JP2003274952A - 新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素、それをコードする遺伝子、ならびに該酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】既知酵素とは異なる分解様式をもつ新しいキシ
ログルカンオリゴ糖分解酵素を提供する。 【解決手段】ゲオトリカム属に属する微生物からキシロ
グルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合
について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合
を特異的に分解する酵素を採取するとともに、そのアミ
ノ酸配列及び該酵素遺伝子の塩基配列を明らかにし、遺
伝子工学的手法を用いて上記酵素活性を有するポリペプ
チドを安価かつ高純度で生産する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なキシログル
カンオリゴ糖分解酵素、キシログルカンオリゴ糖分解活
性を有する特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
その遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組
換えベクターにより形質転換された形質転換体、及び該
形質転換体を培養して上記ポリペプチドを製造する方法
等に関する。

【０００２】

【従来の技術】キシログルカンは、グルコース、キシロ
ース、ガラクトース、フコース、アラビノースなどを構
成単糖とするヘテロ多糖であるが、グルコースがβ-
１，４-グルコシド結合で多数結合した主鎖に対して、
キシロースがα-１，６キシロシド結合で高頻度に分岐
結合した構造を基本とすることから、キシログルカンと
呼称されている。このキシログルカンは、植物の一次細
胞壁の構成成分として、またタマリンド豆に代表される
熱帯産マメ科植物の種子貯蔵多糖として重要な役割を担
っており、その構造や機能が注目されている。特に、植
物の一次細胞壁中におけるキシログルカンは、セルロー
スと密接に関わって存在していると考えられており、セ
ルロースとの相対的な存在形態が、植物細胞の伸長や形
態分化に重要な役割を担っているものと考えられてい
る。このようなキシログルカンの役割を解明するために
種々の手法が用いられているが、中でもキシログルカン
を分解することのできる各種グリコシダーゼは、重要で
強力な分析手段を提供する。

【０００３】上述のようにキシログルカンはグルコー
ス、キシロース、ガラクトース、フコース、アラビノー
スなどを構成単糖とし、かつ主鎖の構造がセルロースと
同様なものであることから、これを分解できるグリコシ
ダーゼとして、エンド-１，４-β-D-グルカナーゼ、β-
ガラクトシダーゼ、イソプリメベロース生成オリゴキシ
ログルカン分解酵素、α-キシロシダーゼ、β-グルコシ
ダーゼおよびα-フコシダーゼが知られており、キシロ
グルカンの構造や機能の解明に、各種起源のこれら酵素
が用いられてきた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、キシロ
グルカンの複雑な構造から察せられるように、既知のグ
リコシダーゼでは切断できない結合が数多く残ってお
り、既知酵素とは異なる分解様式をもつ新しいグリコシ
ダーゼの開発が嘱望されていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、キシログ
ルカンには既知のグリコシダーゼでは直接切断できない
グリコシド結合のほうが多いこと、また酵素は一般的に
高い基質特異性を有していることに着目し、自然界より
キシログルカンを炭素源として生育できる微生物のスク
リーニングを行い、さらに分離微生物の生産するキシロ
グルカン分解酵素系を、種々の構造をもつキシログルカ
ンオリゴ糖を分解基質として精査することにより、これ
まで知られていない分解様式でキシログルカンを分解す
る酵素の存在の可能性について鋭意検討した。その結
果、酵母菌の一種であり、高純度キシログルカンオリゴ
９糖の大量調製に有効な菌株として知られているゲオト
リカム属の一菌株（ゲオトリカム（Geotrichum）属菌M1
28株）が 新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素を生
産することを見出すとともに、該酵素のアミノ酸配列及
びその遺伝子の塩基配列を解明し、本発明を完成するに
至った。

【０００６】すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２
０）に係るものである。 （１）キシログルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グ
ルコシド結合について、還元末端側から２番目のβ-グ
ルコシド結合を特異的に分解する酵素。 （２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するポ
リぺプチド、または該ポリペプチドにおける１個又は複
数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換さ
れたアミノ酸配列を有し、かつキシログルカンオリゴ糖
分解活性を有するポリペプチド。 （３）Ｎ末端にメチオニンが付加された上記（２）に記
載のポリペプチド。 （４）シグナル配列が付加された上記（２）に記載のポ
リペプチド。 （５）配列番号１２中に示されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、若しくは該ポリペプチドにおける１個又
は複数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換され
たアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、キシロ
グルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドの前駆
体となるポリペプチド。 （６）配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する上
記（３）に記載のポリペプチド。 （７）上記（２）〜（５）のいずれかに記載のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド。 （８）配列番号１３に示される塩基配列を有するポリヌ
クレオチド、若しくは該ポリヌクレオチドにおける１個
又は複数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された
塩基配列を有するものであって、キシログルカンオリゴ
糖分解活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレ
オチド。 （９）開始コドンが付加された上記（８）に記載のポリ
ヌクレオチド。 （１０）シグナルペプチド配列に対応する塩基配列が付
加された上記（８）に記載のポリヌクレオチド。 （１１）配列番号１１に示される塩基配列を有するポリ
ヌクレオチド、若しくは該ポリヌクレオチドにおける１
個又は複数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換され
た塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、キシロ
グルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドの前駆
体を発現するポリヌクレオチド。 （１２）上記（８）〜（１１）のいずれかに記載のポリ
ヌクレオチドに対し、ストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするポリヌクレオチド。 （１３）上記（８）〜（１１）のいずれかに記載のポリ
ヌクレオチドに相同性を有するポリヌクレオチド。 （１４）上記（８）〜（１１）のいずれかに記載のポリ
ヌクレオチドに縮重するポリヌクレオチド。 （１５）上記（７）〜（１４）のいずれかに記載のポリ
ヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクタ
ー。 （１６）上記（１５）に記載の組換えベクターを含むこ
とを特徴とする形質転換体。 （１７）上記（１６）に記載の形質転換体を培養し、培
養物から、上記（８）〜（１４）のいずれかに記載のポ
リヌクレオチドに対応するポリペプチドを採取すること
を特徴とする、ポリペプチドの製造方法。 （１８）ポリペプチドが、キシログルカンオリゴ糖分解
活性を有するものである上記（１７）に記載のポリペプ
チドの製造方法。 （１９）キシログルカンオリゴ糖分解活性が、キシログ
ルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合に
ついて、還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合を
特異的に分解するものである上記（１８）に記載のポリ
ペプチドの製造方法。

【０００７】なお、本発明においては、「アミノ酸配列
を有するポリペプチド」あるいは「塩基配列を有するポ
リヌクレオチド」というとき、該記載において指摘する
アミノ酸配列または塩基配列のみではなく、これら配列
をその部分として含有するポリペプチド、ポリヌクレオ
チドも包含する。

【０００８】本発明におけるキシログルカンオリゴ糖分
解酵素は、キシログルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ
-グルコシド結合について、還元末端側から２番目のβ-
グルコシド結合を特異的に分解する機能を有する。この
酵素は、ゲオトリカム（Geotrichum）属菌M128株により
生産され、ゲオトリカム（Geotrichum）属菌M128株は、
ゲオトリカム・エスピー （Geotrichum sp.）M128株、
FERM P-16454として産業技術総合研究所、特許微生物寄
託センターに寄託されている。

【０００９】上記ゲオトリカム（Geotrichum ）属菌M12
8株より、本発明の酵素を生産するためには、通常、タ
マリンド種子キシログルカンを炭素源とし、これに窒素
源として、硝酸塩、アンモニウム塩或いはペプトン、酵
母エキスのような無機または有機の窒素源と少量の金属
塩を含む液体または固体培地を用い、２０〜３０℃で、
４〜１０日程度、好気的に培養される。本発明の酵素
は、菌体外に生産される酵素であるため、液体培地の場
合は培養後、濾過或いは遠心分離した上澄液を、そして
固体培養の場合は培養後、水または適当な無機塩類で抽
出した液を、粗酵素液とすることができる。粗酵素液中
には、本発明の酵素以外にキシログルカンを分解する種
々の酵素活性が含まれるため、これを除去する必要があ
るが、公知のクロマトグラフィーにより、本発明の酵素
以外の共存するグリコシダーゼ活性を除去することがで
きる。

【００１０】上記のようにして得られた本発明の酵素
（精製物）は、以下のような性質を有している。

【００１１】（１）分子量及び等電点；精製された本発
明の酵素は、分子量が約９６,０００で、等電点ｐＨは
約６．０である。

【００１２】（２）作用；本発明の酵素は、各種起源の
キシログルカンのエンド-β-１，４-グルカナーゼによ
る部分分解で生ずるキシログルカン由来オリゴ糖のう
ち、主鎖の重合度が３以上のキシログルカンオリゴ糖に
作用し、そのオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド
結合について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド
結合を特異的に分解する。このとき、還元末端に位置す
るグルコース残基の結合にあずかる４位の水酸基以外が
修飾されていると、本発明の酵素は当該のβ-グルコシ
ド結合を分解できない。

【００１３】また、キシログルカンオリゴ糖について、
主鎖の還元末端グルコースから数えて３番目のグルコー
ス残基に結合している、側鎖キシロースの水酸基のうち
２位水酸基が修飾されていると、本発明の酵素は還元末
端側から２番目のβ-グルコシド結合を分解できない。
さらに、キシロース側鎖を持たない重合度４以上のセロ
オリゴ糖について、本酵素は還元末端側から２番目のβ
-グルコシド結合を分解しセロビオースを生成するが、
キシログルカンオリゴ糖の分解速度にくらべて非常に遅
く、その比は２００分の１以下である。

【００１４】重合度４以上のセロオリゴ糖について、こ
れを分解しセロビオースを生成する酵素として、１，４
-β-D-グルカン-セロビオヒドロラーゼ（EC ３．２．
１．９１）が知られているが、該酵素はキシロース側鎖
をもつキシログルカンオリゴ糖の、主鎖を構成するβ-
グルコシド結合を分解することはできない。このよう
に、既知のグリコシダーゼには、キシログルカンオリゴ
糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合について、還元
末端側から２番目のβ-グルコシド結合に特異的に作用
する酵素は知られておらず、したがって本発明の酵素
は、新規な分解様式をもつ新しいキシログルカンオリゴ
糖分解酵素である。

【００１５】（３）作用ｐＨ及び最適作用ｐＨ；キシロ
グルカンオリゴ７糖を分解基質としたとき、本発明の酵
素の作用ｐＨ範囲は、４５℃で１０分間作用させた場
合、ｐＨ３〜５であり、最適作用ｐＨは約４．０付近に
認められた。

【００１６】（４）安定ｐＨ範囲；本発明の酵素をクエ
ン酸-リン酸塩緩衝液中で、４５℃，３時間放置してそ
の残存活性からみた安定ｐＨ範囲は約ｐＨ３．５〜８．
０であった。

【００１７】（５）作用温度範囲及び最適作用温度；キ
シログルカンオリゴ７糖を分解基質としたとき、本発明
の酵素の作用温度範囲は、ｐＨ４．０で１０分間作用さ
せた場合、約５５℃まで作用が認められたが、最適作用
温度は５０℃であった。

【００１８】（６）熱安定性；本発明の酵素を５０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）のもとで、各温度で１０分間
加熱処理した残存活性は５０℃までは殆ど失活せず、５
５℃で約１０％、６０℃で約８５％が活性を失った。

【００１９】（７）阻害剤；各種金属イオンのうちで、
１ｍＭ以上の水銀イオンにより、本発明の酵素は強く阻
害された。

【００２０】（８）精製法；本発明の酵素は、培養上清
を限外濾過により濃縮・脱塩した後、陰イオン交換体Ｐ
ＢＥ９４のカラムを用いたイオン交換及び吸着クロマト
グラフィーを繰り返し行い、活性を保持している画分を
濃縮して、さらにトヨパールＨＷ５５Ｆカラムによるゲ
ル濾過を行うことで、ＳＤＳ電気泳動的に均一なまで分
離精製することができた。

【００２１】（９）活性測定法；本発明の酵素は、キシ
ログルカンオリゴ糖を特異的に分解することから、タマ
リンドガムより調製したキシログルカンオリゴ７糖の３
０ミリモル水溶液０．５ミリリットル（ｐＨ４．０）に
対して、適量の酵素を添加して全量を１ミリリットルと
し、４５℃で１０分間反応させ、生成する還元糖をネル
ソン-ソモギー法により測定し、活性を求めた。この条
件で、１分間に１マイクロモルのグルコースに相当する
還元力を生成する酵素量を１単位とした。

【００２２】本発明の新規なキシログルカンオリゴ糖分
解酵素は、分泌蛋白であり、配列番号１２に示されるア
ミノ酸配列を有し、該配列中、残基１〜２３はシグナル
配列である。本酵素の成熟体蛋白は、この残基１〜２３
の配列が除かれたものであり、このアミノ酸配列を配列
番号１４に示す。

【００２３】したがって、本発明のポリペプチドとして
好適なものは、少なくともこの配列番号１４のアミノ酸
配列を有するものであるが、また、このポリペプチドと
１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若し
くは置換によりアミノ酸配列が異なるものであっても、
キシログルカンオリゴ糖分解活性を有する限り本発明に
含まれる。

【００２４】また、本発明のポリペプチドとしては、配
列番号１２で示されるような、上記シグナル配列を有す
る前駆体ポリペプチド、あるいは、該ポリペプチドと１
個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しく
は置換によりアミノ酸配列が異なるものであっても、ス
プライシングによりキシログルカンオリゴ糖分解活性を
有するポリペプチドを産生可能なものも挙げることがで
きる。

【００２５】さらに、本発明のポリペプチドは、遺伝子
組換え手段を用いて製造することができる。この場合、
例えば、上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列のＮ
末端に開始コドン由来のメチオニンが付加したもの、あ
るいはそのＣ末端に発現ベクター由来のアミノ酸残基及
び得られるポリペプチドの精製のためのヒスチジンタグ
等が付加したものであってもよく、例えば、配列番号１
８に示されるポリペプチドについて、キシログルカンオ
リゴ糖分解活性を有することが確認されている。

【００２６】本発明のキシログルカンオリゴ糖分解活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子としては、該
酵素を産生する微生物から該遺伝子のクローニングによ
って取得することができる遺伝子や該遺伝子に相同性を
有する遺伝子があげられる。相同性としては、少なくと
も６０％以上の相同性を有する遺伝子、好ましくは８０
％以上の相同性を有する遺伝子、さらに好ましくは９５
％以上の相同性を有する遺伝子が挙げられる。本発明の
キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子としては、例えば以下のようなポリ
ヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が好ましい。

【００２７】（１）配列番号１３に示す塩基配列を有す
るポリヌクレオチド、あるいは該ポリペプチドの１個又
は複数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩
基配列を有するポリヌクレオチドであって、キシログル
カンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド。 （２）上記（１）のポリヌクレオチドに開始コドンが付
加されているポリヌクレオチド。 （３）上記（１）に示されるポリヌクレオチドにシグナ
ル配列に対応する塩基配列が付加されたポリヌクレオチ
ド、あるいは該ポリヌクレオチドにおける１個又は複数
個の核酸が欠失、付加、挿入または置換された塩基配列
を有し、かつスプライシングにより成熟体を発現可能な
ポリヌクレオチドであって、具体的には配列番号１１に
示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。

【００２８】さらに、このほか上記（１）〜（３）のポ
リヌクレオチドに対しストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズする遺伝子、該ポリヌクレオチドに相同性を
有するポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドに縮
重するポリヌクレオチドもそれらがコードするポリペプ
チドがキシログルカンオリゴ糖分解活性を有する限り本
発明に含まれる。なお、ここでいう「ストリンジェント
な条件下」とは、例えば以下の条件をいう。すなわち
０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ（Denhartz's、０．１
％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリド
ン、０．１％フィコール４００）及び１００μg/ｍｌサ
ケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１
５ ｍｏｌ/ｌ、０．０１５ｍｏｌ/ｌクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７．０ ）中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一
晩保温する条件をいう。

【００２９】本発明のキシログルカンオリゴ糖分解活性
を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
は、上述したキシログルカンオリゴ糖分解酵素を産生す
る微生物から、例えば以下に記載するような方法で該遺
伝子のクローニングを行うことによって取得することが
できる。まず、新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素
を産生する微生物から上述の方法によって本発明の新規
なキシログルカンオリゴ糖分解酵素を単離、精製し、そ
の部分アミノ酸配列に関する情報を得る。

【００３０】部分アミノ酸配列決定方法としては、例え
ば、精製された本酵素蛋白質を直接エドマン分解法〔Jo
urnal of Biological Chemistry, 256, 7990-7997 （19
81）〕によりアミノ酸配列分析〔プロテイン−シーケン
サ４７６Ａ、アプライド バイオシステムズ（Applied B
iosystems）社製等〕に供してもよいし、あるいはタン
パク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、
得られたペプチド断片を分離精製し、得られた精製ペプ
チド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的で
ある。

【００３１】こうして得られる部分アミノ酸配列の情報
を基に、新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素遺伝子
をクローニングする。一般的に、 ＰＣＲを用いる方法
あるいはハイブリダイゼーション法を利用してクローニ
ングを行うことができる。

【００３２】ＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法を利
用する場合、例えば、Sambrook andRussell，Molecular
Cloning: A Laboratory Manual，Third edition, Cold
Spring Habor Laboratory Press（2001）に記載の方法
を用いることができる。

【００３３】ＰＣＲ法を利用する場合、以下のような方
法を用いることができる。まず、新規なキシログルカン
オリゴ糖分解酵素を産生する微生物のｃＤＮＡを鋳型と
し、部分アミノ酸配列の情報を基にデザインした合成オ
リゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行
い、目的の遺伝子断片を得る。

【００３４】この増幅ＤＮＡ断片について通常用いられ
る方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネーター法
で塩基配列を決定すると、決定された配列中に合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーの配列以外に新規なキシログ
ルカンオリゴ糖分解酵素の部分アミノ酸配列に対応する
配列が見出され、目的の酵素遺伝子の一部を取得するこ
とができる。さらに、得られた遺伝子断片をプローブと
して用いるハイブリダイゼーション法や、５′−ＲＡＣ
Ｅ(Rapid Amplification of cDNA ends)及び３′−ＲＡ
ＣＥ法等を行うことによって、新規なキシログルカンオ
リゴ糖分解酵素全長をコードする遺伝子をクローニング
することができる。

【００３５】本発明においては、ゲオトリカム・エスピ
ー（Geotrichum sp.）M128株を用い、ＰＣＲ法を利用し
て、キシログルカンオリゴ糖分解酵素をコードする遺伝
子の全塩基配列を決定した。この塩基配列は配列番号１
１に示される。これによってコードされるアミノ酸配列
を配列番号１２に記載した。 このアミノ酸配列のう
ち、Ｎ末端１〜２３のアミノ酸残基はシグナル配列を示
し、成熟体のポリペプチドは、２４番目のリジンから始
まるアミノ酸配列を有し（配列番号１４）、該成熟体ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は
配列番号１３に示すとおりである。なお、配列番号１２
あるいは１４に記載したアミノ酸配列に対応する塩基配
列は配列番号１１あるいは１３に記載したもの以外に無
数に存在するが、これらはすべて本発明の範囲に含まれ
る。

【００３６】また、配列番号１２あるいは１４に記載の
アミノ酸配列や配列番号１１あるいは１３に記載の塩基
配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺
伝子ポリヌクレオチドを得ることもできる(Gene,60(1),
115-127 (1987))。

【００３７】さらに、ゲオトリカム・エスピーM128株を
用いて全塩基配列が明らかにされた新規なキシログルカ
ンオリゴ糖分解酵素遺伝子の全体あるいは一部分をハイ
ブリダイゼーション用のプローブとして用いて、他のキ
シログルカンオリゴ糖分解酵素を産生する微生物のゲノ
ムＤＮＡライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーか
ら、配列番号１１の新規なキシログルカンオリゴ糖分解
酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡを選別することができ
る。

【００３８】ハイブリダイゼーションは、上記に示した
ストリンジェントな条件下で行うことができる。例え
ば、新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素を産生する
微生物から得たゲノムＤＮＡライブラリーあるいはｃＤ
ＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６
×ＳＳＣ 、 ０．５％ＳＤＳ 、５×デンハルツ、１０
０μg/ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼー
ション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングす
る。その後、³²Ｐでラベルした各プローブを加えて、６
５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、
室温で１０分間、０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ
中、室温で１０分間、０．１％ ＳＤＳを含む０．２×
ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオ
グラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズ
するＤＮＡを検出することができる。また、洗いなどの
条件を変えることによって様々な相同性を示す遺伝子を
得ることができる。

【００３９】一方、本発明の遺伝子の塩基配列からＰＣ
Ｒ反応用のプライマーをデザインすることができる。こ
のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことによって、
本発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出した
り、更にはその遺伝子全体を得ることもできる。

【００４０】得られた遺伝子が目的のキシログルカンオ
リゴ糖分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩基
配列を本発明の新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素
の塩基配列又はアミノ酸配列と比較し、その遺伝子構造
及び相同性から推定することもできる。また、得られた
遺伝子のポリペプチドを製造し、キシログルカンオリゴ
糖分解酵素活性を測定することにより、目的の酵素活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどう
か確認することができる。

【００４１】本発明のキシログルカンオリゴ糖分解酵素
遺伝子を用いて、キシログルカンオリゴ糖分解酵素活性
を有するポリペプチドを生産するには以下の方法が便宜
である。まず、目的の酵素遺伝子により発現ベクターを
組み換え、該遺伝子を含む組換えベクターを用いて宿主
の形質転換を行い、次いで該形質転換体の培養を通常用
いられる条件で行うことによって、新規なキシログルカ
ンオリゴ糖分解酵素活性を有するポリペプチドを生産さ
せる。この際、キシログルカンオリゴ糖分解活性を有す
る成熟体ポリペプチドを得るには、該ポリペプチドのＮ
末端にメチオニン残基が付いていないため、該成熟体ポ
リペプチドに対応する塩基配列において開始コドン（at
g）を付加し、さらに、必要に応じ終止コドンを付加す
る(taa/tag/tga)。

【００４２】また、宿主としては微生物、動物細胞、植
物細胞等を用いることができる。微生物としては、大腸
菌、Bacillus属、Streptomyces属、Lactococcus属等の
細菌、Saccharomyces属、Pichia属、Kluyveromyces属等
の酵母、Aspergillus属、Penicillium属、Trichoderma
属等の糸状菌が挙げられる.動物細胞としては、バキュ
ロウイルスの系統が挙げられる。このうち、真核細胞を
用いる場合においては、例えば、遺伝子として、配列番
号１１に示すような、シグナル配列に対応する塩基配列
を有する前駆体ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを用いても、スプライスィングにより成熟体ポリペ
プチドが生産される。

【００４３】発現の確認や発現産物の確認は、新規なキ
シログルカンオリゴ糖分解酵素に対する抗体を用いて行
うことが簡便であるが、酵素活性を測定することにより
発現の確認を行うこともできる。

【００４４】形質転換体の培養物から新規なキシログル
カンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドを精製する
には上述のように、遠心分離、UF濃縮、塩析、イオン交
換樹脂等の各種クロマトグラフィーを適宜組み合わせて
行うことができる。また、ポリペプチドの精製を有利に
行うためには、例えば、使用する遺伝子として、生成す
るポリペプチドのＣ末端にヒスチジンタグが付加される
ように、cay cay caycay cay cay配列を設けてもよく、
また、使用する発現ベクターとしてヒスチジンタグ配列
および終止コドンを有するベクターを用い、該ヒスチヂ
ンタグの５’末端上流側に当該遺伝子を挿入してもよ
い。

【００４５】一方、本発明によりキシログルカンオリゴ
糖分解酵素の一次構造及び遺伝子構造が明らかとなった
ことにより、本発明の遺伝子を用いて、ランダム変異あ
るいは部位特異的変異を導入し、天然のキシログルカン
オリゴ糖分解酵素のアミノ酸配列中に、１個又は複数個
のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少な
くとも１つがなされている遺伝子を得ることが可能であ
る。これにより、キシログルカンオリゴ糖分解酵素活性
を有するが、至適温度、安定温度、至適ｐＨ、安定ｐ
Ｈ、基質特異性等の性質が少しずつ異なったキシログル
カンオリゴ糖分解酵素をコードする遺伝子を得ることが
可能であり、遺伝子工学的にこれら酵素活性を有するポ
リペプチドを製造することが可能となる。

【００４６】ランダム変異を導入する方法としては、例
えば、 DNAを化学的に処理する方法として、亜硫酸水素
ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に変
換するトランジション変異を起こさせる方法〔Proceedi
ngs of the National Academy of Sciences of the Uni
ted States of America, 79, 1408−1412（1982）〕、
生化学的方法として、〔α-S〕ｄＮＴＰ存在下、二本鎖
を合成する過程で塩基置換を生じさせる方法〔Gene, 6
4, 313-319（1988）〕、 ＰＣＲを用いる方法として、
反応系にマンガンを加えてPCRを行い、ヌクレオチドの
取込みの正確さを低くする方法〔Analytical Biochemis
try, 224, 347-353（1995）〕等を用いることができ
る。

【００４７】部位特異的変異を導入する方法としては、
例えば、アンバー変異を利用する方法〔ギャップド デ
ュプレックス（gapped duplex ）法、Nucleic Acids Re
search, 12(24), 9441-9456（1984）〕、制限酵素の認
識部位を利用する方法〔Analytical Biochemistry, 20
0, 81-88（1992）、Gene, 102, 67-70（1991）〕、dut
（dUTPase ）とung （ウラシルDNAグリコシラーゼ）変
異を利用する方法〔クンケル（Kunkel）法、Proceeding
s of the National Academy of Sciences of theUnited
States of America, 82, 488-492（1985）〕、ＤＮＡ
ポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを用いたアンバー変異
を利用する方法〔オリゴヌクレオチド ダイレクティッ
ド デュアル アンバー（Oligonucleotide-directed Dua
l Amber ：ODA）法、Gene, 152, 271-275（1995）、特
開平7-289262号公報〕、ＤＮＡの修復系を誘導させた宿
主を利用する方法（特開平8-70874号公報）、ＤＮＡ鎖
交換反応を触媒するタンパク質を利用する方法（特開平
8-140685号公報）、制限酵素の認識部位を付加した２種
類の変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法
（USP5,512,463）、不活化薬剤耐性遺伝子を有する二本
鎖ＤＮＡベクターと２種類のプライマーを用いたＰＣＲ
による方法〔Gene, 103, 73-77（1991）〕、アンバー変
異を利用したＰＣＲによる方法〔国際公開WO98/02535号
公報〕等を用いることができる。

【００４８】また、市販されているキットを使用するこ
とにより、部位特異的変異を容易に導入することができ
る。市販のキットとしては、例えば、ギャップドデュプ
レックス法を用いたMutan（登録商標）-G（宝酒造社
製）、クンケル法を用いたMutan（登録商標）-K（宝酒
造社製）、ODA法を用いたMutan （登録商標）-Express
Km（宝酒造社製）、変異導入用プライマーとピロコッカ
ス フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来DNAポリメ
ラーゼを用いたQuikChangeTM Site-Directed Mutagenes
is Kit〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕等を用い
ることができ、また、 PCR法を利用するキットとして、
TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit（宝酒造社
製）、Mutan （登録商標）-Super Express Km （宝酒造
社製）等を用いることができる。

【００４９】このように、本発明により、キシログルカ
ンオリゴ糖分解酵素の一次構造及び遺伝子構造が提供さ
れたことにより、キシログルカンオリゴ糖分解酵素活性
を有するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な
製造が可能となる。なお、本明細書では種々の文献等を
引用したが、これらはすべて参考として本明細書に組み
込まれるものである。以下、本発明を実施例を用いて詳
述するが本発明はこれらに限定されるものではない。以
下、特に明記しない限り、本明細書において％はW/V％
で示した。

【００５０】

【実施例】

【実施例１】タマリンド種子キシログルカン１％とペプ
トン０．８％と硫酸マグネシウム０．０５％とリン酸一
カリウム０．２％と酵母エキス０．０５％とを含む培地
（ｐＨ６．０）２０ｍｌを２００ｍｌ容の三角フラスコ
に入れ、常法により殺菌した後、ゲオトリカム・エスピ
ー（Geotrichum sp.）M128株（FERM P-16454）を接種
し、３０℃で６日間通気培養した。その後、遠心分離に
より除菌し、得られた上澄液について前記活性測定法に
より活性を測定した結果、培養液１ｍｌ当り０．０５単
位であった。

【００５１】

【実施例２】前記実施例１と同様な組成の培養液４００
０ｍｌを調製し、ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum
sp.）M128株を接種して同様に培養し、培養上清を得
た。培養液中の全酵素活性は２１６単位であった。培養
上清を限外濾過により濃縮・脱塩した後、陰イオン交換
体ＰＢＥ９４のカラムを用いたイオン交換及び吸着クロ
マトグラフィーを行い、さらにトヨパールＨＷ５５Ｆカ
ラムによるゲル濾過により精製した。精製酵素はＳＤＳ
−電気泳動的に均一であり、活性の収率は培養濾液に対
して９．２％であった。また、精製酵素タンパク質１ｍ
ｇ当たりの活性は、１１．８単位であった。

【００５２】

【実施例３】前記実施例２で得られた本精製酵素０．０
８単位を、８０ミリグラムのキシログルカンオリゴ７糖
を含む反応液１ミリリットルに加え、ｐＨ４．０，４５
℃で３時間作用させた。反応終了後、生成物をバイオ・
ゲルＰ-２〔バイオラッド（Bio-Rad）社製〕を用いたゲ
ル濾過法により分離・精製し構造を解析した。生成物
は、重合度3（オリゴ糖A）と重合度４（オリゴ糖B）の
２種類のオリゴ糖からなり、オリゴ糖Aは、イソプリメ
ベロース生成オリゴキシログルカン分解酵素により、等
モルのイソプリメベロースとグルコースに分解された。
また、オリゴ糖Bは、イソプリメベロース生成オリゴキ
シログルカン分解酵素により分解され、イソプリメベロ
ースのみを生成した。以上の結果から、本酵素は基質と
してあたえたキシログルカンオリゴ７糖の主鎖を構成す
るβ-グルコシド結合について、該オリゴ糖の還元末端
から数えて２番目のβ-グルコシド結合を切断し、分岐
４糖と分岐３糖を生成することが明らかになった。

【００５３】

【実施例４】前記実施例２で得られた本精製酵素０．０
１単位を、表１に示す各種のキシログルカンオリゴ糖5
ミリグラムに１８時間作用させた後、高速液体クロマト
グラフィーにより生成オリゴ糖を分析した。その結果、
本酵素は、主鎖の重合度が３以上のキシログルカンオリ
ゴ糖に作用し、そのオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グル
コシド結合について、還元末端側から２番目のβ-グル
コシド結合を特異的に分解することが示された。また、
このとき、還元末端に位置するグルコース残基が修飾さ
れていると、当該の結合を分解できないこと、さらに主
鎖の還元末端グルコースから数えて３番目のグルコース
残基に結合している側鎖キシロース残基が重要であり、
このキシロース残基が修飾されていると、本酵素は当該
結合を分解できないことが示された。

【００５４】

【表１】

【００５５】側鎖を有するキシログルカンオリゴ糖につ
いて、その主鎖を構成する１，４-β-D-グルコシド結合
を直接分解する酵素としては、イソプリメベロース生成
オリゴキシログルカン分解酵素が従来より知られてい
た。しかし、該酵素はキシログルカンオリゴ糖を、その
非還元末端よりエキソ型の分解様式でイソプリメベロー
ス単位に分解する酵素であるのにた対して、本酵素はキ
シログルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド
結合について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド
結合を直接分解できる点で、既知酵素とは全く異なる基
質特異性と分解様式を持つ酵素であった。

【００５６】

【実施例５】〈ゲオトリカム・エスピー（Geotrichum s
p.）M128株由来の新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵
素をコードする遺伝子の単離〉

【００５７】本明細書においては、遺伝子操作手法は特
に記載しない限り成書（例えばSambrook and Russell，
Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Third edit
ion, Cold Spring Habor Laboratory Press, 2001）に
従って行った。

【００５８】〔部分アミノ酸配列の決定〕実施例３で得
られたキシログルカンオリゴ糖分解酵素の精製標品を、
プロテイン・シークエンサー〔アプライド バイオシス
テムズ（Applied Biosystems）社製〕に供し、配列番号
１に示す２２残基のＮ末端アミノ酸配列を決定した。次
に、実施例３で得られたキシログルカンオリゴ糖分解酵
素の精製標品をリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工
業社製）による分解を行った。得られた分解物を逆相液
体クロマトグラフィーに供し、分離されたペプチド画分
のうち三つをプロテイン・シークエンサーに供し、配列
番号２，３，４に示す９〜１２残基の内部アミノ酸配列
を決定した。

【００５９】 配列番号１： Lys-Glu-His-Tyr-Glu-Phe-Lys-Asn-Val-Ala-Ile-Gly-Gly-Gly-Gly-Tyr-Ile-Thr- Gly-Ile-Val-Ala 配列番号２： Asp-Leu-Leu-Tyr-Ala-Arg-Thr-Asp-Ile-Gly-Gly-Ala 配列番号３： Ala-Ser-Ala-Pro-Ser-Ala-Val-Phe-Ile-Trp-Gly-Thr 配列番号４： Val-Tyr-Gly-Arg-Val-Tyr-Leu-Gly-Thr

【００６０】全ＲＮＡの調製 実施例1と同様に培養を
行い、常法によりＲＮＡ単離キット（FastRNA Kit-RE
D、BIO 101社製）を用いて、添付の説明書に従って全Ｒ
ＮＡを調整し、ｍＲＮＡ調製キット〔QuickPrep mRNA P
urification Kit、アマシャムファルマシア バイオテ
ク（Amersham Pharmacia Biotech）社製〕を用いてｍＲ
ＮＡを精製した。得られたｍＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成
キット〔TimeSaver cDNA Synthesis kit、アマシャム
ファルマシア バイオテク（Amersham Pharmacia Biote
ch）社製〕を用いて、オリゴｄＴプライマーと逆転写酵
素によるｃＤＮＡ合成を行った。

【００６１】ＰＣＲによる増幅 配列番号１のN末端領
域アミノ酸配列および配列番号３の内部アミノ酸配列を
もとに、配列番号５に示すセンス・プライマーと配列番
号６に示すアンチセンス・プライマーの２種の混合オリ
ゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機〔アプライド バイオシ
ステムズ（Applied Biosystems）社製〕により合成し、
ＰＣＲプライマーとした。

【００６２】 配列番号５ センス・プライマー： 5'-GARCAYTAYGARTTYAARAAYGT -3' 配列番号６ アンチセンス・プライマー： 5'-GTNCCCCADATRAANACNGC-3'

【００６３】これらのプライマーとゲオトリカム・エス
ピー（Geotrichum sp.）M128株のｃＤＮＡを鋳型とし
て、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔ
ｅｍ９７００〔アプライド バイオシステムズ（Applied
Biosystems）社製〕を用いてＰＣＲ反応を行なった。

【００６４】＜ＰＣＲ反応液＞ １０×ＰＣＲ反応緩衝
液 (宝酒造社製)１０μl 、ｄＮＴＰ混合液 (それぞれ
２．５ｍｍｏｌ/ｌ、宝酒造社製) 8 μ、 １００μｍｏ
ｌ/ｌセンス・プライマー５μl 、１００μｍｏｌ/ｌア
ンチセンス・プライマー５μl、蒸留水７１μl、ｃＤＮ
Ａ溶液（１００μg/ｍｌ）０．５μl 、ＥＸ−ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ (宝酒造社製)０．５μl

【００６５】＜ＰＣＲ反応条件＞ ステージ１： 変性
（９４℃、５分） １サイクル ステージ２： 変性（９４℃、１分）アニール（４５
℃、１分）伸長（７２℃、２分）３５サイクル ステージ３： 伸長（７２℃、１０分）１サイクル

【００６６】得られた約２ｋｂｐのＤＮＡ断片をpGEM-T
Easy〔プロメガ（Promega）社製〕にクローニング後、
塩基配列を確認したところ、センス・プライマーの直後
とアンチセンス・プライマーの直前に、上記の部分アミ
ノ酸配列をコードする塩基配列が見出された。また、配
列番号２の内部アミノ酸配列をコードする塩基配列も見
いだされた。

【００６７】〔５′末端及び３′末端の決定〕前記ＤＮ
Ａの塩基配列をもとにして、５′−ＲＡＣＥ(Rapid Amp
lification of cDNA ends)用のアンチセンス・プライマ
ーとして配列番号７及び配列番号８で示される２種のプ
ライマーを作製し、ｃＤＮＡを鋳型として、５′−ＲＡ
ＣＥ法により５′末端のＤＮＡ断片を得て、その塩基配
列を決定した。また、同様に、３′−ＲＡＣＥ用のセン
ス・プライマーとして配列番号９及び配列番号１０で示
される２種のプライマーを作製し、３′−ＲＡＣＥ法に
より３′末端のＤＮＡ断片を得て、その塩基配列を決定
した。

【００６８】 配列番号７： 5'-CGTACAGCAGGTCCTTGGTCTTTGG-3' 配列番号８： 5'-TAATGTACCCGCCGCCGCCGAT-3' 配列番号９： 5'-GGCAAGTTCTTCGTCTCGACCGAC-3' 配列番号１０： 5'- CCAAGTCGGACGGCAAGAAGGCTA -3'

【００６９】決定されたキシログルカンオリゴ糖分解酵
素をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１１に示
す。得られたｃＤＮＡは全長２６４６塩基対からなり、
１２０〜１２２番目の開始コドン（atg）から２５５６
〜２５５８番目の終止コドン（taa）で終了する、配列
番号１２に示す８１２アミノ酸からなる蛋白質をコード
すると予想されるオープンリーディングフレームを有す
る。開始コドンの周辺は、翻訳開始部位に重要な−３位
及び＋４位のgの要求を満たしている。このアミノ酸配
列中には、Ｎ末端領域アミノ酸配列（配列番号１）およ
び内部アミノ酸配列（配列番号２〜４）が見出された。
翻訳開始部位から、成熟体のＮ末端領域アミノ酸（配列
番号１）の直前までの配列（残基１〜２３）は、シグナ
ル配列であり、本発明の酵素が分泌蛋白であることを示
唆している。成熟体蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１
４に、該成熟体蛋白質をコードするポリヌクレオチドの
塩基配列を配列番号１３に示す。

【００７０】 配列番号１１： aatcgccccg gtgttggctc atcgggccgc ggtgtcggtg ttgatacgag tacataattg 60 ggactgtcgg tgcgattggc ccccaacttc accacacaac acctacacac tctttagat 119 atg gtg gca gtc acc tcc ctc ggg aag gcg ctt act gcc ctt tcg att 167 Met Val Ala Val Thr Ser Leu Gly Lys Ala Leu Thr Ala Leu Ser Ile 1 5 10 15 ctg gcg tcg ctc gcg gtc gcc aag gag cac tac gag ttc aag aat gtc 215 Leu Ala Ser Leu Ala Val Ala Lys Glu His Tyr Glu Phe Lys Asn Val 20 25 30 gcg atc ggc ggc ggc ggg tac att acc ggg att gtc gcg cac cca aag 263 Ala Ile Gly Gly Gly Gly Tyr Ile Thr Gly Ile Val Ala His Pro Lys 35 40 45 acc aag gac ctg ctg tac gcg cgc acg gac att ggc ggc gcg tac cgc 311 Thr Lys Asp Leu Leu Tyr Ala Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala Tyr Arg 50 55 60 tgg gac gca ggc acg tcc aag tgg atc ccg ctc aac gac ttt atc gag 359 Trp Asp Ala Gly Thr Ser Lys Trp Ile Pro Leu Asn Asp Phe Ile Glu 65 70 75 80 gcg cag gac atg aac att atg ggc acc gag tcg atc gcg ctg gac ccc 407 Ala Gln Asp Met Asn Ile Met Gly Thr Glu Ser Ile Ala Leu Asp Pro 85 90 95 aac aac ccc gac agg ctg tac ctc gcg cag ggg cgc tat gtc ggc gac 455 Asn Asn Pro Asp Arg Leu Tyr Leu Ala Gln Gly Arg Tyr Val Gly Asp 100 105 110 gag tgg gcg gcg ttc tat gtg tcc gaa gac cgc ggc cag tcg ttt aca 503 Glu Trp Ala Ala Phe Tyr Val Ser Glu Asp Arg Gly Gln Ser Phe Thr 115 120 125 atc tac gag tcg ccg ttc ccg atg ggc gcc aac gac atg gga cgc aac 551 Ile Tyr Glu Ser Pro Phe Pro Met Gly Ala Asn Asp Met Gly Arg Asn 130 135 140 aat ggc gag cgc ctc gct gtc aac ccg ttc aac tcg aac gag gtc tgg 599 Asn Gly Glu Arg Leu Ala Val Asn Pro Phe Asn Ser Asn Glu Val Trp 145 150 155 160 atg ggt acg cgt aca gag ggt atc tgg aag agt tcg gac cgc gcc aag 647 Met Gly Thr Arg Thr Glu Gly Ile Trp Lys Ser Ser Asp Arg Ala Lys 165 170 175 acc tgg aca aac gtc acg tcc atc ccg gac gcg ttc acc aac ggt atc 695 Thr Trp Thr Asn Val Thr Ser Ile Pro Asp Ala Phe Thr Asn Gly Ile 180 185 190 gga tac acg tcg gtc att ttc gac ccc gaa cgt aat ggc acc atc tac 743 Gly Tyr Thr Ser Val Ile Phe Asp Pro Glu Arg Asn Gly Thr Ile Tyr 195 200 205 gcg agc gcg act gcc ccg cag ggc atg tac gtc acg cac gac ggc ggt 791 Ala Ser Ala Thr Ala Pro Gln Gly Met Tyr Val Thr His Asp Gly Gly 210 215 220 gtc tcg tgg gag cca gtg gcg ggc cag ccg tcc agc tgg ctc aac agg 839 Val Ser Trp Glu Pro Val Ala Gly Gln Pro Ser Ser Trp Leu Asn Arg 225 230 235 240 acc acg ggc gcg ttc ccg gac aag aag ccc gcg tcg atc gcg ccg cag 887 Thr Thr Gly Ala Phe Pro Asp Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Pro Gln 245 250 255 ccc atg aaa gtc gct ctc acc ccc aac ttc ctc tac gtg act tac gcc 935 Pro Met Lys Val Ala Leu Thr Pro Asn Phe Leu Tyr Val Thr Tyr Ala 260 265 270 gac tac cct ggt cca tgg ggc gtc acg ttc ggc gaa gtc tgg cgc cag 983 Asp Tyr Pro Gly Pro Trp Gly Val Thr Phe Gly Glu Val Trp Arg Gln 275 280 285 aac cgc acc tcg ggc gcc tgg gac gac att act ccc cgc gtc ggc aac 1031 Asn Arg Thr Ser Gly Ala Trp Asp Asp Ile Thr Pro Arg Val Gly Asn 290 295 300 tcg tcg cct gcc ccg tac aac aac cag acg ttc cct gcg ggc gga ttt 1079 Ser Ser Pro Ala Pro Tyr Asn Asn Gln Thr Phe Pro Ala Gly Gly Phe 305 310 315 320 tgc ggt ctc agc gtc gac gcg acc aac ccc aac cgt ctc gtc gtc atc 1127 Cys Gly Leu Ser Val Asp Ala Thr Asn Pro Asn Arg Leu Val Val Ile 325 330 335 acc ctc gac cgc gac ccc gga ccc gcc ctc gac agc atc tac ctc tca 1175 Thr Leu Asp Arg Asp Pro Gly Pro Ala Leu Asp Ser Ile Tyr Leu Ser 340 345 350 acc gat gcc ggc gcg acc tgg aag gac gtc acc cag ctc tcg tcc ccg 1223 Thr Asp Ala Gly Ala Thr Trp Lys Asp Val Thr Gln Leu Ser Ser Pro 355 360 365 tcc aac ctc gaa ggt aac tgg ggc cac ccg act aac gcg gcg cgg tac 1271 Ser Asn Leu Glu Gly Asn Trp Gly His Pro Thr Asn Ala Ala Arg Tyr 370 375 380 aag gac ggc acg cct gtt ccg tgg ctc gac ttc aac aac ggt ccc cag 1319 Lys Asp Gly Thr Pro Val Pro Trp Leu Asp Phe Asn Asn Gly Pro Gln 385 390 395 400 tgg ggg gga tac ggt gcg ccg cac ggt acg ccc ggc ctc acc aag ttt 1367 Trp Gly Gly Tyr Gly Ala Pro His Gly Thr Pro Gly Leu Thr Lys Phe 405 410 415 ggc tgg tgg atg agc gct gtg ctt atc gat ccg ttc aac ccc gag cac 1415 Gly Trp Trp Met Ser Ala Val Leu Ile Asp Pro Phe Asn Pro Glu His 420 425 430 ctg atg tac ggc acg ggg gcg acc atc tgg gcg acc gac acg ctc tcc 1463 Leu Met Tyr Gly Thr Gly Ala Thr Ile Trp Ala Thr Asp Thr Leu Ser 435 440 445 cgt gtc gag aag gac tgg gcg ccg agc tgg tac ctc cag atc gac ggt 1511 Arg Val Glu Lys Asp Trp Ala Pro Ser Trp Tyr Leu Gln Ile Asp Gly 450 455 460 atc gag gag aat gcg atc ctg tcg ctc cgc tcg ccc aag agc ggc gcg 1559 Ile Glu Glu Asn Ala Ile Leu Ser Leu Arg Ser Pro Lys Ser Gly Ala 465 470 475 480 gcg ctc ctg tcg ggc atc ggt gac att agc ggc atg aag cac gac gac 1607 Ala Leu Leu Ser Gly Ile Gly Asp Ile Ser Gly Met Lys His Asp Asp 485 490 495 ctc acc aag ccc cag aag atg ttt ggt gcg ccc cag ttc tcc aac ctc 1655 Leu Thr Lys Pro Gln Lys Met Phe Gly Ala Pro Gln Phe Ser Asn Leu 500 505 510 gac agc atc gac gct gcg ggc aac ttc ccc aac gtt gtc gtc cgc gcc 1703 Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Asn Phe Pro Asn Val Val Val Arg Ala 515 520 525 gga tcc tcg gga cac gag tac gac agc gcg tgc gcg cgc ggt gcg tac 1751 Gly Ser Ser Gly His Glu Tyr Asp Ser Ala Cys Ala Arg Gly Ala Tyr 530 535 540 gcg act gac ggc gga gac gcg tgg acc atc ttc cct acc tgc cct cct 1799 Ala Thr Asp Gly Gly Asp Ala Trp Thr Ile Phe Pro Thr Cys Pro Pro 545 550 555 560 ggc atg aac gcg agc cac tac cag ggc agc acg att gca gtc gac gcg 1847 Gly Met Asn Ala Ser His Tyr Gln Gly Ser Thr Ile Ala Val Asp Ala 565 570 575 agc ggc agc cag atc gtg tgg tcg acc aag ctt gac gag cag gcc tcg 1895 Ser Gly Ser Gln Ile Val Trp Ser Thr Lys Leu Asp Glu Gln Ala Ser 580 585 590 gga ccg tgg tac tcg cac gac tat ggc aag acg tgg tct gtt ccc gct 1943 Gly Pro Trp Tyr Ser His Asp Tyr Gly Lys Thr Trp Ser Val Pro Ala 595 600 605 ggc gac ctg aag gcc cag act gcc aat gtg ctc tcg gac aag gtc cag 1991 Gly Asp Leu Lys Ala Gln Thr Ala Asn Val Leu Ser Asp Lys Val Gln 610 615 620 gat ggc acg ttc tac gct acc gat ggc ggc aag ttc ttc gtc tcg acc 2039 Asp Gly Thr Phe Tyr Ala Thr Asp Gly Gly Lys Phe Phe Val Ser Thr 625 630 635 640 gac ggc ggg aag tcg tat gcc gcc aag ggc gcc gga ctt gtc act ggc 2087 Asp Gly Gly Lys Ser Tyr Ala Ala Lys Gly Ala Gly Leu Val Thr Gly 645 650 655 aca tcg ctc atg cct gcc gtg aac ccc tgg gtg gcc ggc gac gtc tgg 2135 Thr Ser Leu Met Pro Ala Val Asn Pro Trp Val Ala Gly Asp Val Trp 660 665 670 gtg cct gtt ccc gag ggc ggt ctc ttc cac tcg acc gac ttt ggc gcc 2183 Val Pro Val Pro Glu Gly Gly Leu Phe His Ser Thr Asp Phe Gly Ala 675 680 685 tcg ttc acg agg gta ggt acc gcc aac gcg acc ctc gtg agc gtc ggc 2231 Ser Phe Thr Arg Val Gly Thr Ala Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Gly 690 695 700 gcc ccc aag tcc aag tcg gac ggc aag aag gct agc gcg ccc tcc gcg 2279 Ala Pro Lys Ser Lys Ser Asp Gly Lys Lys Ala Ser Ala Pro Ser Ala 705 710 715 720 gtc ttc atc tgg ggc acc gac aag cct gga agc gac atc ggc ctg tac 2327 Val Phe Ile Trp Gly Thr Asp Lys Pro Gly Ser Asp Ile Gly Leu Tyr 725 730 735 cgc tcc gac gac aac ggc agc acc tgg acg cgc gtc aat gac cag gag 2375 Arg Ser Asp Asp Asn Gly Ser Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Gln Glu 740 745 750 cac aac tac tcg ggc ccc acc atg atc gag gcc gac ccc aag gtc tac 2423 His Asn Tyr Ser Gly Pro Thr Met Ile Glu Ala Asp Pro Lys Val Tyr 755 760 765 ggg cgc gtg tat cta ggc acg aac ggc cgc ggt atc gtg tac gcc gac 2471 Gly Arg Val Tyr Leu Gly Thr Asn Gly Arg Gly Ile Val Tyr Ala Asp 770 775 780 ctt acc aac aag aag agc aac gag gag aag tcg acc gca aag tgc gcc 2519 Leu Thr Asn Lys Lys Ser Asn Glu Glu Lys Ser Thr Ala Lys Cys Ala 785 790 795 800 aac ggc cag aag ggc acg cac tgc tat gtg aaa aag taa atgggaagga 2568 Asn Gly Gln Lys Gly Thr His Cys Tyr Val Lys Lys 805 810 aagggcgaaa gggacatacc gcctggttat ttaaatgcat ctacatgtta cttaaaaaaa 2628 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2646 配列番号１２ Met Val Ala Val Thr Ser Leu Gly Lys Ala Leu Thr Ala Leu Ser Ile 1 5 10 15 Leu Ala Ser Leu Ala Val Ala Lys Glu His Tyr Glu Phe Lys Asn Val 20 25 30 Ala Ile Gly Gly Gly Gly Tyr Ile Thr Gly Ile Val Ala His Pro Lys 35 40 45 Thr Lys Asp Leu Leu Tyr Ala Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala Tyr Arg 50 55 60 Trp Asp Ala Gly Thr Ser Lys Trp Ile Pro Leu Asn Asp Phe Ile Glu 65 70 75 80 Ala Gln Asp Met Asn Ile Met Gly Thr Glu Ser Ile Ala Leu Asp Pro 85 90 95 Asn Asn Pro Asp Arg Leu Tyr Leu Ala Gln Gly Arg Tyr Val Gly Asp 100 105 110 Glu Trp Ala Ala Phe Tyr Val Ser Glu Asp Arg Gly Gln Ser Phe Thr 115 120 125 Ile Tyr Glu Ser Pro Phe Pro Met Gly Ala Asn Asp Met Gly Arg Asn 130 135 140 Asn Gly Glu Arg Leu Ala Val Asn Pro Phe Asn Ser Asn Glu Val Trp 145 150 155 160 Met Gly Thr Arg Thr Glu Gly Ile Trp Lys Ser Ser Asp Arg Ala Lys 165 170 175 Thr Trp Thr Asn Val Thr Ser Ile Pro Asp Ala Phe Thr Asn Gly Ile 180 185 190 Gly Tyr Thr Ser Val Ile Phe Asp Pro Glu Arg Asn Gly Thr Ile Tyr 195 200 205 Ala Ser Ala Thr Ala Pro Gln Gly Met Tyr Val Thr His Asp Gly Gly 210 215 220 Val Ser Trp Glu Pro Val Ala Gly Gln Pro Ser Ser Trp Leu Asn Arg 225 230 235 240 Thr Thr Gly Ala Phe Pro Asp Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Pro Gln 245 250 255 Pro Met Lys Val Ala Leu Thr Pro Asn Phe Leu Tyr Val Thr Tyr Ala 260 265 270 Asp Tyr Pro Gly Pro Trp Gly Val Thr Phe Gly Glu Val Trp Arg Gln 275 280 285 Asn Arg Thr Ser Gly Ala Trp Asp Asp Ile Thr Pro Arg Val Gly Asn 290 295 300 Ser Ser Pro Ala Pro Tyr Asn Asn Gln Thr Phe Pro Ala Gly Gly Phe 305 310 315 320 Cys Gly Leu Ser Val Asp Ala Thr Asn Pro Asn Arg Leu Val Val Ile 325 330 335 Thr Leu Asp Arg Asp Pro Gly Pro Ala Leu Asp Ser Ile Tyr Leu Ser 340 345 350 Thr Asp Ala Gly Ala Thr Trp Lys Asp Val Thr Gln Leu Ser Ser Pro 355 360 365 Ser Asn Leu Glu Gly Asn Trp Gly His Pro Thr Asn Ala Ala Arg Tyr 370 375 380 Lys Asp Gly Thr Pro Val Pro Trp Leu Asp Phe Asn Asn Gly Pro Gln 385 390 395 400 Trp Gly Gly Tyr Gly Ala Pro His Gly Thr Pro Gly Leu Thr Lys Phe 405 410 415 Gly Trp Trp Met Ser Ala Val Leu Ile Asp Pro Phe Asn Pro Glu His 420 425 430 Leu Met Tyr Gly Thr Gly Ala Thr Ile Trp Ala Thr Asp Thr Leu Ser 435 440 445 Arg Val Glu Lys Asp Trp Ala Pro Ser Trp Tyr Leu Gln Ile Asp Gly 450 455 460 Ile Glu Glu Asn Ala Ile Leu Ser Leu Arg Ser Pro Lys Ser Gly Ala 465 470 475 480 Ala Leu Leu Ser Gly Ile Gly Asp Ile Ser Gly Met Lys His Asp Asp 485 490 495 Leu Thr Lys Pro Gln Lys Met Phe Gly Ala Pro Gln Phe Ser Asn Leu 500 505 510 Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Asn Phe Pro Asn Val Val Val Arg Ala 515 520 525 Gly Ser Ser Gly His Glu Tyr Asp Ser Ala Cys Ala Arg Gly Ala Tyr 530 535 540 Ala Thr Asp Gly Gly Asp Ala Trp Thr Ile Phe Pro Thr Cys Pro Pro 545 550 555 560 Gly Met Asn Ala Ser His Tyr Gln Gly Ser Thr Ile Ala Val Asp Ala 565 570 575 Ser Gly Ser Gln Ile Val Trp Ser Thr Lys Leu Asp Glu Gln Ala Ser 580 585 590 Gly Pro Trp Tyr Ser His Asp Tyr Gly Lys Thr Trp Ser Val Pro Ala 595 600 605 Gly Asp Leu Lys Ala Gln Thr Ala Asn Val Leu Ser Asp Lys Val Gln 610 615 620 Asp Gly Thr Phe Tyr Ala Thr Asp Gly Gly Lys Phe Phe Val Ser Thr 625 630 635 640 Asp Gly Gly Lys Ser Tyr Ala Ala Lys Gly Ala Gly Leu Val Thr Gly 645 650 655 Thr Ser Leu Met Pro Ala Val Asn Pro Trp Val Ala Gly Asp Val Trp 660 665 670 Val Pro Val Pro Glu Gly Gly Leu Phe His Ser Thr Asp Phe Gly Ala 675 680 685 Ser Phe Thr Arg Val Gly Thr Ala Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Gly 690 695 700 Ala Pro Lys Ser Lys Ser Asp Gly Lys Lys Ala Ser Ala Pro Ser Ala 705 710 715 720 Val Phe Ile Trp Gly Thr Asp Lys Pro Gly Ser Asp Ile Gly Leu Tyr 725 730 735 Arg Ser Asp Asp Asn Gly Ser Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Gln Glu 740 745 750 His Asn Tyr Ser Gly Pro Thr Met Ile Glu Ala Asp Pro Lys Val Tyr 755 760 765 Gly Arg Val Tyr Leu Gly Thr Asn Gly Arg Gly Ile Val Tyr Ala Asp 770 775 780 Leu Thr Asn Lys Lys Ser Asn Glu Glu Lys Ser Thr Ala Lys Cys Ala 785 790 795 800 Asn Gly Gln Lys Gly Thr His Cys Tyr Val Lys Lys 805 810

【００７１】 配列番号１３： aag gag cac tac gag ttc aag aat gtc gcg atc ggc ggc ggc ggg tac 48 Lys Glu His Tyr Glu Phe Lys Asn Val Ala Ile Gly Gly Gly Gly Tyr 1 5 10 15 att acc ggg att gtc gcg cac cca aag acc aag gac ctg ctg tac gcg 96 Ile Thr Gly Ile Val Ala His Pro Lys Thr Lys Asp Leu Leu Tyr Ala 20 25 30 cgc acg gac att ggc ggc gcg tac cgc tgg gac gca ggc acg tcc aag 144 Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala Tyr Arg Trp Asp Ala Gly Thr Ser Lys 35 40 45 tgg atc ccg ctc aac gac ttt atc gag gcg cag gac atg aac att atg 192 Trp Ile Pro Leu Asn Asp Phe Ile Glu Ala Gln Asp Met Asn Ile Met 50 55 60 ggc acc gag tcg atc gcg ctg gac ccc aac aac ccc gac agg ctg tac 240 Gly Thr Glu Ser Ile Ala Leu Asp Pro Asn Asn Pro Asp Arg Leu Tyr 65 70 75 80 ctc gcg cag ggg cgc tat gtc ggc gac gag tgg gcg gcg ttc tat gtg 288 Leu Ala Gln Gly Arg Tyr Val Gly Asp Glu Trp Ala Ala Phe Tyr Val 85 90 95 tcc gaa gac cgc ggc cag tcg ttt aca atc tac gag tcg ccg ttc ccg 336 Ser Glu Asp Arg Gly Gln Ser Phe Thr Ile Tyr Glu Ser Pro Phe Pro 100 105 110 atg ggc gcc aac gac atg gga cgc aac aat ggc gag cgc ctc gct gtc 384 Met Gly Ala Asn Asp Met Gly Arg Asn Asn Gly Glu Arg Leu Ala Val 115 120 125 aac ccg ttc aac tcg aac gag gtc tgg atg ggt acg cgt aca gag ggt 432 Asn Pro Phe Asn Ser Asn Glu Val Trp Met Gly Thr Arg Thr Glu Gly 130 135 140 atc tgg aag agt tcg gac cgc gcc aag acc tgg aca aac gtc acg tcc 480 Ile Trp Lys Ser Ser Asp Arg Ala Lys Thr Trp Thr Asn Val Thr Ser 145 150 155 160 atc ccg gac gcg ttc acc aac ggt atc gga tac acg tcg gtc att ttc 528 Ile Pro Asp Ala Phe Thr Asn Gly Ile Gly Tyr Thr Ser Val Ile Phe 165 170 175 gac ccc gaa cgt aat ggc acc atc tac gcg agc gcg act gcc ccg cag 576 Asp Pro Glu Arg Asn Gly Thr Ile Tyr Ala Ser Ala Thr Ala Pro Gln 180 185 190 ggc atg tac gtc acg cac gac ggc ggt gtc tcg tgg gag cca gtg gcg 624 Gly Met Tyr Val Thr His Asp Gly Gly Val Ser Trp Glu Pro Val Ala 195 200 205 ggc cag ccg tcc agc tgg ctc aac agg acc acg ggc gcg ttc ccg gac 672 Gly Gln Pro Ser Ser Trp Leu Asn Arg Thr Thr Gly Ala Phe Pro Asp 210 215 220 aag aag ccc gcg tcg atc gcg ccg cag ccc atg aaa gtc gct ctc acc 720 Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Pro Gln Pro Met Lys Val Ala Leu Thr 225 230 235 240 ccc aac ttc ctc tac gtg act tac gcc gac tac cct ggt cca tgg ggc 768 Pro Asn Phe Leu Tyr Val Thr Tyr Ala Asp Tyr Pro Gly Pro Trp Gly 245 250 255 gtc acg ttc ggc gaa gtc tgg cgc cag aac cgc acc tcg ggc gcc tgg 816 Val Thr Phe Gly Glu Val Trp Arg Gln Asn Arg Thr Ser Gly Ala Trp 260 265 270 gac gac att act ccc cgc gtc ggc aac tcg tcg cct gcc ccg tac aac 864 Asp Asp Ile Thr Pro Arg Val Gly Asn Ser Ser Pro Ala Pro Tyr Asn 275 280 285 aac cag acg ttc cct gcg ggc gga ttt tgc ggt ctc agc gtc gac gcg 912 Asn Gln Thr Phe Pro Ala Gly Gly Phe Cys Gly Leu Ser Val Asp Ala 290 295 300 acc aac ccc aac cgt ctc gtc gtc atc acc ctc gac cgc gac ccc gga 960 Thr Asn Pro Asn Arg Leu Val Val Ile Thr Leu Asp Arg Asp Pro Gly 305 310 315 320 ccc gcc ctc gac agc atc tac ctc tca acc gat gcc ggc gcg acc tgg 1008 Pro Ala Leu Asp Ser Ile Tyr Leu Ser Thr Asp Ala Gly Ala Thr Trp 325 330 335 aag gac gtc acc cag ctc tcg tcc ccg tcc aac ctc gaa ggt aac tgg 1056 Lys Asp Val Thr Gln Leu Ser Ser Pro Ser Asn Leu Glu Gly Asn Trp 340 345 350 ggc cac ccg act aac gcg gcg cgg tac aag gac ggc acg cct gtt ccg 1104 Gly His Pro Thr Asn Ala Ala Arg Tyr Lys Asp Gly Thr Pro Val Pro 355 360 365 tgg ctc gac ttc aac aac ggt ccc cag tgg ggg gga tac ggt gcg ccg 1152 Trp Leu Asp Phe Asn Asn Gly Pro Gln Trp Gly Gly Tyr Gly Ala Pro 370 375 380 cac ggt acg ccc ggc ctc acc aag ttt ggc tgg tgg atg agc gct gtg 1200 His Gly Thr Pro Gly Leu Thr Lys Phe Gly Trp Trp Met Ser Ala Val 385 390 395 400 ctt atc gat ccg ttc aac ccc gag cac ctg atg tac ggc acg ggg gcg 1248 Leu Ile Asp Pro Phe Asn Pro Glu His Leu Met Tyr Gly Thr Gly Ala 405 410 415 acc atc tgg gcg acc gac acg ctc tcc cgt gtc gag aag gac tgg gcg 1296 Thr Ile Trp Ala Thr Asp Thr Leu Ser Arg Val Glu Lys Asp Trp Ala 420 425 430 ccg agc tgg tac ctc cag atc gac ggt atc gag gag aat gcg atc ctg 1344 Pro Ser Trp Tyr Leu Gln Ile Asp Gly Ile Glu Glu Asn Ala Ile Leu 435 440 445 tcg ctc cgc tcg ccc aag agc ggc gcg gcg ctc ctg tcg ggc atc ggt 1392 Ser Leu Arg Ser Pro Lys Ser Gly Ala Ala Leu Leu Ser Gly Ile Gly 450 455 460 gac att agc ggc atg aag cac gac gac ctc acc aag ccc cag aag atg 1440 Asp Ile Ser Gly Met Lys His Asp Asp Leu Thr Lys Pro Gln Lys Met 465 470 475 480 ttt ggt gcg ccc cag ttc tcc aac ctc gac agc atc gac gct gcg ggc 1488 Phe Gly Ala Pro Gln Phe Ser Asn Leu Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly 485 490 495 aac ttc ccc aac gtt gtc gtc cgc gcc gga tcc tcg gga cac gag tac 1536 Asn Phe Pro Asn Val Val Val Arg Ala Gly Ser Ser Gly His Glu Tyr 500 505 510 gac agc gcg tgc gcg cgc ggt gcg tac gcg act gac ggc gga gac gcg 1584 Asp Ser Ala Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Ala Thr Asp Gly Gly Asp Ala 515 520 525 tgg acc atc ttc cct acc tgc cct cct ggc atg aac gcg agc cac tac 1632 Trp Thr Ile Phe Pro Thr Cys Pro Pro Gly Met Asn Ala Ser His Tyr 530 535 540 cag ggc agc acg att gca gtc gac gcg agc ggc agc cag atc gtg tgg 1680 Gln Gly Ser Thr Ile Ala Val Asp Ala Ser Gly Ser Gln Ile Val Trp 545 550 555 560 tcg acc aag ctt gac gag cag gcc tcg gga ccg tgg tac tcg cac gac 1728 Ser Thr Lys Leu Asp Glu Gln Ala Ser Gly Pro Trp Tyr Ser His Asp 565 570 575 tat ggc aag acg tgg tct gtt ccc gct ggc gac ctg aag gcc cag act 1776 Tyr Gly Lys Thr Trp Ser Val Pro Ala Gly Asp Leu Lys Ala Gln Thr 580 585 590 gcc aat gtg ctc tcg gac aag gtc cag gat ggc acg ttc tac gct acc 1824 Ala Asn Val Leu Ser Asp Lys Val Gln Asp Gly Thr Phe Tyr Ala Thr 595 600 605 gat ggc ggc aag ttc ttc gtc tcg acc gac ggc ggg aag tcg tat gcc 1872 Asp Gly Gly Lys Phe Phe Val Ser Thr Asp Gly Gly Lys Ser Tyr Ala 610 615 620 gcc aag ggc gcc gga ctt gtc act ggc aca tcg ctc atg cct gcc gtg 1920 Ala Lys Gly Ala Gly Leu Val Thr Gly Thr Ser Leu Met Pro Ala Val 625 630 635 640 aac ccc tgg gtg gcc ggc gac gtc tgg gtg cct gtt ccc gag ggc ggt 1968 Asn Pro Trp Val Ala Gly Asp Val Trp Val Pro Val Pro Glu Gly Gly 645 650 655 ctc ttc cac tcg acc gac ttt ggc gcc tcg ttc acg agg gta ggt acc 2016 Leu Phe His Ser Thr Asp Phe Gly Ala Ser Phe Thr Arg Val Gly Thr 660 665 670 gcc aac gcg acc ctc gtg agc gtc ggc gcc ccc aag tcc aag tcg gac 2064 Ala Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Gly Ala Pro Lys Ser Lys Ser Asp 675 680 685 ggc aag aag gct agc gcg ccc tcc gcg gtc ttc atc tgg ggc acc gac 2112 Gly Lys Lys Ala Ser Ala Pro Ser Ala Val Phe Ile Trp Gly Thr Asp 690 695 700 aag cct gga agc gac atc ggc ctg tac cgc tcc gac gac aac ggc agc 2160 Lys Pro Gly Ser Asp Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asp Asp Asn Gly Ser 705 710 715 720 acc tgg acg cgc gtc aat gac cag gag cac aac tac tcg ggc ccc acc 2208 Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Gln Glu His Asn Tyr Ser Gly Pro Thr 725 730 735 atg atc gag gcc gac ccc aag gtc tac ggg cgc gtg tat cta ggc acg 2256 Met Ile Glu Ala Asp Pro Lys Val Tyr Gly Arg Val Tyr Leu Gly Thr 740 745 750 aac ggc cgc ggt atc gtg tac gcc gac ctt acc aac aag aag agc aac 2304 Asn Gly Arg Gly Ile Val Tyr Ala Asp Leu Thr Asn Lys Lys Ser Asn 755 760 765 gag gag aag tcg acc gca aag tgc gcc aac ggc cag aag ggc acg cac 2352 Glu Glu Lys Ser Thr Ala Lys Cys Ala Asn Gly Gln Lys Gly Thr His 770 775 780 tgc tat gtg aaa aag 2367 Cys Tyr Val Lys Lys 785 配列番号１４： Lys Glu His Tyr Glu Phe Lys Asn Val Ala Ile Gly Gly Gly Gly Tyr 1 5 10 15 Ile Thr Gly Ile Val Ala His Pro Lys Thr Lys Asp Leu Leu Tyr Ala 20 25 30 Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala Tyr Arg Trp Asp Ala Gly Thr Ser Lys 35 40 45 Trp Ile Pro Leu Asn Asp Phe Ile Glu Ala Gln Asp Met Asn Ile Met 50 55 60 Gly Thr Glu Ser Ile Ala Leu Asp Pro Asn Asn Pro Asp Arg Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Ala Gln Gly Arg Tyr Val Gly Asp Glu Trp Ala Ala Phe Tyr Val 85 90 95 Ser Glu Asp Arg Gly Gln Ser Phe Thr Ile Tyr Glu Ser Pro Phe Pro 100 105 110 Met Gly Ala Asn Asp Met Gly Arg Asn Asn Gly Glu Arg Leu Ala Val 115 120 125 Asn Pro Phe Asn Ser Asn Glu Val Trp Met Gly Thr Arg Thr Glu Gly 130 135 140 Ile Trp Lys Ser Ser Asp Arg Ala Lys Thr Trp Thr Asn Val Thr Ser 145 150 155 160 Ile Pro Asp Ala Phe Thr Asn Gly Ile Gly Tyr Thr Ser Val Ile Phe 165 170 175 Asp Pro Glu Arg Asn Gly Thr Ile Tyr Ala Ser Ala Thr Ala Pro Gln 180 185 190 Gly Met Tyr Val Thr His Asp Gly Gly Val Ser Trp Glu Pro Val Ala 195 200 205 Gly Gln Pro Ser Ser Trp Leu Asn Arg Thr Thr Gly Ala Phe Pro Asp 210 215 220 Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Pro Gln Pro Met Lys Val Ala Leu Thr 225 230 235 240 Pro Asn Phe Leu Tyr Val Thr Tyr Ala Asp Tyr Pro Gly Pro Trp Gly 245 250 255 Val Thr Phe Gly Glu Val Trp Arg Gln Asn Arg Thr Ser Gly Ala Trp 260 265 270 Asp Asp Ile Thr Pro Arg Val Gly Asn Ser Ser Pro Ala Pro Tyr Asn 275 280 285 Asn Gln Thr Phe Pro Ala Gly Gly Phe Cys Gly Leu Ser Val Asp Ala 290 295 300 Thr Asn Pro Asn Arg Leu Val Val Ile Thr Leu Asp Arg Asp Pro Gly 305 310 315 320 Pro Ala Leu Asp Ser Ile Tyr Leu Ser Thr Asp Ala Gly Ala Thr Trp 325 330 335 Lys Asp Val Thr Gln Leu Ser Ser Pro Ser Asn Leu Glu Gly Asn Trp 340 345 350 Gly His Pro Thr Asn Ala Ala Arg Tyr Lys Asp Gly Thr Pro Val Pro 355 360 365 Trp Leu Asp Phe Asn Asn Gly Pro Gln Trp Gly Gly Tyr Gly Ala Pro 370 375 380 His Gly Thr Pro Gly Leu Thr Lys Phe Gly Trp Trp Met Ser Ala Val 385 390 395 400 Leu Ile Asp Pro Phe Asn Pro Glu His Leu Met Tyr Gly Thr Gly Ala 405 410 415 Thr Ile Trp Ala Thr Asp Thr Leu Ser Arg Val Glu Lys Asp Trp Ala 420 425 430 Pro Ser Trp Tyr Leu Gln Ile Asp Gly Ile Glu Glu Asn Ala Ile Leu 435 440 445 Ser Leu Arg Ser Pro Lys Ser Gly Ala Ala Leu Leu Ser Gly Ile Gly 450 455 460 Asp Ile Ser Gly Met Lys His Asp Asp Leu Thr Lys Pro Gln Lys Met 465 470 475 480 Phe Gly Ala Pro Gln Phe Ser Asn Leu Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly 485 490 495 Asn Phe Pro Asn Val Val Val Arg Ala Gly Ser Ser Gly His Glu Tyr 500 505 510 Asp Ser Ala Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Ala Thr Asp Gly Gly Asp Ala 515 520 525 Trp Thr Ile Phe Pro Thr Cys Pro Pro Gly Met Asn Ala Ser His Tyr 530 535 540 Gln Gly Ser Thr Ile Ala Val Asp Ala Ser Gly Ser Gln Ile Val Trp 545 550 555 560 Ser Thr Lys Leu Asp Glu Gln Ala Ser Gly Pro Trp Tyr Ser His Asp 565 570 575 Tyr Gly Lys Thr Trp Ser Val Pro Ala Gly Asp Leu Lys Ala Gln Thr 580 585 590 Ala Asn Val Leu Ser Asp Lys Val Gln Asp Gly Thr Phe Tyr Ala Thr 595 600 605 Asp Gly Gly Lys Phe Phe Val Ser Thr Asp Gly Gly Lys Ser Tyr Ala 610 615 620 Ala Lys Gly Ala Gly Leu Val Thr Gly Thr Ser Leu Met Pro Ala Val 625 630 635 640 Asn Pro Trp Val Ala Gly Asp Val Trp Val Pro Val Pro Glu Gly Gly 645 650 655 Leu Phe His Ser Thr Asp Phe Gly Ala Ser Phe Thr Arg Val Gly Thr 660 665 670 Ala Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Gly Ala Pro Lys Ser Lys Ser Asp 675 680 685 Gly Lys Lys Ala Ser Ala Pro Ser Ala Val Phe Ile Trp Gly Thr Asp 690 695 700 Lys Pro Gly Ser Asp Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asp Asp Asn Gly Ser 705 710 715 720 Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Gln Glu His Asn Tyr Ser Gly Pro Thr 725 730 735 Met Ile Glu Ala Asp Pro Lys Val Tyr Gly Arg Val Tyr Leu Gly Thr 740 745 750 Asn Gly Arg Gly Ile Val Tyr Ala Asp Leu Thr Asn Lys Lys Ser Asn 755 760 765 Glu Glu Lys Ser Thr Ala Lys Cys Ala Asn Gly Gln Lys Gly Thr His 770 775 780 Cys Tyr Val Lys Lys 785

【００７２】本発明はキシログルカンオリゴ糖分解活性
を有する前記の配列のポリペプチドやそれをコードする
ヌクレオチドに特に限定されるものではなく、キシログ
ルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチドからなる
更に長いポリペプチドやそれをコードするヌクレオチド
を含むものである。

【００７３】実施例６ 〈新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素の大腸菌での
発現プラスミドの構築〉成熟体のＮ末端領域アミノ酸配
列およびＣ末端領域アミノ酸配列をコードするＤＮＡの
塩基配列をもとに、配列番号１５に示すセンス・プライ
マーと配列番号１６に示すアンチセンス・プライマーを
作製した。この際、Ｎ末端領域側のセンス・プライマー
の５’側には、制限酵素Nde I認識配列（catatg）を、
Ｃ末端領域側のアンチセンス・プライマーの５’側には
制限酵素Bgl II認識配列（agatct）を付加した。制限酵
素認識配列のさらに５’側に付加されている複数の塩基
は、制限酵素の切断効率を増加させるためのものであ
る。

【００７４】 配列番号１５ 成熟体発現用センスプライマー： 5'-TCGCTCGCGCATATGAAGGAGCACTACGAGTTCAAGAATG-3' 配列番号１６ 成熟体発現用アンチセンスプライマー 5'-TGGAAGATCTCCTTTTTCACATAGCAGTGCGTGCCCTT-3'

【００７５】これらのプライマーとゲオトリカム・エス
ピー（Geotrichum sp.）M128株のｃＤＮＡを鋳型とし
て、以下の条件下、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔ
ｅｍ ９７００〔アプライド バイオシステムズ（Appli
ed Biosystems）社製〕を用いてＰＣＲ反応を行なっ
た。

【００７６】＜ＰＣＲ反応液＞１０×ＰＣＲ反応緩衝液
(宝酒造社製)１０μl 、ｄＮＴＰ混合液 (それぞれ
２．５ｍｍｏｌ/ｌ、宝酒造社製) 8 μ、１０μｍｏｌ/
ｌセンス・プライマー５μl 、１０μｍｏｌ/ｌアンチ
センス・プライマー５μl 、蒸留水７１μl、ｃＤＮＡ
溶液（１００μg/ｍｌ）０．５μl 、ＥＸ−Ｔａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ (宝酒造社製)０．５μl

【００７７】＜ＰＣＲ反応条件＞ ステージ１： 変性
（９６℃、１分） １サイクル ステージ２： 変性（９６℃、１０秒）アニール及び伸
長（６８℃、４分）30サイクル

【００７８】得られた約２．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を制
限酵素Nde I及びBgl IIで切断し、制限酵素Nde I及びBg
l IIで切断したpET29a(+)〔ノバジェン（Novagen）社
製〕にクローニングした。塩基配列が正しいことを確認
した後、大腸菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP〔ストラタジ
ーン（STRATAGENE）社製〕に導入した。得られた形質転
換体を３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むLB培地で３
７℃で振盪培養した。培地にイソプロピル-β-Ｄ-チオ
ガラクトピラノシドを添加して生産誘導すると、目的の
遺伝子産物は、蛋白質封入体として菌体内に蓄積した。

【００７９】

【実施例７】〈タンパク質封入体の単離・可溶化・巻き
戻し〉上述のようにして培養した菌体を集菌後、蛋白質
抽出キット〔バグバスター（BugBuster）、ノバジェン
（Novagen）社製〕を用いて細胞の破砕および蛋白質封
入体の精製を行った。精製された蛋白質封入体を、８Ｍ
尿素−１ｍＭジチオトレイトール−５０ｍＭトリス・塩
酸−１ｍＭエチレンジアミン四酢酸溶液（ｐＨ８．０）
に、タンパク質濃度が約１ｍｇ／ｍｌになるよう溶解し
た。

【００８０】可溶化上清を２５ｍＭイミダゾール・塩酸
（ｐＨ７．４）に透析し、尿素、ジチオトレイトールを
除去することによって巻き戻しを行った。

【００８１】得られたポリペプチドのアミノ酸配列を配
列番号１８に示し、また、該アミノ酸配列に対応する塩
基配列を配列番号１７に示す。該ポリペプチドは、配列
番号１４に記載の成熟体ポリペプチドのアミノ酸配列の
Ｃ末端（７８９番目のＬｙｓ）に、発現ベクターpET29a
(+)由来の３０アミノ酸残基及び６個のヒスチジンから
なるヒスチジンタグが付加されているものである。該ポ
リペプチドのキシログルカンオリゴ糖分解活性につい
て、表１に示した各種キシログルカンオリゴ糖を基質と
して検討した結果、ゲオトリカム・エスピー（Geotrich
um sp.）M128株から得られた酵素とまったく同様な結果
を得た。すなわち、この組み換え酵素は、キシログルカ
ンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合につい
て、還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合を特異
的に分解する酵素活性を有していた。

【００８２】 配列番号１７： atg aag gag cac tac gag ttc aag aat gtc gcg atc ggc ggc ggc ggg 48 Met Lys Glu His Tyr Glu Phe Lys Asn Val Ala Ile Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 tac att acc ggg att gtc gcg cac cca aag acc aag gac ctg ctg tac 96 Tyr Ile Thr Gly Ile Val Ala His Pro Lys Thr Lys Asp Leu Leu Tyr 20 25 30 gcg cgc acg gac att ggc ggc gcg tac cgc tgg gac gca ggc acg tcc 144 Ala Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala Tyr Arg Trp Asp Ala Gly Thr Ser 35 40 45 aag tgg atc ccg ctc aac gac ttt atc gag gcg cag gac atg aac att 192 Lys Trp Ile Pro Leu Asn Asp Phe Ile Glu Ala Gln Asp Met Asn Ile 50 55 60 atg ggc acc gag tcg atc gcg ctg gac ccc aac aac ccc gac agg ctg 240 Met Gly Thr Glu Ser Ile Ala Leu Asp Pro Asn Asn Pro Asp Arg Leu 65 70 75 80 tac ctc gcg cag ggg cgc tat gtc ggc gac gag tgg gcg gcg ttc tat 288 Tyr Leu Ala Gln Gly Arg Tyr Val Gly Asp Glu Trp Ala Ala Phe Tyr 85 90 95 gtg tcc gaa gac cgc ggc cag tcg ttt aca atc tac gag tcg ccg ttc 336 Val Ser Glu Asp Arg Gly Gln Ser Phe Thr Ile Tyr Glu Ser Pro Phe 100 105 110 ccg atg ggc gcc aac gac atg gga cgc aac aat ggc gag cgc ctc gct 384 Pro Met Gly Ala Asn Asp Met Gly Arg Asn Asn Gly Glu Arg Leu Ala 115 120 125 gtc aac ccg ttc aac tcg aac gag gtc tgg atg ggt acg cgt aca gag 432 Val Asn Pro Phe Asn Ser Asn Glu Val Trp Met Gly Thr Arg Thr Glu 130 135 140 ggt atc tgg aag agt tcg gac cgc gcc aag acc tgg aca aac gtc acg 480 Gly Ile Trp Lys Ser Ser Asp Arg Ala Lys Thr Trp Thr Asn Val Thr 145 150 155 160 tcc atc ccg gac gcg ttc acc aac ggt atc gga tac acg tcg gtc att 528 Ser Ile Pro Asp Ala Phe Thr Asn Gly Ile Gly Tyr Thr Ser Val Ile 165 170 175 ttc gac ccc gaa cgt aat ggc acc atc tac gcg agc gcg act gcc ccg 576 Phe Asp Pro Glu Arg Asn Gly Thr Ile Tyr Ala Ser Ala Thr Ala Pro 180 185 190 cag ggc atg tac gtc acg cac gac ggc ggt gtc tcg tgg gag cca gtg 624 Gln Gly Met Tyr Val Thr His Asp Gly Gly Val Ser Trp Glu Pro Val 195 200 205 gcg ggc cag ccg tcc agc tgg ctc aac agg acc acg ggc gcg ttc ccg 672 Ala Gly Gln Pro Ser Ser Trp Leu Asn Arg Thr Thr Gly Ala Phe Pro 210 215 220 gac aag aag ccc gcg tcg atc gcg ccg cag ccc atg aaa gtc gct ctc 720 Asp Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Pro Gln Pro Met Lys Val Ala Leu 225 230 235 240 acc ccc aac ttc ctc tac gtg act tac gcc gac tac cct ggt cca tgg 768 Thr Pro Asn Phe Leu Tyr Val Thr Tyr Ala Asp Tyr Pro Gly Pro Trp 245 250 255 ggc gtc acg ttc ggc aaa gtc tgg cgc cag aac cgc acc tcg ggc gcc 816 Gly Val Thr Phe Gly Lys Val Trp Arg Gln Asn Arg Thr Ser Gly Ala 260 265 270 tgg gac gac att act ccc cgc gtc ggc aac tcg tcg cct gcc ccg tac 864 Trp Asp Asp Ile Thr Pro Arg Val Gly Asn Ser Ser Pro Ala Pro Tyr 275 280 285 aac aac cag acg ttc cct gcg ggc gga ttt tgc ggt ctc agc gtc gac 912 Asn Asn Gln Thr Phe Pro Ala Gly Gly Phe Cys Gly Leu Ser Val Asp 290 295 300 gcg acc aac ccc aac cgt ctc gtc gtc atc acc ctc gac cgc gac ccc 960 Ala Thr Asn Pro Asn Arg Leu Val Val Ile Thr Leu Asp Arg Asp Pro 305 310 315 320 gga ccc gcc ctc gac agc atc tac ctc tca acc gat gcc ggc gcg acc 1008 Gly Pro Ala Leu Asp Ser Ile Tyr Leu Ser Thr Asp Ala Gly Ala Thr 325 330 335 tgg aag gac gtc acc cag ctc tcg tcc ccg tcc aac ctc gaa ggt aac 1056 Trp Lys Asp Val Thr Gln Leu Ser Ser Pro Ser Asn Leu Glu Gly Asn 340 345 350 tgg ggc cac ccg act aac gcg gcg cgg tac aag gac ggc acg cct gtt 1104 Trp Gly His Pro Thr Asn Ala Ala Arg Tyr Lys Asp Gly Thr Pro Val 355 360 365 ccg tgg ctc gac ttc aac aac ggt ccc cag tgg ggg gga tac ggt gcg 1152 Pro Trp Leu Asp Phe Asn Asn Gly Pro Gln Trp Gly Gly Tyr Gly Ala 370 375 380 ccg cac ggt acg ccc ggc ctc acc aag ttt ggc tgg tgg atg agc gct 1200 Pro His Gly Thr Pro Gly Leu Thr Lys Phe Gly Trp Trp Met Ser Ala 385 390 395 400 gtg ctt atc gat ccg ttc aac ccc gag cac ctg atg tac ggc acg ggg 1248 Val Leu Ile Asp Pro Phe Asn Pro Glu His Leu Met Tyr Gly Thr Gly 405 410 415 gcg acc atc tgg gcg acc gac acg ctc tcc cgt gtc gag aag gac tgg 1296 Ala Thr Ile Trp Ala Thr Asp Thr Leu Ser Arg Val Glu Lys Asp Trp 420 425 430 gcg ccg agc tgg tac ctc cag atc gac ggt atc gag gag aat gcg atc 1344 Ala Pro Ser Trp Tyr Leu Gln Ile Asp Gly Ile Glu Glu Asn Ala Ile 435 440 445 ctg tcg ctc cgc tcg ccc aag agc ggc gcg gcg ctc ctg tcg ggc atc 1392 Leu Ser Leu Arg Ser Pro Lys Ser Gly Ala Ala Leu Leu Ser Gly Ile 450 455 460 ggt gac att agc ggc atg aag cac gac gac ctc acc aag ccc cag aag 1440 Gly Asp Ile Ser Gly Met Lys His Asp Asp Leu Thr Lys Pro Gln Lys 465 470 475 480 atg ttt ggt gcg ccc cag ttc tcc aac ctc gac agc atc gac gct gcg 1488 Met Phe Gly Ala Pro Gln Phe Ser Asn Leu Asp Ser Ile Asp Ala Ala 485 490 495 ggc aac ttc ccc aac gtt gtc gtc cgc gcc gga tcc tcg gga cac gag 1536 Gly Asn Phe Pro Asn Val Val Val Arg Ala Gly Ser Ser Gly His Glu 500 505 510 tac gac agc gcg tgc gcg cgc ggt gcg tac gcg act gac ggc gga gac 1584 Tyr Asp Ser Ala Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Ala Thr Asp Gly Gly Asp 515 520 525 gcg tgg acc atc ttc cct acc tgc cct cct ggc atg aac gcg agc cac 1632 Ala Trp Thr Ile Phe Pro Thr Cys Pro Pro Gly Met Asn Ala Ser His 530 535 540 tac cag ggc agc acg att gca gtc gac gcg agc ggc agc cag atc gtg 1680 Tyr Gln Gly Ser Thr Ile Ala Val Asp Ala Ser Gly Ser Gln Ile Val 545 550 555 560 tgg tcg acc aag ctt gac gag cag gcc tcg gga ccg tgg tac tcg cac 1728 Trp Ser Thr Lys Leu Asp Glu Gln Ala Ser Gly Pro Trp Tyr Ser His 565 570 575 gac tat ggc aag acg tgg tct gtt ccc gct ggc gac ctg aag gcc cag 1776 Asp Tyr Gly Lys Thr Trp Ser Val Pro Ala Gly Asp Leu Lys Ala Gln 580 585 590 act gcc aat gtg ctc tcg gac aag gtc cag gat ggc acg ttc tac gct 1824 Thr Ala Asn Val Leu Ser Asp Lys Val Gln Asp Gly Thr Phe Tyr Ala 595 600 605 acc gat ggc ggc aag ttc ttc gtc tcg acc gac ggc ggg aag tcg tat 1872 Thr Asp Gly Gly Lys Phe Phe Val Ser Thr Asp Gly Gly Lys Ser Tyr 610 615 620 gcc gcc aag ggc gcc gga ctt gtc act ggc aca tcg ctc atg cct gcc 1920 Ala Ala Lys Gly Ala Gly Leu Val Thr Gly Thr Ser Leu Met Pro Ala 625 630 635 640 gtg aac ccc tgg gtg gcc ggc gac gtc tgg gtg cct gtt ccc gag ggc 1968 Val Asn Pro Trp Val Ala Gly Asp Val Trp Val Pro Val Pro Glu Gly 645 650 655 ggt ctc ttc cac tcg acc gac ttt ggc gcc tcg ttc acg agg gta ggt 2016 Gly Leu Phe His Ser Thr Asp Phe Gly Ala Ser Phe Thr Arg Val Gly 660 665 670 acc gcc aac gcg acc ctc gtg agc gtc ggc gcc ccc aag tcc aag tcg 2064 Thr Ala Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Gly Ala Pro Lys Ser Lys Ser 675 680 685 gac ggc aag aag gct agc gcg ccc tcc gcg gtc ttc atc tgg ggc acc 2112 Asp Gly Lys Lys Ala Ser Ala Pro Ser Ala Val Phe Ile Trp Gly Thr 690 695 700 gac aag cct gga agc gac atc ggc ctg tac cgc tcc gac gac aac ggc 2160 Asp Lys Pro Gly Ser Asp Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asp Asp Asn Gly 705 710 715 720 agc acc tgg acg cgc gtc aat gac cag gag cac aac tac tcg ggc ccc 2208 Ser Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Gln Glu His Asn Tyr Ser Gly Pro 725 730 735 acc atg atc gag gcc gac ccc aag gtc tac ggg cgc gtg tat cta ggc 2256 Thr Met Ile Glu Ala Asp Pro Lys Val Tyr Gly Arg Val Tyr Leu Gly 740 745 750 acg aac ggc cgc ggt atc gtg tac gcc gac ctt acc aac aag aag agc 2304 Thr Asn Gly Arg Gly Ile Val Tyr Ala Asp Leu Thr Asn Lys Lys Ser 755 760 765 aac gag gag aag tcg acc gca aag tgc gcc aac ggc cag aag ggc acg 2352 Asn Glu Glu Lys Ser Thr Ala Lys Cys Ala Asn Gly Gln Lys Gly Thr 770 775 780 cac tgc tat gtg aaa aag gag atc tgg gta ccc tgg tgc cac gcg gtt 2400 His Cys Tyr Val Lys Lys Glu Ile Trp Val Pro Trp Cys His Ala Val 785 790 795 800 cca tgg ctg ata tcg gat ccg aat tcg agc tcc gtc gac aag ctt gcg 2448 Pro Trp Leu Ile Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys Leu Ala 805 810 815 gcc gca ctc gag cac cac cac cac cac cac tga 2481 Ala Ala Leu Glu His His His His His His 820 825 配列番号１８： Met Lys Glu His Tyr Glu Phe Lys Asn Val Ala Ile Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Ile Thr Gly Ile Val Ala His Pro Lys Thr Lys Asp Leu Leu Tyr 20 25 30 Ala Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala Tyr Arg Trp Asp Ala Gly Thr Ser 35 40 45 Lys Trp Ile Pro Leu Asn Asp Phe Ile Glu Ala Gln Asp Met Asn Ile 50 55 60 Met Gly Thr Glu Ser Ile Ala Leu Asp Pro Asn Asn Pro Asp Arg Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Ala Gln Gly Arg Tyr Val Gly Asp Glu Trp Ala Ala Phe Tyr 85 90 95 Val Ser Glu Asp Arg Gly Gln Ser Phe Thr Ile Tyr Glu Ser Pro Phe 100 105 110 Pro Met Gly Ala Asn Asp Met Gly Arg Asn Asn Gly Glu Arg Leu Ala 115 120 125 Val Asn Pro Phe Asn Ser Asn Glu Val Trp Met Gly Thr Arg Thr Glu 130 135 140 Gly Ile Trp Lys Ser Ser Asp Arg Ala Lys Thr Trp Thr Asn Val Thr 145 150 155 160 Ser Ile Pro Asp Ala Phe Thr Asn Gly Ile Gly Tyr Thr Ser Val Ile 165 170 175 Phe Asp Pro Glu Arg Asn Gly Thr Ile Tyr Ala Ser Ala Thr Ala Pro 180 185 190 Gln Gly Met Tyr Val Thr His Asp Gly Gly Val Ser Trp Glu Pro Val 195 200 205 Ala Gly Gln Pro Ser Ser Trp Leu Asn Arg Thr Thr Gly Ala Phe Pro 210 215 220 Asp Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Pro Gln Pro Met Lys Val Ala Leu 225 230 235 240 Thr Pro Asn Phe Leu Tyr Val Thr Tyr Ala Asp Tyr Pro Gly Pro Trp 245 250 255 Gly Val Thr Phe Gly Lys Val Trp Arg Gln Asn Arg Thr Ser Gly Ala 260 265 270 Trp Asp Asp Ile Thr Pro Arg Val Gly Asn Ser Ser Pro Ala Pro Tyr 275 280 285 Asn Asn Gln Thr Phe Pro Ala Gly Gly Phe Cys Gly Leu Ser Val Asp 290 295 300 Ala Thr Asn Pro Asn Arg Leu Val Val Ile Thr Leu Asp Arg Asp Pro 305 310 315 320 Gly Pro Ala Leu Asp Ser Ile Tyr Leu Ser Thr Asp Ala Gly Ala Thr 325 330 335 Trp Lys Asp Val Thr Gln Leu Ser Ser Pro Ser Asn Leu Glu Gly Asn 340 345 350 Trp Gly His Pro Thr Asn Ala Ala Arg Tyr Lys Asp Gly Thr Pro Val 355 360 365 Pro Trp Leu Asp Phe Asn Asn Gly Pro Gln Trp Gly Gly Tyr Gly Ala 370 375 380 Pro His Gly Thr Pro Gly Leu Thr Lys Phe Gly Trp Trp Met Ser Ala 385 390 395 400 Val Leu Ile Asp Pro Phe Asn Pro Glu His Leu Met Tyr Gly Thr Gly 405 410 415 Ala Thr Ile Trp Ala Thr Asp Thr Leu Ser Arg Val Glu Lys Asp Trp 420 425 430 Ala Pro Ser Trp Tyr Leu Gln Ile Asp Gly Ile Glu Glu Asn Ala Ile 435 440 445 Leu Ser Leu Arg Ser Pro Lys Ser Gly Ala Ala Leu Leu Ser Gly Ile 450 455 460 Gly Asp Ile Ser Gly Met Lys His Asp Asp Leu Thr Lys Pro Gln Lys 465 470 475 480 Met Phe Gly Ala Pro Gln Phe Ser Asn Leu Asp Ser Ile Asp Ala Ala 485 490 495 Gly Asn Phe Pro Asn Val Val Val Arg Ala Gly Ser Ser Gly His Glu 500 505 510 Tyr Asp Ser Ala Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Ala Thr Asp Gly Gly Asp 515 520 525 Ala Trp Thr Ile Phe Pro Thr Cys Pro Pro Gly Met Asn Ala Ser His 530 535 540 Tyr Gln Gly Ser Thr Ile Ala Val Asp Ala Ser Gly Ser Gln Ile Val 545 550 555 560 Trp Ser Thr Lys Leu Asp Glu Gln Ala Ser Gly Pro Trp Tyr Ser His 565 570 575 Asp Tyr Gly Lys Thr Trp Ser Val Pro Ala Gly Asp Leu Lys Ala Gln 580 585 590 Thr Ala Asn Val Leu Ser Asp Lys Val Gln Asp Gly Thr Phe Tyr Ala 595 600 605 Thr Asp Gly Gly Lys Phe Phe Val Ser Thr Asp Gly Gly Lys Ser Tyr 610 615 620 Ala Ala Lys Gly Ala Gly Leu Val Thr Gly Thr Ser Leu Met Pro Ala 625 630 635 640 Val Asn Pro Trp Val Ala Gly Asp Val Trp Val Pro Val Pro Glu Gly 645 650 655 Gly Leu Phe His Ser Thr Asp Phe Gly Ala Ser Phe Thr Arg Val Gly 660 665 670 Thr Ala Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Gly Ala Pro Lys Ser Lys Ser 675 680 685 Asp Gly Lys Lys Ala Ser Ala Pro Ser Ala Val Phe Ile Trp Gly Thr 690 695 700 Asp Lys Pro Gly Ser Asp Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asp Asp Asn Gly 705 710 715 720 Ser Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Gln Glu His Asn Tyr Ser Gly Pro 725 730 735 Thr Met Ile Glu Ala Asp Pro Lys Val Tyr Gly Arg Val Tyr Leu Gly 740 745 750 Thr Asn Gly Arg Gly Ile Val Tyr Ala Asp Leu Thr Asn Lys Lys Ser 755 760 765 Asn Glu Glu Lys Ser Thr Ala Lys Cys Ala Asn Gly Gln Lys Gly Thr 770 775 780 His Cys Tyr Val Lys Lys Glu Ile Trp Val Pro Trp Cys His Ala Val 785 790 795 800 Pro Trp Leu Ile Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys Leu Ala 805 810 815 Ala Ala Leu Glu His His His His His His 820 825

【００８３】これらの結果より、本発明で得られた新規
なキシログルカンオリゴ糖分解酵素遺伝子を用いて、組
換え酵素を大腸菌を用いて製造出来ることが確認され
た。

【００８４】

【発明の効果】以上説明したように、本発明は、キシロ
グルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド結合
について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド結合
を特異的に分解する新規な酵素を提供するとともにその
アミノ酸配列、その遺伝子の構造を明らかにしたもので
あり、本発明によれば、植物細胞の伸長や形態分化に重
要な役割を担っているものと考えられているキシログル
カンの構造や機能を解明するための新しい分析手段が提
供できる。

【００８５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology <120>Novel oligoxyloglucan hydrolase <130>331-01721 <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Geotrichum sp. M128 <400> 1 Lys Glu His Tyr Glu Phe Lys Asn Val Ala Ile Gly Gly Gly Gly Tyr 1 5 10 15 Ile Thr Gly Ile Val Ala 20 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Geotrichum sp. M128 <400> 2 Asp Leu Leu Tyr Ala Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Geotrichum sp. M128 <400> 3 Ala Ser Ala Pro Ser Ala Val Phe Ile Trp Gly Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Geotrichum sp. M128 <400> 4 Val Tyr Gly Arg Val Tyr Leu Gly Thr 1 5 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <400> 5 garcaytayg arttyaaraa ygt 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <400> 6 gtnccccada traanacngc 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <400> 7 cgtacagcag gtccttggtc tttgg 25 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <400> 8 taatgtaccc gccgccgccg at 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <400> 9 ggcaagttct tcgtctcgac cgac 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <400> 10 ccaagtcgga cggcaagaag gcta 24 <210> 11 <211> 2646 <212> DNA <213> Geotrichum sp. M128 <220> <221> CDS <222> (120)..(2558) <400> 11 aatcgccccg gtgttggctc atcgggccgc ggtgtcggtg ttgatacgag tacataattg 60 ggactgtcgg tgcgattggc ccccaacttc accacacaac acctacacac tctttagat 119 atg gtg gca gtc acc tcc ctc ggg aag gcg ctt act gcc ctt tcg att 167 Met Val Ala Val Thr Ser Leu Gly Lys Ala Leu Thr Ala Leu Ser Ile 1 5 10 15 ctg gcg tcg ctc gcg gtc gcc aag gag cac tac gag ttc aag aat gtc 215 Leu Ala Ser Leu Ala Val Ala Lys Glu His Tyr Glu Phe Lys Asn Val 20 25 30 gcg atc ggc ggc ggc ggg tac att acc ggg att gtc gcg cac cca aag 263 Ala Ile Gly Gly Gly Gly Tyr Ile Thr Gly Ile Val Ala His Pro Lys 35 40 45 acc aag gac ctg ctg tac gcg cgc acg gac att ggc ggc gcg tac cgc 311 Thr Lys Asp Leu Leu Tyr Ala Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala Tyr Arg 50 55 60 tgg gac gca ggc acg tcc aag tgg atc ccg ctc aac gac ttt atc gag 359 Trp Asp Ala Gly Thr Ser Lys Trp Ile Pro Leu Asn Asp Phe Ile Glu 65 70 75 80 gcg cag gac atg aac att atg ggc acc gag tcg atc gcg ctg gac ccc 407 Ala Gln Asp Met Asn Ile Met Gly Thr Glu Ser Ile Ala Leu Asp Pro 85 90 95 aac aac ccc gac agg ctg tac ctc gcg cag ggg cgc tat gtc ggc gac 455 Asn Asn Pro Asp Arg Leu Tyr Leu Ala Gln Gly Arg Tyr Val Gly Asp 100 105 110 gag tgg gcg gcg ttc tat gtg tcc gaa gac cgc ggc cag tcg ttt aca 503 Glu Trp Ala Ala Phe Tyr Val Ser Glu Asp Arg Gly Gln Ser Phe Thr 115 120 125 atc tac gag tcg ccg ttc ccg atg ggc gcc aac gac atg gga cgc aac 551 Ile Tyr Glu Ser Pro Phe Pro Met Gly Ala Asn Asp Met Gly Arg Asn 130 135 140 aat ggc gag cgc ctc gct gtc aac ccg ttc aac tcg aac gag gtc tgg 599 Asn Gly Glu Arg Leu Ala Val Asn Pro Phe Asn Ser Asn Glu Val Trp 145 150 155 160 atg ggt acg cgt aca gag ggt atc tgg aag agt tcg gac cgc gcc aag 647 Met Gly Thr Arg Thr Glu Gly Ile Trp Lys Ser Ser Asp Arg Ala Lys 165 170 175 acc tgg aca aac gtc acg tcc atc ccg gac gcg ttc acc aac ggt atc 695 Thr Trp Thr Asn Val Thr Ser Ile Pro Asp Ala Phe Thr Asn Gly Ile 180 185 190 gga tac acg tcg gtc att ttc gac ccc gaa cgt aat ggc acc atc tac 743 Gly Tyr Thr Ser Val Ile Phe Asp Pro Glu Arg Asn Gly Thr Ile Tyr 195 200 205 gcg agc gcg act gcc ccg cag ggc atg tac gtc acg cac gac ggc ggt 791 Ala Ser Ala Thr Ala Pro Gln Gly Met Tyr Val Thr His Asp Gly Gly 210 215 220 gtc tcg tgg gag cca gtg gcg ggc cag ccg tcc agc tgg ctc aac agg 839 Val Ser Trp Glu Pro Val Ala Gly Gln Pro Ser Ser Trp Leu Asn Arg 225 230 235 240 acc acg ggc gcg ttc ccg gac aag aag ccc gcg tcg atc gcg ccg cag 887 Thr Thr Gly Ala Phe Pro Asp Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Pro Gln 245 250 255 ccc atg aaa gtc gct ctc acc ccc aac ttc ctc tac gtg act tac gcc 935 Pro Met Lys Val Ala Leu Thr Pro Asn Phe Leu Tyr Val Thr Tyr Ala 260 265 270 gac tac cct ggt cca tgg ggc gtc acg ttc ggc gaa gtc tgg cgc cag 983 Asp Tyr Pro Gly Pro Trp Gly Val Thr Phe Gly Glu Val Trp Arg Gln 275 280 285 aac cgc acc tcg ggc gcc tgg gac gac att act ccc cgc gtc ggc aac 1031 Asn Arg Thr Ser Gly Ala Trp Asp Asp Ile Thr Pro Arg Val Gly Asn 290 295 300 tcg tcg cct gcc ccg tac aac aac cag acg ttc cct gcg ggc gga ttt 1079 Ser Ser Pro Ala Pro Tyr Asn Asn Gln Thr Phe Pro Ala Gly Gly Phe 305 310 315 320 tgc ggt ctc agc gtc gac gcg acc aac ccc aac cgt ctc gtc gtc atc 1127 Cys Gly Leu Ser Val Asp Ala Thr Asn Pro Asn Arg Leu Val Val Ile 325 330 335 acc ctc gac cgc gac ccc gga ccc gcc ctc gac agc atc tac ctc tca 1175 Thr Leu Asp Arg Asp Pro Gly Pro Ala Leu Asp Ser Ile Tyr Leu Ser 340 345 350 acc gat gcc ggc gcg acc tgg aag gac gtc acc cag ctc tcg tcc ccg 1223 Thr Asp Ala Gly Ala Thr Trp Lys Asp Val Thr Gln Leu Ser Ser Pro 355 360 365 tcc aac ctc gaa ggt aac tgg ggc cac ccg act aac gcg gcg cgg tac 1271 Ser Asn Leu Glu Gly Asn Trp Gly His Pro Thr Asn Ala Ala Arg Tyr 370 375 380 aag gac ggc acg cct gtt ccg tgg ctc gac ttc aac aac ggt ccc cag 1319 Lys Asp Gly Thr Pro Val Pro Trp Leu Asp Phe Asn Asn Gly Pro Gln 385 390 395 400 tgg ggg gga tac ggt gcg ccg cac ggt acg ccc ggc ctc acc aag ttt 1367 Trp Gly Gly Tyr Gly Ala Pro His Gly Thr Pro Gly Leu Thr Lys Phe 405 410 415 ggc tgg tgg atg agc gct gtg ctt atc gat ccg ttc aac ccc gag cac 1415 Gly Trp Trp Met Ser Ala Val Leu Ile Asp Pro Phe Asn Pro Glu His 420 425 430 ctg atg tac ggc acg ggg gcg acc atc tgg gcg acc gac acg ctc tcc 1463 Leu Met Tyr Gly Thr Gly Ala Thr Ile Trp Ala Thr Asp Thr Leu Ser 435 440 445 cgt gtc gag aag gac tgg gcg ccg agc tgg tac ctc cag atc gac ggt 1511 Arg Val Glu Lys Asp Trp Ala Pro Ser Trp Tyr Leu Gln Ile Asp Gly 450 455 460 atc gag gag aat gcg atc ctg tcg ctc cgc tcg ccc aag agc ggc gcg 1559 Ile Glu Glu Asn Ala Ile Leu Ser Leu Arg Ser Pro Lys Ser Gly Ala 465 470 475 480 gcg ctc ctg tcg ggc atc ggt gac att agc ggc atg aag cac gac gac 1607 Ala Leu Leu Ser Gly Ile Gly Asp Ile Ser Gly Met Lys His Asp Asp 485 490 495 ctc acc aag ccc cag aag atg ttt ggt gcg ccc cag ttc tcc aac ctc 1655 Leu Thr Lys Pro Gln Lys Met Phe Gly Ala Pro Gln Phe Ser Asn Leu 500 505 510 gac agc atc gac gct gcg ggc aac ttc ccc aac gtt gtc gtc cgc gcc 1703 Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Asn Phe Pro Asn Val Val Val Arg Ala 515 520 525 gga tcc tcg gga cac gag tac gac agc gcg tgc gcg cgc ggt gcg tac 1751 Gly Ser Ser Gly His Glu Tyr Asp Ser Ala Cys Ala Arg Gly Ala Tyr 530 535 540 gcg act gac ggc gga gac gcg tgg acc atc ttc cct acc tgc cct cct 1799 Ala Thr Asp Gly Gly Asp Ala Trp Thr Ile Phe Pro Thr Cys Pro Pro 545 550 555 560 ggc atg aac gcg agc cac tac cag ggc agc acg att gca gtc gac gcg 1847 Gly Met Asn Ala Ser His Tyr Gln Gly Ser Thr Ile Ala Val Asp Ala 565 570 575 agc ggc agc cag atc gtg tgg tcg acc aag ctt gac gag cag gcc tcg 1895 Ser Gly Ser Gln Ile Val Trp Ser Thr Lys Leu Asp Glu Gln Ala Ser 580 585 590 gga ccg tgg tac tcg cac gac tat ggc aag acg tgg tct gtt ccc gct 1943 Gly Pro Trp Tyr Ser His Asp Tyr Gly Lys Thr Trp Ser Val Pro Ala 595 600 605 ggc gac ctg aag gcc cag act gcc aat gtg ctc tcg gac aag gtc cag 1991 Gly Asp Leu Lys Ala Gln Thr Ala Asn Val Leu Ser Asp Lys Val Gln 610 615 620 gat ggc acg ttc tac gct acc gat ggc ggc aag ttc ttc gtc tcg acc 2039 Asp Gly Thr Phe Tyr Ala Thr Asp Gly Gly Lys Phe Phe Val Ser Thr 625 630 635 640 gac ggc ggg aag tcg tat gcc gcc aag ggc gcc gga ctt gtc act ggc 2087 Asp Gly Gly Lys Ser Tyr Ala Ala Lys Gly Ala Gly Leu Val Thr Gly 645 650 655 aca tcg ctc atg cct gcc gtg aac ccc tgg gtg gcc ggc gac gtc tgg 2135 Thr Ser Leu Met Pro Ala Val Asn Pro Trp Val Ala Gly Asp Val Trp 660 665 670 gtg cct gtt ccc gag ggc ggt ctc ttc cac tcg acc gac ttt ggc gcc 2183 Val Pro Val Pro Glu Gly Gly Leu Phe His Ser Thr Asp Phe Gly Ala 675 680 685 tcg ttc acg agg gta ggt acc gcc aac gcg acc ctc gtg agc gtc ggc 2231 Ser Phe Thr Arg Val Gly Thr Ala Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Gly 690 695 700 gcc ccc aag tcc aag tcg gac ggc aag aag gct agc gcg ccc tcc gcg 2279 Ala Pro Lys Ser Lys Ser Asp Gly Lys Lys Ala Ser Ala Pro Ser Ala 705 710 715 720 gtc ttc atc tgg ggc acc gac aag cct gga agc gac atc ggc ctg tac 2327 Val Phe Ile Trp Gly Thr Asp Lys Pro Gly Ser Asp Ile Gly Leu Tyr 725 730 735 cgc tcc gac gac aac ggc agc acc tgg acg cgc gtc aat gac cag gag 2375 Arg Ser Asp Asp Asn Gly Ser Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Gln Glu 740 745 750 cac aac tac tcg ggc ccc acc atg atc gag gcc gac ccc aag gtc tac 2423 His Asn Tyr Ser Gly Pro Thr Met Ile Glu Ala Asp Pro Lys Val Tyr 755 760 765 ggg cgc gtg tat cta ggc acg aac ggc cgc ggt atc gtg tac gcc gac 2471 Gly Arg Val Tyr Leu Gly Thr Asn Gly Arg Gly Ile Val Tyr Ala Asp 770 775 780 ctt acc aac aag aag agc aac gag gag aag tcg acc gca aag tgc gcc 2519 Leu Thr Asn Lys Lys Ser Asn Glu Glu Lys Ser Thr Ala Lys Cys Ala 785 790 795 800 aac ggc cag aag ggc acg cac tgc tat gtg aaa aag taa atgggaagga 2568 Asn Gly Gln Lys Gly Thr His Cys Tyr Val Lys Lys 805 810 aagggcgaaa gggacatacc gcctggttat ttaaatgcat ctacatgtta cttaaaaaaa 2628 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2646 <210> 12 <211> 812 <212> PRT <213> Geotrichum sp. M128 <400> 12 Met Val Ala Val Thr Ser Leu Gly Lys Ala Leu Thr Ala Leu Ser Ile 1 5 10 15 Leu Ala Ser Leu Ala Val Ala Lys Glu His Tyr Glu Phe Lys Asn Val 20 25 30 Ala Ile Gly Gly Gly Gly Tyr Ile Thr Gly Ile Val Ala His Pro Lys 35 40 45 Thr Lys Asp Leu Leu Tyr Ala Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala Tyr Arg 50 55 60 Trp Asp Ala Gly Thr Ser Lys Trp Ile Pro Leu Asn Asp Phe Ile Glu 65 70 75 80 Ala Gln Asp Met Asn Ile Met Gly Thr Glu Ser Ile Ala Leu Asp Pro 85 90 95 Asn Asn Pro Asp Arg Leu Tyr Leu Ala Gln Gly Arg Tyr Val Gly Asp 100 105 110 Glu Trp Ala Ala Phe Tyr Val Ser Glu Asp Arg Gly Gln Ser Phe Thr 115 120 125 Ile Tyr Glu Ser Pro Phe Pro Met Gly Ala Asn Asp Met Gly Arg Asn 130 135 140 Asn Gly Glu Arg Leu Ala Val Asn Pro Phe Asn Ser Asn Glu Val Trp 145 150 155 160 Met Gly Thr Arg Thr Glu Gly Ile Trp Lys Ser Ser Asp Arg Ala Lys 165 170 175 Thr Trp Thr Asn Val Thr Ser Ile Pro Asp Ala Phe Thr Asn Gly Ile 180 185 190 Gly Tyr Thr Ser Val Ile Phe Asp Pro Glu Arg Asn Gly Thr Ile Tyr 195 200 205 Ala Ser Ala Thr Ala Pro Gln Gly Met Tyr Val Thr His Asp Gly Gly 210 215 220 Val Ser Trp Glu Pro Val Ala Gly Gln Pro Ser Ser Trp Leu Asn Arg 225 230 235 240 Thr Thr Gly Ala Phe Pro Asp Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Pro Gln 245 250 255 Pro Met Lys Val Ala Leu Thr Pro Asn Phe Leu Tyr Val Thr Tyr Ala 260 265 270 Asp Tyr Pro Gly Pro Trp Gly Val Thr Phe Gly Glu Val Trp Arg Gln 275 280 285 Asn Arg Thr Ser Gly Ala Trp Asp Asp Ile Thr Pro Arg Val Gly Asn 290 295 300 Ser Ser Pro Ala Pro Tyr Asn Asn Gln Thr Phe Pro Ala Gly Gly Phe 305 310 315 320 Cys Gly Leu Ser Val Asp Ala Thr Asn Pro Asn Arg Leu Val Val Ile 325 330 335 Thr Leu Asp Arg Asp Pro Gly Pro Ala Leu Asp Ser Ile Tyr Leu Ser 340 345 350 Thr Asp Ala Gly Ala Thr Trp Lys Asp Val Thr Gln Leu Ser Ser Pro 355 360 365 Ser Asn Leu Glu Gly Asn Trp Gly His Pro Thr Asn Ala Ala Arg Tyr 370 375 380 Lys Asp Gly Thr Pro Val Pro Trp Leu Asp Phe Asn Asn Gly Pro Gln 385 390 395 400 Trp Gly Gly Tyr Gly Ala Pro His Gly Thr Pro Gly Leu Thr Lys Phe 405 410 415 Gly Trp Trp Met Ser Ala Val Leu Ile Asp Pro Phe Asn Pro Glu His 420 425 430 Leu Met Tyr Gly Thr Gly Ala Thr Ile Trp Ala Thr Asp Thr Leu Ser 435 440 445 Arg Val Glu Lys Asp Trp Ala Pro Ser Trp Tyr Leu Gln Ile Asp Gly 450 455 460 Ile Glu Glu Asn Ala Ile Leu Ser Leu Arg Ser Pro Lys Ser Gly Ala 465 470 475 480 Ala Leu Leu Ser Gly Ile Gly Asp Ile Ser Gly Met Lys His Asp Asp 485 490 495 Leu Thr Lys Pro Gln Lys Met Phe Gly Ala Pro Gln Phe Ser Asn Leu 500 505 510 Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly Asn Phe Pro Asn Val Val Val Arg Ala 515 520 525 Gly Ser Ser Gly His Glu Tyr Asp Ser Ala Cys Ala Arg Gly Ala Tyr 530 535 540 Ala Thr Asp Gly Gly Asp Ala Trp Thr Ile Phe Pro Thr Cys Pro Pro 545 550 555 560 Gly Met Asn Ala Ser His Tyr Gln Gly Ser Thr Ile Ala Val Asp Ala 565 570 575 Ser Gly Ser Gln Ile Val Trp Ser Thr Lys Leu Asp Glu Gln Ala Ser 580 585 590 Gly Pro Trp Tyr Ser His Asp Tyr Gly Lys Thr Trp Ser Val Pro Ala 595 600 605 Gly Asp Leu Lys Ala Gln Thr Ala Asn Val Leu Ser Asp Lys Val Gln 610 615 620 Asp Gly Thr Phe Tyr Ala Thr Asp Gly Gly Lys Phe Phe Val Ser Thr 625 630 635 640 Asp Gly Gly Lys Ser Tyr Ala Ala Lys Gly Ala Gly Leu Val Thr Gly 645 650 655 Thr Ser Leu Met Pro Ala Val Asn Pro Trp Val Ala Gly Asp Val Trp 660 665 670 Val Pro Val Pro Glu Gly Gly Leu Phe His Ser Thr Asp Phe Gly Ala 675 680 685 Ser Phe Thr Arg Val Gly Thr Ala Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Gly 690 695 700 Ala Pro Lys Ser Lys Ser Asp Gly Lys Lys Ala Ser Ala Pro Ser Ala 705 710 715 720 Val Phe Ile Trp Gly Thr Asp Lys Pro Gly Ser Asp Ile Gly Leu Tyr 725 730 735 Arg Ser Asp Asp Asn Gly Ser Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Gln Glu 740 745 750 His Asn Tyr Ser Gly Pro Thr Met Ile Glu Ala Asp Pro Lys Val Tyr 755 760 765 Gly Arg Val Tyr Leu Gly Thr Asn Gly Arg Gly Ile Val Tyr Ala Asp 770 775 780 Leu Thr Asn Lys Lys Ser Asn Glu Glu Lys Ser Thr Ala Lys Cys Ala 785 790 795 800 Asn Gly Gln Lys Gly Thr His Cys Tyr Val Lys Lys 805 810 <210> 13 <211> 2367 <212> DNA <213> Geotrichum sp. M128 <400> 13 aag gag cac tac gag ttc aag aat gtc gcg atc ggc ggc ggc ggg tac 48 Lys Glu His Tyr Glu Phe Lys Asn Val Ala Ile Gly Gly Gly Gly Tyr 1 5 10 15 att acc ggg att gtc gcg cac cca aag acc aag gac ctg ctg tac gcg 96 Ile Thr Gly Ile Val Ala His Pro Lys Thr Lys Asp Leu Leu Tyr Ala 20 25 30 cgc acg gac att ggc ggc gcg tac cgc tgg gac gca ggc acg tcc aag 144 Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala Tyr Arg Trp Asp Ala Gly Thr Ser Lys 35 40 45 tgg atc ccg ctc aac gac ttt atc gag gcg cag gac atg aac att atg 192 Trp Ile Pro Leu Asn Asp Phe Ile Glu Ala Gln Asp Met Asn Ile Met 50 55 60 ggc acc gag tcg atc gcg ctg gac ccc aac aac ccc gac agg ctg tac 240 Gly Thr Glu Ser Ile Ala Leu Asp Pro Asn Asn Pro Asp Arg Leu Tyr 65 70 75 80 ctc gcg cag ggg cgc tat gtc ggc gac gag tgg gcg gcg ttc tat gtg 288 Leu Ala Gln Gly Arg Tyr Val Gly Asp Glu Trp Ala Ala Phe Tyr Val 85 90 95 tcc gaa gac cgc ggc cag tcg ttt aca atc tac gag tcg ccg ttc ccg 336 Ser Glu Asp Arg Gly Gln Ser Phe Thr Ile Tyr Glu Ser Pro Phe Pro 100 105 110 atg ggc gcc aac gac atg gga cgc aac aat ggc gag cgc ctc gct gtc 384 Met Gly Ala Asn Asp Met Gly Arg Asn Asn Gly Glu Arg Leu Ala Val 115 120 125 aac ccg ttc aac tcg aac gag gtc tgg atg ggt acg cgt aca gag ggt 432 Asn Pro Phe Asn Ser Asn Glu Val Trp Met Gly Thr Arg Thr Glu Gly 130 135 140 atc tgg aag agt tcg gac cgc gcc aag acc tgg aca aac gtc acg tcc 480 Ile Trp Lys Ser Ser Asp Arg Ala Lys Thr Trp Thr Asn Val Thr Ser 145 150 155 160 atc ccg gac gcg ttc acc aac ggt atc gga tac acg tcg gtc att ttc 528 Ile Pro Asp Ala Phe Thr Asn Gly Ile Gly Tyr Thr Ser Val Ile Phe 165 170 175 gac ccc gaa cgt aat ggc acc atc tac gcg agc gcg act gcc ccg cag 576 Asp Pro Glu Arg Asn Gly Thr Ile Tyr Ala Ser Ala Thr Ala Pro Gln 180 185 190 ggc atg tac gtc acg cac gac ggc ggt gtc tcg tgg gag cca gtg gcg 624 Gly Met Tyr Val Thr His Asp Gly Gly Val Ser Trp Glu Pro Val Ala 195 200 205 ggc cag ccg tcc agc tgg ctc aac agg acc acg ggc gcg ttc ccg gac 672 Gly Gln Pro Ser Ser Trp Leu Asn Arg Thr Thr Gly Ala Phe Pro Asp 210 215 220 aag aag ccc gcg tcg atc gcg ccg cag ccc atg aaa gtc gct ctc acc 720 Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Pro Gln Pro Met Lys Val Ala Leu Thr 225 230 235 240 ccc aac ttc ctc tac gtg act tac gcc gac tac cct ggt cca tgg ggc 768 Pro Asn Phe Leu Tyr Val Thr Tyr Ala Asp Tyr Pro Gly Pro Trp Gly 245 250 255 gtc acg ttc ggc gaa gtc tgg cgc cag aac cgc acc tcg ggc gcc tgg 816 Val Thr Phe Gly Glu Val Trp Arg Gln Asn Arg Thr Ser Gly Ala Trp 260 265 270 gac gac att act ccc cgc gtc ggc aac tcg tcg cct gcc ccg tac aac 864 Asp Asp Ile Thr Pro Arg Val Gly Asn Ser Ser Pro Ala Pro Tyr Asn 275 280 285 aac cag acg ttc cct gcg ggc gga ttt tgc ggt ctc agc gtc gac gcg 912 Asn Gln Thr Phe Pro Ala Gly Gly Phe Cys Gly Leu Ser Val Asp Ala 290 295 300 acc aac ccc aac cgt ctc gtc gtc atc acc ctc gac cgc gac ccc gga 960 Thr Asn Pro Asn Arg Leu Val Val Ile Thr Leu Asp Arg Asp Pro Gly 305 310 315 320 ccc gcc ctc gac agc atc tac ctc tca acc gat gcc ggc gcg acc tgg 1008 Pro Ala Leu Asp Ser Ile Tyr Leu Ser Thr Asp Ala Gly Ala Thr Trp 325 330 335 aag gac gtc acc cag ctc tcg tcc ccg tcc aac ctc gaa ggt aac tgg 1056 Lys Asp Val Thr Gln Leu Ser Ser Pro Ser Asn Leu Glu Gly Asn Trp 340 345 350 ggc cac ccg act aac gcg gcg cgg tac aag gac ggc acg cct gtt ccg 1104 Gly His Pro Thr Asn Ala Ala Arg Tyr Lys Asp Gly Thr Pro Val Pro 355 360 365 tgg ctc gac ttc aac aac ggt ccc cag tgg ggg gga tac ggt gcg ccg 1152 Trp Leu Asp Phe Asn Asn Gly Pro Gln Trp Gly Gly Tyr Gly Ala Pro 370 375 380 cac ggt acg ccc ggc ctc acc aag ttt ggc tgg tgg atg agc gct gtg 1200 His Gly Thr Pro Gly Leu Thr Lys Phe Gly Trp Trp Met Ser Ala Val 385 390 395 400 ctt atc gat ccg ttc aac ccc gag cac ctg atg tac ggc acg ggg gcg 1248 Leu Ile Asp Pro Phe Asn Pro Glu His Leu Met Tyr Gly Thr Gly Ala 405 410 415 acc atc tgg gcg acc gac acg ctc tcc cgt gtc gag aag gac tgg gcg 1296 Thr Ile Trp Ala Thr Asp Thr Leu Ser Arg Val Glu Lys Asp Trp Ala 420 425 430 ccg agc tgg tac ctc cag atc gac ggt atc gag gag aat gcg atc ctg 1344 Pro Ser Trp Tyr Leu Gln Ile Asp Gly Ile Glu Glu Asn Ala Ile Leu 435 440 445 tcg ctc cgc tcg ccc aag agc ggc gcg gcg ctc ctg tcg ggc atc ggt 1392 Ser Leu Arg Ser Pro Lys Ser Gly Ala Ala Leu Leu Ser Gly Ile Gly 450 455 460 gac att agc ggc atg aag cac gac gac ctc acc aag ccc cag aag atg 1440 Asp Ile Ser Gly Met Lys His Asp Asp Leu Thr Lys Pro Gln Lys Met 465 470 475 480 ttt ggt gcg ccc cag ttc tcc aac ctc gac agc atc gac gct gcg ggc 1488 Phe Gly Ala Pro Gln Phe Ser Asn Leu Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly 485 490 495 aac ttc ccc aac gtt gtc gtc cgc gcc gga tcc tcg gga cac gag tac 1536 Asn Phe Pro Asn Val Val Val Arg Ala Gly Ser Ser Gly His Glu Tyr 500 505 510 gac agc gcg tgc gcg cgc ggt gcg tac gcg act gac ggc gga gac gcg 1584 Asp Ser Ala Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Ala Thr Asp Gly Gly Asp Ala 515 520 525 tgg acc atc ttc cct acc tgc cct cct ggc atg aac gcg agc cac tac 1632 Trp Thr Ile Phe Pro Thr Cys Pro Pro Gly Met Asn Ala Ser His Tyr 530 535 540 cag ggc agc acg att gca gtc gac gcg agc ggc agc cag atc gtg tgg 1680 Gln Gly Ser Thr Ile Ala Val Asp Ala Ser Gly Ser Gln Ile Val Trp 545 550 555 560 tcg acc aag ctt gac gag cag gcc tcg gga ccg tgg tac tcg cac gac 1728 Ser Thr Lys Leu Asp Glu Gln Ala Ser Gly Pro Trp Tyr Ser His Asp 565 570 575 tat ggc aag acg tgg tct gtt ccc gct ggc gac ctg aag gcc cag act 1776 Tyr Gly Lys Thr Trp Ser Val Pro Ala Gly Asp Leu Lys Ala Gln Thr 580 585 590 gcc aat gtg ctc tcg gac aag gtc cag gat ggc acg ttc tac gct acc 1824 Ala Asn Val Leu Ser Asp Lys Val Gln Asp Gly Thr Phe Tyr Ala Thr 595 600 605 gat ggc ggc aag ttc ttc gtc tcg acc gac ggc ggg aag tcg tat gcc 1872 Asp Gly Gly Lys Phe Phe Val Ser Thr Asp Gly Gly Lys Ser Tyr Ala 610 615 620 gcc aag ggc gcc gga ctt gtc act ggc aca tcg ctc atg cct gcc gtg 1920 Ala Lys Gly Ala Gly Leu Val Thr Gly Thr Ser Leu Met Pro Ala Val 625 630 635 640 aac ccc tgg gtg gcc ggc gac gtc tgg gtg cct gtt ccc gag ggc ggt 1968 Asn Pro Trp Val Ala Gly Asp Val Trp Val Pro Val Pro Glu Gly Gly 645 650 655 ctc ttc cac tcg acc gac ttt ggc gcc tcg ttc acg agg gta ggt acc 2016 Leu Phe His Ser Thr Asp Phe Gly Ala Ser Phe Thr Arg Val Gly Thr 660 665 670 gcc aac gcg acc ctc gtg agc gtc ggc gcc ccc aag tcc aag tcg gac 2064 Ala Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Gly Ala Pro Lys Ser Lys Ser Asp 675 680 685 ggc aag aag gct agc gcg ccc tcc gcg gtc ttc atc tgg ggc acc gac 2112 Gly Lys Lys Ala Ser Ala Pro Ser Ala Val Phe Ile Trp Gly Thr Asp 690 695 700 aag cct gga agc gac atc ggc ctg tac cgc tcc gac gac aac ggc agc 2160 Lys Pro Gly Ser Asp Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asp Asp Asn Gly Ser 705 710 715 720 acc tgg acg cgc gtc aat gac cag gag cac aac tac tcg ggc ccc acc 2208 Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Gln Glu His Asn Tyr Ser Gly Pro Thr 725 730 735 atg atc gag gcc gac ccc aag gtc tac ggg cgc gtg tat cta ggc acg 2256 Met Ile Glu Ala Asp Pro Lys Val Tyr Gly Arg Val Tyr Leu Gly Thr 740 745 750 aac ggc cgc ggt atc gtg tac gcc gac ctt acc aac aag aag agc aac 2304 Asn Gly Arg Gly Ile Val Tyr Ala Asp Leu Thr Asn Lys Lys Ser Asn 755 760 765 gag gag aag tcg acc gca aag tgc gcc aac ggc cag aag ggc acg cac 2352 Glu Glu Lys Ser Thr Ala Lys Cys Ala Asn Gly Gln Lys Gly Thr His 770 775 780 tgc tat gtg aaa aag 2367 Cys Tyr Val Lys Lys 785 <210> 14 <211> 789 <212> PRT <213> Geotrichum sp. M128 <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(2367) <400> 14 Lys Glu His Tyr Glu Phe Lys Asn Val Ala Ile Gly Gly Gly Gly Tyr 1 5 10 15 Ile Thr Gly Ile Val Ala His Pro Lys Thr Lys Asp Leu Leu Tyr Ala 20 25 30 Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala Tyr Arg Trp Asp Ala Gly Thr Ser Lys 35 40 45 Trp Ile Pro Leu Asn Asp Phe Ile Glu Ala Gln Asp Met Asn Ile Met 50 55 60 Gly Thr Glu Ser Ile Ala Leu Asp Pro Asn Asn Pro Asp Arg Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Ala Gln Gly Arg Tyr Val Gly Asp Glu Trp Ala Ala Phe Tyr Val 85 90 95 Ser Glu Asp Arg Gly Gln Ser Phe Thr Ile Tyr Glu Ser Pro Phe Pro 100 105 110 Met Gly Ala Asn Asp Met Gly Arg Asn Asn Gly Glu Arg Leu Ala Val 115 120 125 Asn Pro Phe Asn Ser Asn Glu Val Trp Met Gly Thr Arg Thr Glu Gly 130 135 140 Ile Trp Lys Ser Ser Asp Arg Ala Lys Thr Trp Thr Asn Val Thr Ser 145 150 155 160 Ile Pro Asp Ala Phe Thr Asn Gly Ile Gly Tyr Thr Ser Val Ile Phe 165 170 175 Asp Pro Glu Arg Asn Gly Thr Ile Tyr Ala Ser Ala Thr Ala Pro Gln 180 185 190 Gly Met Tyr Val Thr His Asp Gly Gly Val 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Met Tyr Gly Thr Gly Ala 405 410 415 Thr Ile Trp Ala Thr Asp Thr Leu Ser Arg Val Glu Lys Asp Trp Ala 420 425 430 Pro Ser Trp Tyr Leu Gln Ile Asp Gly Ile Glu Glu Asn Ala Ile Leu 435 440 445 Ser Leu Arg Ser Pro Lys Ser Gly Ala Ala Leu Leu Ser Gly Ile Gly 450 455 460 Asp Ile Ser Gly Met Lys His Asp Asp Leu Thr Lys Pro Gln Lys Met 465 470 475 480 Phe Gly Ala Pro Gln Phe Ser Asn Leu Asp Ser Ile Asp Ala Ala Gly 485 490 495 Asn Phe Pro Asn Val Val Val Arg Ala Gly Ser Ser Gly His Glu Tyr 500 505 510 Asp Ser Ala Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Ala Thr Asp Gly Gly Asp Ala 515 520 525 Trp Thr Ile Phe Pro Thr Cys Pro Pro Gly Met Asn Ala Ser His Tyr 530 535 540 Gln Gly Ser Thr Ile Ala Val Asp Ala Ser Gly Ser Gln Ile Val Trp 545 550 555 560 Ser Thr Lys Leu Asp Glu Gln Ala Ser Gly Pro Trp Tyr Ser His Asp 565 570 575 Tyr Gly Lys Thr Trp Ser Val Pro Ala Gly Asp Leu Lys Ala Gln Thr 580 585 590 Ala Asn Val Leu Ser Asp Lys Val Gln Asp Gly Thr Phe Tyr Ala Thr 595 600 605 Asp Gly Gly Lys Phe Phe Val Ser Thr Asp Gly Gly Lys Ser Tyr Ala 610 615 620 Ala Lys Gly Ala Gly Leu Val Thr Gly Thr Ser Leu Met Pro Ala Val 625 630 635 640 Asn Pro Trp Val Ala Gly Asp Val Trp Val Pro Val Pro Glu Gly Gly 645 650 655 Leu Phe His Ser Thr Asp Phe Gly Ala Ser Phe Thr Arg Val Gly Thr 660 665 670 Ala Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Gly Ala Pro Lys Ser Lys Ser Asp 675 680 685 Gly Lys Lys Ala Ser Ala Pro Ser Ala Val Phe Ile Trp Gly Thr Asp 690 695 700 Lys Pro Gly Ser Asp Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asp Asp Asn Gly Ser 705 710 715 720 Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Gln Glu His Asn Tyr Ser Gly Pro Thr 725 730 735 Met Ile Glu Ala Asp Pro Lys Val Tyr Gly Arg Val Tyr Leu Gly Thr 740 745 750 Asn Gly Arg Gly Ile Val Tyr Ala Asp Leu Thr Asn Lys Lys Ser Asn 755 760 765 Glu Glu Lys Ser Thr Ala Lys Cys Ala Asn Gly Gln Lys Gly Thr His 770 775 780 Cys Tyr Val Lys Lys 785 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <400> 15 tcgctcgcgc atatgaagga gcactacgag ttcaagaatg 40 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <400> 16 tggaagatct cctttttcac atagcagtgc gtgccctt 38 <210> 17 <211> 2481 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(2481) <223> <400> 17 atg aag gag cac tac gag ttc aag aat gtc gcg atc ggc ggc ggc ggg 48 Met Lys Glu His Tyr Glu Phe Lys Asn Val Ala Ile Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 tac att acc ggg att gtc gcg cac cca aag acc aag gac ctg ctg tac 96 Tyr Ile Thr Gly Ile Val Ala His Pro Lys Thr Lys Asp Leu Leu Tyr 20 25 30 gcg cgc acg gac att ggc ggc gcg tac cgc tgg gac gca ggc acg tcc 144 Ala Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala Tyr Arg Trp Asp Ala Gly Thr Ser 35 40 45 aag tgg atc ccg ctc aac gac ttt atc gag gcg cag gac atg aac att 192 Lys Trp Ile Pro Leu Asn Asp Phe Ile Glu Ala Gln Asp Met Asn Ile 50 55 60 atg ggc acc gag tcg atc gcg ctg gac ccc aac aac ccc gac agg ctg 240 Met Gly Thr Glu Ser Ile Ala Leu Asp Pro Asn Asn Pro Asp Arg Leu 65 70 75 80 tac ctc gcg cag ggg cgc tat gtc ggc gac gag tgg gcg gcg ttc tat 288 Tyr Leu Ala Gln Gly Arg Tyr Val Gly Asp Glu Trp Ala Ala Phe Tyr 85 90 95 gtg tcc gaa gac cgc ggc cag tcg ttt aca atc tac gag tcg ccg ttc 336 Val Ser Glu Asp Arg Gly Gln Ser Phe Thr Ile Tyr Glu Ser Pro Phe 100 105 110 ccg atg ggc gcc aac gac atg gga cgc aac aat ggc gag cgc ctc gct 384 Pro Met Gly Ala Asn Asp Met Gly Arg Asn Asn Gly Glu Arg Leu Ala 115 120 125 gtc aac ccg ttc aac tcg aac gag gtc tgg atg ggt acg cgt aca gag 432 Val Asn Pro Phe Asn Ser Asn Glu Val Trp Met Gly Thr Arg Thr Glu 130 135 140 ggt atc tgg aag agt tcg gac cgc gcc aag acc tgg aca aac gtc acg 480 Gly Ile Trp Lys Ser Ser Asp Arg Ala Lys Thr Trp Thr Asn Val Thr 145 150 155 160 tcc atc ccg gac gcg ttc acc aac ggt atc gga tac acg tcg gtc att 528 Ser Ile Pro Asp Ala Phe Thr Asn Gly Ile Gly Tyr Thr Ser Val Ile 165 170 175 ttc gac ccc gaa cgt aat ggc acc atc tac gcg agc gcg act gcc ccg 576 Phe Asp Pro Glu Arg Asn Gly Thr Ile Tyr Ala Ser Ala Thr Ala Pro 180 185 190 cag ggc atg tac gtc acg cac gac ggc ggt gtc tcg tgg gag cca gtg 624 Gln Gly Met Tyr Val Thr His Asp Gly Gly Val Ser Trp Glu Pro Val 195 200 205 gcg ggc cag ccg tcc agc tgg ctc aac agg acc acg ggc gcg ttc ccg 672 Ala Gly Gln Pro Ser Ser Trp Leu Asn Arg Thr Thr Gly Ala Phe Pro 210 215 220 gac aag aag ccc gcg tcg atc gcg ccg cag ccc atg aaa gtc gct ctc 720 Asp Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Pro Gln Pro Met Lys Val Ala Leu 225 230 235 240 acc ccc aac ttc ctc tac gtg act tac gcc gac tac cct ggt cca tgg 768 Thr Pro Asn Phe Leu Tyr Val Thr Tyr Ala Asp Tyr Pro Gly Pro Trp 245 250 255 ggc gtc acg ttc ggc aaa gtc tgg cgc cag aac cgc acc tcg ggc gcc 816 Gly Val Thr Phe Gly Lys Val Trp Arg Gln Asn Arg Thr Ser Gly Ala 260 265 270 tgg gac gac att act ccc cgc gtc ggc aac tcg tcg cct gcc ccg tac 864 Trp Asp Asp Ile Thr Pro Arg Val Gly Asn Ser Ser Pro Ala Pro Tyr 275 280 285 aac aac cag acg ttc cct gcg ggc gga ttt tgc ggt ctc agc gtc gac 912 Asn Asn Gln Thr Phe Pro Ala Gly Gly Phe Cys Gly Leu Ser Val Asp 290 295 300 gcg acc aac ccc aac cgt ctc gtc gtc atc acc ctc gac cgc gac ccc 960 Ala Thr Asn Pro Asn Arg Leu Val Val Ile Thr Leu Asp Arg Asp Pro 305 310 315 320 gga ccc gcc ctc gac agc atc tac ctc tca acc gat gcc ggc gcg acc 1008 Gly Pro Ala Leu Asp Ser Ile Tyr Leu Ser Thr Asp Ala Gly Ala Thr 325 330 335 tgg aag gac gtc acc cag ctc tcg tcc ccg tcc aac ctc gaa ggt aac 1056 Trp Lys Asp Val Thr Gln Leu Ser Ser Pro Ser Asn Leu Glu Gly Asn 340 345 350 tgg ggc cac ccg act aac gcg gcg cgg tac aag gac ggc acg cct gtt 1104 Trp Gly His Pro Thr Asn Ala Ala Arg Tyr Lys Asp Gly Thr Pro Val 355 360 365 ccg tgg ctc gac ttc aac aac ggt ccc cag tgg ggg gga tac ggt gcg 1152 Pro Trp Leu Asp Phe Asn Asn Gly Pro Gln Trp Gly Gly Tyr Gly Ala 370 375 380 ccg cac ggt acg ccc ggc ctc acc aag ttt ggc tgg tgg atg agc gct 1200 Pro His Gly Thr Pro Gly Leu Thr Lys Phe Gly Trp Trp Met Ser Ala 385 390 395 400 gtg ctt atc gat ccg ttc aac ccc gag cac ctg atg tac ggc acg ggg 1248 Val Leu Ile Asp Pro Phe Asn Pro Glu His Leu Met Tyr Gly Thr Gly 405 410 415 gcg acc atc tgg gcg acc gac acg ctc tcc cgt gtc gag aag gac tgg 1296 Ala Thr Ile Trp Ala Thr Asp Thr Leu Ser Arg Val Glu Lys Asp Trp 420 425 430 gcg ccg agc tgg tac ctc cag atc gac ggt atc gag gag aat gcg atc 1344 Ala Pro Ser Trp Tyr Leu Gln Ile Asp Gly Ile Glu Glu Asn Ala Ile 435 440 445 ctg tcg ctc cgc tcg ccc aag agc ggc gcg gcg ctc ctg tcg ggc atc 1392 Leu Ser Leu Arg Ser Pro Lys Ser Gly Ala Ala Leu Leu Ser Gly Ile 450 455 460 ggt gac att agc ggc atg aag cac gac gac ctc acc aag ccc cag aag 1440 Gly Asp Ile Ser Gly Met Lys His Asp Asp Leu Thr Lys Pro Gln Lys 465 470 475 480 atg ttt ggt gcg ccc cag ttc tcc aac ctc gac agc atc gac gct gcg 1488 Met Phe Gly Ala Pro Gln Phe Ser Asn Leu Asp Ser Ile Asp Ala Ala 485 490 495 ggc aac ttc ccc aac gtt gtc gtc cgc gcc gga tcc tcg gga cac gag 1536 Gly Asn Phe Pro Asn Val Val Val Arg Ala Gly Ser Ser Gly His Glu 500 505 510 tac gac agc gcg tgc gcg cgc ggt gcg tac gcg act gac ggc gga gac 1584 Tyr Asp Ser Ala Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Ala Thr Asp Gly Gly Asp 515 520 525 gcg tgg acc atc ttc cct acc tgc cct cct ggc atg aac gcg agc cac 1632 Ala Trp Thr Ile Phe Pro Thr Cys Pro Pro Gly Met Asn Ala Ser His 530 535 540 tac cag ggc agc acg att gca gtc gac gcg agc ggc agc cag atc gtg 1680 Tyr Gln Gly Ser Thr Ile Ala Val Asp Ala Ser Gly Ser Gln Ile Val 545 550 555 560 tgg tcg acc aag ctt gac gag cag gcc tcg gga ccg tgg tac tcg cac 1728 Trp Ser Thr Lys Leu Asp Glu Gln Ala Ser Gly Pro Trp Tyr Ser His 565 570 575 gac tat ggc aag acg tgg tct gtt ccc gct ggc gac ctg aag gcc cag 1776 Asp Tyr Gly Lys Thr Trp Ser Val Pro Ala Gly Asp Leu Lys Ala Gln 580 585 590 act gcc aat gtg ctc tcg gac aag gtc cag gat ggc acg ttc tac gct 1824 Thr Ala Asn Val Leu Ser Asp Lys Val Gln Asp Gly Thr Phe Tyr Ala 595 600 605 acc gat ggc ggc aag ttc ttc gtc tcg acc gac ggc ggg aag tcg tat 1872 Thr Asp Gly Gly Lys Phe Phe Val Ser Thr Asp Gly Gly Lys Ser Tyr 610 615 620 gcc gcc aag ggc gcc gga ctt gtc act ggc aca tcg ctc atg cct gcc 1920 Ala Ala Lys Gly Ala Gly Leu Val Thr Gly Thr Ser Leu Met Pro Ala 625 630 635 640 gtg aac ccc tgg gtg gcc ggc gac gtc tgg gtg cct gtt ccc gag ggc 1968 Val Asn Pro Trp Val Ala Gly Asp Val Trp Val Pro Val Pro Glu Gly 645 650 655 ggt ctc ttc cac tcg acc gac ttt ggc gcc tcg ttc acg agg gta ggt 2016 Gly Leu Phe His Ser Thr Asp Phe Gly Ala Ser Phe Thr Arg Val Gly 660 665 670 acc gcc aac gcg acc ctc gtg agc gtc ggc gcc ccc aag tcc aag tcg 2064 Thr Ala Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Gly Ala Pro Lys Ser Lys Ser 675 680 685 gac ggc aag aag gct agc gcg ccc tcc gcg gtc ttc atc tgg ggc acc 2112 Asp Gly Lys Lys Ala Ser Ala Pro Ser Ala Val Phe Ile Trp Gly Thr 690 695 700 gac aag cct gga agc gac atc ggc ctg tac cgc tcc gac gac aac ggc 2160 Asp Lys Pro Gly Ser Asp Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asp Asp Asn Gly 705 710 715 720 agc acc tgg acg cgc gtc aat gac cag gag cac aac tac tcg ggc ccc 2208 Ser Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Gln Glu His Asn Tyr Ser Gly Pro 725 730 735 acc atg atc gag gcc gac ccc aag gtc tac ggg cgc gtg tat cta ggc 2256 Thr Met Ile Glu Ala Asp Pro Lys Val Tyr Gly Arg Val Tyr Leu Gly 740 745 750 acg aac ggc cgc ggt atc gtg tac gcc gac ctt acc aac aag aag agc 2304 Thr Asn Gly Arg Gly Ile Val Tyr Ala Asp Leu Thr Asn Lys Lys Ser 755 760 765 aac gag gag aag tcg acc gca aag tgc gcc aac ggc cag aag ggc acg 2352 Asn Glu Glu Lys Ser Thr Ala Lys Cys Ala Asn Gly Gln Lys Gly Thr 770 775 780 cac tgc tat gtg aaa aag gag atc tgg gta ccc tgg tgc cac gcg gtt 2400 His Cys Tyr Val Lys Lys Glu Ile Trp Val Pro Trp Cys His Ala Val 785 790 795 800 cca tgg ctg ata tcg gat ccg aat tcg agc tcc gtc gac aag ctt gcg 2448 Pro Trp Leu Ile Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys Leu Ala 805 810 815 gcc gca ctc gag cac cac cac cac cac cac tga 2481 Ala Ala Leu Glu His His His His His His 820 825 <210> 18 <211> 826 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 18 Met Lys Glu His Tyr Glu Phe Lys Asn Val Ala Ile Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Ile Thr Gly Ile Val Ala His Pro Lys Thr Lys Asp Leu Leu Tyr 20 25 30 Ala Arg Thr Asp Ile Gly Gly Ala Tyr Arg Trp Asp Ala Gly Thr Ser 35 40 45 Lys Trp Ile Pro Leu Asn Asp Phe Ile Glu Ala Gln Asp Met Asn Ile 50 55 60 Met Gly Thr Glu Ser Ile Ala Leu Asp Pro Asn Asn Pro Asp Arg Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Ala Gln Gly Arg Tyr Val Gly Asp Glu Trp Ala Ala Phe Tyr 85 90 95 Val Ser Glu Asp Arg Gly Gln Ser Phe Thr Ile Tyr Glu Ser Pro Phe 100 105 110 Pro Met Gly Ala Asn Asp Met Gly Arg Asn Asn Gly Glu Arg Leu Ala 115 120 125 Val Asn Pro Phe Asn Ser Asn Glu Val Trp Met Gly Thr Arg Thr Glu 130 135 140 Gly Ile Trp Lys Ser Ser Asp Arg Ala Lys Thr Trp Thr Asn Val Thr 145 150 155 160 Ser Ile Pro Asp Ala Phe Thr Asn Gly Ile Gly Tyr Thr Ser Val Ile 165 170 175 Phe Asp Pro Glu Arg Asn Gly Thr Ile Tyr Ala Ser Ala Thr Ala Pro 180 185 190 Gln Gly Met Tyr Val Thr His Asp Gly Gly Val Ser Trp Glu Pro Val 195 200 205 Ala Gly Gln Pro Ser Ser Trp Leu Asn Arg Thr Thr Gly Ala Phe Pro 210 215 220 Asp Lys Lys Pro Ala Ser Ile Ala Pro Gln Pro Met Lys Val Ala Leu 225 230 235 240 Thr Pro Asn Phe Leu Tyr Val Thr Tyr Ala Asp Tyr Pro Gly Pro Trp 245 250 255 Gly Val Thr Phe Gly Lys Val Trp Arg Gln Asn Arg Thr Ser Gly Ala 260 265 270 Trp Asp Asp Ile Thr Pro Arg Val Gly Asn Ser Ser Pro Ala Pro Tyr 275 280 285 Asn Asn Gln Thr Phe Pro Ala Gly Gly Phe Cys Gly Leu Ser Val Asp 290 295 300 Ala Thr Asn Pro Asn Arg Leu Val Val Ile Thr Leu Asp Arg Asp Pro 305 310 315 320 Gly Pro Ala Leu Asp Ser Ile Tyr Leu Ser Thr Asp Ala Gly Ala Thr 325 330 335 Trp Lys Asp Val Thr Gln Leu Ser Ser Pro Ser Asn Leu Glu Gly Asn 340 345 350 Trp Gly His Pro Thr Asn Ala Ala Arg Tyr Lys Asp Gly Thr Pro Val 355 360 365 Pro Trp Leu Asp Phe Asn Asn Gly Pro Gln Trp Gly Gly Tyr Gly Ala 370 375 380 Pro His Gly Thr Pro Gly Leu Thr Lys Phe Gly Trp Trp Met Ser Ala 385 390 395 400 Val Leu Ile Asp Pro Phe Asn Pro Glu His Leu Met Tyr Gly Thr Gly 405 410 415 Ala Thr Ile Trp Ala Thr Asp Thr Leu Ser Arg Val Glu Lys Asp Trp 420 425 430 Ala Pro Ser Trp Tyr Leu Gln Ile Asp Gly Ile Glu Glu Asn Ala Ile 435 440 445 Leu Ser Leu Arg Ser Pro Lys Ser Gly Ala Ala Leu Leu Ser Gly Ile 450 455 460 Gly Asp Ile Ser Gly Met Lys His Asp Asp Leu Thr Lys Pro Gln Lys 465 470 475 480 Met Phe Gly Ala Pro Gln Phe Ser Asn Leu Asp Ser Ile Asp Ala Ala 485 490 495 Gly Asn Phe Pro Asn Val Val Val Arg Ala Gly Ser Ser Gly His Glu 500 505 510 Tyr Asp Ser Ala Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Ala Thr Asp Gly Gly Asp 515 520 525 Ala Trp Thr Ile Phe Pro Thr Cys Pro Pro Gly Met Asn Ala Ser His 530 535 540 Tyr Gln Gly Ser Thr Ile Ala Val Asp Ala Ser Gly Ser Gln Ile Val 545 550 555 560 Trp Ser Thr Lys Leu Asp Glu Gln Ala Ser Gly Pro Trp Tyr Ser His 565 570 575 Asp Tyr Gly Lys Thr Trp Ser Val Pro Ala Gly Asp Leu Lys Ala Gln 580 585 590 Thr Ala Asn Val Leu Ser Asp Lys Val Gln Asp Gly Thr Phe Tyr Ala 595 600 605 Thr Asp Gly Gly Lys Phe Phe Val Ser Thr Asp Gly Gly Lys Ser Tyr 610 615 620 Ala Ala Lys Gly Ala Gly Leu Val Thr Gly Thr Ser Leu Met Pro Ala 625 630 635 640 Val Asn Pro Trp Val Ala Gly Asp Val Trp Val Pro Val Pro Glu Gly 645 650 655 Gly Leu Phe His Ser Thr Asp Phe Gly Ala Ser Phe Thr Arg Val Gly 660 665 670 Thr Ala Asn Ala Thr Leu Val Ser Val Gly Ala Pro Lys Ser Lys Ser 675 680 685 Asp Gly Lys Lys Ala Ser Ala Pro Ser Ala Val Phe Ile Trp Gly Thr 690 695 700 Asp Lys Pro Gly Ser Asp Ile Gly Leu Tyr Arg Ser Asp Asp Asn Gly 705 710 715 720 Ser Thr Trp Thr Arg Val Asn Asp Gln Glu His Asn Tyr Ser Gly Pro 725 730 735 Thr Met Ile Glu Ala Asp Pro Lys Val Tyr Gly Arg Val Tyr Leu Gly 740 745 750 Thr Asn Gly Arg Gly Ile Val Tyr Ala Asp Leu Thr Asn Lys Lys Ser 755 760 765 Asn Glu Glu Lys Ser Thr Ala Lys Cys Ala Asn Gly Gln Lys Gly Thr 770 775 780 His Cys Tyr Val Lys Lys Glu Ile Trp Val Pro Trp Cys His Ala Val 785 790 795 800 Pro Trp Leu Ile Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys Leu Ala 805 810 815 Ala Ala Leu Glu His His His His His His 820 825

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/42 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】キシログルカンオリゴ糖の主鎖を構成する
   β-グルコシド結合について、還元末端側から２番目の
   β-グルコシド結合を特異的に分解する酵素。
2. 【請求項２】配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有
   するポリぺプチド、若しくは該ポリペプチドにおける１
   個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しく
   は置換されたアミノ酸配列を有し、かつキシログルカン
   オリゴ糖分解活性を有するポリペプチド。
3. 【請求項３】Ｎ末端にメチオニンが付加された請求項２
   に記載のポリペプチド。
4. 【請求項４】シグナル配列が付加された請求項２に記載
   のポリペプチド。
5. 【請求項５】配列番号１２中に示されるアミノ酸配列を
   有するポリペプチド、若しくは該ポリペプチドにおける
   １個又は複数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置
   換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、
   キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチド
   の前駆体となるポリペプチド。
6. 【請求項６】配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有
   する請求項３に記載のポリペプチド。
7. 【請求項７】請求項２〜５のいずれかに記載のポリペプ
   チドをコードするポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】配列番号１３に示される塩基配列を有する
   ポリヌクレオチド、若しくは該ポリヌクレオチドにおけ
   る１個又は複数個の核酸が欠失、付加、挿入または置換
   された塩基配列を有するものであって、キシログルカン
   オリゴ糖分解活性を有するポリペプチドを発現するポリ
   ヌクレオチド。
9. 【請求項９】開始コドンが付加された請求項８に記載の
   ポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】シグナルペプチド配列に対応する塩基配
    列が付加された請求項８に記載のポリヌクレオチド。
11. 【請求項１１】配列番号１１に示される塩基配列を有す
    るポリヌクレオチド、若しくは該ポリヌクレオチドにお
    ける１個又は複数個の核酸が欠失、付加、挿入または置
    換された塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、
    キシログルカンオリゴ糖分解活性を有するポリペプチド
    の前駆体を発現するポリヌクレオチド。
12. 【請求項１２】請求項８〜１１のいずれかに記載のポリ
    ヌクレオチドに対し、ストリンジェントな条件下でハイ
    ブリダイズするポリヌクレオチド。
13. 【請求項１３】請求項８〜１２のいずれかに記載のポリ
    ヌクレオチドに相同性を有するポリヌクレオチド。
14. 【請求項１４】請求項８〜１２のいずれかに記載のポリ
    ヌクレオチドに縮重するポリヌクレオチド。
15. 【請求項１５】 請求項７〜１４のいずれかに記載のポ
    リヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベク
    ター。
16. 【請求項１６】請求項１５に記載の組換えベクターを含
    むことを特徴とする形質転換体。
17. 【請求項１７】請求項１６に記載の形質転換体を培養
    し、培養物から、組み換えられたポリヌクレオチドに対
    応するポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリ
    ペプチドの製造方法。
18. 【請求項１８】ポリペプチドが、キシログルカンオリゴ
    糖分解活性を有するものである請求項１７に記載のポリ
    ペプチドの製造方法。
19. 【請求項１９】キシログルカンオリゴ糖分解活性が、キ
    シログルカンオリゴ糖の主鎖を構成するβ-グルコシド
    結合について、還元末端側から２番目のβ-グルコシド
    結合を特異的に分解するものである請求項１８に記載の
    ポリペプチドの製造方法。