JPH09505481A

JPH09505481A - アスペルギルス・フェティダス発現系

Info

Publication number: JPH09505481A
Application number: JP7515687A
Authority: JP
Inventors: エム．ベーカ，ランディー; ヨダー，ウェンディ; 忍高木; チェティアブーミナサン，カルッパン
Original assignee: ノボノルディスクバイオテック，インコーポレイティド
Priority date: 1993-12-01
Filing date: 1994-11-29
Publication date: 1997-06-03
Anticipated expiration: 2015-11-27
Also published as: CN1139456A; WO1995015390A1; DE730656T1; FI962287A; FI962287A0; EP0730656A1; CA2178008A1; AU690617B2; JP3113284B2; AU1260995A

Abstract

(57)【要約】本発明は、アスペルギルス・フェティダス（Aspergillu s foetidus）宿主細胞を異種酵素の発現のための宿主細胞として使用する新規発現系に関する。

Description

【発明の詳細な説明】アスペルギルス・フェティダス発現系発明の分野本発明は、組換えタンパク質の生産に有用な宿主細胞に関する。特に、本発明は、組換えタンパク質、特に酵素の高レベル発現に利用できるアスペルギルス属の真菌宿主細胞に関する。発明の背景異種タンパク質の発現に組換え宿主細胞を使うことは、近年、他の方法ではそれらの天然源からの精製によってのみ得られる商業的に有益なタンパク質の大量生産を大きく単純化した。現在、特定の任意のタンパク質の生産のためには原核および真核宿主を含む様々な発現系の選択肢がある。適当な発現系の選択は、しばしば活性状態で妥当な収率でタンパク質を生産できる宿主細胞の能力に依存するだけでなく、タンパク質の意図する最終用途によっても大きく左右されるだろう。哺乳動物細胞と酵母細胞が最も汎用されている真核宿主であるが、糸状菌が組換えタンパク質生産用の宿主細胞として非常に有用であると現在認識され始めている。現在使われているかまたはそのような用途に提案されている糸状菌の中には、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）、トリポクラジウム・ゲオデス（Tolypocl adium geodes ）、ムーコル・サーシネロイデス（Mucorcircinelloides）およびトリコデルマ・レーセイ（Trichodermareesei）がある。加えて、アスペルギルス属の幾つかの種は組換えタンパク質生産のための宿主細胞として有効に使われている。アスペルギルスは、分生子柄から成る灌水器状物が頂嚢で終わり、この頂嚢が小柄またはフィアリド（小梗）と色々な名前で呼ばれる一層もしくは二層の同時形成された特殊細胞を生み、そして分生子と呼ばれる無性胞子を形成することにより特徴づけられる。アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）種は組換えプラスミドにより形質転換されると報告されている（Ballance他、Biochem．Biophys．Re s．Comm．112：284-289，1983）が、形質転換はかなり低い頻度で起こることがわかった。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）とアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）両種も組換えタンパク質生産において有用であると記載されている。しかしながら、他のアスペルギルス種は異種タンパク質の発現に有用であると示されておらず、実際に、貧弱な発現および／またはプロテアーゼもしくはマイコトキシンの過剰生産のために、アスペルギルスの全ての種がこの目的に宿主細胞として適するわけではないし、或る種から判断して次の種へとこの能力を予測することもできない。アスペルギルス・フェティダス（Asperg illus foetidus ）はＢ型肝炎抗原の発現に使われている（Hongdi他，ActaMicrob iologica Sinica 30：98-104，1990）けれども、他のいずれかの種類のタンパク質の発現に有用であるとは報告されておらず、また高収率でタンパク質を生産することができるとは報告されていない。理想的な発現系は、プロテアーゼおよびマイコトキシン並びに多量の内因性的に作られる分泌タンパク質の生産が実質的になく、且つ既知の宿主細胞よりも高いレベルの発現が可能であるものである。本発明は、それらの要件を満たし且つ相当量の真菌酵素を発現することができる新規アスペルギルス発現系を提供する。発明の要約本発明は、異種酵素をコードする核酸配列を含有する、アスペルギルス・フェティダス（Aspergillus foetidus）宿主細胞を提供する。「異種酵素」とは、宿主細胞にとって生来でない酵素、または生来の配列を変更する修正が行われている生来の酵素を意味する。好ましい態様では、該タンパク質は異種真菌酵素である。該核酸配列は、選択された宿主細胞中で該核酸配列の転写を指令することのできる適当なプロモーター配列に作用可能に連結される。本発明はまた、酵素の組換え生産方法であって、異種酵素をコードする核酸配列を含有するアスペルギルス・フェティダス宿主細胞を、該酵素の発現を促す条件下で培養し、そして培養物から該酵素を回収することを含んで成る方法にも関する。好ましい態様では、該酵素は真菌酵素である。本発明の宿主細胞および方法は、意外にも、他の既知のアスペルギルス種、例えばＡ．ニガーまたはＡ．オリゼよりも、様々な真菌酵素の組換え生産においてより優れている。発明の詳細な説明アスペルギルス・フェティダス（Aspergillus foetidus）種はアスペルギルス属の黒色（Nigri）部門に属する。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus nige r ）により代表されるような黒色部門のメンバーは、放射状分生子頭と黒色気味の分生子集団；球状頂嚢；滑らかで透明な、または頂嚢の下が着色している菌柄；存在するかまたは欠けており、しばしば着色しているメツラ（基底梗子）により特徴づけられる（“The Genus Aspergillus”，K.B．RaperおよびD.I．Fennel 著，The Williams & Wikins Company，Baltimore，1965）。胞子色と装飾物、または他の微視形態的特徴が異なるそれらの株の変異体もこの部門に含められる。アスペルギルス属の黒色部門では、主な分類法が第一に基礎にしている（即ち、RaperおよびFennel，前掲）コロニーの色と分生子形成構造が多様であるため、分類群の境界は論争中である。RaperおよびFennelにより認められたＡ．フェティダス関連分類群はＡ．フェティダス、Ａ．フェティダス変種アシダス（A．foetidus var．acidus）およびＡ．フェティダス変種パリダス（A．foetidus var．pallidus）である。Ａ．フェティダスは一般的に、２列の梗子；灰色がかった濃茶またはオリーブ茶色の分生子頭；成熟した時には球状またはほぼ球状で、不規則に且つ細かくでこぼこになった分生子により特徴づけられる。より詳しくは、この種は次のように特徴づけられる：Czapek溶液寒天上のコロニーは室温（24〜26℃）でゆっくりと増殖し、10日〜２週間で3.5〜4.5cmに達し、大部分が水面下にあるかまたはより密集した比較的硬い表面を形成する白色または黄色味を帯びた無性菌糸を有し、平坦であるかまたは放射状に皺が寄り、非輪紋状または弱い輪紋状であり、株によっては増殖している縁のところを除いて全体に豊富なオリーブ茶〜黒褐色の分生子頭を生じる株もあり、遅く且つあまり豊富にでなく胞子形成する株もあり；滲出物は無いかまたは目立たなく；コロニーの裏側は黄色〜橙色で、成熟すすると赤褐色になり；臭いは非常に強く、アクチノマイセス様の突き刺すような臭いである。分生子頭は最初は小さく球状〜放射状であり、密集したコロニー中央領域ではそのようなままであるが、コロニーの縁近くでは不規則に幾つかの明瞭な柱状体に割れ始めており、通常は全直径が200〜300μであるが、株によっては 500μに達することもあり；分生子柄は大部分が直径25〜35μであるが、40〜50 μに達する株もあり、大きな頭部では全表面が稔性であり、小さな頂嚢では上側の3/4が稔性であり；梗子は二列で、褐色気味に着色しており、第一列は幾分多様であり、大部分が７〜12μ×3.0〜5.0μで、時にはそれより長く、第二列は７〜８μ×2.5〜3.0μであり；分生子は大部分が球状、時に半球状で、褐色でしばしば平滑に見えるが成熟すると不規則で且つ細かくでこぼこした壁を有し、大部分は直径が4.0〜4.5μであり、明らかな分岐点を持たずに鎖状にできる。肉エキス寒天上のコロニーは、幾分速く２週間で５〜６cmに増殖し、平坦で、ビロード状であり、水面下に且つ無色またはわずかに黄色の無性菌糸を有し、全体に激しく胞子形成し、黒褐色で、非輪紋状またはわずかに輪紋状であり；裏側は淡黄色〜ほとんど無色であり；臭いは顕著でない。分生子頭は通常多数の顕著に分岐したコンパクトな柱状体に割れ、大部分の株では直径300〜350μに達するが600〜800μに達する株もあり；分生子はCzapek寒天上よりも一様に棘状である。分生子頭の構造上の詳細は上述した通りである。この種はThomおよびRaper，A Manual of the Aspergilli，219-220，図61Ｃ，1945により最初に記載された。Ａ．フェティダス変種パリダス（Nakazawa，SimoおよびWatanabe，J．Agr．Ch em．Soc．Japan 12：961-962，図10，1936）は、コロニーがCzapek溶液寒天上でむしろ限定的に増殖し、室温（24〜26℃）で10日〜２週間で2.0〜2.5cmの直径に達し、平坦であるかまたはごくわずかに皺が寄り、密集した基底菌糸から成り、非胞子形成性でありそして縁のところが白色または黄色を帯びているが、その他はぼんやり灰色がかったオリーブ色〜濃いオリーブ色に近いオリーブ茶色〜Chac turaまたはオリーブ黒色の密集した分生子頭を生成し；裏側が最初は無色で次に黄色を帯び、成熟すると濃い黄褐色になり；臭いが該種のものより顕著でなく、標徴的でないことにより特徴づけられる。分生子頭は球状〜放射状で、直径が50 0〜600μまでであり、通常は幾つかの不明瞭な柱状体に割れており；分生子柄は滑らかで、無色または茶色がかっており、普通は長さ約１mm×幅８〜16μで、時にはそれより長いことがあり；頂嚢は球状から球状に近く、最も大きな頭部では直径が50〜60μ までであり、全表面が稔性であり；梗子は二列で、茶色味を帯びており、第一列は若い時は通常10〜15μ×3.5〜5.0μであるが成熟した時は30〜40μまでになり、第二列は大抵７〜10μ×3.0〜4.0μであり；分生子は最初は楕円形〜卵形で且つ平滑またはそれに近く、次第に直径3.5〜4.5μで且つかすかにでこぼこしている球状または半球状になり、液体封入では付着性であるが結合物では明白でない。肉エキス上のコロニーは幾分迅速に増殖し、平坦で、通常ビロード状で、全体に渡り激しく胞子形成しており、濃いオリーブ色〜黒色を帯びている。分生子構造は直径が700〜800μで、本質的にはCzapek寒天上のものと同じであるが、成熟した分生子は3.0〜3.5μの、有棘状の球形であり、表面模様が縦方向を示す。この変種は、主に、Czapek寒天上での一層制限された増殖、それの分生子構造が一層大きい寸法とオリーブ色着色を示すこと、並びに肉エキス寒天上では成熟した分生子頭に明らかに分離した柱状部が無いことという点で、当該種とは異なる。Ａ．フェティダス変種アシダス（Nakazawa，SimoおよびWatanabe，J．Agr．Ch em．Soc．Japan 12：961-962，図10，1936）は、コロニーがCzapek溶液寒天上でより遅く増殖し、室温（24〜26℃）で10〜14日間で4.0〜5.0cmに達し、最初は柔毛性で且つ白色〜淡黄色で、少し胞子形成しているが、後に比較的少数の球状〜放射状の、黒褐色分生子頭を周縁部と亜縁部に生成し；裏側が最初は黄色を帯び、成熟すると濃い黄褐色に変わり；臭いが顕著でなく；分生子頭が比較的大きく、直径350〜400μであり、明瞭な柱状体に割れておらず；分生子柄が比較的短くて幅広であり、普通は600〜800μ×20〜30μで、まれに長さが１mmであり；頂嚢が球形からほぼ球形であり、直径80〜85μまでであり、全表面に渡り稔性であり；梗子は二列で、茶色味を帯びており、第一列は20〜 40μ×4.6μで、第二列は６〜10μ×2.5〜3.5μであり；分生子が球形〜幾分平たく、茶色で、平滑に見えるかまたはわずかに不規則であるが有棘状であったり小皺が寄っていたりしない表面を有することにより特徴づけられる。肉エキス寒天上のコロニーは、より速く10日以内に不規則に胞子形成し、広く輪紋状で、平坦であるかまたは細かく皺が寄っており、大部分が水面下に明るい黄金色の無性菌糸を有し；短い分生子柄の上に、上述したのと同様であるがCzap ek上よりも大きく、500〜600μの直径に達し且つ多数の不明瞭な分生子の柱状体を示す、分生子頭が生じる。この変種は、Czapek寒天上と肉エキス寒天上で軽く胞子形成するコロニー、より大きな分生子頭と構造部分、それの比較的短く幅の広い分生子柄、並びに特にそれの明るい黄色の菌糸の点で、当該種とは異なる。本明細書および請求の範囲を通して、用語「Ａ．フェティダス」の使用が、上述した３つの群に含まれる生物だけでなく、別の分類法において以前に指定されたかまたは現在他の種と指定されているが、上記に定義したものと同じ形態的および培養的特徴を有し、Ａ．フェティダスおよびそれの変異体の別名であるかもしれないそれらの種も包含することは理解されよう。例えば、別名としてはＡ．アウレウス・ナカザワ（A．aureus Nakazawa）、およびＡ．アウレウス変種パリダス・ナカザワ，シモ＆ワタナベ（A．aureus var．pallidus Nakazawa，Simo and Watanabe）が挙げられる（がそれらに限定されない）。また、Ａ．シトリクス・モサリー（A．citricus Mosseray）（A．Musallam，Revision of the Black Aspergillus species，Ph.D ．Thesis，University of Utrecht）もおそらく別名であろう。宿主細胞候補としてのＡ．フェティダスの有用性の最初の決定は、アスペルギルス属の異なる分類部門に属する15以上の種からの様々な単離物により生産されるプロテアーゼのレベルの評価によって行う。これは、各単離物を酸性、中性およびアルカリ性ｐＨでのカゼイン透明化平板アッセイにおいて試験することにより達成される。驚くべきことに、黒色（Nigri）部門の幾つかのメンバーが、生産される任意の組換えタンパク質の分解を潜在的に引き起こし得るプロテアーゼを最少量生産したという点で、最も良く働くことがわかった。この基準に基づいて、更なる研究のために次の数種を選択する：Ａ．フェティダス（A．foetidus ）、Ａ．ジャポニカス（A．japonicus）、Ａ．ジャポニカス変種アクレータス（A．Japonicus var．aculeatus）、Ａ．アクレータス（A．aculeatus）、Ａ．タマリィ（A．tamarii）、Ａ．カルボナリウス（A．carbonarius）およびＡ．フェニシス（A．phoenicis）。次いで、選択された種を形質転換することを試みる。最初の努力は標準的なＡ．オリゼ（A．orizae）形質転換技術の使用に集中する（Christensen他，Bio/Te chnology 6：1419-1422，1988；EP出願第87 103 806.3号）。簡単に言えば、プロトプラスト形成、形質転換、およびamdSまたはヒグロマイシンＢ（hygB）マーカー遺伝子についての選択に向けて、Ａ．オリゼのプロトコールを使って同時形質転換体を得る。発現ベクターは、異種コード配列に加えて、Ａ．オリゼのTAKA −アミラーゼ遺伝子と、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子からの転写終結シグナルを含有する。形質転換頻度は、ＤＮＡ１μｇあたり１未満から約10まで異なる。下記の実施例に詳述されるような発現ベクターを使った同時形質転換実験では、同時形質転換の頻度は０〜60％の範囲である。次いで形質転換された種を観察して様々な異種酵素の発現レベルを測定する。試験した異種酵素としては、フミコーラ・ラヌギノーザ（Humicola lanuginosa ）リパーゼ（ＨＬＬ）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）キシラナーゼ（キシラナーゼ）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ（セルラーゼ）およびコプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus ）ペルオキシダーゼ（ＣｉＰ）が挙げられる。驚くべきことに、Ａ．フェティダスは上記酵素の１または複数について良好な発現を示し、ある場合には、対照のＡ．オリゼ株と同等のまたはそれより良い酵素収率を示す。特に、Ａ．フェティダスの１つの株は振盪フラスコ培養において非常に高いレベルのＨＬＬ（約１ｇ／ｌ）を生産する。それらの試験結果の要約は表２に与えられる。結果が明らかに示すように、この種の数個の単離物は異種タンパク質を生産することができる。よって、この能力は単一の単離物または株に限定されるのではなく、むしろこの種の全体としての特徴であると理解される。当業者は、それらの種の他の株または単離物も異種酵素の発現に利用できると認識するだろう。各種の多数の株かATCC（the American Type Culture Collection；12301 Parklawn Drive，Rockville Maryland 20852）；NRRL（Agrlcultural Research Service Culture Collection；1815 North University Street，Peoria，Illinois 6160 4）；FGSC（Fungal Genetics Stock Center；Kansas）；DSM（Deutsche Sammlun g von Mikroorganismenund Zellkulturen；Mascheroder Weg 1B，D-3300 Brauns chweig，Germany）；IAM（Institute of Applied Microbiology；113 東京都文京区弥生町１丁目１−１、東京大学）；IFO（Institute for Fermentation；532 大阪府淀川区十三本町２丁目17−85）およびCBS（Centraal Bureau voor Schimmelcultures；Oosterstraat 1，3740AG Baarn，Netherlands ）の寄託機関において公に入手可能である。当業者は、本明細書中に記載の宿主種の好結果の形質転換が、特に例示されたベクター、プロモーターおよび選択マーカーの使用に限定されないことも認識するだろう。一般的に言って、Ａ．オリゼ、Ａ．ニガーおよびＡ．ニデュランスの形質転換において有用であるそれらの技術は、本発明の宿主細胞にも有用である。例えば、amdSおよびhygB選択マーカーが好ましいけれども、他の有用な選択マーカーとしてargB（Ａ．ニデュランスまたはＡ．ニガー）、trpC（Ａ．ニガーまたはＡ．ニデュランス）、またはpyrG（Ａ．ニガーまたはＡ．ニデュランス）マーカーが挙げられる。プロモーターは、それらの種において強力な転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であることができ、そして細胞外と細胞内の両方のタンパク質、例えばアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼおよび解糖酵素をコードする遺伝子から誘導することができる。そのような適当なプロモーターは、Ａ．オリゼのTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ、Ａ．ニガーの中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸安定性α−アミラーゼ、およびリゾムーコル・ミーヘイのリパーゼをコードする遺伝子から誘導することができる。解糖酵素遺伝子からのプロモーターの例は、ＴＰＩ，ＡＤＨおよびＰＧＫである。プロモーターは同種プロモーター、即ち生来のＡ．フェティダス遺伝子のプロモーターであってもよい。本発明の好ましいプロモーターは、Ａ．オリゼのTAKAアミラーゼプロモーターである。TAKAアミラーゼは公知のα− アミラーゼである（Toda他，Proc．Japan Acad．58 Ser.B.：208-212，1982）。プロモーター配列と着目の遺伝子または選択されたシグナルペプチドまたはプレ領域との連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的で、プロモーター配列にリンカーを提供してもよい。ターミネーターとポリアデニル化配列もプロモーターと同じ源から誘導することかできる。構成物中にエンハンサー配列を挿入することもできる。発現産物を獲得するのに細胞を破壊する必要性を回避するために、および細胞内で起こりうる発現産物の分解の量を最小にするために、該産物が細胞の外に分泌されることが好ましい。このために、好ましい態様では、着目の遺伝子は、発現産物を細胞の分泌経路に差し向けることができるプレ領域、例えばシグナルペプチドまたはリーダーペプチドに連結される。プレ領域は任意の生物からの任意の分泌タンパク質の遺伝子から誘導してもよく、または生来のプレ領域であってもよい。そのようなプレ領域のための有用な入手源の中には、アスペルギルス種からのグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、バシラス（Bacillus）種からのアミラーゼ遺伝子、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）からのリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ（Saccha romyces cerevisiae ）からのα−因子遺伝子、または子牛のプロキモシン遺伝子がある。最も好ましくは、プレ領域はＡ．オリゼのTAKAアミラーゼ遺伝子、Ａ．ニガーの中性α−アミラーゼ遺伝子、Ａ．ニガーの酸安定性α−アミラーゼ遺伝子、Ｂ．リヘニフォルミス（B．licheniformis）のα−アミラーゼ遺伝子、バシラスNCIB 11837からのマルトース産生アミラーゼ遺伝子、Ｂ．ステアロサーモフィラス（B．stearothermophilus）のα−アミラーゼ遺伝子、またはＢ．リヘニフォルミス（B．licheniformis）のサブチリシン遺伝子である。有効なシグナル配列はＡ．オリゼのTAKAアミラーゼシグナル、リゾムーコル・ミーヘイのアスパラギン酸プロテアーゼシグナル、およびリゾムーコル・ミーヘイのリパーゼシグナルである。代わりのものとして、発現させようとする遺伝子にとって生来であるプレ領域を使ってもよい。プロモーターおよびターミネーター配列に作用可能に連結された所望の生成物の遺伝子は、選択マーカーを含むベクター中に含めることができ、または宿主株のゲノム中に組み込むことができる別個のベクターもしくはプラスミド上に置くことができる。ベクター系は単一のベクターもしくはプラスミドであることができ、またはゲノム中に組み込もうとする全ＤＮＡを一緒になって含有する２以上のベクターもしくはプラスミドであることができる。ベクターまたはプラスミドは直鎖状分子であっても閉環状分子であってもよい。本発明の好ましい態様によれば、１つが選択マーカーを含み、そしてもう１つがプロモーター、所望のタンパク質をコードする遺伝子並びに転写ターミネーターおよびポリアデニル化配列を含む導入しようとする残りの異種ＤＮＡを含んで成る、２つのベクターを使って宿主を形質転換させる。本発明の宿主細胞種は、任意の原核または真核生物の着目の異種酵素を発現させるのに用いることができ、好ましくは、真核生物の酵素を発現させるのに使われる。それの食品産業における使用が認可されているという点でこの種は特に有用である。この種について特に着目されるのは、異種真菌酵素の発現におけるそれらの利用である（Regulatory Aspects of Microbial FoodEnzymes，Third Edi tion，The Association of Microbial Food Enzyme Producers，Brussels，Belg ium）。カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼおよび他のタンパク質分解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼ、並びにデオキシリボヌクレエアーゼのような酵素を発現させるのに本発明の新規発現系を使うことができる。用語「真菌酵素」は生来の真菌酵素だけでなく、アミノ酸の置換、削除、付加、または活性、熱安定性、ｐＨ耐容性等を増強するために行うことができる他の修正により変更されているそれらの真菌酵素も包含することは、当業者により理解されるだろう。本発明の宿主細胞は、宿主細胞にとって生来であるタンパク質の組換え生産にも用いることができる。そのような用法の非限定的例としては、タンパク質の発現を増強するため、シグナル配列の使用によって着目の生来のタンパク質の細胞外への輸送を促進するため、または主題の宿主細胞により通常生産されるタンパク質のコピー数を増加させるために、異なるプロモーターの調節下にＡ．フェティダスの生来のタンパク質を置くことが挙げられる。よって、本発明は、そのような発現が宿主細胞にとって生来でない遺伝要素の使用、または宿主細胞中に通常は見られない様式で働くように操作されている生来の要素の使用を含む限り、同種タンパク質のそういった組換え生産も包含する。本発明を次の非限定例により更に説明する。Ｉ．プロテアーゼアッセイ少なくとも15の異なる種からの50以上の株を試験し、各単離物により生産されるプロテアーゼの量を測定し、そしてそれらの細胞外タンパク質分布も観察する。培養接種試料を調製するために、９cmのペトリ皿中の各株の７〜10日培養物に10mlの滅菌蒸留水を加え、菌糸から静かに胞子をかき取り、濃厚な懸濁液を作る。この懸濁液2.5mlを使って100mlのASPO4培地に接種する〔ASPO4培地は、水道水中に１g/lのCaCl₂、２g/lの酵母エキス、１g/lのMgS O₄、５g/lのKH₂PO₄、２g/lのクエン酸、0.5mlの微量金属溶液（14.3g/lのZnSO₄ ・7H₂O，CuSO₄・5H₂O，0.5g/lのNiCl₂・6H₂O，13.8g/lのFeSO₄・7H₂O，8.5g/lの MnSO₄・H₂Oおよび３g/lのクエン酸から成る）、１g/lの尿素、２g/lの(NH₄)₂SO₄ 、20g/lのマルトデキストリン（８mlの25％原液、加圧滅菌後に加える）を含んで成り、加圧滅菌前にｐＨを4.5または6.5に調整し、次いで加圧滅菌後に100ml あたり８mlの0.1Ｍクエン酸を使ってpH4.5に調整した〕。フラスコを、200rpmで軌道振盪器上で振盪させながら、連続した光の中で30および／または37℃で５日間インキュベートする。各々の培養ブロスからの上清を2500rpmで５分間遠心し、そしてカゼイン透明化平板アッセイで使用し、様々な真菌種から生産されるプロテアーゼのレベルを測定して組換えタンパク質発現の有力な候補として評価する。カゼイン透明化平板アッセイは次のようにして行われる。平板培地は、20g/l の脱脂粉乳、20g/lのアガロース、およびpH５とpH７で行われる試験には0.2Mのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液、pH9で行われる試験にはグリシン−NaOH緩衝液から成る。脱脂粉乳を100mlの緩衝液と混合し、60℃に維持する。アガロースを400 mlの緩衝液と混合し、そして５分間加圧滅菌する。わずかに冷却した後、温かい脱脂粉乳混合物を添加し、混合物を穏やかに２〜３回反転させて混合する。平板あたり50〜70mlを使ってこの培地を150mmの平板に注ぎ、使用まで５℃で貯蔵する。使用直前に、寒天の中に平板あたり12個の穴を作る。各株の醗酵物からの上清 25μｌを各pHの平板１枚に加え、37℃で一晩インキュベートする。pH９の平板には、0.5Ｍ氷酢酸を加えてカゼインを沈澱させ、どんな透明帯でも可視化する。次いで各平板を透明帯のサイズ（即ち、透明帯なしから直径＞２cmまで）と透明帯の型（即ち、透明、不透明または両方の型）について評価する。各培養物の上清を使って、株の細胞外タンパク質生産も評価する。製造業者の取扱説明書に従って調製したNovex（San Diego，CA）８〜16％勾配ゲルを使ってタンパク質分布を評価する。培養上清の75μｌ（３日および５日）試料を、20μ ｌの５×解離緩衝液（解離緩衝液＝４mlの１M Tris-HCl，pH 6.8，１ｇのSDS，6 17mgのジチオスレイトールを滅菌蒸留水で10mlにする）とグリセロール／ブロモフェノールブルー（約10mlの80〜90％グリセロールに10〜20mgを加え、沸騰した湯の中に１〜２時間置いて溶解させたもの）に添加し、５分間煮沸し、冷却し、負荷し、そしてブロモフェノールブルー追跡色素がゲルの下端に達するまで60〜 200Ｖで泳動する。Biorad Silver Stain Plusプロトコール（Biorad Laboratori es，Hercules，CA）に従ってゲルを銀染色する。多数のバンドを示すそれらの単離物は有力な新規宿主としてあまり適当でないと見なし、一方でわずか１〜４本の少量バンドを有する比較的きれいな分布を示すものは更なる試験にかける。プロテアーゼアッセイとタンパク質分布の組合せ結果を吟味すると、適当な有力候補の大部分は黒色（Nigri）部門のメンバーの中に見つかる。それらの結果に基づいて、次の単離物を形質転換実験のために選択した：Ａ．フェティダスE4 6、Ａ．フェティダスCBS103.14、Ａ．フェティダス変種パリダス（NRRL 356）、Ａ．フェティダスNO953（NRRL 337；ATCC 10254）、Ａ．ジャポニカス A1438（CBS 172.66）、Ａ．アクレータスN1136（CBS 101.43）、Ａ．アクレータスA1454（CBS 172.66）、Ａ．アクレータスA1455（CBS 186.67）、Ａ．ジャポニカス変種アクレータスNO956（IAM13871）、Ａ．フェニシスA528（CBS 139.48）、Ａ．フェニシスA530（CBS 137.52）、Ａ．フェニシスE419（CBS 137.52）、Ａ．カルボナリウスA3993（IBT 4977）、Ａ．カルボナリウスATCC 1025、Ａ．タマリィE112（ATCC 10836）、Ａ．タマリィN2266（IFO 4358）およびＡ．タマリィN 2267（IFO 4142）。それらの培養物は、ノボ・ノルディスク・バイオテック・カルチャー・コレクション（Novo Nordisk Biotech Culture Collection；Davis ，Callifornia）の一部としても維持される。 II．ベクターの作製Ａ．選択マーカーベクター。ベクターpJaL77とpJaL154をヒグロマイシンＢ耐性選択マーカーによる宿主細胞の形質転換に使用する。このマーカーはＥ．コリのヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子に基づいており、pJaL77中ではTAKAプロモーターの調節下にそしてpJaL154中ではamdSプロモーターの調節下に置かれる。簡単に言えば、それらのベクターは次のようにして作製される。ヒグロマイシンＢに対する耐性を付与する遺伝子を、Boehringer MannheimからプラスミドpHph-1として購入する。この遺伝子に、プライマー：5'-GCT CAG AAGCT T CCATCC TAC ACC TCA GCA ATG TCG CCT GAA CTC ACC GCG ACG TCT-3'（Ｎ−末端）と3'-CGT CCG AGG GCA AAG GAA TAG CTCCAG AGATCT CAT GCT-5'（Ｃ−末端）を使って、ＰＣＲによりアミノ末端とカルボキシ末端に適当な制限部位並びにＡＴＧコドンを取り付ける。ＰＣＲ断片を制限酵素BamHIとXhoIで切断し、次いでアスペルギルス発現ベクターpToC68（WP 91/17243 中に記載されている）中の対応部位にクローニングしてpJaL77を作製する。プラスミドpJaL154は次のようにして作製する。次のプライマー（下線領域はa mdSプロモーターとの相同性を示す）：CCT GGA TCC TCT GTG TTA GCT TAT AGおよびCTT GCA TGC CGC CAG GAC CGA GCA AGを使ったＰＣＲにより、プラスミドpC aHj406からamdSプロモーター変異体Ｉ₉＋Ｉ₆₆₆（Hynes他，Mol．Cell．Biol．3( 8)：1430-1439，1983およびKatz他，Mol．Gen．Gent．220：373-376，1990）をクローニングする。amdSプロモーターを含む694 bpのＰＣＲ断片をBamHIとSphI で切断し、pJaL77のTAKAプロモーターがamdSプロモーターで置換されるようにpJ aL77中の対応部位にクローニングする。 amdSマーカーを含むプラスミドpToC90は、p3SR2（Hynes他，前掲）からの2.7k b XbaI断片を、XbaIで切断しそして脱リン酸したpUC19プラスミド中にクローニングすることにより作製する。pToC186と命名された誘導体は、プロモーター領域がamdS遺伝子の発現を増強することが知られている２つの変異体（Ｉ₉とＩ₆₆₆ ）を含むこと以外はpToC90と同じである（Hynes他，前掲；Corrick他，Gene 53 ：63-71，1987）。Ｂ．発現ベクター。 1. フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）キシラナーゼ。ベクターpHD414はプラスミドp775（EP 238 023）の誘導体である。このプラスミドとは異なり、pHD414はTAKAプロモーターとAMGターミネーターの間に一連のユニークな制限部位を有する。該プラスミドは、ターミネーターの３′末端の長さ約200b pの断片（望ましくないＲＥ部位を含む）の除去に続き、プロモーターの５′末端の長さ約250bpの断片（同じく望ましくない部位を含む）の除去により作製される。NarI（pUCベクター中に存在する）とXbaI （ターミネーターのすぐ３′側）での消化により200bp領域を除去し、次いで生成した末端をクレノウＤＮＡポリメラーゼ＋dNTPを使ってフィルインし、ベクター断片をゲル上で精製し、そしてベクター断片を再連結する。このプラスミドを pHD413と命名する。pHD413をStuI（プロモーターの５′末端に位置する）とPvuI I（pUCベクター中）で切断し、ゲル上で分画しそして再連結し、pHD414を得る。 pYES中に約1,100bpのキシラナラーゼHindIII／XbaI cDNA断片を含有するＥ．コリの株をDSM 6995としてDSMに寄託する。該キシラナーゼcDNA断片をHindIII／Xb aIでの開裂によりクローンの１つから単離する。該断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出させ、連結反応に向けて準備する。該cDNA断片をpHD4 14中に連結してpAXX40-1-1を作製する。キシラナーゼ遺伝子およびタンパク質の配列は配列表の配列番号３と４に与えられる。該遺伝子をDSM(Deutsche Sammlun g von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)6995として寄託する。 2. フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ。フミコーラ・インソレンスのセルラーゼの詳細な特徴づけはWO91/17243中に見つかる。セルラーゼ発現に使った発現ベクターpCaHj418は、制限酵素BamHIとSaIIでの開裂によりpCaHj201から926 bpセルラーゼコード領域断片を切除することにより作製される。この断片を標準技術を使った調製用ゲル電気泳動により精製し、そして BamHIとXhoIで処理しておいたpHD414（上述）と連結せしめる。得られた発現ベクターpCaHj418は、Ａ．オリゼのTAKAアミラーゼプロモーターとＡ．ニガーのグルコアミラーゼターミネーター領域の転写調節下にセルラーゼ遺伝子を含有する。 3. フミコーラ・ラヌギノーザ（Humicola lanuginosa）リパーゼ。Ｈ．ラヌギノーザのリパーゼ遺伝子の単離および発現はEP 305 216中とUS出願第07/236,605号中に報告されており、その内容は参考として本明細書中に組み込まれる。簡単に言えば、ホモジナイズしたＨ．ラヌギノーザ菌糸からBoel他（EMBO J．３：1097-1102，1984）とChirgwin他（Biochemistry 18： 5294-5299，1979）により記載された方法を使って全ＲＮＡを抽出する。AvivおよびLeder（PNAS USA 69：1408-1412，1972）により記載されたようなオリゴ（ｄＴ）−セルロース上での２度のアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを得る。次いでOkayamaおよびBerg（Mol．Cell．Biol．2:16 1-170，1982）により記載された方法と、Noma他（Nature 319:640-646，1986）により記載されたベクターpSP62-K2とpCDVI-PLを使ってcDNAを合成する。合成したcDNAをＥ．コリMC1000のhsdR^-，M⁺誘導体（CasadabanおよびCohen，J．Mol．B iol．138：179-207，1980）中に形質転換せしめ、組換えクローンを作製する。 32個のペンタデカマー（15マー）オリゴデオキシリボヌクレオチドの混合物（その１つは、Phe-Asn-Gln-Phe-Asnをコードする領域がＨ．ラヌギノーザのリパーゼmRNAと相補的である）をApplied Biosystems，Inc.のＤＮＡ合成装置上で合成し、PAGEにより精製する。Ｈ．ラヌギノーザcDNAライブラリーからの約10,0 00のＥ．コリ組換え体をWhatman 540フィルターに移す。Gergen他（Nucleic Aci ds Res．72115-2135，1979）により記載されたようにコロニーを溶解させ固定化する。Boel他（EMBO J．３：1097-1102，1984）により記載された通りに該フィルターを³²Ｐ−標識Ｈ．ラヌギノーザリパーゼ特異的ペンタデカマー混合物とハイブリダイズさせる。フィルターのハイブリダイゼーションと洗浄をそれぞれ37℃と43℃で行い、次いで映像強化膜を使って24時間オートラジオグラフィーを行う。標準手順（BirnboimおよびDoly， Nucleic Acids Res．7:1513-1523，1979）により２つのハイブリダイズしているコロニーpHLL 702.3とpHLL702.4からMiniprepプラスミドＤＮＡを単離し、そしてMaxamおよびGilbert（Methods Enzymol．65：499-560，1980）の手順により該ＤＮＡ挿入断片のＤＮＡ配列を決定する。該cDNAを使った作製作業を更に容易にするために、次のようにしてユニーク制限部位を含むＤＮＡ配列を該cDNAの５′末端と３′末端に付加する。３′非翻訳領域中でcDNAを消化するSau961でpHLL702.3を消化し、生じた末端をＥ．コリＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片）と４つのdNTPを使ってフィルインする。このＤＮＡを次いで該cDNAのメチオニン開始コドンのすぐ３′側を１回切断するSacI で消化する。得られた0.9kb cDNA断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出し、そして連結反応に備える。５′アダプターとして２つのオリゴヌクレオチド927と928を合成する。このアダプターは、cDNAのMet開始コドンのすぐ５′にHindIIIとBamHI部位を付加するようにデザインされる。この２つのオリゴをＡＴＰとＴ₄ポリヌクレオチドキナーゼを使ってリン酸化し、互いにアニーリングし、そしてHindIIIとHincIIで消化し0.7％アガロースゲル上で精製したpUC1 9ベクター中の精製0.9kb cDNA配列に連結せしめる。得られたプラスミドは、ポータブル0.9kb BamHI断片としてＨ．ラヌギノーザのリパーゼcDNAを担持している。BamHI消化とアガロースゲル上での0.9kb cDNA断片の精製の後、その断片をB amHIで消化されリン酸化されたp775と連結せしめ、p960を作製する。p960中では、リパーゼcDNAがＡ．オリゼからのTAKAプロモーターとＡ．ニガーからのAMGターミネーターの転写調節下に置かれている。 pMHan37を調製するために、フミコーラ・ラヌギノーザのリパーゼ遣伝子のすぐ上流のＡ．オリゼTAKAプロモーターの５′非翻訳領域の60塩基対を、Ａ．ニデュランスのtpiA遺伝子（McKnight他，Cell 46：143-147，1986）からの対応領域により置換することにより、p960を変更する。非翻訳領域のすぐ外側にp960配列と相同である20塩基対により各端において隣接されたＡ．ニデュランスのtpiA遺伝子からの５′非翻訳領域を含む合成オリゴヌクレオチドを、TAKAプロモーター領域中にBssHII部位を含む別のプライマーと一緒にＰＣＲ反応に使用する。変異誘発プライマーはATG開始コドンの近くにBamHI部位を含むので、ＰＣＲ断片をBa mHIとBssHIIで消化し、そしてBssHIIで消化しBamHIで部分消化したp960中に再クローニングする。MHan37中のATGコドンの上流の200塩基をＤＮＡ配列分析により確認する。p960とpMHan37との配列の相違を下記に示す： BamHI部位を包含するプライマーの配列： 5. コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）ペルオキシダーゼ。コプリナス・シネレウスのペルオキシダーゼ遺伝子の単離および発現はWO 92/16634 中に記載されている。簡単に言えば、Boel他（EMBO J．3:1097-1102，1984）とC hirgwin他（Biochemistry18：5294-5299，1979）により記載された通りに最大ペルオキシダーゼ活性の時期に収集しホモジナイズしたコプリナス・シネレウス（IFO 8371）菌糸から全ＲＮＡを抽出する。AvivおよびLeder（PNAS USA 69: 14 08-1412，1972）により記載されたようなオリゴ（ｄＴ）−セルロース上での２度のアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを得る。製造業者の取扱説明書に従ってInvitrogenからのcDNA合成キットを使ってcDNAを合成する。コプリナス・シネレウスcDNAライブラリーからの約50,000のＥ．コリ形質転換体をWhatman 540濾紙に移す。Gergen他（Nucleic Acids Res．7:2115-2 135，1979）により記載されたようにコロニーを溶解させ固定化する。該フィルターを0.2×ＳＳＣ，0.1％ＳＤＳ中で³²Ｐ−標識430塩基対ペルオキシダーゼ特異的プローブとハイブリダイズさせる。フィルターのハイブリダイゼーションと洗浄を65℃で行い、次いで映像強化膜を使って24時間オートラジオグラフィーを行う。オートラジオグラフィー後、増加する温度でフィルターを洗浄し、次いで映像強化膜を使って24時間オートラジオグラフィーを行う。こうして、50以上の陽性クローンが同定される。ハイブリダイズしているコロニーから標準手順（Bi rnboimおよびDoly，Nucl．Acids Res．7:1513-1523，1979）によりMiniprepプラスミドＤＮＡを単離し、そしてSangerのジデオキシ法（Sanger他，PNAS USA 74: 5463-5467，1977）によりcDNA挿入断片のＤＮＡ配列を決定する。このペルオキシダーゼcDNA断片をHindIII／XhoIでの開裂によりベクターから切り出し、アガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出し、そして連結反応に備える。該cD NA断片をHindIII／XhoIで消化されたHD414中に連結せしめ、該cDNAがＡ．オリゼからのTAKAプロモーターとＡ．ニガーからのAMGターミネーターの転写調節下に置かれているpCipを作製する。pCiPから、ペルオキシダーゼ開始コドンのすぐ上流のSacI，KpnI，HindIII，PstI，SaIIおよびBamHI制限部位が削除されているプラスミドpJVi9を調製する。コプリナス・シネレウスのペルオキシダーゼをコードするcDNA配列は配列表の配列番号３と４に示される。 6. フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）クチナーゼ。クチナーゼ発現ベクターpCaHj427は、Ａ．オリゼのTAKA−アミラーゼプロモーターとＡ．ニガーのグルコアミラーゼターミネーター領域の転写調節下にフザリウム・ソラニ f．pi siクチナーゼコード領域（Soliday他，J．Bacteriol．171: 1942-1951，1989）を含有する（Christiansen他，図１，前掲）。これを上述のpToC90と共に使用してＡ．フェティダス株 NRRL 341，NRRL 357およびCBS 103.14を同時形質転換せしめる。 7. カンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）リパーゼＢ。発現ベクターpMT1335は、Ａ．オリゼのTAKA−アミラーゼプロモーターとＡ．ニガーのグルコアミラーゼターミネーター領域の転写調節下にカンジダ・アンタークティカのリパーゼＢ遺伝子を含有する（Christiansen他，前掲）。このベクターを上述のpToC90と共に使用してＡ．フェティダス株CBS 103.14，NRRL 356，NRRL 357 およびNRRL 341を同時形質転換せしめる。作製した発現ベクターの要約を表１に与える。 III．アスペルギルス宿主の形質転換例外を表記しない限り、試験した全ての株の形質転換において次の一般手順を使用する。 100mlのYPD培地（Sherman他，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harb or Laboratory，1981）に形質転換しようとする株の胞子を接種し、34℃で振盪しながら１〜２日間インキュベートする。ミラクロス(Miracloth)を通した濾過により菌糸を収集し、200mlの0.6M MgSO₄で洗浄する。菌糸を15mlの1.2M MgSO₄ ，10mM NaH₂PO₄，pH=5.8中に懸濁する。この懸濁液を氷上で冷却し、そ１mlの12mg／mlＢＳＡ（Sigma H25型）を加え、顕微鏡下で観察した時に試料中に多数のプロトプラストが見えるようになるまで穏やかに攪拌しながら37℃で1. 5〜2.5時間インキュベーションを続ける。この懸濁液をミラクロスを通して濾過し、濾液を無菌試験管に移し、その上に５mlの0.6Mソルビトール，100mM Tris-HCl，pH＝7.0を重層する。2500rpmで15分間遠心を行い、MgSO₄クッションの上部からプロトプラストを収集する。２容のＳＴＣ（1.2Mソルビトール，10mM Tris-HCl pH＝7.5，10mM CaCl₂）をプロトプラスト懸濁液に加え、混合物を1000×ｇで５分間遠心する。プロトプラストペレットを３mlのＳＴＣ中に再懸濁し、再びペレット化する。これを繰り返した後、プロトプラストを0.2〜１mlのＳＴＣに再懸濁する。 100μｌのプロトプラスト懸濁液を10μｌのＳＴＣ中の５〜25μｇの適当なＤＮＡと混合する。着目の構造遺伝子を含む発現ベクター（表１参照）と選択マーカーを含むプラスミドを使って各株を同時形質転換せしめる。プラスミドpToC90 とpToC186はＡ．ニデュランスamdS遺伝子を含み、形質転換および唯一の窒素源としてのアセトアミド上での増殖についての選択に使われる。プラスミドpJaL77とpJaL154は形質転換およびヒグロマイシンＢ耐性の選択に使われる。混合物を室温で25分間維持する。0.27mlの60％PEG 4000(BDH29576)，10mM CaC l₂および10mM Tris-HCl pH＝7.5を加え、注意深く２度混合し、最後に同じ溶液0 .85mlを加え、注意深く混合する。この混合物を室温で25分間維持し、2500×ｇで15分間遠心し、ペレットを２mlの1.2Mソルビトール中に再懸濁する。もう１回沈澱させた後、プロトプラストを適当な平板上に塗抹する。1.0Mショ糖，pH＝7. 0、窒素源としての10mMアセトアミド（amdSが選択マーカーである時）およびバックグラウンド増殖を阻害するための20mM CsClを含有する最少培地（Cove，Bio chem．Biophys．Acta113: 51-56，1966）上にプロトプラストを塗抹する。hygB が選択マーカーである時、培地は窒素源として10mM亜硝酸ナトリウムを使いそして150μg/mlのヒグロマイシンＢが存在する点で異なる。最終遠心段階、再懸濁および塗抹に代わるものとして、８mlのＳＴＣを加えてプロトプラストと混合し、３枚の選択用平板の各々に３mlを加え、次いで渦巻状に動かして平板全体に広げる。37℃で４〜７日間インキュベートした後、分生子を有するコロニーを取り、滅菌蒸留水に懸濁し、そして単一コロニーの選択のために塗抹する。この手順を繰り返し、２回目の再単離後の単一コロニーの胞子を限定された形質転換体として保存する。 IV．組換えタンパク質発現の評価上記手順の後、選択された株の個々の単離物を表１に記載の発現ベクターのうちの１つと前の実施例で言及した選択マーカーを含むプラスミドのうちの１つを使って同時形質転換させる。次いで各々の同時形質転換体を適当なアッセイにより試験して着目の遺伝子の発現を調べる。Ａ．リパーゼリパーゼ活性の同時形質転換体を、１ｌの蒸留水中、50g/lのマルトデキストリン，２g/lのMgSO₄・7H₂O，２g/lのKH₂PO₄，３g/lのK₂SO₄，４g/lのクエン酸，８g/lの酵母エキス，３g/lの(NH₄)₂SO₄，0.5mlの微量金属溶液，４mlの50％尿素溶液（別々に加圧滅菌したもの），pH6.0から成るM400Da培地中で培養し、そして５g/lの酵母エキスを水道水中に800ml作製する。加熱滅菌後、166mlの濾過滅菌済の１M尿素（10g/lの最終濃度を与える）と35.3mlの濾過滅菌済の1M NaNO₃（ 0.3％の最終濃度を与える）を加える。基質としてｐ−ニトロフェニルブチレート(pNB)を使って培養濾液中のリパーゼ活性を測定する。pNBの原液は、104.6μｌのpNBを５mlのDMSOに加えることにより調製する。ミクロタイタープレートの各ウエルに90μｌの50mM Tris，pH7を加える。各ウエルに10μｌの試料を加え、ミクロタイタープレートを約１分間振盪することにより混合する。アッセイの直前に、20μｌのpNB原液を970μｌの50 mM Tris緩衝液，pH7と混合する。市販のプレートリーダーを使ってリパーゼ活性についてアッセイする直前に、100μｌのpNB−Tris混合物を各試料ウエルに加え、３分間に渡り405nmで吸光度を測定する。アッセイは温度感受性であるので、各試料セットと共に内部標準を使用する。各試料について決定された傾きはリパーゼ活性と正比例する；アッセイの直線領域は約0.005〜５μｇリパーゼ／mlである。この型のアッセイにおいて、Ｈ．ラヌギノーザのリパーゼの比活性は約40 00LU/mgであると決定され、一方でカンジダのリパーゼＡの比活性は約400LU/mg である。Ｂ．キシラナーゼ全てのキシラナーゼ形質転換体は次の組成（g/lで）を有する培地中で増殖させる：マルトデキストリン，50；MgSO₄・7H₂O，2.0；KH₂PO₄，10.0；K₂SO₄，2.0 ；クエン酸，2.0；酵母エキス，10.0；AMG微量金属溶液，0.5ml；尿素2.0；pH 6 .0。全ての形質転換体は34℃で深部攪拌培養物として増殖させる。培養ブロス中のキシラナーゼ活性は、クエン酸塩−リン酸塩緩衝液，pH 6.5中に懸濁した0.2％AZCL−キシラン（Megazyme Co.，Australia）を使って測定する。培養液を通常は100倍希釈し、希釈した培養液10μｌを１mlの0.2％AZCL−キシラン基質と混合する。この混合物を42℃で30分間インキュベートする。反応混合物を５分毎によく混合する。インキュベーションの終わりに、10,000rpmでの５分間の遠心により未消化の基質を沈澱させる。基質から放出された青色色素を59 5nmでの吸光度により定量し、そして既知の活性を有する酵素調製物を使って作った標準曲線から培養ブロス中の酵素活性の量を計算する。同一条件下で調製した酵素標準物と比較してエンドキシラナーゼ単位(EXU)を決定する。Ｃ．セルラーゼセルラーゼ形質転換体をMY50培地（50g/lのマルトデキストリン，２g/lのMgSO₄ ・7H₂O，10g/lのKH₂PO₄，２g/lのK₂SO₄，２g/lのクエン酸，10g/lの酵母エキス，0.5mlの微量金属溶液，2.0ｇの尿素）中で深部培養物として34℃で増殖させる。セルラーゼ活性は、0.1Mクエン酸塩−リン酸塩緩衝液，pH6.5中に懸濁した0.2 ％AZCL−HE−セルロース（Megazyme）を基質として使って測定する。培養液を0. 1Mクエン酸塩緩衝液，pH6.5中に希釈し、希釈した培養液10μｌを１mlの0.2％AZ CL−HE−セルロースと混合する。この混合物を振盪しながら42℃で30分間インキュベートする。反応混合物を５分毎によく混合する。インキュベーション後、10,000rpmでの５分間の遠心により未消化の基質を沈澱させる。上清中の青色色素を595nmで分光光度的に定量し、そして既知のセルラーゼ標準物を使って作った標準曲線から酵素活性の量を決定する。同一条件下で調製した酵素標準物と比較してエンドセルラーゼ単位(ECU)を決定する。Ｄ．ペルオキシダーゼ CiPの同時形質転換体は、１ｌの蒸留水中、50g/lのマルトデキストリン，２g/ lのMgSO₄・7H₂O，２g/lのKH₂PO₄，３g/lのK₂SO₄，４g/lのクエン酸，８g/lの酵母エキス，３g/lの(NH₄)₂SO₄，0.5mlの微量金属溶液，４mlの50％尿素溶液（別々に加圧滅菌したもの），pH6.0から成るM400Da培地中で培養する。基質としてABTSを使ってまたは既知濃度の標準物に比較したロケット免疫電気泳動により、ペルオキシダーゼ発現をモニタリングする。免疫拡散法のために、ＴＭ緩衝液（1.3g/lのTris塩基，0.6g/lのマレイン酸，pH 7）中の１％アガロースを溶融し次いで55℃に冷却する。400μｌのCiPに対するウサギ抗血清を15mlのアガロースと混合し、10cm×10cmの平板上に塗抹しそして凝固させる。ＣＤＭ中で37℃で７日間増殖させたCiP形質転換体のＣＤＭ寒天（１g/lのK₂PO₄，30g/lのショ糖，0.3g/lのNaNO₃，0.05g/lのKCl，0.05g/lのMgSO₄・7H₂O，0.001g/lのFeS O₄・7H₂O，0.001g/lのZnSO₄・7H₂O，0.0005g/lのCuSO₄・5H₂O，20g/lのマルトデキストリン，15g/lのアガロース）培養試料を、寒天平板上に作った５mmの穴に適用する。タンパク質を48時間拡散させる。該平板をクーマシーブルーＲで染色してタンパク質−抗体沈澱帯を可視化する。標準溶液として、500，1000および2 000ペルオキシダーゼ単位（PODU）／mlの濃度で精製物質を使用する。１PODUは、標準条件下で１分あたり１μモルの過酸化水素の変換を触媒する酵素の量である。 ABTS〔２，２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート）〕法によりペルオキシダーゼを測定するために、２mlの２mM ABTS〔0.1Mリン酸塩緩衝液（10.63ｇのリン酸水素二ナトリウム二水和物p.a．M6580と5.49gのリン酸二水素カリウムp.a．M4873を脱イオン水中に溶かして１ｌにしたもの）中の0.110ｇのABTS，Boehringer Mannheim No．102946〕を30℃で10分間予熱する。これにガラス試験管中の10.6mM H₂O₂溶液（1.0ｇのして25mlにしたもの）と0.2mlの試料または標準物質（標準物質＝5.0mgのKem-En -Tec，grade１，No．4140Aをリン酸塩緩衝液に溶かして25mlに調整し、それを40 0倍希釈したもの）を加える。反応を30℃で３分間行う。試料の吸光度をMilli Q 脱イオン水に対して418nmで測定し、３分間監視する。ペルオキシダーゼ活性の最良の反映は吸光度差：ΔＡ＝Ａ_{(75 sec)}−Ａ_{(15 sec)}により与えられる。吸光度差は試料では0.05〜0.1 PODU／mlに相当する0.15〜0.30の間にあるだろう。Ｅ．クチナーゼ選択された形質転換体を、トリブチリン寒天（13％マルトデキストリン，0.3 ％ MgSO₄・7H₂O，0.5％ KH₂PO₄，0.4％クエン酸，0.6％ K₂SO₄，0.5％酵母エキス，１％トリブチリン，１％尿素，0.3％ NaNO₃，0.5mlの微量金属，２％寒天， pH4.5）上で、トリブチリンの透明化により検出される細胞外クチナーゼを生産する能力についてスクリーニングする。 37℃でM400Da培地（上述）を使った振盪フラスコ培養において最大の透明帯を生じる株を評価する。細胞外クチナーゼ活性を上記と同様にｐ−ニトロフェニルブチレートを使って測定する。全形質転換体の中で、最大のクチナーゼ生産株は、CBS 103.14／CaHj427.1と命名されたＡ．フェティダスCBS 103.14形質転換体である。３日間の振盪培養期間に渡り、この形質転換体はＡ．オリゼ対照形質転換体Qu-1-1により生産される量とほぼ等しいレベルで細胞外クチナーゼを生産する。小規模（２ｌ）の醗酵では、この形質転換体は約１ｇ／ｌの細胞外クチナーゼを生産する。 VI．結果および考察表２は、本発明の代用宿主により生産される様々な異種真菌酵素の発現レベルを要約する。全ての株が少なくとも１つの着目の遺伝子の発現に成功したことがこの表から明らかである。幾つかの場合には、新規宿主株が意外にも高レベルの酵素を与える。例えば、Ａ．フェティダスの少なくとも１つの株が振盪フラスコ培養において驚くほど高いレベルのＨＬＬを生産し（約１ｇ／ｌ）、それらの種が多量の異種タンパク質を発現できることを証明する。実際、それらの形質転換体により生産されるＨＬＬの生産レベルは、Ａ．オリゼの最良の一次形質転換体（例えばHL-23）と同じ位かまたはそれより高いと思われる。同様に、２つの株が同じようなリパーゼＢの高レベル発現を示す。Ａ．フェティダスはまた、Ａ．オリゼに比べてキシラナーゼの生産のための優れた宿主であることがわかる。この酵素についての振盪フラスコ収率は、最良のＡ．オリゼ形質転換体に見られるレベルの約２倍である。与えられたデータからわかるように、Ａ．フェティダス種の多数の株が様々な異種タンパク質を相当量生産することができ、従って標準的なＡ．ニガーおよびＡ．オリゼ宿主系の代替物として有用であると確立され、またそれらの既知宿主の使用よりも好ましい場合がある。

【手続補正書】【提出日】１９９６年７月２４日【補正内容】請求の範囲１．プロモーターに作用可能に連結された異種酵素をコードする核酸配列を含んで成る、アスペルギルス・フェティダス（Aspergillus foetidus）宿主細胞。２．前記酵素がカタラーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α− グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼから成る群より選択される、請求項１の宿主細胞。３．前記プロモーターが真菌プロモーターである、請求項１の宿主細胞。４．前記タンパク質が真菌酵素である、請求項１の宿主細胞。５．選択マーカーを更に含んで成る、請求項１の宿主細胞。６．前記マーカーがargB，trpC，pyrG，amdSおよびhygBから成る群より選択される、請求項５の宿主細胞。７．前記プロモーターが、Ａ．オリゼ（A．oryzae）のTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（A．nlger）のグルコアミラーゼ、Ａ．ニガー（A．niger）の中性α −アミラーゼ、Ａ．ニガーの（A．niger）酸安定性α−アミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）のリパーゼからのプロモーターおよび生来のＡ．フェティダス（A．foetidus）プロモーターから成る群より選択される、請求項３の宿主細胞。８．真菌プロモーターに作用可能に連結された異種真菌酵素をコードする核酸配列および選択マーカーを含んで成る、アスペルギルス・フェティダス（Asperg illus foetidus ）宿主細胞。９．前記酵素がカタラーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼおよびその他のタンパク質分解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよびその他のペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼ、並びにデオキシリボヌクレアーゼから成る群より選択される、請求項８の細胞。 10．リパーゼ、キシラナーゼおよびセルラーゼから成る群より選択された真菌酵素を含んで成る、請求項９の宿主細胞。 11．前記プロモーターが、Ａ．オリゼ（A．oryzae）のTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（A．niger）のグルコアミラーゼ、Ａ．ニガー（A．niger）の中性α −アミラーゼ、Ａ．ニガーの（A．niger）酸安定性α−アミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）のリパーゼからのプロモーターおよび生来のＡ．フェティダス（A．foetidus）プロモーターから成る群より選択される、請求項８の宿主細胞。 12．前記選択マーカーが、argB，trpC，pyrG，amdSおよびhygBから成る群より選択される、請求項８の宿主細胞。 13．TAKA−アミラーゼプロモーターに作用可能に連結された真菌リパーゼをコードする核酸配列を含んで成り、そしてamdSマーカーを更に含んで成る、請求項８の宿主細胞。 14．TAKA−アミラーゼプロモーターまたはAMGプロモーターに作用可能に連結された真菌キシラナーゼをコードする核酸配列を含んで成り、そしてamdSまたは hygBマーカーを更に含んで成る、請求項８の宿主細胞。 15．着目の酵素の生産方法であって、プロモーターに作用可能に連結された異種タンパク質をコードする核酸配列を含んで成るアスペルギルス・フェティダス宿主細胞を、該タンパク質の発現を可能にする条件下で培養し、そして培養物から該タンパク質を回収することを含んで成る方法。 16．前記タンパク質が真核酵素である、請求項15の方法。 17．前記プロモーターが真菌プロモーターである、請求項15の方法。 18．前記タンパク質が真菌酵素である、請求項16の方法。 19．前記酵素がカタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼおよび他のタンパク質分解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼ、並びにデオキシリボヌクレアーゼから成る群より選択される、請求項16の方法。 20．選択マーカーを更に含んで成る、請求項15の方法。 21．前記マーカーがargB，trpC，pyrG，amdSおよびhygBから成る群より選択される、請求項20の方法。 22．前記プロモーターが、Ａ．オリゼのTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ、Ａ．ニガーの中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸安定性α−アミラーゼおよびリゾムーコル・ミーヘイのリパーゼからのプロモーターから成る群より選択される、請求項15の方法。 23．プロモーターに作用可能に連結された異種酵素をコードする組換え核酸配列を含んで成る、アスペルギルス・フェティダス宿主細胞。 24．着目の酵素の生産方法であって、プロモーターに作用可能に連結された異種酵素をコードする組換え核酸配列を含んで成るアスペルギルス・フェティダス宿主細胞を、該酵素の発現を可能にする条件下で培養し、そして培養物から該酵素を回収することを含んで成る方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:66） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者高木忍アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，コーウェルブールバード＃128 1880 (72)発明者ブーミナサン，カルッパンチェティアアメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，ハンボルトアベニュ 2233

Claims

【特許請求の範囲】１．プロモーターに作用可能に連結された異種酵素をコードする核酸配列を含んで成る、アスペルギルス・フェティダス（Aspergillus foetidus）宿主細胞。２．前記酵素がカタラーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α− グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼから成る群より選択される、請求項１の宿主細胞。３．前記プロモーターが真菌プロモーターである、請求項１の宿主細胞。４．前記タンパク質が真菌酵素である、請求項１の宿主細胞。５．選択マーカーを更に含んで成る、請求項１の宿主細胞。６．前記マーカーがargB，trpC，pyrG，amdSおよびhygBから成る群より選択される、請求項５の宿主細胞。７．前記プロモーターが、Ａ．オリゼ（A. oryzae）のTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（A．niger）のグルコアミラーゼ、Ａ．ニガー（A．niger）の中性α −アミラーゼ、Ａ．ニガーの（A．niger）酸安定性α−アミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）のリパーゼからのプロモーターおよび生来のＡ．フェティダス（A. foetidus）プロモーターから成る群より選択される、請求項３の宿主細胞。８．真菌プロモーターに作用可能に連結された異種真菌酵素をコードする核酸配列および選択マーカーを含んで成る、アスペルギルス・フェティダス（Asperg illus foetidus ）宿主細胞。９．前記酵素がカタラーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α− グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼから成る群より選択される、請求項８の細胞。 10．リパーゼ、キシラナーゼおよびセルラーゼから成る群より選択された真菌酵素を含んで成る、請求項９の宿主細胞。 11．前記プロモーターが、Ａ．オリゼ（A. oryzae）のTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（A．niger）のグルコアミラーゼ、Ａ．ニガー（A．niger）の中性α −アミラーゼ、Ａ．ニガーの（A．niger）酸安定性α−アミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）のリパーゼからのプロモーターおよび生来のＡ．フェティダス（A. foetidus）プロモーターから成る群より選択される、請求項８の宿主細胞。 12．前記選択マーカーが、argB，trpC，pyrG，amdSおよびhygBから成る群より選択される、請求項８の宿主細胞。 13．TAKA−アミラーゼプロモーターに作用可能に連結された真菌リパーゼをコードする核酸配列を含んで成り、そしてamdSマーカーを更に含んで成る、請求項８の宿主細胞。 14．TAKA−アミラーゼプロモーターまたはAMGプロモーターに作用可能に連結された真菌キシラナーゼをコードする核酸配列を含んで成り、そしてamdSまたは hygBマーカーを更に含んで成る、請求項８の宿主細胞。 15．着目の酵素の生産方法であって、プロモーターに作用可能に連結された異種タンパク質をコードする核酸配列を含んで成るアスペルギルス・フェティダス宿主細胞を、該タンパク質の発現を可能にする条件下で培養し、そして培養物から該タンパク質を回収することを含んで成る方法。 16．前記タンパク質が真核酵素である、請求項15の方法。 17．前記プロモーターが真菌プロモーターである、請求項15の方法。 18．前記タンパク質が真菌酵素である、請求項16の方法。 19．前記酵素がカタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼおよび他のタンパク質分解酵素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼおよび他のペクチン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、キチナーゼ、並びにデオキシリボヌクレアーゼから成る群より選択される、請求項16の方法。 20．選択マーカーを更に含んで成る、請求項15の方法。 21．前記マーカーがargB，trpC，pyrG，amdSおよびhygBから成る群より選択される、請求項20の方法。 22．前記プロモーターが、Ａ．オリゼのTAKAアミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ、Ａ．ニガーの中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸安定性α−アミラーゼおよびリゾムーコル・ミーヘイのリパーゼからのプロモーターから成る群より選択される、請求項15の方法。 23．プロモーターに作用可能に連結された異種酵素をコードする組換え核酸配列を含んで成る、アスペルギルス・フェティダス宿主細胞。 24．着目の酵素の生産方法であって、プロモーターに作用可能に連結された異種酵素をコードする組換え核酸配列を含んで成るアスペルギルス・フェティダス宿主細胞を、該酵素の発現を可能にする条件下で培養し、そして培養物から該酵素を回収することを含んで成る方法。