CN102978147B - 一种工程菌及其在生产紫穗槐-4，11-二烯中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种工程菌及其在生产紫穗槐-4，11-二烯中的应用。本发明提供了一种工程菌，是在大肠杆菌中导入如下基因得到的重组菌：紫穗槐-4，11-二烯合酶基因、HMG-CoA还原酶基因、HMG-CoA合酶基因、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、IPP异构酶基因和牻牛儿基转移酶基因。本发明公开的甲羟戊酸工程菌和紫穗槐-4，11-二烯工程菌均具有高产性能，且在培养过程中无需抗生素筛选，适于现代商业化生产的要求。本发明利用基因组工程手段将异源代谢通路整合到大肠杆菌染色体上，得到了工程菌，可以高效稳定合成青蒿素前体紫穗槐-4，11-二烯。
Description
技术领域
本发明涉及一种工程菌及其在生产紫穗槐-4，11-二烯中的应用。
背景技术
青蒿素(Artemisinin)，一种倍半萜内酯过氧化物，是我国科学工作者于1971年从植物黄花蒿(Artemisia annua L.)中分离并鉴定的抗疟有效单体。青蒿素及其衍生物如蒿甲醚(Artemether)、蒿乙醚(Arteether)、青蒿琥酯(Artesunate)、二氢青蒿素(Dihydroartemisinin)等均具有良好的抗疟特性。青蒿素与一种或多种其他抗疟药物配伍后得到一种抗疟特效药——以青蒿素为基础的联合药物疗法(Artemisinin-basedcombination therapies，ACTs)。与过去的抗疟药相比，ACTs是个特例，疟疾对它没有耐药性。2005年，世界卫生组织(WHO)将ACTs推荐为治疗非复杂恶性疟疾的第一线用药。2010年，WHO再次发布5种ACTs药物名单，包括蒿甲醚﹢苯芴醇(AL)、青蒿琥酯﹢阿莫地喹(AS﹢AQ)、青蒿琥酯﹢甲氟喹(AS﹢MQ)、青蒿琥酯﹢磺胺多辛-乙胺嘧啶(AS﹢SP)和二氢青蒿素﹢哌喹(DHA﹢PPQ)，其中二氢青蒿素﹢哌喹是最新加入的联合抗疟药物。另外，青蒿素还具有抗癌、抗孕、抗血吸虫和抗弓形虫等作用。高效的抗疟特性和不断增多的适应症需要稳定和充足的青蒿素供应。
目前，从植物中提取仍是获得青蒿素的主要途径。大量种植黄花蒿能提高青蒿素的产量，但这是与粮食种植争夺有限的土地资源，且易受气候等外界因素的影响。
紫穗槐-4，11-二烯为青蒿素的前体，可以通过简单的化学催化步骤得到青蒿素。紫穗槐-4，11-二烯(Amorpha-4，11-diene，AD)，分子式为C15H24，结构式见式(Ⅰ)。
发明内容
本发明的目的是提供一种工程菌及其在生产紫穗槐-4，11-二烯中的应用。
本发明提供了一种工程菌(工程菌甲)，是在大肠杆菌中导入如下基因得到的重组菌：紫穗槐-4，11-二烯合酶基因(ADS基因)、HMG-CoA还原酶基因(mvaE基因)、HMG-CoA合酶基因(mvaS基因)、甲羟戊酸激酶基因(mvaK1基因)、磷酸甲羟戊酸激酶基因(mvaK2基因)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(mvaD基因)、IPP异构酶基因(idi基因)和牻牛儿基转移酶基因(ispA基因)。
所述紫穗槐-4，11-二烯合酶基因可为黄花蒿源紫穗槐-4，11-二烯合酶基因。所述HMG-CoA还原酶基因可为粪肠球菌源HMG-CoA还原酶基因、HMG-CoA合酶基因可为粪肠球菌源HMG-CoA合酶基因、甲羟戊酸激酶基因可为粪肠球菌源甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因可为粪肠球菌源磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因可为粪肠球菌源甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、IPP异构酶基因可为粪肠球菌源IPP异构酶基因和牻牛儿基转移酶基因可为粪肠球菌源牻牛儿基转移酶基因。
所述紫穗槐-4，11-二烯合酶基因可如序列表的序列1自5’末端第23至1660位核苷酸所示。所述HMG-CoA还原酶基因可如序列表的序列2自5’末端第4至2412位核苷酸所示。所述HMG-CoA合酶基因可如序列表的序列3自5’末端第23至1171位核苷酸所示。所述甲羟戊酸激酶基因可如序列表的序列4自5’末端第4至945位核苷酸所示。所述磷酸甲羟戊酸激酶基因可如序列表的序列4自5’末端第1946至3049位核苷酸所示。所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因可如序列表的序列4自5’末端第948至1940位核苷酸所示。所述IPP异构酶基因可如序列表的序列4自5’末端第3036至4076位核苷酸所示。所述牻牛儿基转移酶基因可如序列表的序列5自5’末端第4至882位核苷酸所示。
所述HMG-CoA还原酶基因和所述HMG-CoA合酶基因可通过同源重组整合入所述大肠杆菌的基因组DNA。具体来说，所述HMG-CoA还原酶基因和所述HMG-CoA合酶基因可通过同源重组整合入所述大肠杆菌的基因组DNA中的非功能区域。更具体来说，所述HMG-CoA还原酶基因和所述HMG-CoA合酶基因通过同源重组整合入所述大肠杆菌的基因组DNA中的lpxM位点。对于所述lpxM位点来说，所述同源同组具体是通过lpxM位点左侧同源臂和lpxM位点右侧同源臂实现的。所述lpxM位点左侧同源臂可如序列表的序列6自5’末端第6至1064位核苷酸所示。所述lpxM位点右侧同源臂可如序列表的序列6自5’末端第1087至2073位核苷酸所示。所述HMG-CoA还原酶基因和所述HMG-CoA合酶基因具体可以以融合DNA-Ⅰ或融合DNA-Ⅲ的形式整合入所述大肠杆菌的基因组DNA中。所述融合DNA-Ⅰ中，依次具有T7启动子、所述HMG-CoA还原酶基因、所述HMG-CoA合酶基因和T7终止子。所述融合DNA-Ⅰ具体可通过如下方法制备得到：(1)用序列表的序列2所示的双链DNA分子取代载体pET3b的Nde I和BamHI酶切之间的小片段，得到重组质粒pET3-E；(2)用序列表的序列3所示的双链DNA分子取代重组质粒pET3-E的Xho I和BamHI酶切位点之间的小片段，得到重组质粒pET3-ES；(3)以重组质粒pET3-ES为模板，用5′-GATCCCGCGAAATTAATACGAC-3′和5′-ATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC-3′组成的引物对进行PCR扩增，得到融合DNA-Ⅰ。所述融合DNA-Ⅲ可为将序列表的序列6自5’末端第1064至1086位核苷酸中的Not I的酶切位点插入所述融合DNA-Ⅰ得到的DNA分子。
所述紫穗槐-4，11-二烯合酶基因、所述甲羟戊酸激酶基因、所述磷酸甲羟戊酸激酶基因、所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、所述IPP异构酶基因和所述牻牛儿基转移酶基因通过同源重组整合入所述大肠杆菌的基因组DNA。具体来说，所述紫穗槐-4，11-二烯合酶基因、所述甲羟戊酸激酶基因、所述磷酸甲羟戊酸激酶基因、所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、所述IPP异构酶基因和所述牻牛儿基转移酶基因通过同源重组整合入所述大肠杆菌的基因组DNA的非功能区域。更具体来说，所述紫穗槐-4，11-二烯合酶基因、所述甲羟戊酸激酶基因、所述磷酸甲羟戊酸激酶基因、所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、所述IPP异构酶基因和所述牻牛儿基转移酶基因通过同源重组整合入所述大肠杆菌的基因组DNA的C位点或D位点。对于所述C位点来说，所述同源同组具体是通过C位点左侧同源臂和C位点右侧同源臂实现的。所述C位点左侧同源臂可如序列表的序列7自5’末端第6至421位核苷酸所示。所述C位点右侧同源臂可如序列表的序列7自5’末端第449至1078位核苷酸所示。对于所述D位点来说，所述同源同组具体是通过D位点左侧同源臂和D位点右侧同源臂实现的。所述D位点左侧同源臂可如序列表的序列8自5’末端第6至619位核苷酸所示。所述D位点右侧同源臂可如序列表的序列8自5’末端第651至1350位核苷酸所示。所述紫穗槐-4，11-二烯合酶基因、所述甲羟戊酸激酶基因、所述磷酸甲羟戊酸激酶基因、所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、所述IPP异构酶基因和所述牻牛儿基转移酶基因具体可以以融合DNA-Ⅱ或融合DNA-Ⅳ的形式整合入所述大肠杆菌的基因组DNA中。所述融合DNA-Ⅱ中，依次具有T7启动子、所述甲羟戊酸激酶基因、所述磷酸甲羟戊酸激酶基因、所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、所述IPP异构酶基因、T7终止子、T7启动子、所述牻牛儿基转移酶基因、紫穗槐-4，11-二烯合酶基因和T7终止子。所述融合DNA-Ⅱ具体可通过如下方法制备得到：(1)用序列表的序列4所示的双链DNA分子取代载体pAOC3ANL的Nde I和BamHI酶切位点之间的小片段，得到重组质粒pAOC3-MD；(2)用序列表的序列5所示的双链DNA分子取代载体pET3AL的Nde I和BamHI酶切位点之间的小片段，得到重组质粒pET3AL-ispA；(3)用序列表的序列1所示的双链DNA分子取代重组质粒pET3AL-ispA的XhoI和BamHI酶切位点之间的小片段，得到重组质粒pET3AL-ispA-ADS；(4)用限制性内切酶ApaI和Not I双酶切重组质粒pET3AL-ispA-ADS，回收约2900bp的酶切产物；(5)用限制性内切酶ApaI和Not I双酶切重组质粒pAOC3-MD，回收约6800bp的载体骨架；(6)将步骤(4)的酶切产物和步骤(5)的载体骨架连接，得到重组质粒pAOC3-MD-ispA-ADS；(7)用限制性内切酶Sph I和Not I双酶切重组质粒pAOC3-MD-ispA-ADS，得到约7400bp的融合DNA-Ⅱ。所述融合DNA-Ⅳ可为将序列表的序列7自5’末端第422至448位核苷酸中的Sph I和Not I酶切位点之间的小片段取代为所述融合DNA-Ⅱ得到的DNA分子。所述融合DNA-Ⅳ可为将序列表的序列8自5’末端第620至650位核苷酸中的Sph I和Not I酶切位点之间的小片段取代为所述融合DNA-Ⅱ得到的DNA分子。
所述HMG-CoA还原酶基因和所述HMG-CoA合酶基因可通过表达载体(如载体pET3b)导入所述大肠杆菌。具体来说可将所述融合DNA-Ⅰ插入所述表达载体，得到重组质粒，再将所述重组质粒导入所述大肠杆菌。
所述紫穗槐-4，11-二烯合酶基因、所述甲羟戊酸激酶基因、所述磷酸甲羟戊酸激酶基因、所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、所述IPP异构酶基因和所述牻牛儿基转移酶基因可通过表达载体(如载体pAOC3ANL)导入所述大肠杆菌。具体来说可将所述融合DNA-Ⅱ插入所述表达载体，得到重组质粒，再将所述重组质粒导入所述大肠杆菌。
所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌DHGT7。
以上任一所述工程菌甲可用于生产紫穗槐-4，11-二烯。
本发明还保护一种工程菌(工程菌乙)，是在大肠杆菌中导入如下基因得到的重组菌：所述HMG-CoA还原酶基因和所述HMG-CoA合酶基因。
所述HMG-CoA还原酶基因和所述HMG-CoA合酶基因可通过同源重组整合入所述大肠杆菌的基因组DNA。具体来说，所述HMG-CoA还原酶基因和所述HMG-CoA合酶基因可通过同源重组整合入所述大肠杆菌的基因组DNA中的非功能区域。更具体来说，所述HMG-CoA还原酶基因和所述HMG-CoA合酶基因通过同源重组整合入所述大肠杆菌的基因组DNA中的lpxM位点。对于所述lpxM位点来说，所述同源同组具体是通过lpxM位点左侧同源臂和lpxM位点右侧同源臂实现的。所述lpxM位点左侧同源臂可如序列表的序列6自5’末端第6至1064位核苷酸所示。所述lpxM位点右侧同源臂可如序列表的序列6自5’末端第1087至2073位核苷酸所示。所述HMG-CoA还原酶基因和所述HMG-CoA合酶基因具体可以以所述融合DNA-Ⅰ或所述融合DNA-Ⅲ的形式整合入所述大肠杆菌的基因组DNA中。
所述HMG-CoA还原酶基因和所述HMG-CoA合酶基因可通过表达载体(如载体pET3b)导入所述大肠杆菌。具体来说可将所述融合DNA-Ⅰ插入所述表达载体，得到重组质粒，再将所述重组质粒导入所述大肠杆菌。
所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌DHGT7。
以上任一所述工程菌乙可用于生产甲羟戊酸。
lpxM位点：大肠杆菌的lpxM基因长约3kb，且为非必须基因，lpxM基因插入缺失后并不影响菌体的正常生长和代谢功能(张君等.大肠杆菌BL21(DE3)lpxM突变株的构建.生物技术通讯，2006，17(4):489-492.)。
重组位点C(intD-ompT)：大肠杆菌的基因组中intD与ompT基因之间(简写成C位点)，序列长约21kb，基因插入缺失后不影响菌体的正常生长和代谢功能(Kolisnychenko V，Plunkett III G，Herring CD，et al.Engineering a reduced Escherichia coli genome.Genome research，2002，12:640-647.)。
位点D(yccC-insB-4)：大肠杆菌的基因组中yccC与insB-4基因(简写成D位点，序列长约8kb。
载体pET3L：(1)用SphI和XbaI双酶切载体pET28a(+)，回收约260bp的小片段；(2)用SphI和XbaI双酶切载体pET3b，回收约4380bp的片段；(3)将步骤(1)得到的片段和步骤(2)得到的片段连接，得到载体pET3L(含有乳糖操纵基因lacO)。
载体pET3AL：(1)以载体pET3L为模板，采用E3A和E3N组成的引物对进行PCR扩增，得到约900bp片段；(2)用限制性内切酶SphI和EcoRI双酶切步骤(1)得到的片段，回收酶切产物；(3)用限制性内切酶SphI和EcoRI双酶切载体pET3b，回收约3700bp的片段；(4)将步骤(2)得到的片段和步骤(3)得到的片段连接，得到载体pET3AL。
载体pET3ANL：(1)以载体pET3L为模板，采用E35和E3AN组成的引物对进行PCR扩增，得到约900bp片段；(2)用限制性内切酶SphI和EcoRI双酶切步骤(1)得到的片段，回收酶切产物；(3)用限制性内切酶SphI和EcoRI双酶切载体pET3b，回收约3700bp的片段；(4)将步骤(2)得到的片段和步骤(3)得到的片段连接，得到载体pET3ANL。
载体pAOC3ANL：(1)以载体pACYCDuet-1为模板，采用PC5和PC3组成的引物对进行PCR扩增，得到约1900bp片段；(2)用限制性内切酶SphI和EcoRI双酶切步骤(1)得到的片段，回收酶切产物；(3)用限制性内切酶SphI和EcoRI双酶切载体pET3ANL，回收约900bp片段；(4)将步骤(2)得到的片段和步骤(3)得到的片段连接，得到载体pAOC3ANL。
本发明还保护一种DNA分子，如序列表的序列1自5’末端第23至1660位核苷酸所示。
利用微生物合成青蒿素是替代植物提取和化学合成的方法之一，具有很好的应用前景。本发明公开的甲羟戊酸工程菌和紫穗槐-4，11-二烯工程菌均具有高产性能，且在培养过程中无需抗生素筛选，适于现代商业化生产的要求。本发明利用基因组工程手段将异源代谢通路整合到大肠杆菌染色体上，得到了工程菌，可以高效稳定合成青蒿素前体紫穗槐-4，11-二烯。
附图说明
图1为重组质粒pUC57-ADS的结构示意图。
图2为重组质粒pET3-E的结构示意图。
图3为重组质粒pET22-S的结构示意图。
图4为重组质粒pAOC3-MD的结构示意图。
图5为重组质粒pET3AL-ispA的结构示意图。
图6为载体pKSMN的结构示意图。
图7为重组质粒pKSMN-lpxMLR的结构示意图。
图8为重组质粒pKSMN-CLR的结构示意图。
图9为重组质粒pET3-ES的结构示意图。
图10为重组质粒pET3AL-ispA-ADS的结构示意图。
图11为重组质粒pAOC3-MD-ispA-ADS的结构示意图。
图12为重组质粒pKSMN-lpxMLR-CS的结构示意图。
图13为重组质粒pKSMN-CLR-CS的结构示意图。
图14为重组质粒pKSMN-lpxMLR-ES的结构示意图。
图15为重组质粒pKSMN-CLR-MD-ispA-ADS的结构示意图。
图16为质粒pKDS的结构示意图。
图17为实施例3的步骤三中第一次同源重组的原理示意图。
图18为重组菌DHGT7CS筛选过程中的PCR鉴定电泳图。
图19为实施例3的步骤三中第二次同源重组的原理示意图。
图20为重组菌DHGT7ES筛选过程中的PCR鉴定电泳图。
图21为重组菌DHGT7ES(C)CS筛选过程中的PCR鉴定电泳图。
图22为重组菌DHGT7ES(C)-MD-ispA-ADS筛选过程中的PCR鉴定电泳图。
图23为将甲羟戊酸转化为内酯形式的转化过程示意图。
图24为实施例4的步骤三中气相色谱与质谱联用(GC-MS)检测谱图。
图25为实施例4的步骤二中薄层色谱(TLC)检测结果图谱。
图26为实施例4的步骤三中，以MVL标准品的浓度为横坐标，MVL标准品与内标物IS的峰面积比为纵坐标，制作的标准曲线。
图27为实施例5的步骤二中气相色谱与质谱联用(GC-MS)检测谱图。
图28为实施例6的步骤二中气相色谱与质谱联用(GC-MS)检测谱图。
图29为实施例6、实施例7、实施例8、实施例9中各个重组菌培养24、36、48小时后的培养上清中紫穗槐-4，11-二烯的浓度。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
在T4DNA聚合酶和dTTP存在的条件下，DNA双链从3′端开始被水解，当遇到第一个碱基T时水解停止，因此产生5′突出末端。在T4DNA聚合酶和dATP存在的条件下，DNA双链从3′端开始被水解，当遇到第一个碱基A时水解停止，因此产生5′突出末端。
载体pUC57：南京金斯瑞生物科技有限公司标准载体。载体pET3b：购自Novagen公司，目录号69419-3。载体pET22b(+)：购自Novagen公司，目录号69337-3。载体pET28a(+):购自Novagen公司，目录号69864-3。载体pACYCDuet-1：购自Novagen公司，目录号71147-3。
大肠杆菌(Escherichia coli)DHGT7菌株：DHGT7菌株是在大肠杆菌DH5α基础上改造获得，敲除了大肠杆菌DH5α中的ptsG基因，并在基因组DNA中整合入了T7RNA聚合酶基因(由阿拉伯糖启动子控制)，可以在阿拉伯糖诱导下表达T7RNA聚合酶；提及DHGT7菌株的文献：吴涛等.在大肠杆菌内引入甲羟戊酸途径高效合成抗疟药青蒿素前体—紫穗槐-4，11-二烯.生物工程学报，2011，27:1040-1048)。
载体pET3L：(1)用SphI和XbaI双酶切载体pET28a(+)，回收约260bp的小片段；(2)用SphI和XbaI双酶切载体pET3b，回收约4380bp的片段；(3)将步骤(1)得到的片段和步骤(2)得到的片段连接，得到载体pET3L(含有乳糖操纵基因lacO)。载体pET3AL：(1)以载体pET3L为模板，采用E3A(5’-GGTGCATGC GGGCCCAAGGAGATGGCGCCCAACA-3’，下划线依次标注限制性内切酶SphI的酶切识别序列和限制性内切酶ApaI的酶切识别序列)和E3N(5’-GGGAATTCTCATATCATCGATGCGGCCGCCGGATATAGTTCCTCCTT-3’，下划线依次标注限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶NotI的酶切识别序列)组成的引物对进行PCR扩增，得到约900bp片段；(2)用限制性内切酶SphI和EcoRI双酶切步骤(1)得到的片段，回收酶切产物；(3)用限制性内切酶SphI和EcoRI双酶切载体pET3b，回收约3700bp的片段；(4)将步骤(2)得到的片段和步骤(3)得到的片段连接，得到载体pET3AL。
载体pET3ANL：(1)以载体pET3L为模板，采用E35(5’-AGGAATGGTGCATGCAAGG-3’，下划线标注限制性内切酶SphI的酶切识别序列)和E3AN(5’-GGGAATTC GCGGCCGCTCATATCATCGATGGGCCCCGGATATAGTTCCTCCTT-3’，下划线依次标注限制性内切酶EcoRI、限制性内切酶NotI的酶切识别序列和ApaI的酶切识别序列)组成的引物对进行PCR扩增，得到约900bp片段；(2)用限制性内切酶SphI和EcoRI双酶切步骤(1)得到的片段，回收酶切产物；(3)用限制性内切酶SphI和EcoRI双酶切载体pET3b，回收约3700bp的片段；(4)将步骤(2)得到的片段和步骤(3)得到的片段连接，得到载体pET3ANL。
载体pAOC3ANL：(1)以载体pACYCDuet-1为模板，采用PC5(5’-ggaattcTCACACTGCTTCCGGTAGT-3’，下划线标注限制性内切酶EcoRI的酶切识别序列)和PC3(5’-ACATgcatgc ATCTCGACCGATGCCCTT-3’，下划线标注限制性内切酶SphI的酶切识别序列)组成的引物对进行PCR扩增，得到约1900bp片段；(2)用限制性内切酶SphI和EcoRI双酶切步骤(1)得到的片段，回收酶切产物；(3)用限制性内切酶SphI和EcoRI双酶切载体pET3ANL，回收约900bp片段；(4)将步骤(2)得到的片段和步骤(3)得到的片段连接，得到载体pAOC3ANL。
载体pKSMN：(1)用限制性内切酶Sph I和Bst1107I双酶切载体pET28a(+)，回收约3000bp的片段，平末端处理后自连，得到载体pETM(去除出发载体中的lacI基因及其附近一些不必要序列)；(2)合成双链DNA分子(5’-GAATTCATATGCCCTT GCGGCCGCATGCAGGAGCGATCCTCCTGCATACGCGT AAGGCAATCCTCGAGCTGCAG-3’，下划线依次标注限制性内切酶Nde I、NotI、Mlu I和Xho I的酶切识别序列，方框标注I-Sce I识别位点)；(3)用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切步骤(2)的双链DNA分子，回收酶切产物；(4)用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切载体pETM，回收约3000bp的片段；(5)将步骤(3)的片段和步骤(4)的片段连接，得到载体pKSMN。
质粒pKDS：pKDS是热敏型的，含有λ-Red同源重组酶系(包括exo、bet和gam等3个基因)和归巢内切酶I-Sce I的基因，且均受阿拉伯糖启动子控制，I-Sce I能够识别长达18bp的特异序列；提及质粒pKDS的参考文献：周军智等.大肠杆菌ptsHIcrr操纵子的快速敲除及敲除菌生长性能测定.微生物学通报，2010，37:1146-1152.。
石竹烯标准品，英文名称为(-)-trans-Caryophyllene，缩写为AD：购于Sigma-Aldrich公司，目录号C9653。甲羟戊酸内酯标准品，英文名称为(±)Mevalonolactone，又称MVL标准品：购于Sigma-Aldrich公司，目录号M4667。
FM2G培养基，溶剂为水，溶质及其浓度如下：15g/L胰蛋白胨，12g/L酵母抽提物，3g/LNaH2PO4·2H2O，7g/L K2HPO4·3H2O，2.5g/L NaCl，0.5g/L MgSO4，0.2％葡萄糖，1.5％甘油。
实施例1、DNA分子的制备
一、制备紫穗槐-4，11-二烯合酶基因(ADS基因，按照黄花蒿中ADS基因的核苷酸序列，根据大肠杆菌的偏爱性进行了DNA序列优化)
合成序列表的序列1所示的双链DNA分子(1672bp)。
序列表的序列1中，自5’末端第1至6位核苷酸为限制性内切酶XhoI的酶切识别序列，第23至1660位核苷酸为ADS基因的编码区，第1661至1666位核苷酸为两个连续的终止密码子，第1667至1672位核苷酸为限制性内切酶BamHI的酶切识别序列。
二、制备HMG-CoA还原酶基因(mvaE基因，生物来源为粪肠球菌)
合成序列表的序列2所示的双链DNA分子(2441bp)。
序列表的序列2中，自5’末端第1至6位核苷酸为限制性内切酶Nde I的酶切识别序列，第4至2412位核苷酸为mvaE基因的编码区，第2413至2415位核苷酸为终止密码子，第2416至2421位核苷酸为限制性内切酶XhoI的酶切识别序列，第2436至2441位核苷酸为限制性内切酶BamH I的酶切识别序列。
三、制备HMG-CoA合酶基因(mvaS基因，生物来源为粪肠球菌)
合成序列表的序列3所示的双链DNA分子(1180bp)。
序列表的序列3中，自5’末端第1至6位核苷酸为限制性内切酶Xho I的酶切识别序列，第23至1171位核苷酸为mvaS基因的编码区，第1172为1174位核苷酸为终止密码子，第1175至1180位核苷酸为限制性内切酶BamHI的酶切识别序列。
四、制备甲羟戊酸激酶基因(mvaK1基因，生物来源为粪肠球菌)、磷酸甲羟戊酸激酶基因(mvaK2基因，生物来源为粪肠球菌)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(mvaD基因，生物来源为粪肠球菌)和IPP异构酶基因(idi基因，生物来源为粪肠球菌)的融合基因(简称MD融合基因)
合成序列表的序列4所示的双链DNA分子(4085bp)。
序列表的序列4中，自5’末端第1至6位核苷酸为限制性内切酶Nde I的酶切识别序列，第4至4079位核苷酸为MD融合基因的编码区，其中第4至945位核苷酸为mvaK1基因的编码区，第946至948位核苷酸为终止密码子，第948至1940位核苷酸为mvaD基因的编码区，第1941至1943位核苷酸为终止密码子，第1946至3049位核苷酸为mvaK2基因的编码区，第3050至3052位核苷酸为终止密码子，第3036至4076位核苷酸为idi基因的编码区，第4077至4079位核苷酸为终止密码子，第4080至4085位核苷酸为限制性内切酶BamHI的酶切识别序列。
五、制备牻牛儿基转移酶基因(ispA基因，生物来源为粪肠球菌)
合成序列表的序列5所示的双链DNA分子(911bp)。
序列表的序列5中，自5’末端第1至6位核苷酸为限制性内切酶Nde I的酶切识别序列，第4至882位核苷酸为ispA基因的编码区，第883至885位核苷酸为终止密码子，第886至891位核苷酸为限制性内切酶Xho I的酶切识别序列，第909至911位核苷酸为限制性内切酶BamH I的酶切识别序列。
六、制备lpxMLR片段(大肠杆菌lpxM位点的左右同源片段)
合成序列表的序列6所示的双链DNA分子(2078bp)。
序列表的序列6中，自5’末端第1至5位核苷酸为T4DNA聚合酶的水解序列，第6至1064位核苷酸为左侧同源臂序列，第1072至1079位核苷酸为限制性内切酶Not I的酶切识别序列，第1087至2073位核苷酸为右侧同源臂序列，第2074至2078位核苷酸为T4DNA聚合酶的水解序列。
七、制备CLR片段(大肠杆菌C位点的左右同源序列)
合成序列表的序列7所示的双链DNA分子(1083bp)。
序列表的序列7中，自5’末端第1至5位核苷酸为T4DNA聚合酶的水解序列，第6至421位核苷酸为左侧同源臂序列，第422至427位核苷酸为限制性内切酶Sph I的酶切识别序列，第440至447位核苷酸为限制性内切酶Not I的酶切识别序列，第449至1078位核苷酸为右侧同源臂序列，第1079至1083位核苷酸为T4DNA聚合酶的水解序列。
八、制备DLR片段(大肠杆菌D位点的左右同源序列)
合成序列表的序列8所示的双链DNA分子(1355bp)。
序列表的序列8中，自5’末端第1至5位核苷酸为T4DNA聚合酶的水解序列，第6至619位核苷酸为左侧同源臂序列，第620至625位核苷酸为限制性内切酶Sph I的酶切识别序列，第638至645位核苷酸为限制性内切酶NotI的酶切识别序列，第651至1350位核苷酸为右侧同源臂序列，第1351至1355位核苷酸为T4DNA聚合酶的水解序列。
九、制备氯霉素抗性基因(cat基因，正筛选标记基因)
合成序列表的序列9所示的双链DNA分子(1050bp)。
序列表的序列9中，自5’末端第1至13位核苷酸为T4DNA聚合酶的水解序列，第40至215位核苷酸为cat基因表达调控序列，第216至872位核苷酸为cat基因的编码区，第873至875位核苷酸为终止密码子。
十、制备sacB基因(负筛选标记基因)
合成序列表的序列10所示的双链DNA分子(2008bp)。
序列表的序列10中，自5’末端第1至448位为sacB基因表达调控序列，第449至1867位核苷酸为sacB基因的编码区，第1868至1870位核苷酸为终止密码子，第1996至2008位核苷酸为T4DNA聚合酶的水解序列。
实施例2、质粒的构建
一、质粒pUC57-ADS的构建
1、用限制性内切酶Xho I和BamHI双酶切序列表的序列1所示的双链DNA分子，回收酶切产物。
2、用限制性内切酶Xho I和BamHI双酶切载体pUC57，回收约2700bp的载体骨架。
3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pUC57ADS(结构示意图见图1)。
二、质粒pET3-E的构建
1、用限制性内切酶Nde I和BamH I双酶切序列表的序列2所示的双链DNA分子，回收酶切产物。
2、用限制性内切酶Nde I和BamH I双酶切载体pET3b，回收约4600bp的载体骨架。
3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pET3E(结构示意图见图2)。
三、质粒pET22-S的构建
1、用限制性内切酶Xho I和BamHI双酶切序列表的序列3所示的双链DNA分子，回收酶切产物。
2、用限制性内切酶XhoI和BamHI双酶切载体pET22b(+)，回收约5400bp的载体骨架。
3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pET22-S(结构示意图见图3)。
四、质粒pAOC3-MD的构建
1、用限制性内切酶Nde I和BamHI双酶切序列表的序列4所示的双链DNA分子，回收酶切产物。
2、用限制性内切酶Nde I和BamHI双酶切载体pAOC3ANL，回收约2800bp的载体骨架。
3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pAOC3-MD(结构示意图见图4)。
五、质粒pET3AL-ispA的构建
1、用限制性内切酶Nde I和BamHI双酶切序列表的序列5所示的双链DNA分子，回收酶切产物。
2、用限制性内切酶Nde I和BamH I双酶切载体pET3AL，回收约4600bp的载体骨架。
3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pET3AL-ispA(结构示意图见图5)。
六、质粒pKSMN-lpxMLR的构建
1、用T4DNA聚合酶和dTTP处理序列表的序列6所示的双链DNA分子，回收酶切产物(两端的粘末端分别与限制性内切酶Not I和Mlu I酶切后产生的粘末端相同)。
2、用限制性内切酶Not I和Mlu I双酶切载体pKSMN(结构示意图见图6)，回收约3100bp的载体骨架。
3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pKSMN-lpxMLR(结构示意图见图7)。
七、质粒pKSMN-CLR的构建
1、用T4DNA聚合酶和dTTP处理序列表的序列7所示的双链DNA分子，回收酶切产物(两端的粘末端分别与限制性内切酶Not I和Mlu I酶切后产生的粘末端相同)。
2、用限制性内切酶Not I和Mlu I双酶切载体pKSMN，回收约3100bp的载体骨架。
3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pKSMN-CLR(结构示意图见图8)。
八、质粒pKSMN-DLR的构建
1、用T4DNA聚合酶和dTTP处理序列表的序列8所示的双链DNA分子，回收酶切产物(两端的粘末端分别与限制性内切酶Not I和Mlu I酶切后产生的粘末端相同)。
2、用限制性内切酶Not I和Mlu I双酶切载体pKSMN，回收约3100bp的载体骨架。
3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pKSMN-DLR。
九、质粒pET3-ES的构建
1、用限制性内切酶Xho I和BamH I双酶切重组质粒pET22-S，回收约1180bp的小片段。
2、用限制性内切酶Xho I和BamH I双酶切重组质粒pET3-E，回收约7000bp的载体骨架。
3、将步骤1的小片段和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒pET3-ES(结构示意图见图9)。
十、质粒pET3AL-ispA-ADS的构建
1、用限制性内切酶Xho I和BamH I双酶切重组质粒pUC57-ADS，回收约1600bp的小片段。
2、用限制性内切酶XhoI和BamHI双酶切重组质粒pET3AL-ispA，回收约5200bp的载体骨架。
3、将步骤1的酶切产物和步骤2的酶切产物连接，得到重组质粒pET3AL-ispA-ADS(结构示意图见图10)。
十一、质粒pAOC3-MD-ispA-ADS的构建
1、用限制性内切酶Apa I和Not I双酶切重组质粒pET3AL-ispA-ADS，回收约2900bp的酶切产物。
2、用限制性内切酶Apa I和Not I双酶切重组质粒pAOC3-MD，回收约6800bp的载体骨架。
3、将步骤1的酶切产物和步骤2的酶切产物连接，得到重组质粒pAOC3-MD-ispA-ADS(结构示意图见图11)。
十二、质粒pKSMN-lpxMLR-CS的构建
1、同时将序列表的序列9所示的双链DNA分子和序列表的序列10所示的双链DNA分子为模板，用CAT1和SAC2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
CAT1：5′-ACGAGAGCGGCCTGGATCCTGTGACGGAAGATCACTTCG-3′；
SAC2：5′-AGACACGCGGCCTCCATGGAGGTTAGGAATACGGTTAGC-3′。
2、用T4DNA聚合酶和dATP处理步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物(两端的粘末端均为12bp)。
3、用限制性内切酶Not I单酶切重组质粒pKSMN-lpxMLR，回收约5100bp的线性质粒骨架。
4、用T4DNA聚合酶和dTTP处理步骤3的线性质粒，回收酶切产物(两端的粘末端均为12bp，且与步骤2的酶切产物的粘性末端互补)。
5、将步骤2的酶切产物和步骤4的酶切产物连接，得到重组质粒pKSMN-lpxMLR-CS(结构示意图见图12)。
十三、质粒pKSMN-CLR-CS的构建
1、同时将序列表的序列9所示的双链DNA分子和序列表的序列10所示的双链DNA分子为模板，用CS1和CS2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
CS1：5′-CATGCATGCTGTGACGGAAGATCACTTCG-3′(下划线为Sph I酶切位点)；
CS2：5′-GAATGCGGCCGCAGGTTAGGAATACGGTTAGC-3′(下划线为Not I酶切位点)。
2、用限制性内切酶Sph I和Not I双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶Sph I和Not I双酶切重组质粒pKSMN-CLR，回收约4200bp的载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pKSMN-CLR-CS(结构示意图见图13)。
十四、质粒pKSMN-DLR-CS的构建
1、同时将序列表的序列9所示的双链DNA分子和序列表的序列10所示的双链DNA分子为模板，用CS1和CS2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、用限制性内切酶Sph I和Not I双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶Sph I和Not I双酶切重组质粒pKSMN-DLR，回收约4500bp的载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pKSMN-DLR-CS。
十五、质粒pKSMN-lpxMLR-ES的构建
1、以重组质粒pET3-ES为模板，用P5和P6组成的引物对进行PCR扩增，得到具有T7启动子、mvaE基因、mvaS基因和T7终止子的PCR扩增产物。
P5：5′-AGACACGCGGCCTGATCCCGCGAAATTAATACGAC-3′；
P6：5′-ACGAGAGCGGCCTATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC-3′。
P5和P6中，下划线标注T4DNA聚合酶的水解序列。
2、用T4DNA聚合酶和dATP处理步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物(两端的粘末端均为12bp)。
3、用限制性内切酶Not I单酶切重组质粒pKSMN-lpxMLR，回收线性质粒。
4、用T4DNA聚合酶和dTTP处理步骤3的线性质粒，回收酶切产物(两端的粘末端均为12bp，且与步骤2的酶切产物的粘性末端互补)。
5、将步骤2的酶切产物和步骤4的酶切产物连接，得到重组质粒pKSMN-lpxMLR-ES(结构示意图见图14)。
十六、质粒pKSMN-CLR-MD-ispA-ADS的构建
1、用限制性内切酶Sph I和Not I双酶切重组质粒pAOC3-MD-ispA-ADS，回收约7400bp的片段，含有T7启动子、MD融合基因、T7终止子、T7启动子、ispA基因、ADS基因、T7终止子。
2、用限制性内切酶Sph I和Not I双酶切重组质粒pKSMN-CLR，回收约4100bp的载体骨架。
3、将步骤1的片段和步骤的载体骨架连接，得到重组质粒pKSMN-CLR-MD-ispA-ADS(结构示意图见图15)。
十七、质粒pKSMN-DLR-MD-ispA-ADS的构建
1、用限制性内切酶Sph I和Not I双酶切重组质粒pAOC3-MD-ispA-ADS，回收约7400bp的片段，含有T7启动子、MD融合基因、T7终止子、T7启动子、ispA基因、ADS基因、T7终止子)。
2、用限制性内切酶Sph I和Not I双酶切重组质粒pKSMN-DLR，回收约4400bp的载体骨架。
3、将步骤1的片段和步骤的载体骨架连接，得到重组质粒pKSMN-DLRMD-ispA-ADS。
实施例3、重组菌的构建
一、重组菌pET3-ES/DHGT7的构建
将重组质粒pET3-ES导入大肠杆菌DHGT7感受态细胞，得到重组菌，将其命名为重组菌pET3-ES/DHGT7(产甲羟戊酸)。
二、重组菌pET3-ES/pAOC3-MD-ispA-ADS/DHGT7的构建
将重组质粒pET3-ES和重组质粒pAOC3-MD-ispA-ADS共同导入大肠杆菌DHGT7感受态细胞，得到重组菌，将其命名为重组菌pET3-ES/pAOC3-MD-ispA-ADS/DHGT7(产紫穗槐-4，11-二烯)。
三、重组菌DHGT7ES的构建
1、将质粒pKDS(结构示意图见图16)导入大肠杆菌DHGT7感受态细胞，得到重组菌，将其命名为重组菌pKDS/DHGT7。
2、将重组菌pKDS/DHGT7单克隆接种至5mL含50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃培养过夜；取0.5mL过夜培养的菌液，转接到50mL LB液体培养基中，30℃培养至OD600=0.3；加入L-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.4g/100mL，继续培养至OD600=0.8(诱导质粒pKDS表达Red重组酶)；收集菌体。
3、打靶片段lpxMLR-CS的制备
以重组质粒pKSMN-lpxMLR-CS为模板，用lpxM-1和lpxM-4组成的引物对进行PCR扩增，得到具有大肠杆菌lpxM位点的左侧同源片段、cat基因、sacB基因和大肠杆菌lpxM位点的右侧同源片段的PCR扩增产物，即为打靶片段lpxMLR-CS。
lpxM-1：5′-GGCCATGATTGGCGTAGATTACCTG-3′；
lpxM-4：5′-CGCGACACCTGGGAAGTGTCTCG-3′。
4、第一次同源重组
将步骤3得到的打靶片段lpxMLR-CS电击(1850V)转化步骤2得到的菌体的感受态细胞，电击完成后迅速加入0.5ml SOC培养基，随后将培养液转移至1.5ml的EP管中，37℃孵育60-90min(在Red重组酶的促进作用下，打靶片段lpxMLR-CS与菌体的基因组DNA发生同源重组)，涂布含有10μg/mL氯霉素的LB平板，37℃培养过夜。得到将具有cat基因和sacB基因的DNA分子整合入大肠杆菌lpxM位点的重组菌，命名为重组菌DHGT7CS。
同源重组的原理示意图见图17。
重组菌DHGT7CS筛选过程中的PCR鉴定电泳图见图18。PCR鉴定中采用lpxM-7和lpxM-8组成的引物对(两个引物对应大肠杆菌中lpxM位点的左侧同源片段和右侧同源片段外侧的序列)，重组菌DHGT7CS的目的带约为5kb，非重组菌的目的条带约为3.2kb。
lpxM-7：5′-AGACATTAAGACTGCGGCGT-3′；
lpxM-8：5′-ATATCACCCAACTGGCTGCGGC-3′。
重组菌DHGT7CS的筛选过程中，将待测菌株涂布于含6g/100mL蔗糖的LB平板，重组菌DHGT7CS由于含sacB基因在蔗糖平板上不能生长。
5、第二次同源重组
将质粒pKDS和重组质粒pKSMN-lpxMLR-ES共同电击转化重组菌DHGT7CS，然后接种至5mL含50mg/L氨苄青霉素和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，30℃培养过夜；取0.5mL过夜培养的菌液，转接至50mL含50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃培养至OD600=0.3；加入L-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100mL，继续培养4-6h(诱导质粒pKDS表达归巢内切酶I-Sce I，切割重组质粒pKSMN-lpxMLR-ES产生打靶片段；并诱导质粒pKDS表达Red重组酶，用具有mvaE基因和mvaS基因的DNA分子取代重组菌DHGT7CS的基因组DNA中具有cat基因和sacB基因的DNA分子，同源重组的原理示意图见图19)；取菌液稀释至1000倍体积，涂布于含6g/100mL蔗糖的LB平板(发生重组的菌株sacB基因被替换，能在蔗糖平板上生长；而未发生重组的菌株因含有sacB基因，不能在蔗糖平板上生长)。得到将具有mvaE基因和mvaS基因的DNA分子整合入大肠杆菌lpxM位点的重组菌，命名为重组菌DHGT7ES(产甲羟戊酸)。
重组菌DHGT7ES筛选过程中的PCR鉴定电泳图见图20。PCR鉴定中采用lpxM-7和lpxM-8组成的引物对，重组菌DHGT7ES的目的带约为6kb，非重组菌的目的条带约为5kb。
四、重组菌pAOC3-MD-ispA-ADS/DHGT7ES的构建
将重组质粒pAOC3-MD-ispA-ADS导入重组菌DHGT7ES感受态细胞，得到重组菌，将其命名为重组菌pAOC3-MD-ispA-ADS/DHGT7ES(产紫穗槐-4，11-二烯)。
五、重组菌DHGT7ES(C)-MD-ispA-ADS的构建
1、将质粒pKDS导入重组菌DHGT7ES感受态细胞，得到重组菌，将其命名为重组菌pKDS/DHGT7ES。
2、用重组菌pKDS/DHGT7ES代替重组菌pKDS/DHGT7，其它同步骤三的2。
3、打靶片段CLR-CS的制备
以重组质粒pKSMN-CLR-CS为模板，用C1和C4组成的引物对进行PCR扩增，得到具有大肠杆菌C位点的左侧同源片段、cat基因、sacB基因和大肠杆菌C位点的右侧同源片段的PCR扩增产物，即为打靶片段CLR-CS。
C1：5′-GGCCAAGTTACCAGTCTCATAGGAG-3′；
C4：5′-CGCGACAACCGTAACATCATCAACG-3′。
4、第一次同源重组
用打靶片段CLR-CS代替打靶片段lpxMLR-CS，其它同步骤三的4。
得到将具有cat基因和sacB基因的DNA分子整合入大肠杆菌C位点的重组菌，命名为重组菌DHGT7ES(C)CS。
重组菌DHGT7ES(C)CS筛选过程中的PCR鉴定电泳图见图21。PCR鉴定中采用C5和C6组成的引物对(两个引物对应大肠杆菌中C位点的左侧同源片段和右侧同源片段外侧的序列)，重组菌DHGT7ES(C)CS的目的带约为4kb，阴性菌则由于敲除区域过长无法扩增出条带。
C5：5′-TAATGATCACCGACGTTGGT-3′；
C6：5′-ACGTCATTGAACTCTCAACG-3′。
重组菌DHGT7ES(C)CS的筛选过程中，将待测菌株涂布于含6g/100mL蔗糖的LB平板，重组菌DHGT7ES(C)CS由于含sacB基因在蔗糖平板上不能生长。
5、第二次同源重组
用重组质粒pKSMN-CLR-MD-ispA-ADS代替重组质粒pKSMN-lpxMLR-ES，用重组菌DHGT7ES(C)CS代替重组菌DHGT7CS，其它同步骤三的5。
得到将具有MD融合基因、ispA基因和ADS基因的DNA分子整合入大肠杆菌C位点的重组菌，命名为重组菌DHGT7ES(C)-MD-ispA-ADS(产紫穗槐-4，11-二烯)。
重组菌DHGT7ES(C)-MD-ispA-ADS筛选过程中的PCR鉴定电泳图见图22。PCR鉴定中采用C5和C6组成的引物对，重组菌DHGT7ES(C)-MD-ispA-ADS的目的带约为8.5kb，非重组菌的目的条带约为4kb。
六、重组菌DHGT7ES(D)MD-ispA-ADS的构建
1、同步骤五的1。
2、同步骤五的2。
3、打靶片段DLR-CS的制备
以重组质粒pKSMN-DLR-CS为模板，用D1和D4组成的引物对进行PCR扩增，得到具有大肠杆菌D位点的左侧同源片段、cat基因、sacB基因和大肠杆菌D位点的右侧同源片段的PCR扩增产物，即为打靶片段DLR-CS。
D1：5′-GGCCACCTTGCTAAGTTTGCATAACG-3′；
D4：5′-CGCGAGGTCTTAAATATCGCTGGCT-3′。
4、第一次同源重组
用打靶片段DLR-CS代替打靶片段lpxMLR-CS，其它同步骤三的4。
得到将具有cat基因和sacB基因的DNA分子整合入大肠杆菌D位点的重组菌，命名为重组菌DHGT7ES(D)CS。
5、第二次同源重组
用重组质粒pKSMN-DLR-MD-ispA-ADS代替重组质粒pKSMN-lpxMLR-ES，用重组菌DHGT7ES(D)CS代替重组菌DHGT7CS，其它同步骤三的5。
得到将具有MD融合基因、ispA基因和ADS基因的DNA分子整合入大肠杆菌D位点的重组菌，命名为重组菌DHGT7ES(D)-MD-ispA-ADS(产紫穗槐-4，11-二烯)。
实施例4、应用重组菌pET3-ES/DHGT7生产甲羟戊酸
一、重组菌的培养
挑取重组菌pET3-ES/DHGT7的单菌落，接种至5mL含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220r/min培养过夜；取过夜的培养菌液转接至50mL含100mg/L氨苄青霉素的FM2G培养基，使初始浓度为OD600=0.05，37℃、220r/min培养至OD600=0.3-0.4；加入L-阿拉伯糖并使其初始浓度为0.2g/100mL，30℃培养48小时(分别于24小时、36小时和48小时后取样)。
二、薄层色谱(TLC)检测
取步骤一中培养48小时后的培养体系的上清，用6mol/L的HCl调pH至2.0，37℃温育1-2h(将甲羟戊酸转化为内酯形式，转化过程示意图见图23)，用等体积的乙酸乙酯萃取。取2μL萃取相，点样薄层色谱硅胶预制板(购于烟台市化学工业研究所)，以乙酸乙酯和正丁醇的混合液(体积比=10：1)为展开液，竖直展开。待薄层平板干燥后，用碘熏染3-5min，在紫外(254nm)照射下显色。通过样品与标准品的斑痕位置进行定性检测，通过斑痕的颜色深浅和直径大小进行半定量测定。
结果见图25。A图为甲羟戊酸的定性检测结果，1号样为MVL标准品，2和3号样为重组菌pET3-ES/DHGT7的培养液，4号样为对照菌(即将载体pET3b导入大肠杆菌DHGT7得到的重组菌)的培养液，5号样为1号样和2号样的叠加，可以观察到2号样中具有和MVL标准品在同一水平位置的物质，5号样中样品与MVL标准品混合点样时不发生分离，说明重组菌pET3-ES/DHGT7表达产生了甲羟戊酸。B图为甲羟戊酸的半定量测定结果，1至5号样依次为浓度为8、6、4、2、1g/L的MVL标准品，6号样为重组菌pET3-ES/DHGT7的培养液，根据斑痕的大小和颜色的深浅，可估计重组菌pET3-ES/DHGT7的培养液中甲羟戊酸的浓度约为4g/L。
三、气相色谱与质谱联用(GC-MS)检测
取步骤一得到的培养体系的上清，用6mol/L的HCl调pH至2.0，37℃温育1-2h，用等体积的乙酸乙酯萃取。取10μL萃取相加入190μL含10μg/mL石竹烯(内标物)的乙酸乙酯溶液中，涡旋混匀，得到混合液。混合液用于GC-MS检测，条件如下：1)气相色谱条件：载气，氦气；流速，1.0mL/min；程序升温：70℃保持1min，15℃/min升温至285℃，保持2min，30℃/min升温至310℃；进样口温度，150℃；进样方式，不分流进样；进样量，0.3μL；2)质谱条件：电离方式，电子轰击电离(EI)；电离能量，70eV；电子源温度，220℃；扫描模式，全扫描。
结果见图24。A图为气相色谱(GC)检测结果，分别在7.03和8.42min出现甲羟戊酸内酯(MVL)和内标物石竹烯(IS)的保留峰。对培养上清中的MVL(7.03min)作质谱(MS)检测，质谱图(B图)与MVL标准品的质谱图(C图)比对，二者一致，说明为同一物质，即重组菌pET3-ES/DHGT7表达产生了甲羟戊酸。
进一步采用内标标准曲线法定量测定甲羟戊酸的含量。将MVL标准品稀释成不同浓度(0.6、0.9、1.2、1.5和1.8g/L)，分别加入石竹烯(终浓度为10g/L)作为内标，制备样品进行GC-MS检测。以MVL标准品的浓度为横坐标，MVL标准品与内标物IS的峰面积比为纵坐标，制作标准曲线(见图26)。待测试样中加入等量的石竹烯作为内标，在相同条件下测定样品中MVL与内标的峰面积比，所对应标准曲线的横坐标既为待测试样中MVL的浓度。
结果见图27。重组菌pET3-ES/DHGT7培养48小时后的培养上清中甲羟戊酸浓度为4.11g/L，与采用TLC法的半定量测定结果相近。
实施例5、应用重组菌DHGT7ES生产甲羟戊酸
一、重组菌的培养
用重组菌DHGT7ES代替重组菌pET3-ES/DHGT7，其它同实施例4的步骤一。
二、气相色谱与质谱联用(GC-MS)检测
方法同实施例4的步骤三。
结果见图27。
重组菌DHGT7ES培养48小时后的培养上清中甲羟戊酸浓度达8.22g/L，是重组菌pET3-ES/DHGT7的2倍。
实施例6、应用重组菌pET28-ES/pAOC3-MD-ispA-ADS/DHGT7生产紫穗槐-4，11-二烯
一、重组菌的培养
挑取重组菌pET28-ES/pAOC3-MD-ispA-ADS/DHGT7的单菌落，接种至5mL含50mg/L卡那霉素和25mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃、220r/min培养过夜；取过夜的培养菌液转接至40mL含50mg/L卡那霉素和25mg/L氯霉素的FM2G培养基，使初始浓度为OD600=0.05，37℃、220r/min培养至OD600=0.3-0.4；加入L-阿拉伯糖并使其初始浓度为0.2g/100mL，加入无菌正十二烷并使其初始浓度为20％(体积比)(正十二烷覆盖在培养基的表面，用来收集代谢产物紫穗槐-4，11-二烯，防止其挥发)，30℃培养48小时(分别于24小时、36小时和48小时后取样)。
二、气相色谱与质谱联用(GC-MS)检测
方法同实施例4的步骤三。用紫穗槐-4，11-二烯标准品代替MVL标准品。
GC-MS谱见图28。A图为气相色谱(GC)检测结果，分别在8.83和8.42min出现紫穗槐-4，11-二烯(AD)和内标物石竹烯(IS)的保留峰。对培养上清中的AD(8.83)作质谱(MS)检测，质谱图(B图)与标准品的质谱图(C图)比对，二者一致，说明为同一物质，即重组菌pET28-ES/pAOC3-MD-ispA-ADS/DHGT7表达产生了紫穗槐-4，11-二烯。
重组菌pET28-ES/pAOC3-MD-ispA-ADS/DHGT7培养24、36、48小时后的培养上清中紫穗槐-4，11-二烯的浓度见图29，培养48小时后的培养上清中紫穗槐-4，11-二烯的浓度为101mg/L。
实施例7、应用重组菌pAOC3-MD-ispA-ADS/DHGT7ES生产紫穗槐-4，11-二烯
一、重组菌的培养
挑取重组菌pAOC3-MD-ispA-ADS/DHGT7ES的单菌落，接种至5mL含25mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃、220r/min培养过夜；取过夜的培养菌液转接至40mL含25mg/L氯霉素的FM2G培养基，使初始浓度为OD600=0.05，37℃、220r/min培养至OD600=0.3-0.4；加入L-阿拉伯糖并使其初始浓度为0.2g/100mL，加入无菌正十二烷并使其初始浓度为20％(体积比)，30℃培养48小时(分别于24小时、36小时和48小时后取样)。
二、气相色谱与质谱联用(GC-MS)检测
方法同实施例4的步骤三。用紫穗槐-4，11-二烯标准品代替MVL标准品。
GC-MS谱与图28一致。
重组菌pAOC3-MD-ispA-ADS/DHGT7ES培养24、36、48小时后的培养上清中紫穗槐-4，11-二烯的浓度见图29，培养48小时后的培养上清中紫穗槐-4，11-二烯的浓度为190mg/L。
实施例8、应用重组菌DHGT7ES(C)-MD-ispA-ADS生产紫穗槐-4，11-二烯
一、重组菌的培养
挑取重组菌DHGT7ES(C)-MD-ispA-ADS的单菌落，接种至5mL LB液体培养基中，37℃、220r/min培养过夜；取过夜的培养菌液转接至40mL FM2G培养基，使初始浓度为OD600=0.05，37℃、220r/min培养至OD600=0.3-0.4；加入L-阿拉伯糖并使其初始浓度为0.2g/100mL，加入无菌正十二烷并使其初始浓度为20％(体积比)，30℃培养48h。
二、气相色谱与质谱联用(GC-MS)检测
方法同实施例4的步骤三。用紫穗槐-4，11-二烯标准品代替MVL标准品。
GC-MS谱与图28一致。
重组菌DHGT7ES(C)-MD-ispA-ADS培养24、36、48小时后的培养上清中紫穗槐-4，11-二烯的浓度见图29，培养48小时后的培养上清中紫穗槐-4，11-二烯的浓度为398mg/L。
实施例9、应用重组菌DHGT7ES(D)-MD-ispA-ADS生产紫穗槐-4，11-二烯
一、重组菌的培养
挑取重组菌DHGT7ES(D)MD-ispA-ADS的单菌落，接种至5mL LB液体培养基中，37℃、220r/min培养过夜；取过夜的培养菌液转接至40mL FM2G培养基，使初始浓度为OD600=0.05，37℃、220r/min培养至OD600=0.3-0.4；加入L-阿拉伯糖并使其初始浓度为0.2g/100mL，加入无菌正十二烷并使其初始浓度为20％(体积比)，30℃培养48h。
二、气相色谱与质谱联用(GC-MS)检测
方法同实施例4的步骤三。用紫穗槐-4，11-二烯标准品代替MVL标准品。
GC-MS谱与图28一致。
重组菌DHGT7ES(D)-MD-ispA-ADS培养24、36、48小时后的培养上清中紫穗槐-4，11-二烯的浓度见图29，培养48小时后的培养上清中紫穗槐-4，11-二烯的浓度为398mg/L。
Claims (2)
1.一种工程菌，是在大肠杆菌中导入如下基因得到的重组菌：紫穗槐-4,11-二烯合酶基因、HMG-CoA还原酶基因、HMG-CoA合酶基因、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、IPP异构酶基因和牻牛儿基转移酶基因；
所述HMG-CoA还原酶基因和所述HMG-CoA合酶基因通过同源重组整合入所述大肠杆菌的基因组DNA，所述同源同组是通过lpxM位点左侧同源臂和lpxM位点右侧同源臂实现的；所述lpxM位点左侧同源臂如序列表的序列6自5’末端第6至1064位核苷酸所示；所述lpxM位点右侧同源臂如序列表的序列6自5’末端第1087至2073位核苷酸所示；
所述紫穗槐-4,11-二烯合酶基因、所述甲羟戊酸激酶基因、所述磷酸甲羟戊酸激酶基因、所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、所述IPP异构酶基因和所述牻牛儿基转移酶基因通过同源重组整合入所述大肠杆菌的基因组DNA，所述同源同组是通过C位点左侧同源臂和C位点右侧同源臂实现的；所述C位点左侧同源臂如序列表的序列7自5’末端第6至421位核苷酸所示；所述C位点右侧同源臂如序列表的序列7自5’末端第449至1078位核苷酸所示；或，所述同源同组是通过D位点左侧同源臂和D位点右侧同源臂实现的；所述D位点左侧同源臂如序列表的序列8自5’末端第6至619位核苷酸所示；所述D位点右侧同源臂如序列表的序列8自5’末端第651至1350位核苷酸所示。
2.权利要求1所述工程菌在生产紫穗槐-4,11-二烯中的应用。
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| 吴涛等.在大肠杆菌内引入甲羟戊酸途径高效合成抗疟药青蒿素前体――紫穗槐-4 11-二烯.《生物工程学报》.2011 |
| 在大肠杆菌内引入甲羟戊酸途径高效合成抗疟药青蒿素前体――紫穗槐-4,11-二烯;吴涛等;《生物工程学报》;20110725;第27卷(第07期);1040-1048 * |
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