CN114606139B - 一种爪哇青霉菌及其发酵产物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种爪哇青霉菌及其发酵产物和应用；所述爪哇青霉菌保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名为爪哇青霉菌(Penicillium javanicum)MSC‑R1，保藏编号为CCTCC NO：M20211631，保藏时间为2021年12月15日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。本发明从牛大力中分离内生真菌，具有生产生物多糖的能力，并对其液体发酵培养基进行优化，提高内生真菌多糖的产量，为以后工业化生产奠定基础。其发酵产物‑牛大力内生真菌多肽具有良好的抗炎活性，可以用于制备抗炎相关产品。

Description

一种爪哇青霉菌及其发酵产物和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种爪哇青霉菌及其发酵产物和应用。
背景技术
牛大力(Millettia Speciosa Champ M.speciosa)是豆科植物美丽崖豆藤的干燥根，在传统中药草制剂中具有重要的地位，特别是在国内东南地区被广泛应用于治疗炎症。最近，来自牛大力的多糖由于其重要的生物学特性引起了人们的特别关注，如具有抗癌、抗炎、增强免疫力、抗疲劳等作用。然而，植物中提取多糖过程中，其不仅纯化工艺复杂且提取率低，而且植物本身生长易受季节、地域和虫害等影响，生长周期长。迄今为止，关于从牛大力分离的内生真菌的多糖未见报道。
当植物内生真菌在宿主植物的细胞间和/或细胞内健康组织中定殖时，一些内生真菌可以产生与宿主相同或相似的次级代谢产物。研究发现，红豆杉(Taxus brevifolia)的韧皮部(内皮)分离出的真菌内生菌(Taxomyces andreanae)产生的紫杉醇和相关化合物也是短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的主要生物成分。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种牛大力内生真菌。
本发明第二方面的目的，在于提供一种制备牛大力内生真菌多糖的方法。
本发明第三方面的目的，在于提供一种牛大力内生真菌多糖。
本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面所述的菌株或本发明第三方面所述多糖在制备抗炎产品中的应用。
本发明第五方面的目的，在于提供一种产品。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种牛大力内生真菌，属于爪哇青霉菌属，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名为爪哇青霉菌(Penicillium javanicum)MSC-R1，保藏编号为CCTCC NO：M20211631，保藏时间为2021年12月15日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
本发明的第二方面，提供一种制备高抗炎活性牛大力内生真菌多糖的方法，通过发酵本发明第一方面所述的牛大力内生真菌得到。
在本发明的一些实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
S1：将活化后的牛大力内生真菌菌株种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；
S2：将步骤S1发酵培养后的发酵液进行过滤、浓缩、醇沉、离心、透析、浓缩后得到牛大力内生真菌多糖。
在本发明的一些实施方式中，所述活化培养所用的培养基为pH 5.0-5.5的PDB培养基。
在本发明的一些实施方式中，所述活化的条件为：28-30℃活化80-120h。
在本发明的一些实施方式中，所述发酵培养基是以PDB培养基为基础，添加40-60g/L葡萄糖，5-15g/L酵母提取物和0.3-0.5g/L KCl，pH为5.0-5.5。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，接种量为3-6vol％。
在本发明的一些实施方式中，所述发酵培养的条件为：27-32℃发酵80-132h。
在本发明的一些优选实施方式中，所述发酵培养的条件为：27-32℃发酵95-132h。
在本发明的一些优选实施方式中，所述发酵培养基的条件为：29℃发酵108h。
本发明所采用的基础培养基为PDB培养基，补充添加成分为葡萄糖，酵母提取物，KCl，在此条件下，发酵结束后，经过浓缩、醇沉、提取、纯化得到单一组分HP，得到的多糖组分不仅产量高而且具有强抗炎活性。
在本发明的一些实施方式中，所述沉醇为采用浓缩液：无水乙醇＝1：(2-4)的体积比混合，室温静置18～30h。
在本发明的一些实施方式中，所述离心为7500-8500rpm离心3-8min。
在本发明的一些实施方式中，所述透析是采用截留分析量为3000-4000Da的透析袋透析72-80h。
在本发明的一些实施方式中，所述浓缩可以为减压浓缩，所述减压浓缩具体可以为真空悬蒸浓缩，浓缩液与原液体积比是1:8～12，主要是减少醇沉时使用的乙醇。
在本发明的一些实施方式中，采用HCl调节培养基的pH，也可以用其他常规的酸碱调节剂。
在本发明的一些实施方式中，发酵培养基在使用前需进行灭菌，优选地，所述灭菌的条件为121℃灭菌15～25min。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2所得牛大力内生真菌多糖进一步采用大孔树脂、纤维树脂、凝胶色谱中的至少一种进行纯化，其他常用的纯化方法也都可以，并不对此进行特别的限定。
其中大孔树脂为AB-8大孔树脂、D202大孔树脂或D308大孔树脂，可以去除色素和部分蛋白，所述纤维树脂为DEAE-52纤维素树脂，所述凝胶色谱中使用的为Sephadex G-75葡聚糖凝胶、Sephadex G-25葡聚糖凝胶或Sephadex G-200葡聚糖凝胶。
在本发明的一些实施方式中，对脱除蛋白和色素的组分进一步采用DEAE-52纤维素阴离子交换树脂进行纯化，洗脱液分别为0、0.2、0.4M的NaCl溶液，苯酚硫酸法检测洗脱液中多糖浓度，根据苯酚硫酸法测定的吸光度变化绘制洗脱曲线，得到不同多糖组分，合并相同组分的收集管浓缩后，蒸馏水透析，去除NaCl，减压浓缩，得到单一组分RP。
在本发明的一些实施方式中，采用Sephadex G-75对所得到RP进一步纯化，洗脱液为蒸馏水，苯酚硫酸法跟踪监测所收集的组分。
本发明的第三方面，提供一种牛大力内生真菌多糖，通过本发明第二方面所述的制备方法得到。
在本发明的一些实施方式中，所述牛大力内生真菌多糖的平均分子量为2.5-4×104Da。
在本发明的一些优选实施方式中，所述牛大力内生真菌多糖的平均分子量为3.78×104Da。
在本发明的一些实施方式中，所述牛大力内生真菌多糖包含阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、核糖和葡萄糖醛酸组成；其摩尔比为(0.5～1.5):(3～4):(67～70):(15～18):(0.3～0.7):(7.5～9.5)；优选为1.09:3.47:68.48:16.59:0.50:8.85。
本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述牛大力内生真菌或本发明第三方面所述的牛大力内生真菌多糖在制备抗炎产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为药品、防腐剂、日化用品或饲料。
本发明的第五方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第一方面所述牛大力内生真菌或本发明第三方面所述的牛大力内生真菌多糖。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为药品、防腐剂、日化用品或饲料。
本发明的有益效果是：
本发明分离出一株牛大力内生真菌菌株，属于爪哇青霉菌属，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名为Penicillium javanicum MSC-R1，保藏编号为CCTCCNO：M20211631，保藏时间为2021年12月15日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。本发明从牛大力中分离内生真菌，具有生产生物多糖的能力，并对其液体发酵培养基进行优化，提高内生真菌多糖的产量，为以后工业化生产奠定基础。
其发酵产物-牛大力内生真菌多肽具有良好的生物活性，可以抑制RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和一氧化氮(NO)，具有较高的抗炎活性。而且通过研发得到了较好的发酵工艺，并设计了配套的简单易行纯化工艺；产物产量、活性均有提高，制备过程绿色、环保。
附图说明
图1是进化树图。
图2是在补充成分的PDB培养基发酵获取的粗多糖经DEAE-52纯化的曲线图。
图3是在补充成分的PDB培养基发酵获取的粗多糖经Sephadex G75纯化的曲线图。
图4是纯化多糖组分HP的分子量图。
图5是单糖标准曲线，其中是各种单糖的标准样品混合一起进行检测。
图6是纯化多糖组分HP的单糖组成图。
图7是纯化的多糖组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性。
图8是纯化的多糖组分对细胞因子TNF-α影响的柱状图。
图9是纯化的多糖组分对细胞因子IL-6影响的柱状图。
图10是纯化的多糖组分对细胞因子NO影响的柱状图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
PDB培养基配方：马铃薯浸粉5g/L；蛋白胨10g/L；葡萄糖15g/L；氯化钠5g/L。
实施例1
本实施例为菌株分离与鉴定过程：
申请人从牛大力植物根中分离内生菌，通过反复筛选不同内生菌的多糖产率及活性，获得了一株粗多糖产率为2.56±0.18g/L的真菌。对真菌rDNA ITS区进行扩增测序，得到583bp的核苷酸序列。经blast和两两序列比对分析，MSC-R1与爪哇青霉菌的序列同源性为99～100％；进化树图见图1。因此，筛选得到的菌株命名P.javanicum MSC-R1，并于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏，其分类命名为Penicillium javanicum MSC-R1，保藏编号为NO.M20211631。
ITS序列：
TTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATTATACCTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTCATGGCCGCCGGGGGGCACCCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCCCCCCCTGAACGCTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGCGATTAGCTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCCGCCCCCCGGCTCCCGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGGCGACCCCCCTCAATCTTTCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA(SEQ ID NO.1)。
实施例2
1、牛大力内生真菌P.javanicum MSC-R1在pH 5.0的PDB培养基中29℃活化培养30h，得到发酵菌种种子液。
2、根据确定的组成配置PDB发酵培养基并添加60g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物和0.5g/LKCl，1M HCl调整pH 5.0，分装到500mL的锥形瓶中，每瓶250mL，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种3％(v/v)的种子液，29℃发酵108h：待发酵完成后，过滤，减压浓缩，收集浓缩液并加入3倍体积的无水乙醇，得到的悬浮液于8000rpm离心5分钟，收集离心沉淀后溶于蒸馏水，流水透析72h(透析袋截留分子量3500Da)，减压浓缩到粗多糖样品，产量8.81±0.45g/L。
3、粗多糖溶液首先使用AB-8大孔树脂去除色素和部分蛋白，随后使用DEAE-52纤维素阴离子交换树脂纯化粗多糖。蒸馏水溶解粗多糖配制成10mg/mL，加入20mL粗多糖溶液至已处理的DEAE-52纤维素柱中，纯化洗脱液为浓度0、0.2、0.4、0.6、0.8mol/L的NaCl溶液，自动收集器收集不同浓度的洗脱液，收集流速为0.6mL/min，每管收集5mim，得到单一多糖组分RP。最后采用Sephadex G75进一步纯化。蒸馏水溶解RP配制成2mg/mL，加入10mL RP溶液至已处理的Sephadex G75中，洗脱液为蒸馏水，自动收集器收集洗脱液，收集流速为0.3mL/min,每管收集3min，得到单一多糖组分HP。纯化过程中均使用苯酚硫酸法检测洗脱液多糖浓度，绘制洗脱曲线(图2-图3)。
对收集到的多糖组分HP分别采用GPC和HPAEC-PAD法测定其分子量及单糖组成(图4-图6)，结果表明HP的平均分子量为3.78×104Da，所述分子量为重均分子量，主要是由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、核糖和葡萄糖醛酸组成，其摩尔比为1.09:3.47:68.48:16.59:0.50:8.85。
实施例3
1、牛大力内生真菌P.javanicum MSC-R1在pH 5.0的PDB培养基中29℃活化培养30h，得到发酵菌种种子液。
2、配置PDB发酵培养基，1M HCl调整pH 5.0，分装到500mL的锥形瓶中，每瓶250mL，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种3％(v/v)的种子液，29℃发酵84h：待发酵完成后，过滤，减压浓缩，收集浓缩液并加入3倍体积的无水乙醇，得到的悬浮液于8000rpm离心5分钟，收集离心沉淀后溶于蒸馏水，流水透析72h(透析袋截留分子量3500Da)，减压浓缩到粗多糖样品，产量2.56±0.18g/L。
本实施例的多糖产量明显低于实施例2。可以看出在基础培养基PDB中添加60g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物和0.5g/L KCl有助于提高多糖产量。
实施例4
1、牛大力内生真菌P.javanicum MSC-R1在pH 5.0的PDB培养基中29℃活化培养30h，得到发酵菌种种子液。
2、根据确定的组成配置PDB发酵培养基并添加60g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物和0.5g/LKCl，1M HCl调整pH 5.0，分装到500mL的锥形瓶中，每瓶250mL，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种3％(v/v)的种子液，29℃发酵84h：待发酵完成后，过滤，减压浓缩，收集浓缩液并加入3倍体积的无水乙醇，得到的悬浮液于8000rpm离心5分钟，收集离心沉淀后溶于蒸馏水，流水透析80h(透析袋截留分子量3500Da)，减压浓缩粗多糖样品，产量3.24±0.26g/L。多糖产量低于发酵培养108h的产量(≤8.81±0.45g/L)，从成本效益考虑应选取发酵培养108h。
实施例5
1、牛大力内生真菌P.javanicum MSC-R1在pH 5.0的PDB培养基中29℃活化培养30h，得到发酵菌种种子液。
2、根据确定的组成配置PDB发酵培养基并添加60g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物和0.5g/LKCl，1M HCl调整pH 5.0，分装到500mL的锥形瓶中，每瓶250mL，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种3％(v/v)的种子液，29℃发酵132h：待发酵完成后，过滤，减压浓缩，收集浓缩液并加入3倍体积的无水乙醇，得到的悬浮液于8000rpm离心5分钟，收集离心沉淀后溶于蒸馏水，流水透析72h(透析袋截留分子量3500Da)，减压浓缩得到粗多糖样品，产量8.17±0.41g/L。多糖产量与发酵时间为108h产量稍低，但无明显差别(≤8.81±0.45g/L)，所以选择发酵108h。
实施例6
1、牛大力内生真菌P.javanicum MSC-R1在pH 5.0的PDB培养基中29℃活化培养48h，得到发酵菌种种子液。
2、根据确定的组成配置PDB发酵培养基并添加60g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物和0.5g/LKCl，1M HCl调整pH 5.0，分装到500mL的锥形瓶中，每瓶250mL，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种3％(v/v)的种子液，29℃发酵108h：待发酵完成后，过滤，减压浓缩，收集浓缩液并加入3倍体积的无水乙醇，得到的悬浮液于8000rpm离心5分钟，收集离心沉淀后溶于蒸馏水，流水透析80h(透析袋截留分子量3500Da)，减压浓缩得到粗多糖样品，产量8.43±0.57g/L。多糖产量与种子培养基培养30h的产量(≤8.81±0.45g/L)无显著性差异(p>0.05)，所以从成本效益考虑选取种子培养基培养时间为30h。
实施例7
将RAW 264.7细胞(5×105细胞)接种于96孔微孔板上过夜，然后分别用31.25、62.5、125、250和500μg/mL的HP处理24h。通过MTT比色法测定实施例1中的多糖纯化组分HP对其生长抑制作用，结果表明所得多糖组分对RAW264.7几乎无抑制作用，即无明显的细胞毒性(图7)，可进行后续实验研究。
随后评价所得纯化组分对RAW264.7细胞的免疫活性的影响。将细胞调至1×106细胞/mL的指数期，装入96孔板，连续孵育24h。除对照细胞外，大部分细胞均经LPS处理(1μg/mL)，然后根据TNF-α/IL-6/NO试剂盒的指示，分别用不同浓度(31.25、62.5、125、250、500μg/mL)的HP或地塞米松(DXMS)(50μg/mL)处理细胞，孵育24h。收使用ELISA试剂盒检测NO、TNF-α和IL-6水平。结果表明不同浓度的多糖组分均能不同程度地抑制RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)(图8)、白细胞介素-6(IL-6)(图9)和一氧化氮(NO)(图10)，表明HP具有较高的抗炎活性。结果显示，RAW 264.7细胞经1μg/mL LPS处理后，TNF-α、IL-6和NO的产量迅速增加，分别达到886.09pg/mL、309.18pg/mL和57.64μM。在31.25～250μg/mL范围内，TNF-α、IL-6和NO的减少呈剂量依赖性，其中TNF-α、IL-6和NO的产生量随HP浓度的升高而迅速下降(p<0.01)。250μg/mL HP预处理后RAW 264.7的TNF-α、IL-6、NO浓度分别为615.78pg/mL、239pg/mL、24.78μM，接近50μg/mL地塞米松(DXM)组的564.22pg/mL、160.72pg/mL、15.31μM。这表明在LPS的刺激下，内生真菌多糖HP能不同程度地抑制RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和一氧化氮(NO)，具有较高的抗炎活性。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南理工大学
<120> 一种牛大力内生真菌及其发酵产物和应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 583
<212> DNA
<213> Penicillium javanicum MSC-R1
<400> 1
ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt accgagtgag ggccctctgg gtccaacctc 60
ccacccgtgt ttattatacc tagttgcttc ggcgggcccg ccgtcatggc cgccgggggg 120
caccccgccc ccgggcccgc gcccgccgaa gccccccctg aacgctgtct gaagattgca 180
gtctgagcga ttagctaaat cagttaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttccggcat 240
cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc 300
gagtctttga acgcacattg cgccccctgg tattccgggg ggcatgcctg tccgagcgtc 360
attgctgccc tcaagcacgg cttgtgtgtt gggcccccgc cccccggctc ccggggggcg 420
ggcccgaaag gcagcggcgg caccgcgtcc ggtcctcgag cgtatggggc ttcgtcaccc 480
gctctgtagg cccggccggc gcccgccggc gacccccctc aatctttctc aggttgacct 540
cggatcaggt agggataccc gctgaactta agcatatcaa taa 583

Claims (5)

1.一种爪哇青霉菌(Penicillium javanicum)MSC-R1，其保藏编号为CCTCC NO：M20211631。
2.一种制备爪哇青霉菌多糖的方法，包括以下步骤：通过发酵权利要求1所述的爪哇青霉菌得到；所述方法包含以下步骤：
S1：将活化后的爪哇青霉菌菌株种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；
S2：将步骤S1发酵培养后的发酵液进行过滤、浓缩、醇沉、离心、透析、浓缩后得到爪哇青霉菌多糖；
所述发酵培养基是以马铃薯葡萄糖水培养基为基础，添加40-60g/L葡萄糖，5-15g/L酵母提取物和0.3-0.5g/L KCl，pH为5.0-5.5；
所述发酵培养的条件为：27-32℃发酵80-132h；
所述透析是采用截留分析量为3000-4000Da的透析袋透析72-80h；
步骤S2所得爪哇青霉菌多糖进一步采用大孔树脂、纤维树脂、凝胶色谱中的至少一种进行纯化；
所述爪哇青霉菌多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、核糖和葡萄糖醛酸组成；其摩尔比为(0.5～1.5):(3～4):(67～70):(15～18):(0.3～0.7):(7.5～9.5)，多糖的平均分子量为2.5-4×104Da。
3.一种爪哇青霉菌多糖，通过权利要求2所述的方法制备得到，所述爪哇青霉菌多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、核糖和葡萄糖醛酸组成；其摩尔比为(0.5～1.5):(3～4):(67～70):(15～18):(0.3～0.7):(7.5～9.5)，多糖的平均分子量为2.5-4×104Da。
4.权利要求3所述的爪哇青霉菌多糖在制备抗炎药品中的应用。
5.一种药品，其特征在于，所述产品包含权利要求3所述的爪哇青霉菌多糖。
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