CN115819638A - 一种不同分子量银耳多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不同分子量银耳多糖的制备方法，其包括S1.以有机酸作为溶剂，对银耳粉进行溶解，得到银耳酸解液；S2.将银耳酸解液经高压加热处理，然后待银耳酸解液冷却至室温后离心，得到银耳酸解上清液；S3.将银耳酸解上清液直接浓缩得到银耳浓缩液，或者银耳酸解上清液经酵母菌和嗜热菌组合发酵后得到发酵液，离心后的发酵上清液经浓缩，得到银耳浓缩液；S4.将银耳浓缩液进行醇沉处理，得到银耳醇沉液；S5.得到的银耳醇沉液经抽滤，得到银耳多糖滤渣，滤渣冻干处理后，即得银耳多糖。本发明通过改变提取条件，从而精准制得具有不同分子量的银耳多糖。
Description
技术领域
本发明涉及银耳多糖提取领域，特别涉及一种不同分子量银耳多糖的制备方法。
背景技术
银耳(Tremellafucifor,nis Berk)，又名雪耳、白木耳、菊花耳，主要含有蛋白质、碳水化合物等，维生素和多种氨基酸等，可供药用和滋补食品用。银耳主产于四川、贵州、湖北、陕西、福建、浙江等省，近年来子实体的主要活性成分之一银耳多糖逐渐成为研究的热点。现代研究证实银耳多糖主要是以α-(1-3)-D甘露糖为主链的杂多糖，具有多种生物学活性，如免疫调节、抗肿瘤、抗氧化衰老、降血糖血脂、抗凝血血栓、抗溃疡、促进蛋白质合成、抗病毒、促进神经细胞生长及改善记忆力等。
近30年来，随着植物提取技术的研究发展，银耳多糖的提取已有一定进展，多糖活性组分研究也逐步深入，传统的方法主要有水提取法、酶解提取法、酸碱提取法等。
但是，目前不同分子量银耳多糖的制备工艺研究还不甚成熟，还需要进一步的完善。市场上不同分子量的透明质酸应用于诸多领域，例如超高分子量透明质酸(≥300万Da)用于填充、关节润滑；高分子量透明质酸(≥100万Da)用于保湿、增稠；中分子量透明质酸(1万Da≤100万Da)用于持久保湿、修护皮肤屏障；低分子量透明质酸(≤1万Da)用于深层保湿、抗炎、修复；透明质酸寡聚糖(≤5000Da)用于伤口愈合、肠胃修复、抗氧化。而银耳多糖被认为是一种植物源性类透明质酸物质，其具有透明质酸同等的保湿能力，并且还能抗击部分自由基，特别适用于护肤品里。因此研究不同分子量银耳多糖的制备方法及细化其作用尤为重要。
用水提取法得到银耳多糖的方法，虽然操作简单，但是在提取过程中一些非糖物质被提出，如由于银耳多糖外具有糖蛋白，糖蛋白在后续粗多糖的分离纯化会比较困难。
现阶段提取银耳多糖最常用的是酶解提取法。酶解提取法条件温和、杂质易除、得率高。酶解法一般多用果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶的复合酶。酶解法对工艺条件要求相对较高。
用酸碱提取法得到的银耳多糖中含有水法无法提到的多糖，但是用酸碱提取时，银耳多糖容易发生分解，在酸碱的作用下破坏银耳多糖的结构，分子量会明显降低。现有酸碱提取法，多选用盐酸和氢氧化钠等强酸强碱进行提取，结果表明，随着酸的浓度越大，糖链的破坏程度越大。虽然现有方法已达到降解银耳多糖分子量的目的，但使用强酸强碱的条件对于环境和工业生产有一定的局限性。因此在利用这一原理的基础上，利用相对温和的有机酸探索了一种可控降解银耳多糖分子量的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，就是提出一种不同分子量银耳多糖的制备方法，通过改变提取条件，制得具有不同分子量的银耳多糖。该银耳多糖的制备方法不仅操作简单、目标产物提取率高、产品纯度高，而且避免了在提取分离过程中使用一些有毒性溶剂，很大程度上降低了有毒溶剂所带来的环境污染。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种不同分子量银耳多糖的制备方法，包括以下步骤：
S1.以有机酸作为溶剂，对银耳粉进行溶解，得到银耳酸解液；
S2.将银耳酸解液经高压加热(121℃60min、高压加热压力表数值为0.1MPa、加热次数为1-3次)处理，然后待银耳酸解液冷却至室温后离心，得到银耳酸解上清液；
S3.将银耳酸解上清液直接浓缩，得到银耳浓缩液；或者银耳酸解上清液经酵母菌和嗜热菌组合发酵后得到发酵液，离心后的发酵上清液经浓缩，得到银耳浓缩液；
S4.将银耳浓缩液进行醇沉处理，得到银耳醇沉液；
S5.得到的银耳醇沉液经抽滤，得到银耳多糖滤渣，滤渣冻干处理后，即得银耳多糖。
作为优选地，所述步骤S1中的有机酸与银耳粉的料液比为1：40。
优选地，所述步骤S1中，有机酸为柠檬酸溶液，柠檬酸溶液的浓度为0.01M～0.5M，银耳酸解液配制方法为：不同浓度的柠檬酸溶液与银耳粉混合，摇晃至均质，得到银耳酸解液。
优选地，所述步骤S2中高压加热的条件为：温度121℃，时间1～3h。步骤2中银耳酸解液经离心损耗量为总体积的5％～8％，了解操作过程中损耗的估计值。
优选地，所述步骤S3中浓缩液的体积为银耳酸解上清液的10％-20％。
优选地，所述步骤S4中的醇沉处理时溶剂选用乙醇，乙醇的体积浓度为95％。
优选地，所述步骤S4中醇沉处理时银耳浸提液与溶剂的体积比为1:4。
优选地，所述步骤S4中还包括对乙醇进行旋蒸浓缩的操作，通过旋蒸浓缩将乙醇回收后循环利用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明首次提出了一种不同分子量银耳多糖的制备方法，通过改变提取条件，制得具有不同分子量的银耳多糖。柠檬酸是一种绿色环保的溶剂，本发明的提取银耳多糖的方法不仅操作简单、目标产物提取率高、产品纯度高，而且避免了在提取分离过程中使用一些有毒性溶剂，很大程度上降低了有毒溶剂所带来的环境污染。
附图说明
图1为实施例1中增比粘度比浓度与浓度、相对粘度比浓度与浓度之间的关系；
图2为实施例2中增比粘度比浓度与浓度、相对粘度比浓度与浓度之间的关系；
图3为实施例3中增比粘度比浓度与浓度、相对粘度比浓度与浓度之间的关系；
图4为实施例4中增比粘度比浓度与浓度、相对粘度比浓度与浓度之间的关系；
图5为实施例5中增比粘度比浓度与浓度、相对粘度比浓度与浓度之间的关系；
图6为实施例6中增比粘度比浓度与浓度、相对粘度比浓度与浓度之间的关系；
图7为实施例7中增比粘度比浓度与浓度、相对粘度比浓度与浓度之间的关系；
图8为实施例8中增比粘度比浓度与浓度、相对粘度比浓度与浓度之间的关系；
图9为实施例9中增比粘度比浓度与浓度、相对粘度比浓度与浓度之间的关系。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
一种银耳多糖的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：以0.1M的柠檬酸溶液作为溶剂，80目的银耳粉作为溶质，按料液比1:40的比例，进行摇匀均质，制得银耳酸解液；
步骤2：将步骤1配制的银耳酸解液，在0.1MPa、121℃条件下加热60min，待银耳酸解液冷却至室温，离心，得到银耳酸解上清液；
步骤3：将步骤2得到的银耳酸解上清液，经50℃浓缩，得到银耳浓缩液；
步骤4：将步骤3得到的银耳浓缩液与乙醇(95％)按体积比为1:4混合，经醇沉，得到银耳醇沉液；
步骤5：将步骤4得到的银耳醇沉液，经抽滤，得到银耳多糖滤渣，滤渣冻干处理后，即得银耳多糖T1。
利用粘度法(乌氏粘度计)测算T1银耳多糖分子量
(1)记录流出时间：每个浓度记录三次时间，三次求平均值为流出时间。
| 发酵银耳多糖浓度c(g/mL) | 体系 | 流出时间T | 相对粘度n<sub>r</sub> | 增比粘度n<sub>sp</sub> | n<sub>sp</sub>/c | lnn<sub>r</sub>/c | |
| 空白 | 0 | 10mL纯水 | T<sub>0</sub> | / | / | / | / |
| c<sub>1</sub> | 0.08 | 10mL | |||||
| c<sub>2</sub> | c<sub>1</sub>+2mL水 | ||||||
| c<sub>3</sub> | c<sub>1</sub>+4mL水 | ||||||
| c<sub>4</sub> | c<sub>1</sub>+6mL水 | ||||||
| c<sub>5</sub> | c<sub>1</sub>+8mL水 | ||||||
| c<sub>6</sub> | c<sub>1</sub>+10mL水 | ||||||
| c<sub>7</sub> | c<sub>1</sub>+12mL水 |
注：①nr＝T/T0②nsp＝nr-1
(2)绘制nsp/c与c、lnnr/c与c的拟合曲线，利用[η]＝KMa计算分子量，即可得到分子量范围。
注：K＝0.01089、a＝0.7、[η]＝截距
T1分子量测算：
表1T1银耳多糖溶液流出的时间记录
经计算T1分子量范围：20.88-24.91万道尔顿。且得出T1提取率为57.61％，纯度为84.97％。
实施例2
步骤1：以0.1M的柠檬酸溶液作为溶剂，80目的银耳粉作为溶质，按料液比1:40的比例，进行摇匀均质，得到银耳酸解液；
步骤2：将步骤1配制的银耳酸解液，在0.1MPa、121℃条件下加热60min，加热2次，待银耳酸解液冷却至室温，离心，得到银耳酸解上清液；
步骤3：将步骤2得到的银耳酸解上清液，经浓缩，得到银耳浓缩液；
步骤4：将步骤3得到的银耳浓缩液与乙醇(95％)按体积比为1:4混合，经醇沉，得到银耳醇沉液；
步骤5：将步骤4得到的银耳醇沉液，经抽滤，得到银耳多糖滤渣，滤渣冻干处理后，即得银耳多糖T2。
T2分子量测算：
表2T1银耳多糖溶液流出的时间记录
经计算T2分子量范围：5.62-5.86万道尔顿。且得出T2提取率为52.28％，纯度为74.12％。
实施例3
步骤1：以0.1M柠檬酸溶液作为溶剂，80目的银耳粉作为溶质，按料液比1:40的比例，进行摇匀均质；
步骤2：将步骤1配制的银耳酸解液，在0.1MPa、121℃条件下加热60min，加热3次，待银耳酸解液冷却至室温，离心，得到银耳酸解上清液；
步骤3：将步骤2得到的银耳酸解上清液，经浓缩，得到银耳浓缩液；
步骤4：将步骤3得到的银耳浓缩液与乙醇(95％)按体积比为1:4混合，经醇沉，得到银耳醇沉液；
步骤5：将步骤4得到的银耳醇沉液，经抽滤，得到银耳多糖滤渣，滤渣冻干处理后，即得银耳多糖T3。
T3分子量测算：
表3T3银耳多糖溶液流出的时间记录
经计算T3分子量范围：1.29-1.30万道尔顿。且得出T3提取率为46.25％，纯度为80.45％。
实施例4
步骤1：以0.05M的柠檬酸溶液作为溶剂，80目的银耳粉作为溶质，按料液比1:40的比例，进行摇匀均质；
步骤2：将步骤1配制的银耳酸解液，在0.1MPa、121℃条件下加热60min，加热3次，待银耳酸解液冷却至室温，离心，得到银耳酸解上清液；
步骤3：将步骤2得到的银耳酸解上清液，经浓缩，得到银耳浓缩液；
步骤4：将步骤3得到的银耳浓缩液与乙醇(95％)按体积比为1:4混合，经醇沉，得到银耳醇沉液；
步骤5：将步骤4得到的银耳醇沉液，经抽滤，得到银耳多糖滤渣，滤渣冻干处理后，即得银耳多糖T4。
T4分子量测算：
表4T4银耳多糖溶液流出的时间记录
经计算T4分子量范围：8.14-8.82万道尔顿。且得出T4提取率为49.07％，纯度为84.68％。
实施例5
步骤1：以0.01M的柠檬酸溶液作为溶剂，80目的银耳粉作为溶质，按料液比1:40的比例，进行摇匀均质；
步骤2：将步骤1配制的银耳酸解液，在0.1MPa、121℃条件下加热60min，加热3次，待银耳酸解液冷却至室温，离心，得到银耳酸解上清液；
步骤3：将步骤2得到的银耳酸解上清液，经浓缩，得到银耳浓缩液；
步骤4：将步骤3得到的银耳浓缩液与乙醇(95％)按体积比为1:4混合，经醇沉，得到银耳醇沉液；
步骤5：将步骤4得到的银耳醇沉液，经抽滤，得到银耳多糖滤渣，滤渣冻干处理后，即得银耳多糖T5。
T5分子量测算：
表5T5银耳多糖溶液流出的时间记录
经计算T5分子量范围：27.07-32.31万道尔顿。且得出T5提取率为73.64％，纯度为82.17％。
实施例6
步骤1：以0.05M的柠檬酸溶液作为溶剂，80目的银耳粉作为溶质，按料液比1:40的比例，进行摇匀均质；
步骤2：将步骤1配制的银耳酸解液，在0.1MPa、121℃条件下加热60min，加热3次，待银耳酸解液冷却至室温，离心，得到银耳酸解上清液，调pH至4.8±0.02，为酵母菌/嗜热菌组合发酵培养基；
步骤3：活化培养基配制，细菌学蛋白胨3.0g、葡萄糖0.2g、无水硫酸镁0.35g、磷酸二氢钾0.12g、硫酸铵2g、三氯化铁0.05g、氯化钠0.25g用1L纯水溶解，分装活化培养基，调pH至4.8±0.02(酵母菌活化培养基)、7.8±0.02(嗜热菌活化培养基)；
步骤4：酵母菌、嗜热菌的两次活化培养，第一次活化勾一环酵母菌至酵母菌活化培养基中，200rpm，30℃，活化10小时，第二次活化按接种量10％接入二次活化培养基中，活化10小时，嗜热菌活化方法相同，150rpm，60℃，活化时间为12小时；
步骤5：酵母菌一次发酵，即将步骤4经过二次活化后的酵母菌按接种量10％接入步骤2中的酵母菌/嗜热菌组合发酵培养基，200rpm，30℃，经14小时发酵后，得到一次发酵液；
步骤6：酵母菌/嗜热菌组合发酵，将步骤5的一次发酵液调pH至7.8±0.02，将步骤4经过二次活化后的嗜热菌按接种量10％接入一次发酵液中，150rpm，60℃，组合发酵18小时，得到酵母菌/嗜热菌组合发酵液；
步骤7：步骤6酵母菌/嗜热菌组合发酵液经4000rpm 10min离心，得到组合发酵上清液，浓缩体积至100-200mL，得到组合发酵浓缩液；
步骤8：将步骤7得到的组合发酵浓缩液与乙醇(95％)按体积比为1:4混合，经醇沉，得到银耳醇沉液；
步骤9：将步骤8得到的银耳醇沉液，经抽滤，得到银耳多糖滤渣，滤渣冻干处理后，即得银耳多糖T6。
T6分子量测算：
表6T6银耳多糖溶液流出的时间记录
经计算T6分子量范围：0.94-0.98万道尔顿。且得出T6提取率为74.16％，纯度为59.47％。
实施例7
步骤1：以0.05M的柠檬酸溶液作为溶剂，80目的银耳粉作为溶质，按料液比1:40的比例，进行摇匀均质；
步骤2：将步骤1配制的银耳酸解液，在0.1MPa、121℃条件下加热60min，加热2次，待银耳酸解液冷却至室温，离心，得到银耳酸解上清液，调pH至4.8±0.02，为酵母菌/嗜热菌组合发酵培养基；
步骤3-9:参照实例6。
T7分子量测算：
表7T7银耳多糖溶液流出的时间记录
经计算T7分子量范围：1.75-1.78万道尔顿。且得出T7提取率为95.57％，纯度为61.83％。
实施例8
步骤1：以0.01M的柠檬酸溶液作为溶剂，80目的银耳粉作为溶质，按料液比1:40的比例，进行摇匀均质；
步骤2：将步骤1配制的银耳酸解液，在0.1MPa、121℃条件下加热60min，加热3次，待银耳酸解液冷却至室温，离心，得到银耳酸解上清液，调pH至4.8±0.02，为酵母菌/嗜热菌组合发酵培养基；
步骤3-9:参照实例6。
T8分子量测算：
表8T8银耳多糖溶液流出的时间记录
经计算T8分子量范围：12.04-12.17万道尔顿。且得出T8提取率为47.38％，纯度为65.60％。
实施例9
步骤1：以0.01M的柠檬酸溶液作为溶剂，80目的银耳粉作为溶质，按料液比1:40的比例，进行摇匀均质；
步骤2：将步骤1配制的银耳酸解液，在0.1MPa、121℃条件下加热60min，加热2次，待银耳酸解液冷却至室温，离心，得到银耳酸解上清液，调pH至4.8±0.02，为酵母菌/嗜热菌组合发酵培养基；
步骤3-9:参照实例6。
T9分子量测算：
表9T9银耳多糖溶液流出的时间记录
经计算T9分子量范围：55.15-63.04万道尔顿。且得出T9提取率为42.52％，纯度为69.50％。
通过实施例1-9的制备方法可知，通过调整制备条件，是否进行发酵等操作，可以制得不同的分子量的银耳多糖，且不同的操作条件制备得到的银耳多糖的分子量大小差别较大，因此，本发明可以精准控制所需要得到的银耳多糖的分子量大小，对于制备应用于化妆品中易吸收的中低分子量(≤100万Da)的银耳多糖具有非常重要的意义。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种不同分子量银耳多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.以有机酸作为溶剂，对银耳粉进行溶解，得到银耳酸解液；
S2.将银耳酸解液经高压加热处理，然后待银耳酸解液冷却至室温后离心，得到银耳酸解上清液；
S3.将银耳酸解上清液直接浓缩得到银耳浓缩液，或者银耳酸解上清液经发酵处理得到发酵液，离心后的发酵上清液经浓缩，得到银耳浓缩液；
S4.将银耳浓缩液进行醇沉处理，得到银耳醇沉液；
S5.得到的银耳醇沉液经抽滤，得到银耳多糖滤渣，滤渣冻干处理后，即得银耳多糖。
2.如权利要求1所述的一种不同分子量银耳多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的有机酸与银耳粉的料液比为1：40。
3.如权利要求1所述的一种不同分子量银耳多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，有机酸为柠檬酸溶液，柠檬酸溶液的浓度为0.01M～0.5M。
4.如权利要求1所述的一种不同分子量银耳多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中高压加热的条件为：压力为0.1MPa，温度121℃，时间1～3h，加热次数为1～3次。
5.如权利要求1所述的一种不同分子量银耳多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中浓缩液的体积为银耳酸解上清液的10％-20％。
6.如权利要求1所述的一种不同分子量银耳多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中发酵过程中采用酵母菌和嗜热菌组合发酵。
7.如权利要求1所述的一种不同分子量银耳多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中的醇沉处理时溶剂选用乙醇，乙醇的体积浓度为95％。
8.如权利要求1所述的一种不同分子量银耳多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中醇沉处理时银耳浓缩液与溶剂的体积比为1:4。
9.如权利要求1所述的一种不同分子量银耳多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中还包括对乙醇进行旋蒸浓缩的操作，通过旋蒸浓缩将乙醇回收后循环利用。
10.如权利要求6所述的一种不同分子量银耳多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中的组合发酵步骤包括：将步骤S2得到的银耳酸解上清液调pH至4.8±0.02，作为酵母菌/嗜热菌组合发酵培养基；然后对酵母菌和嗜热菌分别活化培养；将活化后的酵母菌和嗜热菌依次接入酵母菌/嗜热菌组合发酵培养基培养，得到酵母菌/嗜热菌组合发酵液，然后经离心后得到发酵上清液。
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