CN107699497B - 一种黑曲霉及其在辣木叶发酵中的应用 - Google Patents

一种黑曲霉及其在辣木叶发酵中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黑曲霉，分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger)，菌株号为lm_2017，保藏时间为2017年7月18日，保藏编号为CCTCC NO:M 2017428。本发明还公开了上述黑曲霉在辣木叶发酵中的应用，发酵步骤如下：将黑曲霉接种于活化培养基中进行活化，然后将活化的黑曲霉转入发酵培养基进行发酵。通过利用黑曲霉对辣木叶进行发酵，辣木叶的风味得到明显改善；且每克干料中黑曲霉益生菌8×108cfu/g以上，含有多种消化酶，营养价值提高；较未发酵辣木叶，蛋白质含量增加5～7％，游离氨基酸提高23.5～25.9％，总氨基酸生物效价更好，使辣木的饲喂品质提高。

Description

一种黑曲霉及其在辣木叶发酵中的应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种黑曲霉及其在辣木叶发酵中的应用。
背景技术
辣木是一种富营养植物，辣木叶中钙的含量是牛奶的26倍、铁的含量是菠菜的4倍、钾的含量是香蕉的10倍，锌的质量分数为6.99％、蛋白质为27％、总氨酸为19.8％、总糖为33.6％；辣木种子中蛋白质的质量分数为38％、粗纤维为73％，基本满足动物对各种营养素的需要,是一种新型优良的动物饲料资源。
但实际生产中，由于辣木叶饲料风味差，日粮中辣木叶的添加量一般不超过10％，替代鱼粉等高价原料从而降低成本的作用十分有限。要提高辣木叶替代日粮中高价原料的作用，需要通过发酵来改善辣木叶的风味，提高其饲喂品质。CN104982521A公开了植物乳杆菌亚种和干酪乳杆菌L在辣木叶发酵中的应用，但关于黑曲霉在辣木叶发酵中的应用未见报道。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种黑曲霉，并提供了黑曲霉在辣木叶发酵中的应用。通过本发明黑曲霉菌株发酵后，辣木叶的风味得到明显改善，营养价值提高，同时还增加了益生菌和消化酶，使辣木的饲喂品质提高。
技术方案：
一种黑曲霉，其分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger)，菌株号为lm_2017，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年7月18日，保藏编号为CCTCC NO:M2017428，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。该菌株是发明人于2017年3月从云南省保山市辣木叶中筛选获得的。
CCTCC NO:M 2017428的主要生物学特征：培养24～48小时呈白色绒状菌丝，此后菌丝色泽变深，60小时后产生黑色的分生孢子。分生孢子头的顶囊球形或近球形，黑色，双层小梗且长短不一，呈放射状排列。
CCTCC NO:M 2017428的18sDNA基因序列，见SEQ ID NO.1所示。
将CCTCC NO:M 2017428的18sDNA测序结果在NCBI进行blast比对，结果表明，CCTCC NO:M 2017428 1669bp核苷酸片段与Genbank中已知黑曲霉对应核苷酸片段同源性高达100％。综合通过以上结果分析，该分离的菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)。
CCTCC NO:M 2017428在辣木叶发酵中的应用。
辣木叶发酵步骤如下：将黑曲霉接种于活化培养基中进行活化，然后将活化的黑曲霉转入发酵培养基进行发酵。
所述活化培养基为虎红琼脂培养基；所述活化温度为25～31℃，活化时间为5～6天。
所述发酵培养基包括辣木叶和水。
所述辣木叶为辣木叶粉末，粒径为20～40目。
所述发酵培养基的含水量为50～70wt.％。
所述活化的黑曲霉的接种量为辣木叶质量的0.03～0.05％。
所述发酵为固态发酵，发酵培养基厚度为5～8cm。
所述发酵温度为25～31℃，发酵时间为36～72h。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：通过利用菌株CCTCC NO:M2017428对辣木叶进行发酵，辣木叶的风味得到明显改善；且每克干料中黑曲霉益生菌8×108cfu/g以上，含有多种消化酶，营养价值提高；较未发酵辣木叶，蛋白质含量增加5～7％，游离氨基酸提高23.5～25.9％，总氨基酸生物效价更好，使辣木的饲喂品质提高。
附图说明
图1为辣木叶发酵前色谱图；
图2为辣木叶发酵后色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1
1、原始菌株的获得
取辣木叶10g，加100mL无菌水，无菌室中室温搅拌20min，静置10min，取上清液用无菌水稀释。稀释液涂布于虎红琼脂平板培养基上，28℃±0.5℃培养5～10天。挑选产生黑曲霉孢子继续划线培养，直至获得单菌落。获得5株纯培养的黑曲霉，分别命名为lm_2017、1m_02、1m_03、1m_04、1m_05。培养24～48小时呈白色绒状菌丝，此后菌丝色泽变深，60小时后产生黑色的分生孢子。分生孢子头的顶囊球形或近球形，黑色，双层小梗且长短不一，呈放射状排列。
2、真菌18sDNA序列
为了进一步鉴定该菌株，本发明对菌株lm_2017做了18sDNA基因片段序列测定，序列长度1669bp，序列测定结果如SEQ ID No.1所示：
将菌株lm_2017 18sDNA上述测序结果在NCBI进行blast比对，结果表明，菌株lm_2017 1669bp核苷酸片段与Genbank中已知黑曲霉对应核苷酸片段同源性高达100％。综合通过以上结果分析，该分离的菌株为黑曲霉(Aspergillus niger))。
实施例2
配制活化培养基，将8.7g虎红琼脂培养基粉末溶解至250mL水中，121℃灭菌30min，制作平板培养基。将Asp.niger lm_2017、1m_02、1m_03、1m_04、1m_05、T8、T10、A、B、C分别接种于活化平板培养基上，在28℃静置培养5～6天。
然后将辣木叶粉碎至20～40目，加自来水混合，不加其他辅料，混合物总含水量为63wt.％；混合物在120℃灭菌15min，冷却后接种活化的lm_2017、1m_02、1m_03、1m_04、1m_05、T8、T10、A、B、C，接种量为辣木叶重量的0.037％，混合物厚度5～8cm，28℃±0.5℃条件下通气固态发酵36～60h。发酵结果见表1。
表1不同黑曲霉发酵辣木叶风味和速度的比较
Figure BDA0001379105450000031
Figure BDA0001379105450000041
筛选辣木发酵菌种的目的是获得适应性强，发酵速度快和发酵效果较好的菌种，以满足生产需求。然而，辣木中含有黄酮类等物质，对菌种具有选择性。从表1发酵结果可见，多株黑曲霉发酵辣木叶速度存在明显差异，Asp.niger T8未见发酵，Asp.niger lm_2017和Asp.niger lm_03发酵速度较快，24h可见白色菌丝长满整个培养基，其余几种黑曲霉白色菌丝布满培养基的时间需要36h。发酵速度和风味密切相关，一般发酵速度快，风味较浓，但部分菌株发酵有霉臭等不良风味。考虑到辣木风味是其品质的最主要指标之一，同时发酵速度直接关系生产效率，选择Asp.niger lm_2017最佳。
实施例3
Asp.niger lm_2017的活化方法同实施例2。
首先将辣木叶粉碎至20～40目，然后加自来水混合，不加其他辅料，使混合物总含水量为45wt.％；混合物在120℃灭菌15min，冷却后接种活化的lm_2017,接种量为辣木叶重量的0.037％，混合物厚度5～8cm，25℃条件下通气固态发酵36h，发酵结果见表2、表3和图2。块状发酵物适度破碎后于35～40℃鼓风干燥至含水量小于10wt.％，粉碎过60目筛，以添加量5～15％与其他日粮混合使用；块状发酵物也可以不进行干燥，按干基量5～15％直接与日粮混合饲喂。
实施例4
发酵方法同实施例3，不同的是混合物总含水量为55wt.％，发酵温度为28℃，发酵时间为48h，发酵结果见表2。
实施例5
发酵方法同实施例3，不同的是混合物总含水量为65wt.％，发酵温度为31℃，发酵时间为60h，发酵结果见表2和表3。
实施例6
发酵方法同实施例3，不同的是混合物总含水量为70wt.％，发酵温度为28℃，发酵时间为72h。
实施例7
发酵方法同实施例3，不同的是黑曲霉接种量为辣木叶重量的0.03％。
实施例8
发酵方法同实施例3，不同的是黑曲霉接种量为辣木叶重量的0.05％。
表2辣木叶发酵后槲皮素和纤维素酶含量变化
Figure BDA0001379105450000051
g dw：每g绝干辣木叶
表3辣木叶发酵后氨基酸含量变化
Figure BDA0001379105450000052
Figure BDA0001379105450000061
g dw：每g绝干辣木叶
由表2、表3可知，采用Asp.niger lm_2017对辣木叶进行固态发酵处理，每克干料中黑曲霉益生菌8×108cfu/g以上，并含有多种消化酶，辣木叶发酵后产生的芳樟醇气味纯正、圆和,甜润、幽雅，风味明显得到改善；较未发酵物，蛋白质含量增加5～7％，游离氨基酸含量提高23.5～25.9％，总氨基酸生物效价更好，使辣木叶饲料品质得到改善。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学,保山九润绿色产业发展有限公司
<120> 一种黑曲霉及其在辣木叶发酵中的应用
<130> 20170814
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1669
<212> DNA
<213> 黑曲霉 Aspergillus niger
<400> 1
aagcacttta tactgtgaaa ctgcgaatgg ctcattaaat cagttatcgt ttatttgata 60
gtaccttact acatggatac ctgtggtaat tctagagcta atacatgctg aaaacctcga 120
cttcggaagg ggtgtattta ttagataaaa aaccaatgcc cttcggggct ccttggtgaa 180
tcataataac ttaacgaatc gcatggcctt gcgccggcga tggttcattc aaatttctgc 240
cctatcaact ttcgatggta ggatagtggc ctaccatggt ggcaacgggt aacggggaat 300
tagggttcga ttccggagag ggagcctgag aaacggctac cacatccaag gaaggcagca 360
ggcgcgcaaa ttacccaatc ccgacacggg gaggtagtga caataaatac tgatacgggg 420
ctcttttggg tctcgtaatt ggaatgagta caatctaaat cccttaacga ggaacaattg 480
gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccaatagcgt atattaaagt 540
tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaacc ttgggtctgg ctggccggtc cgcctcaccg 600
cgagtactgg tccggctgga cctttccttc tggggaatct catggccttc actggctgtg 660
gggggaacca ggacttttac tgtgaaaaaa ttagagtgtt caaagcaggc ctttgctcga 720
atacattagc atggaataat agaataggac gtgcggttct attttgttgg tttctaggac 780
cgccgtaatg attaataggg atagtcgggg gcgtcagtat tcagctgtca gaggtgaaat 840
tcttggattt gctgaagact aactactgcg aaagcattcg ccaaggatgt tttcattaat 900
cagggaacga aagttagggg atcgaagacg atcagatacc gtcgtagtct taaccataaa 960
ctatgccgac tagggatcgg acggtgtttc tattatgacc cgttcggcac cttacgagaa 1020
atcaaagttt ttgggttctg gggggagtat ggtcgcaagg ctgaaactta aagaaattga 1080
cggaagggca ccaccaggcg tggagcctgc ggcttaattt gactcaacac ggggaaactc 1140
accaggtcca gacaaaataa ggattgacag attgagagct ctttcttgat cttttggatg 1200
gtggtgcatg gccgttctta gttggtggag tgatttgtct gcttaattgc gataacgaac 1260
gagacctcgg cccttaaata gcccggtccg catttgcggg ccgctggctt cttaggggga 1320
ctatcggctc aagccgatgg aagtgcgcgg caataacagg tctgtgatgc ccttagatgt 1380
tctgggccgc acgcgcgcta cactgacagg gccagcgagt acatcacctt ggccgagagg 1440
tctgggtaat cttgttaaac cctgtcgtgc tggggataga gcattgcaat tattgctctt 1500
caacgaggaa tgcctagtag gcacgagtca tcagctcgtg ccgattacgt ccctgccctt 1560
tgtacacacc gcccgtcgct actaccgatt gaatggctcg gtgaggcctt cggactggct 1620
caggagggtt ggcaacgacc ccccagagcc ggaaagttgg tcaaacccg 1669

Claims (10)

1.一种黑曲霉，其分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger)，菌株号为lm_2017，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年7月18日，保藏编号为CCTCC NO:M2017428。
2.权利要求1所述的黑曲霉在辣木叶发酵中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述辣木叶发酵步骤如下：将黑曲霉接种于活化培养基中进行活化，然后将活化的黑曲霉转入发酵培养基中进行发酵，所述活化培养基是虎红琼脂培养基。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述活化温度为25～31℃，活化时间为5～6天。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包括辣木叶和水。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述辣木叶为辣木叶粉末，粒径为20～40目。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的含水量为45～70wt.％。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述活化的黑曲霉的接种量为辣木叶质量的0.03％～0.05％。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵为固态发酵，发酵培养基厚度为5～8cm。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵温度为25～31℃，发酵时间为36～72h。
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