KR20140114818A

KR20140114818A - 재조합 단백질들의 분해를 감소시키기 위한 방법들 및 물질들

Info

Publication number: KR20140114818A
Application number: KR1020147018043A
Authority: KR
Inventors: 바우터 베르베켄; 스테판 리카에르트
Original assignee: 옥시레인 유케이 리미티드
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2014-09-29
Also published as: BR112014015933A2; EP2798074A1; JP2015503338A; US20150031081A1; CN104136622A; WO2013098651A1; CA2859303A1; SG11201403506TA

Abstract

야로위아(Yarrowia)와 같은 균류 세포들 내의 재조합 단백질의 분해를 감소시키기 위한 방법들 및 물질들이 개시된다.

Description

재조합 단백질들의 분해를 감소시키기 위한 방법들 및 물질들{METHODS AND MATERIALS FOR REDUCING DEGRADATION OF RECOMBINANT PROTEINS}

본 발명은 균류 세포들 내의 재조합 단백질들의 분해를 감소시키기 위한 방법들 및 물질들에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 두 가지 다른 앱신 펩티다제(yapsin peptidase) 활성들의 결핍들을 가지는 유전자 조작된 야로위아(Yarrowia) 세포들에 관한 것이다.

본 출원은 그 내용들이 본 명세서에 참조로 포함된 2011년 12월 30일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제61/581,859호를 우선권으로 수반한다.

고성능 발현 시스템들은 현재 개발 중인 대부분의 생물 약제들(예를 들면, 재조합 단백질들)을 생산하는 데 요구된다. 효모계 발현 시스템들(yeast-based expression systems)은 유전자 조작의 용이성과 단백질들을 분비하고 변형시키는 능력을 갖는 미생물의 발효를 결합시킨다. 그러나, 상기 재조합 단백질들은 세포내 프로테아제들(proteases)뿐만 아니라 세포외 프로테아제들에 의해 흔히 분해된다. 이에 따라, 상기 재조합 단백질들의 감소된 분해를 갖는 효모계 발현 시스템들을 위한 필요가 존재한다.

본 발명은 적어도 부분적으로 재조합 단백질들의 분해가 두 상이한 앱신 펩티다제 활성들, YPS1 단백질(pYPS1) 및 YPS2 단백질(pYPS2)의 결핍들을 가지는 야로위아(Yarrowia) 세포들 내에서 감소된다는 발견을 근거로 한다. 여기서 기술되는 유전자 조작된 야로위아(Yarrowia) 균주들은 분해되지 않은 재조합 단백질들(예를 들면, 항체들)을 생산하기 위하여 유용하다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 pYPS1 활성의 결핍 및 pYPS2 활성의 결핍을 포함하도록 유전자 조작되는 분리된 야로위아(Yarrowia) 세포(예를 들면, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포)를 특징으로 한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 세포는 기능(functional) pYPS1 또는 기능 pYPS2의 검출 가능한 레벨들을 생산하지 않는다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 세포는 기능 pYPS1 및 기능 pYPS2를 코딩하는 검출 가능한 mRNA 분자를 생산하지 않는다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 YPS1 및 YPS2 유전자들은 상기 세포 내에서 분쇄된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 YPS1 및 YPS2 오픈 리딩 프레임들(open reading frames)은 소거된다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 그 실질적인 숫자가 pYPS1 활성의 결핍 및 pYPS2 활성의 결핍을 포함하도록 유전자 조작되는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포들의 실질적으로 순수한 배양을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 야로위아(Yarrowia) 내에서 생산되는 표적 단백질(target protein)의 분해를 감소시키기 위한 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 여기에 기술되는 야로위아 세포 내의 상기 표적 단백질을 코딩하는 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 표적 단백질을 생산하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은, pYPS1 활성의 결핍, pYPS2 활성의 결핍, 그리고 상기 표적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하도록 유전자 조작된 야로위아(Yarrowia) 세포를 제공하는 단계; 및 b) 상기 세포가 상기 표적 단백질을 생산하도록 조건들 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

여기에 기술되는 세포들의 임의의 것은 OCH1 활성이 더 결핍될 수 있다.

여기에 기술되는 세포들의 임의의 것은 알파-1,2 만노시다제(mannosidase)를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 알파-1,2 만노시다제는 상기 알파-1,2 만노시다제를 세포내 구간으로 표적화시키는 표적화 서열을 포함할 수 있다.

여기에 기술되는 세포들의 임의의 것은 ALG3 활성이 더 결핍될 수 있다.

여기에 기술되는 세포들의 임의의 것은 알파-1,3-글루코실트란스페라제(glucosyltransferase)를 코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있다.

여기에 기술되는 세포들의 임의의 것은 글루코시다제(glucosidase)의 알파 및 베타 서브유닛들을 코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있다.

여기에 기술되는 세포들의 임의의 것은 GlcNAc-트란스페라제(transferase) I을 코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있다. 상기 GlcNAc-트란스페라제 I은 상기 GlcNAc-트란스페라제 I를 세포내 구간으로 표적화시키는 표적화 서열을 포함할 수 있다.

여기에 기술되는 세포들의 임의의 것은 GlcNAc-트란스페라제 II를 코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있다. 상기 GlcNAc-트란스페라제 II는 상기 GlcNAc-트란스페라제 II를 세포내 구간으로 표적화시키는 표적화 서열을 포함할 수 있다.

여기에 기술되는 세포들의 임의의 것은 갈락토실트란스페라제(galactosyltransferase)를 코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있다. 상기 갈락토실트란스페라제는 상기 갈락토실트란스페라제를 골지체(Golgi apparatus)로 표적화시키는 표적화 서열을 포함할 수 있다.

여기에 기술되는 세포들의 임의의 것은 표적 단백질(예를 들면, 리보솜 단백질(lysosomal protein), 병원체 단백질(pathogen protein), 성장 인자, 시토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체 또는 이의 항원-결합 조각의 하나 또는 둘의 폴리펩티드 사슬들, 혹은 융합 단백질)을 코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있다. 상기 항체는, 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF)에 결합되는 항체, 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR)에 결합되는 항체, CD3에 결합되는 항체, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF)에 결합되는 항체, TNF 수용체에 결합되는 항체, CD20에 결합되는 항체, 당단백질(glycoprotein) IIa/IIb 수용체에 결합되는 항체, IL2-수용체에 결합되는 항체, CD52에 결합되는 항체, CD11a에 결합되는 항체, 그리고 HER2에 결합되는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 항원 결합 조각은 Fab, F(ab')2, Fv 그리고 단일 사슬 Fv(scFv) 조각들로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 (i) pYPS1 활성의 결핍 및 (ii) pYPS2 활성의 결핍; 그리고 (iii) ALG3 활성의 결핍, (iv) OCH1 활성의 결핍, (v) 알파-1,2 만노시다제를 코딩하는 핵산, (vi) GlcNAc-트란스페라제 I를 코딩하는 핵산, (vii) GlcNAc-트란스페라제 II를 코딩하는 핵산, (viii) 만노시다제 II를 코딩하는 핵산, (ix)α-1,3-글루코실트란스페라제를 코딩하는 핵산, (x) 갈락토실트란스페라제를 코딩하는 핵산, 그리고 (xi) 글루코시다제의 α 및 β 서브유닛들을 코딩하는 핵산의 하나 또는 그 이상을 포함하도록 유전자 조작되는 분리된 야로위아 세포를 특징으로 한다. 예를 들면, 이러한 세포는, (i) pYPS1 활성의 결핍; (ii) pYPS2 활성의 결핍; (iii) ALG3 활성의 결핍; (iv) OCH1 활성의 결핍; (v) 알파-1,2 만노시다제를 코딩하는 핵산; (vi) GlcNAc-트란스페라제 I을 코딩하는 핵산; (vii) GlcNAc-트란스페라제 II를 코딩하는 핵산; (viii) 만노시다제 II를 코딩하는 핵산; (ix) α-1,3-글루코실트란스페라제를 코딩하는 핵산; (x) 갈락토실트란스페라제를 코딩하는 핵산; 그리고 (xi) 글루코시다제의 α 및 β 서브유닛들을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 세포들은 여기에 기술되는 표적 단백질을 코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있다.

달리 정의하지 않는 한, 여기에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명에 속하는 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 공통적으로 동일한 의미를 가진다. 비록 여기에 기재되는 것들과 유사하거나 동일한 방법들 및 물질들이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법들 및 물질들이 다음에 기재된다. 여기서 언급되는 모든 공보들, 특허 출원들, 특허들, 젠뱅크®(Genbank®) 기탁 번호들 및 다른 참고 문헌들은 개시 사항들이 참조로 포함된다. 상충되는 경우에, 정의들을 포함하여 본 출원이 조절할 것이다. 상기 물질들, 방법들 및 실시예들은 예시적인 것으로서 제한하려는 의도는 아니다.

본 발명의 다른 특징들과 이점들은 다음의 상세한 설명과 특허청구범위로부터 명확하게 될 것이다.

도 1a는 L사슬 발현 컨스트럭트(SEQ ID NO:1) 및 H사슬 발현 조합(SEQ ID NO:2)의 뉴클레오티드 서열의 묘사이다.
도 1b는 pYPS1(SEQ ID NO:3) 및 pYPS2 단백질(SEQ ID NO:4)의 아미노산 서열의 묘사이다.
도 1c는 항-HER2 항체의 L사슬(LC)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:5)의 묘사, 그리고 밑줄을 그은 LIP2 프레프로 리더 서열(LIP2 prepro leader sequence), 이중선으로 밑줄을 그은 V_L도메인 서열(V _L domain) 및 점선으로 밑줄을 그은 CK 도메인(Ck1 domain)을 가지는 LC의 아미노산 서열(SEQ ID NO:6)의 묘사이다.
도 1d는 항-HER2 항체의 H사슬(HC)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:7)의 묘사, 그리고 밑줄을 그은 LIP2 프레프로 리더 서열(LIP2 prepro leader sequence), 이중선으로 밑줄을 그은 V_H 도메인(V _H domain), 점선으로 밑줄을 그은 CH 도메인(CH domain) 및 "/"로 표기한 앱신 분절 부위를 가지는 HC의 아미노산 서열(SEQ ID NO:8)의 묘사이다.
도 2는 알파 HER2 H 및 L사슬들의 단일 표적화된 복제 통합들을 위해 조합되는 균주의 계통의 개략도이다.
도 3은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 균주 Po1d 내에 발현되는 항-HER2 항체의 웨스턴 블롯의 사진이다. 상기 L사슬 및 H사슬들은 별도로 검출되었다. L사슬은 25kDa의 정확한 분자량에서 존재하였지만 이량체화 되는 경향을 보였다. H사슬도 50kDa의 정확한 분자량에서 검출되었지만, 대부분이 대략 32kDa의 분자량을 갖는 분해된 생성물로서 존재하였다.
도 4는 YPS 유전자들의 분쇄를 위한 조합의 개략도이다.
도 5는 단일 앱신 결실된 균주들의 배양 상청액으로부터 얻어진 H사슬의 두 웨스턴 블롯들의 사진이다. 상측 패널에 있어서, H사슬이 Δyps2 결실, Δyps3 결실, Δyps5 결실, Δyps7 결실 및 Δypsx 결실 균주들, 그리고 컨트롤 균주(ctrl, 앱신 비결실된)를 위해 두 시점들(48시간 및 96시간)에서 검출되었다. 하측 패널에 있어서, H사슬이 Δyps1 결실 및 Δyps4 결실 균주들과 컨트롤 균주 각각의 두 클론들을 위해 96시간의 시점에서 검출되었다.
도 6은 Δyps1 결실 균주, URA-영양요구성 Δyps1 결실 균주, Δyps1Δyps2 이중 결실 균주, Δyps1Δyps3 이중 결실 균주, Δyps1Δyps4 이중 결실 균주, 그리고 컨트롤 균주(앱신 비결실된)의 배양 상청액들로부터 얻어진 H사슬의 웨스턴 블롯의 사진이다.
도 7은 Δyps1Δyps2 및 야생형(ctrl) 균주들 내에 발현되는 재조합 항-HER2 항체의 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis: SDS-PAGE) 겔의 사진이다. 감소시키는(좌측) 및 감소시키지 않는(우측) 조건들이 도시된다. 분해 생성물들을 유도된 H사슬은 별표로 표기된다. 감소시키지 않는 조건들 하에서, H사슬 단백질 가수 분해 생성물들은 컨트롤 균주 내에 단량체 및 이량체 모두로 존재하였다. 감소시키는 조건들 하에서, H사슬의 글리코실화된 및 글리코실화되지 않은 버전들이 관찰되었다. H2L2: 완전히 조립된 Ab; HC: H사슬(중쇄); LC: L사슬(경쇄).

일반적으로, 본 발명은 YPS1 단백질(pYPS1) 및 YPS2 단백질(pYPS2)의 두 가지 상이한 앱신 펩티다아제들(yapsin peptidase)의 결핍들을 갖는 유전자 조작된 세포들을 이용하여 야로위아(Yarrowia)(예를 들면, 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica))와 같은 균류 세포 또는 이형성(dimorphic) 효모의 다른 연관 종들 내의 재조합 단백질들의 분해를 감소시키기 위한 방법들 및 물질들을 제공한다. 앱신들은 제한된 기질 특이성을 가지며, 상기 세포 표면상에 국소화된 글리코포스파티딜리노시톨(glycophosphatidylinositol: GPI)-결합 아스파르트산 엔도펩티다제들(aspartic endopeptidases)이다. 앱신들은 C-말단으로 짝지어진 기본 잔기들(예를 들면, 리신-아르기닌 및 아르기닌-아르기닌); 리신 상의 아르기닌의 존재 없이 C-말단으로 단일 염기 부위들; 그리고 기본 잔기들 사이로 쪼개질 수 있다. 예를 들면, Gagnon-Arsenault 등의 "FEMS Yeast Res"(6: 966-978 (2006))를 참조 바란다.

여기에 기술되는 상기 유전자 조작된 세포들은 재조합 표적 단백질들(target proteins)을 생성하는 데 이용될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 재조합 표적 단백질들은 숙주 세포 조직에 의해 이들의 N-글리코실화(glycosylation)를 야기하는 상기 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)(또는 이형성 효모의 다른 연관 종들) 분비 경로의 하나 또는 그 이상의 단계들을 통해 이동될 수 있다.

재조합으로 생산될 수 있는 적합한 표적 단백질들은, 병원체(pathogen) 단백질들, 리소좀 단백질들(예를 들면, 글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidase), 세레브로시다아제(cerebrosidase), 또는 갈락토세레브로시다아제(galactocerebrosidase)), 인슐린(insulin), 글루카곤(glucagon), 성장 인자들(growth factors), 시토카인(cytokines), 케모카인(chemokines), Fc 수용체에 결합될 수 있는 단백질, 항체들 또는 이의 조각들(fragments), 혹은 항체들 또는 항체들의 조각들에 대한 단백질들의 임의의 것의 융합(예를 들면, 단백질-Fc)을 포함한다. 병원체 단백질들의 제한적이지 않은 예들은, 파상풍 변성 독소(tetanus toxoid); 디프테리아(diphtheria) 변성 독소; 그리고 바이러스 표면 단백질들(예를 들면, 거대세포바이러스(cytomegalovirus: CMV) 당단백질(glycoprotein) B, H 및 gCIII; 인간 면역 결핍 바이러스 1(HIV-1) 외피 당단백질들; 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus: RSV) 외피 당단백질들; 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus: HSV) 외피 당단백질들; 엡스타인-바 바이러스(Epstein Barr virus: EBV) 외피 당단백질들; 수두대상포진 바이러스(varicella-zoster virus: VZV) 외피 당단백질들; 인유두종 바이러스(human papilloma virus: HPV) 외피 당단백질들; 인플루엔자 바이러스 당단백질들; 그리고 간염 패밀리 표면 항원들)을 포함한다. 성장 인자들은, 예를 들면, 혈관내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor: IGF), 골형성 단백질(bone morphogenic protein: BMP), 과립구집락 자극 인자(granulocyte-colony stimulating factor: G-CSF), 과립대식세포집락 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor: GM-CSF), 신경 성장 인자(nerve growth factor: NGF); Neurotrophin, Platelet-derived growth factor(PDGF), 에리스로포이에틴(erythropoietin: EPO), 트롬보포이에틴(thrombopoietin: TPO), 미오스타틴(myostatin: (GDF-8), 성장 분화 인자-9(Growth Differentiation factor-9: GDF9), 염기성 섬유모세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor)(bFGF 또는 FGF2), 상피세포 성장 인자(Epidermal growth factor: EGF), 간세포 성장 인자(Hepatocyte growth factor: HGF)를 포함한다. 시토카인은 인터류킨들(interleukins)(예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, 또는 IL-15와 같은 IL-1 내지 IL-33) 및 인터페론들(interferons)(예를 들면, 인터페론 β 또는 인터페론 γ)을 포함한다. 케모카인은, 예를 들면, I-309, TCA-3, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, 란테스(RANTES), C10, MRP-2, MARC, MCP-3, MCP-2, MRP-2, CCF18, MIP-1γ, 이오탁신(Eotaxin), MCP-5, MCP-4, NCC-1, Ckβ10, HCC-1, 류코탁신(Leukotactin)-1, LEC, NCC-4, TARC, PARC, 또는 이오탁신(Eotaxin)-2를 포함한다. 또한, 예를 들면, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen: CEA), 인간 뮤신들(mucins), HER-2/neu, 그리고 전립선 특이 항원(prostate-specific antigen: PSA)의 종양 당단백질들(예를 들면, 종양관련 항원들)이 포함된다[Henderson 및 Finn의 "Adv in Immunology"(62, pp. 217-56 (1996))].

일부 실시예들에 있어서, 상기 표적 단백질은 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorder: LSD)과 관련된다. LSD와 연관된 표적 단백질들의 비제한적인 예들은, 예를 들면, 알파-L-이두로니다제(iduronidase), 베타-D-갈락토시다제(galactosidase), 베타-글루코시다제(glucosidase), 베타-헥소사미니다제(hexosaminidase), 베타-D-만노시다제(mannosidase), 알파-L-푸코시다제(fucosidase), 아릴술파타제(arylsulfatase) B, 아릴술파타제 A, 알파-N-아세틸갈락토사미니다제(acetylgalactosaminidase), 아스파르틸글루코사미니다제(aspartylglucosaminidase), 이두로네이트(iduronate)-2-술파타제(sulfatase), 알파-글루코사미니드(glucosaminide)-N-아세틸트란스페라제(acetyltransferase), 베타-D-글루코로니다제(glucoronidase), 히알루로니다제(hyaluronidase), 알파-L-만노시다제, 알파-뉴라미니다제(neuraminidase), 포스포트란스페라제(phosphotransferase), 산 라파제(acid lipase), 산 세라미다제(acid ceramidase), 스핀고미엘리나제(sphingomyelinase), 티오에스테라제(thioesterase), 카텝신cathepsin) K, 그리고 리포프로테인 리파제(lipoprotein lipase)를 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 표적 단백질은 항체이다. 상기 항체는 임의의 항체가 될 수 있지만, 항체들의 비제한적인 예들은, OKT3, 테플리주맙(Teplizumab) 또는 오텔릭시주맙(Otelixizumab)과 같은 CD3에 결합되는 항제; 아달리무맙(Adalimumab)(휴미라®(Humira®)) 또는 인플릭시맙(Infliximab)(레미케이드®(Remicade®))와 같은 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF)에 결합되는 항체; 에타네르셉트(Etanercept)(엔브렐®(Enbrel®))와 같은 TNF 수용체에 결합되는 항체; 이브리투모맙 티욱섹탄(Ibritumomab tiuxetan)(제발린®(Zevalin®)) 또는 리툭시맙(Rituximab)(마브테라®(Mabthera®))과 같은 CD20에 결합되는 항체; 아베익시맙(Abeiximab)(레오프로®(Reopro®))과 같은 당단백질(glycoprotein) IIa/IIb 수용체(GPIIa/IIb-R)에 결합되는 항체; 바실릭시맙(Basiliximab)(시물렉트®(Simulect®)) 또는 다실리주맙(Daclizumab)(제나팍스®(Zenapax®))과 같은 IL2-수용체에 결합되는 항체; 세툭시맙(Cetuximab)(에르비툭스®(Erbitux®))과 같은 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR)에 결합되는 항체; 알렘투주맙(Alemtuzamab)(캄파스®(Campath®))과 같은 CD52에 결합되는 항체; 에팔리주맙(Efalizumab)(랩티바®(Raptiva®))과 같은 CD11a에 결합되는 항체; 베바시주맙(Bevacizumab)(아바스틴®(Avastin®))과 같은 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF)에 결합되는 항체, 또는 트라스투주맙(Trastuzamab)(헤르셉틴®(Herceptin®))과 같은 HER2에 결합되는 항체를 포함한다.

표적 단백질들은 또한 융합 단백질들이 될 수 있다. 융합 단백질들은, 예를 들면, (i) 여기에 기술되는 임의의 단백질 또는 이의 조각과 (ii) 항체 또는 이의 조각의 융합을 포함한다. 이들은 또한 (i) 예를 들면, 연관되지 않은 단백질들로부터 유도되는 신호 서열들(signal sequence), 면역글로불린 H사슬(heavy chain) 불변 영역들 또는 이러한 영역들의 일부들, 태그 아미노산 서열들(예를 들면, 녹색 형광 단백질 또는 이의 변종들과 같은 형광 단백질들), 또는 정제들(affinity purifications)을 위해 유용한 서열들(예를 들면, 헥사히스트딘(hexahistidine), FLAG 태그, 또는 엘라스틴 유사 폴리펩티드(elastin-like polypeptide: ELP)와 같은 폴리-히스티딘) 등의 다양한 이종 단백질들 중에서 임의의 것의 융합이 될 수 있다.

항체 조각들(항원-결합 항체 조각들을 포함하는)도 관심의 대상이 된다. 이러한 조각들은 본 명세서에서 개시되는 항체들의 임의의 것이 될 수 있다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "항체 조각"이라는 용어는 (a) 항원-결합 조각 또는 (b) Fc 수용체와 상호 작용 할 수 있는 상기 항체의 Fc 부분을 언급한다. 항원 결합 조각은, 예를 들면, Fab, F(ab')₂, Fv 및 단일 사슬 Fv(scFv) 조각이 될 수 있다. scFv 조각은 상기 scFv가 유도되는 상기 항체의 H사슬 및 L사슬(light chain) 가변 영역들 모두를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 또한, 디아바디들(diabodies)[Poljak의 "Structure"(2(12):1121-1123(1994)); Hudson 등의 "J. Immunol. Methods"(23(1-2):177-189(1999)] 그리고 인트라바디들(intrabodies)[Huston 등의 "Hum. Antibodies"(10(3-4):127-142(2001)); Wheeler 등의 "Mol. Ther."(8(3):355-366(2003)); Stocks의 "Drug Discov. Today"(9(22): 960-966(2004))]은 생산될 수 있는 재조합 단백질들의 예들이다.

표적 단백질은, 선택적으로는 상기 표적 단백질의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 사슬들을 코딩하는(encoding) 하나 또는 그 이상의(예를 들면, 둘, 셋, 넷, 또는 다섯) 발현 벡터들(expression vectors) 내에서, 하나 또는 그 이상의(예를 들면, 둘, 셋, 넷, 또는 다섯) 핵산들에 의해 코딩될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 항체 또는 항체의 항원-결합 조각의 양 사슬들(예를 들면, H사슬 및 L사슬 혹은 하나 또는 모두의 조각)은 단일 발현 벡터 내의 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)에 의해서나 단일 발현 벡터 또는 두 별도의 발현 벡터들 내의 두 ORF들에 의해 발현될 수 있다. 따라서, 항체의 H 및 L사슬 가변 영역들을 함유하는 항체 scFV는 일반적으로 단일 ORF에 의해 코딩될 수 있다. 반면에, 전체 IgG 항체, Fab 조각 또는 F(ab')2 조각의 H 및 L사슬들은 두 별도의 핵산들 내의 분리된 ORF들에 의해 가장 공통적으로(필수적이지는 않지만), 분리된 벡터 내에서 각기 일반적으로(또한 필수적이지는 않지만) 발현될 수 있다. 상술한 항체들 및 항체들의 항원 결합 조각들을 위한 동일한 원리들이 하나 또는 그 이상의(예를 들면, 둘, 셋, 넷, 또는 다섯) 동일하지 않은 폴리펩티드 사슬들로 구성되는 다른 단백질들에 적용되는 점이 이해될 것이다.

표적 단백질들은 또한 폴리머, 캐리어, 보조제, 면역독소(immunotoxin), 또는 검출 가능한(예를 들면, 형광성, 발광성 또는 방사성) 성분(moiety)의 하나 또는 그 이상에 결합될 수 있다. 예를 들면, 재조합 단백질은 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol)에 결합될 수 있고, 이는 작은 단백질들의 분자량을 증가시키거나 및/또는 순환 체류 시간을 증가시키는 데 이용될 수 있다.

유전자 조작된 세포들

여기에 기재되는 유전자 조작된 세포들(예를 들면, 야로위아(Yarrowia) 세포들)은 pYPS1 및 pYPS2 활성들의 결핍을 함유한다. 예를 들면, 이러한 유전자 조작된 세포는 기능(functional) pYPS1 및/또는 기능 pYPS2의 검출 가능한 레벨들을 생산하지 않을 수 있다. 이러한 결핍들은 적어도 두 가지 내인성 앱신(endogenous yapsin) 유전자들, 예를 들면, YPS1(Genolevures 참조 번호: YALI0E10175g; 유전자 ID: 2912589) 및 YPS2(Genolevures 참조 번호: YALI0E22374g; 유전자 ID: 2912981)의 소거 또는 분쇄에 의해 야로위아(Yarrowia) 세포들 내에서 생산될 수 있고, 이들은 pYPS1 및 pYPS2를 각기 코딩한다. pYPS1 및 pYPS2의 아미노산 배열은 각기 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4 내에 설정된다(도 1b 참조). 또한, 젠뱅크 기탁 번호 XP_503768.1, GI:50552716 및 XP_504265.1, GI:50553708을 각기 참조하기 바란다.

상동 재조합(homologous recombination)은 내인성 유전자를 분쇄하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, "유전자 치환(gene replacement)" 벡터가 선택 표지 유전자(marker gene)를 포함하는 방식으로 조합될 수 있다. 상기 선택 표지 유전자는 5' 및 3' 말단에서 상동 재조합을 매개하도록 충분한 길이의 유전자의 일부들에 대해 작동 가능하게 연관될 수 있다. 상기 선택 표지는 URA3, LEU2 및 HIS3 유전자들을 포함하여 숙주 세포 영양 요구를 보충하거나 항생물질 내성을 제공하는 유전자들의 임의의 숫자의 하나가 될 수 있다. 다른 적합한 선택 표지들은 클로람페니콜 내성(chloramphenicol resistance)을 효모 세포들에 부여하는 CAT 유전자, 또는 β-갈락토시다제(galactosidase)에 기인하는 블루 콜로니들(blue colon)을 야기하는 lacZ 유전자를 포함한다. 상기 유전자 치환 벡터의 선형화된 DNA 조각들은 이후에 해당 기술 분야에서 잘 알려진 방법들(하기 참조)을 이용하여 상기 세포들 내로 도입된다. 게놈(genome) 내로의 선형 조각들의 통합과 상기 유전자의 분쇄는 선택 표지에 근거하여 결정될 수 있으며, 예를 들면, 서던 블롯 분석(Southern blot analysis)에 의해 입증될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유전자의 분쇄는 기능 pYPS1 및 기능 pYPS2를 코딩하는 mRNA 분자들의 검출 가능한 레벨들을 생산하지 않는 상기 유전자 재조합 균주(strain)를 야기한다.

선택에 이의 사용에 후속하여, 선택 표지는, 예를 들면, Cre-loxP 시스템들(예를 들면, Gossen 등의 "Ann. Rev. Genetics"(36:153-173 (2002)) 및 미국 공개 특허 제2006/0014264호 참조)에 의해 상기 숙주 세포의 게놈으로부터 제거될 수 있다. 마커 제거의 과정은 "큐어링(curing)"으로 언급된다.

선택적으로는, 유전자 치환 벡터는 분쇄되는 유전자의 일부를 포함하게 하는 방식으로 조합될 수 있으며, 여기서 상기 일부는 임의의 내인성 유전자 프로모터 서열이 결핍되고 상기 유전자의 코딩되는 서열을 아무 것도 코딩하지 않거나, 비활성 조각을 코딩한다. "비활성 조각(inactive fragment)"은, 예를 들면, 상기 유전자의 전체 길이를 코딩하는 서열로부터 생산되는 단백질의 활성의 약 10% 이하(예를 들면, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 또는 0%)를 가지는 단백질을 코딩하는 유전자의 조각이다. 상기 유전자의 이러한 부분은 알려진 프로모터(promotor)가 상기 유전자 서열에 동작 가능하게 연결되지 않지만, 정지 코돈과 전사 종결 서열이 상기 유전자 서열의 일부에 동작 가능하게 연결되는 방식으로 벡터 내에 삽입된다. 이러한 벡터는 후속하여 상기 유전자 서열의 일부 내에 선형화될 수 있고, 세포 내로 형질 전환될 수 있다. 단일 상동 재조합에 의하여, 이러한 선형화된 벡터는 이후에 상기 유전자의 내인성 대항자 내에 통합된다.

일부 실시예들에 있어서, RNA 분자는 pYPS1 및/또는 pYPS2 활성을 갖는 단백질의 기능 발현을 간섭하도록 도입되거나 발현될 수 있다. RNA 분자들은, 예를 들면, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 쇼트 헤어핀(short hairpin) RNA(shRNA), 안티 센스(anti-sense) RNA, 또는 마이크로 RNA(miRNA)를 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, pYPS1 및/또는 pYPS2 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 하나 또는 그 이상의 내인성 유전자들의 프로모터 또는 인핸서 요소들이 변경되어 이들의 코딩된 단백질들의 발현이 변경된다.

유전 공학을 위해 적합한 세포들은 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 세포들 및 다른 연관 이형성 효모 세포들과 같은 야로위아(Yarrowia) 세포들을 포함한다. 이러한 세포들은, 여기에 특정되는 바와 같은 유전자 조작 이전에, 다양한 상업적 소스들과, 예를 들면, American Type Culture Collection(ATCC)(마나사스, 버지니아)과 같은 연구 자원 회사들로부터 얻어질 수 있다. 일 실시예에 있어서, 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)의 po1d 균주가 이용된다. 상기 po1d 균주는 Centre International de Ressources Microbienne에서 기탁 번호 139의 CLIB 컬처 콜렉션(culture collection)으로 입수 가능하다. 상기 po1d 균주에 있어서, 분비된 알칼리성 세포외 프로테아제(protease) AEP(유전자 XPR2)는 소거되었고, 산성 세포외 프로테아제 AXP1(유전자 AXP)은 유전자 분쇄와 표적 유전자의 삽입에 의해 제거되거나 발효 배지의 pH에 의해 조절될 수 있다.

여기에 기술되는 유전자 조작된 세포들은 다른 아스파르트산 프로테아제들, 예를 들면, 프로테이나제(proteinase) A(PEP4 유전자에 의해 코딩된)와 같이 EC 3.4.23 하에서 분류되는 아스파르트산 프로테아제들의 결핍들을 더 포함할 수 있다.

여기서 기술하는 유전자 조작된 세포들은 표적 단백질(예를 들면, 항체로서 앞에서 언급되는 표적 단백질)을 코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있다. "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"라는 용어들은 여기서 상호 교환적으로 사용되며, cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 및 DNA(또는 RNA)를 함유하는 핵산 유사형들을 포함하여 RNA 및 DNA 모두를 언급한다. 핵산들은 임의의 3차원 구조를 가질 수 있다. 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥(즉, 센스 가닥(sense strand) 또는 안티센스 가닥)으로 될 수 있다. 핵산들의 제한적이지 않은 예들은, 유전자들, 유전자 조각들, 엑손들(exons), 인트론들(introns), 전령 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, siRNA, 마이크로-RNA, 리보자임(ribozyme), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드들, 분기된 폴리뉴클레오티드들, 플라스미드들(plasmids), 벡터들, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브들(probes), 그리고 프라이머들(primers)뿐만 아니라 핵산 유사형들을 포함한다. "폴리펩티드" 및 "단백질"은 여기서 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 길이나 번역후 변형에 관계없이 임의의 아미노산들의 펩티드 연관 사슬을 의미한다.

"분리된 핵산"은 자연 발생되는 게놈(예를 들면, 효모 게놈) 내의 핵산의 일측 또는 양측들에 정상적으로 플랭크(flank)되는 핵산들을 포함하여, 자연 발생되는 게놈 내에 존재하는 다른 핵산 분자들로부터 분리되는 핵산을 언급한다. 핵산들에 대하여 여기서 사용되는 바와 같은 "분리된(isolated)"이라는 용어는 또한 이러한 자연적이지 않게 발생되는 서열들이 자연에서는 발견되지 않고 자연 발생되는 게놈 내의 즉각적인 연속 서열들을 가지지 않기 때문에 임의의 자연적이지 않게 발생되는 핵산 서열을 언급한다.

분리된 핵산은, 예를 들면, 자연 발생되는 게놈 내의 DNA 분자가 제거되거나 존재하지 않는 즉각적인 플랭킹이 정상적으로 발견되는 핵산 서열들의 하나를 제공하였던 DNA 분자가 될 수 있다. 따라서, 분리된 핵산은, 제한되지는 않지만, 다른 서열들뿐만 아니라 벡터, 자동적으로 복제되는 플라스미드, 바이러스(예를 들면, 임의의 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 아데노바이러스(adenovirus), 또는 헤르페스 바이러스(herpes virus)) 내로, 혹은 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 통합되는 벡터 내로 통합되는 DNA와 독립적인 별도의 분자(예를 들면, 화학적으로 합성된 핵산, 또는 cDNA 혹은 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 처리에 의해 생산되는 게놈 DNA 조각)로서 존재하는 DNA 분자를 포함한다. 또한, 분리된 핵산은 하이브리드 또는 융합 핵산의 일부인 DNA 분자와 같이 조작된 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, cDNA 라이브러리들 또는 게놈 라이브러리들, 혹은 게놈 DNA 제한 소화물을 함유하는 겔(예를 들면, 전기영동 겔) 슬라이스들 내의 수백 또는 수백만의 다른 핵산들 중에 존재하는 핵산은 분리된 핵산으로 간주되지 않는다.

핵산과 특정 숙주 세포를 참조하여 여기서 사용되는 바에 있어서 "외인성(exogenous)"이라는 용어는 자연에서 발견되는 바와 같은 특정 세포 내에 발생되지 않는(그리고 그로부터 얻을 수 없는) 임의의 핵산을 언급한다. 따라서, 자연적이지 않게 발생되는 핵산은 숙주 세포 내로 도입되면 상기 숙주 세포에 대해 외인성으로 간주된다. 자연적이지 않게 발생되는 핵산들이 전체로서는 자연에 존재하지 않도록 제공되는 자연에서 발견되는 핵산 서열들의 핵산 하위 서열들 또는 조각들을 함유할 수 있는 점에 주목하는 것이 중요하다. 예를 들면, 발현 벡터 내의 핵산 분자를 함유하는 게놈 DNA 서열은 자연적이지 않게 발생되는 핵산이며, 이에 따라 전체(게놈 DNA 플러스 벡터 DNA)로서 핵산 분자가 자연에서 존재하지 않기 때문에 숙주 세포 내로 도입되면 상기 숙주 세포에 대해 외인성이 된다. 따라서, 전체로서는 자연에 존재하지 않는 임의의 벡터, 자동적으로 복제되는 플라스미드, 또는 바이러스(예를 들면, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)는 자연적이지 않게 발생되는 핵산으로 간주된다. 이는 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생산되는 게놈 DNA 조각들뿐만 아니라 cDNA들이 이들이 자연에서 분리된 분자들로 존재하기 때문에 자연적이지 않게 발생되는 핵산으로 간주되는 점을 수반한다. 이는 또한 자연에서 발견되지 않는 임의의 핵산을 함유하는 프로모터 서열 및 배열 내의 폴리펩티드를 코딩하는 서열(예를 들면, cDNA 또는 게놈 DNA)이 자연적이지 않게 발생되는 핵산인 점을 수반한다. 자연 발생되는 핵산은 특정 세포에 대해 외인성이 될 수 있다. 예를 들면, 효모 x의 세포로부터 분리되는 전체 크로모솜(chromosome)은 크로모솜이 효모 y의 세포 내로 도입되면 효모 y의 세포에 대하여 외인성 핵산이다.

재조합 핵산은 스페로플라스트(spheroplast) 기술 또는 전세포 염화리튬 효모 형질전환 방법과 같은 다양한 방법들을 이용하여 플라스미드, 파지(phage), 트란포손(transposon), 코스미드(cosmid) 또는 바이러스 입자와 같은 발현 벡터의 형태 내의 세포 내로 도입될 수 있다. 세포들 내로의 플라스미드들 또는 핵산 벡터들의 형질전환을 위해 유용한 다른 방법들은, 예를 들면, 미국 특허 제4,929,555호; Hinnen 등의 "Proc. Nat. Acad. Sci. USA "(75:1929, (1978)); Ito 등의 "J. Bacteriol."(153:163, (1983)); 미국 특허 제4,879,231호; 그리고 Sreekrishna 등의 "Gene"(59:115, (1987))에 개시되어 있다. 전기천공법(electroporation) 및 PEG1000 전세포 형질전환 과정들 또한 Cregg와 Russel의 "Methods in Molecular Biology"(Pichia Protocols, Chapter 3, Humana Press, Totowa, N.J., pp.27-39(1998))에 기재되어 있는 바와 같이 이용될 수 있다.

형질전환된 효모 세포들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 요구되는 생화학 생성물(세포의 영양요구성)로 인해)의 부존재에서 형질전환 후의 영양요구성 세포들의 배양, 새로운 표현형을 위한 선택과 검출, 또는 형질 전환체들 내에 함유되는 내성 유전자의 부존재에서 상기 효모에 대해 독성인 항생제의 존재에서의 배양을 포함하는 기술들을 이용하여 선택될 수 있다. 형질 전환체들도 선택될 수 있거나 및/또는 상기 게놈 내로의 발현 카세트의 통합에 의해 입증될 수 있으며, 이는, 예를 들면 서던 블롯 또는 PCR 분석들에 의해 평가될 수 있다.

야로위아(Yarrowia) 세포와 같은 세포 내로 상기 벡터들을 도입하기 이전에, 상기 벡터들은 에스캐리키아 콜리(Escherichia coli: E. coli)와 같은 박테리아 세포들 내에서 성장(예를 들면, 증폭)될 수 있다. 상기 벡터 DNA는 박테리아 환경으로부터 벡터 DNA의 정제를 가져오는 해당 기술 분야에서 알려진 방법들의 임의의 것에 의해 박테리아 세포들로부터 분리될 수 있다. 상기 정제된 벡터 DNA는 에스캐리키아 콜리(E. coli) 단백질들이 플라스미드 DNA 제조에 존재하지 않는 점을 확보하도록 페놀, 클로로포름 및 에테르로 광범위하게 추출될 수 있다.

편입형 벡터들(integrative vectors)은, 예를 들면, 미국 특허 제4,882,279호에 개시되어 있다. 편입형 벡터들은 일반적으로 적어도 제1 삽입 가능 DNA 조각, 선택 표지 유전자 및 제2 삽입 가능 DNA 조각의 직렬로 배열된 서열을 포함한다. 상기 제1 및 제2 삽입 가능 DNA 조각들은 각기 길이가 약 200의(예를 들면, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 혹은 약 1000 또는 그 이상의) 뉴클레오티드들이며, 형질 전환되는 종들의 게놈 DNA의 일부들에 상응하는 뉴클레오티드 서열들을 가진다. 발현을 위해 관심의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 유전자(예를 들면, 표적 단백질을 코딩하는 유전자)가 상기 표지 유전자의 전에 또는 후에 상기 제1 및 제2 삽입 가능 DNA 조각들 사이의 이러한 벡터 내에 삽입된다. 편입형 벡터들은 숙주 세포 게놈 내로 관심의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 통합을 용이하게 하도록 효모 형질 전환이전에 선형화될 수 있다.

발현 벡터는 효모(예를 들면, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 알룰라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans) 또는 다른 연관 이형성 효모 종들) 프로모터의 조절 하의 재조합 핵산을 특징으로 할 수 있으며, 이는 이들을 효모 내에서 발현되게 할 수 있다. 적합한 효모 프로모터들은 TEF1, HP4D, GAP, POX2, ADC1, TPI1, ADH2, POX 및 Gal10 프로모터를 포함한다. 예를 들면, Madzak 등의 "J. Mol. Microbiol. Biotechnol."(2:207-216, (2000)) 및 Guarente 등의 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA"(79(23):7410, (1982))를 참조 바란다. 추가적인 적합한 프로모터들은, 예를 들면, Zhu 및 Zhang의 "Bioinformatics"(15(7-8):608-611, (1999))와 미국 특허 제6,265,185호에 기재되어 있다.

프로모터는 조합될 수 있거나 유도될(조건적으로) 수 있다. 조합되는 프로모터는 표준 배양 조건들 하에서 그 발현이 불변이거나 실질적으로 불변인 프로모터로 이해된다. 유도 가능한 프로모터들은 하나 또는 그 이상의 유도 신호들(induction cues)에 반응하는 프로모터들이다. 예를 들면, 유도 가능한 프로모터는, 화학적으로 조절될(예를 들면, 그 전사 활성화가 알콜, 테트라사이클린(tetracycline), 스테로이드(steroid), 금속 또는 다른 작은 분자와 같은 화학 유도제의 존재 또는 부존재에 의해 조절되는 프로모터) 수 있거나, 물리적으로 조절될(예를 들면, 광 또는 높거나 낮은 온도와 같은 물리적 유도자들의 존재 또는 부존재에 의해 조절되는 프로모터) 수 있다. 유도 가능한 프로모터는 또한 이들이 화학적 또는 물리적 신호들에 의해 직접 조절하는 조절되는 하나 또는 그 이상 전자 인자들에 의해 간접적으로 조절될 수 있다.

여기에 기술되는 유전자 조작된 세포들은 하나 또는 그 이상의 추가적인 변형들을 더 포함할 수 있으므로, 상기 세포들이 상기 표적 단백질 상에 원하는 N-글리칸(glycan)을 생산할 수 있다. 상기 추가적인 변형들은, (i) N-글리코실화 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 내인성 유전자의 소거 또는 분쇄; (ii) N-글리코실화 활성을 갖는 단백질(예를 들면, 내인성 또는 외인성 단백질)의 돌연변이체 형태(즉, N-글리코실화 활성을 갖는 돌연변이체 단백질을 발현시키는)를 코딩하는 재조합 핵산의 도입; (iii) 상기 N-글리코실화 활성을 갖는 단백질의 기능 발현을 간섭하는 RNA 분자의 도입 또는 발현; (iv) N-글리코실화 활성을 갖는 야생형(예를 들면, 내인성 또는 외인성) 단백질(즉, N-글리코실화 활성을 갖는 단백질을 발현시키는)을 코딩하는 재조합 핵산의 도입; 그리고 (v) N-글리코실화 활성을 갖는 단백질들을 코딩하는 하나 또는 그 이상의 내인성 유전자들의 프로모터들 또는 인핸서들을 변경하여 이에 따라 잘못 코딩된 단백질들의 발현을 변형하는 것의 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 상기 사항 (ii)가, 예를 들면, 그렇게 치환되는 내인성 유전자에 대해 보다 큰 N-글리코실화 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자로의 내인성 유전의 대체를 포함하는 점이 이해될 것이다. 유전자 조작은 또한 첨가들(예를 들면, 이종 서열), 소거들 또는 치환들(예를 들면, 점 돌연변이들; 보존적 또는 비보존적 돌연변이들과 같은 돌연변이들)을 갖는 단백질을 생산하도록 N-글리코실화 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 내인성 유전자를 변경하는 것을 포함한다. 돌연변이들은 특이적으로 도입될(예를 들면, 위치지정 돌연변이들 또는 상동 재조합) 수 있거나, 임의적으로 도입될(예를 들면, 예를 들면, Newman 및 Ferro-Novick의 "J. Cell Biol."(105(4):1587, (1987)에 기재된 바와 같이 화학적으로 돌연변이될 수 있는 세포들) 수 있다. 변형들은, 예를 들면, WO 2011/061629 및 WO 2011/039634에 기재되어 있는 것들을 포함할 수 있다.

이러한 추가적인 유전자 변형들은, (i) 유전적으로 변형된 세포 내의 하나 또는 그 이상의 N-글리코실화 활성들의 증가, (ii) 유전적으로 변형된 세포 내의 하나 또는 그 이상의 N-글리코실화 활성들의 감소, (iii) 유전적으로 변형된 세포 내의 하나 또는 그 이상의 N-글리코실화 활성들의 국소화 또는 세포내의 분산의 변화, 또는 (iv) 유전적으로 변형된 세포 내의 하나 또는 그 이상 N-글리코실화 활성들의 비율의 변화의 하나 또는 그 이상을 야기할 수 있다. N-글리코실화 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질들의 과발현, 내인성 유전자의 복제 수의 증가(예를 들면, 유전자 중복), 또는 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현의 증가를 자극하는 내인성 유전자의 프로모터 또는 인핸서의 변경에 기인할 수 있는 점이 이해될 수 있을 것이다. 하나 또는 그 이상의 N-글리코실화 활성들의 감소는, 활성들을 변경시키는 N-글리코실화를 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질들의 돌연변이체 형태(예를 들면, 지배적인 저해 형태)의 과발현, N-글리코실화 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질들의 발현을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 간섭 RNA 분자들의 발현의 도입, 또는 N-글리코실화 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 하나 또는 그 이상의 내인성 유전자의 소거 또는 분쇄에 기인할 수 있다. 유전자 조작된 변형들은 조건적이 될 수 있는 점이 이해될 것이다. 예를 들면, 유전자는, 예를 들어 Cre-loxP 시스템(예를 들면, Gossen 등의 "Ann. Rev. Genetics"(36:153-173, (2002)) 및 미국 특허 출원 공개 제2006/0014264호를 참조 바란다)과 같은 부위 특이적 DNA 리콤비나제(recombinase)를 이용하여 조건적으로 소거될 수 있다.

N-글리코실화 활성을 갖는 단백질들은, 예를 들면, 외측 사슬 신장(Outer CHain elongation: OCH1) 단백질, α-1,2-만노시다제, 아스파라긴 결합 글리코실화 3(Asparagine Linked Glycosylation 3: ALG3) 단백질, I-1,3-글루코실트란스페라제(glucosyltransferase), 글루코시다제(glucosidase), 만노시다제 II, GlcNAc-트란스페라제(transferase) I(GnT I), GlcNAc-트란스페라제 II(GnT II), 또는 갈락토실트란스페라제(galactosyltransferase)(Gal T)를 포함한다.

분비된 단백질 상의 원하는 N-글리칸은, 예를 들면, Man₅GlcNAc₂또는 Man₃GlcNAc₂구조에 기초할 수 있다. 예를 들면, Man₅GlcNAc₂계 기초 구조를 생성하기 위하여, 야로위아(Yarrowia) 세포들은 I-1,2-만노시다제 활성이 세포내 구간에서 증가하고 OCH1 활성이 감소되도록 조작될 수 있다. 기초 구조를 생성하기 위하여, ALG3의 활성과, 일부 실시예들에 있어서, OCH1가 감소되고, I-1,2-만노시다제의 활성과, 일부 실시예들에 있어서, I-1,3-글루코실트란스페라제의 활성이 감소된다. 이러한 효모 세포들 내에서 생성되는 단백질들의 N-글리칸 프로파일은, GlcNAc 트란스페라제 I(GnT I) 활성, 만노시다제 II(Man II) 활성, GlcNAc 트란스페라제 II(GnT II) 활성, 글루코시다제 II 활성, 그리고 갈락토실트란스페라제(Gal T) 활성의 하나 또는 그 이상의 활성을 함유하도록 상기 세포를 더 조작하여 변경될 수 있다. 예를 들면, Man₅GlcNAc₂또는 Man₃GlcNAc₂N-글리칸들을 생산하는 야로위아(Yarrowia) 세포 내에 GnT I를 발현시키는 것은 상기 Man₅GlcNAc₂또는 Man₃GlcNAc₂N-글리칸들에 대한 GlcNAc 성분의 전사를 야기하여 GlcNAcMan₅GlcNAc₂또는 GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-글리칸들이 각기 생산되게 한다. GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-글리칸들을 생산하는 세포들에 있어서, 만노시다제 II를 발현시키는 것은 GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-글리칸들을 생산하도록 GlcNAcMan₅GlcNAc₂N-글리칸들로부터 제거되는 두 만노스 잔기들(mannose residues)을 야기한다. GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-글리칸들을 생산하는 세포들에 있어서, GnTII를 발현시키는 것은 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-글리칸들을 생산하도록 GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-글리칸들에 대한 다른 GlcNAc 성분의 전사를 야기한다. GlcNAcMan₃GlcNAc₂또는 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-글리칸들을 생산하는 세포들 내에 Gal T를 발현시키는 것은 GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂또는 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-글리칸들을 생산하도록 GlcNAcMan₃GlcNAc₂또는 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N-글리칸들에 대한 갈락토스의 전사를 야기한다. 일부 실시예들에 있어서, 글루코시다제(glucosidase)(예를 들면, α 및 β 서브유닛들을 발현시킴에 의해)가 상기 Man₃GlcNAc₂ 기초 구조의 생산을 증가시키도록 발현될 수 있다.

N-글리코실화 활성을 갖는 단백질들을 코딩하는 유전자들은 이러한 유전자들을 함유하는 임의의 종들로부터 유래될 수 있다. 그로부터 N-글리코실화 활성을 갖는 단백질들을 코딩하는 유전자들을 얻을 수 있는 예시적인 균류 종들은, 제한되는 것은 아니지만, 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 보비스(Pichia bovis), 피치아 카나덴시시(Pichia canadensis), 피치아 카르소니(Pichia carsonii), 피치아 파리노스(Pichia farinose), 피치아 페르멘탄스(Pichia fermentans), 피치아 플룩숨(Pichia fluxuum), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 칸디다 발리다(Candida valida), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 아스칼라피다룸(Candida ascalaphidarum), 칸디다 암피시에(Candida amphixiae), 칸디다 안타르크티카(Candida Antarctica), 칸디다 아틀란티카(Candida atlantica), 칸디다 아트모스파에리카(Candida atmosphaerica), 칸디다 블라태(Candida blattae), 칸디다 카르포필라(Candida carpophila), 칸디다 세람비시다룸(Candida cerambycidarum), 칸디다 차울리오데스(Candida chauliodes), 칸디다 코리달리스(Candida corydalis), 칸디다 도세이(Candida dosseyi), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis), 칸디다 에르가텐시스(Candida ergatensis), 칸디다 프루크투스(Candida fructus), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 페르멘타티(Candida fermentati), 칸디다 구일리에르몬디(Candida guilliermondii), 칸디다 하에물로니(Candida haemulonii), 칸디다 인세크타멘스(Candida insectamens), 칸디다 인세크토룸(Candida insectorum), 칸디다 인테르메디아(Candida intermedia), 칸디다 제프레시(Candida jeffresii), 칸디다 케피르(Candida kefyr), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 루시타니아에(Candida lusitaniae), 칸디다 리속소필라(Candida lyxosophila), 칸디다 말토사(Candida maltosa), 칸디다 멤브라니파시엔스(Candida membranifaciens), 칸디다 밀레리(Candida milleri), 칸디다 올레오필라(Candida oleophila), 칸디다 오레고넨시스(Candida oregonensis), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 쿠에르시트루사(Candida quercitrusa), 칸디다 쉐하테아(Candida shehatea), 칸디다 템노칠라에(Candida temnochilae), 칸디다 테누이스(Candida tenuis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 트수치야에(Candida tsuchiyae), 칸디다 시놀라보란티움(Candida sinolaborantium), 칸디다 소자에(Candida sojae), 칸디다 비스와나티(Candida viswanathii), 칸디다 우틸리스(Candida utilis), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 실베스트리스(Pichia silvestris), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 초다티(Pichia chodati), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia menbranaefaciens), 피치아 미누스쿨레(Pichia minuscule), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 슈도폴리모르파(Pichia pseudopolymorpha), 피치아 쿠에르쿰(Pichia quercuum), 피치아 로베르트시(Pichia robertsii), 피치아 사이토리(Pichia saitoi), 피치아 실베스트리시(Pichia silvestrisi), 피치아 스트라스부르겐시스(Pichia strasburgensis), 피치아 테리콜라(Pichia terricola), 피치아 바르리지(Pichia vanriji), 슈도지마 안타르크티카(Pseudozyma Antarctica), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 몸드수리쿠스(Saccharomyces momdshuricus), 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 비스포루스(Saccharomyces bisporus), 사카로미세스 케발리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로미세스 델브루에키(Saccharomyces delbrueckii), 사카로미세스 엑시구오우스(Saccharomyces exiguous), 사카로미세스 페르멘타티(Saccharomyces fermentati), 사카로미세스프라길리스(Saccharomyces fragilis), 사카로미세스 마르시아누스(Saccharomyces marxianus), 사카로미세스 멜리스(Saccharomyces mellis), 사카로미세스 로세이(Saccharomyces rosei), 사카로미세스 로욱시(Saccharomyces rouxii), 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로미세스 윌리아누스(Saccharomyces willianus), 사카로미코데스 루드위기(Saccharomycodes ludwigii), 사카로미콥시스카프술라리스(Saccharomycopsis capsularis), 사카로미콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 사카로미콥시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 엔도미세스 호르데이(Endomyces hordei), 엔도미콥시스 포불리게라(Endomycopsis fobuligera). 사투르니스포라 사이토이(Saturnispora saitoi), 쉬조사카로미세스 옥토스포루스(Schizosaccharomyces octosporus), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 쉬반니오미세스 옥시텐탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 토룰라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 토룰라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 사카로미세스 다이렌시스(Saccharomyces dairensis), 토룰라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 토룰라스포라페르멘타티(Torulaspora fermentati), 사카로미세스 페르멘타티(Saccharomyces fermentati), 토룰라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 토룰라스포라 로세이(Torulaspora rosei), 사카로미세스 로세이(Saccharomyces rosei), 토룰라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 사카로미세스 로세이(Saccharomyces rosei), 토룰라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 사카로미세스 델브루에키(Saccharomyces delbrueckii), 토룰라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 사카로미세스 델브루에키(Saccharomyces delbrueckii), 지고사카로미세스 몬골리쿠스(Zygosaccharomyces mongolicus), 도룰라스포라 글로보사(Dorulaspora globosa), 데바리오미세스 글로보수스(Debaryomyces globosus), 토룰롭시스 글로보사(Torulopsis globosa), 트리코스포론 쿠타네움(Trichosporon cutaneum), 트리고놉시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis), 윌리옵시스 칼리포르니카(Williopsis californica), 윌리옵시스 사투르누스(Williopsis saturnus), 지고사카로미세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 지고사카로미세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 데바리오미세스 디스포루아(Debaryomyces disporua). 사카로미세스 비스포라스(Saccharomyces bisporas), 지고사카로미세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 사카로미세스 비스포루스(Saccharomyces bisporus), 지고사카로미세스 멜리스(Zygosaccharomyces mellis), 지고사카로미세스 프리오리아누스(Zygosaccharomyces priorianus), 지고사카로미세스 로욱심(Zygosaccharomyces rouxiim), 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii), 지고사카로미세스 바르케리(Zygosaccharomyces barkeri), 사카로미세스로욱시(Saccharomyces rouxii), 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii), 지고사카로미세스 마조르(Zygosaccharomyces major), 사카로미세스 로우시(Saccharomyces rousii), 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 보비스(Pichia bovis), 피치아 카나덴시스(Pichia Canadensis), 피치아 카르소니(Pichia carsonii), 피치아 파리노세(Pichia farinose), 피치아 페르멘탄스(Pichia fermentans), 피치아 플룩숨(Pichia fluxuum), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 슈도폴리모르파(Pichia pseudopolymorpha), 피치아 쿠에르쿰(Pichia quercuum), 피치아 로베르트시(Pichia robertsii), 슈도지마 안타르크티카(Pseudozyma Antarctica), 로도스포리디움(Rhodosporidium toruloides), 로도스포리디움(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라(Rhodotorula glutinis), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 비스포루스(Saccharomyces bisporus), 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 케발리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로미세스 델브루에키(Saccharomyces delbrueckii), 사카로미세스 페르멘타티(Saccharomyces fermentati), 사카로미세스프라길리스(Saccharomyces fragilis), 사카로미코데스 루드비기(Saccharomycodes ludwigii), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 쉬반니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 토룰라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 토룰라스포라 글로보사(Torulaspora globosa), 트리고놉시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis), 윌리옵시스 칼리포르니카(Williopsis californica), 윌리옵시스 사투르누스(Williopsis saturnus), 지고사카로미세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 지고사카로미세스 멜리스(Zygosaccharomyces mellis), 지고사카로미세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii), 또는 해당 기술 분야에서 알려지거나 여기에 기재되는 임의의 다른 균류들(예를 들면, 효모)을 포함한다.

예시적인 하등 진핵생물들은 또한, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아스페르길루스 카에시엘루스(Aspergillus caesiellus), 아스페르길루스 칸디두스(Aspergillus candidus), 아스페르길루스 카르네우스(Aspergillus carneus), 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 데플렉투스(Aspergillus deflectus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 글라우쿠스(Aspergillus glaucus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니케르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스페르길루스 페니실로이데스(Aspergillus penicilloides), 아스페르길루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus), 아스페르길루스 소자에(Aspergillus sojae), 아스페르길루스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스페르길루스 타마리(Aspergillus tamari), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 우스투스(Aspergillus ustus), 또는 아스페르길루스 베르시콜로르(Aspergillus versicolor)를 포함하는 아스페르길루스(Aspergillus)의 다양한 종들을 포함한다.

그로부터 N-글리코실화 활성을 갖는 단백질들을 코딩하는 유전자들을 얼들 수 있는 예시적인 원생동물 유전자들은, 제한되지는 않지만, 블라스토크리티디아(Blastocrithidia), 크리티디아(Crithidia), 엔도트리파눔(Endotrypanum), 헤르페토모나스(Herpetomonas), 레이쉬마니아(Leishmania), 렙토모나스(Leptomonas), 피토모나스(Phytomonas), 트리파노소마(Trypanosoma)(예를 들면, T. 브루세이(bruceii), T. 감비엔스(gambiense), T. 로데시엔스(rhodesiense) 및 T. 크루지(cruzi)), 그리고 왈라세이나(Wallaceina)를 포함한다.

예를 들면, 상기 GnT I를 코딩하는 유전자는 인간(스위스 단백질 기탁 번호: P26572), 쥐, 아라비돕시스(Arabidopsis), 생쥐, 또는 드로소필라(Drosophila)로부터 얻을 수 있고; 상기 Gnt II를 코딩하는 유전자는 인간, 쥐(스위스 단백질 기탁 번호: Q09326), 아라비돕시스(Arabidopsis), 또는 생쥐로부터 얻을 수 있으며; 상기 Man II를 코딩하는 유전자는 인간, 쥐, 아라비돕시스, 생쥐, 드로소필라(Drosophila)(스위스 단백질 기탁 번호: Q24451)로부터 얻을 수 있고; 상기 Gal T를 코딩하는 유전자는 인간(스위스 단백질 기탁 번호: P15291), 쥐, 생쥐 또는 소로부터 얻을 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 여기에 기술되는 유전자 조작된 세포는 pYPS1 및 pYPS2 활성들의 결핍들을 가지는 것 이외에도 다음 변형들의 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 유전자 조작된 세포는 상기 OCH1(젠뱅크® 기탁 번호: AJ563920) 유전자 또는 이의 유전자 생성물(mRNA 또는 단백질)이 더 결핍될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 유전자 조작된 세포는 상기 ALG3(젠뱅크® 기탁 번호들: XM_503488, Genolevures 참조 번호: YALI0E03190g) 유전자 또는 이의 유전자 생성물(mRNA 또는 단백질)이 더 결핍될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 유전자 조작된 세포는 I-1,3-글루코실트란스페라제(예를 들면, ALG6, 젠뱅크® 기탁 번호들: XM_502922, Genolevures 참조 번호: YALI0D17028g) 단백질을 더 발현(예를 들면, 과발현)시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 유전자 조작된 세포는 I-1,2-만노시다제(예를 들면, 젠뱅크® 기탁 번호: AF212153) 단백질을 더 발현시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 유전자 조작된 세포는 GlcNAc-트란스페라제 I(예를 들면, 스위스 단백질 기탁 번호: P26572) 단백질을 더 발현시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 유전자 조작된 세포는 만노시다제 II 단백질 또는 이의 촉매 도메인(catalytic domain)(예를 들면, 스위스 단백질 기탁 번호: Q24451)을 더 발현시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 유전자 조작된 세포는 갈락토실트란스페라제 I 단백질 또는 이의 촉매 도메인(예를 들면, 스위스 단백질 기탁 번호: P15291)을 더 발현시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유전자 조작된 세포는 GlcNAc-트란스페라제 II 단백질 또는 이의 촉매 도메인(예를 들면, 스위스 단백질 기탁 번호: Q09326)을 더 발현시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유전자 조작된 세포는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei) 또는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger)의 글루코시다제 II와 같은 글루코시다제 II의 알파 또는 베타 서브유닛(또는 알파 및 베타 서브 유닛들 모두)을 더 발현시킬 수 있다. 유전자 조작된 세포는 이들 변형들의 임의의 결합들을 가질 수 있다.

예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 유전자 조작된 세포는 상기 OCH1 유전자가 결핍될 수 있고, I-1,2-만노시다제, GlcNAc-트란스페라제 I, 만노시다제 II, 그리고 갈락토실트란스페라제 I를 발현시킬 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 유전자 조작된 세포는 상기 ALG3 유전자가 결핍될 수 있고, I-1,2-만노시다제, GlcNAc-트란스페라제 I, GlcNAc-트란스페라제 I, 그리고 갈락토실트란스페라제 I를 발현시킬 수 있다. 이러한 유전자 조작된 세포는 I-1,3-글루코실트란스페라제를 더 발현시킬 수 있거나 및/또는 글루코시다제 II의 알파 및 베타 서브유닛들을 발현시킬 수 있거나 및/또는 상기 OCH1 유전자가 결핍될 수 있다.

이러한 단백질들의 하나 또는 그 이상은 이종의 표적화하는 서열을 함유하는 융합 단백질들일 수 있다. 예를 들면, 상기 I-1,2-만노시다제는 HDEL 소포체(endoplasmic reticulum: ER)-보유 아미노산 서열을 가질 수 있다. It is understood that any protein having N-글리코실화 활성을 갖는 임의의 단백질들이 HDEL 서열을 포함하는 융합 단백질 내로 조작될 수 있는 점이 이해될 것이다. 다른 단백질들은 골지체(Golgi apparatus)로 상기 단백질을 표적화시키는 이종의 서열들을 가질 수 있다. 예를 들면, 효모 Kre2p 유전자에 의해 코딩되는 제1의 100 N-말단 아미노산들, S. 세레비시아제(cerevisiae) Mnn2 유전자에 코딩되는 제1의 36 N-말단 아미노 산들(스위스 단백질 기탁 번호: P38069), 또는 S. 세레비시아제(cerevisiae) Mnn2p 유전자에 의해 코딩되는 제1의 46 N-말단 아미노산들이 단백질들을 상기 골지체로 표적화시키는 데 이용될 수 있다. 이와 같이, 균류 세포 내에 발현되는 단백질을 코딩하는 핵산들은 세포내 구간에 상기 코딩된 단백질을 표적화시키는 표적화 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 I-1,2-만노시다제는 상기 ER로 표적화될 수 있는 반면, 상기 GnT I, GnT II, 만노시다제 및 Gal T는 상기 골지체로 표적화될 수 있다.

N-글리코실화 활성을 갖는 표적 단백질 또는 단백질이 그 내로 상기 단백질이 발현되는 세포 보다는 다른 유형인((예를 들면, 다른 종들인) 세포로부터 유도되는 실시예들에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 핵산은 관심의 대상이 되는 특정 세포 내의 발현을 위한 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들면, 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)로부터의 N-글리코실화를 갖는 단백질을 코딩하는 핵산은 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)와 같은 효모 세포 내의 발현을 위해 코돈 최적화 될 수 있다. 이러한 코돈 최적화는 관심의 대상이 되는 세포 내의 단백질의 발현의 증가를 위해 유용할 수 있다. 단백질을 코딩하는 핵산을 코돈 최적화하기 위한 방법들은 해당 기술 분야에서 알려져 있고, 예를 들면, Gao 등("Biotechnol. Prog."(2004) 20(2): 443 -448), Kotula 등("Nat . Biotechn ." (1991) 9, 1386-1389) 및 Bennetzen 등("J. Biol . Chem ."(1982) 257(6):2036-3031)에 기재되어 있다. 표 1은 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)를 위한 코돈 사용 빈도를 나타낸다. 데이터는 5,967의 코딩 서열들 내에 존재하는 2,945,919의 코돈들로부터 유도되었다. 표 1의 내용들은 코돈 사용 빈도 데이터베이스로부터 얻어졌으며, 이는 웹 사이트 kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=284591에서 찾아볼 수 있다.

야로위아 리폴리티카 코돈 사용 빈도표

UUU 15.9( 46804)	CU 21.8( 64161)	AU 6.8( 20043)	GU 6.1( 17849)
UUC 23.0( 67672)	CC 20.6( 60695)	AC 23.1( 68146)	GC 6.1( 17903)
UUA 1.8( 5280)	CA 7.8( 22845)	AA 0.8( 2494)	GA 0.4( 1148)
UUG 10.4( 30576)	CG 15.4( 45255)	AG 0.8( 2325)	GG 12.1( 35555)

CUU 13.2( 38890)	CU 17.4( 51329)	AU 9.6( 28291)	GU 6.0( 17622)
CUC 22.6( 66461)	CC 23.3( 68633)	AC 14.4( 42490)	GC 4.4( 12915)
CUA 5.3( 15548)	CA 6.9( 20234)	AA 9.8( 28769)	GA 21.7( 63881)
CUG 33.5( 98823)	CG 6.8( 20042)	AG 32.1( 94609)	GG 7.7( 22606)

AUU 22.4( 66134)	CU 16.2( 47872)	AU 8.9( 26184)	GU 6.7( 19861)
AUC 24.4( 71810)	CC 25.6( 75551)	AC 31.3( 92161)	GC 9.8( 28855)
AUA 2.2( 6342)	CA 10.5( 30844)	AA 12.4( 36672)	GA 8.4( 24674)
AUG 22.6( 66620)	CG 8.5( 25021)	AG 46.5(136914)	GG 2.4( 7208)

GUU 15.8( 46530)	CU 25.5( 75193)	AU 21.5( 63259)	GU 16.6( 48902)
GUC 21.5( 63401)	CC 32.7( 96219)	AC 38.3(112759)	GC 21.8( 64272)
GUA 4.0( 11840)	CA 11.2( 32999)	AA 18.8( 55382)	GA 20.9( 61597)
GUG 25.7( 75765)	CG 8.9( 26190)	AG 46.2(136241)	GG 4.4( 12883)

상기 표 항목들은 [트리플렛][빈도: 1000 당]([개])로 나타낸다.

일부 실시예들에 있어서, 인간 표적 단백질들이 상기 세포 내로 도입될 수 있고, N-글리코실화 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 내인성 효모 단백질이 억제될(예를 들면, 소거되거나 돌연변이되는) 수 있다. 균류 글리코실화 경로를 "인간화(humanizing)"하기 위한 기술들은, 예를 들면, Choi 등의 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA"(100(9): 5022-5027V); Vervecken 등의 "Appl. Environ. Microb."(70(5): 2639-2646 (2004)); 및 Gerngross의 "Nature Biotech."(22(11): 1410-1414 (2004))에 기재되어 있다.

상기 유전자 조작이 수반되는 경우, 예를 들면, 단백질의 발현 또는 외인성 단백질(내인성 단백질의 돌연변이체 형태를 포함하는)의 발현의 변화의 경우, 다양한 기술들이 상기 유전자 변형 세포들이 상기 단백질을 발현시키는 지를 결정하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 상기 단백질 자체의 존재는, 예를 들면, 노던 블롯(Northern Blot) 또는 RT-PCR 분석 혹은 웨스턴 블롯 분석(Western Blot analysis)을 각기 이용하여 검출될 수 있다. N-글리코실화 활성을 갖는 단백질의 세포내 국소화는 초원심세포분획법 및 면역형광법을 포함하는 다양한 기술들을 이용하여 분석될 수 있다.

표적 단백질의 글리코실화를 검출하기 위한 방법들은 DNA 시퀀서 보조(sequencer-assisted: DSA), 플루오로포어 보조 탄수화물 전기영동(fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis: FACE) 또는 표면 강화 레이버 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry: SELDI-TOF MS)를 포함한다. 예를 들면, 분석은, 당단백질들이, 예를 들면 막 상의 고정화에 수반하여 변성되는 DSA-FACE를 활용할 수 있다. 상기 당단백질들은 이후에 디티오트레이톨(dithiothreitol: DTT) 또는 β-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)과 같은 적합한 감소제로 감소될 수 있다. 상기 단백질의 설프히드랄기들(The sulfhydryl groups)은 요오도 아세트산(iodoacetic acid)과 같은 산을 이용하여 카르복실화될 수 있다. 다음에, 상기 N-글리칸들은 N-글리코시다제 F와 같은 효소를 이용하여 상기 단백질로부터 해리될 수 있다. N-글리칸들은, 선택적으로 환원성 아미노화에 의해 재조합 및 유도체 합성될 수 있다. 상기 유도체 합성된 N-글리칸들은 이후에 농축될 수 있다. N-글리칸 분석을 위해 적합한 기기 장치는, 예를 들면, ABI PRISM® 377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems)를 포함한다. 데이터 분석은, 예를 들면, GENESCAN® 3.1 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 수행될 수 있다. 선택적으로는, 분리된 만노프로테인들(mannoproteins)은 이들의 N-글리칸 상태를 확인하도록 하나 또는 그 이상의 효소들로 더 처리될 수 있다. N-글리칸 분석의 추가적인 방법들은, 예를 들면, 질량 분석(예를 들면, MALDI-TOF-MS), 정성, 역상 및 이온 교환 크로마토그래피 상의 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)(예를 들면, 글리칸들이 레벨화되지 않을 때에는 펄스 전류 검출로 및 글리칸글이 적절하게 라벨화되는 경우에는 UV 흡수 또는 형광으로)을 포함한다. 또한, Callewaert 등의 "Glycobiology"(11(4):275-281, (2001)) 및 Freire 등의 "Bioconjug . Chem ."(17(2):559-564, (2006))을 참조하기 바란다.

여기에 기술되는 상기 유전자 조작된 세포들의 유전자 변형들의 임의의 것이 유도 신호(예를 들면, 화학적 또는 물리적 신호)의 존재상에서 유도 가능하거나 조건적인 경우, 상기 유전자 조작된 세포는, 선택적으로는 상기 핵산의 도입 동안에 또는 후속하여 유도제의 존재에서 배양될 수 있다. 예를 들면, 상기 표적 단백질을 코딩하는 핵산의 도입에 후속하여, 상기 세포는 N-글리코실화 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질들의 발현을 증진시킬 수 있는 화학적 유도제에 노출될 수 있다. 다중 유도 신호들이 N-글리코실화 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질들의 조건적 발현을 유도하는 경우, 세포는 다중 유도제들에 접촉될 수 있다.

원하는 N-글리칸을 포함하도록 변형된 표적 단백질들은 상기 유전자 조작된 세포로부터 분리될 수 있다. 상기 변형된 표적 단백질은 상기 효모 세포 내에 유지될 수 있고 세포 분쇄에 따라 방출될 수 있거나, 상기 변형된 표적 단백질이 코딩 서열에 의한 메커니즘(상기 외인성 핵산에 고유하거나 상기 발현 벡터 내로 조작되는)을 거쳐 배양 배지 내로 분비될 수 있으며, 이는 상기 세포로부터 상기 단백질의 분비를 안내한다. 상기 세포 용해물 또는 배양 배지 내의 변형된 표적 단백질의 존재는 상기 단백질의 존재를 검출하기 위한 다양한 표준 프로토콜들에 의해 입증될 수 있다. 이러한 프로토콜은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 변경된 표적 단백질(또는 상기 표적 단백질 자체)을 위한 항체 특이성을 갖는 면역 블로팅 또는 방사성 면역 침전(radioimmunoprecipitation), 변경된 표적 단백질(또는 상기 표적 단백질 자체)을 위한 리간드 특이성을 갖는 결합, 또는 변형된 표적 단백질(또는 상기 표적 단백질 자체)의 특이적 효소 활성을 위한 시험을 포함할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 유전자 조작된 세포로부터 분리된 상기 표적 단백질의 적어도 약 25%는 원하는 N-글리칸을 함유한다. 예를 들면, 상기 유전자 조작된 세포로부터 분리된 상기 표적 단백질들의 적어도 약 27%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 혹은 적어도 약 99%가 원하는 N-글리칸을 함유할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 분리되고 변형된 표적 단백질들은 동결되고, 동결 건조되거나 고정되며, 예를 들면, 상기 변경된 표적 단백질들이 생리적 활성을 유지하게 하는 적절한 조건들 하에서 저장될 수 있다.

조작된 세포들의 배양들

본 발명은 또한 여기에 기재되는 유전자 조작된 세포들의 임의의 것의 실질적으로 순수한 배양을 제공한다. 여기에 사용되는 바에 있어서, 유전자 조작된 세포의 "실질적으로 순수한 배양(substantially pure culture)"은 상기 배양 내의 생존 가능한 세포들의 전체 숫자의 약 40% 이하(즉, 약 35%; 30%; 25%; 20%; 15%; 10%; 5%; 2%; 1%; 0.5%; 0.25%; 0.1%; 0.01%; 0.001%; 0.0001% 이하, 또는 심지어 그 이하)가 상기 유전자 조작된 세포, 예를 들면, 박테리아, 균류(효모를 포함하는), 마이스코플라스마(mycoplasmal), 또는 원생동물 세포들 외에 생존 가능한 세포들인 이러한 세포의 배양이다. 본 명세서에서 "약"이라는 용어는 특정한 퍼센티지 이상 또는 특정한 퍼센티지 아래의 퍼센티지의 15%가 될 수 있는 적절한 퍼센티지를 의미한다. 따라서, 예를 들면, 약 20%는 17% 내지 23%가 될 수 있다. 유전자 조작된 세포들의 이러한 배양은 상기 세포들과 성장, 저장 또는 이송 매체를 포함한다. 매체는 액체, 반고체(예를 들면, 젤리 같은 매체), 또는 동결될 수 있다. 상기 배양은 상기 액체 내 또는 상기 반고체 매체 내/상에서 성장하거나, 동결된 저장 혹은 이송 매체를 포함하는 저장 또는 이송 매체 내에서 저장되거나 이송되는 세포들을 포함한다. 상기 배양들은 배양 용기 또는 저장 용기 혹은 기판(예를 들면, 배양 접시, 플라스크, 또는 튜브 혹은 저장 바이알이나 튜브) 내에 존재한다.

여기서 기술되는 유전자 조작된 세포들은, 예를 들면 동결된 세포 현탁액들로서, 예를 들면 글리세롤(glycerol) 또는 수크로스(sucrose)와 같은 동해방지제를 함유하는 완충액 내에서 동결 건조된 세포들로 저장될 수 있다. 선택적으로는, 이들은, 예를 들면, 유동층 건조 혹은 스프레이 건조, 또는 임의의 다른 적합한 건조 방법에 의해 얻어지는, 예를 들면 건조된 세포 침전물로 저장될 수 있다.

다음은 본 발명의 실시의 예들이다. 이들은 어떤 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 간주되지는 않는다.

실험예들

실험예 1

야로위아 리폴리티카( Yarrowia lipolytica ) 내로의 항체 유전자들의 도입

항-HER2 항체 H 및 L 사슬들을 위한 아미노산 서열들을 Carter 등의 "Proc Natl Acad Sci USA,"(89(10): 4285-4289 (1992)); 및 Ward 등의 "Appl Environ Microbiol."(70(5): 2567-2576 (2004))로부터 얻었다. 관련된 아미노산 서열들은 역으로 변역되었고, 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)를 위해 코돈 최적화되었으며, aGenArt(레겐스부르그, 독일)에 의해 합성되었다. 매우 높은(＞80%) 또는 매우 낮은(＜30%) GC 함량의 영역들은 가능한 경우에 방지되었다. 최적화 과정들 동안에, 다음의 시스-작용 서열 모티프들(cis-acting sequence motifs) 또한 방지되었다. 내부 TATA-박스들, chi-부위들 및 리보솜 유입 부위들, AT-리치 또는 GC-리치 서열 스트레치들(stretches), 반복 서열들 및 RNA 이차 구조들뿐만 아니라 (은성(cryptic)) 스플리스 도너 및 어셉터 부위들.

상기 단백질들의 분비를 가능하게 하기 위하여, Lip2 단백질 '프레포(prepro)' 신호(펩티드 링커 'GGG'의 경우에 수반되는)의 코딩 서열은 상기 L사슬 및 H사슬들 각각을 위한 코딩 서열의 5' 영역에 첨가되었다. CACA 인핸서 요소는 또한 상기 L 및 H사슬 코딩 서열들 각각을 위한 개시 코돈(ATG)에 5' 첨가되었다. 결과물인 상기 L사슬을 코딩하는 조합은 길이가 769의 뉴클레오티드들이었고, 5'에서 3'으로 조직화되는 다음 도메인들을 함유하였다. cacaATGprepro 신호, 가변 영역(V_L) 및 불변 영역(C_L). 상기 L사슬(LC) 조합의 뉴클레오티드 서열이 도 1a에 나타난다(SEQ ID NO:1). 상기 코딩된 LC 단백질은 길이가 251의 아미노산들이고 대략 25kDa이다. 도 1c는 밑줄을 그은 LIP2 프레프로 리더 서열, 이중선으로 밑줄을 그은 V_L 도메인 서열(V _L 도메인), 그리고 점선으로 밑줄을 그은 Ck1 도메인(Ck1 도메 인)을 가지는 상기 LC의 아미노산 서열을 나타낸다.

H사슬(HC)을 코딩하는 결과물인 조합은 길이가 1482의 뉴클레오티드들이었고, 5'에서 3'까지 조직화되는 다음 도메인들을 함유하였다. 상기 cacaATGprepro 신호, 상기 가변 영역(V_H) 및 세 개의 불변 영역들(C_H1-3). "힌지(hinge)" 영역은 C_H1 및 C_H2을 가로질렀다. 상기 H사슬 조합의 뉴클레오티드 서열이 도 1a에 나타나 있다(SEQ ID NO:2). 상기 코딩된 H사슬 단백질은 길이가 486의 아미노산들이며 대략 55kDa이다. 도 1d는 밑줄을 그은 LIP2 프레프로 리더 서열, 이중선으로 밑줄을 그은 V_H 도메인 서열(V _H 도메인) 및 점선으로 밑줄을 그은 CH 도메인을 가지는 상기 HC의 아미노산 서열을 나타낸다.

상기 HER2 L사슬을 코딩하는 조합 및 상기 HE2 H사슬을 코딩하는 조합은 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 게놈 내로의 표적화된 통합을 위해 URA3 또는 LIP2 로쿠스(locus)를 활용하여 BamHI/AvrII 조각들로서 pJME 벡터 내로 복제되었으며, pJME927PTLipUra3exPOX2 preproHerHC 또는 pJME923PTUraLeu2ExPOX2 preproHerLC로 호칭되었다. 트랜스포손(transposon) 요소들은 사용되지 않았다. 상기 pJME 플라스미드는 애스캐리키아 콜리(E. coli) 또는 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 내의 복제를 할 수 있는 셔틀 벡터(shuttle vector)이며, 박테리아 및 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 특이적 서열들 모두를 포함한다. 상기 플라스미드의 박테리아 부분은 플라스미드 pHSS6으로부터 유도되며, 복제의 박테리아 기원(ori)과 내성을 카나마이신(kanamycin)에 부여하는(KanR) 카나마이신 내성 유전자를 포함한다. 상기 플라스미드의 통합 카세트 부분은 선택 표지 유전자(예를 들면, LEU2 또는 URA3)에 함유되었고 발현 카세트는 hp4d 또는 POX2 프로모터 및 LIP2 유전자의 터미네이터와 프레임 내에 αHER2 L사슬 또는 H사슬 코딩 서열을 삽입하는 다중 복제 부위(MCS)로 구성되었다. 상기 플라스미드들은 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 세포들의 형질 전환 전에 상기 통합 카세트를 방출하도록 NotI로 소화되었다.

상기 NotI-소화된 H사슬 발현 플라스미드는 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 균주 Po1d((MatA ura3-302 leu2-270 xpr2-322) 내로 도입되었다. 상기 URA3 로쿠스 내로의 상기 H사슬 발현 카세트의 통합은 서던 분석을 통해 입증되었다. 상기 전체 항체를 발현시키는 균주를 조합하기 위하여, 상기 NotI-소화된 L사슬은 상기 H사슬 발현 균주 내로 도입되었다. 다시, 상기 LIP2 로쿠스 내로의 상기 L사슬 발현 카세트의 통합은 서던 분석에 의해 입증되었다. 도 2는 균주 계도를 묘사한다.

실험예 2

항체의 분절 부위의 식별

H사슬 및 L사슬 플라스미드들 모두를 위해 적극적인 형질 변환체들이 SuperT 리치 매체 내에서 96시간 동안 배양되었다. 4가지 다른 클론들의 배양으로부터의 상청액(supernatant)이 거두어졌고 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다. 상기 L사슬은 생쥐(제품 #1939, 아브캠®(abcam®)) 내에서 생산된 단일 클론 항인간 Kappa 프리 L사슬 항체(4C11)를 이용하여 검출되었다. 상기 H사슬은 생쥐(Sigma의 제품 # I5885) 내에서 생산된 단일클론 항인간 IgG(감마 사슬 특이적) 항체를 이용하여 검출되었다. 상기 L사슬은 정확한 분자량(25kDa)에서 존재하였지만, 이량체로 되는(dimerize) 경향을 나타내었다. H사슬은 또한 정확한 분자량(50kDa)에서 존재하였지만, 대부분이 대략 32kDa의 분자량을 갖는 분해된 생성물로서 존재하였다. 도 3을 참조하기 바란다.

야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) Po1d 세포들에 의해 생산된 상기 H사슬의 분해 부위를 확인하기 위하여, 상기 H사슬 생성물들은 단백질 G 크로마토그래피를 이용하여 정제되었고, N-말단 펩티드 서열화가 수행되었다. 이는 주요 항체 분절이 상기 C_H1-힌지 영역 내의 Lys-Lys 결합에서 발생되는 점을 드러낸다.

실험예 3

야로위아 리폴리티카( Yarrowia lipolytica )의 단일 앱신 균주들의 조합

앱신 프로테아제들이 상기 H사슬의 분해를 책임지는 지를 결정하기 위하여, 단일 앱신 녹 아웃(knockout) 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 균주들이 생산되었다. 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica)(Yl)의 다음의 앱신3 유사 유전자들의 서열들을 National Center for Biotechnology database(인터넷 웹 사이트 .ncbi.nlm.nih.gov)로부터 얻었다.

YPS1: YALI0E10175g 유전자 ID: 2912589, pYPS1을 코딩

YPS2: YALI0E22374g 유전자 ID: 2912981, pYPS2를 코딩

YPS3: YALI0E20823g 유전자 ID: 2911836, pYPS3을 코딩

YPS4: YALI0D10835g 유전자 ID: 2910442, pYPS4를 코딩

YPS5: YALI0A16819g 유전자 ID: 2906333, pYPS5를 코딩

YPSX: YALI0C10135g 유전자 ID: 7009445, pYPSX를 코딩

YPS7: YALI0E24981g 유전자 ID: 2912672, pYPS7을 코딩

YPSXp: YALI0E34331g 유전자 ID: 2912367, pYPSXp를 코딩

각 앱신 오픈 리딩 프레임(ORF) 표적 서열을 플랭킹하는 상기 프로모터("P") 및 터미네이터("T) 영역들이 P 및 T 조각들을 수득하도록 프라이머들(primers)의 쌍들을 이용하여 증폭되었다. 상기 P 및 T 조각들은 이후에 고유 복제(제한) 부위들(ISce1 및 ICeu1)을 포함하였던 프라이머 쌍들을 이용하여 증폭되었으며, 이는 상기 P 및 T 조각들이 후속하는 PCR 동안에 융합되게 하였고 이후에 OXYP 플라스미드의 NotI 애스캐리키아 콜리(E. coli) 성분 내로 복제되었다. 따라서, 각 최종 분쇄 조합(카세트)은 각 말단에서 NotI 제한 부위들을 함유하였고, 상기 P 및 T 조각들의 융합 영역은 하나는 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) 마커의 삽입을 위한 것이고 하나는 관심의 대상이 되는 유전자에 동작 가능하게 결합되는 프로모터의 삽입을 위한 것인 전술한 두 복제(제한) 부위들을 포함하였으므로, 상기 분쇄 조합들도 표적화되는 통합 조합들로서 사용될 수 있었다. 상기 분쇄 조합은 도 4에 도표화되어 표시된다.

각 앱신 분쇄 카세트는 상술한 야로위아 리폴리티카(Y. lipolytica) po1d 항체 발현 균주 내로 독립적으로 형질 전환되었다. 상기 로쿠스의 분쇄는 서던 블롯 또는 PCR 분석에 의해 입증되었다. 단일 앱신 결실된 균주들이 yps1, yps2, yps3, yps4, yps5 그리고 yps7을 위해 수득되었다.

개개의 분쇄자들을 나타내는 고유 클론들뿐만 아니라 비-앱신 결실된 균주(ctrl)가 쉐이크 플라스크(shake flask) 내의 SuperT 리치 매체 내에서 별도로 성장되었다. 배양 상청액 샘플들은 접종원 후의 48시간 및 96시간에서 취해졌고, 생쥐(Sigma, I5885, 단일클론 항인간 IgG) 내에서 생산되는 감마 사슬 특이적 항인간 IgG 항체를 이용하여 H사슬 분해를 평가하도록 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다. 상기 L사슬과의 교차 재활성은 관찰되지 않았다. Δyps2, Δyps3, Δyps5, Δyps7 및 Δypsx 결실 균주들을 위하여, 단백질 가수 분해의 감소가 컨트롤에 대해 48시간 또는 96시간에서 관찰되지 않았다. 도 5의 상측 패널을 참조하기 바란다.

상기 Δyps1 및 Δyps4 결실 균주들을 위하여, 각 균주의 두 클론들이 쉐이크 플라스크 내의 SuperT 매체 내에서 성장되었고, 배양 상청액 샘플들은 접종원 후의 96시간에서 취해졌으며, 상기 컨트롤 균주에 대한 H사슬 분해를 위해 평가되었다. 상기 Δyps1 균주들을 위하여, 비록 광범위한 분해가 남아 있었지만, 상기 Δyps4 및 컨트롤 균주들 모두와 비교할 경우에 32kDa의 분해 생성물의 감소된 양이 관찰되었다. 도 5의 하측 패널을 참조하기 바란다.

상기 Δyps1 결실 균주 내의 분해를 더 평가하기 위하여, 상기 균주는 superT 매체 내에서 성장되었고, 배양 상청액 샘플들이 접종원 후 24시간, 40시간, 48시간, 60시간, 72시간 및 96시간에서 취해졌으며, H사슬 분해가 상기 컨트롤 균주에 대해 평가되었다. 모든 시점들을 위하여, 상기 컨트롤 균주와 비교하여 32kDa의 단백질 가수 분해 생성물의 감소가 관찰되었다. 후의 시점들에서, 보다 많은 분해 생성물이 검출되었지만, 여전히 컨트롤 균주들 내에 관찰된 분해 보다 낮은 레벨로 남아 있었다. 이들 결과들은 상기 Δyps1 균주 내의 상기 단백질 가수 분해 활성의 부분적 감소가 있었음을 나타낸다.

두 앱신 유전자들의 분쇄가 단백질 가수 분해를 더 감소시키는 지를 결정하기 위하여, 제2의 앱신 유전자가 상기 Δyps1 배경에서 분쇄되었다. 다음의 네 균주들이 생산되었다. Δyps1Δyps2, Δyps1Δyps3, Δyps1Δyps4 및 Δyps1Δyps7. 상기 유전자들의 정확한 분쇄는 서던 분석에 의해 입증되었다.

상기 Δyps1Δyps2, Δyps1Δyps3 및Δyps1Δyps4 균주들과 컨트롤 균주들(비-앱신 결실, Δyps1, 그리고 Δyps1 URA-영양 요구성)이 배양되었다. 상청액 샘플들은 접종원 후 96시간에서 취해졌으며 웨스턴 블로팅이 수행되었다. 도 6에 도시한 바와 같이, 상기 Δyps3.1Δyps3.2 균주 내에서 H사슬 분해 생성물이 관찰되지 않았다. 그러나, 전체 길이 H사슬 생성물(50kDa)의 양의 전반적인 증가는 관찰되지 않았다. Δyps1Δyps3, Δyps1Δyps4 그리고 컨트롤 균주들에 있어서, H사슬 분해 생성물들이 검출되었다.

활성의 분비된 항체의 양은 상기 Δyps1Δyps2 균주 내에서 결정되었고, ELISA를 통해 비분쇄된 균주의 경우와 비교되었다. 전체 기능적인 분비된 생성물의 증가는 검출되지 않았다.

Δyps1Δyps2 균주로부터 유도된 단백질 G 정제된 항체는 은 오염된 SDS-PAGE 겔 상의 H사슬 분해 생성물들의 완전한 부존재를 보였다. 도 7을 참조하기 바란다.

다른 실시예들

본 발명을 그 상세한 설명과 관련하여 기술하였지만, 상술한 설명은 예시적으로 의도된 것이며 첨부된 특허청구범위의 범주에 의해 한정되는 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다. 다른 측면들, 이점들 및 변형들도 다음 특허청구범위의 범주에 속한다.

SEQUENCE LISTING <110> Oxyrane UK Limited <120> METHODS AND MATERIALS FOR REDUCING DEGRADATION OF RECOMBINANT PROTEINS <130> 18990-0033WO1 <150> 61/581,859 <151> 2011-12-30 <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 769 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression construct <400> 1 ggatcccaca atgaagcttt ccaccatcct tttcacagcc tgcgctaccc tggctgccgc 60 cctcccttcc cccatcactc cttctgaggc cgcagttctc cagaagcgag gcggcggcga 120 cattcagatg actcagtctc cctcttctct gtctgcttct gtgggtgacc gagtgaccat 180 tacctgtcga gcttctcagg acgtgaacac tgctgttgct tggtatcagc agaagcctgg 240 aaaggctcct aagctgctga tctactctgc ctctttcctg tactctggcg tgccttctcg 300 attttctggc tctcgatctg gaaccgactt caccctgacc atttcttctc tgcagcctga 360 ggactttgct acctactact gtcagcagca ttacaccacc cctcctactt ttggacaggg 420 caccaaggtt gagattaagc gaaccgtggc tgctccttct gtgttcattt tccccccctc 480 tgacgagcag ctgaagtctg gaactgcttc tgttgtgtgc ctgctgaaca acttttaccc 540 ccgagaggct aaggttcagt ggaaggtgga caacgctctg cagtctggaa actctcagga 600 gtctgttact gagcaggact ctaaggactc gacctactct ctctcttcta ccctgaccct 660 gtctaaggct gactacgaga agcataaggt gtacgcttgt gaggttaccc atcagggact 720 gtcctctccc gtgaccaagt cttttaaccg aggcgagtgc taacctagg 769 <210> 2 <211> 1482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression construct <400> 2 gcaacggatc ccacaatgaa gctttccacc atccttttca cagcctgcgc taccctggct 60 gccgccctcc cttcccccat cactccttct gaggccgcag ttctccagaa gcgaggcggc 120 ggcgaggttc agctggttga gtctggtgga ggactggttc agcctggtgg atctctgcga 180 ctgtcttgtg ctgcttctgg cttcaacatc aaggacacct acattcattg ggtccgacag 240 gctcccggaa agggactgga gtgggttgcc cgaatctacc ctaccaacgg ctacactcga 300 tacgctgact ctgtgaaggg acgattcacc atttctgccg acacctctaa gaacactgcc 360 tacctgcaga tgaactctct gcgagctgag gacactgctg tgtactactg ttctcgatgg 420 ggaggtgacg gtttttacgc catggactac tggggacagg gaactctggt gaccgtttct 480 tctgcttcta ccaagggacc ttctgtgttt cctctggccc cctcttctaa gtctacctct 540 ggtggaactg ctgctctggg atgtctggtg aaggactact ttcctgagcc tgtgactgtg 600 tcttggaact ctggcgctct gacttctggt gttcacacct tccctgctgt tctgcagtcc 660 tctggactgt actctctctc ttctgtggtg accgtgcctt cttcttctct gggaacccag 720 acctacatct gtaacgtgaa ccacaagccc tctaacacta aggtggacaa gcgagtggag 780 cctaagtctt gtgacaagac ccatacctgt cccccttgtc ctgctcctga gctgctggga 840 ggaccctctg tttttctgtt cccccccaag cctaaggaca ccctgatgat ttctcgaacc 900 cctgaggtga cctgtgttgt ggtggacgtt tctcatgagg accctgaggt gaagtttaac 960 tggtacgtgg acggtgttga ggttcacaac gctaagacta agccccgaga ggagcagtac 1020 aactctactt accgagtggt gtctgtgctg actgttctgc atcaggactg gctgaacgga 1080 aaggaataca agtgtaaggt ctccaacaag gctctgcctg ctcctattga aaagaccatc 1140 tctaaggcta agggacagcc cagagagcct caggtttaca ctctgccccc ttcccgagag 1200 gagatgacca agaaccaggt gtccctgact tgtctggtca agggattcta cccctctgac 1260 attgctgttg agtgggagtc taacggacag cctgagaaca actacaagac cacccctcct 1320 gttctggact ctgacggctc tttcttcctg tactctaagc tgaccgtgga caagtctcga 1380 tggcagcagg gaaacgtgtt ctcttgttcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1440 acccagaagt ctctgtctct gtctcccggc aagtaaccta gg 1482 <210> 3 <211> 534 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 3 Met His Phe Ser Asn Phe Leu Leu Gly Ala Leu Ala Ala Thr Ala Ala 1 5 10 15 Ala Lys Asn Thr Tyr Gln Ile Asn Lys Tyr Gly Ser Pro Leu Thr Asn 20 25 30 Gln Lys Arg Ser Leu Ser Glu Asn Ser Val Val Gln Leu Asp Thr Val 35 40 45 Gly Val Arg Ser Ile Arg Asp Glu Pro Ala Pro Arg Asp Ala Ala Leu 50 55 60 Met Lys Arg Gln Thr Ala Thr Leu Pro Leu Lys Asn Leu Val Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Glu Ala Glu Val Lys Ile Gly Thr Pro Ala Gln Thr Val Lys Leu 85 90 95 Leu Ile Asp Thr Gly Ser Ser Asp Ile Trp Val Ile Gly Ser Gly Asn 100 105 110 Pro Asp Cys Gly Ser Ala Gln Asp Ala Gln Arg Asp Pro Asn Ile Ile 115 120 125 Asp Cys Ser Ile Ser Gly Thr Phe Asp Thr Ser Lys Ser Ser Ser Trp 130 135 140 Ser Gln Asn Gln Thr Asp Phe Phe Ile Gln Tyr Gly Asp Gln Thr Ala 145 150 155 160 Ala Glu Gly Gly Trp Gly Thr Asp Thr Phe Ala Phe Gly Asn Thr Asn 165 170 175 Val Ser Gly Leu Ser Ile Ala Val Ala Ser Lys Thr Asn Ser Ser Asn 180 185 190 Gly Val Met Gly Ile Gly Leu Ala Gly Leu Glu Ser Thr Ile Thr Tyr 195 200 205 Arg Gly Asn Asp Gln Ile Ser Gly Asn Pro Tyr Glu Asn Leu Pro Met 210 215 220 Lys Met Lys Ala Glu Gly Leu Ile Lys Ala Asn Ala Tyr Ser Leu Trp 225 230 235 240 Leu Asn Asn Leu Ser Ser Asp Ser Gly Asn Val Leu Phe Gly Gly Val 245 250 255 Asp Tyr Ala Lys Ile Asp Gly Asp Leu Phe Thr Val Lys Leu Val Asn 260 265 270 Pro Gln Arg Ser Val Ser Ser Lys Pro Ile Ala Phe Tyr Val Gly Leu 275 280 285 Asp Ser Val Ser Ile Thr Asp Val Lys Gly Val Ser Gly Phe Ile Thr 290 295 300 Lys Gln Pro Val Pro Ala Leu Leu Asp Ser Gly Thr Thr Leu Thr Tyr 305 310 315 320 Leu Pro Gln Asp Ala Phe Asn Tyr Val Val Arg Ala Met Gly Ala Thr 325 330 335 Tyr Asp Pro Gln Asn Gly Tyr Val Cys Pro Cys Lys Asn Gly Tyr Ser 340 345 350 Gly His Leu Asp Tyr Asn Phe Ser Gly Ala Asn Ile Ser Val Pro Leu 355 360 365 Tyr Gln Leu Thr Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Ser Gln Ser Gly Arg Val 370 375 380 Val Asn Ala Gln Phe Arg Asn Gly Asp Asp Ala Cys Leu Leu Leu Met 385 390 395 400 Gln Ala Ser Gln Asp His Val Ile Leu Gly Asp Ser Phe Leu Arg Ala 405 410 415 Ala Tyr Val Val Tyr Asn Leu Asp Ser Tyr Glu Val Ser Met Gly Gln 420 425 430 Thr Lys Tyr Gly Val Thr Asp Thr Asn Ile Val Glu Ile Asp Ser Asn 435 440 445 Gly Val Lys Asn Ala Asn Pro Ala Pro Glu Tyr Ser Ser Ser Phe Thr 450 455 460 Asn Val Asn Ser Glu Thr Thr Ile Leu Arg Gly Ala Pro Gly Ser Ala 465 470 475 480 Asp Ser Asn Pro Ser Thr Thr Leu Ser Gly Gly Leu Val Ala Gly Ser 485 490 495 Ser Ala Ser Ser Gly Ser Ser Gly Asp Gly Lys Gly Lys Asn Asn Ala 500 505 510 Ala Gly Leu Glu Leu Ser Ile Val Gly Leu Ala Val Ala Val Val Met 515 520 525 Ala Ser Phe Gly Leu Met 530 <210> 4 <211> 727 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytic <400> 4 Met Lys Ser Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ala Val Pro Ala Thr Ala Gln 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Gly His Asp Thr Thr Asp Pro Arg His Gln 20 25 30 Ser Gln Asn His Leu Thr Lys Arg Lys Thr Val Glu Gln Asp Leu Val 35 40 45 Gln Lys Phe Ala Tyr Tyr Glu Ala Thr Val Ser Val Gly Thr Pro Gly 50 55 60 Gln Gln Ile Lys Leu Leu Leu Asp Thr Gly Ser Ser Asp Met Trp Val 65 70 75 80 Leu Gly Gln Asn Val Asn Cys Gly Gly Gly Gly Ile Phe Ser Gln Gly 85 90 95 Ile Asp Cys Thr Gln Ser Gly Val Phe Asp Thr Ser Lys Ser Ser Thr 100 105 110 Tyr His Lys Asn Glu Ser Ile Pro Phe Asp Ile Lys Tyr Ser Asp Gly 115 120 125 Ser Glu Ser Lys Gly Phe Tyr Gly Thr Asp Asn Leu Gly Leu Gly Gly 130 135 140 Thr Thr Leu Asn Asp Phe Thr Phe Ala Val Ala Asp Ser Ala Ser Asp 145 150 155 160 Gly Gln Ala Val Leu Gly Ile Gly Pro Ile Glu Asn Glu Gln Ser Leu 165 170 175 Tyr Thr Asp Asn Pro Val Ala Tyr Ala Asn Leu Pro Leu Ala Leu Met 180 185 190 Met Asp Gly Val Thr Lys Ser Ser Ala Phe Ser Leu Trp Leu Asn Asp 195 200 205 Lys Asp Ala Leu Lys Gly Ser Ile Leu Phe Gly Gly Tyr Asp Arg Ala 210 215 220 Lys Val Asp Gly Asp Leu Phe Thr Val Pro Ile Val Asn Leu Asn Pro 225 230 235 240 Gly Gly Gln Gly Arg Ser Arg Glu Tyr Asn Val Gly Leu Asp Ser Ile 245 250 255 Thr Val Gly Gly Lys Ser Val Gly Ser Ser Thr Pro Ala Leu Leu Asp 260 265 270 Ser Gly Thr Thr Leu Cys Asn Leu Pro Gln Glu Met Val Asp Ala Ile 275 280 285 Leu Ala Gln Phe Ser Gly Val Ser Asn Ser Leu Arg Ala Gly Tyr Tyr 290 295 300 Thr Lys Cys Ser Asn Val Pro Gln Gly Ser Ile Asp Phe Val Phe Ser 305 310 315 320 Gly Asn Lys Leu Thr Val Glu Leu Ala Asp Leu Met Lys Pro Leu Glu 325 330 335 Asn Pro Asp Gly Ser Lys Ile Thr Thr Asp Gly Glu Gln Ala Cys Gly 340 345 350 Ile Leu Val Thr Ser Asn Thr Asp Ser His Ser Ile Ser Asp Ser Val 355 360 365 Val Leu Gly Ala Ser Phe Leu Arg Ser Ala Tyr Val Val Tyr Asp Arg 370 375 380 Asp Ala Gln Lys Ile Met Met Gly Lys Ala Lys Tyr Gly Val Ser Ser 385 390 395 400 Ser Asp Ile Val Glu Leu Lys Asp Gly Ser Ser Glu Gly Val Ala Ser 405 410 415 Ala Glu Ser Ser Ala Glu Ser Ala Ala Ala Thr Ala Ser Ser Ser Ala 420 425 430 Gly Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ser Ser Gly Ala Ser Ser Ala Gly Ala 435 440 445 Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala 450 455 460 Ser Ala Ser Ala Ser Ala Thr Ala Thr Ser Glu Gly Asp Ser Gly Gln 465 470 475 480 Gly Val Ser Thr Met Ala Val Val Val Arg Pro Ser Asp Thr Arg Leu 485 490 495 Ser Ala Tyr Ile Thr Asn Ile Val Val Thr Pro Ser Ala Thr Pro Ala 500 505 510 Leu Ser Thr Val Ser Val Val Val Arg Pro Ser Asp Thr Arg Leu Ser 515 520 525 Ala Tyr Ile Thr Glu Ile Val Val Thr Pro Thr Ala Val Pro Phe Ser 530 535 540 Thr Val Val Ser Thr Thr Ala Ile Glu Ser Thr Glu Ile Val Thr Val 545 550 555 560 Thr Ser Cys Ser Asp Gly Lys Cys Glu His Ala Lys Ser Thr Val Tyr 565 570 575 Lys Ile Val Asp Ala Thr Val Thr Gln Thr Ile Trp Ser Cys Glu Gly 580 585 590 Asp Glu Ser Ala Thr Trp Ala Pro Ala Pro Thr Pro Glu Pro Gln Asn 595 600 605 Thr Gln Val Gln Asn Thr Pro Ala Tyr Gln Ala Pro Ser Ala Pro Pro 610 615 620 Val Phe Leu Pro Val Trp Gly Thr Gln Ser Asp Gly Glu Thr Val Thr 625 630 635 640 His Thr Glu Thr Ala Phe Phe Asn Pro Gln Thr Tyr Thr Gly Pro Pro 645 650 655 Ala Gln Pro Thr Gly Ala Ser Gly Gly Asn Gly Gly Asn Asn Gly Gly 660 665 670 Asn Asn Gly Gly Asn Asn Gly Gly Asn Asn Gly Gly Asn Gly Gly Asn 675 680 685 Asp Asn Asn Gly Gly Ser Ser Ser His Ser Ser Gly Ile Thr Gln Ala 690 695 700 Asn Gly Ala Ser Ser Ile Ser Pro Met Ile Ser Leu Val Val Leu Leu 705 710 715 720 Leu Ser Phe Leu Ile Trp Ala 725 <210> 5 <211> 757 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding light chain <400> 5 cacaatgaag ctttccacca tccttttcac agcctgcgct accctggctg ccgccctccc 60 ttcccccatc actccttctg aggccgcagt tctccagaag cgaggcggcg gcgacattca 120 gatgactcag tctccctctt ctctgtctgc ttctgtgggt gaccgagtga ccattacctg 180 tcgagcttct caggacgtga acactgctgt tgcttggtat cagcagaagc ctggaaaggc 240 tcctaagctg ctgatctact ctgcctcttt cctgtactct ggcgtgcctt ctcgattttc 300 tggctctcga tctggaaccg acttcaccct gaccatttct tctctgcagc ctgaggactt 360 tgctacctac tactgtcagc agcattacac cacccctcct acttttggac agggcaccaa 420 ggttgagatt aagcgaaccg tggctgctcc ttctgtgttc attttccccc cctctgacga 480 gcagctgaag tctggaactg cttctgttgt gtgcctgctg aacaactttt acccccgaga 540 ggctaaggtt cagtggaagg tggacaacgc tctgcagtct ggaaactctc aggagtctgt 600 tactgagcag gactctaagg actcgaccta ctctctctct tctaccctga ccctgtctaa 660 ggctgactac gagaagcata aggtgtacgc ttgtgaggtt acccatcagg gactgtcctc 720 tcccgtgacc aagtctttta accgaggcga gtgctaa 757 <210> 6 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain sequence <400> 6 Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Pro Ser Pro Ile Thr Pro Ser Glu Ala Ala Val Leu Gln Lys 20 25 30 Arg Gly Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 35 40 45 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 50 55 60 Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 65 70 75 80 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 85 90 95 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 100 105 110 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 115 120 125 Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 130 135 140 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 145 150 155 160 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 165 170 175 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 180 185 190 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 195 200 205 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 210 215 220 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 225 230 235 240 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 245 250 <210> 7 <211> 1465 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding heavy chain <400> 7 cacaatgaag ctttccacca tccttttcac agcctgcgct accctggctg ccgccctccc 60 ttcccccatc actccttctg aggccgcagt tctccagaag cgaggcggcg gcgaggttca 120 gctggttgag tctggtggag gactggttca gcctggtgga tctctgcgac tgtcttgtgc 180 tgcttctggc ttcaacatca aggacaccta cattcattgg gtccgacagg ctcccggaaa 240 gggactggag tgggttgccc gaatctaccc taccaacggc tacactcgat acgctgactc 300 tgtgaaggga cgattcacca tttctgccga cacctctaag aacactgcct acctgcagat 360 gaactctctg cgagctgagg acactgctgt gtactactgt tctcgatggg gaggtgacgg 420 tttttacgcc atggactact ggggacaggg aactctggtg accgtttctt ctgcttctac 480 caagggacct tctgtgtttc ctctggcccc ctcttctaag tctacctctg gtggaactgc 540 tgctctggga tgtctggtga aggactactt tcctgagcct gtgactgtgt cttggaactc 600 tggcgctctg acttctggtg ttcacacctt ccctgctgtt ctgcagtcct ctggactgta 660 ctctctctct tctgtggtga ccgtgccttc ttcttctctg ggaacccaga cctacatctg 720 taacgtgaac cacaagccct ctaacactaa ggtggacaag aaggtggagc ctaagtcttg 780 tgacaagacc catacctgtc ccccttgtcc tgctcctgag ctgctgggag gaccctctgt 840 ttttctgttc ccccccaagc ctaaggacac cctgatgatt tctcgaaccc ctgaggtgac 900 ctgtgttgtg gtggacgttt ctcatgagga ccctgaggtg aagtttaact ggtacgtgga 960 cggtgttgag gttcacaacg ctaagactaa gccccgagag gagcagtaca actctactta 1020 ccgagtggtg tctgtgctga ctgttctgca tcaggactgg ctgaacggaa aggaatacaa 1080 gtgtaaggtc tccaacaagg ctctgcctgc tcctattgaa aagaccatct ctaaggctaa 1140 gggacagccc agagagcctc aggtttacac tctgccccct tcccgagagg agatgaccaa 1200 gaaccaggtg tccctgactt gtctggtcaa gggattctac ccctctgaca ttgctgttga 1260 gtgggagtct aacggacagc ctgagaacaa ctacaagacc acccctcctg ttctggactc 1320 tgacggctct ttcttcctgt actctaagct gaccgtggac aagtctcgat ggcagcaggg 1380 aaacgtgttc tcttgttccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cccagaagtc 1440 tctgtctctg tctcccggca agtaa 1465 <210> 8 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain sequence <400> 8 Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Pro Ser Pro Ile Thr Pro Ser Glu Ala Ala Val Leu Gln Lys 20 25 30 Arg Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 35 40 45 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn 50 55 60 Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 65 70 75 80 Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr 85 90 95 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 100 105 110 Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 115 120 125 Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp 130 135 140 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 145 150 155 160 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 165 170 175 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 180 185 190 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 195 200 205 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 210 215 220 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 225 230 235 240 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 245 250 255 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 260 265 270 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 275 280 285 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 290 295 300 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 305 310 315 320 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 325 330 335 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 340 345 350 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 355 360 365 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 370 375 380 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 385 390 395 400 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 405 410 415 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 420 425 430 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 435 440 445 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 450 455 460 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 465 470 475 480 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485

Claims

pYPS1(YPS1 단백질) 활성의 결핍 및 pYPS2(YPS2 단백질) 활성의 결핍을 포함하도록 유전자 조작되는 분리된 야로위아(Yarrowia) 세포.
제 1 항에 있어서, 상기 세포는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세포는 표적 단백질(target protein)을 코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 3 항에 있어서, 상기 표적 단백질은, 리소좀 단백질(lysosomal protein), 병원체(pathogen) 단백질, 성장 인자, 시토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체 또는 이의 항원-결합 조각의 하나 또는 둘의 폴리펩티드 사슬들, 또는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 세포.
제 4 항에 있어서, 상기 항체는, 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF)를 결합하는 항체, 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR)에 결합되는 항체, CD3에 결합되는 항체, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF)에 결합되는 항체, TNF 수용체에 결합되는 항체, CD20에 결합되는 항체, 당단백질(glycoprotein) IIa/IIb 수용체에 결합되는 항체, IL2-수용체에 결합되는 항체, CD52에 결합되는 항체, CD11a에 결합되는 항체, 그리고 HER2에 결합되는 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
제 4 항에 있어서, 상기 항원-결합 조각은 Fab, F(ab')₂, Fv 그리고 단일 사슬 Fv(scFv) 조각들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 OCH1 활성이 더 결핍되는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 알파-1,2 만노시다제(mannosidase)를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 8 항에 있어서, 상기 알파-1,2 만노시다제는 상기 알파-1,2 만노시다제를 세포내 구간으로 표적화시키는 표적화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 ALG3 활성이 더 결핍되는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 알파-1,3-글루코실트란스페라제(glucosyltransferase)를 코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 글루코시다제(glucosidase)의 알파 및 베타 서브유닛들을 코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 GlcNAc-트란스페라제(transferase) I을 코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 13 항에 있어서, 상기 GlcNAc-트란스페라아제 I은 상기 GlcNAc-트란스페라아제 I를 세포내 구간으로 표적화시키는 표적화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 GlcNAc-트란스페라아제 II를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 15 항에 있어서, 상기 GlcNAc-트란스페라아제 II는 상기 GlcNAc-트란스페라아제 II를 세포내 구간으로 표적화시키는 표적화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 갈락토실트란스페라제(galactosyltransferase)를 코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 17 항에 있어서, 상기 갈락토실트란스페라제는 상기 갈락토실트란스페라제를 골지체(Golgi apparatus)로 표적화시키는 표적화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 기능(functional) pYPS1 또는 기능 pYPS2의 검출 가능한 레벨들을 생산하지 않는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 기능 pYPS1 및 기능 pYPS2를 코딩하는 검출 가능한 mRNA 분자들을 생산하지 않는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 YPS1 및 YPS2 유전자들은 상기 세포 내에서 분쇄되는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 YPS1 및 YPS2 오픈 리딩 프레임들(open reading frames)은 소거되는 것을 특징으로 하는 세포.
실질적인 숫자가 pYPS1 활성의 결핍 및 pYPS2 활성의 결핍을 포함하도록 유전자 조작되는 것을 특징으로 하는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포들의 실질적으로 순수한 배양.
(i) pYPS1 활성의 결핍 및 (ii) pYPS2 활성의 결핍, 그리고 (iii) ALG3 활성의 결핍, (iv) OCH1 활성의 결핍, (v) 알파-1,2 만노시다제를 코딩하는 핵산, (vi) GlcNAc-트란스페라제 I을 코딩하는 핵산, (vii) GlcNAc-트란스페라제 II를 코딩하는 핵산, (viii) 만노시다제 II를 코딩하는 핵산, (ix) α-1,3-글루코실트란스페라제를 코딩하는 핵산, (x) 갈락토실트란스페라제를 코딩하는 핵산 및 (xi) 글루코시다제의 α 및 β 서브유닛들을 코딩하는 핵산의 하나 또는 그 이상을 포함하도록 유전자 조작되는 야로위아(Yarrowia) 세포.
제 24 항에 있어서, 상기 세포는 표적 단백질을 코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
야로위아(Yarrowia) 내에서 생산되는 표적 단백질의 분해를 감소시키기 위한 방법에 있어서, 청구항 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 야로위아(Yarrowia) 세포 내의 상기 표적 단백질을 코딩하는 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
표적 단백질을 생산하는 방법에 있어서, a) pYPS1 활성의 결핍, pYPS2 활성의 결핍, 그리고 상기 표적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하도록 유전자 조작된 야로위아(Yarrowia) 세포를 제공하는 단계; 및 b) 상기 세포가 상기 표적 단백질을 생산하도록 조건들 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.