CN103804034B - 氨基酸叶面肥的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了氨基酸叶面肥的制备方法，包括如下步骤：A、将豆粕与酒精发酵废水混合均匀，灭菌，得到发酵培养基；B、将含有产朊假丝酵母或热带假丝酵母的第一种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵；C、然后将含有枯草芽孢杆菌的第二种子培养液和含有黑曲霉菌的第三种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵；D、再将含有嗜酸乳杆菌的第四种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；E、将发酵液进行过滤将发酵液中的固体分离，滤液即为氨基酸叶面肥。本发明氨基酸叶面肥的氨基酸含量大于8%，水不溶物小于5%，pH值在4.0～7.5之间，完全达到国家标准GB/T17419—1998《含氨基酸叶面肥料》的要求。
Description
技术领域
本发明涉及叶面肥生产领域，特别涉及一种氨基酸叶面肥的制备方法。
背景技术
酒精是一种重要的工业、食品原料，广泛应用于化工、食品饮料、日化和医药卫生等行业，同时也是应用广泛的可再生能源，因此具有十分广泛的应用和发展前景。酒精发酵行业是一个污染相对严重的行业，根据常规工艺，每生产1吨酒精排放的废水约12-15吨，酒精废水的处理意见成为各类酒精企业发展的瓶颈。酒精废水中含有大量的有机化合物及悬浮物，主要成分为糖分、蛋白质、维生素等，COD高达30000-60000mg/L，属于典型的高浓度有机废水。如果该废水不能得到稳定处理，实现资源化利用，将对环境产生极大危害。
一般酒精企业采用高温厌氧该废水，利用该废水生产沼气后再经过好氧处理，这种工艺投资大、生产不稳定，而且一般处理后的COD在500mg/L左右，还是高于国家规定的二级排放标准，需要进一步深度处理，处理成本提高。
现有技术中的氨基酸叶面肥的制备方法主要是是采用植物氨基酸与各种矿物质及其它营养成份配制而成，该方法生产成本高，致使氨基酸叶面肥的价格偏高，不利于氨基酸叶面肥的推广使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以酒精发酵废水为主要原料生产氨基酸叶面肥的制备方法，该方法将酒精发酵废水变废为宝，有利于资源节约和环境保护。且该氨基酸叶面肥的制备方法生产成本低，有利于氨基酸叶面肥的推广使用。
根据本发明的一个方面，提供了氨基酸叶面肥的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、将豆粕与酒精发酵废水按照重量比1:8～1:10的比例混合均匀，灭菌，得到发酵培养基；
B、将发酵培养基置于发酵罐中，将含有产朊假丝酵母或热带假丝酵母的第一种子培养液接种至发酵罐中，第一种子培养液与发酵培养基的体积比为2～5%，持续搅拌并通入无菌空气，在温度为30～35℃、搅拌转速为70～120r/min、通气量为2～3L/（min*m3）的条件下发酵24～48h；
C、然后将含有枯草芽孢杆菌的第二种子培养液以体积比1～3%的接种量接种至发酵罐，同时将含有黑曲霉菌的第三种子培养液以体积比1～3%的接种量接种至发酵罐，持续搅拌并通入无菌空气，在搅拌转速为120～180r/min，通气量为2～5L/（min*m3）的条件下发酵培养48～72h，然后停止搅拌和通气；
D、再将含有嗜酸乳杆菌的第四种子培养液以体积比3～5%的接种量接种至发酵罐，搅拌均匀后，停止搅拌和通气，继续发酵48～72小时，得到发酵液；
E、将发酵液进行过滤将发酵液中的固体分离，滤液即为氨基酸叶面肥。
本发明酒精发酵废水为主要原料，并添加少量的豆粕制成发酵培养基。首先在发酵培养基中加入产朊假丝酵母或热带假丝酵母进行发酵以产生蛋白质。再在发酵培养基中加入枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌进行发酵，枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌可产生各种蛋白酶和有机物分解酶，以分解蛋白质和有机物而产生游离肽和氨基酸低聚糖等。最后向发酵培养基中加入嗜酸乳杆菌以产生乳酸。上述方法生产的氨基酸叶面肥的氨基酸含量大于8%，水不溶物小于5%，pH值在4.0～7.5之间，完全达到国家标准GB/T17419—1998《含氨基酸叶面肥料》的要求。
在一些实施方式中，第一种子培养液的有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥30，第二种子培养液的有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥50，第三种子培养液的有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥30，第四种子培养液的有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥40。有一定数量的有效活菌，可确保发酵过程的进行。
在一些实施方式中，第一种子培养液的制备方法如下：
1）制备第一培养基：将葡萄糖15～20g、酵母膏4～8g、蛋白胨8～10g、琼脂15～20g用蒸馏水定容至1000mL，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟，得到第一培养基；
2）制备第一种子：将产朊假丝酵母或热带假丝酵母菌种在无菌环境中接种至第一培养基中，在35～38℃恒温条件下静止培养48～72h，得到第一种子，得到第一种子；
3）制备第一种子培养基：5-10°的麦芽汁，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20-30分钟，得到第一种子培养基；
4）制备第一种子培养液：将第一种子在无菌环境下用接种针接种至第一种子培养基中，在温度为35～38℃、频率为100～120r/min的条件下振荡培养24～48h，得到第一种子培养液。
通过上述过程的培养，可得到PH值为4～7.5，产朊假丝酵母或热带假丝酵母有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥30第一种子培养液。可为原料的发酵提供足量的纯菌种。
在一些实施方式中，第二种子培养液的制备方法如下：
1）制备第二培养基：将酪素8～10g、Na2HPO4·H2O1～1.5g、KH2PO4·3H2O0.3～0.5g、NaCl0.05～0.15g、ZnSO40.02～0.03g、CaCl20.2～0.3g和琼脂15～20g用蒸馏水定容至1000mL，pH值为7.0～7.2，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟，得到第二培养基；
2）制备第二种子：将枯草芽孢杆菌菌种在无菌环境中接种至第二培养基中，在32～35℃恒温条件下静止培养50～72h，得到第二种子；
3）制备第二种子培养基：将玉米粉20～30g,豆粕粉50～60g,K2HPO4.3H2O2～5g，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟，得到第二种子培养基；
4）制备第二种子培养液：将第二种子在无菌环境下用接种针接种至第二种子培养基，在温度为32～35℃、频率为120～160r/min的条件下振荡培养30～48h，得到第二种子培养液。
通过上述过程的培养，可得到PH值为5.5～7.5，产朊假丝酵母或热带假丝酵母的有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥50第一种子培养液。可为原料的发酵提供足量的纯菌种。
在一些实施方式中，第三种子培养液的制备方法如下：
1）制备第三培养基：将植酸钙3～6g、葡萄糖10～20g、酵母粉5～8g、NH4NO35～8g、KCl0.3～0.6g、MgSO4·7H2O0.3～0.6g、FeSO4·7H2O0.02～0.04g、MnSO4·4H2O0.02～0.04g和琼脂15～20g用蒸馏水定容至1000mL，pH值为5～6，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟，得到第三培养基；
2）制备第三种子：将黑曲霉菌菌种在无菌环境中接种至第三培养基中，28～30℃恒温条件下静止培养48～60h，得到第三种子；
3）制备第三种子培养基：将麸皮20～30g、糖蜜15～20g、硫酸铵1.5～2g用蒸馏水定容至1000mL，pH值为5.5～6.0,用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟，得到第三种子培养基；
4）制备第三种子培养液：将第三种子在无菌环境下接种至第三种子培养基中，在温度28～30℃、频率为140～180r/min的条件下振荡培养16～24h，得到第三种子培养液。
通过上述过程的培养，可得到PH值为4～6.5，黑曲霉菌有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥30第一种子培养液。可为原料的发酵提供足量的纯菌种。
在一些实施方式中，第四种子培养液的制备方法如下：
1）制备第四培养基：将胰蛋白胨8～12g、牛肉膏8～10g、酵母膏4～6g、K2HPO42～5g、柠檬酸二铵2～5g、乙酸钠4～5g、葡萄糖15～20g、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯1～1.2g、MgSO4·7H2O0.5～0.6g、MnSO4·4H2O0.2～0.4g、琼脂15～20g和CaCO34～6g用蒸馏水定容至1000mL，pH值为6～7，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟；
2）制备第四种子：嗜酸乳杆菌在无菌环境中接种至第四培养基中，在36～38℃恒温条件下静止培养48～60h，得到第四种子；
3）制备第四种子培养基：将葡萄糖15～25g、蛋白胨15～20g、氯化钠1～1.5g、硫酸锰0.01～0.02g、硫酸镁0.15～0.2g和乙酸钠0.4～0.6g用蒸馏水定容至1000mL，pH值为6.0～6.2，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟，得到第四种子培养基；
4）制备第四种子培养液：将第四种子在无菌环境下用接种针接种至第四种子培养基中，在温度36～38℃下静置培养24～48h，得到第四种子培养液。
通过上述过程的培养，可得到PH值为3.6～7，嗜酸乳杆菌有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥40第一种子培养液。可为原料的发酵提供足量的纯菌种。
在一些实施方式中，酒精发酵废水是淀粉质原料或秸秆类原料经过发酵法生产酒精过程中的蒸馏废水。该废水的有机物含量高，而有害有毒物质含量低，是生产叶面肥的良好原料。
在一些实施方式中，所述酒精发酵废水的化学需氧量为30000～60000mg/L。以保证原材料中的有机物含量。
在一些实施方式中，步骤E中采用滤网进行过滤，所述滤网目数为80-100目。以确保过滤掉发酵液中的固体杂质。
酒精废水有机物含量高，含有丰富的蛋白质、糖类、氨基酸及微量元素，且由于酒精的生产原料一般为木薯、玉米、秸秆等草本植物，其废水中重金属等有害有毒物质含量极低，是生产叶面肥的良好原料。本发明以酒精发酵废水为主要原料生产氨基酸，一方面可以减少废弃物的污染，另一方面可以实现废弃物的增值和资源化利用。本发明以酒精发酵废水为主要原料配比少量豆粕，通过复合菌种多步发酵生产的叶面肥富含氨基酸、游离肽、乳酸、矿物质等营养成分，是优良的植物肥料，该发明原料费用较传统工艺低廉，产品品质优良具有较强的市场竞争力，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
本发明实施例所用的菌种均购买于“中国工业微生物菌种保藏管理中心”，其中各菌种的保藏编号分别为：产朊假丝酵母1769、热带假丝酵母1318、枯草芽孢杆菌10071、黑曲霉菌2109、嗜酸乳杆菌6091。
实施例1
一种以酒精发酵废水为主要原料生产氨基酸叶面肥的方法，包括步骤如下
（一）、制备种子培养液
A、制备第一种子培养液
1）制备第一培养基：将葡萄糖20g、酵母膏8g、蛋白胨9g和琼脂20g用蒸馏水定容至1000mL，pH值自然，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌灭菌20分钟后摆斜面，得到第一培养基。
2）制备第一种子：将购买于“中国工业微生物菌种保藏管理中心”保藏编号为1769的产朊假丝酵母（Candida utilis）菌种在无菌环境中接种至第一培养基，35℃恒温条件下静止培养48h，得到第一种子。
3）制备第一种子培养基：8°Brinx（麦芽汁浓度）的麦芽汁1000mL置于三角瓶中，PH值自然，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟，得到第一种子培养基。
4）制备第一种子培养液：将第一种子在无菌环境下用接种针接种至装有第一种子培养基的三角瓶中，在温度为37℃的条件下，置于摇床频率为120r/min的往复摇床上培养36h，得到第一种子培养液。得到的第一种子培养液：PH值4.0，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥30。
B、制备第二种子培养液
1）制备第二培养基：酪素8g、Na2HPO4·H2O1.5g、KH2PO4·3H2O0.4g、NaCl0.1g、ZnSO40.02g、CaCl20.25g和琼脂15g用蒸馏水定容至1000mL，PH值7.0-7.2，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟后摆斜面，得到第二培养基。
2）制备第二种子：将购买于“中国工业微生物菌种保藏管理中心”保藏编号为10071的枯草芽孢杆菌菌种(Bacillus subtilis)在无菌环境中接种至第二培养基中，34℃恒温条件下静止培养56h，得到第二种子。
3）制备第二种子培养基：玉米粉25g、豆粕粉50g和K2HPO4·3H2O4g置于三角瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌30分钟，得到第二种子培养基；
4）制备第二种子培养液：将第二种子在无菌环境下用接种针接种至第二种子培养基的三角瓶中，在温度35℃，置于摇床频率为150r/min的往复摇床上培养48h，得到第二种子培养液。得到的第二种子培养液：PH值6.4，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥50。
C、制备第三种子培养液
1）制备第三培养基：植酸钙3.5g、葡萄糖15g、酵母粉8g、NH4NO36g、KCl0.5g、MgSO4·7H2O0.6g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·4H2O0.03g和琼脂20g用蒸馏水定容至1000mL，PH值5.5，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟后摆斜面，得到第三培养基。
2）制备第三种子：将购买于“中国工业微生物菌种保藏管理中心”保藏编号为2109的黑曲霉菌菌种（Aspergillus niger）在无菌环境中接种至第三培养基中，28℃恒温条件下静止培养60h，得到第三种子。
3）制备第三种子培养基：麸皮20g、糖蜜18g、硫酸铵1.5g置于三角瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，PH值6.0,用0.1MPa的高压蒸汽灭菌30分钟，得到第三种子培养基。
4）制备第三种子培养液：将第三种子在无菌环境下用接种针接种至第三种子培养基的三角瓶中，在温度29℃，置于摇床频率为180r/min的往复摇床上培养20h，得到第三种子培养液。得到的第三种子培养液：PH值4.2，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥30。
D、制备第四种子培养液
1）制备第四培养基：胰蛋白胨10g、牛肉膏8g、酵母膏4g、K2HPO44g、柠檬酸二铵4g、乙酸钠4g、葡萄糖15g、吐温801.2g、MgSO4·7H2O0.5g、MnSO4·4H2O0.4g、琼脂15g和CaCO34g用蒸馏水定容至1000mL，PH值6.8，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌25分钟后摆斜面，得到第四培养基。
2）制备第四种子：将购买于“中国工业微生物菌种保藏管理中心”保藏编号为6091的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)在无菌环境中接种至第四培养基中，37℃恒温条件下静止培养48h，得到第四种子。
3）制备第四种子培养基：葡萄糖20g、蛋白胨15g、氯化钠1.5g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.15g和乙酸钠0.6g置于三角瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，PH值6.0，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌30分钟，得到第四种子培养基。
4）制备第四种子培养液：将第四种子在无菌环境下用接种针接种至第四种子培养基的三角瓶中，在温度38℃，静置培养48h，得到第四种子培养液。得到的第二种子培养液：PH值3.6，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥40。
（二）、氨基酸叶面肥的制备
A、发酵培养基的制备
豆粕与酒精发酵废水按照重量比1:10的比例混合搅拌均匀，PH值自然，110℃灭菌25min，得到发酵培养基。
B、将步骤A中的发酵培养基置于1立方米的发酵罐中，将第一种子培养液接种至发酵罐中，第一种子培养液与发酵培养基的体积比为5%。持续搅拌并通入无菌空气。在温度为35℃、搅拌转速为100r/min、通气量为2.5L/min的条件下发酵24h；
C、然后将第二种子培养液和第三种子培养液分别以体积比2%和3%的接种量接种至发酵罐，持续搅拌并通入无菌空气，在搅拌转速为150r/min、通气量为4L/min的条件下发酵培养48h，然后停止搅拌和通气；
D、将第四种子培养液以体积比3%的接种量接种至发酵罐，搅拌均匀后，发酵72小时，得到发酵液。
E、将发酵液经过滤网目数为：80-100目板框过滤器，滤液即为氨基酸叶面肥。得到的氨基酸叶面肥的氨基酸含量为8.7%，水不溶物3.5%，PH值6.2。
实施例2
（一）、制备种子培养液
A、制备第一种子培养液
1）制备第一培养基：葡萄糖15g、酵母膏5g、蛋白胨8g和琼脂15g用蒸馏水定容至1000mL，PH值自然，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟后摆斜面。
2）制备第一种子：将购买于“中国工业微生物菌种保藏管理中心”保藏编号为1318的热带假丝酵母（Candida tropicalis）菌种在无菌环境中接种至第一培养基，35℃恒温条件下静止培养62h，得到第一种子。
3）制备第一种子培养基：第一种子培养基：10°Brinx的麦芽汁1000mL置于三角瓶中，PH值自然，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟，得到第一种子培养基。
4）制备第一种子培养液：将第一种子在无菌环境下用接种针接种至装有第一种子培养基的三角瓶中，在温度为36℃的条件下，置于摇床频率为100r/min的往复摇床上培养30h，得到第一种子培养液。得到的第一种子培养液：PH值7.2，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥30。
B、制备第二种子培养液
1）制备第二培养基：第二培养基：酪素8g、Na2HPO4·H2O1g、KH2PO4·3H2O0.4g、NaCl0.15g、ZnSO40.025g、CaCl20.2g和琼脂15g用蒸馏水定容至1000mL，PH值7.1，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟后摆斜面，得到第二培养基。
2）制备第二种子：将枯草芽孢杆菌菌种(Bacillus subtilis)在无菌环境中接种至第二培养基中，34℃恒温条件下静止培养62h，得到第二种子。
3）制备第二种子培养基：第二种子培养基：玉米粉25g、豆粕粉50g和K2HPO4.3H2O4g置于三角瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟，得到第二种子培养基；
4）制备第二种子培养液：将第二种子在无菌环境下用接种针接种至第二种子培养基的三角瓶中，在温度34℃，置于摇床频率为130r/min的往复摇床上培48h，得到第二种子培养液。得到的第二种子培养液：PH值6.1，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥50。
C、制备第三种子培养液
1）制备第三培养基：植酸钙4g、葡萄糖15g、酵母粉7g、NH4NO36g、KCl0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·4H2O0.04g和琼脂20g用蒸馏水定容至1000mL，PH值6，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟后摆斜面，得到第三培养基。
2）制备第三种子：将黑曲霉菌菌种（Aspergillus niger）在无菌环境中接种至第三培养基中，30℃恒温条件下静止培养48h，得到第三种子。
3）制备第三种子培养基：第三种子培养基：麸皮30g、糖蜜20g、硫酸铵2g置于三角瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，PH值6.0,用0.1MPa的高压蒸汽灭菌30分钟，得到第三种子培养基。
4）制备第三种子培养液：将第三种子在无菌环境下用接种针接种至第三种子培养基的三角瓶中，在温度29℃，置于摇床频率为180r/min的往复摇床上培养23h，得到第三种子培养液。得到的第三种子培养液：PH值6.5，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥30。
D、制备第四种子培养液
1）制备第四培养基：胰蛋白胨10g、牛肉膏9g、酵母膏4.5g、K2HPO42g、柠檬酸二铵4g、乙酸钠5g、葡萄糖15g、吐温801.2g、MgSO4·7H2O0.5g、MnSO4·4H2O0.25g、琼脂18g和CaCO35g用蒸馏水定容至1000mL，PH值6，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌25分钟后摆斜面，得到第四培养基。
2）制备第四种子：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)在无菌环境中接种至第四培养基中，36-38℃恒温条件下静止培养50h，得到第四种子。
3）制备第四种子培养基：葡萄糖20g、蛋白胨18g、氯化钠1g、硫酸锰0.015g、硫酸镁0.15g和乙酸钠0.45g置于三角瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，PH值6.1，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟，得到第四种子培养基。
4）制备第四种子培养液：将第四种子在无菌环境下用接种针接种至第四种子培养基的三角瓶中，在温度38℃，静置培养24h，得到第四种子培养液。得到的第四种子培养液：PH值7.0，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥40。
（二）、氨基酸叶面肥的制备
A、发酵培养基的制备：豆粕与酒精发酵废水按照重量比1:8的比例混合搅拌均匀，PH值自然，110℃灭菌25min，得到发酵培养基。
B、将步骤1的发酵培养基置于1立方米的发酵罐中，将第一种子培养液接种至发酵罐中，第一种子培养液与发酵培养基的体积比为3%。持续搅拌并通入无菌空气，在温度为35℃、搅拌转速为110r/min、通气量为3L/min的条件下发酵44h；
C、然后将第二种子培养液和第三种子培养液分别按照以体积比2%和3%的接种量接种至发酵罐，持续搅拌并通入无菌空气，在搅拌转速为150r/min、通气量为3.5L/min的条件下发酵培养56h，然后停止搅拌和通气；
D、将第四种子培养液以体积比5%的接种量接种至发酵罐，搅拌均匀后，发酵60小时。
E、将发酵液经过板框过滤，滤液即为氨基酸叶面肥。得到的氨基酸叶面肥的其氨基酸含量10.8%，水不溶物4.6%，PH值7.1。
实施例3
（一）、制备种子培养液
A、制备第一种子培养液
1）制备第一培养基：葡萄糖18g、酵母膏4g、蛋白胨9g和琼脂18g用蒸馏水定容至1000mL、PH值自然，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌25分钟后摆斜面，得到第一培养基。
2）制备第一种子：将产朊假丝酵母（Candida utilis）菌种在无菌环境中接种至第一培养基中，36℃恒温条件下静止培养72h，得到第一种子。
3）制备第一种子培养基：第一种子培养基：8°Brinx的麦芽汁1000mL置于三角瓶中，PH值自然，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟，得到第一种子培养基。
4）制备第一种子培养液：将第一种子在无菌环境下用接种针接种至装有第一种子培养基的三角瓶中，在温度为38℃的条件下，置于摇床频率为110r/min的往复摇床上培养48h，得到第一种子培养液。得到的第一种子培养液：PH值5.7，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥30。
B、制备第二种子培养液
1）制备第二培养基：将酪素9g、Na2HPO4·H2O1.2g、KH2PO4·3H2O0.5g、NaCl0.1g、ZnSO40.02g、CaCl20.25g和琼脂15g用蒸馏水定容至1000mL，PH值7.0，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌25分钟后摆斜面，得到第二培养基。
2）制备第二种子：将枯草芽孢杆菌菌种(Bacillus subtilis)在无菌环境中接种至第二培养基中，35℃恒温条件下静止培养50h，得到第二种子。
3）制备第二种子培养基：将玉米粉30g、豆粕粉53g和K2HPO4.3H2O5g置于三角瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟，得到第二种子培养基；
4）制备第二种子培养液：将第二种子在无菌环境下用接种针接种至第二种子培养基的三角瓶中，在温度34℃，置于摇床频率为120r/min的往复摇床上培养36h，得到第二种子培养液。得到的第二种子培养液：PH值5.5，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥50。
C、制备第三种子培养液
1）制备第三培养基：将植酸钙6g、葡萄糖10g、酵母粉5g、NH4NO35g、KCl0.3g、MgSO4·7H2O0.3g、FeSO4·7H2O0.02g、MnSO4·4H2O0.02g和琼脂20g用蒸馏水定容至1000mL，PH值5.5，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟后摆斜面，得到第三培养基。
2）制备第三种子：将黑曲霉菌菌种（Aspergillus niger）在无菌环境中接种至第三培养基，30℃恒温条件下静止培养49h，得到第三种子。
3）制备第三种子培养基：第三种子培养基：麸皮28g、糖蜜20g和硫酸铵1.8g置于三角瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，PH值5.8,用0.1MPa的高压蒸汽灭菌30分钟，得到第三种子培养基。
4）制备第三种子培养液：将第三种子在无菌环境下用接种针接种至第三种子培养基的三角瓶中，在温度30℃，置于摇床频率为170r/min的往复摇床上培养16h，得到第三种子培养液。得到的第三种子培养液：PH值5.3，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥30。
D、制备第四种子培养液
1）制备第四培养基：胰蛋白胨8g、牛肉膏9g、酵母膏5g、K2HPO42g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠4.2g、葡萄糖15g、吐温801.1g、MgSO4·7H2O0.53g、MnSO4·4H2O0.3g、琼脂15g、CaCO34.5g，用蒸馏水定容至1000mL，PH值6，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟后摆斜面，得到第四培养基。
2）制备第四种子：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)在无菌环境中接种至第四培养基，36℃恒温条件下静止培养60h，得到第四种子。
3）制备第四种子培养基：葡萄糖15g、蛋白胨15g、氯化钠1.2g、硫酸锰0.012g、硫酸镁0.18g和乙酸钠0.5g置于三角瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，PH值6.2，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌25分钟，得到第四种子培养基。
4）制备第四种子培养液：将第四种子在无菌环境下用接种针接种至第四种子培养基的三角瓶中，在温度37℃，静置培养40h，得到第四种子培养液。得到的第四种子培养液：PH值4.2，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥30。
（二）、氨基酸叶面肥的制备
A、发酵培养基的制备：豆粕与酒精发酵废水按照重量比1:9的比例混合搅拌均匀，PH值自然，110℃灭菌25min，得到发酵培养基。
B、将步骤1的发酵培养基置于1立方米的发酵罐中，将第一种子培养液接种至发酵罐中，第一种子培养液与发酵培养基的体积比为3%。持续搅拌并通入无菌空气，在温度为34℃、搅拌转速为120r/min、通气量为2.8L/min的条件下发酵40h。
C、然后将第二种子培养液和第三种子培养液分别以体积比1%和2%的接种量接种至发酵罐，持续搅拌并通入无菌空气，在搅拌转速为180r/min、通气量为5L/min的条件下发酵培养72h，然后停止搅拌和通气。
D、将第四种子培养液以体积比4.5%的接种量接种至发酵罐，搅拌均匀后，发酵70小时。
E、将发酵液经过板框过滤，滤液即为氨基酸叶面肥。得到的氨基酸叶面肥的氨基酸含量9.27%，水不溶物3.9%，PH值6.6。
实施例4
（一）、制备种子培养液
A、制备第一种子培养液
1）制备第一培养基：葡萄糖18g、酵母膏6g、蛋白胨10g和琼脂18g用蒸馏水定容至1000mL、PH值自然，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌30分钟后摆斜面，得到第一培养基。
2）制备第一种子：将热带假丝酵母（Candida tropicalis）菌种在无菌环境中接种至第一培养基中，38℃恒温条件下静止培养55h，得到第一种子。
3）制备第一种子培养基：将5°Brinx的麦芽汁1000mL置于三角瓶中，PH值自然，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌30分钟，得到第一种子培养基。
4）制备第一种子培养液：将第一种子在无菌环境下用接种针接种至装有第一种子培养基的三角瓶中，在温度为35℃的条件下，置于摇床频率为110r/min的往复摇床上培养24h，得到第一种子培养液。得到的第一种子培养液：PH值5.7，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥20。
B、制备第二种子培养液
1）制备第二培养基：将酪素10g、Na2HPO4·H2O1.2g、KH2PO4·3H2O0.3g、NaCl0.05g、ZnSO40.03g、CaCl20.3g和琼脂20g用蒸馏水定容至1000mL，PH值7.2，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌30分钟后摆斜面，得到第二培养基。
2）制备第二种子：将枯草芽孢杆菌菌种(Bacillus subtilis)在无菌环境中接种至第二培养基，30℃恒温条件下静止培养72h，得到第二种子。
3）制备第二种子培养基：将玉米粉20g、豆粕粉60g和K2HPO4.3H2O2g置于三角瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌30分钟，得到第二种子培养基。
4）制备第二种子培养液：将第二种子在无菌环境下用接种针接种至第二种子培养基的三角瓶中，在温度32℃，置于摇床频率为160r/min的往复摇床上培养36h，得到第二种子培养液。得到的第二种子培养液：PH值5.5，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥50。
C、制备第三种子培养液
1）制备第三培养基：第三培养基：植酸钙3g、葡萄糖20g、酵母粉6g、NH4NO38g、KCl0.6g、MgSO4·7H2O0.4g、FeSO4·7H2O0.04g、MnSO4·4H2O0.02g和琼脂15g用蒸馏水定容至1000mL，PH值5，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌30分钟后摆斜面，得到第三培养基。
2）制备第三种子：将黑曲霉菌菌种（Aspergillus niger）在无菌环境中接种至第三培养基，29℃恒温条件下静止培养55h，得到第三种子。
3）制备第三种子培养基：第三种子培养基：麸皮25g、糖蜜15g和硫酸铵1.8g置于三角瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，PH值5.8,用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟，得到第三种子培养基。
4）制备第三种子培养液：将第三种子在无菌环境下用接种针接种至第三种子培养基的三角瓶中，在温度28℃，置于摇床频率为140r/min的往复摇床上培养24h，得到第三种子培养液。得到的第三种子培养液：PH值5.2，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥30。
D、制备第四种子培养液
1）制备第四培养基：胰蛋白胨12g、牛肉膏10g、酵母膏6g、K2HPO45g、柠檬酸二铵5g、乙酸钠4.5g、葡萄糖20g、吐温801g、MgSO4·7H2O0.6g、MnSO4·4H2O0.2g、琼脂20g和CaCO36g用蒸馏水定容至1000mL，PH值7，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌30分钟后摆斜面，得到第四培养基。
2）制备第四种子：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)在无菌环境中接种至第四培养基中，38℃恒温条件下静止培养54h，得到第四种子。
3）制备第四种子培养基：葡萄糖25g、蛋白胨20g、氯化钠1.2g、硫酸锰0.01g、硫酸镁0.2g和乙酸钠0.4g置于三角瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，PH值6.2，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20分钟，得到第四种子培养基。
4）制备第四种子培养液：将第四种子在无菌环境下用接种针接种至第四种子培养基的三角瓶中，在温度36℃，静置培养36h，得到第四种子培养液。得到的第四种子培养液：PH值4.2，有效活菌数（cfu）/〔×108/g(ml)〕≥30。
（二）、氨基酸叶面肥的制备
A、发酵培养基的制备：豆粕与酒精发酵废水按照重量比1:9的比例混合搅拌均匀，PH值自然，110℃灭菌25min，得到发酵培养基。
B、将步骤1的发酵培养基置于1立方米的发酵罐中，将第一种子培养液接种至发酵罐中，第一种子培养液与发酵培养基的体积比为2%。持续搅拌并通入无菌空气，在温度为34℃、搅拌转速为120r/min、通气量为2.8L/min的条件下发酵40h。
C、然后将第二种子培养液和第三种子培养液分别以体积比3%和2%的接种量接种至发酵罐，持续搅拌并通入无菌空气，在搅拌转速为120r/min、通气量为2L/min的条件下发酵培养72h，然后停止搅拌和通气。
D、将第四种子培养液以体积比5%的接种量接种至发酵罐，搅拌均匀后，停止搅拌和通气，继续发酵48小时。
E、将发酵液经过板框过滤，滤液即为氨基酸叶面肥。得到的氨基酸叶面肥的氨基酸含量8.53%，水不溶物3.6%，PH值6.7。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。
Claims (9)
1.氨基酸叶面肥的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、将豆粕与酒精发酵废水按照重量比1:8～1:10的比例混合均匀，灭菌，得到发酵培养基；
B、将发酵培养基置于发酵罐中，将含有产朊假丝酵母或热带假丝酵母的第一种子培养液接种至发酵罐中，第一种子培养液与发酵培养基的体积比为2～5％，持续搅拌并通入无菌空气，在温度为30～35℃、搅拌转速为70～120r/min的条件下发酵24～48h；
C、然后将含有枯草芽孢杆菌的第二种子培养液以体积比1～3％的接种量接种至发酵罐，同时将含有黑曲霉菌的第三种子培养液以体积比1～3％的接种量接种至发酵罐，持续搅拌并通入无菌空气，在搅拌转速为120～180r/min的条件下发酵培养48～72h，然后停止搅拌和通气；
D、再将含有嗜酸乳杆菌的第四种子培养液以体积比3～5％的接种量接种至发酵罐，搅拌均匀后，停止搅拌和通气，继续发酵48～72小时，得到发酵液；
E、将发酵液进行过滤将发酵液中的固体分离，滤液即为氨基酸叶面肥。
2.根据权利要求1所述的氨基酸叶面肥的制备方法，其特征在于：所述第一种子培养液的有效活菌数cfu/g(ml)≥30×108，所述第二种子培养液的有效活菌数cfu/g(ml)≥50×108，所述第三种子培养液有效活菌数cfu/g(ml)≥30×108，所述第四种子培养液的有效活菌数cfu/g(ml)≥40×108。
3.根据权利要求2所述的氨基酸叶面肥的制备方法，其特征在于，所述第一种子培养液的制备方法如下：
1)制备第一培养基：将葡萄糖15～20g、酵母膏4～8g、蛋白胨8～10g、琼脂15～20g用蒸馏水定容至1000mL，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟，得到第一培养基；
2)制备第一种子：将产朊假丝酵母或热带假丝酵母菌种在无菌环境中接种至第一培养基中，在35～38℃恒温条件下静止培养48～72h，得到第一种子；
3)制备第一种子培养基：5-10°的麦芽汁，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20-30分钟，得到第一种子培养基；
4)制备第一种子培养液：将第一种子在无菌环境下用接种针接种至第一种子培养基中，在温度为35～38℃、频率为100～120r/min的条件下振荡培养24～48h，得到第一种子培养液。
4.根据权利要求2所述的氨基酸叶面肥的制备方法，其特征在于，所述第二种子培养液的制备方法如下：
1)制备第二培养基：将酪素8～10g、Na2HPO4·H2O 1～1.5g、KH2PO4·3H2O 0.3～0.5g、NaCl 0.05～0.15g、ZnSO40.02～0.03g、CaCl20.2～0.3g和琼脂15～20g用蒸馏水定容至1000mL，pH值为7.0～7.2，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟，得到第二培养基；
2)制备第二种子：将枯草芽孢杆菌菌种在无菌环境中接种至第二培养基中，在32～35℃恒温条件下静止培养50～72h，得到第二种子；
3)制备第二种子培养基：将玉米粉20～30g，豆粕粉50～60g，K2HPO4.3H2O 2～5g，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟，得到第二种子培养基；
4)制备第二种子培养液：将第二种子在无菌环境下用接种针接种至第二种子培养基中，在温度为32～35℃、频率为120～160r/min的条件下振荡培养30～48h，得到第二种子培养液。
5.根据权利要求2所述的氨基酸叶面肥的制备方法，其特征在于，所述第三种子培养液的制备方法如下：
1)制备第三培养基：将植酸钙3～6g、葡萄糖10～20g、酵母粉5～8g、NH4NO35～8g、KCl 0.3～0.6g、MgSO4·7H2O 0.3～0.6g、FeSO4·7H2O0.02～0.04g、MnSO4·4H2O 0.02～0.04g和琼脂15～20g用蒸馏水定容至1000mL，pH值为5～6，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟，得到第三培养基；
2)制备第三种子：将黑曲霉菌菌种在无菌环境中接种至第三培养基，28～30℃恒温条件下静止培养48～60h，得到第三种子；
3)制备第三种子培养基：将麸皮20～30g、糖蜜15～20g、硫酸铵1.5～2g用蒸馏水定容至1000mL，pH值为5.5～6.0,用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟，得到第三种子培养基；
4)制备第三种子培养液：将第三种子在无菌环境下接种至第三种子培养基中，在温度28～30℃、频率为140～180r/min的条件下振荡培养16～24h，得到第三种子培养液。
6.根据权利要求2所述的氨基酸叶面肥的制备方法，其特征在于，所述第四种子培养液的制备方法如下：
1)制备第四培养基：将胰蛋白胨8～12g、牛肉膏8～10g、酵母膏4～6g、K2HPO42～5g、柠檬酸二铵2～5g、乙酸钠4～5g、葡萄糖15～20g、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯1～1.2g、MgSO4·7H2O 0.5～0.6g、MnSO4·4H2O 0.2～0.4g、琼脂15～20g和CaCO34～6g用蒸馏水定容至1000mL，pH值为6～7，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟，得到第四培养基；
2)制备第四种子：嗜酸乳杆菌在无菌环境中接种至第四培养基，在36～38℃恒温条件下静止培养48～60h，得到第四种子；
3)制备第四种子培养基：将葡萄糖15～25g、蛋白胨15～20g、氯化钠1～1.5g、硫酸锰0.01～0.02g、硫酸镁0.15～0.2g和乙酸钠0.4～0.6g用蒸馏水定容至1000mL，pH值为6.0～6.2，用0.1MPa的高压蒸汽灭菌20～30分钟，得到第四种子培养基；
4)制备第四种子培养液：将第四种子在无菌环境下用接种针接种至第四种子培养基中，在温度36～38℃下静置培养24～48h，得到第四种子培养液。
7.根据权利要求1所述的氨基酸叶面肥的制备方法，其特征在于：所述酒精发酵废水是淀粉质原料或秸秆类原料经过发酵法生产酒精过程中的蒸馏废水。
8.根据权利要求6所述的氨基酸叶面肥的制备方法，其特征在于：所述酒精发酵废水的化学需氧量为30000～60000mg/L。
9.根据权利要求1所述的氨基酸叶面肥的制备方法，其特征在于：所述步骤E中采用滤网进行过滤，所述滤网目数为80-100目。
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