CN1163150C - 回收富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产富含异黄酮的蛋白质提取物的方法，特别是涉及以发芽豆科植物种子为原料，以生物学方法从这些原料的含水醇提取物中生产富含异黄酮苷原的蛋白质提取物的方法。所说的提取物可直接用作食品添加剂，或经进一步离子交换层析纯化后，用于制备以异黄酮苷原为基本活性成分的药物组合物。

Description

回收富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物的方法

本发明涉及生产富含异黄酮的蛋白质提取物的方法，特别是涉及以发芽豆科植物种子为原料，以微生物学方法从这些原料的含水醇提取物中生产富含异黄酮苷原的蛋白质提取物的方法。所说的提取物可直接用作食品添加剂，或经进一步离子交换层析纯化后，用于制备以异黄酮苷原为基本活性成分的药物组合物。

异黄酮是主要存在于豆科植物种子中的一类植物黄烷类化合物。目前已知，异黄酮的最常见和最重要的来源是大豆，并且包含至少十二种异黄酮异构体：染料木黄酮、染料木苷、6″～O-丙二酰染料木苷、6″-O-乙酰染料木苷、大豆甙原、大豆苷、6″-O-丙二酰大豆苷、6″-O-乙酰异大豆苷、大豆黄素、大豆黄素苷、6″-O-丙二酰大豆黄素苷、6″-O-乙二酰大豆黄素苷(kudou.Agric.Biol.Chcm.15，2227-2233，1991)。大约97-98％的大豆异黄酮是以糖基化形式存在的。近年来发现，豆科植物种子中含有的这些异黄酮类化合物具有重要的药用价值，其中特别令人感兴趣的是去掉葡萄糖分子的异黄酮苷原。

异黄酮是大约70年前，由Walz从大豆中分离(Ann.chem.489，118，1931)并在后来由Walter进一步证实的(J.Amer.chem.soc.63，3273，1941)。九十年代以来，相继发现大豆异黄酮具有降低血清总胆固醇水平、(Andersonet al.NEJM，333，276-282，1995)；Anthony et al.，J.Nutr.125，supp13S：803S-804S，1995)、抑制乳腺癌(Peterson and Barnes，Bioch.& Biophys.Res.Commun.179，661-667，1991)和前列腺癌(Peterson，J.Nutration 125，784s-789s，1995；Peterson and Barmes，prostate 22，335-345，1993)等肿瘤细胞生长和分化等生物学活性。研究还证明，由于大豆异黄酮类化合物的雌激素样活性，因而可用于预防和缓解妇女绝经期综合症(setchell etal，Am.J.Clin.NUTR.40，569-578，1984.)。另外也已证明，口服异黄酮可明显地提高骨密度和增加骨盐含量(Uesugietal，Society of Nutratious Food inJapan，1996)。异黄酮的这些生物学活性的发现和证实，有力地推动了异黄酮分离与提取方法的进展。例如，美国专利5,789,581公开了使生产大豆蛋白中产生的乳清与活性碳和氧化铅等吸附剂接触，然后用醇溶液洗脱以分离乳清中的丙二酰异黄酮糖苷、在强碱条件加热处理除去丙二酰以得到异黄酮糖苷、以及用酸或酶(β萄糖苷酶)处理异黄酮以得到异黄酮配基的方法。另外，美国专利US6,033,714、6,020,471、5,994,508、5,990,291和5,792,503，日本专利JP11243895A和11169127，以及中国专利CN1211573A和1214871A分别描述了使用大豆粉或大豆乳，脱脂大豆或大豆糖蜜为原料，以化学和/或酶学方法制备异黄酮糖苷结合物，异黄酮糖苷及异黄酮配基。这些方法大多是利用异黄酮类化合物在水或醇溶液中及在不同的pH和温度条件下有不同溶解度及沉降系数的原理，将异黄酮与大豆蛋白分离开。其中有些专利公开了使用能够裂解1，4糖苷键的酶如衍生于曲霉的α和β半乳酶糖苷或果胶酶，以及药糖淀粉酶作为补充酶将异黄酮糖苷转化成异黄酮配基的方法(参见欧洲专利EPO837139Az)。

上述这些方法的共同特征是步骤较多，而且对温度和pH条件要求较严格，并且需要加入补充酶。另外，为了得到较高纯度的异黄酮配基和染料木黄酮，必须对粗产物进行高压液相层析，离子交换层析或超滤等处理。显然这些方法的生产成本的工作量都将是很大的。

发明的一个目的是提供一种从大豆中提取富含大豆异黄酮苷原的大豆蛋白提取物的方法，该方法包括：

(1)提供含有较高浓度异黄酮的发芽黑豆；

(2)将发芽黑豆机械粉碎以制成含水大豆匀浆，并于30℃和PH4-5条件保温5-8小时，然后离心收集沉淀物；

(3)于70-85℃用含水乙醇提取上述沉淀物；

(4)收集并浓缩乙醇提取物后，喷雾干燥得到富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的发芽黑豆是将成熟黑豆的籽粒在水中室温浸泡6小时，然后于25-27℃培育64-72小时得到的。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物的收率约为4％，并且总异黄酮配基的浓度约为10-18mg/g。

本发明的另一个目的是提供一种用大豆制备富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物的方法，该方法包括：

(1)提供含有较高浓度异黄酮的发芽黄豆；

(2)将发芽黄豆机械粉碎以制成含水大豆匀浆，并于30℃下保温5-6小时，然后离心收集沉淀物；

(3)用2-3倍体积的含水乙醇将上述沉淀物提取2-3次，然后离心收集上清；

(4)向醇提取物上清中接种短双歧杆菌和植物乳杆菌的共生培养物，并于35-39℃保温5-8小时；

(5)浓缩并喷雾干燥得到所需的富含异黄酮配基的大豆蛋白提取物。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的发芽大豆是将成熟大豆籽粒在水中室温浸泡6小时，然后于25-27℃培育64-72小时得到的。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的富含异黄酮配基的大豆蛋白提取物的收率约为40％，并且总异黄酮含量约为3-4mg/g。

本发明的再一个目的是提供按上述方法制备的富含异黄酮配基的大豆蛋白提取物作为保健食品的应用。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的保健食品的保健功能包括促进钙盐吸收和其骨组织中的沉积，及缓解妇女绝经期综合症。

本发明总地涉及大豆异黄酮类化合物的制备，特别是涉及以发芽大豆为原料，使用相对比较简单和成本较低的醇溶液提取法和酶促转化法，生产富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物。

用于制备富含异黄酮配基的大豆蛋白提取物的优选原料是发芽大豆，特别是发芽黑豆。在我们以前进行的研究中发现，不同地区生产的和不同品种的大豆中，异黄酮糖苷和糖苷结合物(即丙二酰或乙酰异黄酮糖苷)的含量有着较大差异，并发现中国华北地区生产的黑豆中异黄酮类化合物含量高于东北地区生产的黄豆。另一方面，我们还发现，发芽大豆特别是发芽黑豆中异黄酮含量远高于未发芽的储存大豆。推测这种含量差异可能与大豆(包括黑豆和黄豆)不同发育阶段的植物雌激素水平直接相关。

可将大豆浸于等体积水中，于室温下浸泡6-8小时，然后再继续培育约70小时得到发芽大豆。当然，为制备富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物，也可以使用经过脱脂处理的大豆粕、去皮大豆、发酵豆豉、豆浆或大豆糖蜜。

根据本发明的一个实施方案，为了用简单的一步法从发芽大豆中得到异黄酮甙原，首先使用机械粉碎或搅拌装置制备发芽黑豆匀浆。向所得匀浆内加入2-3倍体积的水，并用乙酸等可食用酸将大豆匀浆稀释液的pH调到大豆蛋白的等电点范围以下(约pH4.0-4.5)并放置约15-30分钟。然后收集沉淀物，以除去水溶性糖及少量蛋白质。

离心或过滤收集沉淀物后，向其中加入少量水，并于30℃左右，保温5-8小时，以利用大豆匀浆中的残留酶将绝大部分异黄酮糖苷转化成异黄酮甙原。然后，再次过滤收集沉淀物，并向其中加入2-3倍体积的含水乙醇(约75-85％)。将此醇悬浮液加热到大约80℃并持续搅拌1小时。重复将此醇提取过程重复3次后，使上述转化得到的甙原溶解醇中，并沉淀析出纤维成分和其他杂质。

最后一次醇提取完成后，以常规方法减压浓缩并干燥此悬液，即得到富含异黄酮甙原的蛋白质浓缩物或干燥粉末。

使用Beckman18反相柱以高效液相层析法(HPLC)对上述产物中的异黄酮苷原含量进行定量分析。洗脱剂为甲醇∶乙腈∶水＝25∶25∶50，流速为0.8ml/分钟。根据254nm吸光率确定洗脱的峰值部分。分析中使用的染料木黄酮和大豆苷原标准品购自Sigma公司。分析结果显示，按该方法制备的提取物的收率约为4％，其中染料木黄酮含量为10.39mg/g，大豆苷原含量为7.28mg/g(干重)。

根据本发明的另一实施方案，同样按前述方法制备发芽大豆，然后制备发芽大豆的含水匀浆。将此匀浆于30℃保温5-8小时，以利用发芽大豆原料中天然存在的或大豆表面微生物生长提供的β萄糖苷酶将大豆芽和种子中的异黄酮糖苷转化成异黄酮苷原。

然后离心收集保温后的蛋白质沉淀物，向其中加入2-3倍体积的约75-85％含水乙醇，按上述同样方法提取2-3次，然后离心收集上清。

向此提取物上清中按1000∶1的体积接种短双歧杆菌和植物乳杆菌的共生培养物，并于35-39℃保温5-8小时。所接种的益生菌均为目前可从市场上容易购得的短双歧杆菌和植物乳杆菌已知菌株。这些益生菌的培养基组成是：大豆粉50g/L、牛肝浸液5ml/L、葡萄糖1.5g/L，以及适量的Na₂HPO₄、K₂CO₃、CaCO₃和MgSO₄。接种益生菌的目的是希望这些正常人肠道微生物能够提供一定量的1，4糖苷键裂解酶或其他有利于异黄酮转化的代谢酶。

培养完成后，收集总培养物并按常规方法浓缩和干燥，得到富含异黄酮苷原的大豆蛋白质提取物。按本方法制得的提取物的总收率约为40％。按前述方法进行定量分析，结果显示按本方法制得的大豆蛋白提取物中总异黄酮苷原含量约为3-4mg/g(干重)。

可以将按本发明方法制备的富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物作为食品添加剂，直接添加到已有的普通食品、发酵食品或膨化食品，或牛奶中。或者可在本发明的提取物中加入其他赋形剂、粘合剂、甜味剂、维生素和矿物质等，制成固体粉末状饮料基质。或者，可将本发明的提取物作为起始材料，使用阴离子或阳离子交换层析、凝胶过滤层析、高压液相层析或超滤等方法，进一步纯化得到基本上纯的异黄酮苷原，并以其作为主要活性成分，制备可用于预防或治疗肿瘤、骨质疏松、妇女绝经期综合症、高血脂症等的药物组合物。另外，还可以在常规化妆品基质中加入按本发明方法制备的富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物，以生产具有抗皮肤老化、防皱、促进表皮再生、防止皮肤干燥和搔痒等功能的功能性化妆品。

实施例1：大豆和大豆胚芽中总异黄酮含量分析

本实施例旨在以高压液相层析法，分析发芽和未发芽的黄豆和黑豆中两种高生物学活性异构体：染料木黄酮、大豆黄素的含量，并以此作为本发明方法中选择原料的依据。

取干燥的黑豆和黄豆各10g，温水浸泡6小时后，于27℃下培育72小时，分别得到发芽黑豆和黄豆。将发芽大豆和豆芽粉碎并制成匀浆后，各称取0.5g匀浆加入80％乙醇20ml提取1小时。然后离心收集沉淀并再次用80％乙醇(10ml)提取5分钟。合并两次提取物的上清后，用乙酸乙酯(10ml)萃取3次，然后合并萃取液并以其作待检样品。使用按上述同样方法处理(乙醇提取和乙酸乙酯萃取)的大豆粉样品作为对照。

以Sigma公司生产的染料木苷(0.94mg)作为标准品，用95％乙醇溶解后，测定250nm吸光率，以绘制染料木苷标准浓度曲线。并依据此标准曲线计算上述试验样品和对照样品中的染料木苷和总异黄酮的浓度。结果如下列表1中所示。

表1  发芽和未发芽的黄豆或黑豆中总异黄酮含量分析

样品        取样量(g)     吸光率A     异黄酮含量(mg/g)

黄豆        0.958         0.108         0.147

黑豆        0.514         0.315         0.778

黄豆胚芽    0.446         0.271         0.773

黑豆胚芽    0.478         0.581         1.530

从表1所示的结果可以看出，黑豆种子中的总异黄酮含量相当于黄豆异黄酮含量的约5倍。相对于未发芽的大豆，发芽后黑豆芽中总异黄含量成倍增加。而发芽黄豆的异黄酮含量则比未发芽黄豆增加约4倍。

实施例2：从发芽大豆中制备富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物(方法之一)

本实施例举例描述以发芽黑豆为原料，并利用大豆中固有的转化异黄酮糖苷，以生产富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物的方法。

称取黑豆1000g，洗净后于室温下加水浸泡6小时，然后于26℃培育72小时，得到发芽黑豆(3500g)。向发芽大豆中加入等体量的水，用高速匀浆机制得发芽大豆和大豆胚芽的匀浆液。将此匀浆置于30℃下保温6.5小时，然后通过双层滤布过滤。收集滤液并以500rpm离心10分钟，将离心沉淀物与如上过滤得到的豆芽渣合并。向其中加入2-3倍体积的80％乙醇(约4000ml)，加热至80℃持续搅拌1小时，然后离心(500rpm)收集上清。一般情况，此乙醇提取过程应重复3次。

合并3次乙醇提取的低速离心上清，蒸馏回收乙醇后得到大豆蛋白提取液约1500ml。减压浓缩后，喷雾干燥得到富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物的干燥粉末约400g。HPLC法分析结果表明，所得干燥粉末中染料木黄酮含量为10.39mg/g，大豆苷原含量为7.28mg/g。

实施例3；从发芽大豆中制备富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物(方法之二)

本实施例举例描述以发芽黄豆为原料，并利用大豆中残留和由正常人肠道益生菌提供的萄糖苷酶和其他相关酶转化大豆异黄酮糖苷，以生产富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物的方法。

称取黄豆1000g，按实施例2中所述的同样方法制备豆芽和豆芽的匀浆液(约2500ml)。然后再按实施例2所述的方法向匀浆液中加入2-3倍体积的75％乙醇，并于80℃下反复提取3次。然后，合并三次提取得到的上清液，蒸馏回收乙醇后得到约10升提取物悬液。

按照1％的体积比向所说的悬液中接种预先制备的植物乳杆菌199菌株和短双歧杆菌菌株的细胞悬液(10⁷细胞/ml)各50ml(悬浮于由5％大豆粉、15％葡萄糖、5％胰酶解肉汤和微量Na₂HPO₄、KH₂PO₄、CaCO₃、MgSO₄组成的液体培养基中)(参见待批中国专利申请00111082.9)。将所得到益生菌悬液于38℃下保温24-48小时，保温后，减压浓缩培养物并进一步喷雾干燥得到富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物干粉398g。HPLC法分析所得干粉中异黄酮苷原含量为0.58mg/g，染料木黄酮含量为0.26mg/g。按本发明这一方法制得的总大豆异黄酮苷原浓度约为4％。

实施例4：富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物对大鼠骨质疏松模型的治疗作用

本实施例利用大鼠骨质疏松模型，初步观察按本发明的方法制备的大豆蛋白提取物的骨钙吸收促进作用。其中所说大鼠疏松模型是按标准方法切除雌性动物的双侧卵巢而造成的。

20只Wistar雌性大鼠随机分成四组：假去卵巢对照组、去卵巢对照组、去卵巢+大剂量提取物组、去卵巢+小剂量提取物组。各组动物用戊巴比妥麻醉后，除了去卵巢组只剖腹而不切除卵巢外，其他各组均切除双侧卵巢。手术后第3天，各组动物分别经口灌服5g/ug(大剂量组)、2.5g/kg(小剂量组)的抽取物，或同体积的蒸馏水(假去卵巢和去卵巢对照组)。连续用药28天。停药后第二天，各组动物经颈静脉采血以测定血清钙浓度。将动物断颈处死后手术接取双侧股骨，其中左侧股骨用于以高温灰化法测骨钙含量，右侧股骨则用于病理组织学检查。

实验组和对照组动物服用提取物或蒸馏水后，血钙和股骨骨钙含量的测定结果如下列表2所示。

               表2  本发明的大豆蛋白提取物对大鼠模型血钙和骨钙浓度

组别               剂量     给药时间     血钙浓度            股骨骨钙含量

(n＝5)            (g/kg)       天        (mmol/L)            (mg/g)

去卵巢对照组        -          28        2.0741±0.0512      70.2324±14.8875

假去卵巢对照组      -          28        2.1120±0.0293      91.9468±9.6301^*

大剂量组            5.0        28        2.1060±0.0956      91.8108±20.6047

小剂量组            2.5        28        2.1933±0.0170^**   96.3570±3.5077^**

与去卵巢对照组比较：*p＜0.05；**p＜0.01

从表2所示的结果可以看出，去卵巢对照组动物血钙浓度及股骨骨钙含量均低于假去卵巢对照组，说明去卵巢造成大鼠骨质疏松症模型是成功的。连续给药28天后，大剂量和小剂量组动物的血钙浓度及股骨骨钙含量均有所增加，说明未发明的提取物能够有效的阻止去卵巢后所致的骨质的丢失，提高血钙浓度，增加骨钙的沉积。

另外，从对动物模型股骨所作的组织学检查结果可以看出，去卵巢组动物经连续服用按本发明方法制备的富含异黄酮大豆蛋白提取物后，骨皮质厚度明显大于去卵巢对照组，骨小梁数目未见明显减少(组织学显微照片未示出)。这些结果表明，本发明的大豆蛋白提取物对大鼠骨质疏松模型有一定的治疗作用。

Claims (6)

1、一种从大豆中提取富含大豆异黄酮苷原的大豆蛋白提取物的方法，该方法包括：

(1)提供含有异黄酮的发芽大豆；

(2)将发芽大豆机械粉碎以制成含水大豆匀浆，并于30℃和pH4-5条件下保温5-8小时，然后离心收集沉淀物；

(3)于70-85℃用含水乙醇提取上述沉淀物；

(4)收集并浓缩乙醇提取物后，喷雾干燥得到富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物。

2、根据权利要求1的方法，其中所说的发芽大豆是将成熟大豆的籽粒在水中室温浸泡6小时，然后于25-27℃培育64-72小时得到的。

3、根据权利要求1的方法，其中所说的富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物的收率为4％，并且总异黄酮配基的浓度约10-18mg/g。

4、一种用大豆制备富含异黄酮苷原的大豆蛋白提取物的方法，该方法包括：

(1)提供含有异黄酮的发芽大豆；

(2)将发芽大豆机械粉碎以制成含水大豆匀浆，并于30℃条件下保温5-6小时，然后离心收集沉淀物；

(3)用2-3倍体积的含水乙醇将上述沉淀物提取2-3次，然后离心收集上清；

(4)向醇提取物上清中接种短双歧杆菌和植物乳杆菌的共尘培养物，并于35-39℃保温5-8小时；

(5)浓缩并喷雾干燥得到所需的富含异黄酮配基的大豆蛋白提取物。

5、根据权利要求3的方法，其中所说的发芽大豆是将成熟大豆籽粒在水中室温浸泡6小时，然后于25-27℃培育64-72小时得到的。

6、根据权利要求1的方法，其中所说的富含异黄酮配基的大豆蛋白提取物的收率为40％，并且总异黄酮含量为3-4mg/g。