KR100205622B1

KR100205622B1 - 단백질 분해효소 결함 아스퍼질러스 나이거 변이주

Info

Publication number: KR100205622B1
Application number: KR1019970018068A
Authority: KR
Inventors: 김정윤; 정헌세; 채순기; 박희문; 맹필재
Original assignee: 맹필재; 박희문; 채순기; 김정윤; 정헌세
Priority date: 1997-05-10
Filing date: 1997-05-10
Publication date: 1999-07-01
Also published as: KR19980082955A

Abstract

본 발명에는 아스퍼질러스 나이거의 돌연변이를 통해 얻은 단백질 분해효소 결함 변이주인 아스퍼질러스 나이거 ANPD-153 (KCTC 8795P)가 개시되어 있으며, 이 변이주는 배양시의 pH조건에 관계 없이 단백질 분해효소를 생산하지 않거나 또는 낮은 비율로 생산하므로, 이종단백질 생산을 위한 이종유전자의 발현 숙주로서 적합하다.

Description

단백질 분해효소 결함 아스퍼질러스 나이거 변이주

본 발명은 사상균류의 돌연변이 균주에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아스퍼질러스 나이거를 돌연변이시켜 얻은 단백질 분해효소 결함 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) ANPD-153에 관한 것이다.

아스퍼질러스를 포함하는 사상균 (filamentous fungi)은 효소, 유기산 및 약리활성이 있는 대사산물을 생산하는 미생물로서, 식품, 주류, 의약 및 농업분야 등에 유용하게 이용되어 왔다. 특히, 아스퍼질러스 속 (genus)의 균류들은 아플라톡신 (aflatoxin)을 생산하는 일부의 종을 제외하면 대부분 인체에 해가 없는 것으로 알려져 있으며, 그 중에서도 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae)나 아스퍼질러스 나이거 등은 오래전부터 세포외 효소나 유기산 및 전통발효식품의 제조에 사용되어 왔기 때문에 매우 안전한 균주로 인식되어 왔다. 또한, 최근에는 아스퍼질러스 속 균류들은 이들이 가지고 있는 단백질 분비능력과 고등 진핵세포와 유사한 단백질 분비체계로 인해, 고등 진핵세포 유래의 고부가가치 이종단백질 (heterologous protein)을 생산하기 위한 균주로서도 그 이용성이 매우 높은 것으로 인식되고 있다.

이와 같이 아스퍼질러스를 숙주로 이용하여 이종단백질을 생산하는 이종유전자를 효율적으로 발현하는 체계를 확립하는데 있어서는, 숙주 균주 자체에서 만들어지는 단백질 분해효소가 커다란 장애요인으로 작용한다. 즉, 아스퍼질러스 속 균류들은 세포외 단백질 분해효소를 분비하므로, 이들 단백질 분해효소의 분비를 억제하지 않는 경우에는 생산된 이종단백질이 분해되어 버려 이종단백질 생산효율은 크게 떨어지게 된다. 따라서, 이러한 문제를 해결하기 위해서는 원하는 산물 (즉, 이종단백질)의 생산에는 영향을 미치지 않으면서 단백질 분해효소를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 발효조건을 조성하거나, 단백질 분해효소를 생산하지 못하거나 혹은 매우 적게 생산하는 단백질 분해효소 결함 돌연변이 숙주를 개발해야 할 필요가 있다.

현재까지, 아스퍼질러스 나이거에서는 7종의 단백질 분해효소 유전자 (pepA, B, C, D, E, F, G)가 클로닝되어 있다 ( Frederick, G.D., P. Rombouts 및 F.P. Buxton, 1993, Gene, 125:57-64; Inoue, H., T. Kimura, O. Makabe 및 K. Takahashi, 1991, J. Biol. Chem. 266:19484-19489; Jarai, G., D. Kirchherr 및 F.P. Buxton, 1994, Gene, 139:51-57; Jarai, G., H. van den Hombergh 및 F.P. Buxton, 1994, Gene, 145:171-178; Van den Hombergh, J.P.T.W., G. Jarai, F.P. Buxton 및 J. Visser. 1995, at the 18th Fungal Genetic Conference, 퍼시픽 그루브, 캘리포니아, 미국; Van den Hombergh, J.P.T.W., G. Jarai, F.P. Buxton 및 J. Visser. 1994, Gene, 151:73-79 참조). 전체 단백질 분해효소 활성의 약 80% 내지 85%를 차지하는 것으로 알려진 PepA (아스퍼질로펩신 A)는 아스파틸 프로테아제 (aspartyl protease)로서 산성조건에서 활성을 나타내는 펩신 계열의 세포외 단백질 분해효소이고, PepB는 산성조건에서 활성을 나타내는 아스파틸 프로테아제이지만 비펩신 계열의 엔도펩티다아제이다. 그외에 서틸리신 타잎 (subtilisin type) 단백질 분해효소인 PepC와 알칼라인 프로테아제인 PepD는 모두 세린계열의 단백질 분해효소이고, PepE는 아스파틸 프로테아제, PepF와 PepG는 세린 카르복시펩티다아제인 것으로 알려져 있다.

전술한 바와 같이, 아스퍼질러스 나이거를 이종유전자 발현을 위한 숙주로 사용하기 위한 한가지 방법으로서는 세포외 단백질 분해효소 결함 돌연변이주를 제조하여 이를 이용하는 방법이 있는데, 현재까지 개발된 대부분의 단백질 분해효소 결함 아스퍼질러스 변이주들이 대부분 그 단백질 분해효소 활성이 알칼리성 조건하에서는 별로 영향을 받지 않고 산성조건하에서만 낮아진다거나, 또는 알칼리성조건하에서는 균주의 성장 자체가 저해되는 등의 문제가 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은 배양조건이 산성이든 알칼리성이든 관계 없이 세포외 단백질 분해효소의 활성이 크게 저하되면서 성장 자체는 영향을 거의 받지 않아서 배양조건에 관계 없이 이종유전자의 발현을 위한 숙주로서 효과적으로 사용될 수 있는, 세포외 단백질 분해효소에 결함이 있는 아스퍼질러스 나이거 변이주를 제공하는 것이다.

도 1a는 PIM 고체배지상에서의 아스퍼질러스 나이거 단백질 분해효소 결함 돌연변이주들의 성장을, 도 1b는 CSM 배지상에서의 아스퍼질러스 나이거 단백질 분해효소 결함 돌연변이주들의 성장을 각각 보여주는 사진이다.

도 2는 산성조건하에서의 아스퍼질러스 나이거 단백질 분해효소 결함 돌연변이주들의 단백질 분해효소 활성을 나타내는 그래프이다.

도 3은 알칼리성조건하에서의 아스퍼질러스 나이거 단백질 분해효소 결함 돌연변이주들의 단백질 분해효소 활성을 나타내는 그래프이다.

도 4는 아스퍼질러스 나이거 야생형과 단백질 분해효소 결함 돌연변이주들의 생장곡선을 나타내는 그래프이다.

도 5는 아스퍼질러스 나이거 ANPD-129의 유도체인 F129H49와 아스퍼질러스 나이거 ANPD-153의 유도체인 F153H39 및 이들 사이에서 형성된 이배체 및 아스퍼질러스 나이거 FGSC A798 (A798로 표시됨)의 상보성실험 결과를 나타내는 사진이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 아스퍼질러스 나이거 ANPD-153 (KCTC 8795P)이 제공된다.

상기 돌연변이주는 야생형에 비해 산성 프로테아제 활성이 30% 미만, 알칼리성 프로테아제 활성이 15% 미만이어서, 산성 및 알칼리성조건 모두에 대해 매우 낮은 단백질 분해효소 활성을 보이며, 성장은 야생형과 유사한 양상을 나타낸다.

이하, 본 발명의 아스퍼질러스 나이거의 단백질 분해효소 결함 돌연변이주인 아스퍼질러스 나이거 ANPD-153의 제조방법에 대해 상세히 설명하고자 한다.

1. 모균주 및 배지

본 발명에서 단백질 분해효소 결함 돌연변이주를 제조하기 위한 모균주로는아스퍼질러스 나이거 FGSC A798 (FGSC (Fungal Genetics Stock Center, 캔자스, 미국)로부터 구입)을 사용하였고, 염색체 지도작성을 위해서는 A. niger FGSC A907, A807 및 A. niger FGSC A739 (FGSC로부터 구입)를 사용하였다. 각 균주의 유전자형은 표 1에 나타나 있다.

[표 1]

아스퍼질러스 나이거의 다양한 균주에 대한 유전형

균 주
균 주	Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ ?
FGSC A 907FGSC A 807FGSC A 739FGSC A 798ANPD-129ANPD-153F129H49F129H24F153H39	bioA1 leuA1 nicA1 pabA1 nirA1 oliC2 olv1 hisD4 lysA7,bioA1 argF8 nicA1 pabA1 fwnA1 lysA7 argB2 argB2 prt129 argB2 prt153 fwnA1 lysA7 prt129 fwnA1 argB2 prt129 fwnA1 argB2 prt153

균주의 일반적인 배양시에는 고체완전배지 (이스트 추출물 1.5g/l, 카사미노산 1.5g/l, 포도당 10g/l, 미량원소용액 1ml/l, 비타민용액 1ml/l)를 이용하였고, 단백질 분해효소 결함 돌연변이주의 선별을 위해서는 PIM (Protease Induction Media: 글리세롤 20g/l, KH₂PO₄1.5g/l, MgSO₄·7H₂O 0.5g/l, KCl 0.5g/l, 아르기닌·HCl 0.3g/l, 미량원소용액 1ml/l, 20X 쏠트 믹스(Salt mix) 50ml/l, 스킴 밀크 10g/l)과 CSM (Corn Starch Media: 포도당 1g/l, 콘스타치 10g/l, 아르기닌·HCl 0.3g/l, 1M MgSO₄·7H₂O 2ml/l, 미량원소용액 1ml/l, 20X 쏠트 믹스 50ml/l)을 사용하였다. 또한, 여러 가지 기질에 대한 단백질 분해효소 활성의 변화를 조사하기 위해서는 PIM을 적절히 변형시켜 사용하였으며, 돌연변이주에 대한 염색체 지도작성을 위해서는 최소고체배지 (Minimal Media)와 균주에 따라 요구되는 영양분을 최소고체배지에 적절히 첨가하여 제조한 배지를 사용하였다.

여기에서, 20X 쏠트 믹스는 1리터당 NaNO₃120g (또는 NH₄Cl 74.5g), KH₂PO₄16.3g, K₂HPO₄20.9g, KCl 10.4g을 포함하고 있으며, 미량원소용액은 용액 1리터당 ZnSO₄·7H₂O 22g, H₃BO₃11g, MnCl₂·4H₂O 5g, FeSO₄·7H₂O 5g, CoCl₂·6H₂O 1.6g, CuSO₄·5H₂O 1.6g, (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1g, 티아민-HCl 0.15g, 파라-아미노벤조산 0.75g, 니코틴산 2.5g, 리보플라빈 2.5g, 콜린-HCl 20g, 비오틴 25mg을 포함하고 있다. 모든 고체배지에는 한천을 2중량% 첨가하였으며, 콜로니의 크기를 작게하기 위하여 트리톤 X-100을 0.1%가 되도록 첨가하였다. 배양온도는 모든 경우에 30℃를 유지하였으며, 진탕배양시에는 200rpm의 속도로 진탕하였다.

2. 돌연변이 유발 및 돌연변이주 선별

완전고체배지에서 3일간 배양한 A. niger FGSC A798을 3ml의 0.0001% 트윈 80으로 수확하여 포자현탁액을 제조하였다. 헤마사이토미터(Marienfelt, 독일)를 사용하여 포자수를 측정하고 100 내지 300개의 포자를 스킴 밀크가 첨가된 PIM 고체배지에 도말하고, 10% 내지 20%의 포자만 살아남도록 자외선을 조사한 후 30℃에서 3-4일간 배양하였다. 자외선을 조사한 PIM 고체배지에서 자란 콜로니 중 모균주와 비교하여 투명환(clear ring)이 작거나 없는 것을 1차로 선별하였다. 이때, 투명환을 형성하지 못하는 균주들의 대부분은 콜로니의 크기가 작고 포자의 형성이 매우 느리게 진행되는 것으로 관찰되었는데, 이와 같은 균주들은 비록 단백질 분해효소 결함 돌연변이주로 판명이 되더라도 성장속도가 느리기 때문에 최종 목적생성물인 이종단백질 생산을 코딩하는 이종유전자 발현을 위한 숙주로는 적합하지 않고, 포자가 형성되지 않는 균주들은 보존에 어려움이 있다. 따라서, 모균주와 생장성이 비슷하여, 콜로니의 크기가 비슷하고 포자형성의 정도도 비슷한 균주들만을 선별하였다.

1차 선별된 돌연변이주들을 PIM 고체배지 및 CSM 고체배지에 각각 접종하여 CSM 고체배지에서는 투명환을 정상적으로 형성하지만 PIM 고체배지에서는 투명환을 형성하지 못하거나 또는 작은 투명환을 형성하는 돌연변이주들을 2차 선별하였다. 2차 선별과정에서는, CSM 고체배지에서 형성되는 투명환은 세포외로 분비되는 아밀라아제에 의해 콘스타치가 분해되어 형성되는 것이므로, CSM 고체배지에서 투명환을 형성하지 못하는 균주는 일반적인 단백질 분비기작에 결함이 발생한 균주로 간주하고 단백질 분해효소 결함 돌연변이주의 선별에서 제외시켰다.

선별된 돌연변이주는 ANPD (Aspergillus niger protease deficient)라 명명하고 일렬번호를 부여하였다. 이러한 과정을 통해 13종의 균주 (ANPD-25, 27, 44, 66, 109, 120, 129, 153, 154, 156, 165, 168, 171)를 선별하였는데, 이 돌연변이주들은 콜로니의 모양이나 색깔 등에 있어 공통적인 특징을 가지고 있지 않아서 단백질 분해효소 결함 돌연변이주만이 나타내 보이는 형태적 특징은 없는 것으로 관찰되었다. 이들 돌연변이주들은 대부분 모균주에 비해 포자의 형성이 다소 적거나 느린 것으로 나타났다. 도 1a는 PIM 고체배지상에서의 돌연변이균주의 성장을, 도 1b는 CSM 배지상에서의 돌연변이균주의 성장을 각각 보여주는 사진이다. 이 사진으로부터, 선별된 돌연변이주들은 전반적인 단백질 분비에는 결함이 없으나 단백질 분해효소에만 결함이 있다는 것을 알 수 있다. 특히 ANPD-129의 경우는 모균주와 비슷한 수준의 성장과 포자형성을 나타내 보였으며, ANPD-153의 경우는 형성되는 포자의 양은 모균주에 비해 감소하였지만 균사체의 형성은 모균주와 비슷한 수준을 나타내었다. 또한, ANPD-153은 그 균사체가 짙은 노란색을 띠는 특징을 가지고 있었다.

3. 단백질 분해효소 결함 돌연변이주의 단백질 분해효소 활성 측정

단백질 분해효소 활성 측정방법: 단백질 분해효소의 활성을 측정하기 위한 기질로는 헤마스테인 카제인(Hammrstein casein: Merck, 독일)을 사용하였다. 기질 용액 0.2ml에 알맞게 희석한 배양액을 0.2ml 첨가하고 37℃ 항온수조에서 2시간 반응시킨 후 0.4M 트리클로로아세트산(TCA) 0.6ml을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이어서, 원심분리하여 상등액을 얻은 다음 280nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 1.81mg의 티로신을 100ml의 0.2M HCl에 용해한 표준 티로신용액을 이용하여 작성하였다. 분당 1μmole의 티로신이 방출되는 것을 1유니트로 정의하였으며, 활성도는 유니트/세포건조중량(g)으로 정의하였다. 또한, 단백질 정량은 라우리(Lowry)의 방법을 변형하여 수행하였다 (Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr 및 R.J. Randall, 1953, J. Biol. Chem. 193:265-275 참조).

전술한 방법에 따라 선별된 단백질 분해효소 결함 돌연변이주들 중 일부에 대하여 산성조건하에서의 단백질 분해효소의 활성을 조사한 결과 대부분의 돌연변이주들이 모균주에 비해 효소활성이 감소된 것으로 나타났다 (도 2 참조). 단백질 분해효소 활성면에서, ANPD-44, 120은 모균주의 40% 정도이고, ANPD-109, 153은 20 내지 30% 정도이며, 특히 ANPD-129는 2 내지 3%에 불과하여 매우 낮은 것으로 나타났다.

한편, 돌연변이주의 선별시에 사용된 배지의 pH가 5.0 내외로 제조되어 산성조건에서 돌연변이주의 선별이 이루어졌음에도 불구하고 중성 또는 알칼리조건의 PIM 고체배지에서도 모균주보다 작은 투명환을 형성하는 돌연변이주들이 관찰되었다. 이러한 균주들에 대해 알칼리조건하에서 단백질 분해효소 활성을 측정한 결과 ANPD-129가 모균주의 49%, ANPD-153이 모균주의 13% 정도의 활성을 가지는 것으로 나타났다 (도 3 참조). 한 균주에서 산성 및 알칼리 단백질 분해효소의 활성이 모두 감소되었다는 것은 여러 개의 유전자에 돌연변이가 유발되었을 가능성을 시사하는 것이기도 하지만, 후속 실험을 통해 여러 개의 유전자에 돌연변이가 일어난 것이라기 보다는 단백질 분해효소 유전자의 발현을 조절하는 조절유전자에 돌연변이가 일어났을 가능성이 더 높은 것으로 나타났다.

4. 단백질 분해효소 결함 돌연변이주의 배양 및 생장곡선 작성

사상균류가 액체배지에서 자랄 때는 크게 균사(filamentous) 또는 펠릿(pellet) 형태를 가질 수 있다. 이러한 형태변화는 일반적으로 배지조성과 최초 포자 접종량에 의해 결정된다. 본 실험에서는 포자 접종량을 조절하여 모든 배양을 펠릿형태로 수행하였다.

50ml의 PIM 액체배지가 들어 있는 250ml의 진탕배양용 플라스크를 준비한 후 각 균주마다 15 내지 20개의 플라스크에 동일한 갯수의 포자(10⁶포자/ml)를 접종하였다. 배양을 하면서 일정한 시간마다 2-3개씩의 플라스크를 취하여 각각의 배양액을 여과하고 균사체의 건조중량을 측정하여 평균값을 구하여 생장곡선을 작성하였다 (도 4 참조). 도 4의 그래프에는, 대조를 위한 야생형의 생장곡선(A. niger FGSC A798: ●)이 표시되어 있고, 단백질 분해효소 결함 돌연변이주인 ANPD-129 (▼)와 ANPD-153 (▽)에 대한 생장곡선도 표시되어 있다. 이 그래프로부터, 카제인이 첨가되지 않은 PIM 액체배지에서 단백질 분해효소 결함 돌연변이주들의 생장은 모균주에 비해 느리지 않다는 것을 알 수 있다.

한편, 별도의 실험에서 ANPD-153은 고체배지에서 모균주보다 포자형성이 다소 느린 경향을 보였지만, 콜로니의 직경면에서는 모균주와 차이가 별로 없는 것으로 나타났다.

5. 염색체 지도작성 및 상보성 시험(Complementation test)

돌연변이가 일어난 유전자에 대한 지도를 작성하기 위하여 각각의 염색체에 표지유전자(marker gene)를 갖는 표준균주 (A. niger FGSC A739)와 선별된 두 종류의 돌연변이균주(ANPD-129, 153)에 대해 각각 이형핵체(heterokaryon)를 유도한 후 이배체(diploid)를 형성하였다. 형성된 이배체들을 벤래이트(benlate) 0.6㎍/ml이 첨가된 완전고체배지의 중앙에 일자로 도말하고 5-10일간 배양하였다. 염색체의 상실을 무작위적으로 유도하기 위해 배지내에 영양요구성 돌연변이주들이 요구하는 아르기닌, 루이신, 리신 등을 부가적으로 첨가하였다. 벤래이트가 첨가된 완전고체배지에서 반수체(haploid)가 만들어지면 부채꼴 모양의 구획(sector)이 형성되는데, 이를 마스터 플레이트(master plate)에 옮겨 보관하였다. 마스터 플레이트에 보관된 반수체를 각각의 마커 테스트(marker test)를 위한 배지에 리플리카-플레이팅(replica-plating)함으로써 돌연변이가 생긴 유전자에 대한 염색체 지도를 작성하였다. 이때, 각각의 균주에 대해 약 400개의 분리체(segregant)를 얻었지만 거의 모든 반수체들이 모균주와 동일한 유전자형을 가지는 것으로 나타났다. 이는 균주 자체가 이배체를 형성하기가 곤란한 것일 수도 있고 반수체의 포자가 서로 동일한 색깔을 갖기 때문에 선별시에 명확한 구분을 하지 못한데서 기인된 결과일 수도 있다. 따라서, 이러한 문제를 해결하기 위해 연갈색(fawn color)의 포자를 형성하는 fwnA 돌연변이주 (A. niger FGSC A739)를 이용하여 단백질 분해효소 결함 돌연변이주에 fwnA를 도입하였다.

A. niger FGSC A739와 본 발명에서 최종적으로 선별된 두 종의 돌연변이주(ANPD-129, 153)에 대해 각각 이형핵체를 형성하고 이배체를 선별하여 반수체를 형성한 결과 선별된 연갈색 반수체들이 각각의 표지들에 대하여 35% 내지 60%의 수준으로 분리가 이루어진 것으로 나타났다. 이들 분리체들 중에서 ANPD-129 돌연변이균주에 연갈색 포자형성의 선택표지(fwnA1)만이 도입된 F129H24 (fwnA1, argB, prt129)와 ANPD-153 균주에 fwnA1 선택표지가 도입된 F153H39 (fwnA1, argB, prt153) 및, ANPD-129 균주에 fwnA1과 lysA7 선택표지가 도입된 F129H49 (fwnA1, lysA7, prt129)를 선별하였다.

선별된 단백질 분해효소 결함 돌연변이주들 (ANPD-129, ANPD-153)이 서로 다른 유전자에 돌연변이가 일어난 것인지를 확인하기 위해 상보성 시험을 실시하였다. 이들 두 균주가 모두 argB 돌연변이주이기 때문에 이배체(diploid)의 형성이 어려우므로 먼저 A. niger ANPD-129와 A739 사이에 이배체를 얻은 후 반수체화(haploidization)를 통해 서로 다른 선택표지를 갖는 F129H49와 F153H39를 제조하고, 제조된 F129H49와 F153H39를 사용하여 이배체를 형성한 후 이 균주를 PIM 고체배지에서 배양하여 투명환의 형성 여부 및 그 크기를 비교하였다. 단백질 분해효소 결함 돌연변이주들인 F129H49와 F153H39는 투명환을 형성하지 못하나 두 균주가 합쳐진 이배체는 모균주와 마찬가지로 투명환을 형성하는 것으로 나타났다 (도 5 참조). 이러한 결과는 ANPD-129와 ANPD-153이 서로 다른 위치(locus)에서 일어난 돌연변이에 의해 단백질 분해효소 활성이 저하된 것임을 나타내는 것이다.

한편, 표준균주로서 A. niger FGSC A807 (olvA1, hisD4, lysA7, bioA1, argF8, nicA1, pabA1)을 사용하여 F129H24 균주에 있는 prt129와 F153H39 균주에 있는 prt153에 대한 염색체 지도를 작성하였다. 이때, 150개 이상의 반수체 분리체들을 분석하여 표준균주의 각 표지유전자와 prt 유전자 사이에서 일어난 유전자 재조합 빈도를 측정하여 그 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2의 재조합 빈도로부터 prt129는 연관그룹(linkage group) Ⅵ에, prt153은 연관그룹 Ⅲ에 돌연변이가 일어난 것임을 알 수 있다.

[표 2]

표준균주의 표지유전자와 prt 유전자간의 재조합 빈도

연관 그룹	? Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
A807	olvA1 hisD4 lysA7 bioA1 argF8 nicA1 pabA1
F129H24재조합체(%)^*	prt129 fwnA1 argB2 44^35 31 33 46^*28 11
F153H39재조합체(%)^*	prt153 fwnA1 argB2 41^27 3 7 63^*30 30
^마스터 균주 A807에서 prt 위치와 표지들간의 재조합 비율(%).^fwnA가 olnA에 대해 에피스태틱하므로 과대평가됨.^**argB와 argF의 이중돌연변이가 argB 단일돌연변이와 구별불가로 과대평가됨. prt: 프로테아제 결함; fwnA, olvA: 연갈색 또는 올리브색 분생자; hisD, argB, lysA, bioA, argF, nicA, pabA: 각각 히스티딘, 아르기닌, 리신, 비 오틴, 아르기닌, 니코틴산, p-아미노벤조산에 대한 영양요구성 균주임.

이상의 실험을 통해, 본 발명을 통해 얻은 아스퍼질러스 나이거의 단백질 분해효소 결함 변이주에 대한 유전학적 성질을 알아보았으며, 본 발명의 목적에 적합한 변이주로서 아스퍼질러스 나이거 ANPD-153을 분리하였다. 이 균주는 1997년 3월 27일자로 대전광역시 소재의 생명공학연구소에 기탁번호 KCTC 8795P로서 기탁되었다.

본 발명의 단백질 분해효소 결함 돌연변이주인 A. niger ANPD-153은 산성 및 알칼리성 조건하에서 모균주에 비해 매우 저하된 단백질 분해효소 활성을 나타내면서도 성장면에서는 모균주와 유사한 양상을 나타내고 있어, 이종단백질을 생산하기 위한 이종유전자를 발현시키기에 적합한 숙주로서 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims

아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)의 돌연변이균주로서, 단백질 분해효소 결함 돌연변이주인 A. niger ANPD-153 (KCTC 8795P).
제1항에 있어서, 야생형에 비해 산성 프로테아제 활성이 30% 미만, 알칼리성 프로테아제 활성이 15% 미만이고, 성장면에서는 야생형과 유사한 양상을 나타내는 것을 특징으로 하는 A. niger ANPD-153.