、同じ緩衝液５００ｍ
ｌで再度懸濁し、超音波で菌体の破砕を行った。この菌
体破砕物にピリドキサールリン酸を１ｍＭの濃度になる
よう加え、７０℃の湯浴にて３０分間浸し熱処理を行っ
た。生じた沈殿物を遠心分離により除去し、上清を回収
した。得られた上清に等量の冷アセトンを０℃にてゆっ
くり添加し、生じた沈殿を遠心分離により回収した。こ
の沈殿物を１００ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）に溶解し、８０℃の湯浴にて２０分間浸
し生じた沈殿を遠心分離により除去し、上清を回収し
た。得られた上清を分画分子量１２０００〜１４０００
の膜にて一晩透析（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．８））を行い、市販のゲル（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌ、商品名、東ソー（株）製）により分画を行
い、ＳＤＳ−ポリクリルアミドゲル電気泳動による分析
にてほぼ単一な成分の画分を回収し、酵素化学的特性評
価用の標品とした。
Ｔ１を２００ｍｌ容のバッフル付き３角フラスコを用い
５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ培地（１％
バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキストラ
クト、０．５％ＮａＣｌ）４０ｍｌで３７℃で１５時間
振とう培養を行った。この培養液３０ｍｌを５０μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含むＴＧ培地（５％トリプチケー
スペプトン、３．５％グリセロール、０．７％リン酸２
ナトリウム０、０．３％リン酸１カリウム、０．１％塩
化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０７
４％硫酸マグネシウム７水和物、０．００７３２％硫酸
第一鉄７水和物、０．００４３６％塩化カルシウム２水
和物、ｐＨ７．２）３リットルに植菌し、５リットル容
の発酵槽を用いて３７℃で培養を行った。培養液のＯＤ
６００の吸光度が約１．０になった時点で終濃度が０．
５ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガ
ラクトピラノシド）を加えさらに約１６時間培養した。
この培養物を常法に従って菌体を集めると２１９ｇであ
った。集めた菌体を５００ｍｌの５０ｍＭのトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．８）で洗浄後、同じ緩衝液５００ｍ
ｌで再度懸濁し、超音波で菌体の破砕を行った。この菌
体破砕物にピリドキサールリン酸を１ｍＭの濃度になる
よう加え、７０℃の湯浴にて３０分間浸し熱処理を行っ
た。生じた沈殿物を遠心分離により除去し、上清を回収
した。得られた上清に等量の冷アセトンを０℃にてゆっ
くり添加し、生じた沈殿を遠心分離により回収した。こ
の沈殿物を１００ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）に溶解し、８０℃の湯浴にて２０分間浸
し生じた沈殿を遠心分離により除去し、上清を回収し
た。得られた上清を分画分子量１２０００〜１４０００
の膜にて一晩透析（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．８））を行い、市販のゲル（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌ、商品名、東ソー（株）製）により分画を行
い、ＳＤＳ−ポリクリルアミドゲル電気泳動による分析
にてほぼ単一な成分の画分を回収し、酵素化学的特性評
価用の標品とした。
【００４０】実施例８ ３−（２−ナフチル）−２−オ
キソプロピオン酸の合成 ３−（２−ナフチル）−２−オキソプロピオン酸は２−
ナフトアルデヒド及びヒダントインを原料とする方法に
より合成した。即ち２−ナフトアルデヒド６．２７ｇ
（４０．２ｍｍｏｌ）とヒダントイン４．００ｇ（４
０．０ｍｍｏｌ）を、２５％アンモニア水３ｍｌを含む
メタノール１０ｍｌに懸濁し、密栓して１２０℃６時間
加熱を行い、５−（２−ナフチル）メチレンヒダントイ
ン８．８５ｇ（３７．２ｍｍｏｌ）を収率９３．０％で
得た。この化合物を３当量の苛性ソーダ存在下、水にて
溶解し、９０℃５時間加水分解した後、濃塩酸を加えて
酸性とした。次いでエーテルで抽出を行った後、減圧濃
縮し、ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒より再結晶さ
せ、結晶化した標品を得た。
キソプロピオン酸の合成 ３−（２−ナフチル）−２−オキソプロピオン酸は２−
ナフトアルデヒド及びヒダントインを原料とする方法に
より合成した。即ち２−ナフトアルデヒド６．２７ｇ
（４０．２ｍｍｏｌ）とヒダントイン４．００ｇ（４
０．０ｍｍｏｌ）を、２５％アンモニア水３ｍｌを含む
メタノール１０ｍｌに懸濁し、密栓して１２０℃６時間
加熱を行い、５−（２−ナフチル）メチレンヒダントイ
ン８．８５ｇ（３７．２ｍｍｏｌ）を収率９３．０％で
得た。この化合物を３当量の苛性ソーダ存在下、水にて
溶解し、９０℃５時間加水分解した後、濃塩酸を加えて
酸性とした。次いでエーテルで抽出を行った後、減圧濃
縮し、ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒より再結晶さ
せ、結晶化した標品を得た。
【００４１】得られた３−（２−ナフチル）−２−オキ
ソプロピオン酸についてＮＭＲ（商品名；ＶＸＲ５００
Ｓ、Ｖａｒｉａｎ製）によって分析した結果は以下の通
りである。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） δｐｐｍ
６．５６（Ｓ，１Ｈ）、７．４６〜７．５１（ｍ，２
Ｈ）、７．８５〜７．９４（ｍ，４Ｈ）、８．２８
（ｓ，１Ｈ）、９．５６（ｂｒｏａｄ，１Ｈ）。
ソプロピオン酸についてＮＭＲ（商品名；ＶＸＲ５００
Ｓ、Ｖａｒｉａｎ製）によって分析した結果は以下の通
りである。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） δｐｐｍ
６．５６（Ｓ，１Ｈ）、７．４６〜７．５１（ｍ，２
Ｈ）、７．８５〜７．９４（ｍ，４Ｈ）、８．２８
（ｓ，１Ｈ）、９．５６（ｂｒｏａｄ，１Ｈ）。
【００４２】前記結晶０．４２８ｇ（２ｍｍｏｌ）を
０．２Ｎ苛性ソーダ水溶液１０ｍｌに懸濁した後、７０
℃で加熱し、更に２Ｎ苛性ソーダ水溶液を数滴加えて完
全に溶解し、ナトリウム塩として使用した。
０．２Ｎ苛性ソーダ水溶液１０ｍｌに懸濁した後、７０
℃で加熱し、更に２Ｎ苛性ソーダ水溶液を数滴加えて完
全に溶解し、ナトリウム塩として使用した。
【００４３】実施例９ 酵素活性の測定 実施例８で調製した１０ｍＭの３−ナフチル−２−オキ
ソプロピオン酸ナトリウム及び１０ｍＭのＬ−グルタミ
ン酸ナトリウム・１水和物を含む０．１Ｍのリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）中７０℃５分間保温し酵素反
応を行い、等量の１Ｎ酢酸水溶液を加え反応を停止させ
た。この溶液の一部を取り、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＴＳｋ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ、商品名、東ソ
ー（株）製を使用）によって生成した３−（２−ナフチ
ル）−Ｌ−アラニンを定量した。溶離液として０．１４
Ｍ酢酸ナトリウム−０．５％トリエチルアミン（ｐＨ
６．３５）を用い、アセトニトリルの直線濃度勾配で溶
出させ、２５４ｎｍでの吸光度で検出した。１分間に１
μｍｏｌｅの３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニンを生
成する活性を１Ｕとした場合、実施例７の培養液１ｍｌ
当たり酵素溶液は８．７７Ｕであった。
ソプロピオン酸ナトリウム及び１０ｍＭのＬ−グルタミ
ン酸ナトリウム・１水和物を含む０．１Ｍのリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）中７０℃５分間保温し酵素反
応を行い、等量の１Ｎ酢酸水溶液を加え反応を停止させ
た。この溶液の一部を取り、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＴＳｋ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ、商品名、東ソ
ー（株）製を使用）によって生成した３−（２−ナフチ
ル）−Ｌ−アラニンを定量した。溶離液として０．１４
Ｍ酢酸ナトリウム−０．５％トリエチルアミン（ｐＨ
６．３５）を用い、アセトニトリルの直線濃度勾配で溶
出させ、２５４ｎｍでの吸光度で検出した。１分間に１
μｍｏｌｅの３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニンを生
成する活性を１Ｕとした場合、実施例７の培養液１ｍｌ
当たり酵素溶液は８．７７Ｕであった。
【００４４】次いで、１０ｍＭの３−フェニル−２−オ
キソプロピオン酸ナトリウム・１水和物（ナカライテス
ク社製）及び１０ｍＭのＬ−グルタミン酸ナトリウム・
１水和物を含む０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）中７０℃５分間保温し酵素反応を行い、等量の
１Ｎ酢酸水溶液を加え反応を停止させた。この溶液の一
部を取り、高速液体クロマトグラフィー（ＴＳｋ−ｇｅ
ｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ、商品名、東ソー（株）製を使
用）によって生成したＬ−フェニルアラニンを定量し
た。溶離液として０．１４Ｍ酢酸ナトリウム−０．５％
トリエチルアミン（ｐＨ６．３５）を用い、アセトニト
リルの直線濃度勾配で溶出させ、２５４ｎｍでの吸光度
で検出した。１分間に１μｍｏｌｅのＬ−フェニルアラ
ニンを生成する活性を１Ｕとした場合、実施例７の培養
液１ｍｌ当たり酵素溶液は１１．９Ｕであった。
キソプロピオン酸ナトリウム・１水和物（ナカライテス
ク社製）及び１０ｍＭのＬ−グルタミン酸ナトリウム・
１水和物を含む０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）中７０℃５分間保温し酵素反応を行い、等量の
１Ｎ酢酸水溶液を加え反応を停止させた。この溶液の一
部を取り、高速液体クロマトグラフィー（ＴＳｋ−ｇｅ
ｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ、商品名、東ソー（株）製を使
用）によって生成したＬ−フェニルアラニンを定量し
た。溶離液として０．１４Ｍ酢酸ナトリウム−０．５％
トリエチルアミン（ｐＨ６．３５）を用い、アセトニト
リルの直線濃度勾配で溶出させ、２５４ｎｍでの吸光度
で検出した。１分間に１μｍｏｌｅのＬ−フェニルアラ
ニンを生成する活性を１Ｕとした場合、実施例７の培養
液１ｍｌ当たり酵素溶液は１１．９Ｕであった。
【００４５】実施例１０ 酵素活性の温度プロファイル 実施例９に記載した酵素反応を６０、７０、８０、９
０、１００℃の各温度で行い、温度による活性の変化を
図２に示した。またセプタムキャップ付きのバイアルを
反応容器に用いて８０、９０、１００、１０５、１１
０、１１５℃の各温度で同様に酵素反応を行ない、温度
による活性の変化を図３に示した。その結果本酵素は１
００℃以上の温度においても高い活性を有し、１０５℃
での活性が最も高かった。
０、１００℃の各温度で行い、温度による活性の変化を
図２に示した。またセプタムキャップ付きのバイアルを
反応容器に用いて８０、９０、１００、１０５、１１
０、１１５℃の各温度で同様に酵素反応を行ない、温度
による活性の変化を図３に示した。その結果本酵素は１
００℃以上の温度においても高い活性を有し、１０５℃
での活性が最も高かった。
【００４６】実施例１１ 酵素の耐熱性 実施例７の精製酵素を９５℃の温度で５．５、２３、４
６時間それぞれ処理を行い、遠心分離後の上清の一部を
実施例９に記載した酵素反応を行い活性の変化を求め
た。その結果を図４に示すように本酵素の耐熱性は極め
て高く、９５℃における半減期は約３１時間を示した。
６時間それぞれ処理を行い、遠心分離後の上清の一部を
実施例９に記載した酵素反応を行い活性の変化を求め
た。その結果を図４に示すように本酵素の耐熱性は極め
て高く、９５℃における半減期は約３１時間を示した。
【００４７】実施例１２ ３−（２−ナフチル）−Ｌ−
アラニンの酵素合成 市販のグルタミン酸ナトリウム・１水和物７．９ｇを純
水９２ｍｌに溶解し、２０重量％の硫化ナトリウム９水
和物の水溶液１．０ｍｌを加え、湯浴で加熱して７０℃
とした。この溶液に実施例８で調製した３−（２−ナフ
チル）−２−オキソプロピオン酸ナトリウム５．０ｇを
加えて１５分間攪拌溶解し、次いで５Ｎ ＮａＯＨを加
えてｐＨ８．２に調整した。この溶液に酵素液（酵素活
性、１０００Ｕ／ｍｌ）を０．６ｍｌ加えて反応を開始
し、反応の経時変化を追跡した。なお、本実施例で使用
した酵素は実施例８で調製したものであるが、ＤＥＡＥ
−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌによる分画を行う前の段階の部分
精製品を使用した。また、反応の経時変化は逆相高速液
体クロマトグラフィーＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔ
Ｍカラム、商品名、東ソー（株）を使用）製を用いたに
より追跡した。その結果を図５に示したが、反応開始後
３時間には原料として投入した３−（２−ナフチル）−
２−オキソプロピオン酸の３０％に相当する３−（２−
ナフチル）−Ｌ−アラニンの蓄積が観察された。
アラニンの酵素合成 市販のグルタミン酸ナトリウム・１水和物７．９ｇを純
水９２ｍｌに溶解し、２０重量％の硫化ナトリウム９水
和物の水溶液１．０ｍｌを加え、湯浴で加熱して７０℃
とした。この溶液に実施例８で調製した３−（２−ナフ
チル）−２−オキソプロピオン酸ナトリウム５．０ｇを
加えて１５分間攪拌溶解し、次いで５Ｎ ＮａＯＨを加
えてｐＨ８．２に調整した。この溶液に酵素液（酵素活
性、１０００Ｕ／ｍｌ）を０．６ｍｌ加えて反応を開始
し、反応の経時変化を追跡した。なお、本実施例で使用
した酵素は実施例８で調製したものであるが、ＤＥＡＥ
−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌによる分画を行う前の段階の部分
精製品を使用した。また、反応の経時変化は逆相高速液
体クロマトグラフィーＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔ
Ｍカラム、商品名、東ソー（株）を使用）製を用いたに
より追跡した。その結果を図５に示したが、反応開始後
３時間には原料として投入した３−（２−ナフチル）−
２−オキソプロピオン酸の３０％に相当する３−（２−
ナフチル）−Ｌ−アラニンの蓄積が観察された。
【００４８】
【発明の効果】本発明によって耐熱性が高く、かつ非天
然型アミノ酸を合成する活性を有するアミノトランスフ
ェラーゼ、アミノトランスファラーゼをコードするＤＮ
Ａが新規に提供される。このＤＮＡを使用することによ
り、安価かつ安定的に、大量のアミノトランスファラー
ゼを製造することや、天然に存在するアミノトランスフ
ァラーゼのアミノ酸残基の一部を置換等した変異型アミ
ノトランスファラーゼを製造することが可能となる。
然型アミノ酸を合成する活性を有するアミノトランスフ
ェラーゼ、アミノトランスファラーゼをコードするＤＮ
Ａが新規に提供される。このＤＮＡを使用することによ
り、安価かつ安定的に、大量のアミノトランスファラー
ゼを製造することや、天然に存在するアミノトランスフ
ァラーゼのアミノ酸残基の一部を置換等した変異型アミ
ノトランスファラーゼを製造することが可能となる。
【００４９】本発明は更に、前記アミノトランスファラ
ーゼを用いることにより、非天然型アミノ酸を製造する
ことを提供するものである。この結果、食品添加物、飼
料、医薬品そして農薬の原料として重要なＬ−アミノ酸
等を安価に製造することが可能となる。
ーゼを用いることにより、非天然型アミノ酸を製造する
ことを提供するものである。この結果、食品添加物、飼
料、医薬品そして農薬の原料として重要なＬ−アミノ酸
等を安価に製造することが可能となる。
【００５０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tosoh Corporation <120> 新規耐熱性アミノトランスフェラーゼ <120> PA211-0326 <160> 5 <210> 1 <211> 1224 <212> DNA <213> Aeropyrum pernix <220> <223> アミノトランスファラーゼをコードする遺伝子 <400> 1 atgagcaacg agctcatggt agattacgac aggcttttct cagagattac 50 aaggcgtttc agagcgtctg acgtgagaga gcttctcaag cttactgagg 100 gcaagagagt cataagcttc gcaggtggac ttcccgaccc cagggttttc 150 ccagctgagg agctggctga tatagctagg aatgttgtct ccgagcttgg 200 cgataaggct ctccagtaca gccctacacc gggagtctcc atctttaggg 250 agagggctct ctcgtttctt gagcgtatgg gcttgaagac tagtgatagg 300 cagctactgg ttactactgg gagccaggag gccctcttcc tgacagccct 350 gtccactctg tctccgggcg acgtggtcat tatggaggag cccggctatc 400 tggccgctat aaacgtgttc aaagcacttg gagctaggat agttccagta 450 ccagtagacg ataagggcct caacacgggc gtgctggctg aaactcttga 500 caggctagat gctgaggggg ttaagccgaa gcttgtctac actaacccta 550 catgcaacaa tcctaacggc actacaatgc cgcttgatag gaggcgggaa 600 ctgcttcagc tggcctcaaa ctatgacatg ctggtgatag aggatgaccc 650 ctatagccac atagccttcg agaagacggg cgaagaggtg cctctacagg 700 cgctcgactc tgaaggtagg gttgtctatg tgacaacctt cagcaaaata 750 ctggcaccgg gcctgaggct tggcctaacc cttgccccgt ctgaggtcac 800 ggctaggata gagcttctga agcagatagt agatcttcac acgagcactc 850 tcgaccagta tatagcggcg gaggctcttg agagggggat tgtggataag 900 gtgatctcga gggccgtatc tatctaccgc aggaagagag atatcatgat 950 cgagtctctc gaggagaaca tgagcggagt ggcgacgtgg acgaagccta 1000 ttggagggtt cttcatattc ctcaggataa acgggcctgt ggacatgcgg 1050 gctttaatgc caaaagccgt ggagaggggt gtggcatacg tgcctggcga 1100 cgcgtttcac gtgacgcctg gtgcgggcag gaatactgct aggctcagct 1150 acagcttcaa cactgaggag gagataccgg aggggatatc tatactctca 1200 aagctggtta aagaggtgtt aagc 1224 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 2 atccgagctc atggtagatt acgacaggct tttc 34 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー <400> 3 aactgcagta tcgctattat cttcctcctc gt 32 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 4 atgagcaacg agct 1 4 <210> 5 <211> 1369 <212> DNA <213> Aeropyrum pernix <220> <223> アミノトランスファラーゼをコードする遺伝子を含む、ベクターＤＮＡ <400> 5 gacgtc atg agc aac gag ctc atg gta gat tac gac agg ctt ttc tca 48 Met Ser Asn Glu Leu Met Val Asp Tyr Asp Arg Leu Phe Ser 1 5 10 gag att aca agg cgt ttc aga gcg tct gac gtg aga gag ctt ctc aag 9 6 Glu Ile Thr Arg Arg Phe Arg Ala Ser Asp Val Arg Glu Leu Leu Lys 15 20 25 30 ctt act gag ggc aag aga gtc ata agc ttc gca ggt gga ctt ccc gac 1 44 Leu Thr Glu Gly Lys Arg Val Ile Ser Phe Ala Gly Gly Leu Pro Asp 35 40 45 ccc agg gtt ttc cca gct gag gag ctg gct gat ata gct agg aat gtt 1 92 Pro Arg Val Phe Pro Ala Glu Glu Leu Ala Asp Ile Ala Arg Asn Val 50 55 60 gtc tcc gag ctt ggc gat aag gct ctc cag tac agc cct aca ccg gga 2 40 Val Ser Glu Leu Gly Asp Lys Ala Leu Gln Tyr Ser Pro Thr Pro Gly 65 70 75 gtc tcc atc ttt agg gag agg gct ctc tcg ttt ctt gag cgt atg ggc 2 88 Val Ser Ile Phe Arg Glu Arg Ala Leu Ser Phe Leu Glu Arg Met Gly 80 85 90 ttg aag act agt gat agg cag cta ctg gtt act act ggg agc cag gag 3 36 Leu Lys Thr Ser Asp Arg Gln Leu Leu Val Thr Thr Gly Ser Gln Glu 95 100 105 110 gcc ctc ttc ctg aca gcc ctg tcc act ctg tct ccg ggc gac gtg gtc 3 84 Ala Leu Phe Leu Thr Ala Leu Ser Thr Leu Ser Pro Gly Asp Val Val 115 120 125 att atg gag gag ccc ggc tat ctg gcc gct ata aac gtg ttc aaa gca 4 32 Ile Met Glu Glu Pro Gly Tyr Leu Ala Ala Ile Asn Val Phe Lys Ala 130 135 140 ctt gga gct agg ata gtt cca gta cca gta gac gat aag ggc ctc aac 4 80 Leu Gly Ala Arg Ile Val Pro Val Pro Val Asp Asp Lys Gly Leu Asn 145 150 155 acg ggc gtg ctg gct gaa act ctt gac agg cta gat gct gag ggg gtt 5 28 Thr Gly Val Leu Ala Glu Thr Leu Asp Arg Leu Asp Ala Glu Gly Val 160 165 170 aag ccg aag ctt gtc tac act aac cct aca tgc aac aat cct aac ggc 5 76 Lys Pro Lys Leu Val Tyr Thr Asn Pro Thr Cys Asn Asn Pro Asn Gly 175 180 185 190 act aca atg ccg ctt gat agg agg cgg gaa ctg ctt cag ctg gcc tca 6 24 Thr Thr Met Pro Leu Asp Arg Arg Arg Glu Leu Leu Gln Leu Ala Ser 195 200 205 aac tat gac atg ctg gtg ata gag gat gac ccc tat agc cac ata gcc 6 72 Asn Tyr Asp Met Leu Val Ile Glu Asp Asp Pro Tyr Ser His Ile Ala 210 215 220 ttc gag aag acg ggc gaa gag gtg cct cta cag gcg ctc gac tct gaa 7 20 Phe Glu Lys Thr Gly Glu Glu Val Pro Leu Gln Ala Leu Asp Ser Glu 225 230 235 ggt agg gtt gtc tat gtg aca acc ttc agc aaa ata ctg gca ccg ggc 7 68 Gly Arg Val Val Tyr Val Thr Thr Phe Ser Lys Ile Leu Ala Pro Gly 240 245 250 ctg agg ctt ggc cta acc ctt gcc ccg tct gag gtc acg gct agg ata 8 16 Leu Arg Leu Gly Leu Thr Leu Ala Pro Ser Glu Val Thr Ala Arg Ile 55 260 265 270 gag ctt ctg aag cag ata gta gat ctt cac acg agc act ctc gac cag 8 64 Glu Leu Leu Lys Gln Ile Val Asp Leu His Thr Ser Thr Leu Asp Gln 275 280 285 tat ata gcg gcg gag gct ctt gag agg ggg att gtg gat aag gtg atc 9 12 Tyr Ile Ala Ala Glu Ala Leu Glu Arg Gly Ile Val Asp Lys Val Ile 290 295 300 tcg agg gcc gta tct atc tac cgc agg aag aga gat atc atg atc gag 9 60 Ser Arg Ala Val Ser Ile Tyr Arg Arg Lys Arg Asp Ile Met Ile Glu 305 310 315 tct ctc gag gag aac atg agc gga gtg gcg acg tgg acg aag cct att 1 008 Ser Leu Glu Glu Asn Met Ser Gly Val Ala Thr Trp Thr Lys Pro Ile 320 325 330 gga ggg ttc ttc ata ttc ctc agg ata aac ggg cct gtg gac atg cgg 1 056 Gly Gly Phe Phe Ile Phe Leu Arg Ile Asn Gly Pro Val Asp Met Arg 335 340 345 350 gct tta atg cca aaa gcc gtg gag agg ggt gtg gca tac gtg cct ggc 1 104 Ala Leu Met Pro Lys Ala Val Glu Arg Gly Val Ala Tyr Val Pro Gly 355 360 365 gac gcg ttt cac gtg acg cct ggt gcg ggc agg aat act gct agg ctc 1 152 Asp Ala Phe His Val Thr Pro Gly Ala Gly Arg Asn Thr Ala Arg Leu 370 375 380 agc tac agc ttc aac act gag gag gag ata ccg gag ggg ata tct ata 1 200 Ser Tyr Ser Phe Asn Thr Glu Glu Glu Ile Pro Glu Gly Ile Ser Ile 385 390 395 ctc tca aag ctg gtt aaa gag gtg tta agc tagactacac tacttttccc 1 250 Leu Ser Lys Leu Val Lys Glu Val Leu Ser 400 405 ctaaaaacat cctcgcggcc cgactactca taggtgtaga gactcccttg 1300 gaagagggtc tgctgttcgt ccacatgctt ggtaaggaga cgaggaggaa 1350 gataatagcg atactgcag 1369
【図１】図１は、プラスミドｐＡＰＡＴ１の概要を示す
ものである。図中、Ａ３／ｌａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒは
大腸菌Ｔ３ファージＡ３プロモーターと大腸菌ｌａｃオ
ペレーターとの融合プロモーターを、ＡａｔＩＩは制限
酵素ＡａｔＩＩの切断部位を、ＳａｃＩは制限酵素Ｓａ
ｃＩの切断部位を、ＢｇｌＩＩは制限酵素ＢｇｌＩＩの
切断部位を、ＰｓｔＩは制限酵素ＰｓｔＩの切断部位
を、ＲＢＳはリボゾーム結合部位を、Ａ．Ｐｅｒｎｉｘ
ＡＴはエアロパイラム・ペルニクスのアミノトランス
ファラーゼがコードされている領域を、ｒｒｎＢ Ｔ１
Ｔ２は大腸菌ｒｒｎＢオペロンの転写終結シグナルを、
ｂｌａはベータ・ラクタマーゼ遺伝子を、ｏｒｉはプラ
スミドの複製開始部位を、そしてｌａｃＩｑは大腸菌の
ｌａｃリプレッサーバリアントの遺伝子をそれぞれ示
す。
ものである。図中、Ａ３／ｌａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒは
大腸菌Ｔ３ファージＡ３プロモーターと大腸菌ｌａｃオ
ペレーターとの融合プロモーターを、ＡａｔＩＩは制限
酵素ＡａｔＩＩの切断部位を、ＳａｃＩは制限酵素Ｓａ
ｃＩの切断部位を、ＢｇｌＩＩは制限酵素ＢｇｌＩＩの
切断部位を、ＰｓｔＩは制限酵素ＰｓｔＩの切断部位
を、ＲＢＳはリボゾーム結合部位を、Ａ．Ｐｅｒｎｉｘ
ＡＴはエアロパイラム・ペルニクスのアミノトランス
ファラーゼがコードされている領域を、ｒｒｎＢ Ｔ１
Ｔ２は大腸菌ｒｒｎＢオペロンの転写終結シグナルを、
ｂｌａはベータ・ラクタマーゼ遺伝子を、ｏｒｉはプラ
スミドの複製開始部位を、そしてｌａｃＩｑは大腸菌の
ｌａｃリプレッサーバリアントの遺伝子をそれぞれ示
す。
【図２】図２は実施例１０（６０℃から１００℃におけ
る反応）の結果を示す図であり、横軸は温度（℃）、縦
軸は相対活性（％）である。
る反応）の結果を示す図であり、横軸は温度（℃）、縦
軸は相対活性（％）である。
【図３】図３は実施例１０（８０℃から１１５℃におけ
る反応）の結果を示す図であり、横軸は温度（℃）、縦
軸は相対活性（％）である。
る反応）の結果を示す図であり、横軸は温度（℃）、縦
軸は相対活性（％）である。
【図４】図４は実施例１１の結果を示す図であり、横軸
は時間（ｈｒ）、縦軸は残存活性（％）である。
は時間（ｈｒ）、縦軸は残存活性（％）である。
【図５】図５は実施例１２の結果を示す図であり、横軸
は反応時間（ｈｒ）、縦軸は生成した３−（２−ナフチ
ル）−Ｌ−アラニンの濃度（ｇ／ｌ）である。
は反応時間（ｈｒ）、縦軸は生成した３−（２−ナフチ
ル）−Ｌ−アラニンの濃度（ｇ／ｌ）である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｐ 13/20 13/20 13/22 Ｃ 13/22 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 河野 和久 神奈川県横浜市青葉区たちばな台２丁目７ −３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 AA10 BA10 BA71 BA74 CA04 DA06 EA04 FA01 GA11 HA01 4B050 CC01 DD02 FF05E FF11E LL05 4B064 AE03 AE04 AE17 AE19 AE29 CA02 CA19 CB30 CC24 DA01 DA10 4B065 AA01Y AA26X AB01 BA02 CA29
Claims (10)
- 【請求項１】配列番号１の塩基配列によってコードされ
る蛋白質又はその一部のアミノ酸配列が欠失し、一部の
アミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換され、他のアミ
ノ酸残基が挿入され若しくは他のアミノ酸残基が付加さ
れた蛋白質であって、６０℃以上１１５℃以下の温度条
件下においてアミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋
白質。 - 【請求項２】実質的にエアロパイラム属微生物に由来す
る他の蛋白質を含まないことを特徴とする、請求項１に
記載の蛋白質。 - 【請求項３】配列番号１の塩基配列又は配列番号１の塩
基配列の一部からなるＤＮＡを含む染色体外増殖性ＤＮ
Ａであって、適切な宿主細胞に導入することにより請求
項１に記載の蛋白質を生産し得る環状ＤＮＡ。 - 【請求項４】配列番号１の塩基配列又は配列番号１の塩
基配列の一部からなるＤＮＡを含む染色体外増殖性ＤＮ
Ａであって、適切な宿主細胞に導入することにより請求
項１に記載の蛋白質を生産し得るＤＮＡによって形質転
換された宿主細胞。 - 【請求項５】大腸菌Ｋ１２株又はその誘導体であること
を特徴とする、請求項４に記載の宿主細胞。 - 【請求項６】配列番号１の塩基配列によってコードされ
る蛋白質又はその一部のアミノ酸配列が欠失し、一部の
アミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換され、他のアミ
ノ酸残基が挿入され若しくは他のアミノ酸残基が付加さ
れた蛋白質であって、６０℃以上１１５℃以下の温度条
件下においてアミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋
白質を用い、式１におけるＬ−アミノ酸（式中ａ）と２
−オキソ酸（式中ｂ）からＬ−アミノ酸（式中ｃ）を製
造することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造方法。 【化１】 - 【請求項７】前記式１における（ａ）のＬ−アミノ酸が
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸又はＬ−アラニ
ンのいずれかであることを特徴とする、請求項６に記載
のＬ−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項８】式１における（ｂ）の２−オキソ酸が３−
アリール−２−オキソプロピオン酸であり、（ｃ）のＬ
−アミノ酸が芳香族Ｌ−アミノ酸であることを特徴とす
る、請求項６に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項９】前記３−アリール−２−オキソプロピオン
酸が３−（２−ナフチル）−２−オキソプロピオン酸で
あり、前記芳香族Ｌ−アミノ酸が３−（２−ナフチル）
−Ｌ−アラニンであることを特徴とする、請求項８に記
載のＬ−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項１０】前記３−アリール−２−オキソプロピオ
ン酸が３−フェニル−２−オキソプロピオン酸であり、
前記芳香族Ｌ−アミノ酸がＬ−フェニルアラニンである
ことを特徴とする、請求項８に記載のＬ−アミノ酸の製
造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000357630A JP2002153285A (ja) | 2000-11-20 | 2000-11-20 | 新規耐熱性アミノトランスフェラーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000357630A JP2002153285A (ja) | 2000-11-20 | 2000-11-20 | 新規耐熱性アミノトランスフェラーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002153285A true JP2002153285A (ja) | 2002-05-28 |
Family
ID=18829657
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000357630A Pending JP2002153285A (ja) | 2000-11-20 | 2000-11-20 | 新規耐熱性アミノトランスフェラーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002153285A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007088977A1 (ja) | 2006-02-02 | 2007-08-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
-
2000
- 2000-11-20 JP JP2000357630A patent/JP2002153285A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007088977A1 (ja) | 2006-02-02 | 2007-08-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| US8394612B2 (en) | 2006-02-02 | 2013-03-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for production of an L-amino acid |
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