CN113416687B - 裂褶菌产裂叶多糖的发酵培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于利用微生物生产高附加值产品领域，具体涉及一种裂褶菌产裂叶多糖的发酵培养方法，该方法包括以下步骤：用基础培养基对裂褶菌进行深层液体培养，然后添加环戊酮脂肪酸继续培养。本发明提供的发酵培养基和环戊酮脂肪酸添加物，能够缩短裂褶菌菌丝发酵周期，大幅度提高单位菌丝体产高附加值产品的含量。

Description

裂褶菌产裂叶多糖的发酵培养方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及促进裂褶菌高水平分泌裂叶多糖的方法。

背景技术

多糖是丰富的天然生物聚合物，代表了迄今为止全球制造的最大聚合物。裂叶多糖(SPG)，作为一种生物聚合物，是一种非离子和水溶性细胞外多糖，由1，3-β-D-吡喃葡萄糖单元的主链与单个1，6-键合的β-D-吡喃葡萄糖连接而成。这种生物聚合物由木材腐烂和丝状真菌裂褶菌菌株产生(Kumari，Maushmi，Shrikant A.Survase，and RekhaS.Singhal."Production of schizophyllan using Schizophyllum commune NRCM."Bioresource technology99.5(2008)：1036-1043.Alizadeh，Vahid，Seyed AbbasShojaosadati，and Seyed Morteza Zamir."Enhancement of schizophyllan productionin Schizophyllum commune using microparticles in medium."Bioprocess andBiosystems Engineering 44.2(2021)：317-328.)。SPG具有独特的物理特性，例如高粘度、成膜性和热稳定性，这使得SPG可用于各种工业，例如加强疫苗中的免疫系统和抗癌疗法。SPG还用作食品保鲜的不透氧膜、化妆品乳液的增稠剂、促进油脂回收的乳化剂和食品补充剂(Mousaviasl，Sahar，et al."Synthesis and characterization of schizophyllannanogels via inverse emulsion using biobased materials."International journalof biological macromolecules 120(2018)：468-474.)。由于这种生物聚合物的重要应用，近年来备受关注。

大多数研究都集中在已鉴定菌株(如ATCC 38548)的SPG生产上(Alizadeh，Vahid，Seyed Abbas Shojaosadati，and Seyed Morteza Zamir."Enhancement ofschizophyllan production in Schizophyllum commune using microparticles inmedium."Bioprocess and Biosystems Engineering 44.2(2021)：317-328.)，少数研究使用新分离的菌株研究了其生产(Mohammadi，Aref，et al."Schizophyllan production bynewly isolated fungus Schizophyllum commune IBRC-M 30213：optimization ofculture medium using response surface methodology."Annals of microbiology68.1(2018)：47-62.)。

提高裂褶菌SPG产量仍然是当今面临的主要问题(Alizadeh，Vahid，Seyed AbbasShojaosadati，and Seyed Morteza Zamir."Enhancement of schizophyllan productionin Schizophyllum commune using microparticles in medium."Bioprocess andBiosystems Engineering 44.2(2021)：317-328.)。使用廉价淀粉作为碳源和马铃薯提取物作为氮源曾用于提高SPG的产量(Gunaji，R.G.，R.Junin，and S.Bandyopadhyay."Production and characterization of biopolymer schizophyllan using sago starchas a carbon source."Journal of Physics：Conference Series.Vol.1529.No.5.IOPPublishing，2020.)。

多糖转移酶与多糖合成密切相关(Llull，Daniel，Ernesto García，and Rubens López."Tts，a processiveβ-glucosyltransferase of Streptococcus pneumoniae，directs the synthesis of the branched type 37capsular polysaccharide inpneumococcus and other gram-positive species."Journal of Biological Chemistry276.24(2001)：21053-21061)。如何提高微生物细胞内糖基转移酶的活性会成为影响多糖产量的主要因素。茉莉酸和茉莉酸甲酯都能通过提高糖基转移酶的活性来增加多糖的产量(Jaulneau，Valérie，et al."Ulvan，a sulfated polysaccharide from green algae，activates plant immunity through the jasmonic acid signaling pathway."Journalof Biomedicine and Biotechnology 2010(2010).)，但是仍然不能满足多糖生产的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种裂褶菌产裂叶多糖的发酵培养方法，进一步提高裂褶菌SPG产量。

本发明的技术方案如下：

裂褶菌产裂叶多糖的发酵培养方法，其特征在于包括以下步骤：用基础培养基对裂褶菌进行深层液体培养，然后添加环戊酮脂肪酸继续培养。

优选地，在用基础培养基对裂褶菌进行深层液体培养之前，进行初始培养。

进一步优选地，所述初始培养采用以土豆、葡萄糖和琼脂为主的综合培养基，接种避光培养5-10天。

优选地，所述环戊酮脂肪酸的添加量为1-3nM。

优选地，：所述环戊酮脂肪酸是从珊瑚物种分离，所述珊瑚物种包括软珊瑚、柳珊瑚、红珊瑚、石珊瑚、角珊瑚、水螅珊瑚、苍珊瑚、雪花珊瑚和笙珊瑚。

优选地，所述基础培养基按照以下配比配制：淀粉98.2-109.4g/L，酵母提取物1.5-3.3g/L，豆粕蛋白30.2-45.5g/L，磷羧甲基纤维素钠7.05-9.38g/L，油酸0.9-1.4g/L，用水补充到1L。

进一步优选地，所述基础培养基按照以下配比配制：淀粉105.68g/L、酵母提取物1.92g/L、豆粕蛋白39.82g/L、羧甲基纤维素钠9.33g/L和油酸1.0g/L，用水补充到1L。

进一步优选地，所述豆粕蛋白按照以下方法制备而成：将豆粕浸泡后调整pH值为6-7，加入豆粕重量2％的木瓜蛋白酶，酶解后进行灭酶处理。

进一步优选地，所述豆粕蛋白按照以下方法制备而成：将豆粕浸泡后调整pH值为6-7，加入豆粕重量2％的木瓜蛋白酶，酶解后进行灭酶处理。

本发明的积极效果在于：

一、本发明从珊瑚中分离出环戊酮脂肪酸的衍生物，能明显提高SPG的产量。同时，使用傅里叶变换红外光谱(FTIR)和凝胶渗透色谱(GPC)对生产的SPG进行表征。环戊酮脂肪酸的衍生物浓度能影响SPG的聚合度，随着环戊酮脂肪酸的衍生物浓度增加，SPG聚合度随着增加，结果大分子量SPG分布增加。还可以缩短发酵周期从13天缩短为10天。另外，单位菌丝的SPG产量增加。

二、本发明通过环戊酮脂肪酸促进裂褶菌实现多糖分泌：(1)裂褶菌实现多糖合成的关键酶是糖基转移酶。脂肪酸能诱导糖基转移酶的产生或增加糖基转移酶的活性，环戊酮脂肪酸增加了复合结构分子的不饱和性，进一步提升了糖基转移酶的活性，促进多糖产量明显提升。(2)环戊酮增强裂褶菌的膜渗透性，促进了多糖的分泌。脂肪酸同样也可以增强裂褶菌的膜渗透性进而促进多糖的分泌。环戊酮脂肪酸具备双分子功能，在促糖分泌过程中存在可能的协同机制。

三、本发明用于对裂褶菌进行深层液体培养的基础培养基选用了豆粕，并利用蛋白酶对豆粕进行一定时间的酶解，这对于提高菌丝体中有效成分的含量非常有益。采用本发明提供的优化方案基础培养基，产生了最高的SPG(11.5g/L)。

附图说明

图1是本发明实施例1不同时间的豆粕消化率柱状图。

图2是本发明实施例4环戊酮脂肪酸的分子结构图。

图3是是本发明实施例5中茉莉酸浓度与SPG产量的关系柱状图。

图4是本发明实施例6中茉莉酸甲酯浓度与SPG产量的关系柱状图。

图5是本发明实施例7中环戊酮脂肪酸浓度与SPG产量的关系柱状图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1：豆粕蛋白的制备。

分别采用如下A、B、C、D四个方案制备豆粕蛋白，所述的份均指质量份。

A：80份豆粕用300份水浸泡24小时；调整pH值为6-7，按豆粕重量2％加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀，在55℃下进行酶解0.5小时。将酶解物在100℃下灭酶处理10分钟，处理完后得到豆粕蛋白A。

B：80份豆粕用300份水浸泡24小时；调整pH值为6-7，按豆粕重量2％加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀，在55℃下进行酶解1小时。将酶解物在100℃下灭酶处理10分钟，处理完后得到豆粕蛋白B。

C：80份豆粕用300份水浸泡24小时；调整pH值为6-7，按豆粕重量2％加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀，在55℃下进行酶解1.5小时。将酶解物在100℃下灭酶处理10分钟，处理完后得到豆粕蛋白C。

D：80份豆粕用300份水浸泡24小时；调整pH值为6-7，按豆粕重量2％加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀，在55℃下进行酶解2小时。将酶解物在100℃下灭酶处理10分钟，处理完后得到豆粕蛋白D。

将消化液离心，留上清，残渣用蒸馏水反复冲洗3次，离心，测定上清液中氮含量。计算体外消化率。以不加蛋白酶的为对照。消化率的计算公式为：100％x(消化液氮含量-消化酶氮含量)/底物氮含量。结果显示1.5小时后，上清中的含氮量不在增加，达到最高值如图1所示，因而后面豆粕的制备均用C方案。

实施例2：裂褶菌的初始培养。

裂褶菌(Schizophyllum commune SCSIO z046)采用PDA综合培养基(土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH值自然)，接种后置于30℃避光培养5-10天。

实施例3：SPG基础培养基的优化。

使用Design Expert 7.0.1.0版(Statcon，USA))的实验方法优化SPG的生产。选择用于优化的自变量如下：淀粉、将实施例1的C方案制备的豆粕蛋白、酵母提取物、羧甲基纤维素钠(CMC)和油酸。表1给出了在五个不同级别评估的因素。总实验为50次运行，包括32(2⁵)个因子点、10个轴向点和中心点的8个重复。依赖反应是SPG产量(y₁)和生物量产量(y₂)。

表1：中心复合设计(CCD)中的实验自变量及其水平

正如以往研究中所考虑的那样，本研究中通过一次一个因素的方法研究了碳源和氮源等有效因素以及适当的浓度范围。基于一次一个因子实验中获得的结果，被用作统计设计来研究五种不同培养基成分(自变量)对生物量和SPG产量的影响(表2)。表2中显示的用于优化培养基组成，KH₂PO₄和MgSO₄·7H₂O分别固定在1g/L和0.5g/L。在第14次运行中获得最低的SPG产量(0.61g/L)，组合为37.14g/L淀粉、2.67g/L酵母提取物、31.3g/L豆粕、7.34g/L羧甲基纤维素钠和1.4g/L油酸，用水补充到1L。在31次的运行中，培养获得最高SPG产量(y₁)。在整个运行过程中，在105.68g/L淀粉、1.92g/L酵母提取物、39.82g/L豆粕、9.33g/L羧甲基纤维素钠和1.0g/L油酸，用水补充到1L的条件下，产生了最高的SPG产量(1.50g/L)。

本实施例优化选择以下基础培养配比：淀粉105.68g/L、酵母提取物1.92g/L、豆粕蛋白39.82g/L、羧甲基纤维素钠9.33g/L和油酸1.0g/L，用水补充到1L。

表2：基于CCD的SPG生产和生物量作为响应的培养基成分

Note：单位菌体产量(YP/X)和得率(YP/S)

实施例4：环戊酮脂肪酸的提取和纯化。

环戊酮脂肪酸的提取方法有1)浸渍法：将珊瑚粉末或碎块装入适当的容器中，加入适宜的溶剂(如乙醇、稀醇或水)，浸渍药材以溶出其中成分的方法。本法比较简单易行，但浸出率较差，如用水为溶剂，其提取液易于发霉变质，需要加入适当的防腐剂。2)渗滤法：将珊瑚粉末装在渗滤器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法，当溶剂渗进药粉溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。但应控制流速，在渗渡过程中随时自药面上补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止。或当渗滴液颜色极浅或渗滤液体积相当于原药材重的10倍时，便可认为基本上已提取完全。3)煎煮法：所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免液体变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。4)回流提取法：应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内装药材约为容量的50％～70％，溶剂浸过药材表面约1～2cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾约1小时，小放冷水过滤，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。5)连续提取法：应用挥发性有机溶剂提取珊瑚有效成分，均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少，提取成分也较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。连续提取法，一般需数小时才能提取完全。

获得的环戊酮脂肪酸的粗提物的纯化方法：系统溶剂分离法，较常用的作法是将乙醇或甲醇提取液适当浓缩后，与某种担体(如硅藻土、硅胶等)混合均匀，干燥后，用极性不同的溶剂，极性由小到大分别提取。然后再选择方法进行分离。也可以将珊瑚粗粉直接用极性不同的溶剂分别提取，得各个部分；两相溶剂萃取法，萃取法是利用混合物中各成分在互不混溶的溶剂中分配系数不同而分离的方法。可将被分离物溶于水中，用与水不混溶的有机溶剂进行萃取，也可将被分离物溶在与水不混溶的有机溶剂中，用适当pH的水液进行萃取，达到分离的目的；简单萃取法，将环戊酮脂肪酸提取液适当浓缩，或将乙醇(甲醇)提取液适当浓缩，回收醇后，加入适量水，用极性不同的与水不混溶的有机溶剂，极性由小到大，如选用石油醚、氯仿(或乙醚)、醋酸乙酯、正丁醇，分别进行萃取，分别回收溶剂得到极性不同的萃取物；连续萃取法，为克服使用分液漏斗多次萃取的操作麻烦，可采用连续萃取器。这一仪器利用两溶剂的比重不同，自然分层和分散相液滴穿过连续相溶剂时发生传质。选择连续萃取法时，需视所用溶剂的比重大于或小于被提取的水溶液比重的情况，而采用不同式样的仪器；液滴逆流分配法，此法需特殊的仪器，多用于极性较大的成分的分离，关键是选择好固定相和流动相；沉淀法，此法是将被分离物溶于某种溶剂中，再加入另外一种溶剂或试剂，使某种或某些成分析出沉淀，而某些成分保留在溶液中经过滤后达到分离的一种方法。可以使杂质沉淀析出，也可使欲得成分沉淀析出。加入浓乙醇使含醇量达到一定浓度，使一些成分析出沉淀，通常为50～80％，具体含醇量视欲得到的成分的结构及性质而定。此法通常称为“水煮醇沉法”。用此法可得到多糖类成分；制备色谱分离方法，该法成本较高，不适宜工业生产。

优化环戊酮脂肪酸的提取工艺并确定大孔树脂分离纯化环戊酮脂肪酸的工艺。方法：以环戊酮脂肪酸含量和干膏率的综合评分为评价指标，乙醇浓度、溶剂倍数、提取时间为考察因素，正交试验法优化提取工艺；然后以环戊酮脂肪酸含量为指标，考察大孔树脂种类、树脂用量、水洗脱剂用量，洗脱液乙醇浓度、乙醇用量对分离纯化工艺的影响，优选分离纯化工艺并通过中试验证。结果：提取工艺为：加入10倍量70％乙醇，回流提取90min，提取3次；然后采用S-8大孔树脂对提取物进行分离纯化，加入3倍量大孔树脂，4倍量水洗脱除杂后，再用5倍量60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液。该提取、分离和纯化工艺简单、可行，产品纯度高，得率可达到0.1-0.5mg/g。

纯化的环戊酮脂肪酸用EIMS光谱NMR和IR光谱分析。

环戊酮脂肪酸是一种无色油。EIMS光谱显示在m/z 480/482[M-H2O]+处有一个峰，其相对强度表明存在氯原子。NMR数据加上HREIMS中的[M-H2O]+峰表明分子式为C25H35O8Cl，表明不饱和度为8，如图2。13C NMR谱显示了25个碳的信号。碳信号的多重性由DEPT光谱确定：4个甲基、8个亚甲基、7个次甲基(三个烯烃，三个带有杂原子)和6个非质子化碳(四个羰基)。IR光谱表明分子式中没有氧是羟基，并显示出对α，β-不饱和羰基(1705cm-1)和甲酯(1736，1235cm-1)的吸收。

实施例5：茉莉酸提高SPG的产量。

用实施例3优化选择的基础培养配比制备的基础培养基对裂褶菌进行深层液体培养，培养温度为28℃，摇瓶装量30％，转速120r/min，液体菌种接种量12％，培72小时后，添加不同浓度的茉莉酸。继续培养10天。为了确定细胞干重的数量，发酵液在10，000g下离心30分钟。所得沉淀在65℃下干燥，然后在该温度下保持恒重。所有测量均重复两次。为了估计SPG的量，使用孔径为200μm的膜过滤器过滤从离心机中获得的上清液。由于裂褶菌分泌裂叶多糖，所以这种高附加值产品集中在上清液里。然后，将两体积的95％(v/v)乙醇逐渐加入滤液中，直至SPG沉淀。滤液在4℃下保持12小时以完成沉淀过程。此后，将获得的SPG以10，000g离心30分钟。沉积的SPG在65℃下干燥至恒重。

结果显示0.64nM茉莉酸可以将SPG产量从1.5g/L提高到2.0g/L，而浓度超过1nM反而会使SPG的产量急剧降低，说明较高浓度的茉莉酸有毒性作用，反而会抑制多糖的产量，如图3。

实施例6：茉莉酸甲酯提高SPG的产量。

用实施例3优化选择的基础培养配比制备的基础培养基对裂褶菌进行深层液体培养，培养温度为28℃，摇瓶装量30％，转速120r/min，液体菌种接种量12％，培养72小时后，添加不同浓度的茉莉酸甲酯。继续培养10天。为了确定细胞干重的数量，发酵液在10，000g下离心30分钟。所得沉淀在65℃下干燥，然后在该温度下保持恒重。所有测量均重复两次。为了估计SPG的量，使用孔径为200μm的膜过滤器过滤从离心机中获得的上清液。由于裂褶菌分泌裂叶多糖，所以这种高附加值产品集中在上清液里。然后，将两体积的95％(v/v)乙醇逐渐加入滤液中，直至SPG沉淀。滤液在4℃下保持12小时以完成沉淀过程。此后，将获得的SPG以10，000g离心30分钟。沉积的SPG在65℃下干燥至恒重。

结果显示1.28nM茉莉酸甲酯可以将SPG产量从1.5g/L提高到3.0g/L，而浓度超过1.28nM反而会使SPG的产量急剧降低，说明较高浓度的茉莉酸甲酯也有毒性作用，反而会抑制多糖的产量，如图4。

实施例7：环戊酮脂肪酸提高SPG的产量。

用实施例3优化选择的基础培养配比制备的基础培养基对裂褶菌进行深层液体培养，培养温度为28℃，摇瓶装量30％，转速120r/min，液体菌种接种量12％，培养72小时后，添加不同浓度的环戊酮脂肪酸。继续培养7天。

为了确定细胞干重的数量，发酵液在10，000g下离心30分钟。所得沉淀在65℃下干燥，然后在该温度下保持恒重。所有测量均重复两次。为了估计SPG的量，使用孔径为200μm的膜过滤器过滤从离心机中获得的上清液。由于裂褶菌分泌裂叶多糖，所以这种高附加值产品集中在上清液里。然后，将两体积的95％(v/v)乙醇逐渐加入滤液中，直至SPG沉淀。滤液在4℃下保持12小时以完成沉淀过程。此后，将获得的SPG以10，000g离心30分钟。沉积的SPG在65℃下干燥至恒重。

结果显示2.56nM环戊酮脂肪酸可以将SPG产量从1.45g/L提高到11.50g/L，而浓度超过2.56nM反而会使SPG的产量急剧降低，说明较高浓度的环戊酮脂肪酸也有毒性作用，反而会抑制多糖的产量，如图5。

Claims (7)

1.裂褶菌产裂叶多糖的发酵培养方法，其特征在于包括以下步骤：用基础培养基对裂褶菌进行深层液体培养，然后添加环戊酮脂肪酸继续培养；

所述环戊酮脂肪酸的结构式如下所示

；

所述环戊酮脂肪酸的添加量为1-2.56 nM。

2.根据权利要求1所述的裂褶菌产裂叶多糖的发酵培养方法，其特征在于：在用基础培养基对裂褶菌进行深层液体培养之前，进行初始培养。

3.根据权利要求2所述的裂褶菌产裂叶多糖的发酵培养方法，其特征在于：所述初始培养采用以土豆、葡萄糖和琼脂为主的综合培养基，接种避光培养5-10天。

4.根据权利要求1或2或3所述的裂褶菌产裂叶多糖的发酵培养方法，其特征在于所述基础培养基按照以下配比配制：淀粉98.2-109.4g/L，酵母提取物1.5-3.3g/L，豆粕蛋白30.2-45.5g/L，磷羧甲基纤维素钠7.05-9.38g/L，油酸0.9-1.4g/L，用水补充到1L。

5.根据权利要求4所述的裂褶菌产裂叶多糖的发酵培养方法，其特征在于：所述基础培养基按照以下配比配制：淀粉105.68 g/L、酵母提取物1.92 g/L、豆粕蛋白39.82 g/L、羧甲基纤维素钠9.33 g/L和油酸1.0g/L，用水补充到1L。

6.根据权利要求4所述的裂褶菌产裂叶多糖的发酵培养方法，其特征在于所述豆粕蛋白按照以下方法制备而成：将豆粕浸泡后调整pH值为6-7，加入豆粕重量2％的木瓜蛋白酶，酶解后进行灭酶处理。

7.根据权利要求5所述的裂褶菌产裂叶多糖的发酵培养方法，其特征在于所述豆粕蛋白按照以下方法制备而成：将豆粕浸泡后调整pH值为6-7，加入豆粕重量2％的木瓜蛋白酶，酶解后进行灭酶处理。

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