KR100233616B1 - 비스판균 배양액으로 부터 비스판균을 회수하는 방법 - Google Patents

비스판균 배양액으로 부터 비스판균을 회수하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비스판균의 배양액으로부터 효율적으로 비스판 활성 아포균을 획득하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서는 비스판균 SCD (Bacillus polyfermenticus SCD)를 배지 중에 포함하고 있는 배양액으로부터 균체 슬러리를 얻고, 이에 탈지유 1-10중량%, 글루타민산나트륨 0.1-5중량%, 그래뉼당 1-10중량%, 펩톤 0.01-1중량%, 염화나트륨 0.05-5중량% 및 나머지 량의 0.9% 염화나트륨 수용액으로 이루어진 분산용매를 첨가하는 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 본 발명의 방법은 보다 안정한 활성 아포균을 고수율로 회수할 수있게 한다.

Description

비스판균 배양액으로부터 비스판균을 회수하는 방법
본 발명은 비스판균을 대량으로 생산하여 효율적으로 활성아포균을 획득할 수 있는 제법에 관한 것이다.
의약용 및 시판 생균을 응용한 정장제에 사용되고 있는 세균은 비피도박테리움(Bifidobacterium)속, 락토바실러스(Lactobacillus)속, 엔테로코커스(Enterococcus)속, 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum), 락토바실러스 스포로게네스(Lactobacillus sporogenes), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermentucius) 등이다. 이 중에서도 B. polyfermenticus 균은 활성 아포를 형성하여 생균 대부분이 장에 도달되어 장기간 장질환에 대해 치료효과를 보이고 있는 가장 우수한 균으로서 일반적으로 비스판균이라고 불리고 있다.
비스판균은 일본약국방외의약품성분규격에 당화균(Amylolytic bacillus)이라 하여 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 메센테리쿠스와 같이 게재되어 있으나(일본후생성약무국심사과 감수 : 일본약국외의약품성분규격 735-1125, 1991), 국제명명규약(예를 들어 Bergey's manual)에 의한 분류명에는 존재하지 않는다 (Sneath, P.H.A. : Endospore-forming gram-positive rods and cocci. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 1st ed. 1104-1207, Williams & Wilkins, Baltimore, 1986). 그러나 여러 연구에 의하면, 형태 및 생화학적인 성상을 비교해 볼 때, 바실러스 서브틸리스와 상당히 유사한 것으로 인정되고 있으나, 바실러스 서브틸리스와 다른 점은 비스판균은 락토스를 분해하는 능력이 있고 글루코스와 락토스에서 초산과 유산을 더욱 많이 생산하는 것등이다.
비스판균은 1933년 일본의 미생물학자인 寺門賀述 박사팀이 공기로부터 분리한 아포성 간균이며 여러 종류의 효소를 분비하여 병원성균들인 티프스균, 파라티프스균, 적리균, 콜레라균등을 용균시켜 증식을 억제하는 기능을 가지고 있다. 또한 섭취할 경우 비타민 B1, B2를 공급하여 식욕 및 소화작용을 촉진시키고, 비 경구적 감염방어 작용과 경구적 면역능이 증강된다는 사실도 밝혀져 있다.
지금까지 비스판균의 배양과 이 균의 응용에 관해서는 일본특허공보 소화 11-123호 (일본특허 제 115281호) "세균을 이용하여 장질환 치료약을 제조하는 방법"을 들 수 있다. 상기 특허는 비스판균의 배양액을 65oC로 1시간 가열하고 난 후 33oC로 24시간 두고 다시 65oC로 1시간 가열하는 조작을 4회 반복한 후 초산으로 약산성으로 하여 가온건조하는 공정과 이 비스판균의 배양균체에 0.3-0.5% 황산수를 가하여 37oC로 둔 후 가온건조시키는 공정과 이 균체의 일정량을 옥수수 전분 및 유당에 혼합하여 만드는 각 공정의 결합을 특징으로 하고 있다.
그러나 상기와 같은 배양공정은 비스판균의 배양 균체를 회수함에 있어 지나치게 많은 단계를 거치고 장시간을 요하므로 경제성이 현저하게 떨어지는 단점을 안고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 보다 간단한 방법을 이용하여 높은 효율로서 비스판균의 활성 아포균을 회수하고자 하는 것이다.
본 발명에 따르면 비스판균의 배양액으로부터 보다 안정한 비스판균 활성 아포균을 보다 효율적으로 회수하는 방법이 제공된다.
본 발명의 방법은 비스판균 SCD (Bacillus polyfermenticus SCD)를 배지 중에 포함하고 있는 배양액으로부터 비스판균 활성 아포균을 회수하는 방법으로서, 상기 배양액으로부터 균체 슬러리를 얻는 단계; 및 이 균체 슬러리에 탈지유 1-10중량%, 글루타민산나트륨 0.1-5중량%, 그래뉼당 1-10중량%, 펩톤 0.01-1중량%, 염화나트륨 0.05-5중량% 및 나머지 량의 0.0% 염화나트륨 수용액으로 이루어진 분산용매를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
위와 같은 방법에 의해 보다 가혹한 처리 조건에서도 활성을 유지하는 안정한 활성 아포균을 회수하는 것이 가능하다.
한편, 비스판균의 총 생균수는 발효배양액을 0.1% 펩톤수로 연속적으로 희석을 시킨다음, 평판배지에 0.1㎖씩 분주한 후, 37oC에서 24시간 배양한 후, 콜로니 형성단위(Colony forming unit; CFU)를 측정하여 계산하였다. 활성 아포균수는 발효배양액을 80oC에서 2시간 열처리하여 영양세포를 사멸시키고, 무균의 희석액으로 연속적으로 희석시킨 후, TSA (Tryptic Soy Agar) 평판배지에 0.1㎖을 떨어뜨린다음 연질 아가(soft agar)로 오버레이(overlay)하여 37oC에서 24시간 배양하여 측정하였다.
본 발명에 따라 활성 아포균을 회수하는데 이용되는 비스판균 배양액은 예를 들면, 다음과 같은 제조방법에 따라 얻어진 것일 수 있다 : 비스판균 SCD (Bacillus polyfermenticus SCD)를 포도당 1-3 중량%; 옥수수전분 l-5 중량%, 대두분 1-5 중량%, 및 옥수수 침지액으로 이루어진 성분에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 성분; 그리고 미량성분으로서 제1인산칼륨 0.05-0.5 중량%, 제2인산칼륨 0.05-0.5 중량%, 염화칼슘 2수화물 0.05-0.5 중량%, 황산마그네슘 7수화물 0.01-0.1 중량%, 황산구리 5수화물 0.001-0.01 중량%, 황산망간 0.001-0.01 중량%, 황산철 7수화물 0.001-0.01 중량%, 황산아연 7수화물 0.001-0.01 중량%를 포함하는 액체 생산배지에 접종하는 단계; 및 30-37oC에서 pH를 6.8-7.2로 조절하면서 호기적으로 배양하여, 바람직하게는 배지중의 포도당이 소모되었을 때 농축 포도당을 약 1중량%의 농도로 일정 간격으로 첨가하는 유가식 배양방법에 의해 배양하여 배지중에 비스판균을 함유하고 있는 배양액을 얻는다. 이 방법은 가격이 저렴한 성분의 배지를 사용하면서도 높은 수율로 활성 아포균을 포함하고 있는 배양액을 얻을 수 있어 유리하다.
상기와 같은 방법에 의해 배양이 끝난 후 비스판균의 활성아포를 분리시키기 위해 일반적으로 원심분리, 여과등과 같은 방법을 사용한다. 상기와 같은 방법에 의해 배양된 배양액은 분말화하기 위하여 분무건조법, 동결건조법등을 사용할 수 있다. 특히 최근에 사용되는 분무건조법은 활성을 감소시키지 않고 미세분말을 수득할 수 있기 때문에 사용이 바람직하다. 이 방법에서는 안정제, 전착제, 희석제로서의 역할을 하는 분산용매를 배양액에 첨가함으로써 일회 동작으로 건조분말을 획득할 수 있다. 이와같은 분무건조법은 특히 생성물이 동시에 가열처리되기 때문에 영양세포의 살균공정이 필요없는 제제화 방법에 유리하다. 한편, 동결건조법은 가장 일반적으로 생균제제를 분말화 할수 있는 건조법으로 알려져 있다. 이와같이 얻어진 비스판분말은 제제, 예를들어 정제, 과립제등으로 제제화된다.
본 발명을 아래의 실시예에 의하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
이하 각종 예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예에만 국한된 것은 아니다. 하기 각종 예에서, % 단위는 다른 언급이 없는 한 중량%이다.
<참고예 1>
본 발명자들은 시판중인 비스판제제로부터 비스판균을 분리하고 동정하였다.
즉, 수입 생균제제의 원 분말을 영양 한천(Nutrient Agar) 또는 트립틱 소이 한천 (Tryptic Soy Agar)에 도말하고 37℃에서 배양하였다. 콜로니 형태, 색상 및 표면의 특징이 다르다고 생각되는 집락을 선택하여 희석법으로 순수분리하고 각각 균들을 그램 염색법, 말라카이트 그린 (Malachite Green) 포자 염색법, 편모 염색법 등을 사용하여 현미경으로 관찰하였다. 생화학적 성질 및 자화성은 문헌 (Biochemical tests for Identification of medical bacteria; Manual for the Identification of medical bacteria)에 제시된 방법으로 시험하였으며, 결과를 일본에서 발표된 장질환 유효세균의 실험결과와 비교하였다.
본 발명자들은 이렇게 하여 분리된 비스판균을 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD (Bacillus polyfermenticus SCD)라 명명하고 1997년 8월 5일자로 한국종균협회부설 미생물보존센타에 부다페스트 조약의 규정에 따라 기탁하고 KCCM 10104의 수탁번호를 부여받았다.
본 발명에 따라 분리된 비스판균의 균주 특성을 동정한 결과는 다음 표 1과 같다.
비스판균(KCCM 10104)의 형태, 배양 및 생리학적 특성
특 성 비스판균 SCD(KCCM 10104) 시판 비스판균
형태 간 균 간 균
그람염색성 양 성 양 성
운동성 있 슴 있 슴
아포 형성능 있 슴 있 슴
산소요구성 호 기 성 호 기 성
포도당으로부터 산 생성능 있 슴 있 슴
전분 가수분해능 양 성 양 성
젤라틴 가수분해능 양 성 양 성
카제인 가수분해능 양 성 양 성
버지스-프로스카우어 테스트(VOGES-PROSKAUER TEST) 양 성 양 성
질산염 환원 양 성 양 성
구연산 이용성 양 성 양 성
실시예 1
비스판균 (Bacillus polyfermenticus) SCD (KCCM 10104)를 사용하였다. 종배양배지로는 TSB(트립틱 소이 브로스)를 사용하여 500㎖ 배플 플라스크에 종균을 한 백금이 접종하여 37oC에서 교반속도 200rpm으로 10시간 진탕배양하여 종배양을 제조하였다. 본 배양배지는 포도당 20g/ℓ, 옥수수전분 10g/ℓ, 대두분(콩가루) 30g/ℓ, 제1인산칼륨 1g/ℓ, 제2인산칼륨 1g/ℓ, 염화칼슘 2수화물 1g/ℓ, 황산마그네슘 7수화물 0.3g/ℓ, 황산구리 5수화물 0.01g/ℓ, 황산망간 0.02g/ℓ, 황산철 7수화물 0.02g/ℓ, 황산아연 7수화물 0.02g/ℓ을 사용하였다.
상기 배지 성분 중 열에 안정한 것, 즉 옥수수전분, 대두분, 염화칼슘 2수화물은 121℃에서 20분간 가압살균하고 열에 불안정하거나, 착화합물을 생성하는 성분, 즉 포도당 및 염화칼슘 2수화물을 제외한 미량성분들은 구멍크기가 0.45㎛인 일회용 무균여과기(disposable membrane filter)를 통과시킨 후 무균적으로 발효조에 첨가하였다.
비스판균의 배양방법은 총용량 5ℓ-발효조에 사입된 배지는 3ℓ로하고 상기 종배양액을 30-60㎖을 접종하여 30-37℃에서 배양중에 pH를 6.8-7.2로 조절하고, 통기량은 1.0vvm으로 유지하였다. 회전교반수는 500-700rpm으로 배양한다. 종배양액을 접종한 후 72-96시간이 경과한 후 배양을 종료하였다.
배양시간에 따른 활성 아포균수의 변화를 관찰하고, 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
배양시간 (시간) 활성 아포수/㎖
24 1.70 × 108
36 6.55 × 108
48 1.80 × 109
60 2.17 × 109
72 2.34 × 109
96 3.28 × 109
120 2.96 × 109
실시예 2
실시예 1과 같은 조건과 배양방법으로 행하였으며, 생산배지는 포도당 20g/ℓ, 옥수수전분 10g/ℓ, 옥수수침지액 100㎖/l, 제1인산칼륨 1g/ℓ, 제2인산칼륨 1g/ℓ, 탄산칼슘 1g/ℓ, 황산마그네슘 7수화물 0.3g/ℓ, 황산구리 5수화물 0.01g/ℓ, 황산망간 0.02g/ℓ, 황산철 7수화물 0.02g/ℓ, 황산아연 7수화물 0.02g/ℓ이다. 배양후 얻어진 최대 활성 아포균수는 2.80 x 109/㎖이었다.
실시예 3
실시예 1에서 얻은 배양액 1ℓ에 하기 표 3에 나타낸 적절한 분산용매 200㎖을 첨가한 후 분무건조기(Buchi MINI spray dryer B-191)로 분무건조시킨다. 분무건조기를 다음과 같은 조건으로 유지시켰다(입구온도: 180℃, 출구온도: 90-130℃, aspirator 90%, pump 10%). 건조되어 얻어진 분말에 포함된 활성 아포균수는 0.1M 인산완충용액 1㎖에 0.1g의 분말을 용해시켜 측정하였다.
이하 각 실시예에서 사용된 복합 성분들은 다음과 같다:
복합성분 1 : 탈지유 4%, 글루타민산나트륨 1%, 그래뉼당 5%
복합성분 2 : 탈지유 5%, 글루타민산나트륨 1%, 그래뉼당 5%
복합성분 3 : 탈지유 4%, 글루타민산나트륨 1%, 그래뉼당 6%, 펩톤 0.1%, 염화나트륨 0.5%
복합성분 4 : 탈지유 5%, 글루타민산나트륨 1%, 그래뉼당 5%, 펩톤 0.1%, 염화나트륨 0.5%
분무건조법에 의한 활성아포균의 수집
분산용매 회수된총 분말양(g) 분말 1g당 측정된 활성아포균수 총 얻어진 활성아포균수 회수율(%)
배양액 - - 3.28 × 1012 -
무첨가 12.80 8.05 × 1010 1.03 × 1012 31.4
생리식염수 15.90 1.58 × 1011 2.52 × 1012 76.8
포도당용액 18.25 1.33 × 1011 2.43 × 1012 74.2
전분용액 19.85 1.36 × 1011 2.69 × 1012 82.0
유당용액 23.50 1.06 × 1011 2.49 × 1012 76.0
복합성분 2 33.04 7.75 × 1010 2.56 × 1012 78.0
실시예 4
실시예 2에서 얻어진 배양액을 사용하여 실시예 3과 같이 분무건조를 행하여 얻은 결과는 다음 표 4와 같다.
분무건조법에 의한 활성아포균의 수집
분산용매 회수된총 분말양(g) 분말 1g당 측정된 활성아포균수 총 얻어진 활성아포균수 회수율(%)
배양액 - - 2.80 × 1012 -
무첨가 13.60 7.25 × 1010 9.86 × 1011 35.2
생리식염수 16.70 1.31 × 1011 2.18 × 1012 78.0
포도당용액 19.45 1.08 × 1011 2.11 × 1012 75.5
전분용액 20.65 1.09 × 1011 2.26 × 1012 80.6
유당용액 24.40 9.22 × 1010 2.25 × 1012 80.4
복합성분 35.20 5.91 × 1010 2.08 × 1012 74.2
실시예 5
실시예 1에서 제조된 배양액 1ℓ에 균체세정액을 처리해 2-3회 원심분리를 반복하여 얻어진 균체슬러리(slurry)에 하기 표 5에 나타낸 분산용매 200㎖을 첨가한 후 -70℃ 동결건조기 (freeze dryer)에 넣어 냉동시킨 후, 동결건조기(IL SHIN Co.)를 이용하여 동결건조하여 건조분말을 얻었다. 원심분리후 배양 상등액에 존재하는 활성아포는 0.04%에 불과해 원심분리에 의한 손실은 무시할 수 있는 정도이다.
결과를 하기 표 5에 정리하였다.
동결건조법에 의한 활성아포균의 수집
분산용매 회수된총 분말양(g) 분말 1g당 측정된 활성아포균수 총 얻어진 활성아포균수 회수율(%)
배양액 - - 3.28 × 1012 -
무첨가 14.0 1.79 × 1011 2.51 × 1012 76.5
생리식염수 16.80 1.89 × 1011 3.18 × 1012 97.0
포도당용액 19.07 1.70 × 1011 3.25 × 1012 99.0
전분용액 20.58 1.47 × 1011 3.03 × 1012 92.4
유당용액 24.58 1.29 × 1011 3.18 × 1012 97.0
복합성분 3 33.77 9.30 × 1010 3.14 × 1012 95.7
실시예 6
실시예 2에서 얻어진 배양액을 사용하여 실시예 5와 같이 동결건조를 행하여 얻은 결과는 다음 표 6과 같다.
동결건조법에 의한 활성아포균의 수집
분산용매 회수된총 분말양(g) 분말 1g당 측정된 활성아포균수 총 얻어진 활성아포균수 회수율(%)
배양액 - - 2.80 × 1012 -
무첨가 14.80 1.33 × 1011 1.98 × 1012 70.8
생리식염수 17.40 1.53 × 1011 2.66 × 1012 95.0
포도당용액 20.08 1.37 × 1011 2.76 × 1012 98.4
전분용액 21.80 1.17 × 1011 2.54 × 1012 90.6
유당용액 26.40 1.02 × 1011 2.68 × 1012 95.8
복합성분 2 34.62 7.80 × 1010 2.70 × 1012 96.4
실시예 7
실시예 3에서 얻어진 분무건조분말을 가혹조건에서 처리하고, 분산 용매에 따른 안정성을 측정하였다. 즉, 실온상태에서 6개월간, 가혹조건(40±2℃, 상대습도 75±5%)에서 6개월 보존한 분말에 대해 실험하였다. 결과를 표 7에 나타내었다.
분산용매로 처리한 분무건조 균 분체의 안정성시험
1g당 활성아포균수
분산용매 무첨가 생리식염수 포도당용액 전분용액 유당용액 탈지유용액 복합성분3
제조직후 8.05×1010 1.58×1011 1.33×1011 1.36×1011 1.06×1010 1.36×1011 7.75×1010
실온처리 4.59×1010 1.16×1011 1.06×1011 1.05×1011 8.85×1010 1.23×1011 7.23×1010
가혹처리 3.62×1010 6.35×1010 7.01×1010 7.67×1010 5.92×109 8.37×1010 6.61×1010
실온/제조(%) 57.0 73.4 79.6 77.2 83.4 90.4 93.2
가혹/제조(%) 44.9 40.1 52.7 56.3 55.8 61.0 85.2
실시예 8
실시예 5에서 얻어진 분무건조 분말에 대해 실시예 7과 같은 조건으로 실험을 행하고 결과를 표 8에 나타내었다.
분산용매로 처리한 동결건조 균 분체의 안정성시험
1g당 활성아포균수
분산용매 무첨가 생리식염수 포도당용액 전분용액 유당용액 탈지유용액 복합성분3
제조직후 1.79×1011 1.89×1011 1.70×1011 1.47×1011 1.29×1011 1.58×1011 9.30×1010
실온처리 1.22×1011 1.49×1011 1.35×1011 1.22×1011 1.10×1011 1.41×1011 8.53×1010
가혹처리 7.35×1010 1.01×1011 1.02×1011 7.90×1010 8.48×1010 1.11×1011 7.48×1010
실온/제조(%) 68.1 78.8 79.4 82.9 85.2 89.2 91.7
가혹/제조(%) 41.0 53.4 60.0 53.7 65.7 70.2 80.4
실시예 9
실시예 1과 같은 조건에서 배양한 균액 1ℓ에 균체세정액을 처리해 2-3회 원심분리를 반복하여 얻어진 균체 슬러리(slurry)에 하기 표 9에 나타낸 분산용매 200㎖을 첨가한 후 -70℃ 동결건조기(freeze dryer)에 넣어 냉동시킨 후, 동결건조기(IL SHIN Co.)를 이용하여 동결건조하여 건조분말을 얻었다. 원심분리후 배양상등액에 존재하는 활성아포는 0.04%에 불과해 원심분리에 의한 손실은 무시할 수 있는 정도이다. 결과를 하기 표 9에 정리하였다.
분산용매처방에 따른 동결건조분말의 안정성시험
1g 당 활성아포균수
분산용매 복합성분 1 복합성분 2 복합성분 3 복합성분 4
제조직후 1.32×1011 1.01×1011 1.53×1011 1.39×1011
실온처리 1.18×1011 9.11×1010 1.43×1011 1.28×1011
가혹처리 9.20×1010 6.90×1010 1.30×1011 1.14×1011
실온/제조(%) 89.3 90.1 93.4 92.0
가혹/제조(%) 69.6 68.3 84.9 82.0
본 발명의 방법에 의하면 비스판을 포함하는 배양액으로부터 보다 안정한 활성 아포균을 고수율로 회수할 수 있다.

Claims (4)

  1. 비스판균(Bacillus polyfermenticus)을 배지 중에 포함하고 있는 배양액으로부터 비스판균 활성 아포균을 회수하는 방법으로서,
    (1) 상기 배양액으로부터 균체 슬러리를 얻는 단계; 및
    (2) 이 균체 슬러리에 탈지유 1-10중량%, 글루타민산나트륨 0.1-5중량%, 그래뉼당 1-10중량%, 펩톤 0.01-1중량%, 염화나트륨 0.05-5중량% 및 나머지 량의 0.9% 염화나트륨 수용액으로 이루어진 분산용매를 첨가하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 회수방법.
  2. 제 1항에 있어서, (3) 분무 건조 또는 동결건조에 의해 비스판균 활성 아포균의 분말을 얻는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 회수방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 (1) 단계의 배양액은 다음의 공정:
    (1-a) 비스판균 SCD (Bacillus polyfermenticus SCD) (KCCM 10104)을 포도당 1-3 중량%; 옥수수전분 l-5 중량%, 대두분 1-5 중량%, 및 옥수수 침지액으로 이루어진 성분에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 성분; 그리고 미량성분으로서 제1인산칼륨 0.05-0.5 중량%, 제2인산칼륨 0.05-0.5 중량%, 염화칼슘 2수화물 0.05-0.5 중량%, 황산마그네슘 7수화물 0.01-0.1 중량%, 황산구리 5수화물 0.001-0.01 중량%, 황산망간 0.001-0.01 중량%, 황산철 7수화물 0.001-0.01 중량%, 황산아연 7수화물 0.001-0.01 중량%를 포함하는 액체 생산배지에 접종하는 단계; 및
    (1-b) 30-37oC에서 pH를 6.8-7.2로 조절하면서 호기적으로 배양하여 배지중에 비스판균을 함유하고 있는 배양액을 얻는 단계
    를 포함하는 공정에 의해 얻은 것임을 특징으로 하는 회수방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 (1-b)단계는 배지 중의 포도당이 모두 소모되면 농축 포도당을 약 1중량%의 농도로 첨가하는 유가식 배양으로 행함을 특징으로 하는 회수방법.
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