CN103421707B - 一种藏猪源芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种藏猪源芽孢杆菌及其应用。所公开的藏猪源芽孢杆菌经细菌形态学鉴定、生化鉴定和分子学鉴定，按照分类将其命名为枯草芽孢杆菌BY-2（Bacillus subtilis BY-2），保藏编号为：CCTCC NO：M2012535。该枯草芽孢杆菌BY-2从藏猪盲肠内容物中分离，能产生较高的纤维素分解酶，具有降解羧甲基纤维素钠的能力。

Description

一种藏猪源芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种菌株，是一种从藏猪盲肠内容物中分离出的能够分解纤维素的芽孢杆菌，可用于纤维素酶的提取，以利于工业开发；或在动物生产中用于制作促进猪等单胃动物消化粗纤维的微生态制剂等。

背景技术

1纤维素酶应用领域和前景

纤维素酶因其固有的优点被广泛应用于与人们生产生活息息相关的各个行业。微生物纤维素酶来源广泛,易获得,随着生物技术，特别是基因工程技术的发展，生产这类纤维素酶相对容易。因此，微生物纤维素酶已被广泛用于畜牧业、饲料工业、食品工业、造纸和纺织工业等领域^[1][2][3]。

纤维素是地球上最丰富、最廉价、年产量巨大的可再生资源，合理开发和科学科用这一丰厚的天然资源是世界各国研究开发的重点领域。随着我国畜牧业集约化程度的提高，能量饲料短缺的局面越来越严重。因此，在畜牧业和饲料工业上，将纤维素酶作为外源酶添加到动物日粮中以提高动物对纤维素的消化率，来缓解目前能量饲料短缺、人畜争粮的局面，利于发展节粮性农业。在草食动物中，其瘤胃及肠道中自身的微生物纤维素酶很难达到人们的预期，因此，目前重要是通过添加纤维素酶来补充草食动物内源酶的不足，从而使草食动物对粗纤维的消化利用率得到一定的提高^[4]。但对单胃动物而言，纤维素酶可改善消化道环境，使消化道酸度增加激活其他消化酶如胃蛋白酶的活性^[5][6]，此外，纤维素酶还具有维持小肠绒毛形态和功能完整、促进营养物质吸收的功能。另有研究还表明，添加外源纤维素酶可以减少畜禽粪便营养物质损失，提高畜禽的日增重，提高肉蛋奶产量和品质^[7]；在单胃动物中，添加纤维素酶可有效的减少粪便和尿液中氨态氮的损失^[8]，因此可以减小臭气的来源，大大改善养殖场饲养环境，提高动物福利；在禽类养殖中，添加纤维素酶的可有效提高日粮能量水平，蛋白利用率，以及饲料报酬^[9]。

另外，纤维素酶还可应用于生物乙醇生产，即将粗纤维分解为单糖，进而通过生物发酵产生酒精并进行提纯，生产新型清洁能源。在造纸业和食品工业以及纺织业中，都具有很广泛的用途。除了上述领域之外还可以在堆肥处理，土壤增肥等方面发挥作用。近年来随着分子生物学和基因工程的发展，纤维素酶的研究非常活跃，应用前景非常广阔。

2纤维素分解菌用于纤维素酶的生产

产纤维素酶的生物种群相当广泛，如细菌、真菌、放线菌及昆虫、软体动物、原生动物等。迄今为止，已有很多关于纤维素酶生产菌株的研究报道，国内外研究主要集中在真菌的木霉属和曲霉属。目前己制成纤维素酶制剂的有绿色木霉、黑曲霉（Aspergillius niger）、镰刀霉（Fusarium sp.）、拟青霉（Paecilomyces sp.）和斜卧青霉（Penicillium decumbens）等的纤维素酶^[10]，并在工业生产的应用中获得了可观的经济效益^[11]，但现阶段我国的纤维素酶的生产存在着纤维底物的高度复杂、纤维素酶活力较低、生产成本较高、生产周期长等问题从而阻碍了纤维素酶水解的实际应用^[12]，主要是因为木霉菌普遍缺乏一种限制因子β-葡萄糖苷酶，这可以使纤维二糖积聚，从而反馈抑制酶活，降低酶解效率，这一直是阻碍其大规模生产应用的瓶颈问题。即使应用最广的纤维素酶生产菌--里氏木霉的优良突变株，也存在以上问题。相对于真菌，纤维素分解细菌具有培养简单、生长速度快、发酵周期短等优点^[13]。因此，针对细菌产纤维素酶的特点，开发自然界资源中产酶水平较高的纤维素分解细菌已经引起了人们的广泛关注。

3参考文献

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发明内容

本发明的目的是提供一种藏猪源芽孢杆菌，该芽孢杆菌已于2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BY-2，保藏编号为：CCTCC NO：M2012535。

所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BY-2的16SrDNA的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

用所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BY-2克隆的内切纤维素酶β-1,4葡聚糖酶基因，命名为egls-BY，其基因序列如SEQ ID NO:2所示。

该芽孢杆菌有较高的纤维素酶活性，可用于肠道中或粪便中纤维的降解，改善养殖场动物生存环境，也用于研发微生物制剂，以防治动物肠道疾病的发生。

对BY-2的酶学特性分析表明：在65℃、pH5.5、反应5min条件下，酶活最高达到1.33U/ml.min，且在pH3～8范围内相对酶活均在80%以上。

经过发酵优化，确定了纤维素分解菌BY-2的最适碳源为玉米粉、氮源为酵母和蛋白胨的混合物（1:1）、发酵液起始pH为自然pH值（5.5-6.0之间）。BY-2在1-6%接种量的条件下，发酵至20-28h时均达到产酶高峰。

以Bacillus subtilis168trpC2内切酶基因egls基因序列为参考，成功克隆了BY-2的纤维素内切酶基因egls-BY，并成功构建纤维素内切酶基因egls-BY的原核表达系统。重组菌于37℃、220rpm、菌液OD600达到0.8左右时，进行IPTG诱导，诱导8h时胞外酶活达到最高0.96U/ml.min。

用DNAssist分析软件对纤维素酶基因egls-BY的氨基酸序列进行预测表明：该纤维素酶蛋白由20种氨基酸组成，其分子量理论值为55KD，等电点为8.6；对蛋白结构预测表明，该蛋白具有一定的亲水性，且属于纤维素分解酶BglC的家族。

SDS-PAGE分析表明，BY-2的纤维素内切酶基因egls-BY在原核中成功得以表达，但主要以包涵体的形式存在，纤维素酶的分子量接近55KD，与分子理论值基本一致。

该纤维素分解菌BY-2是从藏猪盲肠内容物中，经分离、筛选获得，与现有技术相比，具有以下优点：

1）BY-2是从藏猪盲肠内容物中筛选出的纯天然菌种，其发酵上清液具有很高的纤维素酶活性，该纤维素酶最适宜反应温度65℃，并在pH3-8之间可以保持80%以上的活性。因此，可以直接用于益生菌的开发、粪肥腐熟处理、纤维素酶提取、粗纤维降解等。

2）BY-2经pET系统表达后，具有较高的纤维素酶活性，证明克隆到的egls-BY基因能够进行外源表达。

附图说明

图1羧甲基纤维素平板筛选出的纤维素酶分解菌株；

图2连续划线培养得到的纯种纤维素分解菌株；

图3纤维素分解菌BY-2革兰氏染色；

图4纤维素分解菌BY-2的芽孢染色；

图5纤维素分解菌BY-2的16SRNA基因，该图中：M为markerIII，泳道1,2,3为16SrDNA基因条带；

图6纤维素分解菌BY-2的16SRNA基因系统发育树；

图7纤维素分解菌BY-2生长曲线及菌体干重；

图8葡萄糖标准曲线；

图9纤维素酶酶反应的最适pH值；

图10纤维素酶的pH稳定性；

图11纤维素酶酶反应最适温度；

图12纤维素酶的热稳定性；

图13纤维素酶酶反应最适时间；

图14碳源对纤维素酶活性的影响，该图中横坐标中的1-9分别代表不同碳源的编号。其编号从小到大所代表的碳源依次为：1%微晶纤维素；1%CMC；1%稻壳；1%玉米粉；1%麸皮；2%CMC；1%CMC+1%稻壳；1%CMC+1%玉米粉；1%CMC+1%麸皮；

图15氮源对纤维酶活的影响，该图中横坐标中的1-6分别代表不同氮源的编号。其编号从小到大所代表的氮源依次为：1%蛋白胨、1%酵母粉、蛋白胨酵母粉混合物（2:1）、蛋白胨酵母粉混合物（1:1）、1%尿素、1%硝酸铵；

图16发酵液起始pH对酶活的影响；

图17不同接种量及发酵时间对酶活的影响；

图18BY-2纤维素酶基因egls琼脂糖凝胶电泳图，该图中：M为D2000，泳道1-5为BY-2纤维素酶基因egls-BY目的条带，大小为1500bp；

图19纤维素内切酶基因egls-BY序列进化树；

图20枯草芽孢杆菌BY-2纤维素内切酶蛋白的疏水性预测；

图21纤维内切酶蛋白氨基酸的序列分析；

图22纤维素内切酶蛋白的空间结构；

图23纤维素酶基因pET28(a+)-egls表达载体的酶切鉴定；

图24重组菌株诱导表达2、4、6、8、10h结果图，该图中有透明圈的区域为重组菌pET-egls-BL21，没有透明圈的为空载体pET-BL21对照；其中（a）为2小时、（b）为4小时、（c）为6小时、（d）为8小时、（e）为10小时；

图25重组菌株的诱导表达后菌液离心后上清液纤维素酶活性；

图26纤维素酶基因表达产物的SDS-PAGE分析，该图中：A图为菌体细胞超声波破碎后上清液的SDS-PAGE电泳，1泳道是含质粒pET28（a+）的大肠杆菌细胞破碎内容物，2泳道是含质粒pET-egls的大肠杆菌诱导前的细胞破碎内容物，3、4、5、6、7泳道是含质粒pET-egls的大肠杆菌诱导2、4、6、8、10小时产物；M为蛋白质标准marker。B图为菌体细胞超声波破碎后沉淀的SDS-PAGE电泳，泳道分布泳道分布同A。

以下结合附图和具体试验及对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

益生菌是一类通过促进肠道微生物平衡对宿主动物产生有益影响的活的微生物饲料添加剂，最早应用于陆生动物。美国食品与药物安全管理局和美国饲料管理协会公布可以饲喂的微生物有43种，我国农业部2006年第658号公告中允许使用的饲料微生物添加剂有16种。目前常用的益生菌主要有乳酸杆菌制剂、芽孢杆菌制剂和真菌及活酵母类制剂等几种。而芽孢杆菌因其抗逆性强、耐高温高压、易贮存等优良特性,且具有调节肠道菌群平衡、增强动物免疫力、提高生产性能等诸多功能,被认为是最理想的微生物添加剂。微生态制剂的出现则在一定程度上解决了抗生素在动物生产实践应用中出现的一些问题，如残留、耐药性、二重感染和降低机体免疫力等。Fuller(1989)指出，直接饲喂活的微生物可刺激动物肠道免疫器官发育,提高动物抗体水平或提高巨噬细胞活性增强机体免疫功能。Jin等发现,肉仔鸡在10、20日龄饲喂0.05%乳酸杆菌混合物后,盲肠大肠杆菌数显著降低。于卓腾（2007）等研究发现，在出生仔鸡日粮中添加益生素和合生元可提高盲肠菌群的多样性和复杂性。Ozawa等通过给断奶仔猪饲喂枯草芽孢杆菌，发现消化道中枯草芽孢杆菌数量不断增加。这些研究说明，饲用芽孢杆菌的芽孢不但能在动物消化道中萌发，而且有自身增殖的能力。益生菌因具有种属特异性，因此，从藏香猪肠道中分离出纤维酶活性高的菌株，来研制和开发猪源的，能促进猪分解纤维素的益生菌具有一定的现实意义。

本发明从草食单胃动物-藏香猪盲肠中分离出的这种新型枯草芽孢杆菌可分泌大量的纤维素酶，因此，利用该菌株发酵生产用于养殖业的纤维素酶生产和猪源益生菌的开发具有一定的现实意义。

本发明的芽孢杆菌，分类命名是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BY-2，保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉大学）保藏编号为CCTCC NO：M2012535。

该枯草芽孢杆菌从藏猪盲肠内容物中分离，能产生纤维素酶，具有降解羧甲基纤维素钠的能力。在37℃，220rpm培养，菌株的产酶能力在20-28h时能达到最高。

申请人以Bacillus sublitis168trpC2的纤维素酶基因egls为依据，内切酶基因egls基因序列为参考，设计引物并成功扩增出了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BY-2的内切纤维素酶β-1,4葡聚糖酶基因egls-BY，并成功构建了纤维素内切酶基因egls-BY原核表达系统，于37℃、220rpm、菌液OD600达到0.8左右时，进行IPTG诱导，诱导8h时胞外酶活达0.96U/ml.min。

该枯草芽孢杆菌BY-2菌株在纤维素酶提取、粗纤维降解、微生物制剂的开发，特别是在选育草食猪，以及大力发展节粮性养殖业方面具有重要意义和广泛应用前景。

以下通过申请人给出的实施例进行详细说明。

实施例1：BY-2的分离筛选

1.1实验材料来源及采集

实验样品采集于西安添鑫藏香猪养殖基地的8月龄健康藏香猪，其日粮组成为青草、草糠和精饲料（玉米粉和小麦麸），其质量比例是青草60%、草糠20%、精饲料20%（玉米70%、麸皮30%）。实验猪屠宰后剖开腹腔，迅速分离盲肠，取20cm左右（取2份）的肠段，并在肠管两端用线绳结扎、剪断，装封口塑料袋中排气封口,放入冰盒迅速带回实验室。一份放入-80℃超低温冰箱冷冻保存用于后续实验，一份放入4℃冰箱并迅速用于分离肠道细菌。

1.2菌株的分离筛选

1.2.1培养基的配置

羧甲基纤维素钠筛选培养基（g/L):CMC-Na10g，蛋白胨5g，酵母粉0.5g，K₂HPO₄1.5g，MgSO₄·7H₂O0.2g，氯化钠5g,琼脂粉15g,蒸馏水定容到1L。基础摇瓶发酵培养基：普通液体LB培养基中加入1%的CMC。

LB培养基：胰蛋白提取物10g；酵母提取物5g；氯化钠5g；蒸馏水定容到1L。

1.2.2纤维素降解菌的初筛

称取藏猪盲肠内容物1g转移至盛有100mL无菌水的三角瓶中，在80℃电热恒温振荡水浴锅中振荡30min，即成10^-2肠道内容物稀释液，然后再按10倍稀释法依次梯度稀释成10^-3-10^-6肠道内容物稀释液。筛选培养基制成平板，然后用移液管分别取100ul涂于相应编号的平板上。涂好后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养48h，然后向培养皿中加入适量0.1%刚果红溶液染色1h；弃去染液，加入适量1mol/LNaCL溶液洗涤，lh后倒出NaCL溶液。用游标卡尺测平板上菌落周围水解圈的直径(D）和菌落直径(d)，并以两者比值(D/d)的大小作为初步判断分解能力的指标，挑选出透明圈直径与菌落直径比值大的菌落。该实验通过羧甲基纤维素平板筛选，从藏猪盲肠内容物中筛选出的一株纤维素分解菌的菌落周围水解圈直径(D=2.8cm）和菌落直径(d=0.8cm)比值达到3.5（图1）。把产生透明圈大的菌落进一步纯化直至成单菌落。每个单菌落划线培养五代，得到纯化菌株（图2）。

1.2.3纤维素降解菌发酵粗酶液的制备及复筛

将筛选出的菌株在LB板上划线，在37℃条件下活化培养，挑单克隆接种到50ml新鲜的液体LB培养基中，在37℃、220rpm条件下震荡培养到对数期，制成液体菌种。将制备好的液体菌种以1%的接种量接种入50mL摇瓶发酵培养基内，在37℃、220rpm发酵条件下，培养24h，于5000rpm、4℃条件下离心发酵液15min，上清液即为粗酶液，对粗酶液进行适当稀释用于纤维素酶活性的测定。最终以纤维素酶活力高低作为筛选高产纤维素菌株的标准。

实施例2：BY-2的鉴定

2.1形态学的特征

BY-2菌株在液体LB培养基中于37℃，220rph震荡培养12h，革兰氏染色后光学显微镜下观察，可见菌体形态杆状，被染色紫色，属于革兰氏阳性菌（图3）。

菌体其孢子形态：将培养至24h的菌液做涂片，用孔雀石绿染色法进行芽孢染色，芽孢被染成绿色，营养体染成红色（图4）。

2.2BY-2生理生化鉴定

根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》中的方法对实验菌株进行的生理生化特性指标测定。测定结果表明，实验菌株BY-2的生理生化特性和《常见细菌系统鉴定手册表》和《伯杰细菌鉴定手册》枯草芽孢杆菌的特性基本一致。因此，将该实验中筛选到的实验菌株初步鉴定为芽胞杆菌属的枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)或其变种。

表1BY-2菌株的生理生化鉴定结果

2.3BY-2的分子生物学鉴定

2.3.1BY-2菌株16SrRNA的基因片段序列测定

将冷冻保存BY-2菌种进行活化培养，当培养至对数期时(OD₆₀₀为1.0-1.5)，离心收集菌体，进行基因组DNA提取。细菌基因组DNA提取方法参照北京天根生化科技有限公司细菌基因组试剂盒提供的方法进行。然后用细菌通用引物（上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'，下游引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行细菌16SrDNA片段扩增。PCR25ul反应体系包括：DNA模板0.5ul(保证50-100ng/ul），上下游引物各1ul，mixTag酶12.5ul，无离子水补足25ul。PCR扩增条件为：反应条件为：95℃预变性5min；94℃30ｓ，55℃30s，72℃50s，35个循环；最后72℃延伸10min,4℃forever。1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果(图5），并对PCR扩增产物胶回收，并将回收产物连于pGEM-T载体，转入DH5α大肠杆菌感受态细胞，恢复培养1h后涂布于Amp抗性的固体LB培养基平板，37℃过夜培养。菌落PCR鉴定为阳性菌落后，送华大基因生物公司进行测序。将测序结果在在NCBI上用BLAST软件在GenBank中进行同源性分析，获取相近典型菌株的基因序列，利用Mega5.0构建系统进化树。

经测序，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BY-2的16SrDNA的基因序列长度是1511bp（Accession NO:KC414931）。其如SEQ ID NO:1所示。

2.3.2BY-2序列分析和系统进化树的构建

将测定的16S rDNA序列，与GenBank数据库中的所有已测定的原核生物16SrDNA进行比对，结果表明，该基因片段与多株枯草芽孢杆菌相似性达99%,但与已见报道的枯草芽孢杆菌遗传距离较远（图6），结合BY-2的形态学和生理生化特性，所以将本试验筛选的纤维素分解菌株命名为Bacillus subtilis BY-2。

实施例3：BY-2生长特性分析

将筛选出的菌株在LB板上划线，在37℃条件下活化培养，挑单克隆接种到5ml液体LB培养基中，在37℃、220rpm条件下震荡培养到OD₆₀₀在1.0-1.5之间，以1%的接种量接种入60mL新鲜LB培养基，4小时后间隔2h取样，直至29h,采用分光光度计法在600nm波长下测定其吸光度，绘制细菌生长曲线。

在测定菌液吸光值的同时，取2mL充分振荡均匀菌液,12000r/min离心2min,弃去上清液后,用0.9%生理盐水洗涤3次,在80℃烘干至恒重,称重,得到2mL菌液含干菌体重W1,然后换算成每升发酵液中干菌重:W1×500(g/L)。测定结果表明，BY-2在接种8h开始进入对数期，20h时进入平台期；菌体干重的变化趋势与细菌的生长保持一致，在20h达到最高（2.95g/L)，之后迅速下降(图7）。

实施例4：纤维素酶活测定及酶学特性分析

4.1BY-2纤维素酶活测定

葡萄糖标准曲线的制作及纤维素酶活性的测定方法参考中华人民共和国农业部发布的纤维素酶活力测定方法(NY/T912-2004)进行，并根据实际情况有所改动。

4.1.1所需试剂和缓冲液的配置

（1）0.1mol/LpH=5.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液：将65.0ml0.2mol/L醋酸钠溶液和35.0ml0.2mol/L醋酸溶液混合后加100ml蒸馏水。

（2）3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂：

称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml。

（3）葡萄糖标准溶液（10mg/ml）：称取1.000克葡萄糖（AR）(105℃干燥至恒重)用蒸馏水溶解后定容至100ml。

（4）羧甲基纤维素钠溶液：称2.0gCMC-Na溶于200ml蒸馏水中，加醋酸缓冲溶液100ml。

（5）缓冲溶液的配制

（a）不同pH的醋酸-醋酸钠缓冲溶液

表2不同pH醋酸-醋酸钠缓冲液配制

母液A：0.1mol/l冰醋酸溶液。

母液B：0.1mol/l无水乙酸钠溶液。

将母液按照表2比例配制，最终定容至100ml。

（b)磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH8.0)

取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使溶解成1000ml。

（c）甘氨酸–氢氧化钠缓冲液

母液A’：0.2mol/l甘氨酸；母液B’：0.2mol/l NaOH

缓冲剂配制：XmlA’溶液+YmlB’溶液加水稀释至200ml。

表3甘氨酸–氢氧化钠缓冲液

pH	A’	B’
			9.0	50	8.8
10	50	32.0

4.1.2葡萄精标准曲线的制作

标准空白样：吸取pH﹦5.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液4.0mL,加入DNS试剂5.0mL,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样。

分别吸取1.0mg/mL葡萄糖溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，分别用缓冲液定容至10mL,配制成浓度为0.1-0.7mg/mL的葡萄糖标准溶液。然后按照表4进行：

表4标准溶液配制比例

将上述各试管混合液，轻柔地摇动混匀，沸水浴加热5min，流水冷却后用蒸馏水定容至25mL，摇匀，在540nm吸收峰处测吸光度，以葡萄糖含量为纵坐标，以OD₅₄₀为横坐标作图，得葡萄糖浓度和OD₅₄₀的关系曲线（图8）。

4.1.3纤维素酶活力的测定

粗酶液的制备按照实例实施2中BY-2复筛中的方法进行。

AB：2mL经适当稀释的酶液加入5mLDNS，混匀，再加入2mL底物，混匀，沸水煮沸5min，定容至25mL，以标准空白样为空白，在适宜的波长条件下测定吸光值。

AE:2mL经适当稀释的酶液加入2mL底物,混匀,40℃准确反应30min，再加入5mLDNS，混匀，沸水煮沸5min,，定容至25mL，以标准空白样为空白，在适宜的波长条件下测定吸光值。

4.1.4酶活力的计算：

计算公式:X_D=[(AE-AB)×K+C_O]/(M×t)×1000  式(1)

式(1)中:X_D为试样稀释液中的纤维素酶活力,u/mL；A_E为酶反应液的吸光度；A_B为酶空白样的吸光度；K为标准曲线的斜率；C_O为标准曲线的截距；M为葡萄糖的分子量(180·2)；T为酶解反应时间,min；1000为转化因子,1mmol=1000μmol。X_D值应在0.04-0.08u/mL之间,如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定。

X=XD·Df  式(2)

式(2)中:X为试样纤维素酶的活力,u/g；Df为试样的总稀释倍数。

4.2纤维素酶酶学特性的研究

以下酶活性测定方法和计算方法按照实施方案4中的方法进行。

4.2.1酶反应的最适pH值（图9）

分别配制pH为4.0，4.4，4.6，4.8，5.0，5.5，6.0，6.5、7.0的0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，用不同pH的醋酸钠缓冲液稀释粗酶液，然后用相应pH的0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液配制1%的羧甲基纤维素钠溶液，其它条件不变(40℃，反应30min)进行酶活性测定。

4.2.2纤维素酶的pH稳定性（图10）

用不同的缓冲液：醋酸和醋酸钠缓冲液（pH3.0-7.0）,磷酸盐缓冲液(pH8.0)以及甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0-10.0)配制pH梯度为pH3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的缓冲液。然后将一定量的粗酶液与不同pH的缓冲液1:1混合，在4℃冰箱中放置24h后，取出在最适pH下按常规方法定纤维素酶活，得到该纤维素酶对酸碱的耐受性（相对于最高酶活的百分比)。

4.2.3酶反应最适温度（图11）

在25mL试管中加入2.0mL1.0%CMC溶液（用最适pH缓冲液配置）与2.0mL适当倍数稀释的粗酶液，均匀混合后分别于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃下分别反应30min，测定其酶活力。

4.2.4纤维素酶的热稳定性（图12）

将纤维素酶粗酶液分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃条件下处理1h，然后在最适pH和温度下测定其酶活力。

4.2.5酶反应最适时间（图13）

底物和粗酶液在最适pH和温度条件下反应5min、10min、15min、20min30min、35min、40min来测定不同反应时间纤维素酶的活力。

BY-2纤维素酶的酶学特性分析结果表明：纤维素酶的最适反应条件为pH5.5，65℃，反应5min。耐酸碱性试验结果表明：纤维素酶在pH3-8范围内放置24h后，其相对酶活均在80%以上。耐热性分析表明，粗酶液在不同温度下温浴1h，在40-50℃范围内其相对酶活能够达到80%以上，当温度达到80℃以上时，该酶几乎失活。

实施例5：BY-2发酵条件的优化

在基础摇瓶发酵培养基（LB+1%CMC)的基础上，对BY-2的发酵条件进行了优化。

5.1不同碳源对产酶的影响（图14）

将产酶发酵培养基中的的碳源及浓度改变，培养基其它成分相同，将种子液按1%接种量接种，37℃220rmp振荡培养24h后进行酶活测定。碳源分别为1%微晶纤维素、1%CMC、1%稻壳、1%玉米粉、1%麸皮以及2%CMC、1%CMC+1%稻壳、1%CMC+1%玉米粉、1%CMC+1%麸皮。结果表明，当碳源为1%的玉米粉时，BY-2的纤维素酶活最高（2.86U/ml.min)，而BY-2几乎不利用微晶纤维素，说明BY-2主要分泌纤维素内切酶。

5.2不同氮源对产酶的影响（图15）

在确定了最佳碳源基础上，添加不同氮源（1%蛋白胨、1%酵母粉、蛋白胨酵母粉混合物（2:1）、蛋白胨酵母粉混合物（1:1）、1%尿素、1%硝酸铵)，培养基其它成分相同，将种子液按1%接种量接种，37℃、220rmp振荡培养24h后进行酶活测定。结果表明，BY-2几乎不利用无机氮源，在有机氮源中，BY-2的最佳氮源为蛋白胨和酵母粉混合物（1:1）。

5.3培养基起始pH值对产酶的影响（图16）

将产酶发酵培养基的起始pH调成4.0、5.0、6.0、8.0以及自然pH,按1%接种量接种,37℃220rmp振荡培养24h后进行酶活测定。结果表明，当起始pH值为4时，酶活最高（2.74U/ml.min），其次为自然pH值发酵液中（2.4U/ml.min），当起始pH值为5时又突然下降，之后又继续上升，8时又继续下降。推测可能是BY-2在过酸的条件下发酵，致使菌体破裂，菌体胞内酶释放的缘故。因此，发酵培养基起始pH值在后续试验中以自然pH值为准（在5.5-6.0之间）。

5.4不同接种量对菌株产酶能力的影响（图17）

在以上碳源、氮源和起始pH基础上，分别按1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的接种量接种，在不同发酵时间取样测定纤维素酶活。结果表明，随着接种量的加大，细菌进入对数期的时间也加快，同时开始发酵产酶的时间也早。其中当接种量为5%和6%时，20h时纤维素分解菌的产酶能力达到最强，20h以后，产酶能力逐渐下降；接种量为1-3%的纤维素分解菌，均在28h产酶能力达到最高，其中4%接种量的发酵液在24h时酶活最高（3.4U/ml.min)，之后逐渐下降。但不同接种量的发酵液在发酵至36h开始，均出现酶活增高的现象，可能是细菌衰老期死亡后，胞内酶释放的原因。

实施例6：芽孢杆菌BY-2纤维素内切酶维素酶β-1,4葡聚糖酶基因的克隆与分析

6.1芽孢杆菌BY-2纤维素内切纤维素酶-β-1,4葡聚糖酶基因的克隆

6.1.1纤维酶基因egls的PCR扩增

按照北京天根生化科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒要求提取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BY-2基因组DNA，以NCBI上所发布的枯草芽孢杆菌（strain168trpC2）的纤维素酶基因egls为依据，利用primer primer5.0设计引物，添加适当的酶切位点，扩增目的片段，引物序列见下表。

表5纤维素酶基因egls引物序列和酶切位点

表6纤维素酶基因egls PCR反应体系

PCR扩增程序如下：95℃反应5min，94℃反应30s，58℃反应30s，72℃反应90s，72℃10min，其中94℃、58℃和72℃条件下循环35次，最后置于4℃。PCR扩增结束后，采用1.2%浓度的琼脂糖电泳进行检测（图18）。

6.1.2PCR产物回收

利用Bio-Flux胶回收试剂盒对PCR产物进行回收。详细步骤如下：

A：用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5ml干净离心管中；

B：按1：3的比例（凝胶质量毫克数：溶胶液体积微升数）加入Extraction Buffer，于50℃水浴中孵育，直至凝胶融化。

C：将混合液全部转移到Spin column内，6，000g离心一分钟，并弃去接液管内的液体。

D：向Spin column内加入500μl Extraction Buffer，于12,000g离心30～60S，并弃去接液管内液体。

E：向Spin column中加入750μl的Wash Buffer，室温放置2～5min，于12,000g离心30～60S，弃去接液管内液体。

F：再次于12,000rpm离心1min，然后将Spin column转移到1.5ml离心管内。向Spincolumn中加入50μl的ddH2O，并室温放置1min。

G：12,000g离心1min，微量离心管内含有DNA目的片段，于-20℃保存。

6.1.3连接转化

用Fermentas公司的连接试剂盒，将PCR回收产物与pGEM-T vector在22℃条件下连接10min，连接体系如下：

表7连接体系表

将连接产物转入DH5αCompetent cells中，具体转化步骤如下：

A：于-80℃冰箱中取感受态细胞并于冰浴中融化。

B：加入101.0μl连接产物，并冰上放置30min。

C：于42℃水浴中热激60～90S。

D：从冰浴中取出连接产物，冰中放置2～3min。

E：加入900μl液体无抗性的LB培养基，并于37℃，150rpm恢复培养45min。

F：将转化产物4000rpm离心2min，弃去适量上层清夜，适量涂于氨苄抗性的LB培养平板中，37℃过夜培养。

6.1.4插入片段的PCR检测

挑取培养平板上的单克隆，分别以纤维素酶基因egls-BY的上下游引物进行扩增，PCR扩增体系、反应程序、琼脂糖检测与目的基因扩增条件相同（表5），将检测为阳性克隆的菌液保存，并送样进行测序。测序表明，克隆的BY-2（Bacillus subtilis）的内切纤维素酶-β-1,4葡聚糖酶基因序列如SEQ ID NO:2所示。

6.2纤维素酶基因egls-BY序列进化树（图19）

表8枯草芽孢杆菌纤维素内切酶基因登陆号

将纤维素酶基因序列提交至Genbank(accession number:KC814696），通过序列分析发现，基因egls-BY与已报道的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因（如：CP003783.1,Z29076.1,XO4689.1,X67044.1,AY66381.1，EF070194.1等）十分相似，相似度为99%。说明克隆的纤维素酶基因egls-BY与与其他芽饱杆菌植酸酶基因既有高度同源性，又存在一定的差异，是新的基因序列。同时也可以说明筛选得到的产纤维素酶的菌株为枯草芽孢杆菌。

6.3egls-BY基因的生物信息学分析

6.3.1纤维素内切酶蛋白的氨基酸序列分析

用DNAssist分析软件对纤维素酶基因egls-BY的氨基酸序列进一步分析发现，该蛋白（499aa)由20种氨基酸构成（如表9所示），其中含量最高的三种氨基酸为：甘氨酸（Glycine，45%，9%)、赖氨酸(Lysine，45，9%)、天冬酰胺（Asparagine，38,7%）；而含量最少的三种氨基酸为：半胱氨酸（cysteine，3,0%），组氨酸（histidine,7,1%），蛋氨酸（methionine,7,1%)。可见不同氨基酸的含量差异很大。根据纤维素酶蛋白的氨基酸序列计算出来的分子量理论值为55KD，和实际测得的分子量基本一致（55KD左右）。此外，通过预测分析，纤维素内切酶的等电点为8.6，因此，该实验中细菌BY-2分泌的纤维素酶属于碱性蛋白酶。

表9BY-2纤维素内切酶蛋白物理生化特性.

6.3.2BY-2纤维素内切酶蛋白的疏水性预测

蛋白质分子的基本特征之一，是亲水的极性部分位于分子表面，可与亲水环境接触，疏水的非极性部分折叠在分子内部。根据各种残基的极性和氨基酸的序列能了解蛋白质一级结构中不同肽段的极性，进而估计不同肽段在分子内外的定位。用DNAssist软件包的Protean软件估测了本基因的疏水区（图20）。推导该蛋白多肽链有10段主要的疏水区，分别位于氨基酸序列的4-30位、86-95位、120-130位、185-194位、196-205位、250-258位、265-274位、410-418位、420-425位、492-495位。与疏水区相比，亲水区占据了该蛋白质多肤链的大部分区域，特别是在位于肽链的30-85位、135-185位、272-492位这三个亲水区相当大。不难看出，此蛋白质肽链表现出较强的亲水性。6.3.3纤维素酶蛋白结构预测

对egls-BY基因编码的499个氨基酸序列进一步分析发现，氨基酸序列由糖基水解酶家族5中的一个纤维素酶和N末端的纤维素绑定区域(CBM-3)组成（图21）。与枯草芽孢杆菌纤维素酶如：CAA97610.1,ACK38261.1、AAK94871.1、AAK39540.1、AAO63626.1等具有99%以上的相似性，属于纤维素分解酶BglC的家族。

同时，通过蛋白质的氨基酸序列，与已知蛋白的三维结构进行同源模建，预测蛋白的三维结构。采用Swiss Model（http://swissmodel.expasy.org/）对枯草芽抱杆菌BY-2纤维素酶蛋白的三级结构预测分析（图22），结果表明，本研究中的枯草芽抱杆菌BY-2纤维素酶与蛋白质数据库中The Endo-1,4-beta-glucanase from bacill168具有99.66%的相似性，具有相同的三维构象。

实施例7：芽孢杆菌BY-2纤维素内切酶基因egls-BY的原核表达

7.1BY-2纤维素内切酶基因的原核表达

7.1.1原核表达载体的构建

将保存的含重组质粒pGEM-egls的菌液和含表达载体pET28(a+)的菌液分别于氨苄抗性和卡那霉素抗性的的LB平板上划线，用灭菌的牙签挑取单克隆摇菌培养，并提取质粒。将提取的质粒均采用BamHI和Hand III于37℃水浴中，进行双酶切。双酶切体系如下：

表10质粒双酶切体系

将酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。将鉴定正确（图23）的目的基因片段egls-BY和线性化的pET28a（a+）片段进行胶回收、连接。

表11egls-BY和pET28a（a+）片段的连接体系

将连接产物在22℃条件下连接10min，转化至感受态细胞DH5α内，涂板（卡那霉素抗性），37℃恒温箱过夜培养，经蓝白斑筛选和菌落PCR检测后，挑选阳性克隆并提取质粒。然后将表达载体质粒pET-egls转入BL21(DE3)感受态细胞中，转化产物4000rpm离心2min，并取适量转化产物涂到卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆，进行摇菌培养，以目的基因克隆时的引物为引物进行PCR鉴定阳性克隆并将鉴定正确的重组子进行冷冻保存。将重组子阳性克隆命名为pET-egls-BL21。同时做pET-28(a+)空载体转化BL21，以做对照。

7.1.2重组菌株pET-egls-BL21的诱导表达

（1）重组菌株的诱导表达

将重组菌pET-egls-BL21于卡那霉素抗性的LB平板上划线过夜培养后挑取单菌落，接种至到含卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm培养12h后，按1:50的比例，接种于新鲜的LB（卡那抗性）液体培养基中，震荡培养至对数生长期（OD600在0.5-0.8）时，补加终浓度为1mmol/L的IPTG(加入IPTG前取样）诱导，分别在诱导2、4、6、8、10h时取样2份，并将其中一份点接在含CMC-Na、IPTG的LB平板(含卡那抗性100ug/L)上培养2天后，采用刚果红染色法观察是否有水解圈，同时以不含有内切葡聚糖酶基因的空载体pET-28(a+)为对照。研究结果表明，重组菌pET-egls-BL21在诱导2、4、6、8、10h时，在CMC-Na、IPTG的LB平板上菌有透明圈的产生（图24），说明重组菌pET-egls-BL21中的纤维素酶基因在IPTG的诱导下能够进行外源表达。

（2）重组菌株的诱导表达后纤维素酶活性的测定

重组菌株pET-egls-BL21在诱导表达2、4、6、8、10h的样品，在4℃下，4000rpm离心10min，收集上清液和菌体沉淀。上清液用于菌液的酶活测定。结果表明（图25）：用TPTG诱导2-8h，菌液OD600值几乎没有变化，诱导10h，菌液OD值开始下降。而菌液中纤维内切酶的活性，则随着诱导时间的延长不断升高，在8h时菌液酶活力达到最高（0.94U/ml.min），10h时菌液酶活已经下降至0.79U/ml.min。

7.1.3重组菌株的SDS-PAGE分析

（1）蛋白样品的制备及预处理

取诱导表达前、后的菌悬液及不含有内切葡聚糖酶基因的空载体菌悬液各lmL，12000r/min离心2-3min，去尽上清。用1/20体积的预冷的PBS缓冲液（pH7.0）lmL洗细胞，12000rpm，离心10min，弃上清，反复洗2-3次。加1mL的PBS缓冲液，放到-80℃冰箱中，反复冻融3-5次，在冰上用超声破碎仪进行破碎细胞（破碎5s，间歇10s，功率400W全程30min）。细胞破碎液在4℃下12，000rpm离心20min，分别收集上清液(可溶性蛋白)和沉淀物(不溶性蛋白)待进行蛋白样品的预处理。

将收集到的的上清液取适量加入5×SDS loading buffer（已经加过DTT），混匀、短暂离心，煮沸10min，离心1s，即为处理的上清液蛋白样品。

细菌裂解后的沉淀物加PBS缓冲液（pH7.0）200ul，按比例加入5×SDS loading buffer（已经加过DTT），混匀、短暂离心，煮沸10min，离心1s，即为处理的沉淀物蛋白样品。

（2）试剂的配置

试剂配置参照《分子克隆》第三版（下册）中SDS-PAGE方法配置。

（3）胶的配置

表12SDS-PAGE分离胶和浓缩胶的配置比例

（4）电泳

具体步骤参照分子克隆《分子克隆》第三版（下册）中SDS-PAGE方法进行。电流设置30mA，电压8V/cm～11V/cm电泳，直至溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处停止电泳，大概需要3个半小时。

（5）电泳完毕后，考马斯亮蓝R250染色，脱色，观察表达产物条带。

纤维素酶基因原核表达产物的SDS-PAGE分析结果表明：含质粒pET-egls的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导后，菌体细胞超声波破碎离心后的上清液和沉淀中，在55KD处均出现了一条新生蛋白条带，证明外源基因在大肠杆菌中成功表达。但由图26A看出，质粒pET-egls的大肠杆菌BL21（DE3)在诱导2、4、6小时能清楚看到目的条带，但在8、10h时目的条带很淡；而图24B电泳结果显示，表达菌株在IPTG诱导2、4、6、8、10h时，均有明显的目的条带，说明表达产物主要以包涵体形式存在于细胞质中，而以可溶性蛋白形式存在的量少。

Claims (5)

1.一种藏猪源芽孢杆菌，其特征在于，该芽孢杆菌的分类命名是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BY-2，保藏编号为：CCTCC NO：M2012535；所述枯草芽孢杆菌BY-2的16SrDNA的序列如SEQ ID NO:1所示。 

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BY-2，其特征在于，由所述枯草芽孢杆菌BY-2克隆的内切纤维素酶β-1,4葡聚糖酶基因命名为egls-BY，基因序列如SEQ ID NO:2所示。 

3.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌BY-2用于内切纤维素酶β-1,4葡聚糖酶提取的应用，编码内切纤维素酶β-1,4葡聚糖酶的基因序列如SEQ ID NO:2所示。 

4.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌BY-2用于粗纤维降解的应用。 

5.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌BY-2用于制备降解粗纤维的微生物制剂的应用。