JP3427984B2 - 新規耐熱性シュクロオリゴ糖生成酵素およびその用途 - Google Patents

新規耐熱性シュクロオリゴ糖生成酵素およびその用途

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JP3427984B2
JP3427984B2 JP07314392A JP7314392A JP3427984B2 JP 3427984 B2 JP3427984 B2 JP 3427984B2 JP 07314392 A JP07314392 A JP 07314392A JP 7314392 A JP7314392 A JP 7314392A JP 3427984 B2 JP3427984 B2 JP 3427984B2
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  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、シュクロオリゴ糖の効
率的かつ安定的な大量生産を可能とする、新規な耐熱性
シュクロオリゴ糖生成酵素、その遺伝子、およびその遺
伝子を含有する組換えベクターを用いた該酵素の製造法
ならびに該酵素の利用法に関する。
【0002】
【従来の技術】スクロースのグルコース部分にグルコー
スがα−1,6結合したテアンデロース(別名イソマル
トシルフラクトシド, G16GF)およびスクロースの
フルクトース部分にグルコースがα−1,6結合したイ
ソメレチトース(GF61G)は、蜂蜜中に含まれる微
量オリゴ糖類であり、蜂蜜の風味と密接な関係があると
考えられている。
【0003】これらのオリゴ糖は、有用腸内細菌である
ビフィズス菌の増殖を選択的に促進するので、整腸作用
が期待される他、虫歯菌であるストレプトコッカス・ミ
ュータンス菌およびソブリヌス菌の生成するグルコシル
トランスフェラーゼ(不溶性グルカン合成酵素)を阻害
し、これらの虫歯菌による酸生成が弱いため、虫歯予防
作用が期待されている。
【0004】また、スクロースの構成単糖であるフルク
トースは、高甘味で味質も優れ、グルコシルトランスフ
ェラーゼによる不溶性グルカン合成の基質とならず、テ
アンデロースやイソメレチトースと同様に不溶性グルカ
ン合成を阻害することも知られている。
【0005】したがって、虫歯発生の原因となるグルコ
ース部分を他のスクロース分子に転移させることによ
り、上述のような好ましい機能を有するテアンデロース
やイソメレチトースを生成させ、その結果得られる糖類
の混合物(シュクロオリゴ糖)は、テアンデロース、イ
ソメレチトース、および転移反応の結果遊離してくるフ
ラクトースを含有する極めて優れた糖製品となる。
【0006】このシュクロオリゴ糖生成反応は、スクロ
ースをグルコシル供与体ならびに受容体とする、スクロ
ース分子間のグルコシル基転移酵素反応によるのが最も
効率的であり、この目的のために、種々のグルコシル基
転移酵素が用いられてきた。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】この酵素反応は、基質
スクロース濃度を上げれば上げるほど効率良く進行する
が、高濃度のスクロース溶液は常温では粘性が高く、撹
拌による反応液の均一性の保持、送液時の流速の低下や
配管の目詰まり等、製造工程上の取扱いに問題点があっ
た。
【0008】この酵素反応を高温で行えば、これらの問
題点が解決する上に、反応速度の増大による反応工程時
間の短縮化や、製造工程の雑菌汚染防止も可能となると
考えられるが、そのためには耐熱性の高い酵素が必要と
される。また、工業的スケールでこれらの酵素を固定化
して高温で長期間にわたり繰り返し使用しようとすれ
ば、さらに高度な耐熱性を持った酵素が要求される。
【0009】本発明者等の研究グループは、先にこのよ
うな耐熱性グルコシル基転移酵素を生産する微生物を見
いだし、これらの微生物を用いるスクロース転移ならび
に該スクロース転移糖として、イソマルトシルフラクト
シドおよび/またはイソメレチトースを含有する新規食
品素材に関する特許出願をそれぞれ行なった(特開平4
−30788号、同 4−30796号、同 4−307
71号)。
【0010】しかしながら、それらの微生物の該酵素生
産性は低く、しかも培養のたびに活性が変動する不安定
なものであるため、シュクロオリゴ糖の工業的な製造に
は実用的には困難が伴い、該酵素の完全精製までには至
らなかった。
【0011】そこで本発明者等は、該微生物の酵素生産
性の向上・安定化に鋭意取り組んだが、次の理由で目的
を達成するには至らなかった。 すなわち、研究の過程
で、上記出願に関して工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィラス A
IK90−30株は、少なくとも2種以上の微生物から
なることを見出したので、それらの微生物を互いに分離
し、シュクロオリゴ糖生成酵素生産菌のみを単離するこ
とを試みた。 しかし、本シュクロオリゴ糖生成酵素生
産菌はそれ単独では非常に死滅しやすく、これ以外の微
生物と寄生あるいは共生関係にあるためか、シュクロオ
リゴ糖生成酵素生産菌自体の純粋単離ができなかった。
【0012】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者等は、該
シュクロオリゴ糖生成酵素の生産性の安定的な向上を目
指し、遺伝子操作の技法によって、共生状態にある微生
物群から該シュクロオリゴ糖生成酵素をコードする遺伝
子のみを単離し、これで大腸菌を形質転換することによ
り、親株に較べて数百倍から2千倍のシュクロオリゴ糖
生成酵素生産能を有する該形質転換体を得、更にシュク
ロオリゴ糖生成酵素自体も明らかにして本発明を完成し
た。
【0013】すなわち、本発明の第一の目的は、遺伝子
工学の手法を応用することにより大量かつ安定的に得ら
れる、工業的に利用可能なシュクロオリゴ糖生成酵素を
提供するものである。また、本発明の第二の目的は、シ
ュクロオリゴ糖生成酵素をコードする新規な遺伝子、そ
の遺伝子を組み込んだベクターならびに当該酵素を産生
する形質転換体を提供することを目的とするものであ
る。更に、本発明の第三の目的は、前記形質転換体を培
養し、その培養物より当該酵素を抽出、精製するシュク
ロオリゴ糖生成酵素の製造方法を提供するものである。
更にまた、本発明の別の目的は、前記酵素を利用したシ
ュクロオリゴ糖製造法を提供するものである。
【0014】本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素は、耐
熱性グルコシル基転移酵素を生産する微生物、例えばバ
チルス ステアロサーモフィラス AIK90−30株よ
り当該酵素をコードする遺伝子を単離し、これを適当な
ベクターに組み込んだ後、これで適当な宿主微生物を形
質転換し、当該微生物の培養液中から分離取得すること
により得られる。上記AIK90−30株から細菌DN
Aを単離するには、例えばサイトウ・ミウラ法(Saito,
H. and Miura, K., Biochem. Biophys. Acta,72巻,619
頁,1963年)等の公知の方法を用いることができる。 ま
た、遺伝子ライブラリーの作成は、制限酵素を用いる公
知の方法を用いることができる。
【0015】こうして得られたDNA断片は、常法によ
りプラスミドに組み込み、宿主に導入して該形質転換体
を得ることができる。宿主細胞としては、大腸菌(エシ
ェリヒア・コリ、Escherichia coli)やバチルス・ズブ
チリス(Bacillus subtilis)を用いることができ、ベ
クターとしては、大腸菌内で複製できるpUC18、p
BR322等、バチルス・ズブチリス内で複製できるp
UB110、pE194、pC194等の公知のプラス
ミドが使用できる。
【0016】このようにして得られた形質転換体につい
て、そのα−グルコシダーゼ活性を測定し、高い該酵素
活性を有する菌株を選択すれば、目的とする形質転換体
を得ることができる。なお、得られた形質転換体の一つ
である、大腸菌(pUSU334/W3110)株は、エシェリヒア・
コリ(Escherichia coli) SAM 1954と命名さ
れ、1992年2月14日付で工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄3749号(FERM BP−3
749)として寄託されている。
【0017】本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素をコー
ドする遺伝子の塩基配列は、α−グルコシダーゼ活性を
示す形質転換体のプラスミドを用いて、常法により決定
できる。 また、これらの塩基配列より、該酵素のアミ
ノ酸配列を推定することができる。かくして得られたシ
ュクロオリゴ糖生成酵素をコードする遺伝子の塩基配列
およびこれより推定されるシュクロオリゴ糖生成酵素の
アミノ酸配列は後記の配列表に示す通りである。 な
お、本明細書において相同性を有するアミノ酸配列と
は、配列の1部にアミノ酸の置換、欠失、付加等がある
が、機能は元のアミノ酸配列で表されるペプチドと同一
であるものをいう。
【0018】本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素を製造
するには、上記のようにして得られた、シュクロオリゴ
糖生成酵素遺伝子を含有するプラスミドで形質転換され
た宿主細胞を適当な炭素源、窒素源および微量の金属元
素を含む培地を用いて培養し、次いで、得られた菌体か
ら公知の方法で菌体成分を抽出し、更に硫安分画法、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー等の通常の蛋白質精製法を用いて精製すれば良い。
また、本酵素は耐熱性であるので、該菌株中で大量に
発現させた後、得られた培養物を熱処理することによ
り、該酵素を含む粗酵素液を容易に大量に調製すること
ができる。
【0019】かくして得られるシュクロオリゴ糖生成酵
素は次のような物理化学的性質を有していた。 (1)作用 転移反応: α−D−グルコピラノシド(Glc−X)
1モルとグルコシル基受容体(Y)1モルとから、新た
なα−D−グルコピラノシド(Glc−Y)1モルと
(X)1モルを生成する。 加水分解: 1モルのα−D−グルコピラノシド(Gl
c−X)を加水分解し、1モルの(X)と1モルのグル
コースを生成する。(ここでX、Yはいずれも糖あるい
はアグリコンを示す) (2)基質特異性 転移反応: α−D−グルコピラノシド(Glc−X)
とグルコシル基受容体(Y)がいずれもスクロースであ
る場合の転移反応の主生成物が、テアンデロースおよび
/またはイソメレチトースである。 加水分解: スクロースおよびp−ニトロフェニル−α
−D−グルコピラノシドを加水分解するが、p−ニトロ
フェニル−β−D−グルコピラノシドは加水分解しな
い。(ここでX、Yは前記と同じ) (3)反応最適pH: pH5.0〜6.0 反応最適温度: 75℃(pH6.0) (4)pH安定性: pH5.0〜12.0(55℃,1
0分間)で安定 熱安定性: 65℃(pH7.2,10分間)で安定 (5)等電点: pI4.6(等電点電気泳動) (6)分子量: 約65,000(SDS−PAGE) 約240,000(ゲル濾過)
【0020】上記の本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素
を用いてシュクロオリゴ糖を製造するには、精製酵素を
用いてもよいが、酵素反応に支障がない限り、例えば上
記のようにして得られた粗酵素液や硫安分画、ゲル濾過
クロマトグラフィー等で精製した部分精製酵素を用いる
ことも出来る。 また、セファローズ等の不溶性担体に
固定化された酵素を用いることも出来る。
【0021】シュクロオリゴ糖を製造する酵素反応につ
いては、スクロース濃度は出来る限り高い方が望ましい
が、糖溶液の粘度を勘案すれば、1〜2g/ml程度が
好ましい。 酵素反応は、pH5.0〜pH12.0の範
囲で進行するが、酵素の至適pHを勘案し、pH5.0
〜6.0の間に保つのが好ましい。 また酵素反応は、室
温〜85℃で進行するが、酵素の安定性および至適温度
を勘案して、反応温度を65〜75℃程度に保つのが好
ましい。また、添加酵素量は、スクロース1gあたり1
〜10PNP単位(1PNP単位とは1分間に1μmol
のp−ニトロフェノール(以下PNPと略す)を遊離す
る酵素力価を示す)とするのが望ましい。 酵素は、一
度に添加しても良いが、高速液体クロマトグラフィー等
で反応をモニターしながら、数回に分けて添加すること
も出来る。 反応時間は1〜4日間程度で充分である
が、反応をモニターしながら反応終了時点を決定するこ
ともできる。
【0022】反応終了後、必要に応じて酵素を除去また
は加熱失活させ、反応終了液をイオン交換樹脂カラム、
活性炭等で処理した後、濃縮すれば、所望のシュクロオ
リゴ糖を製造することができる。
【0023】
【作用】本発明によれば、シュクロオリゴ糖を生成する
耐熱性酵素を大量に安定的に得ることが可能となり、該
酵素を用いたテアンデロースおよび/またはイソメレチ
トースを主成分とするシュクロオリゴ糖の工業的生産を
可能ならしめるものである。
【0024】
【実施例】次いで、実施例を掲げて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれら実施例になんら制約され
るものではない。
【0025】実 施 例 1 バチルスAIK90−30株より、シュクロオリゴ糖生
成酵素(α−グルコシダーゼ)遺伝子の取得: ステップ1: 染色体DNAの単離 染色体DNAの単離は、サイトウおよびミウラ(Saito,
H. and Miura, K., Biochem. Biophys. Acta,72巻,619
頁,1963年)によって報告されている方法を用いた。 即
ち、スクロース5%、酵母エキス0.1%、ポリペプト
ン0.5%を含む液体培地(pH7.0)1.7lを用
い、60℃で振盪培養したバチルスAIK90−30株
の菌体を遠心分離により集め、25%スクロース溶液に
懸濁した後、EDTAおよびリゾチームを加え、37℃
で30分間インキュベートし、次いで、プロナーゼE
200μg/mlおよびNaCl 0.2Mを含む1%S
DS溶液を加え、軽く攪拌して37℃で一晩インキュベ
ートした。
【0026】次に等量のフェノールを加えゆっくりと攪
拌し、遠心分離を行った後、上層を駒込ピペットで回収
し、フェノール/クロロホルム抽出、クロロホルム抽出
を行った。2倍量の冷エタノールを加え、生じたDNA
の沈殿をガラス棒に巻き取って回収した。 得られたD
NAを、1mM EDTAを含む10mM トリス−塩酸
緩衝液(pH8.0)に溶解し、最終濃度がNaCl 2
00mM、RNase100μg/mlとなるように加
え、37℃で1時間インキュベートした後、上記と同様
にフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行
い、得られたDNA沈澱を上記のトリス−塩酸緩衝液に
溶解し、DNA濃度2mg/mlの標品1mlを調製し
た。
【0027】ステップ2: ライブラリーの作成 このようにして調製したDNAをSau3AIで部分分
解し、0.7%アガロースで電気泳動後、6〜9kbの
DNA断片をゲルから切り出し、DNA断片を回収し
た。 この6〜9kbのDNA断片をBamHIで完
全消化後アルカリフォスファターゼ(CAP)処理した
ベクターpUC18とライゲーションし、マンデル・ヒ
ガの方法(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol.,
53巻, 154頁, 1970年)を用いて大腸菌JM109に形
質転換した。
【0028】得られた形質転換体は、pUC18中にア
ンピシリン耐性遺伝子を保有しているので、バクトペプ
トン 1.6%、バクト−イーストエクストラクト 1.0
%、NaCl 0.5%、pH 7.4、アンピシリン 5
0μg/ml, 0.3mM イソプロピル−1−チオ−β
−D−ガラクトシド(IPTG)および0.03% 5−クロ
ロ−4−ブロモ−3−インドリル−β−D−ガラクトシ
ド(X-gal)を含む2xYT寒天培地上に白いコロニー
として生育する。
【0029】ステップ3: 形質転換体の選択 このようにして得た形質転換体の白色コロニーを、同じ
2xYT寒天培地にレプリカし、10mM リン酸ナト
リウム緩衝液(pH 7.2)に溶解した20mM p−
ニトロフェニル−α−D−グルコピラノシド(PNP-Gl
c)溶液を含む0.7%寒天を重層し、60℃でインキュ
ベーションした。この方法によれば、シュクロオリゴ糖
生成酵素を発現している形質転換体はPNP−Glcを
分解してp−ニトロフェノールを生成するので、培地上
に黄色く発色したコロニーとして分離できる。上記選択
の結果、No. 31、51、64および71の4株が分
離された。これらの培養菌体の菌体破砕液を65℃で
1.5時間加熱処理した後、PNP−Glc分解活性と
シュクロオリゴ糖合成活性を測定することにより、目的
の酵素遺伝子が発現していることを確認した。
【0030】ステップ4: サブクローニング 陽性クローンNo. 31、51、64および71株が含
有する組換えプラスミド、各々pUSU31、pUSU
51、pUSU64およびpUSU71について制限酵
素地図を作成した(図1)。 制限酵素地図を比較する
ことにより、これら各プラスミドは互いに共通部分を有
する、長さの異なった挿入DNA断片をもつことがわか
った。 挿入DNA断片が最も短いpUSU71につい
て、さらに詳しい制限酵素地図を作成した。 この制限
酵素地図をもとに、制限酵素サイトを利用して挿入DN
A断片の縮小化を行った。 pUSU71中、挿入DN
A断片の中程にあるHindIIIサイトとマルチクロー
ニングサイトにあるXbaIサイトで切断して得られる
DNA断片(約2.9kb)をpUC19のHindIII
/XbaIサイトに挿入してpUSU267を得た。ま
た、pUSU71のマルチクローニングサイトにあるS
maIサイトと挿入DNA断片中のSmaIサイトの間
を欠失した約2.3kbのバチルスAIK90−30株
由来挿入DNA断片を有する pUSU334を得た
(図1)。 pUSU267および pUSU334を含
む大腸菌はシュクロオリゴ糖生成酵素の活性を有してい
た。
【0031】実 施 例 2 シュクロオリゴ糖生成酵素(α−グルコシダーゼ)遺伝
子の塩基配列の決定:実施例1で得られたpUSU33
4の2.3kb挿入DNA断片をファージM13に両方
向にクローニングし、2本鎖DNA(RF)をおのおの
調製した。これを「続生化学実験講座、第1巻、遺伝子
研究法II」(東京化学同人1986年発行)の289〜
305頁に記載されている方法により、大腸菌エキソヌ
クレアーゼIII と反応させ、一方向に欠失が導入された
二本鎖DNAを調製した。このようして得られた二本鎖
DNAを大腸菌JM109 に形質転換して、一方向に
欠失が挿入されたファージクローンを作成した。
【0032】各ファージクローンから二本鎖DNAを調
製して、制限酵素による切断パターンから欠失の程度を
調べ、適当なクローンから一本鎖ファージDNAを調製
した。これら一本鎖ファージDNAを鋳型として、ジデ
オキシ法(Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 74巻, 5463頁, 1977年)によって塩基配列を決
定した。各クローンの塩基配列をつなぎ合わせることに
より、2.3kbDNA挿入断片(3.1kb)の全塩基配列
を決定した。
【0033】決定された塩基配列は2320塩基からな
り、当該α−グルコシダーゼ遺伝子の全領域を含んでい
る。 塩基配列中には393〜395番目のTTGで始
まり、2154〜2156番目のTGAで終わる176
1塩基対からなる当該α−グルコシダーゼ遺伝子に対応
するオープンリーディングフレームが存在する(配列表
参照)。 翻訳開始コドンは通常ATGであるが、TT
Gで開始される例も知られている。 393〜395番
目のTTGを開始コドンとした理由は、9塩基対前にA
GGAGGからなるリボソームバインディングサイトが
存在すること、及び実施例6で示す当該α−グルコシダ
ーゼのN末端アミノ酸配列が、29アミノ酸残基にわた
ってDNA塩基配列から推定したアミノ酸配列に一致す
ることによる。
【0034】以上の結果から当該α−グルコシダーゼ遺
伝子は、586アミノ酸からなる分子量約69,000
のタンパク質をコードしていることが明らかになった。
【0035】実 施 例 3 シュクロオリゴ糖生成酵素(α−グルコシダーゼ)の発
現:実施例2で得られた当該α−グルコシダーゼ遺伝子
を含む大腸菌組換え体中のα−グルコシダーゼ活性を測
定した。 活性測定は10mM リン酸ナトリウム緩衝液
(pH 7.2)に溶解した10mM PNP−Glc溶
液0.6mlに酵素液0.1mlを添加し、55℃にて反
応させながら分光光度計にて1分間当たりに遊離してく
るPNP量を405nmの吸光度として経時的に測定し
た。 なお、酵素活性は上記測定条件下、1分間に1μm
olのPNPを遊離する酵素力価を1PNP Unitと
した。
【0036】まず、各大腸菌組換え体を、グルコース
0.1%、酵母エキス 0.5%、ポリペプトン 1%、N
aCl 0.5%(pH 7.2)よりなる液体培地にて、
37℃で振盪培養を行った後、その培養液10mlを2
l容三角フラスコに入れた同上培地 400mlに植菌
し、37℃で3時間振盪培養した。 この時点で、10
0mM IPTG溶液を1ml添加し、さらに1日間振
盪培養を行った後、集菌して10mM リン酸ナトリウ
ム緩衝液(pH 7.2)で洗浄した。 次に、この洗浄
菌体を適量の10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.2)に懸濁し、3分間ガラスビーズにて菌体破砕を
行った後、遠心分離により酵素液を調製した。
【0037】各種大腸菌組換え体での培養菌体量と酵素
活性について、表1にまとめた。
【0038】この結果から明らかなように、挿入DNA
断片をpUSU71、pUSU267、pUSU334
と短くすることにより、その酵素生産量は向上した。
また、宿主大腸菌をJM109 から W3110とする
ことにより培養液1ml当たり4.2 PNP Unit
生産され、酵素生産量はJM109(pUSU71)と
比較して約200倍、親株(バチルス)と比較して約2
000倍と著しく向上させることに成功した。
【0039】実 施 例 4 形質転換体の生産するシュクロオリゴ糖生成酵素を用い
たシュクロオリゴ糖の製造: ステップ1: 形質転換体からの酵素液の調製 種培養として、シュクロオリゴ糖生産菌である大腸菌
(pUSU334/W3110)をグルコース 0.1
%、酵母エキス 0.5%、ポリペプトン 1%、NaC
l 0.5%よりなる液体培地に植菌した後、37℃で1
日間振とう培養した。ついで、この培養液1.6lを3
0lの酵母エキス0.1%、ポリペプトン 1%、NH4
Cl 0.1%、Na2HPO4 1.52%、KH2PO4
0.3%、Na2 SO4 0.01%、NaCl 0.3%、
MgCl2 0.008%よりなる液体培地を入れた50
l容ジャーファーメンターに植菌して37℃で200r
pm、0.5vvmにて19時間通気撹拌培養を行っ
た。 培養終了後、遠心分離により集菌し、脱イオン水
にて洗浄して、湿重量118gの菌体を得た。
【0040】得られた菌体を10mM リン酸ナトリウ
ム緩衝液 (pH 7.2) 1lに懸濁し、低温下ビーズ破
砕にて菌体破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去
し粗酵素液を調製した。 得られた粗酵素液を、60℃
で30分間熱処理を行い、遠心分離して上清1,520
ml を得た。これに硫酸アンモニウム11.55gを添
加後、3%ポリエチレンイミン溶液を60.8mlを加
え、室温にて30分間放置後、遠心分離して上清 1,5
60ml を得た。ついで、これに硫酸アンモニウム4
74.24gを添加し、沈殿を遠心分離により回収し
た。
【0041】得られた沈殿物を10mM リン酸ナトリ
ウム緩衝液 (pH 7.2) 80mlに溶解し、セファデ
ックス(Sephadex)G−25を用いたゲル濾過にて脱塩
を行い、活性 812 PNP Unit/mlの酵素溶
液220mlを調製し、−20℃にて凍結保存した。
【0042】ステップ2: シュクロオリゴ糖液の調製 スクロース 10kgを20mM 酢酸緩衝液 (pH 5.
5) 10lに溶解し、上記酵素液をスクロース 1g当
たり2 PNP Unit加え 65℃にて1日間反応さ
せて、糖組成として、テアンデロース 7.5%、イソメ
レチトース 7%、スクロース 71%、イソマルトー
ス 0.7% 、フラクトース 10.3%およびグルコー
ス 3.5 %の糖組成を有するシュクロオリゴ糖液が生
成された。
【0043】さらに、スクロース1g当たり2 PNP
Unitの酵素液を追加し、65℃にて2日間反応させ
た後、95℃で10分間加熱した。 こうして調製した
加熱処理反応液 16lをカチオン交換樹脂(ダイヤイ
オン SK−1B;三菱化成株式会社製)0.8l、アニ
オン交換樹脂(ダイヤイオン WA−30;三菱化成株
式会社製)1.2lおよび活性炭(タケコール;武田薬
品株式会社製)150gにて脱色脱塩を行った。 ケイ
ソウ土(ラジオライト #100;昭和化学工業株式会
社製)濾過にて活性炭を除去することにより4糖オリゴ
糖 5.4%、テアンデロース 13.6%、イソメレチト
ース 12.6%、スクロース 32.8%、イソマルトー
ス 3.5%、フラクトース 23.4%およびグルコース
8.7%の糖組成を有するシュクロオリゴ糖液を調製し
た。 これを糖濃度 75%(W/W)に濃縮して、シュク
ロオリゴ糖液 12.5kgを取得した。
【0044】この酵素反応中、下記条件で高速液体クロ
マトグラフィーで反応生成物の分析を行った。 カラム: アサヒパック NH2P−50(Asahipak NH2
P-50 ; 4.6 mmID ×250 mmL) 溶出溶媒: アセトニトリル−水(70:30) 溶出速度: 1.0ml/min 検出手段: 示差屈折計(Shodex SE-61)
【0045】実 施 例 5 シュクロオリゴ糖液を生成するシュクロオリゴ糖生成酵
素(α−グルコシダーゼ)の完全精製:実施例4で得ら
れた酵素液を50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.2)にて平衡化したセパビーズFP−DA 13(三
菱化成株式会社製)カラムクロマトグラフィーに供し、
素通り画分を溶出させた後、塩化ナトリウムにて溶出を
行った。 活性画分について硫安分画、透析、膜濃縮を
行った後、高速液体クロマトグラフィーによるゲル濾過
クロマトグラフィー(TSKgel G3000 SW ;東ソー株式会
社製)、イオン交換クロマトグラフィー(DEAE-Toyopea
rl 650S ;東ソー株式会社製)、疎水クロマトグラフィ
ー(Butyl-Toyopearl 650S;東ソー株式会社製)および
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー(HCA P-20
05;三井東圧株式会社製)を行い、電気泳動的に単一な
精製酵素標品(比活性 27.6PNP Unit/A2
80、総活性 4,576 PNP Unit)を得た。
【0046】実 施 例 6 シュクロオリゴ糖液を生成するシュクロオリゴ糖生成酵
素(α−グルコシダーゼ)の理化学的諸性質の検討:実
施例5で得られた単一な精製酵素標品について、以下の
ように理化学的諸性質を検討した。
【0047】(1)分子量 Phast−Gel電気泳動装置(ファルマシアLKB
バイオテクノロジー社製)を用いたSDSポリアクリル
アミド電気泳動法による分子量は、約65,000であ
った。また、TSKgel G3000SWカラム(東
ソー株式会社製)を用いた高速液体ゲルクロマトグラフ
ィーによるゲル濾過では、分子量は約240,000で
あった。
【0048】(2)等電点 Phast−Gel電気泳動装置(ファルマシアLKB
バイオテクノロジー社製)を用いる等電点電気泳動法に
よる等電点は、pI 4.6であった。
【0049】(3)至適 pH 10mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 4.5〜5.5)
および10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH 5.5
〜8.5)に溶解した50mM スクロース溶液0.95
mlに酵素液0.05mlを添加し、55℃で10分間
作用させ生成するグルコース量をグルコースオキシダー
ゼ法で測定することにより求め、pH 5.5の場合の活
性を100として相対的に示した至適pHは、図2に示
す通りpH5〜6付近であった。
【0050】また、同様の緩衝液に溶解した10mM
p−ニトロフェニル−α−D−グルコピラノシド溶液
0.65mlに酵素液0.05mlを添加し、55℃で1
0分間作用させた後、1M 炭酸ナトリウム溶液 0.3
mlを添加して反応を止め遊離したPNP量を測定する
エンドポイント測定法でも、至適pHは、図3に示す通
りpH5〜6付近であった。
【0051】(4)pH 安定範囲 各種pHの緩衝液中に55℃で10分間放置後、直ちに
氷冷しその残存活性を以下に示す初速度法にて測定し
た。 図4に示す通りpH 5.0〜12.0の範囲におい
て安定であった。 なお、緩衝液は酢酸ナトリウム緩衝
液(pH 3.5〜6.0)、リン酸ナトリウム緩衝液
(pH 5.5〜8.5)、グリシン−NaOH緩衝液
(pH 8.5〜11.5)を使用した。 残存活性は10
mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.2)に溶解し
た10mM p−ニトロフェニル−α−D−グルコピラ
ノシド溶液 0.6mlに酵素液 0.1mlを添加し、5
5℃にて反応させながら分光光度計で1分間当たりに遊
離してくるPNP量を経時的に測定した。
【0052】(5)至適温度および温度安定範囲 至適温度は実施例6(3)のスクロースを用いる測定方
法で検討した。 pH6.0、10分間の反応条件で活性
は図5に示すように、75℃で最高となり、至適温度は
75℃と推定された。 また、温度安定範囲は、10m
M リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.2)中で酵素を
各種温度で10分間保った後、氷冷しその残存活性を上
記の方法で測定した。 結果は図6に示す通り、65℃
まで安定であった。
【0053】(6)各種阻害剤の酵素活性への影響 金属イオンおよび化学試薬・糖類の酵素活性への影響
を、実施例6(4)に示した測定系を用いて、0.1m
M濃度の各種金属イオンおよび1mM濃度の化学試薬・
糖類を添加して酵素活性を測定した。 その結果、表2
に示すように、銅イオン、鉛イオンおよび銀イオンによ
り、相対活性として各々68%、67%、および19%
と活性の低下が認められたが、化合物添加による顕著な
活性化という現象は認められなかった。
【0054】 * 化合物中の略号は次のものを示す。 AcO : アセチルオキシ基 IAA : モノヨード酢酸 DTNB: 5,5'−ジチオビス(2−ニトロ安息香
酸) DTT : ジチオスレイトール EDTA: エチレンジアミン4酢酸 EGTA: エチレングリコールビス(β−アミノエチ
ルエーテル)4酢酸
【0055】(7)N末端アミノ酸配列 シュクロオリゴ糖生成酵素のN末端アミノ酸配列を島津
製作所社製の気相シーケンサー PSQ−1を用いて、
以下のように決定した。 Ser - Thr - Ala - Leu - Thr - Gln - Thr - Ser - Thr - Asn -Ser - Gln - Gln - Ser - Pro - Ile - Arg - Arg - Ala - Trp -Trp - Lys - Glu - Ala - Val - Val - Tyr - Gln - Ile - このアミノ酸配列は、配列表に示す1〜29番目のアミ
ノ酸配列と一致した。
【0056】(8)C末端アミノ酸 シュクロオリゴ糖生成酵素のC末端アミノ酸は、ヒドラ
ジン分解法(「生化学実験講座 第1巻 タンパク質の
化学II」(1976年 東京化学同人)186〜193
頁)により、ヒスチジンと決定した。
【0057】(9)作用および基質特異性 シュクロオリゴ糖生成酵素の加水分解活性を、基質とし
てp−ニトログリコシド類を使用する場合は、実施例6
(4)に記載の方法に準じ、2糖類を使用する場合は、
実施例6(3)に記載の方法に準じて測定し、測定結果
をp−ニトロフェニル−α−D−グルコピラノシドの分
解速度を100%とした時の相対活性として表3に示し
た。
【0058】
【0059】表3に示すように、本酵素は、スクロース
(73.5%)の他に、マルトース(39.0%)、トレ
ハロース(25.5%)およびp−ニトロフェニル−α
−D−マルトピラノシド(3.4%)を分解した。
【0060】
【発明の効果】本発明によれば、シュクロオリゴ糖を生
成する耐熱性酵素を大量に安定的に製造することがで
き、また、当該シュクロオリゴ糖生成酵素を用いること
によりテアンデロースおよび/またはイソメレチトース
を主成分とするシュクロオリゴ糖の工業的製造が可能と
なった。
【配列表】 配列番号 :1 配列の長さ:2320 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直線状 配列の種類:Genomic DNA 起 源: 生物名: バチルス ステアロサーモフィラス 株 名: AIK90−30株 配列の特徴: 特徴を表す記号: RBS 存在位置: 379..384 特徴を決定した方法:S 配列の特徴: 特徴を表す記号: CDS 存在位置: 396..2153 特徴を決定した方法:E 配 列 1 CC CGG GCT GTT CAC GGC GGC CGT ATT CAC GTT TGT CGC GAG CTG GAC 48 CGA GTT TTT CAT GGC GTT GGT GTT TAA CTC GTC GAG TGC GAT GCG AAC 96 CAT CCC GGT CGG GAT TGC ACT GTT CAG CAG CGA ATA CAA CGT GCC ATA 144 CGG GGA CAT CTT CGC CGG TTC CGT GGT CTC CAT CCT GCC CAT TGT CGT 192 GTT GGT CAT CCT GTT CCG CAA GTG GAT TGT CTC TGG CCT CAC GGC GGG 240 CGC GGT GAA AGG CTG ACC GCT GGG CCG CCC CAA GCC GCT TGT CCG TGC 288 GCG GGG ATG AAG CCA GTT TCG CCC GTC CCG CGG CTG TGC ACC GGT GAG 336 CGG CAG ACA AAG ACG CCG ACG ACT GGA AAC AGG TTG AGC AAA AAG GAG 384 GCA TCG ACA TTG TCC ACC GCC TTG ACG CAG ACC TCA ACG AAC TCG CAG 1 Ser Thr Ala Leu Thr Gln Thr Ser Thr Asn Ser Gln 432 CAA TCG CCC ATT CGC CGG GCG TGG TGG AAG GAA GCG GTC GTA TAC CAG 13 Gln Ser Pro Ile Arg Arg Ala Trp Trp Lys Glu Ala Val Val Tyr Gln 480 ATT TAT CCG AGA TCC TTC ATG GAC TCG AAT GGC GAC GGT ATC GGC GAT 29 Ile Tyr Pro Arg Ser Phe Met Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp 528 TTG CGC GGC ATC CTC TCG AAG CTG GAC TAC CTC AAA CTG CTC GGC GTG 45 Leu Arg Gly Ile Leu Ser Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Val 576 GAT GTG TTG TGG CTG AAT CCC ATC TAC GAC TCG CCG AAT GAC GAC ATG 61 Asp Val Leu Trp Leu Asn Pro Ile Tyr Asp Ser Pro Asn Asp Asp Met 624 GGC TAT GAC ATC CGC GAC TAC TAC AAG ATT ATG GAA GAG TTC GGG ACG 77 Gly Tyr Asp Ile Arg Asp Tyr Tyr Lys Ile Met Glu Glu Phe Gly Thr 672 ATG GAG GAC TTT GAG GAG CTG CTG CGC GAG GTG CAC GCC CGC GGC ATG 93 Met Glu Asp Phe Glu Glu Leu Leu Arg Glu Val His Ala Arg Gly Met 720 AAG CTG GTC ATG GAC CTG GTG GCC AAC CAT ACC TCA GAC GAG CAC CCG 109 Lys Leu Val Met Asp Leu Val Ala Asn His Thr Ser Asp Glu His Pro 768 TGG TTC ATC GAG TCA CGC TCC TCG CGC GAC AAC CCG TAC CGC GAC TGG 125 Trp Phe Ile Glu Ser Arg Ser Ser Arg Asp Asn Pro Tyr Arg Asp Trp 816 TAC ATT TGG CGC GAT CCG AAA GAC GGC CGC GAG CCG AAC AAC TGG TTG 141 Tyr Ile Trp Arg Asp Pro Lys Asp Gly Arg Glu Pro Asn Asn Trp Leu 864 TCG TAT TTC AGC GGA TCG GCC TGG GAA TAC GAC GAG CGC ACG GGG CAG 157 Ser Tyr Phe Ser Gly Ser Ala Trp Glu Tyr Asp Glu Arg Thr Gly Gln 912 TAC TAC CTG CAC TTG TTC AGC CGC AGG CAG CCG GAC TTG AAC TGG GAA 173 Tyr Tyr Leu His Leu Phe Ser Arg Arg Gln Pro Asp Leu Asn Trp Glu 960 AAC CCA AAG GTT CGC GAG GCC ATC TTC GAG ATG ATG CGG TTC TGG CTC 189 Asn Pro Lys Val Arg Glu Ala Ile Phe Glu Met Met Arg Phe Trp Leu 1008 GAC AAA GGG ATA GAT GGC TTC CGC ATG GAT GTC ATC AAC GCC ATC GCC 205 Asp Lys Gly Ile Asp Gly Phe Arg Met Asp Val Ile Asn Ala Ile Ala 1056 AAG GCC GAG GGT CTG CCG GAC GCG CCG GCG CGT CCC GGA GAG CGT TAC 221 Lys Ala Glu Gly Leu Pro Asp Ala Pro Ala Arg Pro Gly Glu Arg Tyr 1104 GCT TGG GGC GGC CAG TAC TTT CTC AAT CAG CCG AAG GTC CAC GAG TAC 237 Ala Trp Gly Gly Gln Tyr Phe Leu Asn Gln Pro Lys Val His Glu Tyr 1152 CTG CGC GAG ATG TAT GAT AAG GTG CTC TCT CAT TAC GAC ATC ATG ACC 253 Leu Arg Glu Met Tyr Asp Lys Val Leu Ser His Tyr Asp Ile Met Thr 1200 GTC GGC GAG ACC GGC GGT GTG ACG ACA AAG GAT GCA CTC TTG TTT GCC 269 Val Gly Glu Thr Gly Gly Val Thr Thr Lys Asp Ala Leu Leu Phe Ala 1248 GGT GAA GAC CGG CGC GAG CTG AAC ATG GTC TTC CAG TTT GAA CAC ATG 285 Gly Glu Asp Arg Arg Glu Leu Asn Met Val Phe Gln Phe Glu His Met 1296 GAC ATC GAT GCG ACC GAC GGC GAC AAG TGG CGG CCG CGG CCG TGG CGA 301 Asp Ile Asp Ala Thr Asp Gly Asp Lys Trp Arg Pro Arg Pro Trp Arg 1344 TTG ACC GAG TTG AAA ACC ATC ATG ACG CGG TGG CAA AAT GAT TTG TAC 317 Leu Thr Glu Leu Lys Thr Ile Met Thr Arg Trp Gln Asn Asp Leu Tyr 1392 GGC AAG GCC TGG AAC AGC CTG TAC TGG ACC AAC CAT GAC CAG CCC CGC 333 Gly Lys Ala Trp Asn Ser Leu Tyr Trp Thr Asn His Asp Gln Pro Arg 1440 GCG GTG TCG CGG TTT GGC AAC GAC GGT CCC TAC CGC GTG GAG TCA GCC 349 Ala Val Ser Arg Phe Gly Asn Asp Gly Pro Tyr Arg Val Glu Ser Ala 1488 AAG ATG CTT GCC ACC GTC CTG CAC ATG ATG CAG GGG ACC CCC TAC ATC 365 Lys Met Leu Ala Thr Val Leu His Met Met Gln Gly Thr Pro Tyr Ile 1536 TAC CAG GGC GAG GAA ATC GGC ATG ACG AAC TGT CCG TTT GAC TCT ATT 381 Tyr Gln Gly Glu Glu Ile Gly Met Thr Asn Cys Pro Phe Asp Ser Ile 1584 GAC GAG TAC CGG GAC GTC GAG ATC CAC AAC CTG TGG CGG CAC CGT GTG 397 Asp Glu Tyr Arg Asp Val Glu Ile His Asn Leu Trp Arg His Arg Val 1632 ATG GAA GGC GGC CAG GAC CCT GCC GAG GTG CTG CGC GTC ATC CAG CTC 413 Met Glu Gly Gly Gln Asp Pro Ala Glu Val Leu Arg Val Ile Gln Leu 1680 AAA GGG CGG GAC AAC GCG CGC ACG CCC ATG CAG TGG GAC GAT TCA CCG 429 Lys Gly Arg Asp Asn Ala Arg Thr Pro Met Gln Trp Asp Asp Ser Pro 1728 AAC GCC GGG TTC ACC ACC GGT ACG CCG TGG ATC AAG GTG AAC CCA AAC 445 Asn Ala Gly Phe Thr Thr Gly Thr Pro Trp Ile Lys Val Asn Pro Asn 1776 TAT CGC GAG ATT AAC GTC AAG CAG GCC CTG GCG GAC CCG AAC TCG ATT 461 Tyr Arg Glu Ile Asn Val Lys Gln Ala Leu Ala Asp Pro Asn Ser Ile 1824 TTC CAT TAC TAC CGC CGC CTG ATT CAG TTG CGC AAA CAG CAT CCC ATC 477 Phe His Tyr Tyr Arg Arg Leu Ile Gln Leu Arg Lys Gln His Pro Ile 1872 GTG GTG TAC GGC AAG TAT GAC CTG ATT CTG CCG GAT CAC GAG GAG ATT 493 Val Val Tyr Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Leu Pro Asp His Glu Glu Ile 1920 TGG GCT TAC ACG CGC ACG CTG GGA GAC GAG CGC TGG CTG ATT GTG GCC 509 Trp Ala Tyr Thr Arg Thr Leu Gly Asp Glu Arg Trp Leu Ile Val Ala 1968 AAC TTC TTT GGC GGC ACT CCG GAG TTC GAG CTG CCG CCG GAA GTC CGG 525 Asn Phe Phe Gly Gly Thr Pro Glu Phe Glu Leu Pro Pro Glu Val Arg 2016 TGC GAG GGC GCA GAG CTG GTG ATT GCC AAC TAC CCG GTG GAC GAT TCG 541 Cys Glu Gly Ala Glu Leu Val Ile Ala Asn Tyr Pro Val Asp Asp Ser 2064 GAA GCG GGC GGT CCA GCG GCC GCT GGG GCA CCT CAC CGC TTC CGT CTG 557 Glu Ala Gly Gly Pro Ala Ala Ala Gly Ala Pro His Arg Phe Arg Leu 2112 CGC CCG TAC GAA TGC CGC GTC TAC CGG CTG CTC GGC TGG CAC TGA CAG 573 Arg Pro Tyr Glu Cys Arg Val Tyr Arg Leu Leu Gly Trp His 2160 GCG ATT GGG CGG GTG CGC GCA CGG GCC TGC GCA AGA GGG AGG TCG GTA 2208 CGA TGA AGG CGG TCT ACA TTG AGG CCT ATG GTG GCA GGG AAC AGC TCA 2256 AGT ACG GTG ATC TCC CGA AGC CTG AGC TTC GTC CCC GCG ACG TGC TCA 2304 TCG AGG TGC ACG CCG CC
【図面の簡単な説明】
【図1】 シュクロオリゴ糖生成酵素遺伝子を含有する
DNA 断片が挿入された、各種挿入DNA 断片の長さ
の異なるプラスミドの制限酵素地図を示す図面。
【図2】 スクロースを基質とした場合の本発明のシュ
クロオリゴ糖生成酵素の反応最適pHを示す図面。 図
中、○は酢酸ナトリウム緩衝液、●はリン酸ナトリウム
緩衝液を示す。
【図3】 p−ニトロフェニル−α−D−グルコピラノ
シドを基質としてエンドポイント法で測定した場合の本
発明のシュクロオリゴ糖生成酵素の反応最適pHを示す
図面。 図中、○および●は図2と同じである。
【図4】 本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素の pH
安定範囲を示す図面。図中、○は酢酸ナトリウム緩衝
液、●はリン酸ナトリウム緩衝液、□はグリシン−Na
OH緩衝液を示す。
【図5】 本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素の反応最
適温度を示す図面。
【図6】 本発明のシュクロオリゴ糖生成酵素の温度安
定範囲を示す図面。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 柴野 裕次 大阪府三島郡島本町若山台1丁目1番1 号 サントリー株式会社基礎研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/10 GenBank/EMBL/DDBJ/G eneSeq SwissProt/PIR/GeneS eq BIOSIS/MEDLINE/WPID S(STN) JICSTファイル(JOIS)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 次の式(I) STATTSTNSSRRAWWKAVVYYRSMDSNGDGGDRGSKDYKGVDVWNYDSNDDMGYDRDYY KMGTMDRVHARGMKVMDVANHTSDHWSRSSRDNYRDWYWRDKDGRNNWSYSGSAWYDRTG YYHSRRDNWNKVRAMMRWDKGDGRMDVNAAKAGDAARGRYAWGGYNKVHYRMYDKVSHYD MTVGTGGVTTKDAAGDRRNMVHMDDATDGDKWRRWRTKTMTRWNDYGKAWNSYWTNHDRA VSRGNDGYRVSAKMATVHMMGTYYGGMTNCDSDYRDVHNWRHRVMGGDAVRVKGRDNART MWDDSNAGTTGTWKVNNYRNVKAADNSHYYRRRKHVVYGKYDDHWAYTRTGDRWVANGGT VRCGAVANYVDDSAGGAAAGAHRRRYCRVYRGWH (I) (式中のアルファベットは、以下のアミノ酸を示す。
    A; アラニン、C; システイン、D; アスパラギン酸、
    E; グルタミン酸、F; フェニルアラニン、G;グリシ
    ン、H; ヒスチジン、I; イソロイシン、K; リシン、
    L; ロイシン、M; メチオニン、N; アスパラギン、
    P; プロリン、Q; グルタミン、R; アルギニン、S;
    セリン、T; スレオニン、V; バリン、W; トリプトフ
    ァン、Y; チロシン)で表されるアミノ酸配列または当
    該配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
    若しくは付加されたアミノ酸配列で示され、下記の作用
    を有する新規耐熱性シュクロオリゴ糖生成酵素。転移反応:α−D−グルコピラノシド(Glc−X)1
    モルとグルコシル基受容体(Y)1モルとから、新たな
    α−D−グルコピラノシド(Glc−Y)1モルと
    (X)1モルを生成する。 加水分解:1モルのα−D−グルコピラノシド(Glc
    −X)を加水分解し、1モルの(X)と1モルのグルコ
    ースを生成する。(ここでX、Yはいずれも糖あるいは
    アグリコンを示す)
  2. 【請求項2】 下記の理化学的性質を有する請求項1記
    載の新規耐熱性シュクロオリゴ糖生成酵素。 (1)基質特異性 転移反応:α−D−グルコピラノシド(Glc−X)と
    グルコシル基受容体(Y)がいずれもスクロースである
    場合の転移反応の主生成物が、テアンデロースおよび/
    またはイソメレチトースである。 加水分解:スクロースおよびp−ニトロフェニル−α−
    D−グルコピラノシドを加水分解するが、p−ニトロフ
    ェニル−β−D−グルコピラノシドは加水分解しない。
    (ここでX、Yはいずれも糖あるいはアグリコンを示
    す) (2)反応最適pH: pH5.0〜6.0 反応最適温度: 75℃(pH6.0) (3)pH安定性: pH5.0〜12.0(55℃,1
    0分間)で安定 熱安定性: 65℃(pH7.2,10分間)で安定 (4)等電点: pI4.6(等電点電気泳動) (5)分子量: 約65,000(SDS−PAGE) 約240,000(ゲル濾過)
  3. 【請求項3】 前記式(I)で表されるアミノ酸配列ま
    たは当該配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠
    失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる請求
    項1のポリペプチドをコードする遺伝子。
  4. 【請求項4】 次の式(II) TCCACCG CCTTGACGCA GACCTCAACG AACTCGCAGC AATCGCCCAT TCGCCGGGCG TGGTGGAAGG AAGCGGTCGT ATACCAGATT TATCCGAGAT CCTTCATGGA CTCGAATGGC GACGGTATCG GCGATTTGCG CGGCATCCTC TCGAAGCTGG ACTACCTCAA ACTGCTCGGC GTGGATGTGT TGTGGCTGAA TCCCATCTAC GACTCGCCGA ATGACGACAT GGGCTATGAC ATCCGCGACT ACTACAAGAT TATGGAAGAG TTCGGGACGA TGGAGGACTT TGAGGAGCTG CTGCGCGAGG TGCACGCCCG CGGCATGAAG CTGGTCATGG ACCTGGTGGC CAACCATACC TCAGACGAGC ACCCGTGGTT CATCGAGTCA CGCTCCTCGC GCGACAACCC GTACCGCGAC TGGTACATTT GGCGCGATCC GAAAGACGGC CGCGAGCCGA ACAACTGGTT GTCGTATTTC AGCGGATCGG CCTGGGAATA CGACGAGCGC ACGGGGCAGT ACTACCTGCA CTTGTTCAGC CGCAGGCAGC CGGACTTGAA CTGGGAAAAC CCAAAGGTTC GCGAGGCCAT CTTCGAGATG ATGCGGTTCT GGCTCGACAA AGGGATAGAT GGCTTCCGCA TGGATGTCAT CAACGCCATC GCCAAGGCCG AGGGTCTGCC GGACGCGCCG GCGCGTCCCG GAGAGCGTTA CGCTTGGGGC GGCCAGTACT TTCTCAATCA GCCGAAGGTC CACGAGTACC TGCGCGAGAT GTATGATAAG GTGCTCTCTC ATTACGACAT CATGACCGTC GGCGAGACCG GCGGTGTGAC GACAAAGGAT GCACTCTTGT TTGCCGGTGA AGACCGGCGC GAGCTGAACA TGGTCTTCCA GTTTGAACAC ATGGACATCG ATGCGACCGA CGGCGACAAG TGGCGGCCGC GGCCGTGGCG ATTGACCGAG TTGAAAACCA TCATGACGCG GTGGCAAAAT GATTTGTACG GCAAGGCCTG GAACAGCCTG TACTGGACCA ACCATGACCA GCCCCGCGCG GTGTCGCGGT TTGGCAACGA CGGTCCCTAC CGCGTGGAGT CAGCCAAGAT GCTTGCCACC GTCCTGCACA TGATGCAGGG GACCCCCTAC ATCTACCAGG GCGAGGAAAT CGGCATGACG AACTGTCCGT TTGACTCTAT TGACGAGTAC CGGGACGTCG AGATCCACAA CCTGTGGCGG CACCGTGTGA TGGAAGGCGG CCAGGACCCT GCCGAGGTGC TGCGCGTCAT CCAGCTCAAA GGGCGGGACA ACGCGCGCAC GCCCATGCAG TGGGACGATT CACCGAACGC CGGGTTCACC ACCGGTACGC CGTGGATCAA GGTGAACCCA AACTATCGCG AGATTAACGT CAAGCAGGCC CTGGCGGACC CGAACTCGAT TTTCCATTAC TACCGCCGCC TGATTCAGTT GCGCAAACAG CATCCCATCG TGGTGTACGG CAAGTATGAC CTGATTCTGC CGGATCACGA GGAGATTTGG GCTTACACGC GCACGCTGGG AGACGAGCGC TGGCTGATTG TGGCCAACTT CTTTGGCGGC ACTCCGGAGT TCGAGCTGCC GCCGGAAGTC CGGTGCGAGG GCGCAGAGCT GGTGATTGCC AACTACCCGG TGGACGATTC GGAAGCGGGC GGTCCAGCGG CCGCTGGGGC ACCTCACCGC TTCCGTCTGC GCCCGTACGA ATGCCGCGTC TACCGGCTGC TCGGCTGGCA C (II) で表される塩基配列からなる請求項3記載の遺伝子。
  5. 【請求項5】 請求項3に記載の遺伝子を含有する組換
    えベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、該
    培養物より耐熱性シュクロオリゴ糖生成酵素を採取する
    ことを特徴とする請求項1に記載の新規耐熱性シュクロ
    オリゴ糖生成酵素の製造法。
  6. 【請求項6】 請求項1に記載の新規耐熱性シュクロオ
    リゴ糖生成酵素を用いることを特徴とする、テアンデロ
    ースおよび/またはイソメレチトースを主成分とするシ
    ュクロオリゴ糖の製造法。
  7. 【請求項7】 スクロース、マルトースおよびトレハロ
    ースのいずれも加水分解するα−グルコシダーゼ活性を
    有する請求項1に記載の新規耐熱性シュクロオリゴ糖生
    成酵素。
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