CZ28939U1 - Genový konstrukt a fúzní endolysin - Google Patents
Genový konstrukt a fúzní endolysin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ28939U1 CZ28939U1 CZ2015-31540U CZ201531540U CZ28939U1 CZ 28939 U1 CZ28939 U1 CZ 28939U1 CZ 201531540 U CZ201531540 U CZ 201531540U CZ 28939 U1 CZ28939 U1 CZ 28939U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- sequence
- fusion
- expression
- ubiquitin
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 65
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title description 13
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 18
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 15
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000002367 endolytic effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 40
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Substances C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N lysine Chemical compound NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000002849 thermal shift Methods 0.000 description 4
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 4
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 2
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001195348 Nusa Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000002022 differential scanning fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000742002 Homo sapiens Prickle-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001091773 Homo sapiens Rab-interacting lysosomal protein Proteins 0.000 description 1
- 102100021559 KRR1 small subunit processome component homolog Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101150040948 RIP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035836 Rab-interacting lysosomal protein Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010944 pre-mature reactiony Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 235000019195 vitamin supplement Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládané technické řešení se týká genového konstruktu pro expresi endolytických enzymů s katalytickou aktivitou cystein-histidin dependentní amidohydrolázy, a fuzních endolysinů. Dosavadní stav techniky
Rekombinantní endolysiny obsahující CHAP doménu jsou v literatuře známy. CHAP doména je oblast s 110 až 140 aminokyselinami, která je nacházena v proteinech bakterií, bakteriofágů, archaeích, eukaryotech rodu Trypanosomidae. Název domény je akronymem cystein, histidindependentní amidohydroláza/peptidáza. Většina těchto proteinů není charakterizována, ale předpokládá se, že se mohou účastnit hlavně hydrolýzy peptidoglykanů. CHAP domény jsou často asociované s bakteriálními na buněčnou stěnu vázanými doménami typu SH3b a s několika typy amidázových domén.
Předkládané řešení si klade za cíl poskytnout genový konstrukt pro efektivní expresi endolytických enzymů s vysokou aktivitou a stabilitou a snadnou expresí, a fuzní endolysiny, z nichž se odštěpením efektivně získá výsledný enzym.
Podstata technického řešení
Předkládané technické řešení poskytuje genový konstrukt obsahující kódující sekvenci endolytického enzymu, který obsahuje kódující sekvenci ubikvitinu Ub3 a ve směru čtení od sekvence ubikvitinu Ub3 sekvenci kódující His-Tag, přičemž sekvence kódující His-Tag je následována sekvencí kódující štěpné místo pro TEV proteázu a sekvence kódující štěpné místo pro TEV proteázu je následována alespoň jednu nukleotidovou sekvencí kódující endolytický enzym vybranou ze skupiny zahrnující
- chapl 76 mající nukleotidovou sekvenci atggctaagactcaagcagaaataaataaacgtttagatgcttatgcaaaaggaacagtagatagcccttacagagttaaaaaagctacaagttatgacccatcatttggtgtaatggaagcaggagccattgatgcagatggttactatcacgct cagtgtcaagaccttattacagactatgttttatggttaacagataataaagttagaacttggggtaatgctaaagaccaaattaaacagagttat ggtactggatttaaaatacatgaaaataaaccttctactgtacctaaaaaaggttggattgcggtatttacatccggtagttatgaacagtggggt cacataggtattgtatatgatggaggtaatacttctacatttactattttagagcaaaactggaatggttatgctaataaaaaacctacaaaacgtg tagataattattacggattaactcacttcattgaaatacctgtaaaagcaggaactactgttaaaaaagaaacagctaagaaataa (SEQIDNO. 1), a
- fl mající nukleotidovou sekvenci atggctaagactcaagcagaaataaataaacgtttagatgcttatgcaaaaggaacagtagatagcccttacagagttaaaaaagctacaagttatgacccatcatttggtgtaatggaagcaggagccattgatgcagatggttactatcacgct cagtgtcaagaccttattacagactatgttttatggttaacagataataaagttagaacttggggtaatgctaaagaccaaattaaacagagttat ggtactggatttaaaatacatgaaaataaaccttctactgtacctaaaaaaggttggattgcggtatttacatccggtagttatgaacagtggggt cacataggtattgtatatgatggaggtaatacttctacatttactattttagagcaaaactggaatggttatgctaataaaaaacctacaaaacgtg tagataattattacggattaactcacttcattgaaatacctgtaaaagcaggaactactgttaaaaaagaaacagctaagaaaagcgcaagtac accggcaactagaccagttacaggttcttggaaaaagaaccagtacggaacttggtataaaccggaaaatgcaacatttgtcaatggtaacc aacctatagtaactagaataggttctccattcttaaatgctccagtaggcggtaacttaccggcaggggctacaattgtatatgacgaagtttgta tccaagcaggtcacatttggataggttataatgcttacaacggtaacagagtatattgccctgttagaacttgtcaaggtgttccacctaatcaaa tacctggcgttgcctggggagtattcaaataga (SEQ ID NO. 2).
Tento genový konstrukt se s výhodou exprimuje s pomocí expresního systému zahrnujícího rekombinantní plasmid pro expresi endolytických enzymů, obsahující indukovatelný promotor
-1 CZ 28939 Ul a selekční gen, a dále obsahujícího kódující sekvenci ubikvitinu Ub3 a ve směru čtení od sekvence ubikvitinu Ub3 sekvenci kódující His-Tag, přičemž sekvence kódující His-Tag je následována sekvencí kódující štěpné místo pro TEV proteázu a sekvence kódující štěpné místo pro TEV proteázu je následována alespoň jednou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující
- chapl 76 mající nukleotidovou sekvenci atggctaagactcaagcagaaataaataaacgtttagatgcttatgcaaaaggaacagtagatagcccttacagagttaaaaaagctacaagttatgacccatcatttggtgtaatggaagcaggagccattgatgcagatggttactatcacgct cagtgtcaagaccttattacagactatgttttatggttaacagataataaagttagaacttggggtaatgctaaagaccaaattaaacagagttat ggtactggatttaaaatacatgaaaataaaccttctactgtacctaaaaaaggttggattgcggtatttacatccggtagttatgaacagtggggt cacataggtattgtatatgatggaggtaatacttctacatttactattttagagcaaaactggaatggttatgctaataaaaaacctacaaaacgtg tagataattattacggattaactcacttcattgaaatacctgtaaaagcaggaactactgttaaaaaagaaacagctaagaaataa (SEQIDNO. 1), a
- fl mající nukleotidovou sekvenci atggctaagactcaagcagaaataaataaacgtttagatgcttatgcaaaaggaacagtagatagcccttacagagttaaaaaagctacaagttatgacccatcatttggtgtaatggaagcaggagccattgatgcagatggttactatcacgct cagtgtcaagaccttattacagactatgttttatggttaacagataataaagttagaacttggggtaatgctaaagaccaaattaaacagagttat ggtactggatttaaaatacatgaaaataaaccttctactgtacctaaaaaaggttggattgcggtatttacatccggtagttatgaacagtggggt cacataggtattgtatatgatggaggtaatacttctacatttactattttagagcaaaactggaatggttatgctaataaaaaacctacaaaacgtg tagataattattacggattaactcacttcattgaaatacctgtaaaagcaggaactactgttaaaaaagaaacagctaagaaaagcgcaagtac accggcaactagaccagttacaggttcttggaaaaagaaccagtacggaacttggtataaaccggaaaatgcaacatttgtcaatggtaacc aacctatagtaactagaataggttctccattcttaaatgctccagtaggcggtaacttaccggcaggggctacaattgtatatgacgaagtttgta tccaagcaggtcacatttggataggttataatgcttacaacggtaacagagtatattgccctgttagaacttgtcaaggtgttccacctaatcaaa tacctggcgttgcctggggagtattcaaataga (SEQ ID NO. 2).
Indukovatelným promotorem může být promotor T7, selekčním genem gen pro rezistenci k antibiotiku kanamycin. Vhodným plasmidem je například expresní vektor pETM60, v němž je gen kódující protein NusA nahrazen genem kódujícím ubikvitin Ub3 a do něhož jsou vloženy sekvence chapl 76 a/nebo/7.
Z endolysinu z bakteriofága Φ812Π byly připraveny genové konstrukce obsahující geny chapl76 a fl, a dále upraveny ve dvou variantách pro produkci rekombinantního endolysinu CHAP176, která končí aminokyselinovou sekvencí KKETAKK a obsahuje 176 aminokyselin a pro produkci rekombinantního endolysinu Fl, což je přirozený endolysin nalezený u mutanta fága Φ812Π. Tento endolysin obsahuje výše zmiňovanou CHAP doménu a navíc doménu SH3b vázající substrát peptidoglykan, ale neobsahuje střední amidázovou doménu (Ami) jako u původního fága Φ812. Endolysin Fl obsahuje 284 aminokyselin a detail napojení obou domén ukazuje následující aminokyselinová sekvence: CHAP doména KKETAKK-SASTPAT SH3b doména.
Ubikvitin Ub3 při práci s vektorem (plasmidem) slouží jako fůzní tag, který usnadňuje práci s rekombinantními proteiny. Jeho přítomnost v sekvenci usnadňuje identifikaci, produkci a izolaci proteinu z hostitelského produkčního systému. Také produkovanému proteinu přináší mnoho pozitivních vlastností jako je například vyšší rozpustnost. Ubikvitin je eukaryotický protein o velikosti 8,5 kDa s mnoha funkcemi. Jeho sekvence je vysoce konzervovaná a skládá se ze 76 aminokyselin. Sekvence modifikovaného Ub3 je napříč organismy téměř totožná a od lidského ubikvitinu se liší pouze třemi substituovanými aminokyselinami (R42—>E42, R72—>Q72 aR74—+E74):
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQELIFAGKQLEDGRTLSDYNIQ KESTLHLVLQLESASGSGHHHHHHSAGENLYFQGA (SEQ ID NO. 3),
-2CZ 28939 Ul
Universální tag Ubikvitin (Ubi) je protein vytvářející s většinou proteinů interakci s afinitou KD> 0,3 mM, který umožňuje pokrýt hydrofobní oblasti zájmového proteinu s přímým vlivem na míru exprese a rozpustnosti. Původní ubikvitin (Ubi) má však dvě nevýhody. První nevýhodou je, že má isoelektrický bod blízko neutrálního pH (pH=7,l ), což vede ke snížené rozpustnosti vpH blízkém této hodnotě. Druhou nevýhodou je, že kvůli dvěma glycinům na konci sekvence (UbiGG-X) u tohoto proteinu dochází ke spontánní degradaci (k odštěpení fůzního proteinu). Oba faktory hrají roli při uchování rozpustnosti fůzního proteinu a při zachování stabilního konstruktu. Proto byl využit nově konstruovaný ubikvitin, který nese mutace v sekvenci divokého typu (R42—»E42, R72—>Q72 a R74—>E74) a mutaci na C-konci sekvence, která mění dva C-koncové glyciny 75 a 76 na Serin 75 aAlanin 76 (VLKLKGGSGSGHHH.. na VLQLESASGSGHHH...). Díky těmto změnám došlo ke snížení pí ubikvitinu z 7,1 na 5,4 a odstranění štěpného místa pro řadu proteáz, které se vyskytují ve většině heterologních expresních systémech. Obě změny vedly k výraznému zvýšení termodynamické stability fůzního endolysinu (Ub3-Fl a Ub3CHAP176).
Dále je výhodné použít fuzní tag His-Tag zajišťující vysokou výtěžnost čistého proteinu během purifikace. His-Tag je umístěn za Ub3 a následován štěpným místem pro TEV proteázu. Přítomnost TEV štěpného místa usnadňuje oddělení obou fuzní ch tagů pro pozdější strukturní a funkční studie.
Předmětem předkládaného technického řešení je dále fuzní endolysin vybraný ze skupiny zahrnující:
Ub3-CHAP176:
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQELIFAGKQLEDGRTLSDYNIQ
KESTLHLVLQLESASGSGHHHHHHSAGENLYFQGAMAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSP
YRVKKATSYDPSFGVMEAGAIDADGYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQI
KQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYEQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWNG
YANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAKK (SEQ ID NO. 4), a
Ub3-Fl:
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQELIFAGKQLEDGRTLSDYNIQ
KESTLHLVLQLESASGSGHHHHHHSAGENLYFQGAMAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSP
YRVKKATSYDPSFGVMEAGAIDADGYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQI
KQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYEQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWNG
YANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAKKSASTPATRPVTGSWKKNQYGT
WYKPENATFVNGNQPIVTRIGSPFLNAPVGGNLPAGATIVYDEVCIQAGHIWIGYNAYN
GNRVYCPVRTCQGVPPNQIPGVAWGVFK (SEQ ID NO. 5).
Podrobný popis provedení technického řešení
Klonování
Pro klonování obou rekombinantních proteinů byl použit expresní vektor pETM60-Ub3. Tento vektor obsahuje silný promotor T7 a gen pro rezistenci k antibiotiku kanamycin, který uděluje buňkám selekční výhodu a usnadňuje expresi genů. Vektor pETM60-Ub3 je modifikovaný komerční expresní vektor pETM60, od kterého se liší nahrazením genu kódující protein NusA genem kódujícím modifikovaný lidský ubikvitin Ub3 (Rogov VV, Rozenknop A, Rogova NY, Lóhr F, Tikole S, Jaravine V, Gůntert P, Dikic I, Dótsch V. A universal expression tag for structural and functional studies of proteins, Chembiochem. 2012;13(7):959-63). Ubikvitin je eukaryotický protein o velikosti 8,5 kDa s mnoha funkcemi. Jeho sekvence je vysoce konzervovaná a skládá se ze 76 aminokyselin. Sekvence modifikovaného Ub3 je napříč organismy téměř totožná a od lidského ubikvitinu se liší pouze třemi substituovanými aminokyselinami (R42—>E42, R72—>Q72
-3CZ 28939 Ul a R74—+E74). Ubikvitin ve vektoru pETM60-Ub3 slouží jako fuzní tag, který usnadňuje práci s rekombinantními proteiny. Jeho přítomnost v sekvenci usnadňuje identifikaci, produkci a izolaci proteinu z hostitelského produkčního systému. Také produkovanému proteinu přináší mnoho pozitivních vlastností jako je například vyšší rozpustnost. Dalším z přítomných fuzních tagů v sekvenci pETM60-Ub3 je His-Tag zajišťující vysokou výtěžnost čistého proteinu během purifikace. His-Tag je umístěn za Ub3 a následován štěpným místem pro TEV proteázu. Přítomnost TEV štěpného místa usnadňuje oddělení obou fuzních tagů pro pozdější strukturní a funkční studie.
Transformace
Za expresní systém byl zvolen bakteriální systém E. coli, a to zejména pro nízké náklady na kultivaci, vysokou rychlost růstu a vysokou výtěžnost exprese. Lze použít například expresní buňky BL21(DE3)ripl (Novagen), což jsou geneticky modifikované kmeny E. coli s upraveným genomem pro cílenou manipulaci a načasování exprese rekombinantního proteinu. Klíčovou roli zde hraje gen láci, který kóduje lac represor, a gen DE3, který nese informaci pro syntézu T7 RNA polymerázy, která je zodpovědná za transkripci inzertu. Lac represor nasedá na lac promotor (promotor genu DE3), blokuje tím syntézu T7 RNA polymerázy a transkripce neprobíhá. Pokud je v buňce přítomen IPTG, váže na sebe lac represor, který se uvolní z vazby na lac promotor a umožní tím syntézu T7 RNA polymerázy a transkripci. Kmen RILP obsahuje navíc kopie genů kódujících kódující tRNA pro arginin, izoleucin, leucin a prolin, které jsou normálně v buňce E. coli zastoupeny v malé míře. Rovněž lze použít buňky E. coli 66, uložené v laboratoři přihlašovatele, jejich transformací byly získány kmeny CCM 8622 a CCM 8623. Transformace plasmidové DNA byla provedena metodou teplotního šoku do chemokompetentních buněk E. coli. Pro další manipulaci a analýzy byly z kolonií připraveny bakteriální konzervy, které byly zamraženy v hluboko mrazicím boxu při -80 °C, kde je možno bakterie uchovat až několik let.
Exprese proteinů v bohatém a minimálním médiu
Pro kultivaci expresních buněk nesoucích rekombinantní plasmidovou DNA byly zvoleny dvě strategie: kultivace v minimálním médiu (médium obsahující pouze nezbytný zdroj uhlíku a dusíku, vitamíny a stopové prvky) a kultivace v médiu na výživu bohatém.
Strategie minimálního média byla použita pro expresi 13C, 15N značeného proteinu, dále použitelného pro studium struktury pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR). Strategie bohatého média byla použita pro simulaci provozních podmínek výroby a pro ověření enzymatických vlastností proteinů. Obě kultivace byly optimalizovány pro maximum výtěžku funkčního proteinu. Důraz byl kladen především na dobu a teplotu kultivace, kdy nejlepší výsledky v poměru výtěžnost/aktivita byly zaznamenány při teplotě 22 °C pro dobu kultivace 8 hodin v bohatém médiu a 12 hodin v médiu minimálním. Exprese genů kódujících endolysiny byla indukovaná pomocí IPTG o koncentraci v rozmezí 0,2 až 1 mM. Koncentrace IPTG neměla na produkci výsledných proteinů žádný výrazný vliv.
Purifikace
Pro uvolnění proteinů z bakteriálních buněk byla zvolena metoda ultrasonikace, kdy jsou buněčné stěny dezintegrovány pomocí ultrazvuku. Podmínky byly zvoleny a navrženy v souvislosti s choulostivými vlastnostmi obou enzymů. Oba proteiny byly přečištěny a purifikovány pomocí afinitní metalochromatografie, využívající kompetice látek histidin - imidazol pro vazbu k niklu, který je imobilizován na matrici kolony. Purifikace byla díky histidinové kotvičce velmi efektivní a pro zisk čistého proteinu stačila její jednokroková varianta. Oba proteiny, Ub3-CHAP176 i Ub3-Fl, se vymývají ve chvíli, kdy obsah imidazolu v elučním pufru dosáhne 120 mM koncentrace. Z jednoho litru kultury je možno získat okolo 100 mg čistého proteinu.
Objasnění výkresu
Obr. 1 znázorňuje plasmid pETM60-Ub3 použitý v příkladech provedení.
-4CZ 28939 Ul
Obr. 2 znázorňuje vliv vápníku na stabilitu enzymů. A: 100 mM Tris pH 8,0, Tm = 40,5 °C, B: 100 mM Tris pH 8,0, 5 μΜ CaCl2, Tm = 46,4 °C, C: 100 mM Tris pH 8,0, 0,5 mM CaCl2, Tm = 48,4 °C, D: 100 mM Tris pH 8,0, 1 mM CaCl2, Tm = 49,4 °C, F: 100 mM Tris pH 8,0, 3 mM CaCl2, Tm = 49,9 °C, G: 100 mM Tris pH 8,0, 5 mM CaCl2, Tm = 50,1 °C.
Příklady provedení technického řešení
Klonování
Všechny subklonování a veškerá genetická manipulace byla prováděna v kmeni E. coli ϋΗΙΟβ (Invitrogen, Carlsbad, US). Klonování bylo prováděno v expresním systému označovaném pETM60-Ub3. DNA kódující gen pro endolysin Lys812 byla původně isolována z bakteriofága Φ812Π, jehož hostitelským kmenem je Staphylococcus aureus 812 a klonována do expresního plasmidu. PCR primery s vhodně doplněnými restrikčními místy byly navrženy podle programu Oligo7. Na klonování genu fl do plasmidu pETM60-Ub3, byly použity následující dva primery: Forward primer ,,/7“ s počátečním Ncol místem: 5 '-AGCCATGGCTAAGACTCAAGCAGAAAT-3'a Revers primer ,,/7“ s konečným štěpícím místem pro BamHI: 5 -TGTGGATCCTTATTTCTTAGCTGTTTCTTTTTTAACAGTAGTTCC -3', navržená restrikční místa jsou vyznačena podtržením. Na klonování genu chapl76 do plasmidu pETM60-Ub3, byly použity následující dva primery: Forward primer „chap“ s počátečním Ncol místem: 5 '-AGCCATGGCTAAGACTCAAGC-3' a Revers primer „chap“ s konečným štěpícím místem pro BamHI: 5 '-TGTGGATCCTTATTTGAATACTCCCC AGGC-3navržená restrikční místa jsou vyznačena podtržením. PCR produkty byly štěpeny pomocí dvou restrikčních enzymů Ncol a BamHI (TAKARA, Kyoto, Japan) a následně purifikovány na agarózovém gelu. Výsledný fragment nesoucí gen chapl76 nebo fl byl extrahován z gelu pomocí kituGenElute™ Gel ExtractionKit (Sigma Aldrich, USA) a ligován do podobně štěpeného, defosfoiylovaného, na TBE agarózovém gelu purifikovaného a z gelu extrahovaného plasmidu pETM60-Ub3. Byly použity různé koncentrace a poměry insertu k plasmidu. Výsledná ligační směs byla inkubována s T4 DNA Ligázou (New England Biolabs, GBR) po dobu 16 h při teplotě 17 °C a následně poté transformována do buněk E. coli 66 s výslednou efektivitou jednotek až desítek kolonií. Na miskách s kanamycinovou rezistencí narostlé kolonie byly testovány, zda obsahují klonovaný insert. Ze sedmi kolonií byla isolována plasmidová DNA, která byla štěpena NcoI/BamHI restrikčními enzymy. Všechny testované kolonie měly daný insert. Pro ověření přítomnosti insertu byly vybrány dvě kolonie, z nichž byla připravena DNA pomoci Qiagenkitu (QIAprep Spin Miniprep, QIAGEN, USA). DNA byla ověřena sekvenováním firmou Macrogen (Jižní Korea). Získané transformované kmeny E. coli byly uloženy v CCM pod ukládacím číslem CCM 8622 (kmen nesoucí plasmid s chapsl 76) a CCM 8623 (kmen nesoucí plasmid s fl).
Transformace
Na ledu a za sterilních podmínek bylo smícháno 37,5 μΐ sterilní vody s 10 μΐ 5 x KCM. Poté bylo přidáno 5 μΐ DNA o koncentraci ~20 pg/ml a 100 μΐ kompetentních buněk. Směs byla inkubována po 20 minut za stálého chlazení ledem, poté následovala inkubace po dobu 10 minut při laboratorní teplotě. Dále bylo přidáno 400 μΐ LB média obohaceného o 1% glukózu a inkubace probíhala po dobu jedné hodiny za stálého míchání (300 rpm).
Suspenze byla v objemech 50 μΐ, 100 μΐ a 300 μΐ vyseta na agarové plotny s antibiotikem kanamycinem (50 pg/ml) a inkubována přes noc při teplotě 37 °C. Jednotlivé kolonie byly kultivovány odděleně v 5 ml LB média s přídavkem příslušného antibiotika a to opět přes noc při teplotě 37 °C za stálého třepání. Následujícího rána byla z jednotlivých kolonií izolovaná DNA pomocí NucleoSpin® PlasmidQuickPureKit (Macherey-Nagel). Kontrola sekvence plazmidu byla provedena pomocí restrikčního štěpení enzymy BamHI a Ncol.
Příprava bakteriálních konzerv
Z agarové plotny obsahující narostlé kolonie expresních buněk bylo odpíchnuto 20 až 30 kolonií a ty byly zaočkovány do 100 ml TB média s přídavkem 1% glukózy a 50 pg/ml kanamycinu a 30 pg/ml chloramfenikolu, jakožto selekčních antibiotik. Bakteriální suspenze rostla přes noc
-5CZ 28939 Ul pri 37 °C. Následovala centrifugace (10 minut, 5 000 rpm). Pelet byl rozsuspendován ve 4 ml 10% sterilního glycerolu, rozpipetován do mikrozkumavek po objemu 1 ml, a pro další použití zamražen v tekutém dusíku a skladován na -80 °C.
Exprese v bohatém a minimálním médiu • Složení bohatého média (1 litr):
g LB média, 1 ml kanamycinu (pro výslednou koncentraci 50 pg/ml) • Složení minimálního media (1 litr):
15,03 g Na2HPO4x 12 H2O, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl, 0,5 g NH4C1 /15 NH4CI, g glukózy (=10 ml 20% roztoku glukózy) / 13C glukózy, 2 ml 1M MgSO4, μΐ 1M CaCl2,1 ml 0,01M FeSO4> 1 ml roztoku stopových prvků, 1 ml roztok vitamínů, ml kanamycinu (pro výslednou koncentraci 50 pg/ml)
| Roztok vitamínů (lOOOx): | Roztok stopových prvků (lOOOx): | ||
| 1 g | D-biotin | 0,73 mg | Na2MoO4 x 2 H2O |
| 0,5 g | kyselina listová | 24,7 mg | H3BO3 |
| 1 g | myo-inositol | 7,14 mg | CoC12x6H2O |
| 0,5 g | nikotinamid | 2,5 mg | CuSO4x5H2O |
| 0,5 g | pyridoxal HC1 | 13,5 mg | MnSO4x7H2O |
| 0,5 g | thiaminHCl | 2,9 mg | ZnSO4x7H2O |
| *Glukóza, MgSO4, CaCl2, | , FeSO4, stopové prvky | a vitaminové doplňky je nutno sterili- | |
| zovat filtrací (mikrofiltr s | velikostí pórů 0,22 pm). Ostatní komponenty je možno jedno- | ||
| duše autoklávovat. Roztok FeSO4je nutno skladovat při teplotě -20 °C. Pokud je roztok | |||
| nahnědlý, je nutno ho připravit čerstvý. |
Do jednoho litru média (bohatého či minimálního) byl přidán 1 ml bakteriální konzervy a kultivace probíhala při 37 °C po dobu 6 hodin (200 rpm). Po této době dosáhla optická hustota (měřená při 600 nm) hodnoty 0,6 = log fáze, což je růstová fáze vhodná pro indukci pomocí IPTG o výsledné koncentraci 1 mM/L. Kultivace probíhala při 22 °C po dobu 8 hodin v případě média bohatého či po dobu 12 hodin v případě média minimálního.
Purifikace
Kultura byla stočena (30 minut, 4 °C, 8 000 rpm) a pelet byl rozsuspendován v 20 ml sonikačního pufru (100 mM Tris pH 8; 500 mM NaCl, 4 mM DTT, 10 mM imidazol; 0.1% TritonX100). Buňky byly následně lyžovány ultrazvukovými pulzy o výkonu 40 W po dobu 45 minut (doba jednoho pulsu byla 1 s, pauza mezi jednotlivými pulsy 4 s). Lyzát byl stočen (1 h, 4 °C, 14 000 rpm). Supematant byl před nanesením na chromatografickou matrici zbaven zbytků buněčných stěn přečištěním přes mikrofiltr s póry o velikosti 0,22 pm. Pro purifikaci byl použit automatický purifíkační systém AKTA FPLC s automatickým sběračem frakcí Frac-950 (GE Healthcare) a kolona naplněná matricí (Ni Sepharose High Performance) a s imobilizovaným iontem niklu (HisTrap HP, 5 ml, GE Healthcare). Kolona byla promyta 3 objemy ekvilibračního pufru, který vytvořil podmínky pro vazbu histidinové kotvičky proteinu k iontům niklu. Celý objem supematantu byl na kolonu nanesen rychlostí 1 ml/min. Následně byla kolona promyta ekvilibračním pufrem, aby se vymyly nenavázané proteiny, obvykle 5 až 7 objemy kolony při rychlosti 1 ml/min.Pro uvolnění a vymytí cílového proteinu byl použit vzestupný lineární gradient elučního pufru. Protein se uvolňuje při 120 mM koncentraci imidazolu (40% gradient). Odštěpování fúzních tagů
Po purifikaci byly frakce obsahující proteiny Ub3-CHAP176 a Ub3-Fl pomocí PD-10 kolonek očištěny od zbytků imidazolu a rovněž byl snížen obsah NaCl. Původní pufr byl vyměněn za pufr
-6CZ 28939 Ul vhodný pro reakci TEV proteázy, která odštěpuje fuzní tágy (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 2 mM DTT, 3 mM NaN3). Reakce byla prováděna při teplotě 25 °C po dobu 2 hodin. Optimální poměr fuzní protein/TEV proteáza byl pro CHAP176 1:10 a pro F1 1:70. TEV proteáza a odštěpené tágy byly od enzymů odděleny pomocí afinitní metalochromatografie.
Určení stability endolysinů CHAP176 a F1
Pro experiment byla použita metoda Thermal Shift Assay (TSA), známá v literatuře také jako diferenciační skenovací fluorimetrie (DSF), která umožňuje stanovit optimální podmínky pro stabilizaci proteinů bez nutnosti použít specializovaný přístroj. TSA sleduje tepelné rozvíjení (denaturaci) proteinu v přítomnosti fluorescenční barvy (např. SYPRO oranž). Barva je v nepolárním prostředí vysoce fluorescenční. Nepolární prostředí zajišťují hydrofobní místa rozvíjejícího se proteinu, které se při postupném zvyšování teploty odkrývají na povrch. Měřená teplota tání (Tm) proteinu tak vyjadřuje jeho stabilitu.
Do 96 - jamkové destičky byla aplikována směs v pořadí - voda, pufr, protein a nakonec fluorescenční barva, která je citlivá na světlo a je nutno s ní manipulovat rychle, aby nedošlo k předčasné reakci. Přes destičku byla nalepena ochranná fólie a krátce zcentrifugována (max. 5 000 rpm). Na thermocycleru byl nastaven program gradient 20 °C —> 90 °C, který zvyšuje teplotu o 0,2 °C na cyklus. Výsledky byly zpracovány pomocí softwaru Protein ThermalShift™. Výstupem experimentu jsou křivky teploty tání prO každý testovaný pufr (Obr. 2). Jejich vrcholem je bod tání, který určuje stabilitu proteinu. Křivky jsou vypočítané automaticky a to dvěma numerickými metodami - Boltzmannovou metodou (vrchní křivka) a metodou první derivace (spodní křivka). V experimentu se základní testovací sadou pufrů se jako nejvíce stabilizující pufr pro oba testované proteiny ukázal 100 mM HEPES (pH7,5) s přídavkem 200 mM NaCl a 100 mM Tris-HCl (pH 8,5) s přídavkem 200 mM NaCl. V experimentu s rozšířenou testovací sadou pufrů se nejvíce stabilizující pufr pro oba testované proteiny ukázal 100 mM Tris pH 8,0, 5 mM CaCl2, Tm = 50,1 °C.
Claims (1)
- NÁROKY NA OCHRANU1. Genový konstrukt obsahující kódující sekvenci endolytického enzymu, vyznačený tím, že obsahuje kódující sekvenci ubikvitinu Ub3 a ve směru čtení od sekvence ubikvitinu Ub3 sekvenci kódující His-Tag, přičemž sekvence kódující His-Tag je následována sekvencí kódující štěpné místo pro TEV proteázu a sekvence kódující štěpné místo pro TEV proteázu je následována alespoň jednou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující- chapl76mající nukleotidovou sekvenci
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-31540U CZ28939U1 (cs) | 2015-09-21 | 2015-09-21 | Genový konstrukt a fúzní endolysin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-31540U CZ28939U1 (cs) | 2015-09-21 | 2015-09-21 | Genový konstrukt a fúzní endolysin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ28939U1 true CZ28939U1 (cs) | 2015-12-07 |
Family
ID=54883632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2015-31540U CZ28939U1 (cs) | 2015-09-21 | 2015-09-21 | Genový konstrukt a fúzní endolysin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ28939U1 (cs) |
-
2015
- 2015-09-21 CZ CZ2015-31540U patent/CZ28939U1/cs not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Widhalm et al. | Phylloquinone (vitamin K1) biosynthesis in plants: two peroxisomal thioesterases of lactobacillales origin hydrolyze 1, 4‐dihydroxy‐2‐naphthoyl‐coa | |
| Kinney et al. | Elucidating essential role of conserved carboxysomal protein CcmN reveals common feature of bacterial microcompartment assembly | |
| Terauchi et al. | RcaE is a complementary chromatic adaptation photoreceptor required for green and red light responsiveness | |
| Lu et al. | Split intein facilitated tag affinity purification for recombinant proteins with controllable tag removal by inducible auto-cleavage | |
| Wiegard et al. | Biochemical analysis of three putative KaiC clock proteins from Synechocystis sp. PCC 6803 suggests their functional divergence | |
| Roy et al. | Broad range amino acid specificity of RNA-dependent lipid remodeling by multiple peptide resistance factors | |
| Zhao et al. | A multifunctional tag with the ability to benefit the expression, purification, thermostability and activity of recombinant proteins | |
| ES2824029T3 (es) | Variantes de mevalonato difosfato descarboxilasa | |
| Gerova et al. | Endolysin of bacteriophage BFK20: evidence of a catalytic and a cell wall binding domain | |
| Farhangnia et al. | Cloning, expression, and purification of recombinant Lysostaphin from Staphylococcus simulans | |
| CN102421892B (zh) | 二鸟苷酸环化酶、其生产方法及其在制备环化-di-GMP及其类似物中的应用 | |
| Proença et al. | A two‐component, multimeric endolysin encoded by a single gene | |
| Binnenkade et al. | Characterization of ExeM, an extracellular nuclease of Shewanella oneidensis MR-1 | |
| Nagashima et al. | Arabidopsis tRNA ligase completes the cytoplasmic splicing of bZIP60 mRNA in the unfolded protein response | |
| Yung et al. | Re-directing bacterial microcompartment systems to enhance recombinant expression of lysis protein E from bacteriophage ϕX174 in Escherichia coli | |
| Godin‐Roulling et al. | Functional adaptations of the bacterial chaperone trigger factor to extreme environmental temperatures | |
| Brunialti et al. | Promiscuity, stability and cold adaptation of a newly isolated acylaminoacyl peptidase | |
| Kaur et al. | The peptidyl-prolyl cis-trans isomerase activity of the wheat cyclophilin, TaCypA-1, is essential for inducing thermotolerance in Escherichia coli | |
| Budiman et al. | Role of polar and nonpolar residues at the active site for PPIase activity of FKBP22 from Shewanella sp. SIB1 | |
| He et al. | Cloning and characterization of two novel chloroplastic glycerol-3-phosphate dehydrogenases from Dunaliella viridis | |
| JP2016518855A (ja) | 融合プロテアーゼ | |
| Sheppard et al. | Characterization of an endoplasmic reticulum-associated silaffin kinase from the diatom Thalassiosira pseudonana | |
| Chodisetti et al. | A LytM-domain factor, ActS, functions in two distinctive peptidoglycan hydrolytic pathways in E. coli | |
| Rudolph et al. | Truncation of N-terminal regions of Digitalis lanata progesterone 5β-reductase alters catalytic efficiency and substrate preference | |
| Feng et al. | A novel self-cleavage system for production of soluble recombinant protein in Escherichia coli |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG1K | Utility model registered |
Effective date: 20151207 |
|
| MK1K | Utility model expired |
Effective date: 20190921 |