JP2003250559A - 糖転移反応を触媒する新規な酵素をコードする遺伝子および当該酵素の製造方法 - Google Patents
糖転移反応を触媒する新規な酵素をコードする遺伝子および当該酵素の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【課題】 糖転移反応を触媒する新規な酵素をコードす
る遺伝子、当該酵素遺伝子を含む組換えDNA、その組換
えDNAを移入した形質転換体、それらを利用した組換え
酵素およびその製造方法並びに該酵素を用いた配糖体の
製造方法の提供。 【解決手段】 (a)特定の配列に記載のアミノ酸配列か
らなるタンパク質または、(b)アミノ酸配列(a)において
1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ糖転移活性を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子、上記の遺伝子を含む組換
えDNA、上記組換えDNAを導入した形質転換体、上
記の形質転換体によって生産される糖転移活性を有する
組換え酵素、上記の形質転換体を培地に培養し培養物か
ら糖転移活性を有する組換え酵素を採取することを特徴
とする糖転移活性を有する組換え酵素の製造方法、およ
び、上記の形質転換体または上記組換え酵素を用いるこ
とを特徴とする配糖体の製造方法。
る遺伝子、当該酵素遺伝子を含む組換えDNA、その組換
えDNAを移入した形質転換体、それらを利用した組換え
酵素およびその製造方法並びに該酵素を用いた配糖体の
製造方法の提供。 【解決手段】 (a)特定の配列に記載のアミノ酸配列か
らなるタンパク質または、(b)アミノ酸配列(a)において
1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ糖転移活性を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子、上記の遺伝子を含む組換
えDNA、上記組換えDNAを導入した形質転換体、上
記の形質転換体によって生産される糖転移活性を有する
組換え酵素、上記の形質転換体を培地に培養し培養物か
ら糖転移活性を有する組換え酵素を採取することを特徴
とする糖転移活性を有する組換え酵素の製造方法、およ
び、上記の形質転換体または上記組換え酵素を用いるこ
とを特徴とする配糖体の製造方法。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は糖転移反応を触媒す
る新規な酵素をコードする遺伝子、当該酵素遺伝子を含
む組換えDNA、その組換えDNAを移入した形質転換体、そ
れらを利用した組換え酵素およびその製造方法並びに該
酵素を用いた配糖体の製造方法に関する。
る新規な酵素をコードする遺伝子、当該酵素遺伝子を含
む組換えDNA、その組換えDNAを移入した形質転換体、そ
れらを利用した組換え酵素およびその製造方法並びに該
酵素を用いた配糖体の製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、
β−グルコシダーゼ等の糖質加水分解酵素は、反応系に
適当な受容体が存在すると糖転移反応を触媒する性質を
有することは広く知られている。加水分解酵素による糖
転移反応は、デンプン、麦芽糖、セルロース等の安価に
大量に入手可能な糖質を糖の供与体として利用できるこ
と、基質特異性や反応効率が高いといった理由からオリ
ゴ糖の製造等に広く利用されている。しかしながら、多
くの場合、このような糖転移反応は糖質間では起こり易
いものの、糖以外の化合物を受容体とした糖転移反応で
は反応効率が低く、各種配糖体の合成に利用するには適
していなかった。例えば、酵母由来のα−グルコシダー
ゼを用い、メントールを受容体とした糖転移反応により
l−メンチル−α−D−グルコピラノシドを合成した場合
の収率は10%以下と低く実用化には問題があった(特開
平9−224693号公報)。
β−グルコシダーゼ等の糖質加水分解酵素は、反応系に
適当な受容体が存在すると糖転移反応を触媒する性質を
有することは広く知られている。加水分解酵素による糖
転移反応は、デンプン、麦芽糖、セルロース等の安価に
大量に入手可能な糖質を糖の供与体として利用できるこ
と、基質特異性や反応効率が高いといった理由からオリ
ゴ糖の製造等に広く利用されている。しかしながら、多
くの場合、このような糖転移反応は糖質間では起こり易
いものの、糖以外の化合物を受容体とした糖転移反応で
は反応効率が低く、各種配糖体の合成に利用するには適
していなかった。例えば、酵母由来のα−グルコシダー
ゼを用い、メントールを受容体とした糖転移反応により
l−メンチル−α−D−グルコピラノシドを合成した場合
の収率は10%以下と低く実用化には問題があった(特開
平9−224693号公報)。
【0003】l−メンチル−α−D−グルコピラノシドは
メントールとグルコースが結合した化合物であり、それ
自体は無味無臭の白色結晶であり、昇華性も示さない
が、加水分解酵素や熱によって分解し、メントールを生
じるという独特の性質を持っており(Agric. Biol. Che
m., 43巻, 307頁, 1979年)、食品、口中清涼剤、化粧
品、タバコ等で清涼感の持続や安定性の向上、香喫味改
良剤としての応用が開示されているが(特開昭62−1617
16号公報、特開平6−329528号公報、特開平5−219929号
公報)、効率的に生産する方法が見出されていなかった
ために実用化されていなかった。
メントールとグルコースが結合した化合物であり、それ
自体は無味無臭の白色結晶であり、昇華性も示さない
が、加水分解酵素や熱によって分解し、メントールを生
じるという独特の性質を持っており(Agric. Biol. Che
m., 43巻, 307頁, 1979年)、食品、口中清涼剤、化粧
品、タバコ等で清涼感の持続や安定性の向上、香喫味改
良剤としての応用が開示されているが(特開昭62−1617
16号公報、特開平6−329528号公報、特開平5−219929号
公報)、効率的に生産する方法が見出されていなかった
ために実用化されていなかった。
【0004】先に、本発明者らはl−メンチル−α−D−
グルコピラノシドの効率的な生産を目指して微生物を探
索した結果、Xanthomonas campestris WU-9701 (FERM
BP-6578)、Stenotrophomonas maltophilia D-1 (FERM
BP-6579)を用い、メントールとマルトースを原料とし
て効率的にl−メンチル−α−D−グルコピラノシドを生
産する方法を見出した(特開平11-155591号公報)。さ
らに、これら菌株においてl−メンチル−α−D−グルコ
ピラノシドの合成を触媒する酵素の諸性質から、本酵素
が高い糖転移活性を示す新規な酵素であることを明らか
にし、本酵素がメントールのみならずハイドロキノンや
カプサイシン等の水酸基を有する化合物も糖転移反応の
受容体としうることを見出した(特開2001-46096号公
報)。
グルコピラノシドの効率的な生産を目指して微生物を探
索した結果、Xanthomonas campestris WU-9701 (FERM
BP-6578)、Stenotrophomonas maltophilia D-1 (FERM
BP-6579)を用い、メントールとマルトースを原料とし
て効率的にl−メンチル−α−D−グルコピラノシドを生
産する方法を見出した(特開平11-155591号公報)。さ
らに、これら菌株においてl−メンチル−α−D−グルコ
ピラノシドの合成を触媒する酵素の諸性質から、本酵素
が高い糖転移活性を示す新規な酵素であることを明らか
にし、本酵素がメントールのみならずハイドロキノンや
カプサイシン等の水酸基を有する化合物も糖転移反応の
受容体としうることを見出した(特開2001-46096号公
報)。
【0005】しかしながら、上記菌株における本酵素の
生産量は必ずしも満足できるものではなく、さらに効率
的かつ安定な生産方法の確立が望まれていた。
生産量は必ずしも満足できるものではなく、さらに効率
的かつ安定な生産方法の確立が望まれていた。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】メントール等の水酸基
を有する化合物を受容体として高い糖転移活性を示す酵
素は各種配糖体の製造において重要な酵素の一つである
が、このような性質を示す酵素はXanthomonas属細菌、S
tenotrophomonas属細菌等の一部の細菌にしか見出され
ておらず、これら酵素のアミノ酸配列についても一部の
配列しか明らかにされていない。また、上記菌株におけ
る本酵素の生産量は、配糖体生産を工業的に行うことを
考えた場合に必ずしも満足できるものではなかった。
を有する化合物を受容体として高い糖転移活性を示す酵
素は各種配糖体の製造において重要な酵素の一つである
が、このような性質を示す酵素はXanthomonas属細菌、S
tenotrophomonas属細菌等の一部の細菌にしか見出され
ておらず、これら酵素のアミノ酸配列についても一部の
配列しか明らかにされていない。また、上記菌株におけ
る本酵素の生産量は、配糖体生産を工業的に行うことを
考えた場合に必ずしも満足できるものではなかった。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明者らは本酵素の効
率的生産を目的として鋭意検討した結果、Xanthomonas
campestris WU-9701(FERM BP-6578)から本酵素をコー
ドする遺伝子のクローニングに成功し、その全塩基配列
並びに推定アミノ酸配列を決定した。さらに、取得した
遺伝子を含む組換えDNAを保持する微生物を培養するこ
とにより、本酵素を効率的に生産できることを見出すと
ともに、配糖体の合成に利用できることを確認し本発明
を完成させた。
率的生産を目的として鋭意検討した結果、Xanthomonas
campestris WU-9701(FERM BP-6578)から本酵素をコー
ドする遺伝子のクローニングに成功し、その全塩基配列
並びに推定アミノ酸配列を決定した。さらに、取得した
遺伝子を含む組換えDNAを保持する微生物を培養するこ
とにより、本酵素を効率的に生産できることを見出すと
ともに、配糖体の合成に利用できることを確認し本発明
を完成させた。
【0008】即ち、本願の第1の発明は、以下の(a)配
列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質また
は、(b)アミノ酸配列(a)において1もしくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列から
なり、かつ糖転移活性を有するタンパク質をコードする
遺伝子であり、本願の第2の発明は、上記の遺伝子を含
むことを特徴とする組換えDNAであり、また本願の第
3の発明は、上記組換えDNAを用いて上記の遺伝子を
導入した形質転換体であり、また更に本願の第4の発明
は、上記の形質転換体によって生産される糖転移活性を
有する組換え酵素であり、また更に本願の第5の発明
は、上記の形質転換体を培地に培養し、培養物から糖転
移活性を有する組換え酵素を採取することを特徴とする
糖転移活性を有する組換え酵素の製造方法であり、また
更に本願の第6の発明は、上記の形質転換体または上記
組換え酵素を用いることを特徴とする配糖体の製造方法
である。
列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質また
は、(b)アミノ酸配列(a)において1もしくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列から
なり、かつ糖転移活性を有するタンパク質をコードする
遺伝子であり、本願の第2の発明は、上記の遺伝子を含
むことを特徴とする組換えDNAであり、また本願の第
3の発明は、上記組換えDNAを用いて上記の遺伝子を
導入した形質転換体であり、また更に本願の第4の発明
は、上記の形質転換体によって生産される糖転移活性を
有する組換え酵素であり、また更に本願の第5の発明
は、上記の形質転換体を培地に培養し、培養物から糖転
移活性を有する組換え酵素を採取することを特徴とする
糖転移活性を有する組換え酵素の製造方法であり、また
更に本願の第6の発明は、上記の形質転換体または上記
組換え酵素を用いることを特徴とする配糖体の製造方法
である。
【0009】
【発明の実施の形態】本発明の糖転移反応を触媒する新
規な酵素をコードする遺伝子のクローニング、組換えDN
Aの調製、形質転換体の作製、組換え酵素の生産、配糖
体の製造方法については、実施例で詳細に説明するが、
以下に概略を記す。
規な酵素をコードする遺伝子のクローニング、組換えDN
Aの調製、形質転換体の作製、組換え酵素の生産、配糖
体の製造方法については、実施例で詳細に説明するが、
以下に概略を記す。
【0010】1) DNAの抽出
まず、l−メンチル−α−D−グルコピラノシドを効率的
に生産できる微生物、例えばXanthomonas campestris W
U-9701(FERM BP-6578)やStenotrophomonas maltophil
ia D-1(FERM BP-6579)を培養して得られる培養物から
遠心分離等の方法で菌体を回収し、取得した菌体からDN
Aを抽出する。DNAの抽出は常法に従って行うことができ
る。即ち、リゾチーム等の酵素処理、超音波処理、界面
活性剤処理、凍結融解処理などの方法で溶菌した後、フ
ェノール抽出、除タンパク処理、プロテアーゼ処理、リ
ボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿、遠心分離などの
方法を適宜組み合わせることで行うことができる。ま
た、市販のDNA抽出キットを用いて行うこともできる。
に生産できる微生物、例えばXanthomonas campestris W
U-9701(FERM BP-6578)やStenotrophomonas maltophil
ia D-1(FERM BP-6579)を培養して得られる培養物から
遠心分離等の方法で菌体を回収し、取得した菌体からDN
Aを抽出する。DNAの抽出は常法に従って行うことができ
る。即ち、リゾチーム等の酵素処理、超音波処理、界面
活性剤処理、凍結融解処理などの方法で溶菌した後、フ
ェノール抽出、除タンパク処理、プロテアーゼ処理、リ
ボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿、遠心分離などの
方法を適宜組み合わせることで行うことができる。ま
た、市販のDNA抽出キットを用いて行うこともできる。
【0011】2) 遺伝子ライブラリーの作製
常法により、抽出したDNAを適当な制限酵素で消化し、
必要に応じてフォスファターゼ等の修飾酵素処理や種々
のリンカーやアダプターの付加を施した後、得られたDN
A断片をファージやプラスミドベクターに挿入して遺伝
子ライブラリーを作製できる。また、密度勾配遠心法や
電気泳動ゲルからの抽出等の方法によって最適な長さの
DNA断片のみを選択してファージやプラスミドベクター
に挿入して部分遺伝子ライブラリーを作製できる。
必要に応じてフォスファターゼ等の修飾酵素処理や種々
のリンカーやアダプターの付加を施した後、得られたDN
A断片をファージやプラスミドベクターに挿入して遺伝
子ライブラリーを作製できる。また、密度勾配遠心法や
電気泳動ゲルからの抽出等の方法によって最適な長さの
DNA断片のみを選択してファージやプラスミドベクター
に挿入して部分遺伝子ライブラリーを作製できる。
【0012】3) 目的遺伝子のクローニング方法
本酵素の精製標品より決定した部分アミノ酸配列を基に
オリゴヌクレオチドを合成し、l−メンチル−α−D−グ
ルコピラノシドを効率的に生産できる微生物から抽出し
たDNAをテンプレート、合成したオリゴヌクレオチドを
プライマーとしてPCRを行う。PCRにより増幅されたDNA
断片(以下、PCR増幅産物)の塩基配列を決定し、精製
酵素の部分アミノ酸配列に相当する塩基配列が含まれて
いることを確認した後、このPCR増幅産物をプローブと
してハイブリダイゼーション等の方法を用いて上記遺伝
子ライブラリーから目的遺伝子を含むものを選抜でき
る。また、PCR法を利用せずに上記オリゴヌクレオチド
をプローブとしてハイブリダイゼーション等の方法を用
いて目的遺伝子の選抜を行うことも可能である。
オリゴヌクレオチドを合成し、l−メンチル−α−D−グ
ルコピラノシドを効率的に生産できる微生物から抽出し
たDNAをテンプレート、合成したオリゴヌクレオチドを
プライマーとしてPCRを行う。PCRにより増幅されたDNA
断片(以下、PCR増幅産物)の塩基配列を決定し、精製
酵素の部分アミノ酸配列に相当する塩基配列が含まれて
いることを確認した後、このPCR増幅産物をプローブと
してハイブリダイゼーション等の方法を用いて上記遺伝
子ライブラリーから目的遺伝子を含むものを選抜でき
る。また、PCR法を利用せずに上記オリゴヌクレオチド
をプローブとしてハイブリダイゼーション等の方法を用
いて目的遺伝子の選抜を行うことも可能である。
【0013】当然のことであるが、本発明によって初め
て明らかにされた本酵素をコードする遺伝子の全塩基配
列並びに本酵素の全アミノ酸配列を基に各種オリゴヌク
レオチドを合成し、それらを用いてPCRやハイブリダイ
ゼーションを行うことにより、様々な生物から本酵素と
同様の糖転移反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を
取得することも可能である。
て明らかにされた本酵素をコードする遺伝子の全塩基配
列並びに本酵素の全アミノ酸配列を基に各種オリゴヌク
レオチドを合成し、それらを用いてPCRやハイブリダイ
ゼーションを行うことにより、様々な生物から本酵素と
同様の糖転移反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を
取得することも可能である。
【0014】4) 形質転換体の作製
本酵素を生産する形質転換体は上記方法により取得され
た本酵素遺伝子を含む組換えDNAを用いて宿主を形質転
換することにより作製できる。当該組換えDNAは宿主微
生物で自律的に増殖し得るプラスミドベクターあるいは
ファージベクターに本酵素遺伝子を挿入することにより
作製できる。宿主−ベクター系は、当該組換えDNAが自
律的に増殖可能で安定に保持され、形質が発現可能なも
のであればよい。例えば、プラスミドベクターpUC118や
ファージベクターλEMBL3と大腸菌、プラスミドベクタ
ーpUB112と枯草菌、プラスミドベクターYEpと酵母など
の宿主−ベクター系が挙げられる。宿主微生物に組換え
DNAを導入して形質転換する方法は公知の方法を用いる
ことができ、例えば、塩化カルシウム法[Cohen, S.N.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (197
2)]やエレクトロポレーション法によって組換え体DNA
を導入することができる。
た本酵素遺伝子を含む組換えDNAを用いて宿主を形質転
換することにより作製できる。当該組換えDNAは宿主微
生物で自律的に増殖し得るプラスミドベクターあるいは
ファージベクターに本酵素遺伝子を挿入することにより
作製できる。宿主−ベクター系は、当該組換えDNAが自
律的に増殖可能で安定に保持され、形質が発現可能なも
のであればよい。例えば、プラスミドベクターpUC118や
ファージベクターλEMBL3と大腸菌、プラスミドベクタ
ーpUB112と枯草菌、プラスミドベクターYEpと酵母など
の宿主−ベクター系が挙げられる。宿主微生物に組換え
DNAを導入して形質転換する方法は公知の方法を用いる
ことができ、例えば、塩化カルシウム法[Cohen, S.N.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (197
2)]やエレクトロポレーション法によって組換え体DNA
を導入することができる。
【0015】5) 組換え酵素の生産
上記方法で作製した形質転換体を培養し、培養物から組
換え酵素である糖転移反応を触媒する酵素を採取するこ
とができる。培養条件については宿主やベクターの種類
に応じて、適宜決定することができる。例えば、大腸菌
を宿主とする場合の培養条件は、LB培地、YT培地、M9培
地等を用いて培養温度25〜37℃で培養時間4〜48時間で
ある。得られた培養物からの本酵素の採取は常法により
行うことができ、例えば、培養物から遠心分離により菌
体を回収し、超音波処理、フレンチプレス等の方法で細
胞を破砕し、細胞残渣を遠心分離により除き、本酵素を
採取することができる。本酵素をさらに精製する場合
は、硫安分画、透析、各種クロマトグラフィー等の公知
の方法を組み合わせる方法が挙げられる。
換え酵素である糖転移反応を触媒する酵素を採取するこ
とができる。培養条件については宿主やベクターの種類
に応じて、適宜決定することができる。例えば、大腸菌
を宿主とする場合の培養条件は、LB培地、YT培地、M9培
地等を用いて培養温度25〜37℃で培養時間4〜48時間で
ある。得られた培養物からの本酵素の採取は常法により
行うことができ、例えば、培養物から遠心分離により菌
体を回収し、超音波処理、フレンチプレス等の方法で細
胞を破砕し、細胞残渣を遠心分離により除き、本酵素を
採取することができる。本酵素をさらに精製する場合
は、硫安分画、透析、各種クロマトグラフィー等の公知
の方法を組み合わせる方法が挙げられる。
【0016】なお、上記方法で得られた酵素は、以下の
性質を有する。 (a)作用:糖類のα−1,4−結合を加水分解する。
マルトースを供与体として受容体にグルコースを転移さ
せ配糖体を合成する。 (b)加水分解反応の基質特異性:加水分解反応では、
マルトース、p−ニトロフェニル−α−D−グルコピラ
ノシドには作用するが、マルトトリオース、マルトへキ
サオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、シ
ュークロース、トレハロース、可溶性デンプン、アミロ
ース、シクロデキストリンにはほとんど作用しない。 (c)糖転移反応の受容体特異性:糖転移反応では、メ
ントール、エタノール、1−プロパノール、1−ブタノ
ール、2−ブタノール、イソブチルアルコール、1−ア
ミルアルコール、2−アミルアルコール、5−ノニルア
ルコール等のアルコール性水酸基を有する化合物及びカ
プサイシン、ジヒドロカプサイシン、ノニル酸バニリル
アミド、カテキン、エピカテキン、バニリン、ハイドロ
キノン、カテコール、レゾルシノール、3,4−ジメト
キシフェノール等のフェノール性水酸基を有する化合物
を受容体とすることができる。 (d)反応至適pH:マルトースを加水分解する場合の
至適pHはpH7〜8近辺である。メントールを受容
体、マルトースを供与体とした糖転移反応の至適pHは
pH7.0〜8.5近辺である。 (e)反応最適温度:マルトースを基質とした加水分解
反応の最適温度は30〜40℃、メントールを受容体、
マルトースを供与体とした糖転移反応の最適温度は35
〜45℃である。 (f)分子量:SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動の結果、分子量は約57,000であった。
性質を有する。 (a)作用:糖類のα−1,4−結合を加水分解する。
マルトースを供与体として受容体にグルコースを転移さ
せ配糖体を合成する。 (b)加水分解反応の基質特異性:加水分解反応では、
マルトース、p−ニトロフェニル−α−D−グルコピラ
ノシドには作用するが、マルトトリオース、マルトへキ
サオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、シ
ュークロース、トレハロース、可溶性デンプン、アミロ
ース、シクロデキストリンにはほとんど作用しない。 (c)糖転移反応の受容体特異性:糖転移反応では、メ
ントール、エタノール、1−プロパノール、1−ブタノ
ール、2−ブタノール、イソブチルアルコール、1−ア
ミルアルコール、2−アミルアルコール、5−ノニルア
ルコール等のアルコール性水酸基を有する化合物及びカ
プサイシン、ジヒドロカプサイシン、ノニル酸バニリル
アミド、カテキン、エピカテキン、バニリン、ハイドロ
キノン、カテコール、レゾルシノール、3,4−ジメト
キシフェノール等のフェノール性水酸基を有する化合物
を受容体とすることができる。 (d)反応至適pH:マルトースを加水分解する場合の
至適pHはpH7〜8近辺である。メントールを受容
体、マルトースを供与体とした糖転移反応の至適pHは
pH7.0〜8.5近辺である。 (e)反応最適温度:マルトースを基質とした加水分解
反応の最適温度は30〜40℃、メントールを受容体、
マルトースを供与体とした糖転移反応の最適温度は35
〜45℃である。 (f)分子量:SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動の結果、分子量は約57,000であった。
【0017】6) 配糖体の製造方法
上記形質転換体あるいは上記形質転換体から採取した組
換え酵素を用い、特開平11-155591号公報及び特開2001-
46096号公報に記載の方法と同様の反応条件で各種配糖
体を生産することができる。例えば、上記形質転換体を
培養し、培養物から菌体を回収してこれを凍結乾燥し、
マルトースを含む緩衝液に凍結乾燥菌体とメントールを
加えて反応させることによりl−メンチル−α−D−グル
コピラノシドを合成することができる。
換え酵素を用い、特開平11-155591号公報及び特開2001-
46096号公報に記載の方法と同様の反応条件で各種配糖
体を生産することができる。例えば、上記形質転換体を
培養し、培養物から菌体を回収してこれを凍結乾燥し、
マルトースを含む緩衝液に凍結乾燥菌体とメントールを
加えて反応させることによりl−メンチル−α−D−グル
コピラノシドを合成することができる。
【0018】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
る。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
る。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
【0019】[実施例1] 糖転移反応を触媒する酵素
をコードする遺伝子の取得 1) ゲノムDNAの抽出Xanthomonas campestris WU-9701(FERM BP-6578)を10
mlのマルトース培地(5.0%マルトース一水和物、1.0%
ペプトン、0.2%酵母エキス、0.1%硫酸マグネシウム七
水和物)で30℃、24時間振盪培養し、培養物を得た。得
られた培養物からのゲノムDNAの抽出は市販のDNA抽出キ
ット「ISOPLANT II」(ニッポンジーン社)を用いて行
った。
をコードする遺伝子の取得 1) ゲノムDNAの抽出Xanthomonas campestris WU-9701(FERM BP-6578)を10
mlのマルトース培地(5.0%マルトース一水和物、1.0%
ペプトン、0.2%酵母エキス、0.1%硫酸マグネシウム七
水和物)で30℃、24時間振盪培養し、培養物を得た。得
られた培養物からのゲノムDNAの抽出は市販のDNA抽出キ
ット「ISOPLANT II」(ニッポンジーン社)を用いて行
った。
【0020】2) 目的遺伝子のクローニング
WU-9701株の糖転移反応を触媒する酵素については、既
に精製酵素からN末端アミノ酸配列が決定されているの
で、今回新たに内部部分アミノ酸配列を決定し、これら
のアミノ酸配列を基に5_-CARACICCITGGTGGMG-3_及び5_-
AGIACYTGRTCKATCAT-3_で表される配列のオリゴヌクレオ
チドを合成した。WU-9701株のゲノムDNAをテンプレー
ト、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとしてアニー
リング温度49〜56℃、30サイクルの条件でPCRを行い、
約300塩基対のDNA断片の増幅を確認した。このPCR増幅
産物をプラスミドベクターpGEM-Tに挿入してクローニン
グし、塩基配列を決定した結果、WU-9701株の糖転移反
応を触媒する酵素と同じN末端および内部部分アミノ酸
配列に相当する塩基配列が確認された。
に精製酵素からN末端アミノ酸配列が決定されているの
で、今回新たに内部部分アミノ酸配列を決定し、これら
のアミノ酸配列を基に5_-CARACICCITGGTGGMG-3_及び5_-
AGIACYTGRTCKATCAT-3_で表される配列のオリゴヌクレオ
チドを合成した。WU-9701株のゲノムDNAをテンプレー
ト、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとしてアニー
リング温度49〜56℃、30サイクルの条件でPCRを行い、
約300塩基対のDNA断片の増幅を確認した。このPCR増幅
産物をプラスミドベクターpGEM-Tに挿入してクローニン
グし、塩基配列を決定した結果、WU-9701株の糖転移反
応を触媒する酵素と同じN末端および内部部分アミノ酸
配列に相当する塩基配列が確認された。
【0021】次に、WU-9701株のゲノムDNAを各種制限酵
素で完全消化した後、上記PCR増幅産物をプローブとし
てサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、制限
酵素Sal Iで消化した場合に約5000塩基対のDNA断片にハ
イブリダイズした。本酵素はSDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の結果から、約56kDaであることが明ら
かになっており、本酵素をコードする遺伝子は約1500塩
基対からなると推定されるので、上記の約5000塩基対の
DNA断片には本酵素をコードする遺伝子の全長が含まれ
ていると推測された。そこで、Sal Iを用いてWU-9701株
の部分ゲノムDNAライブラリーを作製した。すなわち、W
U-9701株のゲノムDNAをSal Iで完全消化してアガロース
ゲル電気泳動を行い、約3000〜7000塩基対のDNA断片を
含む部分のゲルを切り出し、ゲルからDNA断片を回収し
た後、DNAリガーゼを用いてプラスミドベクターpUC18の
Sal I部位に挿入した。このプラスミド溶液を用いて大
腸菌JM109を形質転換し、上記約300塩基対のPCR増幅産
物をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーション法
により目的遺伝子のスクリーニングを行い、2株の陽性
クローンを取得した。これら2株の陽性クローンが保持
する組換えDNA(pUGTF-7、pUGTF-64)は約4800塩基対の
同一挿入断片を含んでいたが、プラスミドベクターpUC1
8に対する挿入方向が逆向きであった。挿入断片のう
ち、目的とする酵素をコードする領域及びその周辺領域
について塩基配列を決定した(配列番号1)。
素で完全消化した後、上記PCR増幅産物をプローブとし
てサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、制限
酵素Sal Iで消化した場合に約5000塩基対のDNA断片にハ
イブリダイズした。本酵素はSDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の結果から、約56kDaであることが明ら
かになっており、本酵素をコードする遺伝子は約1500塩
基対からなると推定されるので、上記の約5000塩基対の
DNA断片には本酵素をコードする遺伝子の全長が含まれ
ていると推測された。そこで、Sal Iを用いてWU-9701株
の部分ゲノムDNAライブラリーを作製した。すなわち、W
U-9701株のゲノムDNAをSal Iで完全消化してアガロース
ゲル電気泳動を行い、約3000〜7000塩基対のDNA断片を
含む部分のゲルを切り出し、ゲルからDNA断片を回収し
た後、DNAリガーゼを用いてプラスミドベクターpUC18の
Sal I部位に挿入した。このプラスミド溶液を用いて大
腸菌JM109を形質転換し、上記約300塩基対のPCR増幅産
物をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーション法
により目的遺伝子のスクリーニングを行い、2株の陽性
クローンを取得した。これら2株の陽性クローンが保持
する組換えDNA(pUGTF-7、pUGTF-64)は約4800塩基対の
同一挿入断片を含んでいたが、プラスミドベクターpUC1
8に対する挿入方向が逆向きであった。挿入断片のう
ち、目的とする酵素をコードする領域及びその周辺領域
について塩基配列を決定した(配列番号1)。
【0022】[実施例2] 組換え酵素の生産及び糖転
移活性の測定 実施例1で取得した組換えベクターpUGTF-7を用いてエレ
クトロポレーション法により大腸菌JM109を形質転換し
た。得られた形質転換体をIPTGとアンピシリンを含むLB
培地で37℃、16時間培養し、遠心分離(4,000×g、15 m
in)により培養液から菌体を回収した。菌体を10 mMク
エン酸−リン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、同緩衝
液に懸濁させ、超音波処理(20 kHz、200 W、2 min×5
回)で細胞を破砕した。遠心分離(30,000×g、60 mi
n)により細胞残渣を除き、組換え酵素を含む粗酵素溶
液を得た。
移活性の測定 実施例1で取得した組換えベクターpUGTF-7を用いてエレ
クトロポレーション法により大腸菌JM109を形質転換し
た。得られた形質転換体をIPTGとアンピシリンを含むLB
培地で37℃、16時間培養し、遠心分離(4,000×g、15 m
in)により培養液から菌体を回収した。菌体を10 mMク
エン酸−リン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄した後、同緩衝
液に懸濁させ、超音波処理(20 kHz、200 W、2 min×5
回)で細胞を破砕した。遠心分離(30,000×g、60 mi
n)により細胞残渣を除き、組換え酵素を含む粗酵素溶
液を得た。
【0023】次に、1.5 Mマルトースを含む10 mMホウ酸
緩衝液(pH8.5)を調製し、この緩衝液1.6 mlに上記粗
酵素溶液0.4 mlとl−メントール20 mgを加え、40℃で1
時間振盪した。沸騰浴中で10分間煮沸処理して反応を停
止させた後、反応溶液全量と8 mlのメタノールを混合
し、生成したl−メンチル−α−D−グルコピラノシドの
量を既報[Biosci. Biotech. Biochem., 60: 1914-1915
(1996)]に従ってHPLCで定量した。その結果、形質転換
体から得られた粗酵素溶液の比活性は140.7 mU/mg prot
einであった。ただし、1 Uは1分間に1 μmolのl−メ
ンチル−α−D−グルコピラノシドを生成する活性と定
義する。
緩衝液(pH8.5)を調製し、この緩衝液1.6 mlに上記粗
酵素溶液0.4 mlとl−メントール20 mgを加え、40℃で1
時間振盪した。沸騰浴中で10分間煮沸処理して反応を停
止させた後、反応溶液全量と8 mlのメタノールを混合
し、生成したl−メンチル−α−D−グルコピラノシドの
量を既報[Biosci. Biotech. Biochem., 60: 1914-1915
(1996)]に従ってHPLCで定量した。その結果、形質転換
体から得られた粗酵素溶液の比活性は140.7 mU/mg prot
einであった。ただし、1 Uは1分間に1 μmolのl−メ
ンチル−α−D−グルコピラノシドを生成する活性と定
義する。
【0024】尚、Xanthomonas campestris WU-9701(FE
RM BP-6578)から調製した粗酵素溶液の比活性は14.2 m
U/mg proteinであり、形質転換体から調製した粗酵素溶
液の比活性はWU-9701株から調製した粗酵素溶液の約10
倍であることが明らかになった。
RM BP-6578)から調製した粗酵素溶液の比活性は14.2 m
U/mg proteinであり、形質転換体から調製した粗酵素溶
液の比活性はWU-9701株から調製した粗酵素溶液の約10
倍であることが明らかになった。
【0025】[実施例3] 凍結乾燥菌体の調製及び糖
転移活性測定 実施例2の方法で形質転換体を作製し、IPTGとアンピシ
リンを含むLB培地で37℃、16時間培養した。遠心分離
(4,000×g、15 min)により培養液から菌体を回収し、
菌体を10 mMクエン酸−リン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄し
た後、凍結乾燥して凍結乾燥菌体を調製した。1.0 Mマ
ルトースを含む10 mMホウ酸緩衝液(pH8.5)2 mlに凍結
乾燥菌体とl−メントール10 mgを加え、40℃で1時間振
盪し反応させた。実施例2と同様の方法で反応溶液中に
生成したl−メンチル−α−D−グルコピラノシドを定量
した結果、凍結乾燥菌体は7.32 mU/mg dry cellsの活性
を示した。
転移活性測定 実施例2の方法で形質転換体を作製し、IPTGとアンピシ
リンを含むLB培地で37℃、16時間培養した。遠心分離
(4,000×g、15 min)により培養液から菌体を回収し、
菌体を10 mMクエン酸−リン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄し
た後、凍結乾燥して凍結乾燥菌体を調製した。1.0 Mマ
ルトースを含む10 mMホウ酸緩衝液(pH8.5)2 mlに凍結
乾燥菌体とl−メントール10 mgを加え、40℃で1時間振
盪し反応させた。実施例2と同様の方法で反応溶液中に
生成したl−メンチル−α−D−グルコピラノシドを定量
した結果、凍結乾燥菌体は7.32 mU/mg dry cellsの活性
を示した。
【0026】[実施例4] 組換え酵素を用いたl−メン
チル−α−D−グルコピラノシドの合成 実施例2に記載の方法で粗酵素溶液を調製し、1.2 Mマル
トースを含む10 mMホウ酸緩衝液(pH8.5)2 mlに50 mU
の本酵素とl−メントール20 mgを加え、40℃で24時間振
盪した。実施例2と同様の方法でHPLC分析を行った結
果、反応溶液中に42.8 mgのl−メンチル−α−D−グル
コピラノシドが生成しており、反応に供したl−メント
ールに対するモル収率は99.4%であった。
チル−α−D−グルコピラノシドの合成 実施例2に記載の方法で粗酵素溶液を調製し、1.2 Mマル
トースを含む10 mMホウ酸緩衝液(pH8.5)2 mlに50 mU
の本酵素とl−メントール20 mgを加え、40℃で24時間振
盪した。実施例2と同様の方法でHPLC分析を行った結
果、反応溶液中に42.8 mgのl−メンチル−α−D−グル
コピラノシドが生成しており、反応に供したl−メント
ールに対するモル収率は99.4%であった。
【0027】[実施例5] 組換え酵素を用いたハイド
ロキノン−α−D−グルコピラノシドの合成 実施例2に記載の方法で粗酵素溶液を調製し、1.2 Mマル
トースを含む10 mMホウ酸緩衝液(pH7.5)2 mlに50 mU
の本酵素とハイドロキノン10 mgを加え、40℃で24時間
振盪した。反応溶液と8 mlのメタノールを混合し、メン
ブレンフィルターで不溶物を除去した後、HPLC分析を行
った結果、反応溶液中に24.9 mgのハイドロキノン−α
−D−グルコピラノシドが生成しており、反応に供した
ハイドロキノンに対するモル収率は94.4%であった。
ロキノン−α−D−グルコピラノシドの合成 実施例2に記載の方法で粗酵素溶液を調製し、1.2 Mマル
トースを含む10 mMホウ酸緩衝液(pH7.5)2 mlに50 mU
の本酵素とハイドロキノン10 mgを加え、40℃で24時間
振盪した。反応溶液と8 mlのメタノールを混合し、メン
ブレンフィルターで不溶物を除去した後、HPLC分析を行
った結果、反応溶液中に24.9 mgのハイドロキノン−α
−D−グルコピラノシドが生成しており、反応に供した
ハイドロキノンに対するモル収率は94.4%であった。
【0028】[実施例6] 組換え酵素を用いたカプサ
イシン−α−D−グルコピラノシドの合成 実施例2に記載の方法で粗酵素溶液を調製し、1.2 Mマル
トースを含む10 mMホウ酸緩衝液(pH9.0)2 mlに50 mU
の本酵素とカプサイシン5 mgを加え、40℃で8時間振盪
した。反応溶液と8 mlのメタノールを混合し、メンブレ
ンフィルターで不溶物を除去した後、HPLC分析を行った
結果、反応溶液中に4.1 mgのカプサイシン−α−D−グ
ルコピラノシドが生成しており、反応に供したカプサイ
シンに対するモル収率は51.6%であった。
イシン−α−D−グルコピラノシドの合成 実施例2に記載の方法で粗酵素溶液を調製し、1.2 Mマル
トースを含む10 mMホウ酸緩衝液(pH9.0)2 mlに50 mU
の本酵素とカプサイシン5 mgを加え、40℃で8時間振盪
した。反応溶液と8 mlのメタノールを混合し、メンブレ
ンフィルターで不溶物を除去した後、HPLC分析を行った
結果、反応溶液中に4.1 mgのカプサイシン−α−D−グ
ルコピラノシドが生成しており、反応に供したカプサイ
シンに対するモル収率は51.6%であった。
【0029】[実施例7] 形質転換体を用いたl−メン
チル−α−D−グルコピラノシドの合成 実施例3の方法で凍結乾燥菌体を調製し、1.0 Mマルトー
スを含む10 mMホウ酸緩衝液(pH8.5)2 mlに凍結乾燥菌
体10 mgとl−メントール10 mgを加え、40℃で24時間振
盪し反応させた。実施例2と同様の方法でHPLC分析を行
った結果、反応溶液中に20.1 mgのl−メンチル−α−D
−グルコピラノシドが生成しており、反応に供したl−
メントールに対するモル収率は98.6%であった。
チル−α−D−グルコピラノシドの合成 実施例3の方法で凍結乾燥菌体を調製し、1.0 Mマルトー
スを含む10 mMホウ酸緩衝液(pH8.5)2 mlに凍結乾燥菌
体10 mgとl−メントール10 mgを加え、40℃で24時間振
盪し反応させた。実施例2と同様の方法でHPLC分析を行
った結果、反応溶液中に20.1 mgのl−メンチル−α−D
−グルコピラノシドが生成しており、反応に供したl−
メントールに対するモル収率は98.6%であった。
【0030】
【発明の効果】本発明によれば、従来の酵素では糖転移
反応が困難であったメントールやカプサイシン等の水酸
基を有する化合物を受容体として、高い糖転移活性を示
す優れた酵素を効率的に生産することができる。
反応が困難であったメントールやカプサイシン等の水酸
基を有する化合物を受容体として、高い糖転移活性を示
す優れた酵素を効率的に生産することができる。
【配列表】
<110> Waseda University
<110> Lotte Co., Ltd.
<120> 糖転移反応を触媒する新規な酵素をコードする遺伝子および当該酵素の製
造方法
<130> P11995-AP
<160> 2
<210> 1
<211> 2210
<212> DNA
<213> Xanthomonas campestris WU-9701 (FERM BP-6578)
<400>
gtcgacactg ccacaggtgg tgttgtcccg tctgggccag atcaagacag gcgcgtgtgg 60
gacgaacatc gtgccggcac gcatggacta tgtcgattcg ctacagcatc tttagttgag 120
atggacttgt ctattgaata cgtatgcgcg gatgagctct gagtctgcta cgccgctacg 180
cttgtgccct tgatgggcgt cttttctgtc gccccccatt ggcccgggag gggcgtat 238
atg tcg cag aca cca tgg tgg cgc ggg gcc gtc atc tat cag att tat ccg 289
cgt agt ttt ctg gat tcc aat ggg gat ggc gta ggc gat ctg ccg ggc att 340
att gcc aag ctc gac tac atc tcc ggg ctg ggc gtg gat gcg atc tgg att 391
tcg cct ttt ttc aag tcg ccg atg gcc gat ttc ggc tat gac atc tca gac 442
tat cgc gcg gtg gac ccg ttg ttc ggg tcg ttg gcc gat ttc gat cgc ttg 493
ctc gag aag gcg cat gga ctc ggg ctg aag gtg atg att gat cag gtg ctg 544
agt cat acc tcg atc gcg cat gcg tgg ttt cag gag agc cgg cag gat cgg 595
agc aac ccg aag gct gat tgg tac gtg tgg gcc gat ccg cgc gag gat gga 646
acg ccg ccg aac aac tgg ctg tcg ttg ttt ggc ggg gtc gca tgg cag tgg 697
gag ccg cgg cgt gag cag tac tac ctg cac aac ttt ctg gtg gac cag ccc 748
gat ctc aat ttc cac aac gcc gag gtg cag cag gca acg ctc gat aac gtg 799
cgg ttc tgg ctc gat cgc ggt gtg gat ggg ttc cgc ctg gat gcg atc aac 850
ttc tgc ttt cac gac gcg cag ctg cgc gat aac ccg gcc aag ccg gca gac 901
aag cgg gtg ggg cgc ggc ttt agc gcg gac aat ccg tat gcc tac cag tac 952
cac tac ttc aac aac acg cag ccg gaa aat ttg ccg ttt ctg gag cgg ctg 1003
cgc ggg ctg ttg gac agc tac ccg ggt gcg gtg agt ctg ggc gag att tcg 1054
tcg gaa gat tcg ctg gcg acc acc gcc gaa tac acc gcc cag ggc cgc ttg 1105
cat atg ggc tac agc ttc gag ctg ctg gtg cag gat tac agc gct gcc tac 1156
atc cgc gac acc gta agc cgg ctc gag gcc acc atg ttg gag ggc tgg cca 1207
tgc tgg gcc att tcc aat cac gac gta gtg cgc gcg gtg acg cgc tgg ggt 1258
ggg gcg cag gcg acg ccg gcg ttc gcg cgg atg gtg gtg gcg ctg ctg tgt 1309
tcg ttg cgt ggc tcg att tgc ttg tat cag ggc gaa gag ctc ggg ctc agt 1360
gag gca gag gtg gcg ttc gag gac ctg cag gat ccg tat ggg att acc ttc 1411
tgg ccg acc ttc aag ggg cgg gat ggc tgc cgt acg ccg atg ccg tgg acc 1462
gac gcg cca tct gcc gga ttc act agt ggc aag ccg tgg ctg ccg tta gct 1513
gcg tcg cat cgt gcc gca gct gta agc gtg caa cag gac gat gcg cat tcc 1564
gtg ttg aga gca gta cgg gct ttt ctg gct tgg cgc aag gag atg ccg gcg 1615
ctg cgt gag gga tcc atc gct ttc tac gac acg gcc gaa ccg gtg ctg atg 1666
ttc cgc cgc gaa cac gcc ggc cag gtt gtg ctg ttg gca ttc aat ctg tcc 1717
gcc gat cct gcc gag ctg gcc ttg cct gcc ggc gag tgg gag cag atc gat 1768
gta cct ggt gtc gag ctt ggg gcg atg gat ggc gga cac cta cgg ctg gcc 1819
ggg cat gcg gtc gtt gct gct gtc ggt cgt ggc tga gtaagcgcag 1865
ctgaaacctc tcggcttgga gcagctatca aagctgctgc gcagccgcca ggcgggcgcg 1925
gccggtgctc ggaatcggca tgtacccacg tacactccgg ttcctccgcg ccgtccgcac 1985
ccacctgacg gctactcgct acggtttgtt agccgctctt agaacctgtt cacgatcttt 2045
cctgatcggt gcagactatg cagatgcgcc aaaagaccta tccgagtgac atgagccggg 2105
agcagttcga acacgtgctg ccgatcctgg aacaagcgcg taagcgccac caagccacgc 2165
cgtgtggatg tgtatgaggt gtggtgcgca gtgttgtacg tgctg 2210
<210> 2
<211> 538
<212> PRT
<213> Xanthomonas campestris WU-9701 (FERM BP-6578)
<400>
Met Ser Gln Thr Pro Trp Trp Arg Gly Ala Val Ile Tyr Gln Ile Tyr
1 5 10 15
Pro Arg Ser Phe Leu Asp Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Asp Leu Pro
20 25 30
Gly Ile Ile Ala Lys Leu Asp Tyr Ile Ser Gly Leu Gly Val Asp Ala
35 40 45
Ile Trp Ile Ser Pro Phe Phe Lys Ser Pro Met Ala Asp Phe Gly Tyr
50 55 60
Asp Ile Ser Asp Tyr Arg Ala Val Asp Pro Leu Phe Gly Ser Leu Ala
65 70 75 80
Asp Phe Asp Arg Leu Leu Glu Lys Ala His Gly Leu Gly Leu Lys Val
85 90 95
Met Ile Asp Gln Val Leu Ser His Thr Ser Ile Ala His Ala Trp Phe
100 105 110
Gln Glu Ser Arg Gln Asp Arg Ser Asn Pro Lys Ala Asp Trp Tyr Val
115 120 125
Trp Ala Asp Pro Arg Glu Asp Gly Thr Pro Pro Asn Asn Trp Leu Ser
130 135 140
Leu Phe Gly Gly Val Ala Trp Gln Trp Glu Pro Arg Arg Glu Gln Tyr
145 150 155 160
Tyr Leu His Asn Phe Leu Val Asp Gln Pro Asp Leu Asn Phe His Asn
165 170 175
Ala Glu Val Gln Gln Ala Thr Leu Asp Asn Val Arg Phe Trp Leu Asp
180 185 190
Arg Gly Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Ile Asn Phe Cys Phe His
195 200 205
Asp Ala Gln Leu Arg Asp Asn Pro Ala Lys Pro Ala Asp Lys Arg Val
210 215 220
Gly Arg Gly Phe Ser Ala Asp Asn Pro Tyr Ala Tyr Gln Tyr His Tyr
225 230 235 240
Phe Asn Asn Thr Gln Pro Glu Asn Leu Pro Phe Leu Glu Arg Leu Arg
245 250 255
Gly Leu Leu Asp Ser Tyr Pro Gly Ala Val Ser Leu Gly Glu Ile Ser
260 265 270
Ser Glu Asp Ser Leu Ala Thr Thr Ala Glu Tyr Thr Ala Gln Gly Arg
275 280 285
Leu His Met Gly Tyr Ser Phe Glu Leu Leu Val Gln Asp Tyr Ser Ala
290 295 300
Ala Tyr Ile Arg Asp Thr Val Ser Arg Leu Glu Ala Thr Met Leu Glu
305 310 315 320
Gly Trp Pro Cys Trp Ala Ile Ser Asn His Asp Val Val Arg Ala Val
325 330 335
Thr Arg Trp Gly Gly Ala Gln Ala Thr Pro Ala Phe Ala Arg Met Val
340 345 350
Val Ala Leu Leu Cys Ser Leu Arg Gly Ser Ile Cys Leu Tyr Gln Gly
355 360 365
Glu Glu Leu Gly Leu Ser Glu Ala Glu Val Ala Phe Glu Asp Leu Gln
370 375 380
Asp Pro Tyr Gly Ile Thr Phe Trp Pro Thr Phe Lys Gly Arg Asp Gly
385 390 395 400
Cys Arg Thr Pro Met Pro Trp Thr Asp Ala Pro Ser Ala Gly Phe Thr
405 410 415
Ser Gly Lys Pro Trp Leu Pro Leu Ala Ala Ser His Arg Ala Ala Ala
420 425 430
Val Ser Val Gln Gln Asp Asp Ala His Ser Val Leu Arg Ala Val Arg
435 440 445
Ala Phe Leu Ala Trp Arg Lys Glu Met Pro Ala Leu Arg Glu Gly Ser
450 455 460
Ile Ala Phe Tyr Asp Thr Ala Glu Pro Val Leu Met Phe Arg Arg Glu
465 470 475 480
His Ala Gly Gln Val Val Leu Leu Ala Phe Asn Leu Ser Ala Asp Pro
485 490 495
Ala Glu Leu Ala Leu Pro Ala Gly Glu Trp Glu Gln Ile Asp Val Pro
500 505 510
Gly Val Glu Leu Gly Ala Met Asp Gly Gly His Leu Arg Leu Ala Gly
515 520 525
His Ala Val Val Ala Ala Val Gly Arg Gly
530 535
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C12N 9/26 C12N 15/00 ZNAA
C12P 19/14 5/00 A
(72)発明者 佐藤 利行
東京都新宿区大久保3−4−1 早稲田大
学理工学部内
(72)発明者 木野 邦器
東京都新宿区大久保3−4−1 早稲田大
学理工学部内
(72)発明者 宇佐美 昭次
東京都新宿区大久保3−4−1 早稲田大
学理工学部内
(72)発明者 吉田 圭司郎
埼玉県さいたま市沼影1−5−13 しらさ
ぎハウス
(72)発明者 津金 貴則
東京都豊島区池袋3−70−17
(72)発明者 志村 進
東京都八王子市元八王子町3−2486
Fターム(参考) 4B024 AA01 AA03 AA05 BA13 CA03
DA06 EA04 GA14
4B050 CC03 DD02 LL05
4B064 AF41 CA02 CA19 CC24 CE02
CE03 DA01 DA10
4B065 AA01Y AA26X AB01 BA02
BA03 BD01 BD15 CA19 CA32
CA41 CA44
Claims (6)
- 【請求項1】 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコ
ードする遺伝子 (a) 配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタン
パク質。 (b) アミノ酸配列(a)において1若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつ糖転移活性を有するタンパク質。 - 【請求項2】 請求項1記載の遺伝子を含むことを特徴
とする組換えDNA。 - 【請求項3】 請求項2記載の組換えDNAを用いて請求
項1記載の遺伝子が導入された形質転換体。 - 【請求項4】 請求項3記載の形質転換体によって生産
される糖転移活性を有する組換え酵素。 - 【請求項5】 請求項3記載の形質転換体を培地に培養
し、培養物から糖転移活性を有する組換え酵素を採取す
ることを特徴とする糖転移活性を有する組換え酵素の製
造方法。 - 【請求項6】 請求項3記載の形質転換体または請求項
4記載の組換え酵素を用いることを特徴とする配糖体の
製造方法。
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---|---|---|---|
JP2002054853A JP2003250559A (ja) | 2002-02-28 | 2002-02-28 | 糖転移反応を触媒する新規な酵素をコードする遺伝子および当該酵素の製造方法 |
PCT/JP2003/002158 WO2003072776A1 (fr) | 2002-02-28 | 2003-02-26 | Gene codant une nouvelle enzyme catalysant une reaction de transfert de glycosyl et procede de preparation de l'enzyme |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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JP2002054853A Pending JP2003250559A (ja) | 2002-02-28 | 2002-02-28 | 糖転移反応を触媒する新規な酵素をコードする遺伝子および当該酵素の製造方法 |
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---|---|
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WO (1) | WO2003072776A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011177118A (ja) * | 2010-03-02 | 2011-09-15 | Showa Sangyo Co Ltd | 転移酵素、糖質の製造方法、配糖体の製造方法、転移酵素の製造方法 |
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---|---|---|---|---|
CN102978147B (zh) * | 2012-12-06 | 2014-08-20 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种工程菌及其在生产紫穗槐-4,11-二烯中的应用 |
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JP2001046096A (ja) * | 1999-08-09 | 2001-02-20 | Lotte Co Ltd | α−グルコシダーゼによる配糖体の製造方法及び新規なα−グルコシダーゼ並びにその製造方法 |
-
2002
- 2002-02-28 JP JP2002054853A patent/JP2003250559A/ja active Pending
-
2003
- 2003-02-26 WO PCT/JP2003/002158 patent/WO2003072776A1/ja active Application Filing
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011177118A (ja) * | 2010-03-02 | 2011-09-15 | Showa Sangyo Co Ltd | 転移酵素、糖質の製造方法、配糖体の製造方法、転移酵素の製造方法 |
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WO2003072776A1 (fr) | 2003-09-04 |
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