CN105194048A

CN105194048A - 一种具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法

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Publication number: CN105194048A
Application number: CN201510687728.0A
Authority: CN
Inventors: 刘磊; 张名位; 张瑞芬; 张雁; 唐小俊; 邓媛元; 马永轩
Original assignee: Guangzhou Lehel Clinical Nutrition Co ltd; Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Current assignee: Guangzhou Lehel Clinical Nutrition Co ltd; Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2015-10-22
Publication date: 2015-12-30
Anticipated expiration: 2035-10-22
Also published as: CN105194048B

Abstract

本发明公开了一种具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法，本发明属于龙眼加工技术领域，具体为对龙眼干依次进行超声波-酶协同前处理、超高压处理、乙醇分步沉淀处理和冷冻干燥处理后制得龙眼蛋白多糖。本发明解决了目前常规方法提取的龙眼蛋白多糖不具备改善记忆功能的问题，全套工艺简单，操作方便，所得产品品质稳定。

Description

一种具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及龙眼加工技术领域，尤其涉及一种具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法。

背景技术

龙眼又称桂圆，是我国南方亚热带特色水果，具有药食两用功效。龙眼的益智功能在《本草纲目》、《滇南本草》等我国古代医药书上已早有记载，现代医学研究表明多糖是龙眼果肉的主要活性成分，表现出抗氧化、免疫调节、改善记忆功能等多重生物活性。

多糖的传统提取方法以热水浸提为主，随着天然产物分离纯化技术的不断发展，酶解和超声波等技术已广泛用于植物活性多糖的提取分离，然而这些方法存在耗时长、能耗高、杂质含量高及提取率低等缺陷。超高压技术是近年来发展较快的一种新型加工技术，通过使得细胞内外形成巨大的压力差，造成细胞破裂，释放出有效成分，具有操作简单、时间短、杂质含量少及环保等优点。目前已经被应用于植物有效活性成分的提取，包括黄酮、皂苷、生物碱及多酚类物质。近年来，已有植物活性多糖的超高压提取工艺方面的报道，如申请号为201310676570.8的专利公开了一种超高压提取松茸多糖的工艺。

植物蛋白多糖是具有生物活性的大分子，和细胞壁上的纤维素结合在一起，结构紧密，单纯采用超高压技术不能有效的对多糖进行提取，而且提取出来的蛋白多糖的不存在改善记忆的功能，本发明采用超声波-酶协同前处理结合超高压提取龙眼蛋白多糖，可以用作特殊医学用途食品的配料，为龙眼的精深加工提供了新途径，对推动我国龙眼产业的健康发展具有十分中药的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高提取率且具有改善记忆功能的龙眼蛋白多糖的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案实现：

一种具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法，对龙眼干依次进行超声波-酶协同前处理、超高压处理、乙醇分步沉淀处理和冷冻干燥处理后制得龙眼蛋白多糖。

超高压提取技术是一种新型的加工技术，具有快速、高效、耗能小、提取温度低等特点，已被广泛应用到物料中有效成分的提取，但是经过发明人的试验，虽然利用超高压提取技术也能进行提取，但是其提取率较低，并且在随后的小鼠实验中，通过超高压提取技术提取得到的龙眼蛋白多糖，其并没有改善小鼠的记忆功能障碍，经过发明人的进一步探究，在进行超高压处理前，结合超声波-酶进行前处理后，再通过超高压提取，不仅仅大幅度的提高了龙眼蛋白多糖的提取率，而且能显著改善小鼠的记忆功能障碍。

更具体的步骤如下：

S1．超声波-酶协同前处理：龙眼干加水打浆，将浆液置于超声场中同时添加复合酶进行处理，得酶解液；

S2．超高压处理：对步骤S1中的酶解液进行超高压处理得龙眼液；

S3．乙醇分步沉淀处理：对步骤S2中的龙眼液过滤后浓缩，于浓缩液中加入乙醇进行分步沉淀；

S4．冷冻干燥处理：将步骤S3中的沉淀进行真空冷冻干燥，得龙眼蛋白多糖。

步骤S1中，水的添加量为龙眼干重量的10~40倍，所述复合酶为纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的添加量为龙眼干重量的0.2~0.6%，木聚糖酶的添加量为龙眼干重量的0.1~0.5%，超声波功率为200~400w。

通过纤维素酶和木聚糖酶结合超声波进行前处理，再进行超高压处理，正是通过这两种方式的结合，使得最终提取出来的龙眼蛋白多糖具有显著的改善记忆功能，而且发明人在确定这两种方式后，通过进一步的优化，采用了纤维素酶和木聚糖酶，并在合适的用量和酶解条件下，提高最终的龙眼蛋白多糖提取率。

步骤S1中，调整浆液pH为5.0~6.8，于温度为35~50℃下处理10~30min。

步骤S2中，超高压压力为200~500Mpa，处理时间为3~15min。

步骤S3中，将过滤后的龙眼液浓缩汁1/4体积。

步骤S3中，于浓缩液中加入乙醇进行分步沉淀具体为：于浓缩液中加入95%乙醇至最终乙醇的体积百分比为30%，在3~6℃下静置8~12h后过滤去掉沉淀，向上清液中继续加入95%乙醇至最终乙醇的体积百分比为80%，并在3~6℃下静置8~12h后离心得沉淀。这一步骤中，分为两次沉淀操作，通过舍弃第一次得到的沉淀，并且将第二次沉淀操作中乙醇的浓度定位至80%，这使得最终提取出来的蛋白多糖具备显著的改善记忆功能。

于转速为4000r/min的条件下离心5~10min。

步骤S4中，真空冷冻干燥具体为：于-60~-20℃冷冻干燥20~48h得龙眼蛋白多糖。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1．本发明通过超声波-酶处理与超高压处理结合，使得制备出来的龙眼蛋白多糖具有显著的改善记忆功能；

2．本发明全套工艺简单，操作方便，所得产品品质稳定，可用作特殊医学用途配方食品的配料，同时也提高了龙眼的附加值，为其他药食两用植物资源食品的精深加工提供了指导。

具体实施方式

为了让本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明作进一步阐述。

实施例1

一、龙眼蛋白多糖的制备

一种具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法，包括如下步骤：

S1．超声波-酶协同前处理：于100g龙眼干添加其重量10倍的水进行打浆，将浆液置于200w功率的超声场中，同时添加纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的添加量为龙眼干重量的0.2%，木聚糖酶的添加量为龙眼干重量的0.1%，调整浆液的pH为5.0，于温度为35℃下处理10min得酶解液；

S2．超高压处理：将步骤S1中的酶解液于压力为200Mpa的条件下处理3min得龙眼液；

S3．乙醇分步沉淀处理：将步骤S2中的龙眼液过滤后浓缩至1/4体积，于浓缩液中加入95%乙醇至最终乙醇的体积百分比为30%，在3℃下静置8h后过滤去掉沉淀，向上清液中继续加入95%乙醇至最终乙醇的体积百分比为80%，并在3℃下静置8h后离心得沉淀；

S4．将S3得到的沉淀于-60℃冷冻干燥20h得龙眼蛋白多糖。

经测试，龙眼蛋白多糖的提取率为14.1%。

二、动物实验

1、试验条件

1.1样品

本实施例1的龙眼蛋白多糖粉末。

1.2实验动物

KM小鼠，雄性，体重20~25g，SPF级，由南方医科大学实验动物中心提供。小鼠于实验前7d置于实验室适应环境，温度23±2℃，湿度为50~60%，自由饮食、摄水。

1.3分组及处理

（1）分组

KM小鼠60只，适应性喂养1周后随即分为5组，每组12只，包括对照组、模型组和3个龙眼蛋白多糖剂量组。对照组和模型组灌胃0.9%生理盐水，龙眼蛋白多糖组按低剂量100mg/kg、中剂量200mg/kg、高剂量300mg/kg灌胃给药，连续给药28天，在最后一次给药1h后，除对照组腹腔注射生理盐水外，其它组均腹腔注射东莨菪碱（3mg/kgb.w.），并于注射20min后进行明暗箱避暗实验。

（2）明暗箱实验

被动回避实验时利用动物的好暗避光（明暗穿梭）、对厌恶刺激（如足电击）的恐惧和记忆而建立起来的。避暗系统包括两个等大（20.3cm*15.9cm*21.3cm）的隔室，一个为明箱，一个为暗箱，明室上盖对应有LED灯，暗室上盖对应有一红外探头，两室之间由一个拱门（8.9cm*11.4cm）相连，门可由实验需要关闭或打开。隔室地板为不锈钢栅栏（直径3.175mm）。暗箱一侧的栅栏地板与刺激器相联，并可给予电击；明箱一侧则不与电击相连，故没有电流通过。实验分为电击刺激训练和记忆保持测试两部分。

小鼠灌胃第26天起，连续2天在同一时间将小鼠放入明暗箱（不通电）中适应3min。第28天腹腔注射东莨菪碱20min后开始测试训练（0h），将小鼠背对拱门放入明箱后，给暗室不锈钢栅栏通以0.4mA电流，小鼠一进入暗室即受电击后回到明室，此为训练过程，记录小鼠第一次被电击的时间。分别于测试训练24h和48h后对小鼠进行记忆测验，将小鼠放入明箱，记录小鼠第一次进入暗室的时间，此为避暗潜伏期，5min内未进入暗室的小鼠其潜伏期按300s计算。

（3）样品处理及分析

记忆测试试验结束后，立即乙醚麻醉小鼠，摘眼球取血，取血后迅速于冰上断头取脑，用4oC预冷的生理盐水漂洗除去血液，吸干多余水分，加9倍重量的冰生理盐水，用高速分散匀浆机制成10%的组织匀浆，3000r/min4℃离心10min，取上清液，分析其中乙酰胆碱转移酶（ChAT）和乙酰胆碱酯酶（TChE）的含量。

1.4数据分析

采用SPSS进行数据分析。

2、实验结果

2.1龙眼蛋白多糖对东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠避暗行为实验潜伏期的影响：

表1龙眼粗多糖对东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠避暗行为实验潜伏期的影响

	0h	24h	48h
				对照	17.7±3.4 ^a	280.0±11.2^c	300.0±0.0 ^b
模型	15.2±2.9 ^a	202.3±9.4 ^a	261.8±12.3 ^a
				低剂量	16.7±2.5 ^a	220.3±9.7^b	280.3±14.9 ^ab
中剂量	17.2±3.1 ^a	251.1±10.2 ^c	289.9±10.3 ^b
				高剂量	15.9±2.6 ^a	260.3±11.6 ^c	290.3±8.8 ^b

注：每一列中字母不同代表差异显著（p<0.05）。

明暗箱是利用小鼠好暗避光，对厌恶刺激（如足电击）的恐惧来检测其大脑记忆功能。

小鼠在服用龙眼蛋白多糖21天后采用明暗箱进行学习记忆功能的测试。从表1可以看出，在记忆的获取阶段（0h），5组小鼠都快速的进入暗箱，其潜伏期没有显著差异，这表明5组小鼠的生活习性正常。在学习记忆的保持阶段（24h），与对照组相比，注射东莨菪碱的模型组小鼠进入暗箱的时间快，潜伏期短，表明模型组小鼠已有记忆功能障碍;与模型组小鼠相比,服用了龙眼蛋白多糖的3组小鼠的潜伏期显著增加了(p<0.05)，并且中剂量组、高剂量组和空白对照组的潜伏期无显著差异，这表明龙眼蛋白多糖可以改善东莨菪碱引起的记忆功能障碍。在学习记忆的保持阶段（48h），龙眼蛋白多糖同样表现出了对东莨菪碱引起的小鼠记忆功能障碍的改善作用。

2.2龙眼蛋白多糖对东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠大脑组织中乙酰胆碱转移酶（ChAT）及乙酰胆碱酯酶（TChE）含量的影响如表2所示：

表2龙眼蛋白多糖对小鼠大脑组织中ChAT和TChE含量的影响

	ChAT (U/g组织湿重)	TChE (U/mg prot)
			对照	97.7±6.4 ^b	0.24±0.02^a
模型	56.6±10.9 ^a	0.36±0.03^c
			低剂量	92.7±12.5 ^b	0.29±0.02^b
中剂量	108.2±13.1 ^b	0.25±0.02 ^a
			高剂量	105.9±12.6 ^b	0.23±0.02 ^a

注：每一列中字母不同代表差异显著（p<0.05）。

乙酰胆碱转移酶（ChAT）及乙酰胆碱酯酶（TChE）在大脑的学习记忆功能中发挥了重要了作用。从表2可以看出，与对照组相比，注射了东莨菪碱的模型组小鼠大脑组织中ChAT含量显著降低，并且TChE含量显著升高（p<0.05）。与模型组相比，龙眼蛋白多糖可以显著增加小鼠大脑组织中ChAT的含量和减少TChE的含量（p<0.05）。

综上所述，龙眼蛋白多糖可以通过调节大脑组织中ChAT和TChE的含量来改善东莨菪碱致衰小鼠的记忆功能。

实施例2

S1．超声波-酶协同前处理：于100g龙眼干添加其重量40倍的水进行打浆，将浆液置于400w功率的超声场中，同时添加纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的添加量为龙眼干重量的0.6%，木聚糖酶的添加量为龙眼干重量的0.5%，调整浆液pH为6.8，于温度为50℃下处理30min得酶解液；

S2．超高压处理：将步骤S1中的酶解液于压力为500Mpa的条件下处理15min的龙眼液；

S3．乙醇分步沉淀处理：对步骤S2的龙眼液过滤后浓缩至1/4体积，于浓缩液中加入95%乙醇至最终乙醇的体积百分比为30%，在6℃下静置12h后过滤去掉沉淀，向上清液中继续加入95%乙醇至最终乙醇的体积百分比为80%，并在6℃下静置12h后离心得沉淀；

S4．将步骤S3中的沉淀于-20℃冷冻干燥48h得龙眼蛋白多糖。

经测试，龙眼蛋白多糖的提取率为18.2%。

对比例1

一、龙眼蛋白多糖的制备

S1．超高压处理：于100g龙眼干添加其重量10倍的水进行打浆，将浆液置于压力为200Mpa的条件下处理3min得龙眼液；

S2．乙醇分步沉淀处理：将步骤S1中的龙眼液浓缩至1/4体积，于浓缩液中加入95%乙醇至最终乙醇的体积百分比为30%，在3℃下静置8h后过滤去掉沉淀，向上清液中继续加入95%乙醇至最终乙醇的体积百分比为80%，并在3℃下静置8h后离心得沉淀；

S3．将步骤S2中得到的沉淀于-60℃冷冻干燥20h得龙眼蛋白多糖。

经测试，龙眼蛋白多糖的提取率为8.6%。

二、动物实验

实验方法如同实施例1中的实验方法，样品为本对比例1中的龙眼蛋白多糖粉末，结果如下：

	0h	24h	48h
				对照	17.7±3.4 ^a	280.0±11.2^b	300.0±0.0 ^b
模型	15.2±2.9 ^a	202.3±9.4 ^a	261.8±12.3 ^a
				低剂量	15.4±2.4 ^a	203.2±6.4 ^a	264.9±9.6 ^a
中剂量	16.5±2.2 ^a	206.1±9.2 ^a	270.1±9.2 ^a
				高剂量	16.8±3.1 ^a	207.6±10.1 ^a	271.2±8.1 ^a

注：每一列中字母不同代表差异显著（p<0.05）。

小鼠在服用龙眼蛋白多糖21天后采用明暗箱进行学习记忆功能的测试。从表1可以看出，在记忆的获取阶段（0h），5组小鼠都快速的进入暗箱，其潜伏期没有显著差异，这表明5组小鼠的生活习性正常。在学习记忆的保持阶段（24h），与对照组相比，注射东莨菪碱的模型组小鼠进入暗箱的时间快，潜伏期短，表明模型组小鼠已有记忆功能障碍；与模型组小鼠相比，服用了龙眼蛋白多糖的3组小鼠的潜伏期无显著增大，这表明龙眼蛋白多糖没有改善东莨菪碱引起的记忆功能障碍。在学习记忆的保持阶段（48h），龙眼蛋白多糖同样没有表现出对东莨菪碱引起的小鼠记忆功能障碍的改善作用。

表2龙眼蛋白多糖对小鼠大脑组织中ChAT和TChE含量的影响

	ChAT (U/g组织湿重)	TChE (U/mg prot)
			对照	97.7±6.4 ^b	0.24±0.02^a
模型	56.6±10.9 ^a	0.36±0.03^b
			低剂量	58.1±9.4 ^a	0.35±0.03 ^b
中剂量	58.9±9.2 ^a	0.35±0.02 ^b
			高剂量	60.2±7.1^a	0.33±0.03 ^b

注：每一列中字母不同代表差异显著（p<0.05）。

从表2可以看出，与对照组相比，注射了东莨菪碱的模型组小鼠大脑组织中ChAT含量显著降低，并且TChE含量显著升高（p<0.05）。与模型组相比，龙眼蛋白多糖没有显著增加小鼠大脑组织中ChAT，和减少TChE的含量。

综上所述，对比例1的龙眼蛋白多糖不具备改善小鼠的记忆功能的功效，这其中的原因可能是由于缺少了超声波-酶的前处理，使得制备的龙眼蛋白多糖空间结构发生变化，导致其失去改善记忆功能的功效。

对比例2

一、龙眼蛋白多糖的制备

除了步骤S3中，第一次添加乙醇至最终乙醇的体积百分比为40%，第二次添加乙醇至最终乙醇体积百分比为70%外，其它条件同实施例1。

经测试，龙眼蛋白多糖的提取率为9.2%。

二、动物实验

实验方法如同实施例1中的实验方法，样品为本对比例2中的龙眼蛋白多糖粉末，结果如下：

	0h	24h	48h
				对照	17.7±3.4 ^a	280.0±11.2^c	300.0±0.0 ^b
模型	15.2±2.9 ^a	202.3±9.4 ^a	261.8±12.3 ^a
				低剂量	15.1±2.4 ^a	205.2±6.4 ^a	258.1±8.4 ^a
中剂量	15.8±2.2 ^a	207.8±10.2 ^a	263.5±12.2 ^a
				高剂量	16.2±3.1 ^a	212.3±11.1 ^a	264.2±13.1 ^a

注：每一列中字母不同代表差异显著（p<0.05）。

表2龙眼蛋白多糖对小鼠大脑组织中ChAT和TChE含量的影响

	ChAT (U/g组织湿重)	TChE (U/mg prot)
			对照	97.7±6.4 ^b	0.24±0.02^a
模型	56.6±10.9 ^a	0.36±0.03^b
			低剂量	57.1±8.4 ^a	0.36±0.02^b
中剂量	58.8±7.2 ^a	0.35±0.02 ^b
			高剂量	59.2±9.1 ^a	0.34±0.03^b

注：每一列中字母不同代表差异显著（p<0.05）。

综上所述，对比例2的龙眼蛋白多糖不具备改善小鼠的记忆功能的功效，由于在乙醇沉淀过程中，不是按照30%和80%浓度进行沉淀的，而其它浓度沉淀出来的龙眼蛋白多糖不具备改善记忆功能的功效。

Claims

1.一种具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征在于，对龙眼干依次进行超声波-酶协同前处理、超高压处理、乙醇分步沉淀处理和冷冻干燥处理后制得龙眼蛋白多糖。

2.根据权利要求1所述的具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

3.根据权利要求2所述的具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征在于，步骤S1中，水的添加量为龙眼干重量的10~40倍，所述复合酶为纤维素酶和木聚糖酶，纤维素酶的添加量为龙眼干重量的0.2~0.6%，木聚糖酶的添加量为龙眼干重量的0.1~0.5%，超声波功率为200~400w。

4.根据权利要求2所述的具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征在于，步骤S1中，调整浆液pH为5.0~6.8，于温度为35~50℃下处理10~30min。

5.根据权利要求2所述的具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征在于，步骤S2中，超高压压力为200~500Mpa，处理时间为3~15min。

6.根据权利要求2所述的具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征在于，步骤S3中，将过滤后的龙眼液浓缩至1/4体积。

7.根据权利要求2所述的具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征在于，步骤S3中，于浓缩液中加入乙醇进行分步沉淀具体为：于浓缩液中加入95%乙醇至最终乙醇的体积百分比为30%，在3~6℃下静置8~12h后过滤去掉沉淀，向上清液中继续加入95%乙醇至最终乙醇的体积百分比为80%，并在3~6℃下静置8~12h后离心得沉淀。

8.根据权利要求7所述的具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征在于，于转速为4000r/min的条件下离心5~10min。

9.根据权利要求2所述的具有改善记忆功能龙眼蛋白多糖的制备方法，其特征在于，步骤S4中，真空冷冻干燥具体为：于-60~-20℃冷冻干燥20~48h得龙眼蛋白多糖。