CN107880144A - 一种活性小球藻多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种活性小球藻多糖的制备方法，其具体步骤为：将小球藻粉和水混合均匀，再加入8‑氯茶碱，超声波破碎，离心，留下上清液；调节上清液的pH，提取后离心，上清液即为小球藻粗多糖溶液；采用酶解法‑Sevage法除蛋白，然后将上清液干燥得到脱蛋白多糖；将小球藻多糖溶于无水甲酰胺中，冰水浴搅拌，加入酯化试反应，反应完成后离心，收集上清液，透析，浓缩，醇沉，离心，沉淀加水复溶，浓缩，冷冻干燥得活性小球藻多糖。有益效果为：本发明提取方法简单可行，机械化操作成度高，提取效率高，耗时短，小球藻多糖的提取率高、活性高，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力。

Description

一种活性小球藻多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及天然活性成分领域，特别涉及一种活性小球藻多糖的制备方法。

背景技术

海洋覆盖着地球的表面积，广阔的海洋面积及其特殊的环境，导致了海洋生物物种的多样性远远超过了陆地生物物种多样性。海洋微生物种类及资源是不可估量的，种类繁多。与陆地环境相比，由于海洋高压、高盐、低温特别是深海或局部高温、寡营养、无光照等特殊生活环境，使海洋微生物不仅以其独特的生物代谢方式在极端的生态环境中得以生存，而且还可以产生与陆地微生物不同的活性代谢产物。特殊环境微生物是在特殊的生境或极端的环境下形成的具有特殊功能或特殊构造与组分的生物资源，它拥有特殊的基因及其表达产物或性状，是人类尚未充分开发利用的珍贵遗传资源宝库，也是获取丰富微生物多糖的宝贵资源。因此，海洋微生物多糖独特的化学结构和生物活性研究受到广泛关注。近年来，海洋微生物多糖的结构及生物活性研究取得了显著进展。真菌多糖作为多糖研究领域中的一个重要分支，因其独特的生物活性而引起越来越多的关注。近年来，已有大量关于真菌多糖生物活性的研究报道，主要集中在抗肿瘤、免疫调节、抗突变、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化、抗辐射和抗溃疡等方面。

小球藻属于绿藻门（Chlorophyta）绿球藻目（Chlorococcales）卵囊藻科（Oocysteceae）小球藻属（Chlorella），是一种广泛分布的海洋微藻。小球藻中富含多糖类成分，其多糖的生物活性多样，具有很高的抗肿瘤和降血糖活性，可促进脾淋巴细胞及腹腔巨噬细胞的增殖，成为人们研究的重点。

现有技术如授权公告号为CN 103880971 B的中国发明专利，公开了一种小球藻水不溶性多糖提取的方法，该方法包括原料的处理、酶法提取、分离、浓缩、醇沉、干燥等工艺。该多糖原料来源丰富、廉价，可来源于小球藻产油后的残渣，而且方法工艺简单、生产成本低廉，是一种有效提升小球藻高附加值和综合利用率的方法。但是该提取方法的提取效率低，得到的小球藻多糖活性较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取方法简单可行，机械化操作成度高，提取效率高，耗时短，小球藻多糖的提取率高、活性高，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力的活性小球藻多糖的制备方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种活性小球藻多糖的制备方法，包括超声波破碎、小球藻粗多糖制备、酶解法-Sevage法除蛋白、多糖修饰，其具体步骤为：

超声波破碎：按料液比为1:8-12将小球藻粉和水混合均匀，再加入8-氯茶碱，在超声波功率为500-520MPa的条件下超声波破碎8-15min，然后置于转速为7000-9000r/min的离心机中离心8-15min，留下上清液，备用，8-氯茶碱为脱脂小球藻粉的重量的0.22-0.33‰，8-氯茶碱能提高小球藻粉在水中的分散性，避免团聚现象的发生，使得超声微波能更好地作用于小球藻粉，提高小球藻的破壁率，同时在小球藻多糖提取时能让提取出来的多糖快速溶于水中，缩短了提取时间，减少能源消耗，最终提高小球藻的提取效果和小球藻多糖的得率，该步骤利用超声波对小球藻进行破壁，超声波能够在局部产生强大的高速射流，从而大大增加了传质效率，让细胞内部的多糖等活性物质更加快速完全地释放了出来，具有快速、操作简单、节能、高效等特点；

小球藻粗多糖制备：将超声波破碎步骤得到的上清液的pH调至9.5-10.2，然后在温度为65-75℃下提取3-5h，然后置于转速为3000-5000r/min的离心机中离心8-15min，上清液即为小球藻粗多糖溶液，备用，破碎后的多糖提取率整体高于直接水提的多糖提取率，提取的温度、pH都小于直接水提，大大降低了小球藻多糖提取时所消耗的能源，且能够保护小球藻多糖的螺旋结构不被破坏，进而保持多糖的活性，具有很大的发展前景；

酶解法-Sevage法除蛋白：按酶添加量为220-250U/g和380-420U/g向小球藻粗多糖溶液中加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为50-60℃、pH为7.7-8.5的条件下酶解2-3h，酶解完成后在90-100℃下灭酶20-30min，冷却至室温，然后置于转速为3000-5000r/min的离心机中离心8-15min，再将上清液中以体积比1:3-5加入Sevage试剂，混合后剧烈振摇20-30min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复2-3次，将上清液干燥得到脱蛋白多糖，酶解法能够将糖液中游离的蛋白质和部分糖蛋白水解，从而大大的降低多糖中的蛋白质含量，但是加酶量不适宜易引入外来的蛋白质，因此在酶解之后，再用Sevage法处理，能够有效的脱除多糖液中游离及酶解的蛋白质，并保证多糖的存在，有效的降低了多糖的损失率；

多糖修饰：按料液比为1:80-120将小球藻多糖溶于无水甲酰胺中，冰水浴搅拌，加入酯化试，然后在55-65℃下反应100-150min，反应完成后，恢复至室温，调节pH至6.5-7.5，在6000-8000rpm下离心15-20min，收集上清液，透析，浓缩至原体积的20-30%，再加入3-5倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，静置过夜，进行沉淀多糖，在6000-8000rpm下离心15-20min，沉淀加水复溶，旋蒸浓缩，冷冻干燥得活性小球藻多糖，酯化试为重量比为1:4-6:0.002-0.003的氯磺酸、吡啶和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制备得到，该酯化剂一方面能明显改善制备的多糖在水溶液中的分布状态，大大提高其溶解性，另一方面酯化剂中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的加入能提高酯化试剂中氯磺酸吡啶衍生物-吡啶-SO₃复合物的生成量，使得小球藻多糖可充分与之反应，使得小球藻多糖更易被硫酸化修饰，大大提高硫酸化产物的得率，最终提高小球藻多糖的活性，该步骤使得小球藻多糖中的羟基被硫酸基团取代，形成的天然、半合成多糖，对多糖进行硫酸化分子修饰得到很好的效果，使多糖的空间构象发生改变，大大增强多糖原有的生物活性功能，且使多糖产生其原来并不具备的新活性。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明提取方法简单可行，机械化操作成度高，提取效率高，耗时短，小球藻多糖的提取率高、活性高，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力；2）本发明利用超声波对小球藻进行破壁，然后再进行水提，破碎后的多糖提取率整体高于直接水提的多糖提取率，提取的温度、pH都小于直接水提，大大降低了小球藻多糖提取时所消耗的能源，且能够保护小球藻多糖的螺旋结构不被破坏，进而保持多糖的活性，具有很大的发展前景；3）本发明对多糖进行修饰，使得小球藻多糖中的羟基被硫酸基团取代，使多糖的空间构象发生改变，大大增强多糖原有的生物活性功能，且使多糖产生其原来并不具备的新活性。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种活性小球藻多糖的制备方法，包括超声波破碎、小球藻粗多糖制备、酶解法-Sevage法除蛋白、多糖修饰，其具体步骤为：

1）超声波破碎：按料液比为1:12将小球藻粉和水混合均匀，再加入8-氯茶碱，在超声波功率为500MPa的条件下超声波破碎15min，然后置于转速为7000r/min的离心机中离心15min，留下上清液，备用，8-氯茶碱为脱脂小球藻粉的重量的0.22‰；

2）小球藻粗多糖制备：将超声波破碎步骤得到的上清液的pH调至10.2，然后在温度为65℃下提取5h，然后置于转速为3000r/min的离心机中离心15min，上清液即为小球藻粗多糖溶液，备用；

3）酶解法-Sevage法除蛋白：按酶添加量为220U/g和420U/g向小球藻粗多糖溶液中加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为50℃、pH为8.5的条件下酶解2h，酶解完成后在100℃下灭酶20min，冷却至室温，然后置于转速为5000r/min的离心机中离心8min，再将上清液中以体积比1:5加入Sevage试剂，混合后剧烈振摇20min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复3次，将上清液干燥得到脱蛋白多糖液；

4）多糖修饰：按料液比为1:80将小球藻多糖溶于无水甲酰胺中，冰水浴搅拌，加入酯化试，然后在65℃下反应100min，反应完成后，恢复至室温，调节pH至7.5，在6000rpm下离心20min，收集上清液，透析，浓缩至原体积的20%，再加入5倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，静置过夜，进行沉淀多糖，在6000rpm下离心20min，沉淀加水复溶，旋蒸浓缩，冷冻干燥得活性小球藻多糖，酯化试为重量比为1:4:0.003的氯磺酸、吡啶和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制备得到。

实施例2：

一种活性小球藻多糖的制备方法，包括超声波破碎、小球藻粗多糖制备、酶解法-Sevage法除蛋白、多糖修饰，其具体步骤为：

1）超声波破碎：按料液比为1:8将小球藻粉和水混合均匀，再加入8-氯茶碱，在超声波功率为520MPa的条件下超声波破碎8min，然后置于转速为9000r/min的离心机中离心8min，留下上清液，备用，8-氯茶碱为脱脂小球藻粉的重量的0.33‰；

2）小球藻粗多糖制备：将超声波破碎步骤得到的上清液的pH调至9.5，然后在温度为75℃下提取3h，然后置于转速为5000r/min的离心机中离心8min，上清液即为小球藻粗多糖溶液，备用；

3）酶解法-Sevage法除蛋白：按酶添加量为250U/g和380U/g向小球藻粗多糖溶液中加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为60℃、pH为7.7的条件下酶解3h，酶解完成后在90℃下灭酶30min，冷却至室温，然后置于转速为3000r/min的离心机中离心15min，再将上清液中以体积比1:3加入Sevage试剂，混合后剧烈振摇30min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复2次，将上清液干燥得到脱蛋白多糖液；

4）多糖修饰：按料液比为1:120将小球藻多糖溶于无水甲酰胺中，冰水浴搅拌，加入酯化试，然后在55℃下反应150min，反应完成后，恢复至室温，调节pH至6.5，在8000rpm下离心15min，收集上清液，透析，浓缩至原体积的30%，再加入3倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，静置过夜，进行沉淀多糖，在8000rpm下离心15min，沉淀加水复溶，旋蒸浓缩，冷冻干燥得活性小球藻多糖，酯化试为重量比为1:6:0.002的氯磺酸、吡啶和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制备得到。

实施例3：

一种活性小球藻多糖的制备方法，包括超声波破碎、小球藻粗多糖制备、酶解法-Sevage法除蛋白、多糖修饰，其具体步骤为：

1）超声波破碎：按料液比为1:10将小球藻粉和水混合均匀，再加入8-氯茶碱，在超声波功率为510MPa的条件下超声波破碎12min，然后置于转速为8000r/min的离心机中离心10min，留下上清液，备用，8-氯茶碱为脱脂小球藻粉的重量的0.28‰；

2）小球藻粗多糖制备：将超声波破碎步骤得到的上清液的pH调至10.0，然后在温度为70℃下提取4h，然后置于转速为4000r/min的离心机中离心10min，上清液即为小球藻粗多糖溶液，备用；

3）酶解法-Sevage法除蛋白：按酶添加量为240U/g和400U/g向小球藻粗多糖溶液中加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为55℃、pH为8.0的条件下酶解2.5h，酶解完成后在95℃下灭酶25min，冷却至室温，然后置于转速为4000r/min的离心机中离心10min，再将上清液中以体积比1:4加入Sevage试剂，混合后剧烈振摇25min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复2次，将上清液干燥得到脱蛋白多糖液；

4）多糖修饰：按料液比为1:100将小球藻多糖溶于无水甲酰胺中，冰水浴搅拌，加入酯化试，然后在60℃下反应120min，反应完成后，恢复至室温，调节pH至7.0，在7000rpm下离心18min，收集上清液，透析，浓缩至原体积的25%，再加入4倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，静置过夜，进行沉淀多糖，在7000rpm下离心18min，沉淀加水复溶，旋蒸浓缩，冷冻干燥得活性小球藻多糖，酯化试为重量比为1:5:0.0025的氯磺酸、吡啶和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制备得到。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种活性小球藻多糖的制备方法，包括超声波破碎、小球藻粗多糖制备、酶解法-Sevage法除蛋白、多糖修饰，其特征在于：所述超声波破碎步骤为：将小球藻粉和水混合均匀，再加入8-氯茶碱，超声波破碎，离心，留下上清液，备用。

2.根据权利要求1所述的一种活性小球藻多糖的制备方法，其特征在于：所述小球藻粉和水的料液比为1:8-12，超声波破碎功率为500-520MPa、时间为8-15min。

3.根据权利要求1所述的一种活性小球藻多糖的制备方法，其特征在于：所述8-氯茶碱为脱脂小球藻粉的重量的0.22-0.33‰。

4.根据权利要求1所述的一种活性小球藻多糖的制备方法，其特征在于：所述小球藻粗多糖制备步骤为：将超声波破碎步骤得到的上清液的pH调至9.5-10.2，然后在温度为65-75℃下提取3-5h，然后离心，上清液即为小球藻粗多糖溶液，备用。

5.根据权利要求1所述的一种活性小球藻多糖的制备方法，其特征在于：所述酶解法-Sevage法除蛋白步骤为：按酶添加量为220-250U/g和380-420U/g向小球藻粗多糖溶液中加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为50-60℃、pH为7.7-8.5的条件下酶解2-3h，酶解完成后在90-100℃下灭酶20-30min，冷却至室温，然后置于转速为3000-5000r/min的离心机中离心8-15min，再将上清液中以体积比1:3-5加入Sevage试剂，混合后剧烈振摇20-30min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复2-3次，将上清液干燥得到脱蛋白多糖液。

6.根据权利要求1所述的一种活性小球藻多糖的制备方法，其特征在于：所述多糖修饰步骤为：按料液比为1:80-120将小球藻多糖溶于无水甲酰胺中，冰水浴搅拌，加入酯化试，然后在55-65℃下反应100-150min，反应完成后，恢复至室温，调节pH至6.5-7.5，离心，收集上清液，透析，浓缩至原体积的20-30%，再加入3-5倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，静置过夜，进行沉淀多糖，离心，沉淀加水复溶，旋蒸浓缩，冷冻干燥得活性小球藻多糖。

7.根据权利要求6所述的一种活性小球藻多糖的制备方法，其特征在于：所述酯化试为重量比为1:4-6:0.002-0.003的氯磺酸、吡啶和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺制备得到。