CN117867000A - 一种高产nisin的乳酸乳球菌重组菌株及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产nisin的乳酸乳球菌重组菌株及其制备和应用，所述重组菌株的构建方法为：将序列如SEQ ID NO.1所示的2nisA片段插入初始质粒中得到重组质粒，再将重组质粒转入乳酸乳球菌即得高产nisin的乳酸乳球菌重组菌株。本发明通过在重组质粒上串联前体结构基因nisA，提高了nisin生产菌的nisin产量，为基因串联在乳酸乳球菌中的应用提供了新的实验支持和理论思路。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种高产nisin的乳酸乳球菌重组菌株及其制备方法和应用。
背景技术
乳酸链球菌素(nisin)是在乳酸乳球菌发酵过程中产生的一种小分子抗菌肽，被广泛地应用于食品防腐、医疗等行业中。乳酸乳球菌分泌nisin的产率低，分离提取难度大；化学合成的方法成本过高；nisin分子量较小，用常规基因工程方法构建单拷贝基因重组质粒后目的基因在宿主细胞中的表达量很低且不稳定，容易被宿主蛋白酶降解；此外，在发酵过程中nisin的不断累积会抑制乳酸乳球菌的正常生长，从而影响nisin的产量。
基因串联技术通过将目标基因定向连接起来，在重组载体启动子的控制下表达小分子肽。基因串联技术在小分子蛋白的表达中有很多优势：一方面串联体可以形成一定的空间结构，其空间结构可以降低单体产物的毒性作用；另一方面在基因层面上控制提高了蛋白表达，串联体表达出来的产物还可以在化学试剂或酶的作用下裂解成单体，从而再次获得目标肽的单体物质。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在利用基因串联技术，串联了控制小分子多肽nisin合成的前体基因nisA，构建了高产nisin的重组表达载体和重组菌株，从而提高nisin蛋白的表达量。
本发明的技术方案具体如下：
本发明提供了一种高产nisin的乳酸乳球菌重组菌株的构建方法，其包括以下步骤：
S1、将序列如SEQ ID NO.1所示的2nisA片段插入初始质粒中得到重组质粒；
S2、将重组质粒转入乳酸乳球菌即得高产nisin的乳酸乳球菌重组菌株。
优选地，在上述构建方法中，初始质粒为质粒pMG36e。
更为优选地，在上述构建方法中，步骤S1具体包括以下过程：
S11、利用引物扩增序列如SEQ ID NO.1所示的2nisA片段，以引入PstI和XbaI酶切位点；
S12、用PstI和XbaI分别对初始质粒和步骤S11扩增所得片段进行双酶切，消化和纯化后，将载体产物和2nisA片段产物连接后导入大肠杆菌，提取即得重组质粒。
在本发明一实施例中，步骤S11中所用引物序列如SEQ ID NO.2-3所示。
在本发明一实施例中，步骤S12中所述双酶切的方法具体为：将31μL ddH2O、2μL酶、5μL buffer与10μL底物混合后于37℃孵育2h，其中底物为初始质粒或步骤S11扩增所得片段。
在本发明一实施例中，步骤S12中所述连接条件为16℃、1h；在本发明另一些实施例中，步骤S12中所述连接条件为4℃过夜。
在本发明一实施例中，步骤S12中所述消化和纯化的过程为：用Dpn I酶及buffer对PCR产物进行消化，用fast AP酶及buffer对pMG36e质粒进行消化，37℃消化1h左右；消化完成后用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，纯化过程按PCR产物纯化消化试剂盒进行。
优选地，在上述构建方法中，所述乳酸乳球菌为乳酸乳球菌ATCC11454。
优选地，在上述构建方法中，步骤S2采用电转方式将重组质粒转入乳酸乳球菌；在本发明一实施例中，电转条件为：2.2kv，25μF，电击4.5-5ms。
基于本发明所述乳酸乳球菌重组菌株的构建方法制备的高产nisin的乳酸乳球菌重组菌株也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了所述高产nisin的乳酸乳球菌重组菌株在nisin生产中的应用。本发明实验数据表明，相对于常规单基因乳酸乳球菌重组菌，本发明提供的高产nisin的乳酸乳球菌重组菌株的nisin基因转录量得到了增加；而且，利用本发明所述乳酸乳球菌重组菌株制备的nisin是串联体的形式(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，实验结果表明，本发明所得串联体的抑菌效果比单体的效果强。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明将串联后的2nisA片段通过重组质粒导入nisin生产菌中，构建得到了重组菌株，其构建方法简便；本发明提供的重组乳酸乳球菌具有较高的nisin基因的转录量，nisin产量得到明显增加，而且表达所得nisin蛋白的提取纯化方法简单，采用AKTA-pure一步法即可成功获得高纯度nisin蛋白；通过串联nisA基因，提高了nisin生产菌的nisin耐受能力，减少了发酵过程中nisin对菌株生长的抑制。
附图说明
图1为本发明实施例1中三种质粒的图谱，其中A1为质粒pUC57[2nisA]，A2为质粒pMG36e[nisA]，A3为质粒pMG36e[2nisA]。
图2为本发明实施例1中nisA和2nisA扩增PCR结果检测(A)及载体质粒pMG36e提取的示意图(B)。
图3为本发明实施例1中重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞的菌落PCR电泳图
图4为本发明实施例1中重组质粒转化乳酸乳球菌ATCC11454感受态细胞的菌落PCR电泳图。
图5为本发明实施例2中乳酸乳球菌基因工程菌pMG36e[nisA]和乳酸乳球菌基因工程菌pMG36e[2nisA]的实时荧光定量PCR结果图。
图6为本发明实施例3中基因工程菌菌株上清液在NZ3900抑菌平板上的抑菌圈大小情况，其中(A1)-(A4)为乳酸乳球菌ATCC11454，(B1)-(B4)为乳酸乳球菌ATCC11454[pMG36e]，(C1)-(C4)为乳酸乳球菌基因工程菌pMG36e[nisA]，(D1)-(D4)为乳酸乳球菌基因工程菌pMG36e[2nisA]，(A1)、(B1)、(C1)、(D1)为0.02MHCl对照，(A2)、(B2)、(C2)、(D2)为四种乳酸乳球菌的上清液，(A3)、(B3)、(C3)、(D3)为稀释10倍后的四种乳酸乳球菌的上清液，(A4)、(B4)、(C4)、(D4)为稀释5倍后的四种乳酸乳球菌的上清液。
图7为本发明实施例3中nisin效价的标准曲线，图中横坐标为nisin浓度(IU/mL)，纵坐标为抑菌圈直径(cm)。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。
现有技术利用乳酸乳球菌制备nisin存在nisin分泌产率低、nisin分子量较小易被宿主蛋白酶降解、以及nisin累积抑制乳酸乳球菌生长等问题，为了提高乳酸乳球菌的nisin产量，本发明提高了一种高产nisin的乳酸乳球菌重组菌株。本发明所述重组菌株通过将串联后的2nisA经重组质粒导入nisin生产菌乳酸乳球菌中的方法制得，提高了nisin生产菌的nisin耐受能力，从而减少了发酵过程中nisin对菌株生长的抑制，进而提高了nisin的产量，明显提高了乳酸乳球菌的nisin产量。
下面列举了一些具体实施例，需说明的是，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
以下实施例所用大肠杆菌为大肠杆菌DH5α，该菌株在以下实施例中作为目的质粒pMG36e的转化载体、用于克隆重组质粒和保存基因工程菌菌株；以下实施例所用乳酸乳球菌ATCC11454经由宝赛生物公司购买，该菌株在实施例中是nisin的生产菌菌株，并用于制备感受态细胞、作为目的质粒转化载体以及作为基因工程菌的载体用于表达nisin蛋白；以下实施例中的质粒pUC57[2nisA]和载体pMG36e中目的序列均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
以下实施例中未注明具体技术或条件的，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1重组乳酸乳球菌的制备
本例以载体pMG36e为初始质粒，以乳酸乳球菌ATCC11454为宿主菌，制备乳酸乳球菌重组菌株，其制备过程具体如下：
(1)重组质粒pMG36e[nisA]和pMG36e[2nisA]的构建。
按常规分子生物学操作，以质粒pUC57[2nisA](如图1所示)为模版，NisA-XbaI-U1和NisA-PstI-D1为引物PCR扩增nisA和2nisA片段。其中，引物NisA-XbaI-U1和NisA-PstI-D1的序列具体为：
NisA-XbaI-U1：5’-cgatcctctagaATGAAAAAGAAAATTATTTC-3’(SEQ ID NO.2),
NisA-PstI-D1：5’-gcatgcctgcagTTATTTTGAAACATGAATTG-3’(SEQ ID NO.3)。
PCR扩增的反应体系如表1所示：
表1质粒PCR体系
PCR扩增反应的条件为：第一阶段，95℃预变性2分钟；第二阶段，95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1分钟，10个循环；第三阶段，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，10个循环；第四阶段，72℃延伸10分钟。
再按表2所示体系将载体pMG36e与PCR扩增所得nisA和2nisA片段进行PstI和XbaI双酶切，于37℃恒温培养箱中酶切2小时，按表3将酶切产物消化模版，于37℃恒温培养箱消化1小时，并纯化回收载体产物与nisA和2nisA片段产物。
图2为扩增PCR结果及质粒pMG36e提取示意图，其中A图中泳道1、2为nisA和2nisA扩增PCR结果，B图中泳道1和2均为pMG36e质粒。
表2 PCR扩增片段与载体双酶切体系
表3 PCR扩增片段与载体消化体系
纯化后的载体与nisA和2nisA片段的加入量按摩尔比1:1、1:3、3:1分三组进行实验，将两种纯化产物按比例分别加入到三个EP管中，再分别加入T4DNA连接酶及buffer后进行连接，连接条件为16℃、1h。得到如图1所示的重组质粒pMG36e[nisA]和pMG36e[2nisA]。将重组质粒pMG36e[nisA]和pMG36e[2nisA]加入大肠杆菌DH5α感受态细胞进行热转化，转化后对菌种进行培养后进行菌落PCR，结果如图3所示。
(2)乳酸乳球菌重组菌株的制备。
将构建成功的两个质粒pMG36e[nisA]和pMG36e[2nisA]用质粒提取试剂盒从大肠杆菌中分别提取出来，取1-2μL电转至乳酸乳球菌感受态细胞中，电击条件2.2kv，25μF，电击时间4.5-5ms，电转完成后涂布抗性平板，30℃恒温箱中过夜培养。待平板上长出单菌落后，对平板上长势较好的单菌落进行标记，取标记好的菌落加入到ddH2O中混匀，加入PCR体系液后进行菌落PCR(图4)，检验重组载体是否成功电转入乳酸乳球菌。
经过以上步骤，本例成功得到两株乳酸乳球菌基因工程菌，即转入质粒pMG36e[2nisA]的乳酸乳球菌(记为乳酸乳球菌基因工程菌pMG36e[nisA])、转入质粒pMG36e[nisA]的乳酸乳球菌(记为乳酸乳球菌基因工程菌pMG36e[2nisA])。
实施例2重组乳酸乳球菌的nisin基因转录量检测
为验证串联基因对基因表达的影响，本例设计了荧光定量PCR实验，从转录层面进行分析。实验样品为乳酸乳球菌基因工程菌pMG36e[nisA]、乳酸乳球菌基因工程菌pMG36e[2nisA]以及不含质粒的乳酸乳球菌(即乳酸乳球菌ATCC11454)。
本例的实验操作如下：
(1)利用天根生化科技有限公司的RNA simple总RNA提取试剂盒提取样品的总RNA，提取过程中均使用RNase-free的耗材及试剂，并在无RNase污染的条件下进行，提取的RNA保存在-80℃冰箱中备用。
(2)采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的反转录和qPCR试剂盒对提取的样品总RNA进行反转录和荧光定量PCR，qPCR引物、内参引物和cDNA稀释倍数均通过预实验确定，具体步骤参考说明书，配置好体系后加到96孔板中进行上机实验，整个过程需避光操作。
所得实验结果如图5所示，可以看出串联后的nisA基因转录量大于未串联nisA基因转录量，证明串联nisA基因增加了nisA基因的转录，即增加了nisin基因的转录量。
实施例3重组乳酸乳球菌的nisin表达实验
本例采取的蛋白检测方法为抑菌圈法，具体操作为：将乳酸乳球菌基因工程菌pMG36e[nisA]和乳酸乳球菌基因工程菌pMG36e[2nisA]分别在含有红霉素抗性的GM17平板上划线，30℃过夜，次日挑取平板上的单菌落至3mL含有红霉素抗性的GM17液体培养基中，30℃静置过夜。取过夜菌液，调节其pH至2.0左右，煮沸后离心，取上清样品加入抑菌圈平板中，放入30℃恒温箱过夜培养。每个实验组重复三次，用不含质粒的乳酸乳球菌菌液上清作为阴性对照组，样品处理同上。
结果如图6所示，通过游标卡尺测量可知，抑菌圈从大到小依次为：转入质粒pMG36e[2nisA]的乳酸乳球菌、转入质粒pMG36e[nisA]的乳酸乳球菌、不含质粒的乳酸乳球菌。表明串联nisA基因对于nisin产量增加是有一定影响的，将抑菌圈的大小代入nisin效价的标准曲线(图7)，可粗略估计上清发酵液中nisin含量，不含质粒的乳酸乳球菌的上清发酵液中nisin含量为300μg/mL左右，转入质粒pMG36e[2nisA]的乳酸乳球菌为和转入质粒pMG36e[nisA]的乳酸乳球菌均为450μg/mL左右。
实施例4重组乳酸乳球菌所得nisin蛋白的纯化
本例利用的是强阳离子交换柱HiTrap spff 1mL进行蛋白纯化，纯化原理是通过调节缓冲液pH使nisin蛋白表面带有正电荷，从而吸附在强阳离子柱上，再用NaCl溶液将蛋白梯度洗脱下来，从而实现蛋白的初步纯化，以下是具体操作步骤：
(1)准备样品：nisin是一种分泌蛋白，将培养好的菌液样品4℃、12,000rpm、10min离心，取上清过0.45μm的滤膜后备用。
(2)将1ml的预装柱HiTrap spff安装到对应的柱位上，流速设置为1mL/min，使用起始缓冲液对离子交换柱及仪器进行清洗和平衡，待流出液的紫外吸收值不变，说明色谱柱已清洗干净并平衡完毕。
(3)流速设置为1mL/min，将进样管加入样品中进行上样。
(4)当细胞上清液全部流过离子交换柱后，将进样管加入到起始缓冲液中开始平衡，待流出液的紫外吸收值不变，说明蛋白已经完全吸附到柱上，平衡完毕。
(5)将进样管加入到洗脱缓冲液中进行梯度洗脱，同时设置收集器为1mL/管，按时间收集，当观察到流出液的紫外吸收值保持不变，说明蛋白已洗脱完成。
(6)洗脱完成后用起始缓冲液再次冲洗柱子及仪器以便下次上样，待其达到平衡状态时方可关闭仪器。
结果表明，本发明利用重组乳酸乳球菌表达所得nisin蛋白的提取纯化方法简单，采用AKTA-pure一步法即可成功获得高纯度nisin蛋白。
综上所述，本发明通过将串联后的2nisA经重组质粒导入nisin生产菌乳酸乳球菌ATCC11454中，明显提高了乳酸乳球菌ATCC11454的nisin产量。本发明拓宽了抗菌肽改造的实验思路，为基因串联在乳酸乳球菌中的应用提供了新的实验支持和理论思路。
以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高产nisin的乳酸乳球菌重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将序列如SEQ ID NO.1所示的2nisA片段插入初始质粒中得到重组质粒；
S2、将重组质粒转入乳酸乳球菌即得高产nisin的乳酸乳球菌重组菌株。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述初始质粒为质粒pMG36e。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1包括以下过程：
S11、利用引物扩增序列如SEQ ID NO.1所示的2nisA片段，以引入PstI和XbaI酶切位点；
S12、用PstI和XbaI分别对初始质粒和步骤S11扩增所得片段进行双酶切，消化、纯化后，将载体产物和2nisA片段产物连接后导入大肠杆菌，提取即得重组质粒。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤S11所述引物序列如SEQ IDNO.2-3所示。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤S11所述扩增的条件为：95℃预变性2分钟；95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1分钟，10个循环；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，10个循环；72℃延伸10分钟。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述双酶切具体为：31μL ddH2O、2μL酶、5μL buffer与10μL底物混合后于37℃孵育2h；其中，所述底物为初始质粒或步骤S11扩增所得片段。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌为乳酸乳球菌ATCC11454。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S2采用电转方式将重组质粒转入乳酸乳球菌，且电击条件为：2.2kv，25μF，电击4.5-5ms。
9.根据权利要求1～8任一项所述的构建方法制备的乳酸乳球菌重组菌株。
10.如权利要求8所述的乳酸乳球菌重组菌株在nisin生产中的应用。
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