CN114350725B

CN114350725B - 一种酵母菌胞外多糖、制备方法及其应用

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Publication number: CN114350725B
Application number: CN202210041717.5A
Authority: CN
Inventors: 吴重德; 张敏; 曾思源; 金垚; 黄钧; 周荣清
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2042-01-14
Also published as: CN114350725A

Abstract

本发明提供了一种酵母菌胞外多糖、制备方法及其应用，涉及微生物技术领域。所述酵母菌胞外多糖由鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)发酵产生，所述鲁氏酵母菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.3791。本发明的酵母菌胞外多糖对其他菌种特别是乳酸乳球菌具有低温保护和冻干保护作用，适合推广应用。

Description

一种酵母菌胞外多糖、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种酵母菌胞外多糖、制备方法及其应用。

背景技术

胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)是微生物在生长代谢过程中产生的次级代谢产物，有的附着在细胞壁上，形成荚膜多糖；有的被分泌到周围环境中，形成粘液多糖。近年来，微生物胞外多糖因其独特的物理化学性质、生物安全性和生物活性而受到广大研究者的青睐，但是低产量和高生产成本一直是制约其大规模生产与应用的主要因素。胞外多糖因其具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节等活性，在人类的健康生活方面具有广泛的应用前景。

此外，在微生物领域中，微生物的保存尤为重要，通常保存在以甘油为基质的液体中，或保存在固体斜面培养基上，再或者制成菌剂固体保存，因此，寻找合适的保护剂，提高微生物存活率具有重要意义。

鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)是一种常见的耐高渗透压酵母菌，能够在NaCl浓度达18％～24％的高盐和高糖环境中生长，是已知的最喜旱的生物之一。鲁氏酵母菌降解淀粉水解物产生糖类等物质，代谢生成乙醇以及高级醇和芳香杂醇类副产物，还能产生具有焦糖般气味的呋喃酮类化合物，是酱油、豆酱、香醋、泰国发酵鱼制品和日本味噌等发酵食品的重要增香微生物。

对鲁氏酵母菌产生的胞外多糖(EPS)进行分离纯化，分析其结构特征，探索其潜在功能活性，为其在食品、化妆品以及制药方面的应用奠定理论基础，具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酵母菌胞外多糖、制备方法及其应用。本发明的胞外多糖对其他菌种特别是乳酸乳球菌具有低温保护和冻干保护作用，可以作为菌种保护剂以提高菌种保存的存活率。

本发明提供的技术方案如下：

在一个方面，本发明提供了一种酵母菌胞外多糖，所述胞外多糖由鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)发酵产生，所述鲁氏酵母菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.3791。

所述鲁氏酵母菌从蚕豆辣酱中分离得到，经生理生化和16S rDNA序列分析鉴定。

本发明所涉及的鲁氏酵母菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2010年04月29日，分类命名为Zygosaccharomyces rouxii SZ-1。该菌株为已公开的菌株，本发明的侧重点在于所述鲁氏酵母菌在生产胞外多糖中的应用以及其所发酵产生的胞外多糖及其制备方法与应用。

在本发明的下文中，所述酵母菌胞外多糖也称为胞外多糖EPS-3791，二者均指由保藏编号为CGMCC No.3791的鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)发酵产生的胞外多糖。

在一个实施方案中，所述酵母菌胞外多糖的分子量为64.412KDa。

在一个实施方案中，所述酵母菌胞外多糖包含半乳糖、葡萄糖和甘露糖；其中，所述半乳糖、葡萄糖和甘露糖的摩尔比为1.00：4.25：13.30。

在另一个方面，本发明保护上述酵母菌胞外多糖的制备方法，所述方法包括在发酵培养基中培养所述鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)，从发酵液中获得所述胞外多糖。

在一个实施方案中，所述培养包括在30～35℃温度下静置培养50～60h。培养的温度可以包括但不限于30、31、32、33、34或35℃；培养的时间包括但不限于50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60h。

在一个具体的实施方案中，所述发酵培养基包含以下组分：酵母膏0.5～1.5g、蛋白胨1.5～2.5g、葡萄糖1.5～2.5g、蒸馏水100mL。

在一个优选的实施方案中，所述发酵培养基由以下组分组成：酵母膏1g、蛋白胨2g、葡萄糖2g、蒸馏水100mL。

在一个实施方案中，所述方法还包括所述胞外多糖的提取和纯化步骤。

在一个实施方案中，所述胞外多糖的提取包括将所述发酵液离心后取上清液，加入三氯乙酸去除蛋白，再次离心取上清液经醇沉淀后，重溶、透析和冷冻干燥；所述胞外多糖的纯化包括将提取到的胞外多糖用溶剂溶解后，经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱分级、Sephadex G-100凝胶层析柱分离后收集胞外多糖组分。

经胞外多糖的提取步骤获得胞外多糖粗品，加溶液溶解分散，经DEAE-SepharoseFast Flow离子交换柱分离，再经Sephadex G-100凝胶层析柱分离后收集胞外多糖组分，经透析、真空冷冻干燥后，制得纯化的胞外多糖。

在一个具体的实施方案中，本发明酵母菌胞外多糖的制备包括以下步骤：

(1)将鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)CGMCC No.3791进行活化、扩大培养；

(2)将步骤(1)制得的扩培液接种至发酵培养基中，30℃静置培养60h，获得含有鲁氏酵母菌胞外多糖的发酵液；

(3)将步骤(2)制得的液体发酵液离心，收集上清液；

(4)将步骤(3)制得的上清液中加入终浓度为4％的三氯乙酸，室温搅拌半小时，离心，收集上清液；

(5)将步骤(4)制得的上清液中加入三倍体积的无水乙醇，经醇沉后，离心，收集沉淀；

(6)将步骤(5)制得的沉淀用水溶解，透析，真空冷冻干燥后，制得粗胞外多糖；

(7)将步骤(6)制得的粗胞外多糖用水溶解，制得粗胞外多糖溶液；

(8)将步骤(7)制得的粗胞外多糖溶液通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱获得胞外多糖分级组分，再经过Sephadex G-100凝胶层析柱分离，收集多糖组分；

(9)将步骤(8)制得的胞外多糖溶液经透析、真空冷冻干燥后，制得纯化的胞外多糖。

在一个实施方案中，所述方法的胞外多糖产量为810mg/L。

在另一个方面，本发明保护所述酵母菌胞外多糖在对乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)低温保护方面的应用；优选地，所述乳酸乳球菌为MG1363乳酸菌。本发明的胞外多糖可以保护乳酸乳球菌免受低温损伤。

在另一个方面，本发明保护所述酵母菌胞外多糖在对乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)冻干保护方面的应用；优选地，所述乳酸乳球菌为MG1363乳酸菌。本发明的胞外多糖可以保护乳酸乳球菌免受冻干损伤。

本发明涉及的MG1363乳酸菌为已公开菌株，公众可获得。

在另一个方面，本发明保护所述酵母菌胞外多糖在制备药品、化妆品或保健品中的应用；本发明的胞外多糖具有低温保护和冻干保护的作用，例如可用于制备低温保护剂和冻干保护剂。

有益效果：

(1)本发明提供的酵母菌胞外多糖具有保护乳酸乳球菌免受低温损伤的能力；可用于制备细胞低温保护剂；

(2)本发明提供的酵母菌胞外多糖具有保护乳酸乳球菌免受冻干损伤的能力；可用于制备细胞冻干保护剂；

(3)本发明提供的胞外多糖对细胞无毒害、无损伤；

(4)本发明通过特定的鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)进行胞外多糖的生产制备，制备方法简单高效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的鲁氏酵母菌粗胞外多糖的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱洗脱图；

图2为本发明提供的鲁氏酵母菌胞外多糖EPS-3791的凝胶过滤色谱柱洗脱图；

图3为本发明提供的鲁氏酵母菌胞外多糖EPS-3791的单糖组成；

图4为本发明提供的鲁氏酵母菌胞外多糖EPS-3791的红外光谱图；

图5为本发明提供的鲁氏酵母菌胞外多糖EPS-3791对乳酸乳球菌低温保护(a)和冻干保护(b)作用。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1.本发明鲁氏酵母菌胞外多糖的制备

(2)将步骤(1)制得的扩培液以5％的接种量接种至发酵培养基中，30℃静置培养60h，获得含有鲁氏酵母菌胞外多糖的发酵液；

发酵培养基由以下组分组成：酵母膏1g、蛋白胨2g、葡萄糖2g、蒸馏水100mL；

(3)将步骤(2)制得的液体发酵液离心，收集上清液；

(4)将步骤(3)制得的上清液中加入终浓度为3-8％的三氯乙酸，室温搅拌半小时，离心，收集上清液；

图1为本发明鲁氏酵母菌粗胞外多糖的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱洗脱图。

图2为本发明鲁氏酵母菌胞外多糖EPS-3791的Sephadex G-100凝胶过滤色谱柱洗脱图。

实施例2.本发明鲁氏酵母菌胞外多糖的鉴定

2.1分子量测定

具体步骤如下：

(1)取实施例1得到的EPS-3791溶解在0.1M NaNO₃水溶液中至终浓度为1mg/mL，并通过孔径为0.45μm的过滤器过滤；

(2)将步骤(1)制得的滤液(100μL)注入凝胶排阻色谱柱(Ohpak SB-805HQ(300×8mm)，Ohpak SB-804HQ(300×8mm)，Ohpak SB-803HQ(300×8mm))，用硝酸钠溶液(0.1M)以0.4mL/min流速进行洗脱，柱温45℃，得到响应值数据；

(3)将得到的数据收集和处理，根据马克·霍温克方程(Mark-Houwink Equation)计算分子量。

测定结果为：EPS-3791的平均分子量为64.412KDa。

2.2单糖的组成测定

具体步骤如下：

(1)将5mg实施例1得到的EPS-3791用三氟乙酸(TFA)在121℃水解2小时；

(2)通入氮气，吹干，加入甲醇清洗，再吹干，重复甲醇清洗2-3次；

(3)加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测；

(4)以标准岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸作为对比，通过高效阴离子交换色谱(HPAEC)连同脉冲安培检测器和Dionex^TMCarboPac^TMPA20(150mm×1.0mm，10μm)液相色谱柱测定水解产物的单糖组成和单糖含量；

其中，HPAEC操作条件如下：

流动相A：0.1M NaOH；流动相B：0.1M NaOH，0.2M NaAc；流速：0.5mL/min。

梯度洗脱条件如下：0min，95％A、5％B；30min，80％A、20％B；30.1min，60％A、40％B；45min，60％A、40％B；45.1min，95％A、5％B；60min，95％A、5％B。

将测定结果与标准品对比计算，结果发现：EPS-3791由半乳糖、葡萄糖和甘露糖以1.00：4.25：13.30的摩尔比组成。

图3为本发明鲁氏酵母菌胞外多糖EPS-3791的单糖组成。

2.3FT-IR光谱检测

具体步骤如下：

将实施例1得到的EPS-3791和KBr以1：100的比例混合研磨，然后通过抽真空压成薄片；将压成薄片的EPS在4000～400cm^-1的范围内在IRTracer-100傅里叶变换红外光谱仪上测定。

测定结果为：如图4，在3413cm^-1的宽峰代表O-H的伸缩振动；在2929cm^-1的峰表示C-H伸缩振动；在1651cm^-1的信号是由于C＝O的伸缩振动；在1545和1410cm^-1处的吸收峰是由C-O的伸缩振动引起的；1200～1000cm^-1是多糖的特征区域，主要由C-O-C和C-OH键振动引起；912cm^-1处的吸收峰与吡喃环的非对称伸缩振动有关；882cm^-1的条带是由糖单体之间的β-糖苷键引起的；在814cm^-1的峰揭示了EPS-3791中甘露糖单元的α型构型。

实施例3.本发明鲁氏酵母菌胞外多糖的功能

3.1本发明鲁氏酵母菌胞外多糖EPS-3791对乳酸乳球菌的低温保护作用

具体步骤如下：

(1)取1mL乳酸乳球菌MG 1363的对数中期发酵液，离心(8 000g，4℃，5min)，弃上清；

(2)分别加入1mL 0.9％生理盐水(未添加任何保护剂组)、20％甘油、1％EPS、3％EPS、5％EPS水溶液，充分震荡摇匀；

(3)在-80℃低温冷冻7天，解冻，采用稀释涂布平板法计算活菌数，存活率用冷冻后活细胞数相对于冷冻前活细胞数的百分比表示。

测定结果如下：如图5中a所示，低温冷冻7天后，未添加任何保护剂的细胞存活率为53.70％，添加1％EPS、3％EPS、5％EPS和20％甘油的细胞存活率分别为59.76％、67.07％、70.42％和74.07％。

结果表明，鲁氏酵母菌胞外多糖EPS-3791对乳酸乳球菌MG 1363在-80℃低温冷冻条件下具有保护作用，可以作为潜在的细菌冷冻保护剂进行开发与应用。

3.2本发明鲁氏酵母菌胞外多糖EPS-3791对乳酸乳球菌的冻干保护作用

具体步骤如下：

(2)分别加入1mL 0.9％生理盐水、5％海藻糖、1％EPS、3％EPS、5％EPS水溶液，充分震荡摇匀；

(3)在-80℃冷冻干燥至少1天，用同体积无菌水复溶，采用稀释涂布平板法计算活菌数，存活率用冻干后活细胞数相对于冻干前活细胞数的百分比表示。

测定结果如下：如图5中b所示，冷冻干燥后，未添加任何保护剂的细胞存活率为15.74％，添加1％EPS、3％EPS、5％EPS和5％海藻糖的细胞存活率分别为33.80％、43.52％、51.64％和47.02％。

结果表明，鲁氏酵母菌胞外多糖EPS-3791对乳酸乳球菌在冻干条件下具有保护作用，当浓度为5％时，其保护作用优于5％海藻糖，可以作为潜在的细菌冻干保护剂进行开发与应用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种酵母菌胞外多糖，所述酵母菌胞外多糖由鲁氏酵母菌（Zygosaccharomyces rouxii）发酵产生，所述鲁氏酵母菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.3791；

所述酵母菌胞外多糖的分子量为64.412 kDa；

所述酵母菌胞外多糖包含半乳糖、葡萄糖和甘露糖；其中，所述半乳糖、葡萄糖和甘露糖的摩尔比为1.00：4.25：13.30。

2.权利要求1所述酵母菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括在发酵培养基中培养所述鲁氏酵母菌（Zygosaccharomyces rouxii），从发酵液中获得所述酵母菌胞外多糖。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述培养包括在30~35℃下静置培养50~60 h。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括所述酵母菌胞外多糖的提取和纯化步骤。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述酵母菌胞外多糖的提取包括将所述发酵液离心后取上清液，加入三氯乙酸去除蛋白，再次离心取上清液经醇沉淀后，重溶、透析和冷冻干燥；所述酵母菌胞外多糖的纯化包括将提取到的胞外多糖用溶剂溶解后，经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱分级、Sephadex G-100凝胶层析柱分离后收集胞外多糖组分。

6.权利要求1所述的胞外多糖在对乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）低温保护方面的应用。

7.根据权利要求6所述胞外多糖在对乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）低温保护方面的应用，其特征在于，所述乳酸乳球菌为MG1363乳酸菌。

8.权利要求1所述的酵母菌胞外多糖在对乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）冻干保护方面的应用。

9.根据权利要求8所述的酵母菌胞外多糖在对乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）冻干保护方面的应用，其特征在于，所述乳酸乳球菌为MG1363乳酸菌。