CZ33404U1 - Genový konstrukt a fúzní termostabilní lysostafin - Google Patents
Genový konstrukt a fúzní termostabilní lysostafin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ33404U1 CZ33404U1 CZ201936726U CZ201936726U CZ33404U1 CZ 33404 U1 CZ33404 U1 CZ 33404U1 CZ 201936726 U CZ201936726 U CZ 201936726U CZ 201936726 U CZ201936726 U CZ 201936726U CZ 33404 U1 CZ33404 U1 CZ 33404U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- sequence
- gly
- thermostable
- gene construct
- fusion
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 48
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims description 11
- 108090000988 Lysostaphin Proteins 0.000 title claims description 10
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 claims description 25
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 claims description 25
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 10
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 102220591663 7-alpha-hydroxycholest-4-en-3-one 12-alpha-hydroxylase_N39P_mutation Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 11
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 11
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 229910003251 Na K Inorganic materials 0.000 description 7
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Substances C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 7
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 3
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002849 thermal shift Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 2
- CQIIXEHDSZUSAG-QWRGUYRKSA-N Gly-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 CQIIXEHDSZUSAG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 2
- XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000191978 Staphylococcus simulans Species 0.000 description 2
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002022 differential scanning fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229940037648 staphylococcus simulans Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N Ala-Gly-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GRPHQEMIFDPKOE-HGNGGELXSA-N Ala-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GRPHQEMIFDPKOE-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- ROWCTNFEMKOIFQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N ROWCTNFEMKOIFQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- JQHASVQBAKRJKD-GUBZILKMSA-N Arg-Ser-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N JQHASVQBAKRJKD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- COWITDLVHMZSIW-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O COWITDLVHMZSIW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NTWOPSIUJBMNRI-KKUMJFAQSA-N Asn-Lys-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NTWOPSIUJBMNRI-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- VLDRQOHCMKCXLY-SRVKXCTJSA-N Asn-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O VLDRQOHCMKCXLY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HPASIOLTWSNMFB-OLHMAJIHSA-N Asn-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HPASIOLTWSNMFB-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- FMNBYVSGRCXWEK-FOHZUACHSA-N Asn-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O FMNBYVSGRCXWEK-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- QNNBHTFDFFFHGC-KKUMJFAQSA-N Asn-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O QNNBHTFDFFFHGC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UCHSVZYJKJLPHF-BZSNNMDCSA-N Asp-Phe-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O UCHSVZYJKJLPHF-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- NJLLRXWFPQQPHV-SRVKXCTJSA-N Asp-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJLLRXWFPQQPHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N Glu-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N Glu-Asn Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YKLNMGJYMNPBCP-ACZMJKKPSA-N Glu-Asn-Asp Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N YKLNMGJYMNPBCP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HDNXXTBKOJKWNN-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HDNXXTBKOJKWNN-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- RVGMVLVBDRQVKB-UWVGGRQHSA-N Gly-Met-His Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)CN RVGMVLVBDRQVKB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N Gly-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- BXDLTKLPPKBVEL-FJXKBIBVSA-N Gly-Thr-Met Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O BXDLTKLPPKBVEL-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- ONSARSFSJHTMFJ-STQMWFEESA-N Gly-Trp-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ONSARSFSJHTMFJ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N Gly-Tyr-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- BAYQNCWLXIDLHX-ONGXEEELSA-N Gly-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CN BAYQNCWLXIDLHX-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N His-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- BZKDJRSZWLPJNI-SRVKXCTJSA-N His-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BZKDJRSZWLPJNI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- CNHSMSFYVARZLI-YJRXYDGGSA-N His-His-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CNHSMSFYVARZLI-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- XMAUFHMAAVTODF-STQMWFEESA-N His-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XMAUFHMAAVTODF-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- KAXZXLSXFWSNNZ-XVYDVKMFSA-N His-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KAXZXLSXFWSNNZ-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- ZHHLTWUOWXHVQJ-YUMQZZPRSA-N His-Ser-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)O)N ZHHLTWUOWXHVQJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LPBWRHRHEIYAIP-KKUMJFAQSA-N His-Tyr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LPBWRHRHEIYAIP-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N Leu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O STAVRDQLZOTNKJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N Leu-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- AMSSKPUHBUQBOQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N AMSSKPUHBUQBOQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BTEMNFBEAAOGBR-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BTEMNFBEAAOGBR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- RDFIVFHPOSOXMW-ACRUOGEOSA-N Leu-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RDFIVFHPOSOXMW-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N Lys-Glu-Gly Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(=O)NCC([O-])=O GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- NNKLKUUGESXCBS-KBPBESRZSA-N Lys-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O NNKLKUUGESXCBS-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220526247 NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 6_R42E_mutation Human genes 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPTXMUIBLMGTQH-ONGXEEELSA-N Phe-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 FPTXMUIBLMGTQH-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220639062 Protein Wnt-11_R74E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N Ser-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O BTKUIVBNGBFTTP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- RDFQNDHEHVSONI-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asn-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RDFQNDHEHVSONI-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N Ser-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- IXCHOHLPHNGFTJ-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)N IXCHOHLPHNGFTJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N Ser-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000191976 Staphylococcus simulans bv. staphylolyticus Species 0.000 description 1
- YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XGFGVFMXDXALEV-XIRDDKMYSA-N Trp-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N XGFGVFMXDXALEV-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- WKQNLTQSCYXKQK-VFAJRCTISA-N Trp-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WKQNLTQSCYXKQK-VFAJRCTISA-N 0.000 description 1
- KBKTUNYBNJWFRL-UBHSHLNASA-N Trp-Ser-Asn Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 KBKTUNYBNJWFRL-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- ITUAVBRBGKVBLH-BVSLBCMMSA-N Trp-Tyr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N ITUAVBRBGKVBLH-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N Tyr-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- JKUZFODWJGEQAP-KBPBESRZSA-N Tyr-Gly-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O JKUZFODWJGEQAP-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- ZZDYJFVIKVSUFA-WLTAIBSBSA-N Tyr-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O ZZDYJFVIKVSUFA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- DNOOLPROHJWCSQ-RCWTZXSCSA-N Val-Arg-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DNOOLPROHJWCSQ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001516 effect on protein Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 108010006664 gamma-glutamyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010045126 glycyl-tyrosyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 101150011498 lad gene Proteins 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N lysine Chemical compound NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N pentaglycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000010944 pre-mature reactiony Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 102200135559 rs387907064 Human genes 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017949 tyrosyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 108010027345 wheylin-1 peptide Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládané technické řešení se týká genového konstruktu pro expresi bakteriocinových lytických enzymů s katalytickou aktivitou dvoubodové termostabilní varianty β-lytické endopeptidázy a fúzních endolysinů.
Dosavadní stav techniky
Lysostafin (EC 3.4.24.75) je monomemí enzym patricí do skupiny peptidů a proteinů známých jako bakteriociny. Jedná se o extracelulámí enzym produkovaný bakterií Staphylococcus simulans. Lysostafin hydrolyticky štěpí peptidovou vazbu mezi 3. a 4. glycinovým zbytkem pentaglycinové spojky peptidoglykanu v buněčných stěnách bakterií Staphylococcus aureus. Struktura aktivní formy lysostafinu je tvořena katalytickou doménou a vazebnou doménou, která interaguje s peptidoglykanem buněčných stěn. Obě domény jsou spojeny linkerem, což je řetězec asi 15 aminokyselin.
Předkládané řešení si klade za cíl poskytnout genový konstrukt pro efektivní expresi termostabilní varianty β-lytické endopeptidázy a fúzních endolysinů s vysokou aktivitou a stabilitou a snadnou expresí.
Podstata technického řešení
Předkládané technické řešení poskytuje genový konstrukt obsahující kódující sekvenci termostabilní varianty β-lytické endopeptidázy s dvěma bodovými mutacemi, který obsahuje kódující sekvenci ubikvitinu Ub2 a ve směru čtení od sekvence ubikvitinu Ub2 sekvenci kódující 14 His-Tag, přičemž sekvence kódující 14 His-Tag je následována sekvencí kódující štěpné místo pro TEV proteázu a sekvence kódující štěpné místo pro TEV proteázu je následována nukleotidovou sekvencí kódující termostabilní variantu β-lytické endopeptidázy N39P_T178L s optimalizovanou frekvencí kodonů pro E. coli. Tato sekvence je zde uvedena jako SEQ ID NO. 1.
atgcagatcttcgttaaaaccctgaccggtaaaaccatcaccctggaagttgaaccgtctgacaccatcgaaaacgttaaagcgaaaatcca ggacaaagaaggtatcccgccggaccagcaggaactgatcttcgcgggtaaacagctggaagacggtcgtaccctgtctgactacaacat ccagaaagaatctaccctgcacctggttctgcagctcgagggtggtcaccaccaccactctggtcaccaccacaccggtcaccaccaccac tctggttctcaccaccactctggtggtgaaaacctgtacttccagtctggtggtggtaccatggcgCACGAACACAGCGCGCA GTGGCTGAACAACTACAAGAAAGGTTATGGCTATGGTCCGTATCCGCTGGGTATCAA TGGTGGTATGCACTACGGCGTGGACTTCTTTATGCCGATCGGTACCCCGGTGAAGGC GATCAGCAGCGGCAAAATTGTTGAGGCGGGTTGGAGCAACTATGGTGGCGGTAACC AGATCGGCCTGATTGAAAACGACGGTGTGCACCGTCAATGGTACATGCACCTGAGCA AGTATAACGTGAAAGTTGGCGATTACGTTAAGGCGGGTCAGATCATTGGCTGGAGCG GTAGCACCGGTTATAGCACCGCGCCGCACCTGCACTTCCAGCGTATGGTGAACAGCT TTAGCAACAGCACCGCGCAAGACCCGATGCCGTTCCTGAAGAGCGCGGGTTATGGTA AAGCGGGCGGATCCGTTACCCCGACCCCGAACACCGGCTGGAAGACCAACAAATAC GGCACCCTGTATAAAAGCGAGAGCGCGAGCTTCACCCCGAACACCGACATCATTCTG CGTACCACCGGCCCGTTTCGTAGCATGCCGCAGAGCGGCGTGCTGAAGGCGGGTCA AACCATCCACTATGACGAAGTTATGAAACAGGATGGTCACGTGTGGGTTGGTTACAC CGGCAACAGCGGTCAACGTATTTATCTGCCGGTTCGCACCTGGAATAAAAGCACCAA TACCCTGGGCGTTCTGTGGGGCACCATCAAGTAAAGATCTCTCGAG (SEQ ID NO. 1)
Původní gen kódující β-lytickou endopeptidázu obsahuje enzymovou část a predoménu
- 1 CZ 33404 U1 ovlivňující aktivitu enzymu (gen ENAICAA29494ICAA29494.1 Staphylococcus simulans bv. staphylolyticus). V rámci předkládaného řešení byla sekvence kódující enzymovou část (velká písmena v SEQ ID NO. 1) vyňata z genu a byla optimalizována frekvence kodonů pro E. coli. Navíc byly provedeny změny kodónů vedoucí k mutacím N39P a T178L. Dále byl připojen fúzní protein ubiquitin Ub2 a His-Tag kotvička.
Dalším předmětem technického řešení je proteinový produkt exprese genového konstruktu majícího sekvenci SEQ ID NO. 1. Proteinový produkt - fúzní termostabilní lysostafm - obsahuje sekvence ubikvitinu 2, 14 His-Tagu, přičemž sekvence kódující His-Tag je následována podtrženou sekvencí (NLYFQ) kódující štěpné místo pro TEV proteázu a β-lytické termostabilní endopeptidázy N39P_T178L (aM23-SH3b) má sekvenci SEQ ID NO. 2:
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQELIFAGKQLEDGRTLSDYNIQ KESTLHLVLQLEGGHHHHSGHHHTGHHHHSGSHHHSGGENLYFQSGGGTMAHEHSAQ WLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMPIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQI GLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFS NSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGSVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIILRTTGP FRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVL WGTIK (SEQ ID NO. 2)
Níže je uvedena kódující sekvence SEQ ID NO. 1 s kódovanými aminokyselinami (SEQ ID NO. 2). Podtrženy jsou kodóny a aminokyseliny odpovídající mutacím N39P a T178L:
-2CZ 33404 U1 atg cag. aw ttc gtt. aaa acc egg, acc ggt, aaa ace ate ace. gtg gaa gtt gas coj, ret.
M Q I F V K T L T G K T I T L E V E P S gag acc aw gaa aac gtt aaa geg aaa ate, gag gee aaa gaa ggt ate egg ggg gag gag
D T I E R V X A K I Q D K E G Σ P P D Q gag, gaa ctg. ate tie. ggg ggt, aaa gag, ctg. gaa gag. ggt egg. acc gag, tet gag. cac aac.
QELIEAGKQLEDGRTLSDYK ate cag aaa jge tet acc gtg cag etg gtt etg gag etc gag ggt ggt cac gas cac sac
I KESTLHLVLGLEG G Η Η Η H tet- get cac cac cac acc got cac cac cac cac tet ggt tet cac cac cac tet qqt qqt <.χχ··.·χ<·· <.'»κ·χχ· χ<·χχ··.<χ- ν.·χ<·χχ· χ<·χχ·:·χ- χχ·:·χ<·χ· wexx·:·· <·χχ·:>χ<·' <.χχ·χχ·>· «.·χχ·:«χχ· ν..χχ·χχ· χ<·χχ·;.χ·· χχ·χχ<«χ·· χχ·>χχ·χ· <·χχ·χχ<< κ·χχ<>χχ· ν>χχ·χχ· ·5ν«·χχ· '·χ··ο.··.>χS G Η Η Η I G S Η Η Η, S S S Η Η 8 S GG.
gaa, aac etg. tac tee. cag tet ggt, ggt. ggt. acc atg. ggg CAC GAA CAC AGC GCG CAGTGG
EMLYF QSG G G. T M A Η E β S A QW ere AAC AAC TAC AAG AAA GGT TAT GGC TAT GGT CCG TAT CCG CTG GGT ATC AAT GGEGGT
L Μ N Y K X G Y G Y G P Y P L G I N GG
ATG CAC TAC GGC GTG GAC TTC 1ST ATG CCG ATC GGT ACC CCG GTG AAG GCG ATC AGCAGC
Μ Η Y G V D F F & P I G T P V K A I SS
GGC AAA ATT GTT GAG GCG GGT TGG AGC AAC TAT GGT GGC SGI AAC CAG ATC GGC CTGATT
S K I V E A G W 5 K Y G G G N $ I G LI
GAA AAC GAC GGT GTG CAC CGT CAA TGG TAC ATG CAC CTG AGC AAG TAT AAC GTG AAAGTT
E a D G V K R Q 5f Y Μ K L S K Y 3 V KV iJ-kl aAG GlG G\jT CAG Al L· AT 1 AGC GG1 AGl. As_c TA.T Aí^C ACC
G D Y V K A G Q I I. G W S G S T G Y 5T
GCG CCG CAC CTG CAC TTC CAG CGT ATG GTG AAC AGC TET AGC AAC AGC ACC GCG CAAGAC
APHLHFQRM V N 5 F S N S E A QD·
CCG ATG CCG TTC CTG AAG AGC GCG GGT TAT GGT AAA GCG GGC GGA TCC GTT ACC CCGACC
PMPFLKSAGY G K A G G S V T PT
CCG AAC ACC GGC TGG AAG ACC AAC AAA TAC GGC ACC CTG IAE AAA AGC GAG AGC GCGAGC
P Η T G Li X T N K Y G TLYKSESAS
TTC ACC CCG AAC ACC GAC ATC ATT CTG CGT ACC ACC GGC CCG TTT CGT AGC ATG CCGCAG
F T P K T D Σ I L R T T G F F S 5 M PQ
AGC GGC GTG CTG ΆΆΞ GCG GGT CAA ACC ATC CAC TAT GAC GAA GTT ATG AAA CAG GATSGT
S G V L K A. G Q T T β Ϊ D E V Μ K Q EG
CAC GTG TGG GTT GGT TAC ACC GGC AAC AGC GGT CAA CGT ATT TAT CTG CCG GTT CGC ACC
Η V W V G Y T G if .5 G Q RITE P V RT
TGG AAT AAA AGC ACC AAT ACC CTG GGC GTT CTG TGG GGC ACC ATC AAG TAA AGA TCT CTC w K KSTNTLGVLWGTIK-R5L
Tento genový konstrukt lze exprimovat pomocí expresního systému zahrnujícího rekombinantní 5 plasmid pro expresi termostabilní varianty β-lytické endopeptidázy, obsahující indukovatelný promotor a selekční gen, a dále obsahující sekvenci označenou výše jako SEQ ID NO. 1 kódující sekvenci ubikvitinu Ub2 a ve směru čtení od sekvence ubikvitinu Ub2 sekvenci kódující 14 HisTag, přičemž sekvence kódující His-Tag je následována sekvencí kódující štěpné místo pro TEV proteázu, viz. SEQ ID NO. 2, a sekvence kódující štěpné místo pro TEV proteázu je následována ίο nukleotidovou sekvencí pro β-lytickou endopeptidázu.
Indukovatelným promotorem může být promotor T7, selekčním genem gen pro rezistenci k antibiotiku kanamycin. Vhodným plasmidem je například expresní vektor pUbExl5 (Kobzová S, Diplomová práce, Masarykova univerzita 2017) obsahující gen pro Ub2, do něhož je vložen genový konstrukt obsahující sekvenci termostabilní varianty β-lytické endopeptidázy N39P_T178L (aM23-SH3b).
Podle původní sekvence ze Staphylococcus simulans bv. staphylolyticus byl připraven genový konstrukt obsahující gen pro termostabilní variantu β-lytické endopeptidázy. Tento gen obsahuje katalytickou doménou a vazebnou doménou, která interaguje s peptidoglykanem buněčných stěn. Termostabilní varianta β-lytické endopeptidázy N39P T178L byla navržena s využitím energetického a evolučního výpočetního přístupu stabilizace proteinů. Bylo navrženo 14 potenciálně stabilizujících jednobodových mutací β-lytické endopeptidázy. Po verifikaci jednobodových mutací bylo navrženo a experimentálně ověřeno pět dvoubodových mutací, z nichž varianta β-lytické endopeptidázy N39P T178L vykazuje zlepšení teplotní stability enzymu o 3 °C. Sekvence obsahuje dvě bodové mutace N38P (prolin za asparagin) v katalytické doméně a T178L (leucin za threonin) ve vazebné doméně.
Universální tag Ubikvitin (Ub) je protein vytvářející s většinou proteinů interakci s afinitou Kd>0,3 mM, který zakrývá hydrofobní části fúzovaného proteinu s přímým vlivem na expresi a rozpustnost proteinu. Ubikvitin Ub2 při práci s vektorem slouží jako fuzní tag, který usnadňuje práci s rekombinantními proteiny. Původně je ubikvitin eukaryotický protein o velikosti 8,5 kDa s mnoha funkcemi. Jeho sekvence je vysoce konzervovaná od jednobuněčných organismů až po člověka. Jeho přítomnost v sekvenci usnadňuje produkci, isolaci a identifikaci proteinu z hostitelského produkčního systému. Produkovanému proteinu zvyšuje rozpustnost. Sekvence 76 aminokyselin modifikovaného Ub2 je téměř totožná s lidským ubikvitinem a liší se jen ve třech aminokyselinách R42E, R72Q a R74E. Díky těmto změnám došlo ke snížení pí ubikvitinu z 7,0 na 6,2. Tato změna vedla ke zvýšení termodynamické stability fuzního endolysinu.
Dále je výhodné použít fuzní tag 14 His-Tag zajišťující vysokou výtěžnost čistého proteinu během purifikace. Díky delší a flexibilnější sekvenci nedochází u tohoto afinitního tágu ke skrytí do struktury fuzního proteinu. Tento fuzní 14 His-Tag je umístěn za Ub2 a následován štěpným místem pro TEV proteázu. Přítomnost TEV štěpného místa (podtržená sekvence NLYFQ v SEQ ID NO. 1) kódující štěpné místo pro TEV proteázu usnadňuje oddělení obou fuzních tagů pro pozdější strukturní a funkční studie.
Objasnění výkresů
Obr. 1 Bod tání původní β-lytické endopeptidázy měřený pomocí diferenciační skenovací fluorimetrie, v pufiru NaK fosfát pH6 + 400 mM NaCL
Obr. 2 Bod tání mutantní β-lytické endopeptidázy měřený pomocí diferenciační skenovací fluorimetrie, v pufiru NaK fosfát pH6 + 400 mM NaCL
Obr. 3 Bod tání původní βΐ^κ^έ endopeptidázy měřený pomocí diferenciační skenovací fluorimetrie, v pufiru NaK fosfát pH5 + 400 mM NaCL
Obr. 4 Bod tání mutantní β-lytické endopeptidázy měřený pomocí diferenciační skenovací fluorimetrie, v pufiru NaK fosfát pH5 + 400 mM NaCL
-4CZ 33404 U1
Příklady uskutečnění technického řešení
Klonování
Pro klonování rekombinantního proteinu byl použit expresní vektor pUbExl5. Tento vektor obsahuje silný promotor T7 a gen pro rezistenci k antibiotiku kanamycin, který uděluje buňkám selekční výhodu a usnadňuje expresi genů (Kobzová Š, Diplomová práce, Masarykova univerzita 2017).
Všechna subklonování a veškerá genetická manipulace byla prováděna v kmeni E. coli DH10[> (Invitrogen, Carlsbad, US). Gen pro lysostafin s bodovými mutacemi byl syntetizován firmou GenScript na zakázku podle zadání původců, jednalo se o sekvenci popsanou výše jako SEQ ID NO. 1. Navržená sekvence obsahovala místa pro restrikční štěpení. Celý gen (aM23-SH3b) byl štěpen enzymy Ncol a Xhol a vložen do vektoru pUbExl5 (Ncol, Sáli)
Transformace
Za expresní systém byl zvolen bakteriální systém E. coli buňky BL21(DE3), což jsou geneticky modifikované kmeny E. coli s upraveným genomem pro cílenou manipulaci a načasování exprese rekombinantního proteinu. Klíčovou roli zde hraje gen lad, který kóduje lac represor, a gen DE3, který nese informaci pro syntézu T7 RNA polymerázy, která je zodpovědná za transkripci inzertu. Lac represor nasedá na lac promotor (promotor genu DE3), blokuje tím syntézu T7 RNA polymerázy a transkripce neprobíhá. Pokud je v buňce přítomen IPTG, váže na sebe lac represor, který se uvolní z vazby na lac promotor a umožní tím syntézu T7 RNA polymerázy a transkripci. Transformace plasmidové DNA byla provedena metodou teplotního šoku do chemokompetentních buněk E. coli. Pro další manipulaci a analýzy byly z kolonií připraveny bakteriální konzervy, které byly zamraženy v hluboko mrazicím boxu při -80 °C, kde je možno bakterie uchovat až několik let.
Jako buňky schopné přijmout rekombinantní DNA byly tedy použity kompetentní buňky E. coli kmen BL21(DE3). Do mikrozkumavky, společně s kompetentními buňkami (100 μΐ), bylo vloženo 5 μΐ plasmidové DNA. Takto vzniklá směs byla promíchána na vortexu a ponechána na ledu. Po 30 minutách byla směs krátce zahřáta na 42 °C ve vodní lázni po dobu 1 minuty. Ke směsi bylo přidáno 500 μΐ SOC media, vzorek byl inkubován ve 37 °C 1 hodinu za stálého míchání (200 ot/min). Nakonec byl vzorek stočen ve stolní centrifuze (3 000 ot/min, 1 min, RT), určitý objem média byl odlit ave zbylém objemu (asi 100 μΐ) byl buněčný pelet rozpuštěn a nanesen na agarové misky, jež obsahovaly antibiotikum kanamycin.
Jednotlivé kolonie byly kultivovány odděleně v 5 ml LB (Luria-Bertoni) média s přídavkem příslušného antibiotika, a to opět přes noc při teplotě 37 °C za stálého třepání. Následující den byla z jednotlivých kolonií izolovaná DNA pomocí NucleoSpin® PlasmidQuickPureKit (Macherey-Nagel). Kontrola sekvence plazmidu byla provedena pomocí restrikčního štěpení enzymy BamHI a Ncol.
Příprava bakteriálních konzerv
Z agarové plotny obsahující narostlé kolonie expresních buněk bylo odpíchnuto 20 až 30 kolonií a ty byly zaočkovány do 100 ml TB média s přídavkem 1% glukózy a 50 pg/ml kanamycinu. Bakteriální suspenze rostla přes noc při 37 °C. Následovala centrifugace (10 minut, 5 000 ot/min). Pelet byl rozpuštěn ve 4 ml 10% sterilního glycerolu, rozdělen pomocí mikropipety do mikrozkumavek po objemu 1 ml, a pro další použití zamražen v tekutém dusíku a skladován na -80 °C.
-5 CZ 33404 U1
Exprese v bohatém médiu
Pro kultivaci expresních buněk nesoucích rekombinantní plasmidovou DNA bylo zvoleno LB médium s obsahem 1% glukózy. Buňky byly indukovány 0,4 mM IPTG po dosažení optické denzity 0,6 při 22 °C.
• Složení bohatého média (1 litr):
g LB média, 1 ml kanamycinu (pro výslednou koncentraci 50 pg/ml), 1% glukóza
Do jednoho litru média (bohatého či minimálního) byl přidán 1 ml bakteriální konzervy a kultivace probíhala při 37 °C po dobu 2 hodin (200 ot/min). Po této době dosáhla optická hustota (měřená při 600 nm) hodnoty 0,6 = log fáze, což je růstová fáze vhodná pro indukci pomocí IPTG o výsledné koncentraci 0,4 mM. Kultivace probíhala při 22 °C po dobu 16 hodin.
Purifikace
Pro uvolnění proteinů z bakteriálních buněk byla zvolena metoda ultrasonikace, kdy jsou buněčné stěny dezintegrovány pomocí ultrazvuku. Proteiny byly přečištěny a purifikovány pomocí afmitní metalochromatografie, využívající kompetice látek histidin - imidazol pro vazbu k niklu, který je imobilizován na matrici kolony. Purifikace byla díky histidinové kotvičce velmi efektivní a pro zisk čistého proteinu stačila její jednokroková varianta. Z jednoho litru kultury je možno získat okolo 200 mg čistého proteinu.
Kultura byla stočena (30 minut, 4 °C, 8 000 ot/min) a pelet byl rozpuštěn v 20 ml sonikačního pufru (lOOmM Tris pH 8; 500mM NaCl, lOmM imidazol; 0.1% TritonX-100). Buňky byly následně lyžovány ultrazvukovými pulzy po dobu 30 minut (doba jednoho pulsu byla 1 s, pauza mezi jednotlivými pulsy 4 s). Lyzát byl stočen (30 minut, 4 °C, 14 000 ot/min). Supernatant byl před nanesením na chromatografickou matrici zbaven zbytků buněčných stěn přečištěním přes mikrofiltr s póry o velikosti 0,22 pm. Pro purifikaci byl použit automatický purifikační systém FPLC AZURA Bio purification system s automatickým sběračem frakcí FOXY R1 a kolona naplněná matricí (Ni Sepharose High Performance) a s imobilizovaným iontem niklu (HisTrap HP, 5ml, GE Healthcare). Kolona byla promyta třemi objemy ekvilibračního pufru, který vytvořil podmínky pro vazbu histidinové kotvičky proteinu k iontům niklu. Celý objem supematantu byl na kolonu nanesen rychlostí 1 ml/min. Následně byla kolona promyta ekvilibračním pufrem, aby se vymyly nenavázané proteiny, obvykle 5 až 7 objemů kolony při rychlosti 2,5 ml/min. Pro uvolnění a vymytí cílového proteinu (SEQ ID NO. 2) byl použit eluční pufr s 300mM imidazolem.
Určení stability Lysostafinu
Pro experiment byla použita metoda Thermal Shift Assay (TSA), známá v literatuře také jako diferenciační skenovací fluorimetrie (DSF), která umožňuje stanovit optimální podmínky pro stabilizaci proteinů bez nutnosti použít specializovaný přístroj. TSA sleduje tepelné rozbalení (denaturaci) proteinu v přítomnosti fluorescenční barvy (SYPRO oranž). Barva je v nepolárním prostředí vysoce fluorescenční. Nepolární prostředí zajišťují hydrofobní místa denaturujícího se proteinu, které se při postupném zvyšování teploty odkrývají na povrch. Měřená teplota tání (Tm) proteinu tak vyjadřuje jeho stabilitu.
Do 96jamkové destičky byla aplikována směs v pořadí - pufr, voda, protein, a nakonec fluorescenční barvivo (SYPRO oranž), které je citlivé na světlo a je nutno sním manipulovat rychle, aby nedošlo k předčasné reakci. Přes destičku byla nalepena ochranná fólie a krátce stočena (max. 5 000 ot/min). Na thermocycleru byl nastaven program gradient 25 °C —> 95 °C, který zvyšuje teplotu o 0,2 °C na cyklus. Výsledky byly zpracovány pomocí softwaru LightCycler® 480 Software, verze 1.5.
-6CZ 33404 U1
Výstupem experimentu jsou křivky teploty tání pro každý testovaný pufr. Jejich vrcholem je bod tání, kdy právě polovina proteinu je v denaturovaném stavu, který určuje stabilitu proteinu. Ve fosfátovém pufru v pH 6 (NaK fosfát pH 6 + 400 mM NaCl) byl mutant stabilnější než původní 5 β-lytická endopeptidáza o 5,2 °C (obr. 1 a 2). Ve fosfátovém pufru vpH5 (NaK fosfát pH5 + 400 mM NaCl) dosáhl mutant β-lytické endopeptidázy vůbec nejvyšší stability 67,72 °C (obr. 4). Stejně tak v tomto pufru původní β-lytická endopeptidáza dosáhla nejvyšší stability 63,99 °C (obr. 3). Oproti mutantu měla ovšem endopeptidáza sníženou stabilitu o 3,71 °C.
ίο Křivky jsou vypočítané automaticky, a to dvěma numerickými metodami - Boltzmannovou metodou a metodou první derivace. Největší teplotní stabilita obou enzymů byla naměřena u pufřů v rozmezí pH 5,0 až 7,0 (tabulka 1).
| Pufr | Tm Mutant [°C] | Směrodatná odchylka | |
| 0,1 MNa-K fosfát pH 7,0 | 64,44 | ± | 1,16 |
| 0,2 M MES pH 6,2 + 400 mM NaCl | 65,08 | ± | 1,19 |
| 0,1 M Na-K fosfát pH6 | 65,28 | ± | 1,62 |
| 0,2 M MES pH 5,8 + 400 mM NaCl | 65,335 | ± | 1,48 |
| 0,1 M Na-K fosfát pH6 + 400 mM NaCl | 66,70 | ± | 2,02 |
| 0,1 M Na-K fosfát pH 5,0 + 400 mM NaCl | 67,30 | ± | 1,83 |
| Pufr | Tm WT [°C] | Směrodatná odchylka | |
| 0,1 M Na-K fosfát pH6 + 400 mM NaCl | 60,71 | ± | 1,23 |
| 0,1 M Na-K fosfát pH6 + 400 mM NaCl | 61,48 | ± | 1,92 |
| 0,1 MNa-K fosfát pH 7,0 | 61,11 | ± | 1,09 |
| 0,2 M MES pH 6,2 + 400 mM NaCl | 61,29 | ± | 0,31 |
| 0,1 M Na-K fosfát pH6 | 62,96 | ± | 0,99 |
| 0,1 M Na-K fosfát pH 5,0 + 400 mM NaCl | 64,45 | ± | 1,02 |
-7 CZ 33404 U1
SEQUENCE LISTING <110> Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i.
<120> Genový konstrukt a fúzní termostabilní lysostafin <130> UM <160>2 <170> Patentin version 3.5 <210>1 <211>1083 <212> DNA <213> artificial <220>
<223> genový konstrukt kódující mutantní beta-lytickou endopeptidázu <400> 1
| atgcagatct | tcgttaaaac | cctgaccggt | aaaaccatca | ccctggaagt | tgaaccgtct | 60 |
| gacaccatcg | aaaacgttaa | agcgaaaatc | caggacaaag | aaggtatccc | gccggaccag | 120 |
| caggaactga | tcttcgcggg | taaacagctg | gaagacggtc | gtaccctgtc | tgactacaac | 180 |
| atccagaaag | aatctaccct | gcacctggtt | ctgcagctcg | agggtggtca | ccaccaccac | 240 |
| tctggtcacc | accacaccgg | tcaccaccac | cactctggtt | ctcaccacca | ctctggtggt | 300 |
| gaaaacctgt | acttccagtc | tggtggtggt | accatggcgc | acgaacacag | cgcgcagtgg | 360 |
| ctgaacaact | acaagaaagg | ttatggctat | ggtccgtatc | cgctgggtat | caatggtggt | 420 |
| atgcactacg | gcgtggactt | ctttatgccg | atcggtaccc | cggtgaaggc | gatcagcagc | 480 |
| ggcaaaattg | ttgaggcggg | ttggagcaac | tatggtggcg | gtaaccagat | cggcctgatt | 540 |
| gaaaacgacg | gtgtgcaccg | tcaatggtac | atgcacctga | gcaagtataa | cgtgaaagtt | 600 |
| ggcgattacg | ttaaggcggg | tcagatcatt | ggctggagcg | gtagcaccgg | ttatagcacc | 660 |
| gcgccgcacc | tgcacttcca | gcgtatggtg | aacagcttta | gcaacagcac | cgcgcaagac | 720 |
| ccgatgccgt | tcctgaagag | cgcgggttat | ggtaaagcgg | gcggatccgt | taccccgacc | 780 |
| ccgaacaccg | gctggaagac | caacaaatac | ggcaccctgt | ataaaagcga | gagcgcgagc | 840 |
| ttcaccccga | acaccgacat | cattctgcgt | accaccggcc | cgtttcgtag | catgccgcag | 900 |
| agcggcgtgc | tgaaggcggg | tcaaaccatc | cactatgacg | aagttatgaa | acaggatggt | 960 |
| cacgtgtggg | ttggttacac | cggcaacagc | ggtcaacgta | tttatctgcc | ggttcgcacc | 1020 |
| tggaataaaa | gcaccaatac | cctgggcgtt | ctgtggggca | ccatcaagta | aagatctctc | 1080 |
| gag | 1083 |
-8CZ 33404 U1 <210> 2 <2H> 356 <212> PRT <213> artificial <220>
<223> mutantni beta-lytická endopeptidáza <400> 2
| Met 1 | Gin | He | Phe | Vai 5 | Lys | Thr | Leu | Thr | Gly 10 | Lys | Thr | He | Thr | Leu 15 | Glu |
| Vai | Glu | Pro | Ser | Asp | Thr | He | Glu | Asn | Vai | Lys | Ala | Lys | He | Gin | Asp |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Lys | Glu | Gly | He | Pro | Pro | Asp | Gin | Gin | Glu | Leu | He | Phe | Ala | Gly | Lys |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | Leu | Glu | Asp | Gly | Arg | Thr | Leu | Ser | Asp | Tyr | Asn | He | Gin | Lys | Glu |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ser | Thr | Leu | His | Leu | Vai | Leu | Gin | Leu | Glu | Gly | Gly | His | His | His | His |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Ser | Gly | His | His | His | Thr | Gly | His | His | His | His | Ser | Gly | Ser | His | His |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| His | Ser | Gly | Gly | Glu | Asn | Leu | Tyr | Phe | Gin | Ser | Gly | Gly | Gly | Thr | Met |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Ala | His | Glu | His | Ser | Ala | Gin | Trp | Leu | Asn | Asn | Tyr | Lys | Lys | Gly | Tyr |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Gly | Tyr | Gly | Pro | Tyr | Pro | Leu | Gly | He | Asn | Gly | Gly | Met | His | Tyr | Gly |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Vai | Asp | Phe | Phe | Met | Pro | He | Gly | Thr | Pro | Vai | Lys | Ala | He | Ser | Ser |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Gly | Lys | He | Vai | Glu | Ala | Gly | Trp | Ser | Asn | Tyr | Gly | Gly | Gly | Asn | Gin |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| He | Gly | Leu | He | Glu | Asn | Asp | Gly | Vai | His | Arg | Gin | Trp | Tyr | Met | His |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Leu | Ser | Lys | Tyr | Asn | Vai | Lys | Vai | Gly | Asp | Tyr | Vai | Lys | Ala | Gly | Gin |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| He | He | Gly | Trp | Ser | Gly | Ser | Thr | Gly | Tyr | Ser | Thr | Ala | Pro | His | Leu |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| His | Phe | Gin | Arg | Met | Vai | Asn | Ser | Phe | Ser | Asn | Ser | Thr | Ala | Gin | Asp |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Pro | Met | Pro | Phe | Leu | Lys | Ser | Ala | Gly | Tyr | Gly | Lys | Ala | Gly | Gly | Ser |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Vai | Thr | Pro | Thr | Pro | Asn | Thr | Gly | Trp | Lys | Thr | Asn | Lys | Tyr | Gly | Thr |
| 260 | 265 | 270 |
9CZ 33404 U1
Leu Tyr Lys Ser Glu
275
Leu Arg Thr Thr Gly
290
Lys Ala Gly Gin Thr
305
His Val Trp Val Gly
325
Pro Val Arg Thr Trp
340
Gly Thr lie Lys
355
Ser Ala Ser Phe Thr
280
Pro Phe Arg Ser Met
295 lie His Tyr Asp Glu
310
Tyr Thr Gly Asn Ser
330
Asn Lys Ser Thr Asn
345
Pro Asn Thr Asp lie lie
285
Pro Gin Ser Gly Val Leu
300
Val Met Lys Gin Asp Gly
315 320
Gly Gin Arg lie Tyr Leu
335
Thr Leu Gly Val Leu Trp
Claims (2)
1. Genový konstrukt pro expresi termostabilního lysostafinu, vyznačený tím, že obsahuje kódující sekvenci ubikvitinu Ub2 a ve směru čtení od sekvence ubikvitinu Ub2 sekvenci kódující 14 His-Tag, přičemž sekvence kódující 14 His-Tag je následována sekvencí kódující štěpné místo pro TEV proteázu a sekvence kódující štěpné místo pro TEV proteázu je následována nukleotidovou sekvencí kódující termostabilní variantu β-lytické endopeptidázy N39P T178L s optimalizovanou frekvencí kodonů pro E. coli, přičemž uvedený genový konstrukt má následující sekvenci:
atgcagatcttcgttaaaaccctgaccggtaaaaccatcaccctggaagttgaaccgtctgacaccatcgaaaacgttaaagcgaaaatcca ggacaaagaaggtatcccgccggaccagcaggaactgatcttcgcgggtaaacagctggaagacggtcgtaccctgtctgactacaacat ccagaaagaatctaccctgcacctggttctgcagctcgagggtggtcaccaccaccactctggtcaccaccacaccggtcaccaccaccac tctggttctcaccaccactctggtggtgaaaacctgtacttccagtctggtggtggtaccatggcgCACGAACACAGCGCGCA GTGGCTGAACAACTACAAGAAAGGTTATGGCTATGGTCCGTATCCGCTGGGTATCAA TGGTGGTATGCACTACGGCGTGGACTTCTTTATGCCGATCGGTACCCCGGTGAAGGC GATCAGCAGCGGCAAAATTGTTGAGGCGGGTTGGAGCAACTATGGTGGCGGTAACC AGATCGGCCTGATTGAAAACGACGGTGTGCACCGTCAATGGTACATGCACCTGAGCA AGTATAACGTGAAAGTTGGCGATTACGTTAAGGCGGGTCAGATCATTGGCTGGAGCG GTAGCACCGGTTATAGCACCGCGCCGCACCTGCACTTCCAGCGTATGGTGAACAGCT TTAGCAACAGCACCGCGCAAGACCCGATGCCGTTCCTGAAGAGCGCGGGTTATGGTA AAGCGGGCGGATCCGTTACCCCGACCCCGAACACCGGCTGGAAGACCAACAAATAC GGCACCCTGTATAAAAGCGAGAGCGCGAGCTTCACCCCGAACACCGACATCATTCTG CGTACCACCGGCCCGTTTCGTAGCATGCCGCAGAGCGGCGTGCTGAAGGCGGGTCA AACCATCCACTATGACGAAGTTATGAAACAGGATGGTCACGTGTGGGTTGGTTACAC CGGCAACAGCGGTCAACGTATTTATCTGCCGGTTCGCACCTGGAATAAAAGCACCAA TACCCTGGGCGTTCTGTGGGGCACCATCAAGTAAAGATCTCTCGAG (SEQ ID NO. 1).
2. Fúzní termostabilní lysostafin kódovaný genovým konstruktem podle nároku 1, vyznačený tím, že obsahuje sekvence ubikvitinu 2, 14 His-Tagu a β-lytické termostabilní endopeptidázy N39P T178L a má následující sekvenci:
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQELIFAGKQLEDGRTLSDYNIQ KESTLHLVLQLEGGHHHHSGHHHTGHHHHSGSHHHSGGENLYFQSGGGTMAHEHSAQ
- 10CZ 33404 U1
WLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMPIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQI GLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFS NSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGSVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIILRTTGP FRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVL 5 WGTIK (SEQ ID NO. 2).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ201936726U CZ33404U1 (cs) | 2019-10-09 | 2019-10-09 | Genový konstrukt a fúzní termostabilní lysostafin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ201936726U CZ33404U1 (cs) | 2019-10-09 | 2019-10-09 | Genový konstrukt a fúzní termostabilní lysostafin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ33404U1 true CZ33404U1 (cs) | 2019-11-19 |
Family
ID=68617419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ201936726U CZ33404U1 (cs) | 2019-10-09 | 2019-10-09 | Genový konstrukt a fúzní termostabilní lysostafin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ33404U1 (cs) |
-
2019
- 2019-10-09 CZ CZ201936726U patent/CZ33404U1/cs active Protection Beyond IP Right Term
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101351550B (zh) | 具有卓越的伴侣和折叠活性的嵌合融合蛋白 | |
| US20110151538A1 (en) | Affinity purification by cohesin-dockerin interaction | |
| JP2016504417A (ja) | インテイン媒介によるタンパク質の精製 | |
| EP2714727B1 (en) | High affinity sumo traps | |
| US8859237B2 (en) | Diguanylate cyclase method of producing the same and its use in the manufacture of cyclic-di-GMP and analogues thereof | |
| KR20220061126A (ko) | 카스파제-2 변이체 | |
| Araújo et al. | Influence of the histidine tail on the structure and activity of recombinant chlorocatechol 1, 2-dioxygenase | |
| US20230416708A1 (en) | Novel Variants of Endonuclease V and Uses Thereof | |
| JP2002514906A (ja) | 哺乳動物リボヌクレアーゼインヒビターおよびその使用 | |
| JP2016518855A (ja) | 融合プロテアーゼ | |
| He et al. | High-level expression of human extracellular superoxide dismutase in Escherichia coli and insect cells | |
| CZ33404U1 (cs) | Genový konstrukt a fúzní termostabilní lysostafin | |
| JP4546089B2 (ja) | 融合タンパク質 | |
| US20210163899A1 (en) | Fusion proteins for the detection of apoptosis | |
| CZ36714U1 (cs) | Termostabilní endolysin a kódující sekvence | |
| Andrianova et al. | Role of α-helical domains in functioning of ATP-dependent Lon protease of Escherichia coli | |
| JP2018521690A (ja) | タンパク質の発現、溶解性および精製を改善するための融合タンパク質タグとしてのリカバリン | |
| EP1362120A1 (en) | Method for purification of soluble ssao | |
| CN102108344A (zh) | 那西肽耐药型核糖体rna甲基转移酶、其制备方法及应用 | |
| RU2732795C1 (ru) | Рекомбинантный слитый белок | |
| KR101080750B1 (ko) | 저온 저항성을 부여하는 단백질 | |
| CZ28939U1 (cs) | Genový konstrukt a fúzní endolysin | |
| RU2451076C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНАЗЫ Ulp275 | |
| US10604778B2 (en) | BRCA2 mediated protein purification recombinase | |
| KR19990067302A (ko) | 벼 nadh-의존성 환원효소, 그의 유전자 및 그의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG1K | Utility model registered |
Effective date: 20191119 |
|
| ND1K | First or second extension of term of utility model |
Effective date: 20230919 |