WO2003072776A1 - Gene codant une nouvelle enzyme catalysant une reaction de transfert de glycosyl et procede de preparation de l'enzyme - Google Patents

Gene codant une nouvelle enzyme catalysant une reaction de transfert de glycosyl et procede de preparation de l'enzyme Download PDF

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WO2003072776A1
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enzyme
recombinant
producing
transformant
gene
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PCT/JP2003/002158
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Kohtaro Kirimura
Toshiyuki Sato
Kuniki Kino
Shoji Usami
Keishiro Yoshida
Takanori Tsugane
Susumu Shimura
Original Assignee
Waseda University
Lotte Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins

Definitions

  • the present invention relates to a gene encoding a novel enzyme that catalyzes a glycosyltransfer reaction, a recombinant DNA containing the enzyme gene, a transformant into which the recombinant DNA has been transferred, a recombinant enzyme using them, and production of the same.
  • the present invention relates to a method and a method for producing a glycoside using the enzyme.
  • saccharide hydrolyzing enzymes such as ⁇ -amylase, —darcosidase, and / 3-dalcosidase have a property of catalyzing a glycosyltransfer reaction when an appropriate receptor is present in a reaction system.
  • the glycosyltransfer reaction using a hydrolase produces oligosaccharides because of the availability of inexpensive and large quantities of carbohydrates such as starch, maltose, and cellulose as sugar donors, and high substrate specificity and high reaction efficiency. Widely used for etc.
  • 1-Mentyl- ⁇ -D-Darcopyranoside is a compound in which menthol and glucose are combined, and is itself a tasteless, odorless white crystal, and does not exhibit sublimability, but is decomposed by hydrolytic enzymes or heat to produce menthol. Has unique properties
  • Xant omonas campes tr is WU-9701 (FERM BP-6578) and Stenotrophomonas mal tophi lia Using Dl (FERM BP-6579), a method for efficiently producing 11-menthyl-hydroxy D-darcopyranoside using menl and maltose as raw materials has been found (Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-155591). Furthermore, the properties of the enzyme that catalyzes the synthesis of 1-menthyl- ⁇ -D-darcopyranoside in these strains revealed that this enzyme is a novel enzyme exhibiting high glycosyltransferase activity.
  • Enzymes that exhibit high glycosyltransferase activity by using a compound having a hydroxyl group such as menthol as an acceptor are one of the important enzymes in the production of various glycosides.Enzymes that exhibit such properties are bacteria belonging to the genus Xanthomonas, Stenotrophomonas It has been found only in some bacteria such as the genus Bacteria, and only a part of the amino acid sequence of these enzymes has been disclosed. In addition, the production amount of the present enzyme in the above strain was not always satisfactory when considering the industrial production of glycosides.
  • the present inventors have conducted intensive studies for the purpose of efficient production of the present enzyme, and as a result, succeeded in cloning the gene encoding the present enzyme from Xanthomonas campes tris WU-9701 (FERM BP-6578). The entire nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence were determined. Furthermore, the present inventors have found that the present enzyme can be efficiently produced by culturing a microorganism having a recombinant DNA containing the obtained gene, and confirmed that the enzyme can be used for the synthesis of glycosides, thereby completing the present invention. .
  • the first invention of the present application relates to the following (a) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or (b) an amino acid sequence (a) in which one or several amino acids are deleted or substituted. Or a gene encoding a protein having an added amino acid sequence and having glycosyltransferase activity.
  • the second invention of the present application is a recombinant DNA characterized by comprising the above-mentioned gene
  • the third invention of the present application is a transformant into which the above-mentioned gene has been introduced using the above-mentioned recombinant DNA
  • the fourth invention of the present application further relates to a glycosyltransfer produced by the above-mentioned transformant.
  • a fifth aspect of the present invention is a recombinant enzyme having an activity, wherein the transformant is cultured in a medium, and a recombinant enzyme having a glycosyltransferase activity is collected from the culture.
  • a sixth invention of the present application is a method for producing a glycoside, comprising using the above transformant or the above recombinant enzyme.
  • DNA extraction First, microorganisms capable of efficiently producing 1-menthyl ⁇ -D-dalcopyranoside, such as Xanthomonas campes tr is WU-9701 (FERM BP-6578) and Steno t rophomonas mal toph ilia D-1 (FERM Collect cells by centrifugation or the like from the culture obtained by culturing BP-6579), and extract DM from the obtained cells. DNA extraction can be performed according to a conventional method.
  • a gene library Preparation of gene library
  • the extracted DNA is digested with an appropriate restriction enzyme according to a conventional method, and treated with a modification enzyme such as phosphatase, and if necessary, various linkers and adapters are added.
  • a modification enzyme such as phosphatase
  • various linkers and adapters are added.
  • a gene library can be prepared.
  • a partial gene library can be prepared by selecting only a DNA fragment having an optimum length by a method such as density gradient centrifugation or extraction from an electrophoresis gel and inserting it into a phage / plasmid vector.
  • PCR amplification product After determining the nucleotide sequence of the DNA fragment amplified by PCR (hereinafter referred to as “PCR amplification product”) and confirming that the nucleotide sequence corresponding to the partial amino acid sequence of the purified enzyme is contained, the PCR amplification product was probed.
  • a gene containing the target gene can be selected from the above-mentioned gene library by using a method such as hybridization.
  • the target gene can be selected by a method such as hybridization using the above oligonucleotide as a probe without using the PCR method.
  • various oligonucleotides were synthesized based on the entire nucleotide sequence of the gene encoding the present enzyme and the entire amino acid sequence of the present enzyme, which were first revealed by the present invention, and PCR and hybridization were performed using them.
  • a transformant producing the present enzyme can be prepared by transforming a host with the recombinant DNA containing the present enzyme gene obtained by the above method.
  • the recombinant DNA can be prepared by inserting the present enzyme gene into one plasmid vector or one phage vector capable of autonomous propagation in a host microorganism.
  • the host-vector system only needs to be capable of autonomously growing the recombinant DNA, stably maintaining the recombinant DNA, and expressing the trait.
  • host vector systems such as plasmid vector PUC118 and phage vector A EMBL3 and Escherichia coli, plasmid vector PUB112 and Bacillus subtilis, and plasmid vector YEp and yeast can be mentioned.
  • Known methods can be used for introducing the recombinant DM into the host microorganism and performing transformation. For example, the calcium chloride method [Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972)] or by the elect-portion method.
  • the transformant produced by the above method is cultured, and the enzyme that catalyzes the transglycosylation reaction, which is a recombinant enzyme, can be collected from the culture.
  • Culture conditions can be appropriately determined according to the type of host or vector. For example, when Escherichia coli is used as a host, the culture conditions are LB medium, YT medium, M9 medium and the like at a culture temperature of 37 ° C and a culture time of 4 to 48 hours.
  • the present enzyme can be collected from the obtained culture by a conventional method.For example, cells are collected from the culture by centrifugation, and the cells are disrupted by a method such as sonication or French press.
  • the residue can be removed by centrifugation and the enzyme can be collected.
  • a known method such as ammonium sulfate fractionation, dialysis, or various types of chromatography may be used.
  • the enzyme obtained by the above method has the following properties.
  • glycosyltransfer reaction In glycosyltransfer reaction, menthol, ethanol, 1-propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutyl alcohol, 1-amyl alcohol, 2-amyl Alcohols, compounds having an alcoholic hydroxyl group such as 5-nonyl alcohol, and force psycin, dihydroforce psycin, nonylate vanillylamide, catechin, epicatechin, vanillin, octidoquinone, force alcohol, resorcinol, 3,4-dimethoxyphenol, etc.
  • the compound having a phenolic hydroxyl group can be used as an acceptor.
  • Reaction optimum pH The optimum pH for hydrolyzing maltose is around pH 7-8.
  • the optimal pH of the glycosyltransfer reaction using menthol as an acceptor and maltose as a donor is around pH 7.0-8.5.
  • Optimal reaction temperature The optimal temperature for the hydrolysis reaction using maltose as a substrate is 30 to 40 ° C, and the optimal temperature for the sugar transfer reaction using menthol as an acceptor and maltose as a donor is 35 to 45 ° C. It is.
  • glycosides can be produced under the same reaction conditions as those described in JP-A-11-155591 and JP-A-2001-46096.
  • the above transformant is cultured, the cells are collected from the culture, lyophilized, and the lyophilized cells and menthol are added to a buffer containing maltose and reacted to obtain a mixture of the enzyme and menthol.
  • D-Darcopyranoside can be synthesized.
  • Xant omonas campestris 9701 (FERM BP-6578) in 10 ml of Malus! Medium (5.0% maltomonohydrate, 1.0% peptone, 0.2% yeast extract, 0.1% magnesium sulfate heptahydrate) The cells were cultured with shaking at 30 ° C for 24 hours to obtain a culture. Genomic DNA was extracted from the obtained culture using a commercially available DNA extraction kit “IS0PLANT II” (Futtsubon Gene).
  • An oligonucleotide having a sequence represented by 5--AGIACYTGRTCKATCAT-3_ was synthesized.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the WU-9701 strain as a template and the above oligonucleotide as a primer under the conditions of an annealing temperature of 49 to 56 ° C and 30 cycles to confirm the amplification of a DNA fragment of about 300 base pairs.
  • This PCR amplification product was inserted into a plasmid vector, pGEM-T, cloned, and its nucleotide sequence was determined.As a result, it was found that the N-terminal and internal partial amino acid sequences were the same as those of the enzyme catalyzing the glycosyltransfer reaction of WU-9701. The corresponding nucleotide sequence was confirmed.
  • the genomic DNA of the WU-9701 strain was completely digested with Ml and subjected to agarose gel electrophoresis, a gel containing a DNA fragment of about 3000 to 7000 base pairs was cut out, and the DNA fragment was recovered from the gel.
  • Plasmid vector I was inserted into the I site of pUC18 using ligase. Using this plasmid solution, Escherichia coli JM109 was transformed, and the target gene was screened by the colony hybridization method using the above PCR amplification product of about 300 base pairs as a probe to obtain two positive clones. .
  • Example 2 Production of recombinant enzyme and measurement of glycosyltransferase activity Using the recombinant vector PUGTF-7 obtained in Example 1, E. coli JM109 was transformed by electroporation. The obtained transformant was cultured in an LB medium containing IPTG and ampicillin at 37 ° C for 16 hours, and the cells were recovered from the culture by centrifugation (4,000 Xg, 15 mill). The cells were washed with 10 mM citrate-phosphate buffer (pH 7.0), suspended in the same buffer, and disrupted by sonication (20 kHz, 200 W, 2 minX5 times) .
  • 10 mM citrate-phosphate buffer pH 7.0
  • the specific activity of the crude enzyme solution obtained from the transformant was 140.7 mU / ing protein.
  • l'U is defined as the activity to produce 1 mol of 1-menthyl-a-D-g in 1 minute.
  • the specific activity of the crude enzyme solution prepared from Xanthomonas campestris WU-9701 (FERM BP-6578) was 14.2 ⁇ / mg protein, and the specific activity of the crude enzyme solution prepared from the transformant was prepared from WU-9701 strain. It was found to be about 10 times that of the crude enzyme solution.
  • Example 3 Preparation of freeze-dried cells and measurement of glycosyltransferase activity Transformants were prepared by the method of Example 1, and cultured in an LB medium containing IPTG and ampicillin for 37 and 16 hours. Collect the cells from the culture by centrifugation (4,000 Xg, 15 min), wash the cells with 10 mM citrate-phosphate buffer (pH 7.0), freeze-dry, and freeze-dry the cells. Was prepared. Lyophilized cells and 10 mg of 1-menthol were added to 2 ml of 10 mM borate buffer (pH 8.5) containing 1.0 M maltose, and the mixture was reacted by shaking at 40 ° C. for 1 hour. As a result of quantifying 1-menthyl-a-D-darcopyranoside produced in the reaction solution in the same manner as in Example 2, the freeze-dried cells showed an activity of 7.32 mU / mg dry cells.
  • Example 4 Synthesis of 1-menthyl-D-darcopyranoside using recombinant enzyme
  • a crude enzyme solution was prepared by the method described in Example 2, and 50 ml of the present enzyme and 20 mg of 1-menthol were added to 2 ml of 10-borate buffer (pH 8.5) containing 1.2 M maltose. Shake at 40 ° C for 24 hours.
  • 42.8 mg of 1-menthyl_ — D-darcopyranoside was produced in the reaction solution, and the molar yield based on 1-menthol used in the reaction was 99.4%.
  • Example 5 Synthesis of Hydroquinone- ⁇ -D-Darcopyranoside Using Recombinant Enzyme
  • a crude enzyme solution was prepared by the method described in Example 2, and a 10 mM phosphate buffer containing 1.2 M maltose ( PH 7.5) 50 ml of this enzyme and hydroquinone 10 mg were added to 2 ml, and the mixture was shaken at 40 ° C for 24 hours.
  • the reaction solution was mixed with 8 ml of methanol, and the insolubles were removed with a membrane filter.
  • 24.9 mg of hydroquinone-Q! -D-darcopyranoside was formed in the reaction solution.
  • the molar yield based on hydroquinone subjected to the reaction was 94.4%.
  • Example 6 Synthesis of force psicin- ⁇ -D-darcopyranoside using recombinant enzyme A crude enzyme solution was prepared by the method described in Example 2, and 10 mM buffer containing 1.2 ⁇ M maltose was prepared. To 2 ml of an acid buffer (pH 9.0) was added 50 niU of the present enzyme and 5 mg of capsaicin, and the mixture was shaken at 40 ° C for 8 hours. After mixing the reaction solution and 8 ml of methanol and removing the insoluble matter with a membrane filter, HPLC analysis showed that 4.1 mg of cabsaicin- ⁇ -D-darcopyranoside was formed in the reaction solution. The molar yield of cabsaicin subjected to the reaction was 51.6%.
  • Example 7 Synthesis of 1-menthyl- ⁇ -D-darcopyranoside using a transformant Lyophilized cells were prepared by the method of Example 3, and 10 mM malate-containing 10 mM borate buffer (pH 8. 5) 10 mg of freeze-dried cells and 10 mg of 1-menthol were added to 2 ml, and the mixture was reacted by shaking at 40 ° C for 24 hours.
  • 20.1 mg of 1-menthyl- ⁇ -D-darcopyranoside was formed in the reaction solution, and the molar yield based on 1-menthol used for the reaction was found.
  • a compound having a hydroxyl group such as mentholcapsicin which has been difficult to perform a glycosyltransfer reaction with a conventional enzyme, is used as a receptor to exhibit high glycosyltransferase activity. Excellent enzymes can be efficiently produced.

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Description

明細
糖転移反応を触媒する新規な酵素をコードする遺伝子および当該酵素の製造方法
技術分野 本発明は糖転移反応を触媒する新規な酵素をコードする遺伝子、当該酵素遺伝子 を含む組換え DNA、 その組換え DNAを移入した形質転換体、 それらを利用した組換 え酵素およびその製造方法並びに該酵素を用いた配糖体の製造方法に関する。
技術背景 α—アミラーゼ、 —ダルコシダーゼ、 /3—ダルコシダーゼ等の糖質加水分解酵 素は、反応系に適当な受容体が存在すると糖転移反応を触媒する性質を有すること は広く知られている。加水分解酵素による糖転移反応は、 デンプン、 麦芽糖、 セル ロース等の安価に大量に入手可能な糖質を糖の供与体として利用できること、基質 特異性や反応効率が高いといった理由からォリゴ糖の製造等に広く利用されてい る。 しかしながら、多くの場合、 このような糖転移反応は糖質間では起こり易いも のの、糖以外の化合物を受容体とした糖転移反応では反応効率が低く、各種配糖体 の合成に利用するには適していなかった。例えば、酵母由来の α _ダルコシダーゼ を用い、 メントールを受容体とした糖転移反応により 1一メンチル一 α—D—ダル コピラノシドを合成した場合の収率は 10%以下と低く実用化には問題があった (特開平 9一 224693号公報) 。
1一メンチルー《— D—ダルコピラノシドはメントールとグルコースが結合した 化合物であり、それ自体は無味無臭の白色結晶であり、昇華性も示さないが、加水 分解酵素や熱によって分解し、メントールを生じるという独特の性質を持っており
(Agr i c. Bi o l. Chem. , 43巻， 307頁, 1979年) 、 食品、 口中清涼剤、 化粧品、 タバコ等で清涼感の持続や安定性の向上、香喫味改良剤としての応用が開示されて いるが （特開昭 62— 161716号公報、 特開平 6— 329528号公報、 特開平 5— 219929 号公報）、効率的に生産する方法が見出されていなかつたために実用化されていな かった。 先に、 本発明者らは 1一メンチル—ひ一 D—ダルコピラノシドの効率的な生産を 目指して微生物を探索した結果、 Xant omonas campes tr i s WU-9701 (FERM BP- 6578)、 Stenotrophomonas mal tophi l i a D-l (FERM BP-6579) を用い、 メン] ルとマル ト一スを原料として効率的に 1一メンチルーひ一 D—ダルコピラノシドを生産する 方法を見出した （特開平 11 - 155591号公報） 。 さらに、 これら菌株において 1—メ ンチルー α— D—ダルコピラノシドの合成を触媒する酵素の諸性質から、 本酵素が 高い糖転移活性を示す新規な酵素であることを明らかにし、本酵素がメントールの みならずハイドロキノンゃカブサイシン等の水酸基を有する化合物も糖転移反応 の受容体としうることを見出した （特開 2001-46096号公報） 。 しかしながら、上記菌株における本酵素の生産量は必ずしも満足できるものでは なく、 さらに効率的かつ安定な生産方法の確立が望まれていた。 メントール等の水酸基を有する化合物を受容体として高い糖転移活性を示す酵 素は各種配糖体の製造において重要な酵素の一つであるが、このような性質を示す 酵素は Xanthomonas属細菌、 Stenotrophomonas属細菌等の 部の細菌にしか見出 されておらず、これら酵素のアミノ酸配列についても一部の配列しか明らかにされ ていない。 また、 上記菌株における本酵素の生産量は、配糖体生産を工業的に行う ことを考えた場合に必ずしも満足できるものではなかった。 発明の開示 本発明者らは本酵素の効率的生産を目的として銳意検討した結果、 Xanthomonas campes tr is WU-9701 (FERM BP-6578) から本酵素をコードする遺伝子のクローニン グに成功し、その全塩基配列並びに推定アミノ酸配列を決定した。 さらに、取得し た遺伝子を含む組換え DNAを保持する微生物を培養することにより、本酵素を効率 的に生産できることを見出すとともに、配糖体の合成に利用できることを確認し本 発明を完成させた。 即ち、 本願 第 1の発明は、 以下の (a)配列番号 2に記載のアミノ酸配列からな るタンパク質または、 （b)ァミノ酸配列 (a)において 1もしくは数個のァミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖転移活性を有するタン パク質をコードする遺伝子であり、本願の第 2の発明は、上記の遺伝子を含むこと を特徴とする組換え D NAであり、 また本願の第 3の発明は、上記組換え D NAを 用いて上記の遺伝子を導入した形質転換体であり、 また更に本願の第 4の発明は、 上記の形質転換体によって生産される糖転移活性を有する組換え酵素であり、また 更に本願の第 5の発明は、上記の形質転換体を培地に培養し、培養物から糖転移活 性を有する組換え酵素を採取することを特徴とする糖転移活性を有する組換え酵 素の製造方法であり、また更に本願の第 6の発明は、上記の形質転換体または上記 組換え酵素を用いることを特徴とする配糖体の製造方法である。 発明を実施するための最良の形態 本発明の糖転移反応を触媒する新規な酵素をコ一ドする遺伝子のクローニング、 組換え DNAの調製、形質転換体の作製、組換え酵素の生産、配糖体の製造方法につ いては、 実施例で詳細に説明するが、 以下に概略を記す。
1) DNAの抽出 まず、 1一メンチルー α— D—ダルコピラノシドを効率的に生産できる微生物、例 えば Xanthomonas campes tr i s WU-9701 (FERM BP- 6578) や Steno t rophomonas mal toph i l i a D - 1 (FERM BP-6579) を培養して得られる培養物から遠心分離等の方 法で菌体を回収し、 取得した菌体から DMを抽出する。 DNAの抽出は常法に従って 行うことができる。即ち、リゾチーム等の酵素処理、超音波処理、界面活性剤処理、 凍結融解処理などの方法で溶菌した後、 フエノール抽出、 除タンパク処理、 プロテ ァ一ゼ処理、 リポヌクレア一ゼ処理、 アルコール沈殿、遠心分離などの方法を適宜 組み合わせることで行うことができる。また、市販の DNA抽出キットを用いて行う こともできる。
2) 遺伝子ライブラリ一の作製 常法により、抽出した DNAを適当な制限酵素で消化し、必要に応じてフォスファ ターゼ等の修飾酵素処理や種々のリンカ一やアダプタ一の付加を施した後、得られ た DNA断片をファージゃプラスミドベクタ一に挿入して遺伝子ライブラリーを作 製できる。また、密度勾配遠心法や電気泳動ゲルからの抽出等の方法によって最適 な長さの DNA断片のみを選択してファージゃプラスミドベクタ一に挿入して部分 遺伝子ライブラリ一を作製できる。
3) 目的遺伝子のクローニング方法 本酵素の精製標品より決定した部分アミノ酸配列を基にオリゴヌクレオチドを 合成し、 1ーメンチルー 一 D—グルコピラノシドを効率的に生産できる微生物から 抽出した DNAをテンプレート、 合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして PCRを行う。 PCRにより増幅された DNA断片 （以下、 PCR増幅産物） の塩基配列を 決定し、精製酵素の部分アミノ酸配列に相当する塩基配列が含まれていることを確 認した後、この PCR増幅産物をプローブとしてハイブリダィゼーション等の方法を 用いて上記遺伝子ライブラリ一から目的遺伝子を含むものを選抜できる。また、 PCR 法を利用せずに上記オリゴヌクレオチドをプローブとしてハイプリダイゼ一ショ ン等の方法を用いて目的遺伝子の選抜を行うことも可能である。 当然のことであるが、本発明によって初めて明らかにされた本酵素をコードする 遺伝子の全塩基配列並びに本酵素の全アミノ酸配列を基に各種オリゴヌクレオチ ドを合成し、 それらを用いて PCRやハイブリダィゼ一ションを行うことにより、 様々な生物から本酵素と同様の糖転移反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を 取得することも可能である。
4) 形質転換体の作製 本酵素を生産する形質転換体は上記方法により取得された本酵素遺伝子を含む 組換え DNAを用いて宿主を形質転換することにより作製できる。 当該組換え DNA は宿主微生物で自律的に増殖し得るプラスミドベクタ一あるいはファージベクタ 一に本酵素遺伝子を挿入することにより作製できる。宿主一ベクター系は、当該組 換え DNAが自律的に増殖可能で安定に保持され、形質が発現可能なものであればよ い。例えば、 プラスミドベクター PUC118やファ一ジベクタ一 A EMBL3と大腸菌、 プ ラスミドベクター PUB1 12と枯草菌、プラスミドベクター YEpと酵母などの宿主一べ クタ一系が挙げられる。宿主微生物に組換え DMを導入して形質転換する方法は公 知の方法を用いることができ、 例えば、 塩化カルシウム法 [Cohen, S. N. e t al. , Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA, 69 : 2110 (1972) ] やエレクト口ポレーシヨン法に よつて組換え体 DNAを導入することができる。
5) 組換え酵素の生産 上記方法で作製した形質転換体を培養し、培養物から組換え酵素である糖転移反 応を触媒する酵素を採取することができる。培養条件については宿主やベクターの 種類に応じて、適宜決定することができる。例えば、大腸菌を宿主とする場合の培 養条件は、 LB培地、 YT培地、 M9培地等を用いて培養温度 〜 37°Cで培養時間 4〜 48時間である。得られた培養物からの本酵素の採取は常法により行うことができ、 例えば、培養物から遠心分離により菌体を回収し、超音波処理、 フレンチプレス等 の方法で細胞を破砕し、細胞残渣を遠心分離により除き、本酵素を採取することが できる。本酵素をさらに精製する場合は、 硫安分画、 透析、 各種クロマトグラフィ 一等の公知の方法を組み合わせる方法が挙げられる。 なお、 上記方法で得られた酵素は、 以下の性質を有する。
( a ) 作用：糖類の α— 1， 4一結合を加水分解する。 マルトースを供与体として 受容体にグルコースを転移させ配糖体を合成する。
( b ) 加水分解反応の基質特異性：加水分解反応では、 マルトース、 p—ニトロフ ェニルー《— D—ダルコビラノシドには作用するが、マルトトリオース、マルトへ キサオース、 イソマル! ス、 イソマルトトリオ一ス、 シユークロース、 トレハロ 一ス、可溶性デンプン、アミロース、シクロデキストリンにはほとんど作用しない。
( c ) 糖転移反応の受容体特異性：糖転移反応では、 メントール、 エタノール、 1 一プロパノール、 1ーブ夕ノール、 2—ブタノ一ル、 イソブチルアルコール、 1― ァミルアルコール、 2—ァミルアルコール、 5—ノニルアルコール等のアルコール 性水酸基を有する化合物及び力プサイシン、ジヒドロ力プサイシン、 ノニル酸バニ リルアミド、 カテキン、 ェピカテキン、 バニリン、 八イドロキノン、 力テコ一ル、 レゾルシノール、 3 , 4—ジメトキシフエノール等のフエノール性水酸基を有する 化合物を受容体とすることができる。 ( d )反応至適 p H：マルトースを加水分解する場合の至適 pHは pH7〜8近辺 である。メントールを受容体、マルト一スを供与体とした糖転移反応の至適 PHは pH7. 0〜8. 5近辺である。
(e)反応最適温度：マルトースを基質とした加水分解反応の最適温度は 30〜4 0°C、メントールを受容体、マルトースを供与体とした糖転移反応の最適温度は 3 5〜45°Cである。
( f )分子量： S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、分子量は約 57，
000であった。
6) 配糖体の製造方法 上記形質転換体あるいは上記形質転換体から採取した組換え酵素を用い、特開平
11-155591号公報及び特開 2001-46096号公報に記載の方法と同様の反応条件で各 種配糖体を生産することができる。例えば、 上記形質転換体を培養し、 培養物から 菌体を回収してこれを凍結乾燥し、マルトースを含む緩衝液に凍結乾燥菌体とメン トールを加えて反応させることにより 1一メンチルー CK—D—ダルコピラノシドを 合成することができる。 以下、実施例により本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例 に限定されるものではない。
[実施例 1] 糖転移反応を触媒する酵素をコードする遺伝子の取得
1) ゲノム DNAの抽出
Xant omonas campestris昏 9701 (FERM BP- 6578)を 10mlのマル! ^一ス培地（5.0% マルト一ス一水和物、 1.0%ペプトン、 0.2%酵母エキス、 0.1%硫酸マグネシウム 七水和物） で 30°C、 24時間振盪培養し、 培養物を得た。 得られた培養物からのゲ ノム DNAの抽出は市販の DNA抽出キット 「IS0PLANT II」 （二ツボンジーン社） を 用いて行った。
2) 目的遺伝子のクローニング WU-9701株の糖転移反応を触媒する酵素については、既に精製酵素から N末端ァ ミノ酸配列が決定されているので、今回新たに内部部分アミノ酸配列を決定し、 こ れらのアミノ酸配列を基に 5_-CARACICCITGGTGGMG-3—及び
5— - AGIACYTGRTCKATCAT-3_で表される配列のオリゴヌクレオチドを合成した。
WU-9701株のゲノム DNAをテンプレート、上記オリゴヌクレオチドをプライマーと してアニーリング温度 49〜56°C、 30サイクルの条件で PCRを行い、 約 300塩基対 の DNA断片の増幅を確認した。 この PCR増幅産物をプラスミドベクタ一 pGEM-Tに 揷入してクローニングし、 塩基配列を決定した結果、 WU- 9701株の糖転移反応を触 媒する酵 素と同じ N末端および内部部分アミノ酸配列に相当する塩基配列が確認された。 次に、 WU-9701株のゲノム DNAを各種制限酵素で完全消化した後、 上記 PCR増幅 産物をプロ一ブとしてサザンハイブリダィゼーシヨンを行ったところ、 制限酵素 SaJ. Iで消化した場合に約 5000塩基対の DNA断片にハイブリダィズした。 本酵素 は S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果から、約 56kDaであることが明 らかになつており、 本酵素をコードする遺伝子は約 1500塩基対からなると推定さ れるので、 上記の約 5000塩基対の DNA断片には本酵素をコードする遺伝子の全長 が含まれていると推測された。そこで、 Iを用いて WU-9701株の部分ゲノム DNA ライブラリ一を作製した。 すなわち、 WU-9701株のゲノム DNAを M lで完全消化 してァガロースゲル電気泳動を行い、 約 3000〜7000塩基対の DNA断片を含む部分 のゲルを切り出し、 ゲルから DNA断片を回収した後、 DNAリガーゼを用いてプラス ミドベクタ一 pUC18の I部位に揷入した。 このプラスミド溶液を用いて大腸菌 JM109を形質転換し、上記約 300塩基対の PCR増幅産物をプローブとしたコロニー ハイプリダイゼ一ション法により目的遺伝子のスクリ一二ングを行い、 2株の陽性 クローンを取得した。これら 2株の陽性クローンが保持する組換え DNA (pUGTF- 7、 pUGTF-64) は約 4800塩基対の同一揷入断片を含んでいたが、 プラスミドベクター PUC18に対する挿入方向が逆向きであった。 揷入断片のうち、 目的とする酵素をコ ードする領域及びその周辺領域について塩基配列を決定した （配列番号 1 ) 。
[実施例 2] 組換え酵素の生産及び糖転移活性の測定 実施例 1で取得した組換えベクター PUGTF- 7を用いてエレクトロポレーション法 により大腸菌 JM109を形質転換した。 得られた形質転換体を IPTGとアンピシリン を含む LB培地で 37°C、 16時間培養し、 遠心分離 （4, 000Xg、 15 mill) により培養 液から菌体を回収した。 菌体を 10 mMクェン酸—リン酸緩衝液 （pH7.0) で洗浄し た後、 同緩衝液に懸濁させ、 超音波処理 （20 kHz、 200 W、 2 minX5回) で細胞を 破碎した。 遠心分離 （30， 000Xg、 60 min) により細胞残渣を除き、 組換え酵素を 含む粗酵素溶液を得た。 次に、 1.5 Mマルト一スを含む 10 mMホウ酸緩衝液 （pH8.5) を調製し、 この緩 衝液 1.6 mlに上記粗酵素溶液 0.4 mlと 1—メントール 20 mgを加え、 40°Cで 1時 間振盪した。 沸騰浴中で 10分間煮沸処理して反応を停止させた後、 反応溶液全量 と 8 mlのメタノールを混合し、 生成した 1_メンチルーひ— D—ダルコビラノシド の量を既報 [Biosci. Biotech. Biochem. , 60: 1914-1915 (1996)]に従って HPLC で定量した。その結果、形質転換体から得られた粗酵素溶液の比活性は 140.7mU/ing proteinであった。 ただし、 l 'Uは 1分間に 1 molの 1—メンチルー a—D—グ を生成する活性と定義する。 尚、 Xanthomonas campestris WU-9701 (FERM BP-6578) から調製した粗酵素溶液 の比活性は 14.2 ιηϋ/mg proteinであり、 形質転換体から調製した粗酵素溶液の比 活性は WU - 9701株から調製した粗酵素溶液の約 10倍であることが明らかになった。
[実施例 3] 凍結乾燥菌体の調製及び糖転移活性測定 実施例 1の方法で形質転換体を作製し、 IPTGとアンピシリンを含む LB培地で 37 、 16時間培養した。 遠心分離 （4, 000Xg、 15 min) により培養液から菌体を 回収し、 菌体を 10 mMクェン酸—リン酸緩衝液 （pH7.0) で洗浄した後、 凍結乾燥 して凍結乾燥菌体を調製した。 1.0 Mマルト一スを含む 10 mMホウ酸緩衝液（pH8.5) 2mlに凍結乾燥菌体と 1—メントール 10mgを加え、 40°Cで 1時間振盪し反応させ た。 実施例 2と同様の方法で反応溶液中に生成した 1_メンチルー a—D—ダルコ ピラノシドを定量した結果、 凍結乾燥菌体は 7.32 mU/mg dry cellsの活性を示し た。
[実施例 4] 組換え酵素を用いた 1—メンチルーひ一 D—ダルコピラノシドの合成 実施例 2に記載の方法で粗酵素溶液を調製し、 1. 2 Mマルトースを含む 10 ホ ゥ酸緩衝液 （pH8. 5) 2 mlに 50 mUの本酵素と 1一メントール 20 mgを加え、 40°C で 24時間振盪した。実施例 2と同様の方法で HPLC分析を行った結果、反応溶液中 に 42. 8 mgの 1—メンチル _ — D—ダルコピラノシドが生成しており、 反応に供 した 1一メントールに対するモル収率は 99. 4%であった。
[実施例 5] 組換え酵素を用いたハイドロキノンー α—D—ダルコピラノシドの 合成 実施例 2に記載の方法で粗酵素溶液を調製し、 1. 2 Mマルトースを含む 10 mMホ ゥ酸緩衝液 （PH 7. 5) 2 mlに 50 mUの本酵素とハイドロキノン 10 mgを加え、 40°C で 24時間振盪した。 反応溶液と 8 mlのメタノールを混合し、 メンブレンフィルタ —で不溶物を除去した後、 HPLC分析を行った結果、 反応溶液中に 24. 9 mgのハイ ドロキノンー Q!—D—ダルコピラノシドが生成しており、 反応に供したハイドロキ ノンに対するモル収率は 94. 4%であった。
[実施例 6] 組換え酵素を用いた力プサイシン一 α— D—ダルコピラノシドの合 成 実施例 2に記載の方法で粗酵素溶液を調製し、 1. 2 Μマルト一スを含む 10 mMホ ゥ酸緩衝液 （pH9. 0) 2 mlに 50 niUの本酵素とカプサイシン 5 mgを加え、 40°Cで 8 時間振盪した。 反応溶液と 8 mlのメタノールを混合し、 メンブレンフィルターで 不溶物を除去した後、 HPLC分析を行った結果、 反応溶液中に 4. 1 mgのカブサイシ ンー α— D—ダルコピラノシドが生成しており、 反応に供したカブサイシンに対す るモル収率は 51. 6%であった。
[実施例 7] 形質転換体を用いた 1ーメンチルー α— D—ダルコピラノシドの合成 実施例 3の方法で凍結乾燥菌体を調製し、 1. 0 Μマルトースを含む 10 mMホウ酸 緩衝液 （pH8. 5) 2 mlに凍結乾燥菌体 10 mgと 1一メントール 10 mgを加え、 40°C で 24時間振盪し反応させた。実施例 2と同様の方法で HPLC分析を行った結果、反 応溶液中に 20. 1 mgの 1 _メンチルー α—D—ダルコピラノシドが生成しており、 反応に供した 1一メントールに対するモル収率は 98. 6%であった。 P T/JP03/02158
10 産業上の利用の可能性 本発明によれば、従来の酵素では糖転移反応が困難であつたメン卜一ルゃカプサ ィシン等の水酸基を有する化合物を受容体として、高い糖転移活性を示す優れた酵 素を効率的に生産することができる。

Claims

請求の範囲
1 . 以下の （a) 又は （b) のタンパク質をコードする遺伝子
(a) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなる夕ンパク質。
(b) アミノ酸配列（a) において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しく は付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ糖転移活性を有するタンパク質。
2 . 請求項 1記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換え DNA。
3 . 請求項 2記載の組換え DNAを用いて請求項 1記載の遺伝子が導入された形質 転換体。
4 . 請求項 3記載の形質転換体によって生産される糖転移活性を有する組換え酵 素。
5 . 請求項 3記載の形質転換体を培地に培養し、培養物から糖転移活性を有する 組換え酵素を採取することを特徴とする糖転移活性を有する組換え酵素の製造方 法。
6 . 請求項 3記載の形質転換体または請求項 4記載の組換え酵素を用いることを 特徴とする配糖体の製造方法。
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