CN105816430B - 一种具有抗肿瘤作用三叶青多糖颗粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有抗肿瘤作用三叶青多糖颗粒的制备方法。该制剂以三叶青多糖为活性成分，辅以其它药用辅料包括缓释材料，填充剂，粘合剂，润滑剂等。本发明利用各种移植瘤小鼠模型及体外淋巴细胞增殖实验评价三叶青多糖颗粒体内外抗肿瘤及增强免疫方面的良好效果，且与化疗药比较，毒副作用小，在抗肿瘤方面具有良好的应用前景。本发明三叶青多糖颗粒剂使用方便，可直接吞服，也可冲入水中饮服，其飞散性、附着性、吸湿性等均较少，药物含量稳定。

Description

一种具有抗肿瘤作用三叶青多糖颗粒的制备方法
技术领域
本发明属于医药科技领域，具体涉及一种应用在抗肿瘤中的三叶青多糖颗粒的制备方法。
背景技术
癌症是一种世界性的疾病，已成为威胁人类生命和健康的首要敌人，其发病率也在逐年上升。世界卫生组织(WHO)发布研究报告显示，仅仅2012年就有1400万人被诊断患癌，并预测2035年全球新癌症病例将增加近一半，癌症的发病率与死亡率呈持续上升趋势。
癌症的治疗中，药物治疗是一个很重要的环节，有效的抗癌药物的使用，可以帮助患者获得更长的生存时间，拥有活下来的希望。化疗是临床肿瘤常规治疗手段，但化疗药物作用缺乏选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，对机体也带来损伤，特别是对免疫功能有很大的影响，常常伴随着不同程度的毒副作用，以损害造血系统和胃肠道系统为主，有些药物对心脏、肝脏、肾脏等也具有明显的毒性。开发疗效确切、毒副作用小的新型抗癌药物，以及缓解化疗药毒副作用的辅助药物，具有较好的研究及开发前景。
三叶青学名为三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)，是我国特有的葡萄科崖爬藤属珍稀药用植物，主要分布于浙江、广西、江西等少数省份，以地下块根或全草入药。具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效，主治毒蛇咬伤、扁桃体炎、淋巴结结核、跌打损伤、小儿高热惊厥等疾病。现代科学研究显示，三叶青具有解热抗炎、抗肿瘤、抗病毒、保肝、调节免疫等活性，黄酮、多酚和多糖为三叶青中主要的生理活性物质。尽管已有文献报道三叶青提取物具有良好的抗肿瘤作用，但有关三叶青多糖抗肿瘤方面的研究尚未见有任何报道。且目前市场上，三叶青相关的中成药制剂鲜少，含三叶青多糖的相关剂型尚未有发现。
发明内容
本发明的目的在于为了解决现有三叶青相关的中成药制剂鲜少的缺陷而提供一种应用在抗肿瘤中的三叶青多糖颗粒的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种具有抗肿瘤作用三叶青多糖颗粒的制备方法，包括如下步骤：
1)取三叶青全草35-65℃烘箱干燥，干燥至恒重后粉碎，称取相应所需的量，并按1:10-30的物料比，加双蒸水回流提取1-5次，过滤；合并滤液、减压浓缩，并采用浓缩后3倍质量的90％乙醇静置过夜，得沉淀物；2-3次水提醇沉后，沉淀用无水乙醇洗涤，并采用真空冷 冻干燥技术得到三叶青多糖粉末；
2)取步骤1)得到的三叶青多糖粉末与缓释材料，填充剂混合均匀后过100目筛，加入粘合剂，30-50℃干燥1-10小时，然后过20目筛整粒，加入润滑剂，混匀，即得三叶青多糖颗粒制剂。
在本技术方案中，步骤(1)所用的水提醇沉条件通过单因素试验及正交试验得到最佳提取工艺。所采用真空冷冻干燥法制备三叶青多糖，避免了高温加热对多糖活性的破坏，且所得固体产品易粉碎溶解。
本发明通过各种移植瘤小鼠模型及体外实验显示，该三叶青多糖具有良好的抗肿瘤及增强免疫效果，涉及的肿瘤包括：肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌等，在医药及保健品领域具有广泛的应用前景。
作为优选，三叶青多糖颗粒制剂原料按重量份计分别为：三叶青多糖100-300份、缓释材料150-300份、填充剂100-250份、粘合剂10-50份、润滑剂1-5份。
作为优选，步骤2)中缓释材料选自羟丙甲基纤维素、乙基纤维素素、醋酸纤维素、乙基纤维素水分散体中的一种或多种混合物。
作为优选，步骤2)中填充剂选自微晶纤维素、蔗糖、乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、木糖醇、糊精、β-环糊精、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙中的一种或多种混合物。
作为优选，步骤2)中粘合剂选自1-5％的乙基纤维素的乙醇溶液、2-5％的聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液中的一种。
作为优选，步骤2)中润滑剂选自微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、超微粉碎的聚乙二醇中的一种或多种混合物。
本发明三叶青多糖颗粒抗肿瘤及免疫增强作用的实验论证：
三叶青多糖颗粒对H22肝癌荷瘤小鼠的抑瘤作用：
(1)实验动物：ICR雄性小鼠，体重18-22g。
(2)药物剂量及给药方式：将实施1方案制备的三叶青多糖颗粒作为供试药物，取60只小鼠，随机分为6组，除正常组外，其余各组均于小鼠右腋皮下接种H22腹水瘤。接种后，三叶青多糖颗粒低、中、高剂量组分别按2.5、5、10g/kg剂量每天灌胃，连续14d，空白组及荷瘤对照组以等体积蒸馏水灌胃，阳性对照环磷酰胺组隔天腹腔注射给药。
(3)评价方法：给药前后对比各组小鼠体重变化。末次给药后，各组小鼠均摘眼球取血测定血常规，脱颈椎处死，解剖并剥离瘤体，摘取脾、胸腺、肝脏等脏器称重，并计算各脏器指数，以单因素方差分析进行数据处理。通过对比各组瘤体的重量评价抗癌的效果。体重是衡量药物毒性作用的综合性指标之一，环磷酰胺能抑瘤的同时降低小鼠的体重，三叶青多糖颗粒在抑瘤的同时体重稳定增加说明多糖在抑制肿瘤的同时对小鼠没有明显副作用。环磷酰胺最大的副作用是白细胞降低、抑制免疫，通过测定血常规和脾、胸腺、肝脏指数，将三叶青多糖颗粒与环磷酰胺比较，其在抑瘤的同时具有免疫增强作用。
三叶青多糖颗粒对人肺癌A549、人胃癌SGC-37901、人结肠癌HT-29裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用：
(1)实验动物：雄性裸鼠，体重18-22g。
(2)药物剂量及给药方式：采用裸鼠建立人肺癌A549、人胃癌SGC-37901、人肠癌HT-29实体瘤模型，将实施1方案制备的三叶青多糖颗粒作为供试药物，取50只裸鼠，随机分为5组，即模型组、阳性组、三叶青多糖颗粒低、中、高剂量组。造模后，分别按相应剂量给药，并持续一定时间。
(3)评价方法：停药后，比较治疗前后各组小鼠体重变化，断颈椎处死小鼠，剥瘤称重，计算肿瘤生长抑制率。通过对比各组瘤体的重量及抑制率评价抗癌的效果。
三叶青多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖作用：
(1)将小鼠脱颈椎处死，分离脾脏，制备脾淋巴细胞悬液。
(2)体外给予三叶青多糖观察三叶青多糖单独对淋巴细胞增殖的影响。采用LPS及ConA诱导淋巴细胞增殖观察三叶青多糖协同LPS及ConA对脾淋巴细胞增殖的影响。
(3)评价方法：采用MTS法，在波长490nm测定吸光度评价三叶青多糖对淋巴细胞的增殖作用。吸光度增加说明三叶青多糖能够明显刺激淋巴细胞的增殖，并能协同LPS及ConA共同诱导淋巴细胞增殖，具有免疫促进作用。
本发明的优势在于：本发明从三叶青中提取分离得到三叶青多糖，并将其制作成三叶青多糖颗粒，药物稳定性好，使用方便，可直接吞服，也可冲水服用，而且工艺简单可行，成本低，易于工业化生产。生产的三叶青多糖颗粒具有明显的抗肿瘤作用，对于肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌等均具有显著抑制肿瘤生长的作用、同时毒副作用与化疗药相比更小，并有增强免疫作用，可开发成为新型的抗癌药物及辅助用药。
附图说明
图1是本发明三叶青多糖对小鼠淋巴细胞增殖的影响对比图。
图中，1、三叶青多糖；2、LPS+三叶青多糖；3、ConA+三叶青多糖。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
三叶青多糖的制备
取三叶青地上部分或块根35-65℃烘箱干燥，干燥至恒重后粉碎，称取相应所需的量，放入圆底烧瓶中，并按物料比1：15，加双蒸水回流提取3次，每次30min。过滤后合并3次提取液，减压蒸馏浓缩，加入3倍浓缩液质量的95％乙醇，水提醇沉3次，4℃静置过夜后，4200rpm，高速离心15min，得沉淀物。沉淀物，用无水乙醇洗涤2次，采用真空冷冻干燥得三叶青多糖粉末。
实施例2
三叶青多糖颗粒的制备
取实施例1制备的100g三叶青多糖粉末，200g羟丙甲基纤维素，150g微晶纤维素，混合均匀后过100目筛，加入20g 1-5％的乙基纤维素的乙醇溶液，50℃干燥5小时，然后过20目筛整粒，加入4g微粉硅胶，混匀，即得三叶青多糖颗粒制剂。
实施例3
三叶青多糖颗粒的制备
取实施例1制备的100g三叶青多糖，200g乙基纤维素，150g乳糖，混合均匀后过100目筛，加入20g 1-5％的乙基纤维素的乙醇溶液，50℃干燥5小时，然后过20目筛整粒，加入4g硬脂酸镁，混匀，即得三叶青多糖颗粒制剂。
实施例4三叶青多糖颗粒的制备
取实施例1制备的100g三叶青多糖，200g醋酸纤维素，150g甘露醇，混合均匀后过100目筛，加入20g 1-5％的聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液，50℃干燥5小时，然后过20目筛整粒，加入4g滑石粉，混匀，即得三叶青多糖颗粒制剂。
实施例5
三叶青多糖颗粒的制备
取实施例1制备的100g三叶青多糖，200g乙基纤维素水分散体，150gβ-环糊精，混合均匀后过100目筛，加入20g 1-5％的聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液，50℃干燥5小时，然后过20目筛整粒，加入4g超微粉碎的聚乙二醇，混匀，即得三叶青多糖颗粒制剂。
实施例6
三叶青多糖颗粒的制备
取实施例1制备的100g三叶青多糖，200g缓释材料(其中羟丙甲基纤维素100g，醋酸纤维素100g)，150g填充剂(其中蔗糖100g，淀粉50g)，混合均匀后过100目筛，加入20g 5-15％的聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液，50℃干燥5小时，然后过20目筛整粒，加入4g润滑剂(其中微粉硅胶2g，超微粉碎的聚乙二醇2g)，混匀，即得三叶青多糖颗粒制剂。
实施例7
三叶青多糖颗粒对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用
实验方法：
60只小鼠，根据体重随机分为6组，每组10只，即空白组、模型组、环磷酰胺组、三叶青多糖颗粒低、中、高剂量组。正常组小鼠正常饲养，不做处理，无肿瘤负荷。余下的各组小鼠，将H22腹水瘤小鼠乳白色浓稠腹水，用生理盐水稀释至1*107个/mL且活细胞大于95％，以0.2mL接种于小鼠右腋皮下。于造模后当天各试验组开始用药。除阳性组隔天腹腔注射CTX50mg/kg外，其余各组均每天灌胃给药，空白组与模型组ig蒸馏水，各给药组ig相应浓度的药物。给药14d后，各组小鼠均摘眼球取血，加入抗凝管中测定血常规。处死后取肿瘤块，脾脏、胸腺、肝脏并称重，计算抑瘤率及脾、胸腺、肝脏指数。抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重*100。
三叶青多糖颗粒对H22荷瘤小鼠体重增长的影响：
给药前后，模型组H22荷瘤小鼠体重增长缓慢，与空白组比较差异显著(P<0.01)。环磷酰胺给药组加重了荷瘤小鼠的恶病体质，导致其体重出现了负增长，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)。而三叶青多糖颗粒低、中、高各给药组荷瘤小鼠体重均正常增长，各个剂量组增重均明显高于模型组(P<0.01)。(见表1)。
表1：三叶青多糖颗粒对H22荷瘤小鼠体重增长的影响
组别 N 剂量 给药前 给药结束后 增重(g)
空白组 9 —— 24.69±1.04 29.40±1.18 4.71±1.25
模型组 6 —— 25.20±2.41 25.69±2.13<sup>*</sup> 0.49±1.87<sup>**</sup>
环磷酰胺组 8 50mg/kg 25.94±1.84 24.80±1.94<sup>△</sup> -1.14±1.13<sup>△</sup>
多糖颗粒低剂量组 7 2.5g/kg 25.03±2.21 29.34±2.96<sup>△</sup> 4.31±1.57<sup>△△</sup>
多糖颗粒中剂量组 7 5g/kg 24.11±1.39 29.01±1.98<sup>△</sup> 4.90±1.56<sup>△△</sup>
多糖颗粒高剂量组 7 10g/kg 25.03±1.14 30.61±2.14<sup>△</sup> 5.58±2.35<sup>△△△</sup>
注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001。
三叶青多糖颗粒对H22荷瘤小鼠抑瘤率的影响：
接种肿瘤第4天后，模型组小鼠的腋下开始隆起，且实体瘤生长迅速。而环磷酰胺组和三叶青多糖颗粒高剂量组瘤块重量均明显低于荷瘤对照组(P<0.001，P<0.05)。其中三叶青多糖 颗粒低、中、高剂量组抑瘤率分别为21.33％、35.75％和54.11％，呈现剂量依赖性，提示三叶青多糖颗粒对H22荷瘤小鼠肿瘤的生长具有明显的抑制作用(见表2)。
表2：三叶青多糖颗粒对H22荷瘤小鼠抑瘤率的影响
组别 N 剂量 瘤重 抑瘤率(％)
空白组 9 —— —— ——
模型组 6 —— 3.158±1.472 ——
环磷酰胺组 8 50mg/kg 0.209±0.344<sup>***</sup> 93.39
多糖颗粒低剂量组 7 2.5g/kg 2.347±2.127 21.33
多糖颗粒中剂量组 7 5g/kg 2.029±1.332 35.75
多糖颗粒高剂量组 7 10g/kg 1.449±1.482<sup>*</sup> 54.11
与模型组比较，*P<0.05，***P<0.001。
三叶青多糖颗粒对H22荷瘤小鼠脏器指数的影响：
实验结果显示，H22荷瘤小鼠组脾脏出现过度增大，脾指数与空白组比较具有极显著性差异(P<0.001)。环磷酰胺组脾、胸腺、肝脏指数与模型组比较均出现了显著降低，其中脾和胸腺指数极显著(P<0.001，P<0.01)。三叶青多糖颗粒低、中、高剂量组能抑制荷瘤小鼠脾脏的异常增大，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)。同时与环磷酰胺组比较，又不导致免疫器官的过度抑制，说明三叶青多糖颗粒对小鼠荷瘤所引起的免疫器官有保护和改善作用(见表3)。
表3：三叶青多糖颗粒对H22荷瘤小鼠脏器指数的影响
组别 N 剂量 脾指数(g/g) 胸腺指数(g/g) 肝脏指数(g/g)
空白组 9 —— 0.25±0.071 0.403±0.098 4.438±0.430
模型组 6 —— 0.768±0.234<sup>***</sup> 0.358±0.069 4.870±0.886
环磷酰胺组 8 50mg/kg 0.191±0.079<sup>△△△</sup> 0.178±0.171<sup>△△</sup> 4.242±0.637<sup>△</sup>
多糖颗粒低剂量组 7 2.5g/kg 0.530±0.177<sup>△</sup> 0.350±0.085 4.417±0.411
多糖颗粒中剂量组 7 5g/kg 0.528±0.087<sup>△</sup> 0.277±0.144 4.743±0.769
多糖颗粒高剂量组 7 10g/kg 0.373±0.300<sup>△△△</sup> 0.285±0.147 4.283±0.597
与空白组比较，***P<0.001；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001。
三叶青多糖颗粒对H22荷瘤小鼠血常规的影响：
对各组小鼠血常规进行检测后显示，模型组H22荷瘤小鼠白细胞较正常组明显升高(P<0.05)，红细胞显著下降(P<0.001)。环磷酰胺组白细胞出现极显著降低，与模型组比较具有极显著性差异(P<0.001)。三叶青多糖颗粒低、中、高各给药组白细胞未出现显著降低，与模型组比较无显著性差异(见表4)。
表4：三叶青多糖颗粒对H22荷瘤小鼠血常规的影响
与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，△P<0.05，△△△P<0.001。
实施例8
三叶青多糖颗粒对人肺癌A549裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用：
实验方法：
取对数生长期的肿瘤细胞，在无菌条件下制备成1*107/mL细胞悬液，以0.2mL接种于小鼠右侧腋窝皮下。待7d后，小鼠均出现直径>5mm的皮下结节，根据结节大小，将移植瘤模型小鼠随机分为5组，每组10只。即模型对照组、环磷酰胺组、三叶青多糖颗粒低、中、高剂量组(2.5、5、10g/kg)。除环磷酰胺组隔天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg外，其余各组均每天灌胃给药，模型组ig蒸馏水，各给药组ig相应浓度的药物。给药18d后，记录给药前后各组小鼠的体重。末次给药后，小鼠脱颈椎处死，取肿瘤块称重，计算抑瘤率。抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重*100。
结果显示，环磷酰胺组对人肺癌A549裸鼠移植瘤的抑瘤率为70.94％，三叶青多糖颗粒低、中、高剂量组抑瘤率分别为20.77％、37.79％及43.80％，与模型组比较，中、高剂量组具有显著性差异(P<0.05)。但给药后，环磷酰胺组毒性比较大，小鼠体重与模型组比较显著下降(P<0.01)。而三叶青多糖颗粒各剂量组体重稳定上升，与环磷酰胺组比较差异极显著(P<0.001)(见表5)。
表5：三叶青多糖颗粒对人肺癌A549裸鼠异种移植肿瘤的影响
与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与环磷酰胺组比较，△△△P<0.001。
实施例9
三叶青多糖颗粒对人胃癌SGC-37901裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用：
实验方法：
取对数生长期的肿瘤细胞，在无菌条件下制备成1*107/mL细胞悬液，以0.2mL接种于小鼠右侧腋窝皮下。待7d后，小鼠均出现直径>5mm的皮下结节，根据结节大小，将移植瘤模型小鼠随机分为5组，每组10只。即模型对照组、环磷酰胺组、三叶青多糖颗粒低、中、高剂量组(2.5、5、10g/kg)。除环磷酰胺组隔天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg外，其余各组均每天灌胃给药，模型组ig蒸馏水，各给药组ig相应浓度的药物。给药18d后，记录给药前后各组小鼠的体重。末次给药后，小鼠脱颈椎处死，取肿瘤块称重，计算抑瘤率。抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重*100。
结果显示，环磷酰胺组对人胃癌SGC-37901裸鼠移植瘤的抑瘤率为73.35％，三叶青多糖颗粒低、中、高剂量组抑瘤率分别为27.35％、41.23％及48.97％，与模型组比较，中、高剂量组具有显著性差异(P<0.05)。但给药后，环磷酰胺组毒性比较大，小鼠体重与模型组比较显著下降(P<0.01)。而三叶青多糖颗粒各剂量组体重稳定上升，与环磷酰胺组比较差异极显著(P<0.001)(见表6)。
表6：三叶青多糖颗粒对人胃癌SGC-37901裸鼠异种移植肿瘤的影响
与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与环磷酰胺组比较，△△△P<0.001。
实施例10
三叶青多糖颗粒对人结肠癌HT-29裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用：
实验方法：
取对数生长期的肿瘤细胞，在无菌条件下制备成1*107/mL细胞悬液，以0.2mL接种于小鼠右侧腋窝皮下。待7d后，小鼠均出现直径>5mm的皮下结节，根据结节大小，将移植瘤模型小鼠随机分为5组，每组10只。即模型对照组、环磷酰胺组、三叶青多糖颗粒低、中、高剂量组(2.5、5、10g/kg)。除环磷酰胺组隔天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg外，其余各组均每天灌胃给药，模型组ig蒸馏水，各给药组ig相应浓度的药物。给药18d后，记录给药前后各组小鼠的体重。末次给药后，小鼠脱颈椎处死，取肿瘤块称重，计算抑瘤率。抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重*100。
结果显示，环磷酰胺组对人结肠癌HT-29裸鼠移植瘤的抑瘤率为73.97％，三叶青多糖颗粒低、中、高剂量组抑瘤率分别为22.59％、32.55％及61.26％，与模型组比较，中、高剂量组具有显著性差异(P<0.01)。但给药后，环磷酰胺组毒性比较大，小鼠体重与模型组比较显著下降(P<0.05)。而三叶青多糖颗粒各剂量组体重稳定上升，与环磷酰胺组比较差异极显著(P<0.001)(见表7)。
表7：三叶青多糖颗粒对人结肠癌HT-29裸鼠异种移植肿瘤的影响
与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与环磷酰胺组比较，△△△P<0.001。
实施例11
三叶青多糖对淋巴细胞增殖作用的影响：
实验方法：
颈椎脱臼法处死小鼠，75％的乙醇浸泡5min，取出脾后用PBS清洗脾，无菌玻璃棒研磨脾并挤压过孔径为0.074mm筛网(200目)，适量PBS冲洗，收集细胞悬液，4℃1500rpm/min离心3min，弃上清液后加入3-5倍红细胞裂解液，静置5min，离心，弃上清液。沉淀应为白色，如有红色，继续加入裂解液，重复上述离心操作。RPMI 1640培养液重复洗涤2次，RPMI1640培养液(含100mL/L血清)重悬细胞，台盼蓝染色，镜检计数，RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度至5*106/mL。
按上法方法制备脾淋巴细胞悬液，分为3种，一种为未活化脾淋巴细胞组、T淋巴细胞组(加入诱导剂Con A，终浓度为5mg/L)，B淋巴细胞组(加入诱导剂LPS，终浓度为10mg/L)。接种96孔板，每孔100μL。试验组设计如下：三叶青多糖组分别设置为0、50、100、200、400μg/mL，ConA组设置为三叶青多糖终质量浓度分别为0、50、100、200、400μg/mL，LPS组设置为三叶青多糖终质量浓度分别为0、50、100、200、400μg/mL。每组设6个复孔。加样后置于37℃、50mL/L CO2培养箱中培养48h后，加入40μL MTS，继续培养2h，静置10min。酶标仪测D490nm值。
结果显示，在三叶青多糖刺激小鼠脾淋巴细胞48小时后，其100、200、400μg/mL三个剂量组D490nm值均显著增加，并呈量效关系。三叶青多糖协同LPS对B淋巴细胞增殖 的结果显示，与LPS协同后，在多糖200、400μg/mL剂量组显著高于LPS单独作用组(P<0.05)。分别与ConA协同后，三叶青100、200、400μg/mL剂量组均可以明显促进T淋巴细胞的生长，吸光值均高于ConA单独作用组(P<0.05)(见表8，图1)。
表8：三叶青多糖对小鼠脾淋巴细胞的影响
参见图1，与空白组比较，*P<0.05，***P<0.001；与LPS组比较，△P<0.05；与ConA组比较， △P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001。
根据三叶青多糖颗粒抗肿瘤、增强免疫实验结果来看，三叶青多糖颗粒具有良好的抗肿瘤及增强免疫的作用，实验结果确切可靠。其可以开发成为新型抗癌及辅助治疗的中药制剂，并作进一步推广使用。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (1)

1.一种具有抗肿瘤作用三叶青多糖颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）取三叶青全草35-65℃烘箱干燥，干燥至恒重后粉碎，称取相应所需的量，并按1:10-30的物料比，加双蒸水回流提取1-5次，过滤；合并滤液、减压浓缩，并采用浓缩后3倍质量的90%乙醇静置过夜，得沉淀物；2-3次水提醇沉后，沉淀用无水乙醇洗涤，并采用真空冷冻干燥技术得到三叶青多糖粉末；
2）取步骤1）得到的100g三叶青多糖粉末，200g醋酸纤维素，150g甘露醇，混合均匀后过100目筛，加入20g 1-5%的聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液，50℃干燥5小时，然后过20目筛整粒，加入4g滑石粉，混匀，即得三叶青多糖颗粒制剂。
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