CN101392241A - β-甘露聚糖酶及基因和制备方法以及载体和宿主细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种β－甘露聚糖酶，该β－甘露聚糖酶具有SEQ ID：NO.2所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.4所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.6所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列，或者对SEQ ID：NO.2、SEQ ID：NO.4、SEQ ID：NO.6或SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而得到的β－甘露聚糖酶活性不变的氨基酸序列。本发明还提供了编码上述β－甘露聚糖酶的基因、含有所述基因的重组载体和含有所述重组载体的宿主细胞。本发明还提供了一种β－甘露聚糖酶的制备方法，该方法包括培养本发明提供的宿主细胞。本发明提供的β－甘露聚糖酶具有耐热耐酸性，可以利用本发明构建的原核表达系统进行生产，而且可以利用六个组氨酸标签进行纯化。

Description

β-甘露聚糖酶及基因和制备方法以及载体和宿主细胞

技术领域

本发明是关于一种β-甘露聚糖酶及其编码基因和制备方法，以及含有该基因的重组载体和重组宿主细胞。

背景技术：

甘露聚糖酶是一类能够水解半纤维素中第二大组分——异甘露聚糖的内切酶，在医药、食品、饲料、造纸、纺织、印染、洗涤、石油开采及生物技术等诸多领域得到了广泛应用。例如：甘露聚糖酶可作为饲料酶添加剂，饲料中添加甘露聚糖酶可补充内源消化酶不足，消除和降解饲料原料中的抗营养因子，促进畜禽生长，减少养殖污染(Lee，et al.，Poultry Science，82：1925-1931，2003)；可水解甘露聚糖型植物胶(如角豆胶、瓜儿豆胶、魔芋等)，生成具有增殖双岐杆菌生理功效的低聚甘露糖，具有较大的市场前景。

β-甘露聚糖酶的来源非常广泛，细菌中的芽孢杆菌属、气单胞菌属、肠杆菌属、假单孢菌属和链霉菌属，丝状真菌和酵母，以及高等植物和某些低等动物中都发现了甘露聚糖酶。各种不同来源的β-甘露聚糖酶，在活性大小及对环境条件的要求等方面，大多存在或多或少的差别。工业生产一般需要经过高温过程，所以能够进行工业生产的甘露聚糖酶需要具有一定的耐热性(最好具有60-70℃的耐热性)。如果要用于饲料或食物添加剂，还需要具备一定的耐酸性，这是因为尽管消化碳水化合物的主要过程发生在中性微酸的小肠和其它消化道中，但是食物或饲料还是要经过胃部的酸性环境。目前分离到的黑曲霉(Aspergillus niger)AS2710菌株产生的甘露聚糖酶能够较好地满足以上两点，该酶耐热性能好，工作温度范围是30-85℃，最适反应温度70℃；反应pH2-9.2，最适pH3.0-3.8(丁宏标等，中国专利CN01144782.6，2001年)。然而，黑曲霉AS2710菌株的甘露聚糖酶基因还没有克隆得到，其表达主要是通过黑曲霉AS2710菌株发酵，该菌发酵周期长(5天以上)，另外因为没有有效的启动子控制，也不容易实现甘露聚糖酶基因的高效表达，且该酶没有有效的亲和标签，不利于快速方便地纯化。

发明内容：

本发明的一个目的是克服目前没有适于原核表达且易于纯化分离的耐酸耐热的β-甘露聚糖酶的缺陷，提供一种适于原核表达且易于纯化分离的耐酸耐热的β-甘露聚糖酶。

本发明的第二个目的是提供编码该β-甘露聚糖酶的基因。

本发明的第三个目的是提供含有该基因的重组载体。

本发明的第四个目的是提供含有该重组载体的宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供所述β-甘露聚糖酶的制备方法。

本发明提供了一种β-甘露聚糖酶，该β-甘露聚糖酶具有SEQ ID：NO.2所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.4所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.6所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列，或者对SEQ ID：NO.2、SEQ ID：NO.4、SEQ ID：NO.6或SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而得到的β-甘露聚糖酶活性不变的氨基酸序列。

本发明提供了一种编码本发明提供的β-甘露聚糖酶的基因。

本发明提供了一种重组载体，该重组载体含有本发明提供的基因。

本发明提供了一种重组宿主细胞，该宿主细胞含有本发明提供的重组载体。

本发明提供了一种β-甘露聚糖酶的制备方法，该方法包括培养本发明提供的宿主细胞。

本发明提供的β-甘露聚糖酶能够水解各种含有β-1，4甘露糖苷键的甘露聚糖，生成寡糖，其最适作用条件是pH 5-5.5，60-65℃，能够作为食物或饲料添加剂，适应胃部的酸性环境，而且能够满足工业生产对耐热性的需要。虽然，之前已经分离到的黑曲霉(Aspergillus niger)AS2710菌株产生的甘露聚糖酶，具有耐热耐酸性，但是其生产方法是真菌发酵的方法，存在周期长、产量低的缺点，而本发明提供的β-甘露聚糖酶可以利用本发明构建原核表达系统进行生产，克服了上述真菌发酵的缺点。另外，本发明中的重组甘露聚糖酶，表达后具有六个组氨酸标签，纯化十分方便。

本发明涉及的重组宿主细胞为含有SEQ ID：NO.1的重组克隆载体转化菌株DH5α(pUC1.17)，分类命名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为Escherichiacoli，于2007年5月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2051。

附图说明

图1：SEQ ID：NO.6所示的β-甘露聚糖酶和E159A突变体的SDS-PAGE电泳图；

图2：SEQ ID：NO.6所示的β-甘露聚糖酶活性随温度和pH变化的曲线图。

具体实施方式

本发明提供的β-甘露聚糖酶具有SEQ ID：NO.2所示的氨基酸序列，SEQID：NO.4所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.6所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列，或者对SEQ ID：NO.2、SEQ ID：NO.4、SEQ ID：NO.6或SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而得到的β-甘露聚糖酶活性不变的氨基酸序列。

组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。例如，本领域技术人员公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser和Asn、Ala和Val、Ser和Gly、Tyr和Phe、Ala和pro、Lys和Arg、Asp和Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，两两之间相互取代，不会影响蛋白的立体结构和功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述β-甘露聚糖酶的任意一个氨基酸残基位置上。

本发明提供的β-甘露聚糖酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的β-甘露聚糖酶具有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

所述β-甘露聚糖酶优选具有SEQ ID：NO.2所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.4所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.6所示的氨基酸序列，或者SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列，更优选具有SEQ ID：NO.2或SEQ ID：NO.6所示的氨基酸序列。

本发明提供了一种编码本发明提供的β-甘露聚糖酶的基因。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的β-甘露聚糖酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述β-甘露聚糖酶活性一致的氨基酸序列。

优选情况下，编码本发明提供的β-甘露聚糖酶的基因具有SEQ ID：NO.1所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.3所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.5所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.7所示的核苷酸序列，或者对SEQ ID：NO.1、SEQ ID：NO.3、SEQ ID：NO.5或SEQ ID：NO.7所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码活性不变的β-甘露聚糖酶的核苷酸序列。更优选的情况下，编码本发明提供的β-甘露聚糖酶的基因具有SEQ ID：NO.1所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.3所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.5所示的核苷酸序列，或者SEQ ID：NO.7所示的核苷酸序列。进一步优选的情况下，具有SEQ ID：NO.1或SEQ ID：NO.5所示的核苷酸序列

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

本发明提供的重组载体含有本发明提供的基因。

优选所述重组载体为重组质粒pUC1.17或重组质粒pETMAN-HA963。在本发明中，所述“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pUC18或pET28a质粒。重组载体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(如对于pUC18，可用Sal I、BamH I、EcoR I等；对于pET28a，可用Nde I、Nhe I、EcoR I、BamH、HindIII等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用SalI切割pUC18及与其连接的基因片段。Nhe I和HindIII双酶切pET28a及与其连接的PCR产物片段，经连接酶连接，分别构建重组载体pUC1.17和pETMan-HA963。

本发明提供的重组宿主细胞含有本发明提供的重组载体。

可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母或各种动植物细胞，更优选所述宿主细胞为大肠杆菌。

本发明还提供的制备β-甘露聚糖酶的方法包括培养本发明提供的重组宿主细胞。所述培养条件为常规的培养条件，如使用LB培养基(酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，NaCl 10克/升)，在37℃下培养。由于本发明提供的重组宿主细胞中含有编码β-甘露聚糖酶的基因，可以高效地表达β-甘露聚糖酶。培养后经过分离提纯，即可得到高纯度的β-甘露聚糖酶。

下面的实施例将对本发明作进一步的描述。

实施例1.含有SEQ ID：NO.1所示的β-甘露聚糖酶基因的重组质粒pUC1.17和转化菌株DH5α(pUC1.17)的构建

从云南腾冲热泉(pH2，90℃)采集水样2L，经0.22μm微孔滤膜(Milipore公司)过滤收集水样中的菌体，用STE缓冲液(0.1M NaCl；10mMTris-HCl，pH8.0；1mM EDTA，pH8.0)洗下滤膜上的菌体，离心4000rpm，10min，得菌体新鲜湿重约0.5g。菌体沉淀物用UltraClean^TM Soil DNA Kit提取总DNA(100μl，4μg/μl)，测定吸光度比值为：A260/A280＝1.947，A260/A230＝2.15。取上述总DNA溶液50μl(约含200μg DNA)，用限制酶Sal I酶切，酶切体系中含有5μl Sal I酶(20U/μl)，5μl Buffer1(10mMKCl，10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，200μg/ml BSA，50％甘油，NEB公司)，35μl去离子水，37℃温育4h充分反应。反应产物经琼脂糖凝胶电泳回收2-4kb DNA片段，溶于50μl TE(10mM Tris-Cl，pH8.0；1mMEDTA，pH8.0)溶液中，即得环境基因组DNA。采用与酶切基因组相同的反应体系和条件用Sal I酶切pUC18质粒，琼脂糖凝胶电泳回收后溶于30μl去离子水中(浓度约10μg/μl)，加入1μl热敏磷酸酶(5U/μl，NEB公司生产)，5.6μl10倍热敏磷酸酶反应缓冲液(NEB公司生产)，37℃反应30min，再于65℃水浴5min使磷酸酶失去活性，12000rpm离心10min后，上清即为去磷酸化的pUC18质粒DNA溶液。取2μl此质粒DNA溶液与14μl上述环境基因组DNA溶液混合，另外加入2μl 10X连接酶缓冲液和2μl的连接酶(10U/μl，NEB公司生产)，4℃条件下过夜连接，得连接混合物。取4支含50μl电转化感受态细胞的1.5ml离心管，于冰浴中融化10min后，每管加入上述连接混合物2μl，混匀，冰浴2min，然后将其转入已预冷的电转槽中，电击(1.8kV，电容25vF，电击时间5ms，如无特别说明，本说明书均采用此条件进行电击转化)后迅速加入液体LB培养基1ml，混匀后于37℃摇床培养，转速220rpm，50min后按100μl/平板涂布于含有安苄青霉素(100μg/mL)、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal，20μg/mL)和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，20μg/mL)的LB(LB培养基的基本成分为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，NaCl 10克/升)平板上，37℃培养15h。获得了近10000个克隆子。克隆子经过substrate overlay method(参看Teather，R.M.，and P.J.Wood，Applied and Environmental Microbiology 43：777-80，1982)活性测定，筛选得到一个具有甘露聚糖酶的阳性克隆子，经测序公司(均尧公司，北京，下同)对其插入片段进行测序，该插入片段的序列如SEQ ID：NO.9所示，该序列中自核苷酸175位至1137位为一个编码基因，该基因的序列如SEQID：NO.1所示，可以得知SEQ ID：NO.1所示的基因即为甘露聚糖酶manA基因，编码的氨基酸序列如SEQ ID：NO.2所示。该阳性克隆子即为含有SEQID：NO.1所示序列的重组克隆载体转化菌株DH5α(pUC1.17)(此菌种已保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2051)。转化菌株DH5α(pUC1.17)中的重组质粒pUC1.17(含有SEQ ID：NO.1所示的序列)可用于进一步构建表达载体。

实施例2.β-甘露聚糖酶表达载体和转化菌株的构建：

根据SEQ ID：NO.1所示的核苷酸序列(manA序列)，合成正反向引物，正向引物为5’-GTGCGCTAGCATGGGACG-3’，下划线部分为Nhe I的酶切位点，反向引物为5’-GCGAAGCTTTCATCGATTTG-3’，下划线部分为HindIII的酶切位点。采用这两个引物，以质粒pUC1.17为模板，利用下面PCR反应体系(Taq DNA聚合酶及其缓冲液、dNTP采用天根公司成品)：

10X缓冲液              5μl

dNTP                   4μl

Taq DNA聚合酶          0.5μl

正向引物(25pM)         1μl

反向引物(25pM)         1μl

pUC1.17模板(1μg/μl)    1μl反应条件：94℃预变性4min，然后94℃变性30秒-50℃退火30秒-72℃延伸1min30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒(超薄离心柱型，天根公司生产)纯化。纯化后用Nhe I和HindIII双酶切该PCR产物，反应体系为50μl PCR产物、Nhe I(10U/μl，NEB公司)和HindIII(10U/ul，NEB)各5μl、10μl Buffer2(50mM NaCl，10mM Tris-Cl，10mM MgCl2，1mM DTT，NEB公司)，30μl去离子水，37℃温育4h，琼脂糖电泳回收。质粒pET28a经同样条件双酶切，电泳回收。所回收双酶切PCR产物和质粒进行连接(连接酶用量、反应条件同实施例1)，构建成pETMan-HA963重组表达载体。此重组载体电击转化大肠杆菌BL21(DE3)后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养15h，即得含有SEQ ID：NO.1所示序列的重组表达载体的转化菌株Man-HA963。由于连接到pET28a的SEQ ID：NO.1所示序列与pET28a中编码组氨酸标签的序列处于同一阅读框，实际获得的蛋白质序列如SEQ ID：NO.6所示，与SEQ ID：NO.2相比，该序列在前端多了23个由pET28a上游序列编码的氨基酸，其中包括用于分离纯化的六个组氨酸标签。编码SEQID：NO.6的核苷酸序列如SEQ ID：NO.5所示。

实施例3.甘露聚糖酶基因突变体的制备

以实施例2的表达载体pETMan-HA963为模板，采用Stratagene公司的定点突变试剂盒(QuikChange site-directed mutagenesis kit)，参照说明书，通过在引物中引入突变碱基并进行PCR扩增，将SEQ ID：NO.1所示的核苷酸序列在476位A突变为C，获得含有该突变体的载体pETMan-E159A。该突变体的核苷酸序列经北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，结果如SEQID：NO.3所示，实现了预设的点突变，即，与SEQ ID：NO.1相比，该突变体基因的核苷酸序列在476位A突变为C，三联体密码子GAA变为GCA，相应的氨基酸序列(如SEQ ID：NO.4所示)159位氨基酸Glu变为Ala。按照与实施例2相同的方法，将此重组质粒pETMan-E159A电击转入大肠杆菌BL21(DE3)，含有此重组质粒的大肠杆菌称为Man-HA963-E159A。由于连接到pET28a的SEQ ID：NO.3所示序列与pET28a中编码组氨酸标签的序列处于同一阅读框，实际获得的蛋白质序列如SEQ ID：NO.8所示，与SEQ ID：NO.4相比，该序列在前端多了23个由pET28a上游序列编码的氨基酸，其中包括用于分离纯化的六个组氨酸标签。编码SEQ ID：NO.8的核苷酸序列如SEQ ID：NO.7所示。

实施例4.重组β-甘露聚糖酶的表达和纯化

将上述含有重组表达载体的转化菌株Man-HA963培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基(基本成分为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，NaCl 10克/升)中，37℃培养3h，OD₆₀₀＝0.7，加入IPTG至终浓度为0.8μM，转至30℃继续培养4h。5000rpm，10min离心收集菌体，悬浮于溶液A(20mM Tris-Cl，pH 7.9，0.5M NaCl，10mM咪唑)中，于冰浴中超声破碎(60W，10min内循环超声，超声2s，停止2s，防止溶液过热导致蛋白失活)，之后15000rpm离心10min除去细胞碎片，上清过Ni-IDA His·Bind Superflow纯化柱，用5ml溶液A冲洗，再用10ml溶液B(20mM Tris-Cl，pH 7.9，0.5M NaCl，60mM咪唑)漂洗，最后用5ml溶液C(20mM Tris-Cl，pH 7.9，0.5M NaCl，500mM咪唑)洗脱，收集洗脱液。然后将洗脱液用FPLC(快速蛋白液相层析)的脱盐、凝胶过滤和离子交换层析柱分别进行纯化，获得纯化蛋白。Man-HA963-E159A的培养和甘露聚糖酶突变体的纯化同上，获得甘露聚糖酶突变体E159A。10％ SDS-PAGE电泳(120V，2h，25℃)显示所得重组蛋白均显示为一条纯的单一蛋白带(如图1所示，图1中泳道1表示低分子量蛋白Marker，泳道2表示SEQ ID：NO.6所示的蛋白，泳道3为SEQ ID：NO.8所示的突变重组蛋白)。SDS-PAGE电泳显示SEQ ID：NO.6所示的蛋白和突变蛋白的分子量均为约36kD左右，基本符合理论推断的38kD。

实施例5.甘露聚糖酶活性测定

标准活性测定体系为1ml，其中含有0.9ml 0.5％槐豆胶溶液(pH 5.5的50mM磷酸柠檬酸缓冲液配制)，0.1ml如SEQ ID：NO.6所示的β-甘露聚糖酶的酶液(0.05μM)。底物在测定温度先温育5min后加入酶液，反应10min后加入二硝基水杨酸溶液(DNS)终止反应(张龙翔等主编.《生化实验方法和技术》，高等教育出版社，1996.)，然后沸水浴10min后测定在540nm处的吸光值。酶活单位定义为1min内催化产生1μmol还原糖所需的酶量。测定最适反应温度时采用pH5.5的50mM磷酸柠檬酸缓冲液，在测定温度温育5min，加入0.1ml酶液，继续在该温度反应10min后加入1mlDNS终止反应，其余同标准活性测定。最适反应pH测定在40℃进行，分别采用pH为4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5和8的磷酸柠檬酸缓冲液配制底物溶液，其余反应同标准活性测定。结果见图2。该重组蛋白最适作用pH5.5，最适温度65℃。测定还显示突变体活性与SEQ ID：NO.6所示的β-甘露聚糖酶完全相同。本发明重组表达菌株产酶活力为78U·ml^-1，约为黑曲霉AS2710菌株150U·ml^-1的一半，但考虑到发酵周期，黑曲霉发酵周期需要至少5天，而本发明中菌株活化需要10h左右，加上诱导表达的8h，共18h，所以日平均产酶活力本发明中的甘露聚糖酶为104U·ml^-1·day^-1，黑曲霉AS2710菌株的甘露聚糖酶小于30U·ml^-1·day^-1，另外，本发明中的重组甘露聚糖酶，表达后在蛋白的第5到第10个氨基酸的位置有六个组氨酸，使得目的蛋白一次纯化即达到90％以上，十分方便有效。因此本发明在发酵生产上比黑曲霉AS2710菌株具有更大的优势。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院微生物研究所

<120>β-甘露聚糖酶及基因和制备方法以及载体和宿主细胞

<130>I7947ZKW

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1173

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

<210>2

<211>320

<212>PRT

<213>重组表达

<400>2

<210>3

<211>963

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

<210>4

<211>320

<212>PRT

<213>重组表达

<400>4

<210>5

<211>1032

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

<210>6

<211>343

<212>PRT

<213>重组表达

<400>6

<210>7

<211>1032

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

<210>8

<211>343

<212>PRT

<213>重组表达

<400>8

<210>9

<211>1173

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

Claims (13)

1、一种β-甘露聚糖酶，该β-甘露聚糖酶具有SEQ ID：NO.2所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.4所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.6所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列，或者对SEQ ID：NO.2、SEQ ID：NO.4、SEQ ID：NO.6或SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而形成的β-甘露聚糖酶活性不变的氨基酸序列。

2、根据权利要求1所述的β-甘露聚糖酶，其中，该β-甘露聚糖酶具有SEQ ID：NO.2所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.4所示的氨基酸序列，SEQID：NO.6所示的氨基酸序列，或者SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列。

3、编码权利要求1所述的β-甘露聚糖酶的基因。

4、根据权利要求3所述的基因，该基因具有SEQ ID：NO.1所示核苷酸序列，SEQ ID：NO.3所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.5所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.7所示的核苷酸序列，或者对SEQ ID：NO.1、SEQ ID：NO.3、SEQ ID：NO.5或SEQ ID：NO.7所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码活性不变的β-甘露聚糖酶的核苷酸序列。

5、根据权利要求4所述的基因，该基因具有SEQ ID：NO.1所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.3所示的核苷酸序列，SEQ ID：NO.5所示的核苷酸序列，或者SEQ ID：NO.7所示的核苷酸序列。

6、一种重组载体，该重组载体含有权利要求3-5中任意一项所述的基因。

7、根据权利要求6所述的重组载体，其中，该重组载体为重组质粒。

8、根据权利要求7所述的重组载体，其中，该重组载体为重组质粒pUC1.17或重组质粒pETMAN-HA963。

9、一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞含有权利要求6所述的重组载体。

10、根据权利要求9所述的重组宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌。

11、根据权利要求10所述的重组宿主细胞，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21(DE3)。

12、根据权利要求11所述的重组宿主细胞，该重组宿主细胞为保藏编号为CGMCC No.2051的重组大肠杆菌DH5α(pUC1.17)。

13、一种β-甘露聚糖酶的制备方法，该方法包括培养权利要求9-12中任意一项所述的重组宿主细胞。

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