CN1621091A - 聚乙二醇化轮状病毒体肠靶向制剂及其合成方法 - Google Patents
聚乙二醇化轮状病毒体肠靶向制剂及其合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1621091A CN1621091A CNA2003101101872A CN200310110187A CN1621091A CN 1621091 A CN1621091 A CN 1621091A CN A2003101101872 A CNA2003101101872 A CN A2003101101872A CN 200310110187 A CN200310110187 A CN 200310110187A CN 1621091 A CN1621091 A CN 1621091A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rotavirus
- antibody
- mepeg
- synthetic
- igy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抗体类药物聚乙二醇化轮状病毒抗体肠靶向制剂及其合成方法。该新型药剂有如上结构：n为2－10,000；其通过方法如下合成：首先合成聚乙二醇PEG活化中间体MePEG－S－NHS及MePEG－S－EDC；然后提纯特异性抗轮状病毒抗体RV－IgY，最后用聚乙二醇PEG活化中间体对特异性抗轮状病毒抗体进行结构修饰，制得聚乙二醇化轮状病毒抗体肠靶向制剂。该药具有一定的肠道靶向定位作用，提高了生物利用度，降低了原型药物的毒副作用，并具有一定的缓释靶向功能，增前强了临床治疗效果。该药用于治疗轮状病毒引起的婴儿腹泻具有显著疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗体类新药和其制备方法，尤其涉及聚乙二醇化轮状病毒抗体肠靶向制剂及其合成方法。
背景技术
我国每年5岁以下小儿腹泻病患者达2.5亿人次，其中1.2亿人次是由轮状病毒引起的秋冬季腹泻，对于该病的治疗，目前除了采用口服或静脉注射补液纠正脱水外，尚无特殊疗法。轮状病毒传染性极强，往往由抵抗力低弱的婴幼儿首先感染，接着传染给其他小儿，幼儿园很容易形成扩散感染，并有较高的医院内感染几率。小儿感染轮状病毒后，由于频繁腹泻与呕吐，食欲又低下，容易出现不同程度的脱水现象，及电解质紊乱，更甚者还可合并脑炎、肠出血、肠套叠或心肌炎而危及生命。目前虽有将抗轮状病毒特异性多克隆抗体(RV-IgY)用于轮状病毒腹泻的治疗，然而未修饰的裸抗体(RV-IgY)与其它抗体或蛋白质药物一样，在药物应用的剂型上存在许多缺点和局限性：1)易引起机体的免疫反应；2)容易被胃肠道各种水解酶降解；3)半衰期短，生物利用度低；4)不易保存等，故其疗效受到很大影响。尽管小儿的胃肠道较短，胃酸和各种水解酶的活性较弱，也可以通过加大用药剂量和在制剂配方和工艺采用一些常规的稳定技术加以弥补，但是其根本性的缺陷仍然难以克服，制约和影响药效的充分发挥。
PEG修饰的抗体可以从根本上解决这些难题，将成为该类药物制剂发展的方向。PEG化技术在蛋白质类药物(或其它药物)的开发中已越来越受到人们的重视，国内的研究报道也日益增多，随着人类基因组计划研究的深入，越来越多的生物活性分子将会开发出来，如细胞因子、趋化因子等。同时，诸如给药方式、如何最大限度地发挥药物活性及消除某些不良反应等问题也随之而来。因此，PEG技术的运用显得尤为重要，而且未来PEG活化技术及PEG药物新剂型的研制对新药开发来说具有特别重要的价值和广阔的应用前景。
已上市的聚乙二醇修饰药物有：聚乙二醇修饰的腺苷脱氨酶，聚乙二醇修饰天冬氨酸酶，聚乙二醇修饰的干扰素-α，聚乙二醇修饰的人粒细胞集落刺激因子Pegfilgrastim等。现在已有两个PEG修饰抗体用于II期临床研究，一个是用来治疗类风湿性关节炎和Crohn病的CDP870(肿瘤坏死因子-α抗体片段)，另一个是用于治疗急性冠脉狭窄的CDP860。这些药物安全性良好，并且可以廉价地大规模生产。这些研究为PEG修饰的抗体或片段抗体用于临床治疗，提供了一个良好的技术平台和实验基础。
目前国内外还未见有关PEG修饰轮状病毒抗体药物的相关研究报道“PEG-RV-IgY”创新药物的研制成功，不仅可以有效地治疗轮状病毒婴幼儿腹泻，还将推动PEG化药物技术在我国的应用和推广，带动相关产业的发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗体类新药—聚乙二醇化轮状病毒抗体肠靶向制剂(PEG-RV-IgY)及其合成方法。
为了实现本发明目的，本发明技术方案如下：本发明以具有明确病毒中和活性的抗轮状病毒特异性鸡卵黄免疫球蛋白(RV-IgY)为目标药物，对该抗体进行聚乙二醇化修饰，制备聚乙二醇化轮状病毒特异性鸡卵黄免疫球蛋白(PEG-RV-IgY)，并将其发展成为一种具有肠道靶向抗轮状病毒特异性的多克隆抗体口服制剂，为治疗由轮状病毒感染引起的婴幼儿腹泻提供特效药物。
本发明聚乙二醇化轮状病毒体肠靶向制剂PEG-RV-IgY其有如下结构：
n为2-10,000。
该抗体类药物聚乙二醇化轮状病毒抗体肠靶向制剂的合成方法，通过如下步骤实现：
首先合成聚乙二醇PEG活化中间体MePEG-S-NHS及MePEG-S-EDC；然后提纯特异性抗轮状病毒抗体RV-IgY，最后用聚乙二醇PEG活化中间体对特异性抗轮状病毒抗体进行结构修饰，制得聚乙二醇化轮状病毒体肠靶向制剂。具体步骤如下，
(一)聚乙二醇PEG活化中间体的合成
第一步：ω-甲氧基聚乙二醇的合成
在0--100℃条件下，将溴代甲烷加入聚乙二醇的有机溶剂中，搅拌，反应2-10小时，真空除去有机溶剂，残留物利用柱色谱进行分离，TLC(碘显色)检测，得产品。
第二步：ω-甲氧基聚乙二酸单酯的合成
将聚乙二醇MePEG2000、丁二酸酐、DMAP、二氯甲烷(CaH2干燥)分别加入到1000ml单口烧瓶中，磁力搅拌使固体完全溶解后，开始滴加三乙胺，分别聚溶解后，滴完三乙胺、反应10-30分钟，以8％甲醇的氯仿溶液为展开剂，分别用碘及7％的钼酸铵溶液(40g钼酸铵、500ml水、40ml浓硫酸)显色，确保MePEG2000反应完全。放置过夜。次日，用甲醇、氢氧化钠溶液洗涤；
第三步：活化PEG中间体的合成
(1)MePEG-S-NHS的合成
将MePEG2000-S、NHS、三氯甲烷分别加入1000ml烧瓶中，搅拌溶解，滴加DCC溶液(10ml三氯甲烷)，分别溶解后，反应30-120分钟，确定反应进行完全，4小时后，将反应液过滤，滤液于水浴40℃下蒸除有机溶剂，残杂用乙醚沉淀两次，每次150ml。得湿重10g。
(2)MePEG-S-EDC的合成
在0--100℃条件下，将EDC加入聚乙二醇的有机溶剂中，搅拌，反应2-10小时，真空除去有机溶剂，残留物利用柱色谱进行分离，TLC(碘显色)检测，得产品。
(二)提纯特异性抗轮状病毒抗体RV-IgY
将预先制备好的免疫原抗体置入动物体内如产蛋母鸡体内，定期检测鸡卵黄免疫球蛋白IgY中和效价，待Igy中和效价达500单位/ml后收集鸡蛋进行IgY提取；脱脂并分离卵黄，进行盐析、离心沉淀和超滤后，制得特异性抗轮状病毒抗体RV-IgY，于-20℃--10℃备用；
(三)聚乙二醇化轮状病毒体肠靶向制剂的制备
在0--100℃条件下，将MePEG-S-NHS和抗体溶液混合，搅拌，反应1-120分钟，真空除去有机溶剂，分离提纯，检测，得产品。
本发明机理在于，聚乙二醇与相应的水分子形成了一层屏障，保护了被修饰的药物使之不被酶类降解，不与细胞表面的蛋白质相互作用，降低了免疫原性；聚乙二醇化还增加了药物对pH和温度的稳定性。因此，本发明聚乙二醇化新药在进行临床应用时具有很多的优点：能显著增强被修饰蛋白质药物的稳定性；降低被修饰药物的免疫原性；提高生物利用度；降低原型药物的毒性作用；具有一定的缓释靶向能力；较长的保存有效期限；以及使用的便利性等，从而增强临床治疗效果。
具体实施方式
为了更好地对本发明进行说明，下面列举实施例。
实施例1
(一)聚乙二醇PEG活化中间体的合成
第一步：ω-甲氧基聚乙二醇的合成
在0--100℃条件下，将溴代甲烷加入聚乙二醇的有机溶剂中(摩尔比1∶1)，搅拌，反应2-10小时，真空除去有机溶剂，残留物利用柱色谱进行分离，TLC(碘显色)检测，得产品。
第二步：ω-甲氧基聚乙二酸单酯的合成
| 名称 | 分子量 | 摩尔比 | 投料量 | 摩尔数 |
| MePEG2000 | 2000 | 1 | 100g | 0.05 |
| 丁二酸酐 | 100 | 3 | 15g | 0.15 |
| 三乙胺 | 101 | 2 | 14ml | 0.1 |
| DMAP | 122 | 1.1 | 6.8g | 0.055 |
| 二氯甲烷 | 500ml |
将聚乙二醇MePEG2000、丁二酸酐、DMAP、二氯甲烷(CaH2干燥)分别加入到1000ml单口烧瓶中，磁力搅拌使固体完全溶解后，开始滴加三乙胺，分别聚溶解后，滴完三乙胺、反应10-30分钟，以8％甲醇的氯仿溶液为展开剂，分别用碘及7％的钼酸铵溶液(40g钼酸铵、500ml水、40ml浓硫酸)显色，确保MePEG2000反应完全。放置过夜。次日，用以下溶液洗涤：
A水100ml+盐酸13ml+甲醇50ml
B水105ml+氢氧化钠0.25g+甲醇50ml(洗后变混)
C水105ml+甲醇100ml(放置时间应稍长)
分去水层后，向有机层加入无水MgSO4约62g干燥(以溶液澄清为准)，自然过滤除去干燥剂，用少量二氯甲烷淋洗，水浴40℃下蒸除有机溶剂，放凉，残留物中加入500ml乙醚结晶，放置1小时后，抽滤，用少量乙醚淋洗，得湿品104.5g。
(2)称取样品20g，用25ml氯仿溶解。称取硅胶约90g装柱。用以下梯度进行洗脱。
| 0.0％ | 0.5％ | 1.5％ | 3.5％ |
| 200ml | 200ml | 400ml | 400ml |
收集0.5％1.5％洗脱液，水浴40℃下蒸除有机溶剂，放凉，残留物中加入150ml乙醚结晶，放置1小时后，抽滤，用少量乙醚淋洗，得湿品14.5g(干9.5g)。
第三步：活化PEG中间体的合成
(1)MePEG-S-NHS的合成
| 名称 | 分子量 | 摩尔比 | 投料量 | 摩尔数 |
| Mepeg2000-S | 2100 | 1.00 | 9.5g | 0.004523 |
| NHS | 115.1 | 1.19 | 0.62g | 0.005386 |
| DCC | 206.3 | 1.62 | 1.51g | 0.007319 |
| 三氯甲烷 | 100ml |
将MePEG2000-S、NHS、三氯甲烷分别加入1000ml烧瓶中，搅拌溶解，滴加DCC溶液(10ml三氯甲烷)，分别溶解后，反应30-120分钟，确定反应进行完全，4小时后，将反应液过滤，滤液于水浴40℃下蒸除有机溶剂，残杂用乙醚沉淀两次，每次150ml。得湿重10g。(TLC展开剂浓度6％)
(2)MePEG-S-EDC的合成
在0--100℃条件下，将EDC加入MePEG-S的有机溶剂中(摩尔比1∶1)，搅拌，反应2-10小时，真空除去有机溶剂，分离提纯，检测，得产品。
(二)提纯特异性抗轮状病毒抗体RV-IgY
将预先制备好的免疫原抗体置入动物体内如产蛋母鸡体内，定期检测鸡卵黄免疫球蛋白IgY中和效价，待IgY中和效价达500单位/ml后收集鸡蛋进行IgY提取；脱脂并分离卵黄，进行盐析、离心沉淀和超滤后，制得特异性抗轮状病毒抗体RV-IgY，于-20℃--10℃备用；
(三)聚乙二醇化轮状病毒体肠靶向制剂的制备
在0--100℃条件下，将MePEG-S-NHS加入到轮状病毒抗体的溶剂中(摩尔比1∶1)，搅拌，反应2-10小时，真空除去有机溶剂，残留物进行分离提纯，检测，得产品。
最后，将其制成PEG-RV-IgY口服片剂剂型；PEG-RV-IgY口服液剂剂型。
Claims (3)
1、抗体类药物聚乙二醇化轮状病毒体肠靶向制剂，其特征在于，其有如下结构：
n为2----10,000。
2、抗体类药物聚乙二醇化轮状病毒抗体的合成方法，其特征在于通过如下步骤实现：
首先合成聚乙二醇PEG活化中间体MePEG-S-NHS及MePEG-S-EDC然后提纯特异性抗轮状病毒抗体RV-IgY，最后用聚乙二醇PEG活化中间体对特异性抗轮状病毒抗体进行结构修饰，制得聚乙二醇化轮状病毒体肠靶向制剂；具体步骤如下，
(一)聚乙二醇PEG活化中间体的合成
第一步：ω-甲氧基聚乙二醇的合成
在0--100℃条件下，将溴代甲烷加入聚乙二醇的有机溶剂中，进行合成反应；
第二步：ω-甲氧基聚乙二酸单酯的合成
将聚乙二醇MePEG2000、丁二酸酐、DMAP、二氯甲烷(CaH2干燥)分别加入到1000ml单口烧瓶中，磁力搅拌使固体完全溶解后，开始滴加三乙胺，分别聚溶解后，滴完三乙胺、反应10-30分钟，以8％甲醇的氯仿溶液为展开剂，分别用碘及7％的钼酸铵溶液(40g钼酸铵、500ml水、40ml浓硫酸)显色，确保MePEG2000反应完全。放置过夜。次日，用甲醇、氢氧化钠溶液洗涤；
第三步：活化PEG中间体的合成
(1)MePEG-S-NHS的合成
将MePEG2000-S、NHS、三氯甲烷分别加入1000ml烧瓶中，搅拌溶解，滴加DCC溶液(10ml三氯甲烷)，分别溶解后，反应30-120分钟，确定反应进行完全，4小时后，将反应液过滤，滤液于水浴40℃下蒸除有机溶剂，残杂用乙醚沉淀两次，每次150ml，得湿重10g；
(2)MePEG-S-EDC的合成
在0--100℃条件下，将EDC加入聚乙二醇的有机溶剂中，进行合成反应；
(二)提纯特异性抗轮状病毒抗体RV-IgY
将预先制备好的免疫原抗体置入动物体内如产蛋母鸡体内，定期检测鸡卵黄免疫球蛋白IgY中和效价，待IgY中和效价达500单位/ml后收集鸡蛋进行IgY提取；脱脂并分离卵黄，进行盐析、离心沉淀和超滤后，制得特异性抗轮状病毒抗体RV-IgY，于-20℃--10℃备用；
(三)聚乙二醇化轮状病毒体肠靶向制剂的制备
在0--100℃条件下，将MePEG-S-NHS和抗体溶液混合，进行合成反应。
3、如权利要求2所述的抗体类药物聚乙二醇化轮状病毒抗体的合成方法，其特征在于n为2----10,000。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2003101101872A CN1621091A (zh) | 2003-11-28 | 2003-11-28 | 聚乙二醇化轮状病毒体肠靶向制剂及其合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2003101101872A CN1621091A (zh) | 2003-11-28 | 2003-11-28 | 聚乙二醇化轮状病毒体肠靶向制剂及其合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1621091A true CN1621091A (zh) | 2005-06-01 |
Family
ID=34759074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2003101101872A Pending CN1621091A (zh) | 2003-11-28 | 2003-11-28 | 聚乙二醇化轮状病毒体肠靶向制剂及其合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1621091A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101212984B (zh) * | 2005-07-06 | 2011-09-28 | Ucb医药有限公司 | 连接效应分子与蛋白质的方法 |
| US8758802B2 (en) | 2009-12-14 | 2014-06-24 | University Of Massachusetts | Methods of inhibiting cataracts and presbyopia |
| US9675589B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-06-13 | University Of Massachusetts | Methods of inhibiting cataracts and presbyopia |
| US10736863B2 (en) | 2015-11-13 | 2020-08-11 | University Of Massachusetts | Methods of inhibiting cataracts and presbyopia |
-
2003
- 2003-11-28 CN CNA2003101101872A patent/CN1621091A/zh active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101212984B (zh) * | 2005-07-06 | 2011-09-28 | Ucb医药有限公司 | 连接效应分子与蛋白质的方法 |
| US8758802B2 (en) | 2009-12-14 | 2014-06-24 | University Of Massachusetts | Methods of inhibiting cataracts and presbyopia |
| US9283237B2 (en) | 2009-12-14 | 2016-03-15 | University Of Massachusetts | Methods of inhibiting presbyopia |
| US9675589B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-06-13 | University Of Massachusetts | Methods of inhibiting cataracts and presbyopia |
| US9789091B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-10-17 | University Of Massachusetts | Methods of inhibiting cataracts and presbyopia |
| US10413529B2 (en) | 2013-03-14 | 2019-09-17 | University Of Massachusetts | Methods of inhibiting cataracts and presbyopia |
| US10736863B2 (en) | 2015-11-13 | 2020-08-11 | University Of Massachusetts | Methods of inhibiting cataracts and presbyopia |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1211091C (zh) | 治疗高胆固醇血症的聚烯丙胺聚合物 | |
| CN102234310B (zh) | 一种聚乙二醇修饰蛋白的分离纯化方法 | |
| CN1879889A (zh) | 一种肾靶向药物载体及与其形成的前药、制法和应用 | |
| CN1931875A (zh) | 高纯度乌司他丁及其制备方法和含有乌司他丁的药物组合物 | |
| CN103421079A (zh) | 蛋白质的聚乙二醇化修饰方法 | |
| CN1238789A (zh) | 用于降低饮食中磷酸根或草酸根吸收的水溶性聚合物 | |
| CN1059659A (zh) | 病毒性肝炎的诊断和治疗 | |
| CN1621091A (zh) | 聚乙二醇化轮状病毒体肠靶向制剂及其合成方法 | |
| WO2005077421A1 (fr) | Procede de preparation d'interferon alpha 1b modifie au polyethylene glycol | |
| CN1823768A (zh) | 西咪替丁冻干组合物 | |
| CN1958070A (zh) | 抗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联高免免疫球蛋白 | |
| CN102247817B (zh) | 一种以分子簇为功能基的内毒素吸附剂及其制备方法 | |
| CN103467591B (zh) | 一种用于聚乙二醇干扰素的偶联方法 | |
| CN1651463A (zh) | 一种单甲氧基聚乙二醇－胰岛素复合物及其制备方法 | |
| CN113842464A (zh) | 一种类风湿因子吸附材料及其制备方法与应用 | |
| CN102499986B (zh) | 一种大分子-顺铂复合物及其制备方法与应用 | |
| CN1120174C (zh) | 海洋芋螺镇痛多肽的制备方法 | |
| CN1289528C (zh) | 一种重组人干扰素－α1b复合物及其制备方法 | |
| CN1263849C (zh) | 一种双水相萃取体系及应用此体系分离纯化α－淀粉酶抑制剂的方法 | |
| CN100336557C (zh) | 一种生长抑素的水溶液制剂、其制备方法及应用 | |
| CN1872101A (zh) | 具抗病毒作用的小紫金牛提取物及其提取方法和应用 | |
| EP0481013B1 (en) | A composition for removing or inactivating harmful components in blood or other extracellular body fluids | |
| CN100371347C (zh) | 毛蚶中的多肽蛋白类活性物质及其制备方法和用途 | |
| CN1067405C (zh) | 硫酸酯化箬叶多糖及其制备方法 | |
| CA2801275A1 (en) | New low molecular weight complexes between iron and maltobionic acid, use thereof for intramuscular or subcutaneous administration in the treatment of anemic states, and new pharmaceutical compositions adapted for these uses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |