CN111004333B - 一种改性羊肚菌多糖的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改性羊肚菌多糖的制备方法及应用，首先将羊肚菌洗净、除杂、烘干、粉碎、乙醇脱脂后，通过水提醇沉法获得羊肚菌粗多糖，去除粗多糖中的蛋白质；然后将复合酶制剂加入至去除蛋白质后的羊肚菌粗多糖中，进行酶解反应，得到单糖或寡聚糖；其中，复合酶制剂包括几丁质酶与真菌β‑葡聚糖酶；将酶解后的反应物进行高温真空熔融缩聚反应，得到改性羊肚菌多糖粗品；将改性羊肚菌多糖粗品经脱色、透析、浓缩、干燥后，得到改性羊肚菌多糖。制备的羊肚菌多糖可显著提高小鼠肠道内产短链脂肪酸细菌的占比，并可促进短链脂肪酸的产生。
Description
技术领域
本发明属于食用菌资源开发技术领域，具体涉及一种改性羊肚菌多糖的制备方法及应用。
背景技术
羊肚菌又称羊肚菜，属于子囊菌亚门、盘菌纲、盘菌目、羊肚菌科、羊肚菌属，是世界上珍贵的稀有食用菌之一。羊肚菌的味道鲜美、营养丰富，含有丰富的碳水化合物、氨基酸、维生素、矿质元素等营养物质。除了具有营养丰富、味道鲜美等特点外，羊肚菌还具有一定的药用价值，传统中医认为，羊肚菌性平、味甘，具有益肠胃、消化助食的作用。随着人们对多糖药用价值的进一步加深，意识到羊肚菌多糖可能是羊肚菌生物活性和药用功能的主要作用因子之一，近期的研究也表明羊肚菌多糖具有抗肿瘤、抗菌、抗疲劳、增强免疫力等多种药理活性。
多糖的性质改造(改性)逐渐成为近年来的研究热点，其改性后的多糖具有更好的生物活性功能。例如，有研究学者报道了无花果多糖经超声改性后，具有更强的抗氧化能力。目前多糖的改性方法包括化学改性(如：酯化改性、醚化改性、交联改性、接枝共聚改性等)，物理改性(如共混改性、湿热改性、超声改性等)和生物改性(酶法改性、微生物改性等)。在诸多改性方法中，化学改性能够使多糖的结构产生更多的变化，从而使多糖具有更强的生物活性，因而应用较为广泛，但是化学改性后的多糖中会残留一定量的有毒物质。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种改性羊肚菌多糖、制备方法及应用，解决现有的改性方法改性后的多糖存在有毒物质，使得其应用受限的问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：
本发明公开的一种改性羊肚菌多糖制备方法，包括：
步骤1：将羊肚菌洗净、除杂、烘干、粉碎、乙醇脱脂后，通过水提醇沉法获得羊肚菌粗多糖，去除粗多糖中的蛋白质；
步骤2：将复合酶制剂加入至去除蛋白质后的羊肚菌粗多糖中，进行酶解反应，得到单糖或寡聚糖；其中，复合酶制剂包括几丁质酶与真菌β-葡聚糖酶；
步骤3：将酶解后的反应物进行高温真空熔融缩聚反应，得到改性羊肚菌多糖粗品；
步骤4：将改性羊肚菌多糖粗品经脱色、透析、浓缩、干燥后，得到改性羊肚菌多糖。
具体的，所述的几丁质酶与真菌β-葡聚糖酶的质量比为2：1。
具体的，所述的复合酶制剂的添加质量为羊肚菌粗多糖质量的0.2％～0.5％。
具体的，所述的步骤2中的酶解反应温度为36～40℃，pH值为5.8～6.4，时间为8～12小时。
具体的，所述的高温真空熔融缩聚反应条件为：温度120～160℃、真空度为-0.05～-0.09MPa、反应时间0.5～1.5小时。
具体的，所述的步骤1中使用Savage试剂去除粗多糖中的蛋白质。
具体的，所述的脱色的条件为：按质量百分数0.3％～0.5％的比例加入活性碳，在温度为60℃～80℃的条件下，脱色处理40～60分钟。
具体的，其特征在于，透析时，使用的透析袋的最大截留分子量为500Da，流水透析24小时，蒸馏水透析12小时。
本发明还公开了上述制备方法制备的改性羊肚菌多糖。
本发明还公开了上述制备方法制备的改性羊肚菌多糖用于促进肠道产短链脂肪酸细菌的增殖。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明根据羊肚菌多糖的结构特点，使用酶法改性结合高温真空熔融的方法，改善羊肚菌多糖的生物活性，通过实验发现，该方法制备的羊肚菌多糖可显著提高小鼠肠道内产短链脂肪酸细菌的占比，并可促进短链脂肪酸的产生。而短链脂肪酸具有保持肠道健康，增强免疫力等诸多保健效果，因此，本发明所制备的改性羊肚菌多糖具有更强的生物活性及更好的保健效果，在保健食品的生产中具有潜在的应用价值。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例中，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
实施例1
步骤1，羊肚菌粗多糖的制备：
采用水提醇沉法获得羊肚菌粗多糖。新鲜采集的羊肚菌烘干后，取200g羊肚菌子实体经粉碎后，加入1L 95％乙醇脱脂过夜，离心去除乙醇，样品自然干燥，加入20倍体积蒸馏水，95℃水浴6小时，反复提取3次，6000rpm离心收集上清，然后减压蒸馏浓缩，浓缩产物加入9倍体积无水乙醇过夜醇沉，醇沉产物6000rpm离心收集沉淀，沉淀用适量蒸馏水溶解，加入5倍体积Savage试剂(氯仿：正丁醇＝4：1，V/V)剧烈振荡，静置分层后收集上层溶液，重复操作直至蛋白除尽，除蛋白后的产物经过6000rpm离心，除去残留Savage试剂，减压蒸馏浓缩与醇沉，收集沉淀溶解后，冷冻干燥得到羊肚菌粗多糖。
步骤2，酶解：
将羊肚菌粗多糖与去离子水(其比例为1：4，w/w)混合均匀后，加入复合酶制剂，该复合酶制剂由几丁质酶与真菌β-葡聚糖酶按照重量比为2：1混合而成。复合酶制剂的添加量为0.2％，酶解反应的作用温度为38℃，pH值为6.1，作用时间为12小时。
步骤3，高温真空熔融缩聚：
将酶解后的反应液，使用旋转蒸发仪进行浓缩；将浓缩液冷冻干燥后进行高温真空熔融缩聚反应制得改性羊肚菌多糖粗品；其反应温度为120℃，真空度为-0.09MPa，反应时间为1.5小时。
步骤4，精制：
将改性羊肚菌多糖粗品按质量百分数0.3％的比例加入活性碳，在80℃的温度条件下脱色处理60分钟。随后，离心去除活性炭，将上清液进行透析；透析时，使用的透析袋的最大截留分子量为500Da，流水透析24小时，蒸馏水透析12小时。将透析后的截留液，使用旋转蒸发仪进行浓缩；将浓缩液冷冻干燥后，得到改性羊肚菌多糖精品。
本实施例制备的改性羊肚菌多糖用于促进肠道内产短链脂肪酸细菌的增殖及肠道内短链脂肪酸含量的提高，其增值效果同实施例2。
实施例2
步骤1，羊肚菌粗多糖的制备：制备过程与实施例1相同；
步骤2，酶解：将羊肚菌粗多糖与去离子水(其比例为1：4，w/w)混合均匀后，加入复合酶制剂，该复合酶制剂包括几丁质酶与真菌β-葡聚糖酶(重量比为2：1)。复合酶制剂的添加量为0.35％，酶解反应的作用温度为40℃，pH值为6.4，作用时间为10小时。
步骤3，高温真空熔融缩聚：将酶解后的反应液，使用旋转蒸发仪进行浓缩；将浓缩液冷冻干燥后进行高温真空熔融缩聚反应制得改性羊肚菌多糖粗品；其反应温度为140℃，真空度为-0.07MPa，反应时间为1.0小时。
步骤4，精制：将改性羊肚菌多糖粗品按质量百分数0.4％的比例加入活性碳，在70℃的温度条件下脱色处理50分钟。随后，离心去除活性炭，将上清液进行透析；透析时，使用的透析袋的最大截留分子量为500Da，流水透析24小时，蒸馏水透析12小时。将透析后的截留液，使用旋转蒸发仪进行浓缩；将浓缩液冷冻干燥后，得到改性羊肚菌多糖精品。
本实施例制备的改性羊肚菌多糖用于促进肠道内产短链脂肪酸细菌的增殖及肠道内短链脂肪酸含量的提高，其增值效果见表1、表2以及下述实验结果。
实施例3
步骤1，羊肚菌粗多糖的制备：制备过程与实施例1相同；
步骤2，酶解：将羊肚菌粗多糖与去离子水(其比例为1：4，w/w)混合均匀后，加入复合酶制剂，该复合酶制剂包括几丁质酶与真菌β-葡聚糖酶(重量比为2：1)。复合酶制剂的添加量为0.5％，酶解反应的作用温度为36℃，pH值为5.8，作用时间为8小时。
步骤3，高温真空熔融缩聚：将酶解后的反应液，使用旋转蒸发仪进行浓缩；将浓缩液冷冻干燥后进行高温真空熔融缩聚反应制得改性羊肚菌多糖粗品；其反应温度为160℃，真空度为-0.05MPa，反应时间为0.5小时。
步骤4，精制：将改性羊肚菌多糖粗品按质量百分数0.5％的比例加入活性碳，在60℃的温度条件下脱色处理40分钟。随后，离心去除活性炭，将上清液进行透析；透析时，使用的透析袋的最大截留分子量为500Da，流水透析24小时，蒸馏水透析12小时。将透析后的截留液，使用旋转蒸发仪进行浓缩；将浓缩液冷冻干燥后，得到改性羊肚菌多糖精品。
本实施例制备的改性羊肚菌多糖用于促进肠道内产短链脂肪酸细菌的增殖及肠道内短链脂肪酸含量的提高，其增值效果同实施例2。
对比例1
本对比例与实施例2的区别在于：使用实施例2中的步骤1与步骤4的操作，制备羊肚菌多糖。
本对比例制备的羊肚菌多糖用于促进肠道内产短链脂肪酸细菌的增殖及肠道内短链脂肪酸含量的提高，其增值效果见表1、表2和下述实验结果。
对比例2
本对比例与实施例2的区别在于：使用实施例2中的步骤1、步骤2与步骤4的操作，制备羊肚菌多糖。
本对比例制备的羊肚菌多糖用于促进肠道内产短链脂肪酸细菌的增殖及肠道内短链脂肪酸含量的提高，其增值效果见表1、表2和下述实验结果。
对比例3
本对比例与实施例2的区别在于：使用实施例2中的步骤1、步骤3与步骤4的操作，制备羊肚菌多糖。
本对比例制备的羊肚菌多糖用于促进肠道内产短链脂肪酸细菌的增殖及肠道内短链脂肪酸含量的提高，其增值效果见表1、表2和下述实验结果。
分别将实施例2与对比例1-3制备的羊肚菌多糖用于对小鼠盲肠内产短链脂肪酸细菌增殖效果及大肠中短链脂肪酸含量的提高程度进行测试，以此验证羊肚菌多糖的生物活性。
(1)实验方法
动物实验：
50只SPF BALB/c小鼠(8周龄，18至20g)被随机分为5组，每组10只，在无菌、22±1℃的环境下饲养一周后，采用灌胃的方式，每天对小鼠进行多糖给药，共进行7天。CT组为空白对照组，对小鼠不做任何处理；PC1-PC3组为实验对照组，其中每天为PC1组中的小鼠灌胃对比例1中所得的羊肚菌多糖(200mg/Kg体重)；PC2组为对比例2制备的羊肚菌多糖(200mg/Kg体重)；PC3组为对比例3制备的羊肚菌多糖(200mg/Kg体重)；PC4组为改性羊肚菌多糖组，每天为小鼠灌胃实施例2所得的改性羊肚菌多糖精品(200mg/Kg体重)。
盲肠内容物微生物多样性分析：
第8天，将小鼠处死，并收集各组小鼠的盲肠及大肠内容物，基于北京百迈克生物科技有限公司的llumina HiSeq测序平台，利用双末端测序(Paired-End)的方法，构建小片段文库，对盲肠内容物中的细菌16S rDNA进行测序。随后，利用北京百迈克生物科技有限公司的云计算平台对测序结果进行DNA测序序列的拼接过滤、OTUs(Operational TaxonomicUnits)聚类、物种注释及丰度分析等生物信息学分析以揭示样品的物种构成。在科水平，其优势物种的相对丰度占比如表1所示。
大肠中短链脂肪酸的检测：
将小鼠大肠内容物用蒸馏水以1:6的比例进行均质稀释；混匀后，室温静置30min，5000r/min离心10min，取0.1ml上清液，加入0.2％的浓盐酸和2-乙基丁酸(作为内标，其终浓度为1mmol/L)，4℃静置30min，6000r/min离心10min，取上清液，使用0.22um的滤膜过滤后用于气相色谱分析。
通过气相色谱仪进行色谱分析，色谱柱为DB-FFAP色谱柱(30m X0.535mm X 1um)，检测器为FID检测器。气相分析条件：载气为氦气，氦气流速为1.0mL/min，分流比为1:25；检测器温度为260℃，进样口温度为250℃。柱温箱升温程序：50℃保持1分钟，随后按15℃/min的升温速度，从50℃升温至120℃，再按5℃/min的升温速度，从120℃升温至170℃，再按15℃/min的升温速度，从170℃升温至240℃；最后240℃保持3.0分钟。样品进样量为1uL。
使用乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸作为标准品，按照以上方法，以峰面积为Y坐标轴，酸浓度为X坐标轴，用于标准曲线的绘制。各组小鼠大肠中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸含量如表2所示。
(2)实验结果
表1科水平的优势物种的相对丰度占比
上表中，产短链脂肪酸细菌a的说明：由于产短链脂肪酸的细菌主要分布在Lachnospiraceae、Ruminococcaceae和Erysipelotrichaceae这3科细菌中，因此，产短链脂肪酸细菌的占比主要是指以上三科细菌的占比之和。
表2各组小鼠大肠中短链脂肪酸的含量
经统计分析，改性羊肚菌多糖组(PC4)的小鼠盲肠内产短链脂肪酸细菌的占比均显著高于空白对照组(CT)和实验对照组(PC1-3)；改性羊肚菌多糖组(PC4)小鼠肠道中的丙酸、丁酸、戊酸含量均显著高于空白对照组和实验对照组(PC1-3)，而改性羊肚菌多糖组(PC4)小鼠肠道中的乙酸含量显著高于空白对照组(CT)、PC1与PC2组，而与PC3组的差别不大。说明在促进小鼠肠道内产短链脂肪酸细菌的增殖，以及促进肠道内短链脂肪酸的产生方面，本发明组所得的改性羊肚菌多糖的效果显著。
Claims (7)
1.一种改性羊肚菌多糖制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：将羊肚菌洗净、除杂、烘干、粉碎、乙醇脱脂后，通过水提醇沉法获得羊肚菌粗多糖，去除粗多糖中的蛋白质；
步骤2：将复合酶制剂加入至去除蛋白质后的羊肚菌粗多糖中，进行酶解反应，得到单糖或寡聚糖；其中，复合酶制剂包括几丁质酶与真菌β-葡聚糖酶；
步骤3：将酶解后的反应物进行高温真空熔融缩聚反应，得到改性羊肚菌多糖粗品；
所述的高温真空熔融缩聚反应条件为：温度120～160℃、真空度为-0.05～-0.09MPa、反应时间0.5～1.5小时；
步骤4：将改性羊肚菌多糖粗品经脱色、透析、浓缩、干燥后，得到改性羊肚菌多糖。
2.如权利要求1所述的改性羊肚菌多糖制备方法，其特征在于，所述的几丁质酶与真菌β-葡聚糖酶的质量比为2：1。
3.如权利要求1所述的改性羊肚菌多糖制备方法，其特征在于，所述的复合酶制剂的添加质量为羊肚菌粗多糖质量的0.2％～0.5％。
4.如权利要求1所述的改性羊肚菌多糖制备方法，其特征在于，所述的步骤2中的酶解反应温度为36～40℃，pH值为5.8～6.4，时间为8～12小时。
5.如权利要求1所述的改性羊肚菌多糖制备方法，其特征在于，所述的步骤1中使用Savage试剂去除粗多糖中的蛋白质。
6.如权利要求1所述的改性羊肚菌多糖制备方法，其特征在于，所述的脱色的条件为：按质量百分数0.3％～0.5％的比例加入活性碳，在温度为60℃～80℃的条件下，脱色处理40～60分钟。
7.如权利要求1所述的改性羊肚菌多糖制备方法，其特征在于，透析时，使用的透析袋的最大截留分子量为500Da，流水透析24小时，蒸馏水透析12小时。
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