CN113174398A - 一种用于重组表达棘白菌素b脱酰基酶的表达盒及应用 - Google Patents

一种用于重组表达棘白菌素b脱酰基酶的表达盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒及应用，所述表达盒包括依次连接的启动子核酸序列、RBS核酸序列、编码OmpA信号肽的核酸序列、编码第一促溶肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列、第一终止密码子、RBS核酸序列、编码OmpA信号肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列、编码第二促溶肽的核酸序列、第二终止密码子，其中，第一促溶肽的氨基酸序列为：GEGEG；第二促溶肽的氨基酸序列为：KKKKKK。本发明表达盒能够用于表达获得棘白菌素B脱酰基酶，通过两种特定序列促溶肽的加入，使得棘白菌素B脱酰基酶能够有效且高效表达，发酵培养得到的菌体破碎后酶活可高达57.88U/g。

Description

一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒及应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒及应用。
背景技术
真菌感染是指由真菌微生物引起的感染。近年来，真菌感染造成的死亡人数不断增多，其原因与皮质激素、细胞毒性药物、光谱抗生素及免疫抑制剂等在临床中的广泛应用有关。棘白菌素类药物作为与细胞壁合成酶作用的抑制剂普遍存在抗菌活性强，与其他药物不存在拮抗作用等特点，其中尤以阿尼芬净最为突出，其具有较大的分布容积和光谱抗菌性，不经肝脏代谢，不存在交叉耐药性等优点，而生物法催化生产阿尼芬净前体已经成为国内外抗真菌药物研究的热点。
Echinocandin B脱酰基酶(ECBD)能够通过裂解亚油酰基侧链来催化Echinocandin B(ECB)向环状六肽棘皮菌素B核(ECBN)的转化，这是半合成新型抗真菌药物阿尼芬净(anidulafungin)的关键中间体。Echinocandin B脱酰基酶(ECBD)属于N末端亲核酶(Ntn)水解酶超家族，其前体由信号肽(SP)，α亚基，连接肽(LP)和β亚基组成。
亚基重构(Subunit reconsititution)是指针对多亚基蛋白的一种结构域再安排，与循环排列类似(Circular permutation)，多见于抗体基因在大肠杆菌中的表达，由于在目的基因中含有内含子或连接肽等无功能活性的基因，将原本单链多亚基的蛋白利用基因工程的方法将其独立表达后再利用蛋白的自组装形成活性结构域，该过程本身不会导致对现有蛋白质序列的任何氨基酸取代，而只是重组了多肽链中残基的顺序。而且此方法规避了单链多亚基蛋白在大肠杆菌中复杂的成熟过程，更有利于拥有复杂基因结构的蛋白在大肠杆菌中的成功表达。
近几年来，棘白菌素B脱酰基酶的异源表达宿主主要为链霉菌，如变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌等。但是链霉菌的基因分子操作很不便利，可供使用的载体与改造方法也有限(如更换质粒的拷贝数、更换强启动子与信号肽等方法)。而且其发酵周期与代谢调控与大肠杆菌相比复杂很多。
在通过亚基重构(Subunit reconsitituion)解决了单链多亚基蛋白在大肠杆菌中复杂的成熟过程后，成功将棘白菌素B脱酰基酶大肠杆菌中的活性表达。但是其活性与可溶性并不理想。大量的包涵体在周质空间内聚集，无活性的蛋白甚至对大肠杆菌的生长产生了一定的阻碍。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供了一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒及应用。
一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒，包括依次连接的启动子核酸序列、RBS核酸序列、编码OmpA信号肽的核酸序列、编码第一促溶肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列、第一终止密码子、RBS核酸序列、编码OmpA信号肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列、编码第二促溶肽的核酸序列、第二终止密码子，
其中，第一促溶肽的氨基酸序列为：GEGEG；第二促溶肽的氨基酸序列为：KKKKKK。
优选的，其中，RBS核酸序列：TTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA；编码OmpA信号肽的核酸序列：ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC；编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列与第一终止密码子的核酸序列：如SEQ ID No.6所示；编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列：如SEQ ID No.7所示。
所述的表达盒，包括启动子的核酸序列如SEQ ID No.24所示。启动子可以使用常用的启动子，且可以根据所要表达的宿主细胞来源进行选择，比如原核表达的宿主细胞中可以选择T7启动子。
本发明又提供了所述表达盒在重组表达棘白菌素B脱酰基酶中的应用。
本发明又提供了包含所述表达盒的重组表达载体。
本发明又提供了包含所述重组表达载体的基因工程菌，由宿主菌中转入所述重组表达载体得到。优选的，所述基因工程菌，宿主菌为大肠杆菌，比如常用的E.coli BL21(DE3)菌株。宿主菌为大肠杆菌时，重组表达载体使用的是在大肠杆菌中表达的表达载体，比如，可以使用常用的pET28a(+)载体，当然也可以使用其他载体。
本发明还提供了一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的方法，将所述基因工程菌在培养基中发酵表达棘白菌素B脱酰基酶。优选的，所述基因工程菌用浓度为0.2～0.6mM的IPTG诱导；IPTG诱导时间5～20h；发酵温度16℃～24℃。更优选的，所述基因工程菌用浓度为0.4mM的IPTG诱导；IPTG诱导时间15h；发酵温度20℃。
有益效果：本发明用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒能够用于表达获得棘白菌素B脱酰基酶，通过两种特定序列促溶肽的加入，使得棘白菌素B脱酰基酶能够有效且高效表达，发酵培养得到的菌体破碎后酶活可高达57.88U/g。
附图说明
图1为重组质粒pT7-α/β的图谱，质粒骨架为pET28a(+)。
图2为重组质粒pT7-α/β与不同的促溶短肽融合表达在E.coli BL21(DE3)细胞破碎上清的SDS-PAGE电泳图。
图3为重组质粒pT7-α/β与不同的促溶短肽融合表达后的粗酶液酶活结果图。
图4为重组质粒pT7-α/β与不同的促溶短肽的构建方法示意图。
图5为重组菌株T7-GE-α/β-6K的诱导剂浓度优化检测结果图。
图6为重组菌株T7-GE-α/β-6K的培养温度优化检测结果图。
图7为重组菌株T7-GE-α/β-6K的诱导时长优化检测结果图。
具体实施方式
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB(g/L)：胰蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH 7.0；
发酵培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油5g/L，KH2PO4 2.31g/L，K2HPO412.54g/L，pH 7.5。接种前添加卡那霉素至终浓度50μg·mL-1。
棘白菌素B脱酰基酶酶活测定方法：
在35℃下，在总共1mL反应混合物中测定ECBD活性，该混合物由pH 7、0.1M磷酸钠缓冲液和0.2g/L ECB组成。反应在600rpm下进行30分钟。反应结束后，离心以终止反应。之后采用HPLC检测产物生成。一个单位ECBD活性(U)定义为在35℃，pH 7的标准条件下每分钟产生1μg ECBN所需的酶量。比活性(U/g)定义为每克干细胞所具有的活性。
实施例1
重组菌株E.coli BL21(DE3)/pT7-α/β的构建。
1、棘白菌素B脱酰基酶编码基因密码子优化及合成
棘白菌素B脱酰基酶由实验室保藏质粒获得。
根据大肠杆菌密码子偏好性，通过人工设计并合成经过密码子优化的棘白菌素B脱酰基酶编码核苷酸(DNA)序列，经过测序验证，获得目的基因片段。
棘白菌素B脱酰基酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其优化后的核酸序列如SEQID NO.2所示，其中，信号肽编码序列1-96bp，α亚基编码序列97-645bp(优化后的序列，加上TAA作为终止密码子后的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示)，连接肽编码序列646-690bp，β亚基编码序列691-2364bp(优化后的序列，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示)。
2、重组质粒的构建
将经合成的基因片段，采用一步克隆法与pET28a(+)载体(购自于Novagen公司)进行连接后获得质粒载体pT7-α/β(图1)。
设计引物如下：
上游引物ECBD-F(小写字母表示同源臂)：
5'-agaaggagagaattcATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTG-3'；
下游引物ECBD-R(小写字母表示同源臂)：
5'-tgcggccgcaagcttTTACGACCACGTTGCGCAAC-3'。
线性化扩增质粒引物如下：
上游引物28a-F：5'-AAGCTTGCGGCCGCACTC-3'；
下游引物28a-R：5'-GAATTCTCTCCTTCTTAAAGTTAAACAA-3'。
3、重组菌株的构建
将重组表达质粒pT7-α/β转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(购自Invitrogen公司)感受态细胞，获得菌株T7-α/β，将转化后感受态细胞涂布含50μg/mL卡那霉素抗性的LB-琼脂平板(含有LB固体培养基的平板培养基)，37℃培养过夜(大肠杆菌感受态细胞制备及转化参照分子克隆实验室手册)。
(1)挑取活化的菌落于100mL发酵培养基中，37℃、180rpm培养2h使OD 600达到0.4；所述发酵培养基的组分为：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油5g/L，KH2PO4 2.31g/L，K2HPO4 12.54g/L；
(2)向发酵液中加入终浓度0.2mmol·L-1的诱导剂IPTG，转到16℃，180rpm摇床中诱导产酶；
(3)将获得的发酵液，离心收集菌体沉淀，沉淀用0.1mM PBS缓冲液洗涤2次后重悬，菌悬液经适当倍数稀释后利用超声破碎仪破碎细胞，破碎液离心后即得胞内粗酶液。
4、样品处理及检测
再将发酵菌液置于50mL离心管中，于4℃、5000rpm离心5min，弃去上清，收集菌体细胞；将离心后的菌体用等体积的0.1mM PBS重悬，置于冰上进行超声破碎，将破碎后细胞悬液置于4℃、8000rpm离心10min，分别收集离心上清(破碎细胞上清部分)和细胞碎片(破碎细胞沉淀组分)。
在35℃下，在总共1mL反应混合物中测定ECBD活性，该混合物由pH 7、0.1M磷酸钠缓冲液和0.2g/L ECB组成。反应在600rpm下进行30分钟。反应结束后，离心以终止反应。之后采用HPLC检测产物生成。一个单位ECBD活性(U)定义为在35℃，pH 7的标准条件下每分钟产生1μg ECBN所需的酶量。比活性(U/g)定义为每克干细胞所具有的活性。
然后采用标准的SDS-PAGE电泳方法和酶活性检测确定重组蛋白的表达水平和酶活力，分析目的蛋白的在破碎细胞上清部分和破碎细胞沉淀部分的比例分布(结果如图2所示)，构建的菌株T7-α/β的上清于沉淀中都能看到明显的α与β亚基的条带。
实施例2
重组菌株T7-α/β-6K，T7-GE-α/β-6K，T7-GK-α/β-6K，pT7-GE-α/β的构建。
1、含有不同促溶短肽的重组菌株的构建
其中短肽的核酸序列为：
6K促溶短肽(氨基酸序列KKKKKK)：aaaaaaaaaaaaaaaaaa；
GE促溶短肽(氨基酸序列GEGEG)：ggagaaggagaagga；
GK促溶短肽(氨基酸序列GKGKG)：ggtaaaggtaaaggt。
所用引物序列为：
GKGKG融合-F：
AGCGCAGGCCggtaaaggtaaaggtCATGATGGTGGCTACGCGGCGCTGAT；
GKGKG融合-R：
GCGCCGCGTAGCCACCATCATGacctttacctttaccGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAA；
GEGEG融合-F：
TAGCGCAGGCCggagaaggagaaggaCATGATGGTGGCTACGCGGCGCTGATCCG；
GEGEG融合-R：
GCGCCGCGTAGCCACCATCATGtccttctccttctccGGCCTGCGCTACGGTAGCGAA；
6K-F：
GAAGCGCCGGACGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAggatcctaatacgactcactatagg；
6K-R：
cgtattaggatccTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCGTCCGGCGCTTCCGGCGCGCTC，
将所选的促溶短肽进行合理的组合后与载体pT7-α/β进行融合表达，导入到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，分别构建含有pT7-GE-α/β-6K(表达盒不包括启动子的核酸序列如SEQ ID No.24所示，pET28a(+)载体上使用T7启动子)，pT7-GK-α/β-6K，pT7-α/β-6K，pT7-GE-α/β质粒的四种E.coli BL21(DE3)宿主菌，分别命名为T7-GE-α/β-6K，T7-GK-α/β-6K，T7-α/β-6K，T7-GE-α/β(图4)。
挑取活化的菌落于100mL发酵培养基中，37℃、180rpm培养2h使OD600达到0.4；向发酵液中加入终浓度0.2mmol·L-1的诱导剂IPTG，转到16℃，180rpm摇床中诱导产酶。
2、样品处理及检测
参照实施例1中样品处理和检测方法，收集处理并检测样品。
结果显示当与多种促溶短肽融合表达之后棘白菌素B脱酰基酶可溶性表达水平有显著提升。如图3所示，含有两个短肽融合表达的菌株T7-GE-α/β-6K活力最高，此时棘白菌素B脱酰基酶酶活力18.56U/g，是单独表达酶活力的3倍。而只使用一种短肽的菌株活力与对照相差并不是很大，而且菌株T7-GK-α/β-6K活性最低，推测是因为两种短肽的静电力相斥导致的亚基组装效率下降。
实施例3
重组菌株T7-GE-α/β-6K的发酵条件优化。
1、重组菌株T7-GE-α/β-6K的诱导剂浓度优化。
众所周知，除了表达宿主本身以外，表达条件在很大程度上影响重组酶的生产率。因此，我们研究IPTG浓度，诱导温度和诱导时间对表达ECBD的粗酶溶液活性的影响。酶活性随IPTG浓度从0mM增加到0.4mM而提高，但进一步增加IPTG浓度则降低了活性。当IPTG的浓度超过0.6mM时，α和β亚基的可溶形式显着降低。细胞的活性与可溶性形式的α亚基的表达水平相关。最强的生长抑制发生在IPTG 0.2mM处。在0.4mM的IPTG处获得了最高的酶活性(图5)，这被设置为诱导大肠杆菌的最佳IPTG浓度。
2、重组菌株T7-GE-α/β-6K的培养温度优化
28℃诱导重组蛋白使用最广泛的温度，但是，在此温度下，α和β亚基均弱表达。较低的温度有助于α和β亚基的共表达，因为酶活性与诱导温度成反比(图6)。从20℃到24℃，其他α和β亚基的表达急剧下降。考虑到生物量和活性之间的权衡，生物量从16℃增加到24℃，但在28℃下降。将20℃设置为最佳诱导温度。
3、重组菌株T7-GE-α/β-6K的诱导时长优化
在诱导时间中，酶活性从0增加到20小时，但之后降低。相反，生物量随着诱导时间的延长而提高。表现出最高活性的15小时被定义为最佳诱导时间(图7)。
4、样品处理及检测
参照实施例1中样品处理和检测方法，收集处理并检测样品。
结果显示当用菌株T7-GE-α/β-6K，在优化的诱导条件下，ECBD的产量达到了57.88U/g DCW(细胞干重，dry cell weight)，是共表达两个亚基的初始菌株的9倍。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒及应用
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2364
<212> DNA
<213> Actinoplanes utahensis
<400> 1
gtgacgtcct cgtacatgcg cctgaaagca gcagcgatcg ccttcggtgt gatcgtggcg 60
accgcagccg tgccgtcacc cgcttccggc agggaacatg acggcggcta tgcggccctg 120
atccgccggg cctcgtacgg cgtcccgcac atcaccgccg acgacttcgg gagcctcggt 180
ttcggcgtcg ggtacgtgca ggccgaggac aacatctgcg tcatcgccga gagcgtagtg 240
acggccaacg gtgagcggtc gcggtggttc ggtgcgaccg ggccggacga cgccgatgtg 300
cgcagcgacc tcttccaccg caaggcgatc gacgaccgcg tcgccgagcg gctcctcgaa 360
gggccccgcg acggcgtgcg ggcgccgtcg gacgacgtcc gggaccagat gcgcggcttc 420
gtcgccggct acaaccactt cctacgccgc accggcgtgc accgcctgac cgacccggcg 480
tgccgcggca aggcctgggt gcgcccgctc tccgagatcg atctctggcg tacgtcgtgg 540
gacagcatgg tccgggccgg ttccggggcg ctgctcgacg gcatcgtcgc cgcgacgcca 600
cctacagccg ccgggcccgc gtcagccccg gaggcacccg acgccgccgc gatcgccgcc 660
gccctcgacg ggacgagcgc gggcatcggc agcaacgcgt acggcctcgg cgcgcaggcc 720
accgtgaacg gcagcgggat ggtgctggcc aacccgcact tcccgtggca gggcgccgca 780
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ggcccggcga gcctgccggt gcggttccgc gacgactacg tcaccaactc caacgacagt 1500
cactggctgg ccagcccggc cgccccgctg gaaggcttcc cgcggatcct cggcaacgaa 1560
cgcaccccgc gcagcctgcg cacccggctc gggctggacc agatccagca gcgcctcgcc 1620
ggcacggacg gtctgcccgg caagggcttc accaccgccc ggctctggca ggtcatgttc 1680
ggcaaccgga tgcacggcgc cgaactcgcc cgcgacgacc tggtcgcgct ctgccgccgc 1740
cagccgaccg cgaccgcctc gaacggcgcg atcgtcgacc tcaccgcggc ctgcacggcg 1800
ctgtcccgct tcgatgagcg tgccgacctg gacagccggg gcgcgcacct gttcaccgag 1860
ttcgccctcg cgggcggaat caggttcgcc gacaccttcg aggtgaccga tccggtacgc 1920
accccgcgcc gtctgaacac cacggatccg cgggtacgga cggcgctcgc cgacgccgtg 1980
caacggctcg ccggcatccc cctcgacgcg aagctgggag acatccacac cgacagccgc 2040
ggcgaacggc gcatccccat ccacggtggc cgcggggaag caggcacctt caacgtgatc 2100
accaacccgc tcgtgccggg cgtgggatac ccgcaggtcg tccacggaac atcgttcgtg 2160
atggccgtcg aactcggccc gcacggcccg tcgggacggc agatcctcac ctatgcgcag 2220
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<210> 2
<211> 2364
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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atccgtcgtg cgagctatgg cgtgccgcac attaccgcgg acgatttcgg tagcctgggt 180
tttggcgtgg gttatgttca ggcggaggat aacatctgcg ttattgcgga aagcgtggtt 240
accgcgaacg gtgaacgtag ccgttggttt ggtgcgaccg gtccggatga tgcggatgtg 300
cgtagcgacc tgttccaccg taaggcgatc gacgatcgtg ttgcggagcg tctgctggaa 360
ggtccgcgtg atggtgtgcg tgcgccgagc gatgatgttc gtgatcaaat gcgtggtttc 420
gtggcgggct acaaccactt tctgcgtcgt accggcgttc atcgtctgac cgatccggcg 480
tgccgtggta aagcgtgggt gcgtccgctg agcgagatcg acctgtggcg taccagctgg 540
gatagcatgg tgcgtgcggg tagcggtgcg ctgctggatg gcattgttgc ggcgaccccg 600
ccgaccgcgg cgggtccggc gagcgcgccg gaagcgccgg acgcggcggc gatcgcggcg 660
gcgctggatg gtaccagcgc gggcattggt agcaacgcgt atggtctggg tgcgcaggcg 720
accgtgaacg gtagcggtat ggttctggcg aacccgcact tcccgtggca gggtgcggcg 780
cgtttttacc gtatgcacct gaaagtgccg ggtcgttatg acgttgaggg tgcggcgctg 840
atcggcgatc cgatcattgg cattggtcac aaccgtaccg ttgcgtggag ccacaccgtt 900
agcaccgcgc gtcgtttcgt gtggcatcgt ctgagcctgg ttccgggtga cccgaccagc 960
tactatgttg atggtcgtcc ggaacgtatg cgtgcgcgta ccgtgaccgt tcaaaccggt 1020
agcggtccgg ttagccgtac cttccacgac acccgttacg gtccggtggc ggttatgccg 1080
ggcacctttg attggacccc ggcgaccgcg tatgcgatca ccgacgttaa cgcgggtaac 1140
aaccgtgcgt tcgatggttg gctgcgtatg ggccaggcga aggacgtgcg tgcgctgaaa 1200
gcggttctgg atcgtcacca atttctgccg tgggtgaacg ttattgcggc ggatgcgcgt 1260
ggtgaggcgc tgtacggcga tcacagcgtg gttccgcgtg tgaccggtgc gctggcggcg 1320
gcgtgcattc cggcgccgtt tcagccgctg tatgcgagca gcggtcaagc ggttctggat 1380
ggtagccgta gcgattgcgc gctgggtgcg gacccggatg cggcggtgcc gggcatcctg 1440
ggtccggcga gcctgccggt gcgtttccgt gacgattacg ttaccaacag caacgacagc 1500
cattggctgg cgagcccggc ggcgccgctg gaaggttttc cgcgtatcct gggtaacgag 1560
cgtaccccgc gtagcctgcg tacccgtctg ggtctggacc agattcagca acgtctggcg 1620
ggtaccgatg gtctgccggg caagggtttc accaccgcgc gtctgtggca agtgatgttt 1680
ggtaaccgta tgcacggcgc ggaactggcg cgtgacgatc tggttgcgct gtgccgtcgt 1740
caaccgaccg cgaccgcgag caacggtgcg atcgtggatc tgaccgcggc gtgcaccgcg 1800
ctgagccgtt tcgatgaacg tgcggacctg gatagccgtg gtgcgcacct gttcaccgag 1860
tttgcgctgg cgggtggcat tcgtttcgcg gacacctttg aagtgaccga tccggttcgt 1920
accccgcgtc gtctgaacac caccgacccg cgtgtgcgta ccgcgctggc ggatgcggtt 1980
caacgtctgg cgggtatccc gctggacgcg aaactgggcg acattcacac cgatagccgt 2040
ggtgaacgtc gtattccgat tcatggtggc cgtggcgagg cgggtacctt caacgttatc 2100
accaacccgc tggtgccggg cgttggttac ccgcaggtgg ttcacggtac cagctttgtg 2160
atggcggtgg agctgggtcc gcatggtccg agcggtcgtc agattctgac ctatgcgcaa 2220
agcaccaacc cgaacagccc gtggtacgcg gaccaaaccg tgctgtatag ccgtaagggc 2280
tgggatacca tcaaatacac cgaagcgcag attgcggcgg acccgaacct gcgtgtgtat 2340
cgtgttgcgc aacgtggtcg ttaa 2364
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taatacgact cactatagg 19
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttgtttaac tttaagaagg aga 23
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60
gcc 63
<210> 6
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catgatggtg gctacgcggc gctgatccgt cgtgcgagct atggcgtgcc gcacattacc 60
gcggacgatt tcggtagcct gggttttggc gtgggttatg ttcaggcgga ggataacatc 120
tgcgttattg cggaaagcgt ggttaccgcg aacggtgaac gtagccgttg gtttggtgcg 180
accggtccgg atgatgcgga tgtgcgtagc gacctgttcc accgtaaggc gatcgacgat 240
cgtgttgcgg agcgtctgct ggaaggtccg cgtgatggtg tgcgtgcgcc gagcgatgat 300
gttcgtgatc aaatgcgtgg tttcgtggcg ggctacaacc actttctgcg tcgtaccggc 360
gttcatcgtc tgaccgatcc ggcgtgccgt ggtaaagcgt gggtgcgtcc gctgagcgag 420
atcgacctgt ggcgtaccag ctgggatagc atggtgcgtg cgggtagcgg tgcgctgctg 480
gatggcattg ttgcggcgac cccgccgacc gcggcgggtc cggcgagcgc gccggaagcg 540
ccggacgcgt aa 552
<210> 7
<211> 1674
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcaacgcgt atggtctggg tgcgcaggcg accgtgaacg gtagcggtat ggttctggcg 60
aacccgcact tcccgtggca gggtgcggcg cgtttttacc gtatgcacct gaaagtgccg 120
ggtcgttatg acgttgaggg tgcggcgctg atcggcgatc cgatcattgg cattggtcac 180
aaccgtaccg ttgcgtggag ccacaccgtt agcaccgcgc gtcgtttcgt gtggcatcgt 240
ctgagcctgg ttccgggtga cccgaccagc tactatgttg atggtcgtcc ggaacgtatg 300
cgtgcgcgta ccgtgaccgt tcaaaccggt agcggtccgg ttagccgtac cttccacgac 360
acccgttacg gtccggtggc ggttatgccg ggcacctttg attggacccc ggcgaccgcg 420
tatgcgatca ccgacgttaa cgcgggtaac aaccgtgcgt tcgatggttg gctgcgtatg 480
ggccaggcga aggacgtgcg tgcgctgaaa gcggttctgg atcgtcacca atttctgccg 540
tgggtgaacg ttattgcggc ggatgcgcgt ggtgaggcgc tgtacggcga tcacagcgtg 600
gttccgcgtg tgaccggtgc gctggcggcg gcgtgcattc cggcgccgtt tcagccgctg 660
tatgcgagca gcggtcaagc ggttctggat ggtagccgta gcgattgcgc gctgggtgcg 720
gacccggatg cggcggtgcc gggcatcctg ggtccggcga gcctgccggt gcgtttccgt 780
gacgattacg ttaccaacag caacgacagc cattggctgg cgagcccggc ggcgccgctg 840
gaaggttttc cgcgtatcct gggtaacgag cgtaccccgc gtagcctgcg tacccgtctg 900
ggtctggacc agattcagca acgtctggcg ggtaccgatg gtctgccggg caagggtttc 960
accaccgcgc gtctgtggca agtgatgttt ggtaaccgta tgcacggcgc ggaactggcg 1020
cgtgacgatc tggttgcgct gtgccgtcgt caaccgaccg cgaccgcgag caacggtgcg 1080
atcgtggatc tgaccgcggc gtgcaccgcg ctgagccgtt tcgatgaacg tgcggacctg 1140
gatagccgtg gtgcgcacct gttcaccgag tttgcgctgg cgggtggcat tcgtttcgcg 1200
gacacctttg aagtgaccga tccggttcgt accccgcgtc gtctgaacac caccgacccg 1260
cgtgtgcgta ccgcgctggc ggatgcggtt caacgtctgg cgggtatccc gctggacgcg 1320
aaactgggcg acattcacac cgatagccgt ggtgaacgtc gtattccgat tcatggtggc 1380
cgtggcgagg cgggtacctt caacgttatc accaacccgc tggtgccggg cgttggttac 1440
ccgcaggtgg ttcacggtac cagctttgtg atggcggtgg agctgggtcc gcatggtccg 1500
agcggtcgtc agattctgac ctatgcgcaa agcaccaacc cgaacagccc gtggtacgcg 1560
gaccaaaccg tgctgtatag ccgtaagggc tgggatacca tcaaatacac cgaagcgcag 1620
attgcggcgg acccgaacct gcgtgtgtat cgtgttgcgc aacgtggtcg ttaa 1674
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agaaggagag aattcatgaa aaagacagct atcgcgattg 40
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcggccgca agcttttacg accacgttgc gcaac 35
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagcttgcgg ccgcactc 18
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaattctctc cttcttaaag ttaaacaa 28
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaaaaaaaaa aaaaaaaa 18
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Glu Gly Glu Gly
1 5
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggagaaggag aagga 15
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gly Lys Gly Lys Gly
1 5
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggtaaaggta aaggt 15
<210> 18
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agcgcaggcc ggtaaaggta aaggtcatga tggtggctac gcggcgctga t 51
<210> 19
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcgccgcgta gccaccatca tgacctttac ctttaccggc ctgcgctacg gtagcgaaa 59
<210> 20
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tagcgcaggc cggagaagga gaaggacatg atggtggcta cgcggcgctg atccg 55
<210> 21
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcgccgcgta gccaccatca tgtccttctc cttctccggc ctgcgctacg gtagcgaa 58
<210> 22
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaagcgccgg acgcgaaaaa aaaaaaaaaa aaataaggat cctaatacga ctcactatag 60
g 61
<210> 23
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cgtattagga tccttatttt tttttttttt ttttcgcgtc cggcgcttcc ggcgcgctc 59
<210> 24
<211> 2431
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60
gccggagaag gagaaggaca tgatggtggc tacgcggcgc tgatccgtcg tgcgagctat 120
ggcgtgccgc acattaccgc ggacgatttc ggtagcctgg gttttggcgt gggttatgtt 180
caggcggagg ataacatctg cgttattgcg gaaagcgtgg ttaccgcgaa cggtgaacgt 240
agccgttggt ttggtgcgac cggtccggat gatgcggatg tgcgtagcga cctgttccac 300
cgtaaggcga tcgacgatcg tgttgcggag cgtctgctgg aaggtccgcg tgatggtgtg 360
cgtgcgccga gcgatgatgt tcgtgatcaa atgcgtggtt tcgtggcggg ctacaaccac 420
tttctgcgtc gtaccggcgt tcatcgtctg accgatccgg cgtgccgtgg taaagcgtgg 480
gtgcgtccgc tgagcgagat cgacctgtgg cgtaccagct gggatagcat ggtgcgtgcg 540
ggtagcggtg cgctgctgga tggcattgtt gcggcgaccc cgccgaccgc ggcgggtccg 600
gcgagcgcgc cggaagcgcc ggacgcgtaa tctagaccat cttagtattt gtttaacttt 660
aagaaggaga cctaggatga aaaagacagc tatcgcgatt gcagtggcac tggctggttt 720
cgctaccgta gcgcaggcca gcaacgcgta tggtctgggt gcgcaggcga ccgtgaacgg 780
tagcggtatg gttctggcga acccgcactt cccgtggcag ggtgcggcgc gtttttaccg 840
tatgcacctg aaagtgccgg gtcgttatga cgttgagggt gcggcgctga tcggcgatcc 900
gatcattggc attggtcaca accgtaccgt tgcgtggagc cacaccgtta gcaccgcgcg 960
tcgtttcgtg tggcatcgtc tgagcctggt tccgggtgac ccgaccagct actatgttga 1020
tggtcgtccg gaacgtatgc gtgcgcgtac cgtgaccgtt caaaccggta gcggtccggt 1080
tagccgtacc ttccacgaca cccgttacgg tccggtggcg gttatgccgg gcacctttga 1140
ttggaccccg gcgaccgcgt atgcgatcac cgacgttaac gcgggtaaca accgtgcgtt 1200
cgatggttgg ctgcgtatgg gccaggcgaa ggacgtgcgt gcgctgaaag cggttctgga 1260
tcgtcaccaa tttctgccgt gggtgaacgt tattgcggcg gatgcgcgtg gtgaggcgct 1320
gtacggcgat cacagcgtgg ttccgcgtgt gaccggtgcg ctggcggcgg cgtgcattcc 1380
ggcgccgttt cagccgctgt atgcgagcag cggtcaagcg gttctggatg gtagccgtag 1440
cgattgcgcg ctgggtgcgg acccggatgc ggcggtgccg ggcatcctgg gtccggcgag 1500
cctgccggtg cgtttccgtg acgattacgt taccaacagc aacgacagcc attggctggc 1560
gagcccggcg gcgccgctgg aaggttttcc gcgtatcctg ggtaacgagc gtaccccgcg 1620
tagcctgcgt acccgtctgg gtctggacca gattcagcaa cgtctggcgg gtaccgatgg 1680
tctgccgggc aagggtttca ccaccgcgcg tctgtggcaa gtgatgtttg gtaaccgtat 1740
gcacggcgcg gaactggcgc gtgacgatct ggttgcgctg tgccgtcgtc aaccgaccgc 1800
gaccgcgagc aacggtgcga tcgtggatct gaccgcggcg tgcaccgcgc tgagccgttt 1860
cgatgaacgt gcggacctgg atagccgtgg tgcgcacctg ttcaccgagt ttgcgctggc 1920
gggtggcatt cgtttcgcgg acacctttga agtgaccgat ccggttcgta ccccgcgtcg 1980
tctgaacacc accgacccgc gtgtgcgtac cgcgctggcg gatgcggttc aacgtctggc 2040
gggtatcccg ctggacgcga aactgggcga cattcacacc gatagccgtg gtgaacgtcg 2100
tattccgatt catggtggcc gtggcgaggc gggtaccttc aacgttatca ccaacccgct 2160
ggtgccgggc gttggttacc cgcaggtggt tcacggtacc agctttgtga tggcggtgga 2220
gctgggtccg catggtccga gcggtcgtca gattctgacc tatgcgcaaa gcaccaaccc 2280
gaacagcccg tggtacgcgg accaaaccgt gctgtatagc cgtaagggct gggataccat 2340
caaatacacc gaagcgcaga ttgcggcgga cccgaacctg cgtgtgtatc gtgttgcgca 2400
acgtggtcgt aaaaaaaaaa aaaaaaaata a 2431
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tttgtttaac tttaagaagg aga 23
<210> 26
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60
gcc 63

Claims (10)

1.一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒，其特征在于，包括依次连接的启动子核酸序列、RBS核酸序列、编码OmpA信号肽的核酸序列、编码第一促溶肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列、第一终止密码子、RBS核酸序列、编码OmpA信号肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列、编码第二促溶肽的核酸序列、第二终止密码子，
其中，第一促溶肽的氨基酸序列为：GEGEG；第二促溶肽的氨基酸序列为：KKKKKK。
2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，RBS核酸序列：TTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA；编码OmpA信号肽的核酸序列：ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC；编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列与第一终止密码子的核酸序列：如SEQ ID No.6所示；编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列：如SEQ ID No.7所示。
3.如权利要求2所述的表达盒，其特征在于，不包括启动子的核酸序列如SEQ ID No.24所示。
4.如权利要求1～3任一所述表达盒在重组表达棘白菌素B脱酰基酶中的应用。
5.包含如权利要求1～3任一所述表达盒的重组表达载体。
6.包含如权利要求5所述重组表达载体的基因工程菌，其特征在于，由宿主菌中转入所述重组表达载体得到。
7.如权利要求6所述基因工程菌，其特征在于，宿主菌为大肠杆菌。
8.一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的方法，其特征在于，将权利要求7所述基因工程菌在培养基中发酵表达棘白菌素B脱酰基酶。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌用浓度为0.2～0.6mM的IPTG诱导；IPTG诱导时间5～20h；发酵温度16℃～24℃。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌用浓度为0.4mM的IPTG诱导；IPTG诱导时间15h；发酵温度20℃。
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