CN113584102A - 具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微藻多糖制备技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法。通过超声波—微波—酶法协同提取微拟球藻内多糖，提取时充分结合了超声波对微拟球藻藻粉的空化破碎效果、微波对微拟球藻藻粉所造成的高能作用以及酶所对微拟球藻藻粉细胞壁的高效专一性质，增大了其内部多糖的溶出，大大提高了微拟球藻多糖的提取率；本发明对提取的微拟球藻多糖进行α‑淀粉酶修饰，改变多糖结构，使多糖空间结构上的剪切修饰后多糖的基团及结构发生变化，从而导致其物理化学性质可在不同程度上得到改变，以至提高其生物学活性，经修饰后的微拟球藻多糖DPPH自由基清除率(‑Sa/％)可由为经修饰的61.5％提升至78.9％，提升率为28.29％。
Description
技术领域
本发明属于微藻多糖制备技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法。
背景技术
微拟球藻(Nannochloropsis)，单细胞藻类，微拟球藻具有优质的蛋白质、丰富的藻黄素和紫黄素，并且含有丰富的油脂、饱和类脂肪酸以及不饱和脂肪酸等，藻类巨大的储量和极高的产量，现有技术中一般对微拟球藻应用在食品、畜牧饲料、保健品、生物柴油等方面具有广泛的研究，而对其其含有的多糖类活性物质少有研究。
微拟球藻中所含多糖为海藻多糖，其多糖组分与硅藻相似，葡萄糖占多糖的68％，另外还含有半乳糖、葡萄糖和木糖等多种胞外多糖。人们陆续发现海藻多糖具备很高的生物活性，有降低血糖血脂、抑菌、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、提高免疫力、参与细胞代谢等作用，且多数无毒，在开发成为海洋药物方面有较大的潜力。
海藻中多糖需要提取后使用，在海藻多糖提取过程中，不同的提取工艺对海藻多肽的空间结构、组成和理化性质都有不同程度的影响。一般海藻多糖的提取方法主要有：醇提取法、热水浸提法、碱浸提法、酶解提取法等。相对比而言，热水浸提法采用的温度为70～80℃，耗能多、提取时间长且容易破坏多糖结构；酶解提取法在工业生产中用量大，不经济；碱提取法会造成多糖生物活性的降低，提取率高的超临界流体提取，其费用高并且对仪器设备要求严格，也不符合经济性。
现有技术如授权公告号为CN103880971B的中国发明专利，公开了一种小球藻水不溶性多糖提取的方法。用40℃-90℃的热水提取，再加入糖苷水解酶进行水解，用简单工艺进行有效提取，但该方法只是进行了提取，没有对多糖的纯化活性进行深一步的研究。
现有技术如授权公告号为CN108821965A的中国发明专利，公开了一种复合酶法提取微拟球藻中EPA的方法。通过复合酶对微藻细胞壁结构和脂多糖等复合体进行降解。此方法虽具能耗低、绿色环保等优点。但是方法结构单一，单一方法的处理结果比复合协同技术的效率低，不能记性更快速、更高效的提取有效功能的活性多糖成分。
现有技术如授权公告号为CN106832030A的中国发明专利，公开了从海藻中提取活性多糖的方法。用丙酮-石油醚混合液回流脱脂，用乙醇回流脱苷类和生物碱，进行除杂；复合酶制剂酶解纤维素和果胶的效率高，并且酶解充分，对细胞壁的破坏率高；酶解将纤维素与果胶水解，破坏细胞壁结构，并且辅以超声波提取，焦磷酸钾和聚磷酸铵通过硫酸镁醋精产生意想不到的效果，促进活性多糖从海藻细胞中流出溶解于水中，活性多糖的提取率高；用Sevage试剂使蛋白质变性，去除蛋白；采用超滤、凝胶层析和透析对粗制海藻活性多糖粉末进行分离纯化，得到的海藻活性多糖，然而且缺陷在于，得到的海藻活性多糖抗氧化功能比较局限。
此外，经传统方法制备的海藻多糖，常混有较多的蛋白质，必须予以去除。一般选择使蛋白质沉淀而使多糖不沉淀的试剂来处理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等，但处理过程中多糖极易降解。因此，对海藻多糖高效提取与纯化十分困难。在海藻多糖的提取分离技术上还存在缺陷。
发明内容
针对以上技术问题，本发明在于提供一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，采用超声波—微波—酶法对微拟球藻中多糖进行提取，并将提取的多糖进行修饰，制备了具有较高抗氧化活性的微拟球藻多糖。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
本发明所述的具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)将微拟球藻粉溶于水，置于超声波-微波条件下处理，得提取液；
(2)向所得提取液中投入复合酶进行酶解，所述复合酶为纤维素酶与果胶酶；
(3)酶解后灭酶处理，冷却后酶解液置于离心机中离心，得上清液；
(4)将上清液减压蒸馏，加入无水乙醇醇沉；
(5)醇沉混合液离心，将离心沉淀物冷冻至共晶点，真空冷冻干燥，得微拟球藻粉多糖粗提物；
(6)将多糖粗提物溶解并加入脱色剂，置于摇床内震荡脱色，脱色后离心得处理液；
(7)向处理液中加入Sevage试剂混匀除去蛋白质，离心后得上清液真空冷冻干燥处理，得到微拟球藻多糖纯化物；
(8)配制微拟球藻多糖纯化物溶液，加入α-淀粉酶对微拟球藻多糖进行修饰处理，高温灭酶后得酶修饰微拟球藻多糖。
作为本发明技术方案的进一步优选：
优选的，步骤(1)中配制微拟球藻溶液的料液比为1：10g/ml，超声波的功率为300W-400W，微波的功率为100-200W，超声波-微波的处理时间为15-25min。
优选的，步骤(2)中纤维素酶与果胶酶的质量比为1：1，提取液中复合酶的用量为0.2％-0.4％，酶解的温度为40-60℃。
优选的，步骤(3)中灭酶处理为高温灭酶，灭酶温度为80℃，灭酶时间为30min。
优选的，步骤(4)中无水乙醇的用量为减压蒸馏后溶液体积的3倍。
优选的，步骤(5)中共晶点温度为＜-70℃。
优选的，步骤(3)、(5)、(6)、(7)中所述离心机均为高速冷冻离心机，离心时离心转速为5000r/min，温度为4℃，时间15min，离心时采用高速冷冻离心机低温离心，可以保持活性物质的生物活性。
优选的，步骤(6)中脱色剂为活性炭，活性炭的用量为0.03-0.1g/mL，脱色工艺为：微拟球藻粗多糖溶液浓度为0.5-1.5mg/mL，摇床转速为100-200r/min，脱色温度为40-50℃，脱色时间为0.5-1.5h。
优选的，步骤(7)中Sevage试剂中氯仿:正丁醇＝3:1(V/V)，Sevage试剂与处理液的用量比为4:1(V/V)。
优选的，步骤(8)中微拟球藻多糖纯化物溶液的浓度为1mg/mL，α-淀粉酶加酶量为200～280U/g，修饰温度为45～55℃，修饰时间为10～20min。
作为一个优选的技术方案，本发明所述的具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)称取微拟球藻藻粉10g加入100mL蒸馏水，置于提取仪中，在300W～400W超声波功率，100-200W微波功率条件下进行超声波—微波处理15min，得提取液；
(2)50℃条件下向提取液中加入0.2％～0.4％的复合酶，所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，纤维素酶：果胶酶＝1：1，酶解2h，得酶解液；
(3)酶解液80℃水浴灭酶30min，冷却后置于高速冷冻离心机中5000r/min，4℃下离心15min，取上清液；
(4)上清液经过减压蒸馏后，以其3倍剩余溶液体积的无水乙醇进行醇沉，静置10min；
(5)将醇沉结束的混合液置于离心机中以5000r/min，4℃的离心条件对其进行低温离心15min，将离心沉淀物冷冻至共晶点以下后，进行真空冷冻干燥处理，得到微拟球藻多糖的多糖粗提物；
(6)除色素：配置1mg/mL的微拟球藻粗多糖溶液，并加入0.06g/mL的活性炭粉末置于恒温摇床中，在150r/min，45℃的脱色条件下进行脱色处理1h；脱色后的粗多糖溶液用低温离心机在5000r/min、4℃的离心条件下低温离心15min；
(7)除蛋白：将Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝3：1)与微拟球藻粗多糖溶液严格按照4：1的混合比例进行混匀0.5h，混合搅拌处理结束后，将除蛋白混合溶液在7500r/min转速、4℃的离心条件下进行低温离心操作15min，离心结束后取上清液进行真空冷冻干燥处理，得到微拟球藻多糖的多糖纯化物。
(8)将纯化后的微拟球藻多糖用蒸馏水配置成浓度为1mg/mL的微拟球藻多糖溶液，加入α-淀粉酶，α-淀粉酶加酶量为200～280U/g，在45～55℃的修饰温度下，对微拟球藻多糖进行修饰10～20min，修饰结束后进行10min的沸水浴灭酶处理，得到酶修饰微拟球藻多糖。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果。
(1)本发明通过超声波—微波—酶法协同提取微拟球藻内多糖，提取时充分结合了超声波对微拟球藻藻粉的空化破碎效果、微波对微拟球藻藻粉所造成的高能作用以及酶所对微拟球藻藻粉细胞壁的高效专一性质，增大了其内部多糖的溶出，大大提高了微拟球藻多糖的提取率；
(2)本发明对提取的微拟球藻多糖进行α-淀粉酶修饰，α-淀粉酶可剪切多糖α-1,4-糖苷键，发生半缩醛羟基转位作用，改变多糖结构，使多糖空间结构上的剪切修饰后多糖的基团及结构发生变化，从而导致其物理化学性质可在不同程度上得到改变，以至提高其生物学活性，经修饰后的微拟球藻多糖DPPH自由基清除率(-Sa/％)可由为经修饰的61.5％提升至78.9％，提升率为28.29％。
附图说明
图1为本发明所述制备方法工艺流程图。
具体实施方式
下面结合实施例和说明书附图对本发明做进一步说明。
实施例1-3中所使用提取仪均为电脑微波超声波紫外组合催化合成萃取仪，型号规格XH-300UA(北京祥鹄科技发展有限公司)。
实施例1
本发明所述的具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)称取微拟球藻藻粉10g加入100mL蒸馏水，置于提取仪中，在350W超声波功率，150W微波功率条件下进行超声波—微波处理20min，得提取液；
(2)50℃条件下向提取液中加入0.3％的复合酶，所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，纤维素酶：果胶酶＝1：1，酶解2h，得酶解液；
(3)酶解液80℃水浴灭酶30min，冷却后置于高速冷冻离心机中5000r/min，4℃下离心15min，取上清液；
(4)上清液经过减压蒸馏后，以其3倍剩余溶液体积的无水乙醇进行醇沉，静置10min；
(5)将醇沉结束的混合液置于离心机中以5000r/min，4℃的离心条件对其进行低温离心15min，将离心沉淀物冷冻至共晶点以下后，进行真空冷冻干燥处理，得到微拟球藻多糖的多糖粗提物；
(6)除色素：配置1mg/mL的微拟球藻粗多糖溶液，并加入0.06g/mL的活性炭粉末置于恒温摇床中，在150r/min，45℃的脱色条件下进行脱色处理1h；脱色后的粗多糖溶液用低温离心机在5000r/min，4℃的离心条件下低温离心15min；
(7)除蛋白：将Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝3：1)与微拟球藻粗多糖溶液严格按照4：1的混合比例进行混匀0.5h，混合搅拌处理结束后，将除蛋白混合溶液在7500r/min转速，4℃的离心条件下进行低温离心操作15min，离心结束后取上清液进行真空冷冻干燥处理，得到微拟球藻多糖的多糖纯化物；
(8)将纯化后的微拟球藻多糖用蒸馏水配置成浓度为1mg/mL的微拟球藻多糖溶液，加入α-淀粉酶，α-淀粉酶加酶量为240U/g，在50℃的修饰温度下，对微拟球藻多糖进行修饰20min，修饰结束后进行10min的沸水浴灭酶处理，得到酶修饰微拟球藻多糖。
以DPPH自由基清除率来作为微拟球藻多糖酶修饰效果的检测指标。取2mL的浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液，并向其中加入0.1mg/mL、2mL配置好的微拟球藻修饰多糖溶液，混合均匀后，室温条件下保持黑暗中反应30min。结束后在517nm处测量其吸光值Ai；取2mL的微拟球藻修饰多糖溶液加入2mL无水乙醇，其处理操作同上,测其吸光值Aj；取2mL的DPPH溶液加入2mL无水乙醇，其处理操作同上，测其吸光值A0。取2mL蒸馏水加2mL无水乙醇同上处理操作用以对本试验过程进行调零处理。
另取2mL的浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液，并向其中加入0.1mg/mL、2mL配置好的未修饰微拟球藻多糖溶液重复上述操作，计算DPPH自由基清除率(Sa/％)。
计算DPPH自由基清除率(Sa/％)公式为：
实验测得修饰后多糖DPPH自由基清除率为78.9％，而其未修饰多糖DPPH自由基清除率为61.5％，提高了28.29％，说明提取的微拟球藻多糖经修饰后抗氧化活性明显增强。
对比例
为了验证本申请超声波微波—酶法协同提取微拟球藻多糖，本发明提供如下对比例：
称取微拟球藻藻粉10g加入100mL蒸馏水，在350W超声波功率，150W微波功率条件下进行超声波—微波处理20min，得提取液；50℃条件下提取2h却后置于高速冷冻离心机中5000r/min，4℃下离心15min，取上清液；上清液经过减压蒸馏后，以其3倍剩余溶液体积的无水乙醇进行醇沉，静置10min；将醇沉结束的混合液置于离心机中以5000r/min，4℃的离心条件对其进行低温离心15min，将离心沉淀物冷冻至共晶点以下后，进行真空冷冻干燥处理，得到微拟球藻多糖的多糖粗提物；其粗多糖提取率为0.70％。
本发明实施例1中步骤(5)中多糖的提取率为1.24％，可见复合酶处理后提取率有较大提升。
实施例2
(1)称取微拟球藻藻粉10g加入100mL蒸馏水，置于提取仪中，在300W超声波功率，100W微波功率条件下进行超声波—微波处理15min，得提取液；
(2)50℃条件下向提取液中加入0.2％的复合酶，所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，纤维素酶：果胶酶＝1：1，酶解2h，得酶解液；
(3)酶解液80℃水浴灭酶30min，冷却后置于高速冷冻离心机中5000r/min，4℃下离心15min，取上清液；
(4)上清液经过减压蒸馏后，以其3倍剩余溶液体积的无水乙醇进行醇沉，静置10min；
(5)将醇沉结束的混合液置于离心机中以5000r/min，4℃的离心条件对其进行低温离心15min，将离心沉淀物冷冻至共晶点以下后，进行真空冷冻干燥处理，得到微拟球藻多糖的多糖粗提物；多糖提取率0.96％；
(6)除色素：配置1mg/mL的微拟球藻粗多糖溶液，并加入0.03g/mL的活性炭粉末置于恒温摇床中，在150r/min，40℃的脱色条件下进行脱色处理1h；脱色后的粗多糖溶液用低温离心机在5000r/min，4℃的离心条件下低温离心15min；
(7)除蛋白：将Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝3：1)与微拟球藻粗多糖溶液严格按照4：1的混合比例进行混匀0.5h，混合搅拌处理结束后，将除蛋白混合溶液在7500r/min转速，4℃的离心条件下进行低温离心操作15min，离心结束后取上清液进行真空冷冻干燥处理，得到微拟球藻多糖的多糖纯化物；
(8)将纯化后的微拟球藻多糖用蒸馏水配置成浓度为1mg/mL的微拟球藻多糖溶液，加入α-淀粉酶，α-淀粉酶加酶量为200U/g，在45℃的修饰温度下，对微拟球藻多糖进行修饰10min，修饰结束后进行10min的沸水浴灭酶处理，得到酶修饰微拟球藻多糖。
实施例3
(1)称取微拟球藻藻粉10g加入100mL蒸馏水，置于提取仪中，在400W超声波功率，200W微波功率条件下进行超声波—微波处理25min，得提取液；
(2)50℃条件下向提取液中加入1％的复合酶，所述复合酶为纤维素酶和果胶酶，纤维素酶：果胶酶＝1：1，酶解2h，得酶解液；
(3)酶解液80℃水浴灭酶30min，冷却后置于高速冷冻离心机中5000r/min，4℃下离心15min，取上清液；
(4)上清液经过减压蒸馏后，以其3倍剩余溶液体积的无水乙醇进行醇沉，静置10min；
(5)将醇沉结束的混合液置于离心机中以5000r/min，4℃的离心条件对其进行低温离心15min，将离心沉淀物冷冻至共晶点以下后，进行真空冷冻干燥处理，得到微拟球藻多糖的多糖粗提物；多糖提取率提取率0.87％；
(6)除色素：配置1mg/mL的微拟球藻粗多糖溶液，并加入0.06g/mL的活性炭粉末置于恒温摇床中，在150r/min，45℃的脱色条件下进行脱色处理1h；脱色后的粗多糖溶液用低温离心机在5000r/min，4℃的离心条件下低温离心15min；
(7)除蛋白：将Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝3：1)与微拟球藻粗多糖溶液严格按照4：1的混合比例进行混匀0.5h，混合搅拌处理结束后，将除蛋白混合溶液在7500r/min转速，4℃的离心条件下进行低温离心操作15min，离心结束后取上清液进行真空冷冻干燥处理，得到微拟球藻多糖的多糖纯化物；
(8)将纯化后的微拟球藻多糖用蒸馏水配置成浓度为1mg/mL的微拟球藻多糖溶液，加入α-淀粉酶，α-淀粉酶加酶量为280U/g，在55℃的修饰温度下，对微拟球藻多糖进行修饰20min，修饰结束后进行10min的沸水浴灭酶处理，得到酶修饰微拟球藻多糖。
Claims (10)
1.一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将微拟球藻粉溶于水，置于超声波-微波条件下处理，得提取液；
(2)向所得提取液中投入复合酶进行酶解，所述复合酶为纤维素酶与果胶酶；
(3)酶解后灭酶处理，冷却后酶解液置于离心机中离心，得上清液；
(4)将上清液减压蒸馏，加入无水乙醇醇沉；
(5)醇沉混合液离心，将离心沉淀物冷冻至共晶点，真空冷冻干燥，得微拟球藻粉多糖粗提物；
(6)将多糖粗提物溶解并加入脱色剂，置于摇床内震荡脱色，脱色后离心得处理液；
(7)向处理液中加入Sevage试剂混匀除去蛋白质，离心后得上清液真空冷冻干燥处理，得到微拟球藻多糖纯化物；
(8)配制微拟球藻多糖纯化物溶液，加入α-淀粉酶对微拟球藻多糖进行修饰处理，高温灭酶后得酶修饰微拟球藻多糖。
2.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中配制微拟球藻溶液的料液比为1：10g/ml，超声波的功率为300W-400W，微波的功率为100-200W，超声波-微波的处理时间为15-25min。
3.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于：步骤(2)中纤维素酶与果胶酶的质量比为1：1，提取液中复合酶的用量为0.2％-0.4％，酶解的温度为40-60℃。
4.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于：步骤(3)中灭酶处理为高温灭酶，灭酶温度为80℃，灭酶时间为30min。
5.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于：步骤(4)中无水乙醇的用量为减压蒸馏后溶液体积的3倍。
6.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于：步骤(5)中共晶点温度为＜-70℃。
7.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于：步骤(3)、(5)、(6)、(7)中所述离心机均为高速冷冻离心机，离心时离心转速为5000r/min，温度为4℃，时间15min。
8.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于：步骤(6)中脱色剂为活性炭，活性炭的用量为0.03-0.1g/mL，脱色工艺为：微拟球藻粗多糖溶液浓度为0.5-1.5mg/mL，摇床转速为100-200r/min，脱色温度为40-50℃，脱色时间为0.5-1.5h。
9.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于：步骤(7)中Sevage试剂中氯仿:正丁醇＝3:1V/V，Sevage试剂与处理液的用量比为4:1V/V。
10.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于：步骤(8)中微拟球藻多糖纯化物溶液的浓度为1mg/mL，α-淀粉酶加酶量为200～280U/g，修饰温度为45～55℃，修饰时间为10～20min。
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