CN1467224A - 对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能刺激体内细胞增生的重组融合蛋白的表达，生产的成套技术和方法，用以改善公众健康或用于疾病的治疗处理。特别是：发明了人血清白蛋白(HSA)和一种细胞增生刺激因子(CPSF)利用基因工程方法重组形成融合蛋白，其可，1)刺激多种细胞增生，特别是可使造血系统中的各种血细胞发育成型；2)HSA/CPSF融合蛋白可在体内得到缓慢释放，以达到细胞增生刺激因子最大临床治疗效果，并且还包括3)能够最大限度减低由于单独使用细胞增生刺激因子所带来的潜在副作用及毒性。本发明还提供了利用酵母菌来生产这种重组融合蛋白的高效\低成本的制造方法。

Description

对多种细胞具刺激增生作用的 人血清白蛋白重组融合蛋白
技术领域
本发明涉及人血清白蛋白融合蛋白的基因重组及表达。并论述了单一融合蛋白或不同种类融合蛋白组合使用方法。特别集中阐述了利用酵母菌表达生产由人血清白蛋白与造血细胞增生刺激因子所形成的融合蛋白(HSA/CPSF)。血细胞增生刺激因子包括：血红细胞增生素(EPO)、白细胞增生介素(ILs)，干细胞因子(SCF)，血小板增生素(TPO)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和巨噬粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)等。
背景技术
人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半，白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸，类固醇和激素分子等。其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要组成部分。血清白蛋白是一个球状非糖基化，分子量为65kd的血清蛋白质。人血清白蛋白基因位于4号染色体上有16961碱基对，分为15个间隔区。经RNA加工拼接后形成的mRNA可编码一个具有585个氨基酸的蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)在通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，分泌到细胞外。血清白蛋白有35个胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二巯健的单体(参见Brown JR，“白蛋白的结构、功能和应用”Pergamon，纽约，1977)。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90％的抗原性(与血浆中自然状态白蛋白相比)，并且是不溶性蛋白质，并形成白蛋白聚合体。现在用于临床的白蛋白均是由人血浆中提取。利用微生物体重组表达白蛋白(rHSA)的生产已在专利EP330 451和EP361991中公开。
白蛋白具有多种多态体及30种不同的遗传杂分子(Weikamp，CR等，人类遗传年报，37：219-226，1973)。血清白蛋白分子的三维结构已经X-光衍射法测定(Carter，科学，244，1195-1198，1989)。白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克。半衰期寿命为14-20天。综上所述白蛋白具有极大的优势使之可抵御生物体内酶的作用。并可使治疗性蛋白质以较高剂量使用。
利用基因工程技术将人血清白蛋白与人生长激素在酵母菌中表达为融合蛋白，其增加了人生长激素在血清中和储存时的稳定性。已在中国的专利申请CN1207131中公开。同理，人血清白蛋白与CD4蛋白受体形成融合蛋白后融合蛋白对HIV-1病毒的亲和性与CD4受体蛋白质单体相比有相同或更高的结合度(美国专利6,165,470)。在此均引为参考文献。
发明内容
本发明用动物和细胞体内体外实验证明了人血清白蛋白与细胞增生刺激因子形成的融合蛋白可刺激各种血液细胞增生，并具有比单体的细胞增生刺激因子在体内停留有更长的时间(半衰期)，动物实验还发现复合使用不同的HSA/CPSFs可同时刺激多种细胞的增生，并具协同增效作用。
本发明所涉及的造血细胞增生刺激因子(CPSF)包括但不局限于，白细胞介素11(IL-11)，红细胞增生素(EPO)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落因子(M-CSF)，血小板生素(TPO)以及白细介素-3(IL-3)。现就其特性分别简述如下：
①白细胞介素-11(IL-11)：人白细胞介素-11(IL-11)是由早期分化的骨髓细胞中发现的(Paul等，1990，美国国家科学院院报，87：7512)。IL-11也在由间叶细胞中表达，如基质母成纤维细胞，早期肺成纤维细胞以及滋养层细胞等。IL-11刺激血小板的增生。IL-11也称为Adipogenesis抑制因子(AGIF)，其可作用于造血形成干细胞和基质母细胞(Kawashima等，生长因子研究进展，4：191，1992).成熟IL-11是一个非糖基化蛋白。178个氨基酸长，分子量为23千道尔顿。人的IL-11座落在19号染色体，并有5个间隔区，IL-11的序列与具有类似功能的白细胞介素-6(IL-6)序列无同源性。IL-11是一种多效的生长因子可作用于多种造血干细胞的分化，并刺激T-Cell及分泌抗体的B-细胞发育。IL-11还可刺激红细胞的增生与分化。(Que sniaux，VFJ，等血液，80，1218，1992)。
IL-11(商品名为Neurmaga由美国家庭产品公司生产)已获得FDA批准，临床上应用于刺激造血干细胞分化和巨核细胞前体的增生和诱导骨髓巨核细胞成熟。结果是增加血小板的产生。IL-11已用于防止严重的血小板减少症和化疗后减少对血小板输入的依赖。
②红细胞增生素(EPO)：EPO是一种糖蛋白，主导血红细胞的增生和分裂(美国专利5,547,933)，EPO的产生贯穿人的发育的各个阶段。EPO由肾细胞中合成，也决定了体内红细胞的数量，为各组织器官提供足够的氧。红细胞的增生是由骨髓细胞分化而来，并在EPO的作用控制下。
EPO是一种酸性糖蛋白分子量在30.4千道尔顿，基因长约582核苷酸由161个氨基酸组成，EPO有三种形式α-，β-和Asialo-EPO。α-和β-EPO只是在碳氢化合物修饰上略有不同，而Asialo-EPO是无碳氢化合物修饰的EPO。在健康人体内EPO的含量维持在一个极低的水平，这一数量是可满足各器官组织对氧的需求，由于EPO在红细胞形成上是必需的，所以EPO在诊断和治疗血液病上有着极为重要的作用。由于在血液和尿液中EPO含量极低，大量分离纯化EPO用于临床目的是极为困难的。利用基因工程方法在中国仓鼠细胞(CHO)中生产制备EPO(美国专利5,547,933)已成为现实，并以Epogen的名称由美国Amgen公司生产。仅在美国一年就有100万人贫血而需要EPO治疗。EPO还可用于治疗许多重要的疾病，各种血液增生异常的病症，特别是对爱滋病，肿瘤化疗患者，药物及化疗，肾透析常常对患者的造血系统产生严重的损害，因而临床上对EPO的需求量是极大的。
③粒细胞集落刺激因子(G-CSF)：粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是由单核细胞及成纤维细胞所产生的，它刺激粒细胞集落形成、增生。活化嗜中性白细胞，分化特定的骨髓淋巴细胞。并对成熟粒细胞有极强的活化作用(Metcalf，细胞，43：5，1985及Groopman，细胞，50：5，1987)。天然的人G-CSF是196千道尔顿糖蛋白，并有177个氨基酸组成(Souza，LM等，科学，232：62，1986)。人和鼠的G-CSF在氨基酸序列上有大约75％的同源性，重组的人G-CSF生物活性是以对NFS-60Cell刺激增生能力测定。重组的G-CSF是由大肠杆菌生产的非糖基化蛋白质，商品为Neupogen，由美国Amgen公司生产。
将红细胞增生刺激因子(EPO)与粒白细胞集落刺激因子(G-CSF)利用基因工程技术形成的融合蛋白使之具有较高的双重生物活性的方法已在中国专利CN1311332中公开。在此引为参考文献。
④巨噬粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)∶GM-CSF是由骨髓分化而成的骨髓前体细胞中分离得到的。其刺激巨噬和粒细胞形成集落。GM-CSF也可作用于刺激成熟巨噬细胞，嗜酸性白细胞，嗜中性白细胞而导致各种功能活性(Mazur E和Cohen J临床药学理论，46：250，1989；Morstyn和Burgess癌症研究，48：5624，1988)。GM-CSF是酸性蛋白[人：18-22千道尔顿(Wong等，科学，228：810，1986)鼠：23千道尔顿(Metcalf，血液，67：257，1986)]可与GM-CSF敏感细胞的受体有很高的亲合性。虽然人和鼠的GM-CSF在氨基酸序列上有54％的同源性，但其生物活性则有属种的特异性，其它生长因子和CSFs分子受体结合也与GM-CSF有共同的作用(Nicola，今日免疫学，8：134。1987)。人的GM-CSF对细胞刺激增生作用是以TF-1细胞培养来测定的(Kitamura等，细胞生理学杂志，140：32，1989)。人GM-CSF基因重组制品以商品名Leukine进入市场并由Immunex公司制造和销售.
⑤巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)：M-CSF由单核细胞，成纤维细胞和内皮细胞中产生。M-CSF刺激巨噬细胞克隆的形成(Metcalf，血液，67：257，1986)，并增强单粒细胞和巨噬细胞对抗体依赖细胞的细胞毒性(Mufson等，细胞免疫学，119：182，1989)，MCSF还抑制由骨母细胞产生的骨吸收效应(Hattersley等，细胞物理杂志，137，199，1988)。M-CSF是一种糖蛋白，根据糖基化程度的不同而有不等的分子量。蛋白多肽有159个氨基酸组成(Kawasaki等，科学，230：291，1988)。
⑥血小板增生素(TPO)：TPO作用在刺激血小板巨核细胞前体的发育，作用类似于EPO，TPO作用的结果增强血小板的数量，EPO还影响整个造血系统进程。尤其在后期具很强的作用。其它的造血系统细胞介素包括干细胞因子，白细胞介素-3、白细胞介素-6和白细胞介素-11。
TPO蛋白多肽为335氨基酸，而由于糖基化作用，在SDS-凝胶电泳中显示分子量约为75千道尔顿，人、鼠、狗的TPO之间有69-75％的同源性。TPO前体为356个氨基酸，含有一个21氨基酸组成的信号多肽。重组表达的TPO生物活性是以刺激MOF细胞增生的能力来测定。
⑦白细胞介素-3(IL-3)：白细胞介素-3是数目不断增长的众多的生长因子中的一员。白细胞介素-3支持造血系统细胞前体的增生和分化，并在体内和体外作用于各种骨髓前体细胞。人IL-3成熟蛋白有133个氨基酸，糖基化与否对IL-3在体内外的生物活性不具影响。人与鼠的IL-3之间同源性极低。IL-3是由活化的正常T-细胞产生的(Ihele和Weinstein，1986，Yang和Clark，1998)。IL-3的结构，以及IL-3基因的结构和其在染色体上的位置与其它造血干细胞生长因子相似。在临床前和临床试验中，IL-3在人体内观察到的影响包括：可明显增加嗜中性白细胞计数(ANC)。在体外，IL-3与其它细胞介素组合使用，包括与干细胞因子(SCF)，IL-6，IL-1，IL-11，GCSF，EPO或TPO。在半固体培养基中，由IL-3诱导粒巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)，CFU-EO，CFU-Baso，红细胞-Burst形成单位。巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)和粒/红/巨噬/巨核细胞形成单位(CFU-GEMM)的增长。IL-3与其它因子共同作用在悬浮培养中，还可刺激纯化的CD34+细胞的增生(Eder等，干细胞，15：327-333。1997)。
除以上所简述的细胞增生刺激因子(CPSF)外，还有其它生长因子可以与人血清白蛋白形成融合蛋白用以刺激细胞增生以达到治疗的目的。
对本发明的论述将集中在以下几点：
1)HSA/CPSF融合蛋白
在本发明中，由核苷酸编码，HSA和一种CPSF形成融合蛋白，即HSA/CPSF融合，同时可以指出的是任何一种白蛋白均可与一种CPSF用本发明的方法来形成一种融合蛋白。
CPSF可以是任何一种蛋白，其可刺激细胞的分化和增生。最典型的一个例子为CPSF是一种造血活性细胞因子，CPSF的个例在Aggarwal和Puri(1995)“细胞因子在免疫机制调节中的作用”一文中有详细的阐述，列为本发明的参考文献之一。
本发明所指的CPSF可以是下列中的任何蛋白质类别的一员，包括但不局限于，(1)集落刺激因子有：粒白细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬性白细胞集落刺激因子(GM-CSF)，嗜酸性白细胞集落刺激因子(EOS-CSF)(即IL-5)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF即CSF-1)，复合性CSF(即IL-3)和EPO。(2)白细胞介素有：白细胞介素-1，-2，-4，-6，-7，-9，-10，-11，-12，-13和白细胞介素-18。(3)非集落刺激因子又非白细胞介素有：Steel因子(SLF：C-Kit类似物，干细胞因子和肥大细胞生长因子)，血红增活性因子(EPA)，乳铁蛋白(LF)，H-亚单位铁蛋白(即酸性异铁蛋白)，前列腺素(PG)E1和E2，肿瘤坏死因子(TNF)-α和-β，干扰素(IFN)-α，-β，和-γ，转移因子(TGF)-β，活性素，抑制素，白血球抑制因子和Oncostatin-M。(4)Chemokines有：巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1-α(即干细胞抑制因子)，巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1-β，巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-2-α(即GRO-β)，GRO-α，M1P-2-β(即GRO-γ)，血小板因子-4，巨噬细胞趋势性和活性因子，以及IP-10因子。另外还有，(5)人生长因子：如肝细胞生长因子；表皮细胞生长因子；神经细胞生长因子；内皮细胞生长因子等。
四种典型集落刺激因子能启动骨髓前细胞，原细胞和母细胞的激活和增生的CPSF已经被详细地研究了。它们是GM-CSF，G-CSF，M-CSF和IL-3(多功能复合CSF)。GM-CSF和IL-3是复合强力生长因子，其可刺激多种造血系统细胞系的分裂。反之，G-CSF和M-CSF是非广谱系限制性造血生长因子，其刺激最后的有丝分裂和结束部分造血前体细胞的成熟。红细胞增生素则是一种造血生长因子，可刺激红细胞前体的分化，增生和成熟。生长因子如干细胞因子，所有的白细胞介素和所有的干扰素均可以是CPSF。
CPSF可以直接以N末端与HSA的C-末端相联以构成融合蛋白，或可在HSA和CPSF之间增加一个联接肽(Linker)，以构成融合蛋白：HSA/L/CPSF或CPSF/L/HSA(L＝Linker)。连接肽长度可为2-100，常用的是10-50个氨基酸，优选的是14-30个氨基酸。连接短肽可以对HSA和CPSF之间有更大的变化空间并有更好的柔韧性或刚性或有更大的变化空间使CPSF与受体的结合更容易些，连接肽的结构可为(G4S)3-4。
融合蛋白可以是分泌型，其可与特异识别的抗人血清白蛋白抗体相结合。融合蛋白也可与特异识别CPSF的抗体相结合。
具体地，利用遗传工程方法构建的一条核苷酸链其编码一个人血清白蛋白与人白细胞介素11所组成的融合蛋白(HSA/hIL-11)，与Seq IDNo.1有至少90％的同源性，优选的该核苷酸链与Seq ID No.1有95％地同源性，该核苷酸链编码的蛋白质氨基酸多肽序列为Seq ID No.2。
具体地，利用遗传工程方法构建一条核苷酸链其可编码一个人血清白蛋白与人白细胞介素3所组成的融合蛋白(HSA/hIL-3)，与Seq ID No.3有至少90％的同源性，优选的该核苷酸链与Seq ID No.3有至少95％序列同源性。优选的，该核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸多肽序列为SeqID No.4。
具体地，利用遗传工程方法构建一条核苷酸链其可编码一个人血清蛋白与人红细胞增生素(EPO)所组成的融合蛋白(HSA/hEPO)与Seq IDNo.5有至少90％地同源性。优选的该核苷酸链与Seq ID No.5有至少95％地同源性。优选地，该核苷酸编码的蛋白质氨基酸序列为Seq ID No.6。
具体地，利用遗传工程构建的一条核苷酸链，其可编码一个人血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子所组成的融合蛋白(HSA/hG-CSF)。该核苷酸序列与Seq ID No.7有至少90％同源性，优选地，该核苷酸序列与Seq ID No.7有至少95％地同源性。优选地，该核苷酸序列编码一条蛋白质氨基酸序列为Seq ID No.8。
再具体地，利用遗传工程方法构建的一条核苷酸链，其可编码一个人血清白蛋白与巨噬粒细胞集落刺激因子所组成的融合蛋白(HSA/hGM-CSF)。该核苷酸序列与Seq ID9有至少90％同源性。优选地，该核苷酸序列与Seq ID9有至少95％同源性。优选地，该核苷酸序列编码一条蛋白质氨基酸序列为Seq ID 10。
与上述的核苷酸多肽是有一定程度的序列相似性是指：例如，能编码一种HSA/CPSF融合蛋白，也具有至少95％相似的核苷酸序列之间同源性。其包括核苷酸链序列每百个核苷酸有5个点突变，并也编码HSA/CPSF融合蛋白核苷酸序列。换句话讲，任何核苷酸多肽链与上述编码HSA/CPSF融合蛋白的核苷酸链具有95％的同源性，即，即便有多达5％的核苷酸个体可以替换、删减、新插入等均与本发明所指的核苷酸序列相同。突变不管是在5’或3’端，或在两端之间的任何位点，以单体或多体发生的突变均在本发明范围内。
实践上，不管任何特指的核酸分子只要在90％、95％、96％、97％、98％或99％相似即在本发明保护范围。而且核苷酸链序列编码HSA/CPSF融合蛋白也可由常规已知的计算机软件，如Bestfit软件(Wisconsin)序列分析软件包)来获得。Bestfit应用区域同源性比较方法(文献：Smith和Waterman，应用数学进展，2：482-489(1981)来寻找两个序列之间最佳的同源序列。当应用该软件或其它任何具有类似的DNA序列对比分析下，某一特定的序列如与本发明所提出的序列有95％以上同源均视为与本发明所述的序列相同源。
当在室温或更高的温度下，HSA和CPSF形成的融合蛋白与CPSF单体相比，在同样条件下，可有2倍以上优选地，达4倍或6倍或更优选地达10倍以上的贮存期(Shelf-Life).
本发明涉及到白蛋白可用做载体携带治疗性的蛋白质药物，如CPSF来处理，治疗各种疾病或异常。或那些以加强细胞增生以增加血细胞计数为目的的人，如癌症病人。在本发明中，HSA/CPSF融合蛋白可以用于脊椎动物，优选地是人类，并通过不同途径，包括但不局限于口服，非经肠胃，腹腔膜内、静脉内、动脉内、皮下、舌下、肌内、肠内、唾液腺、鼻内，脂质法，通过吸入、注射。阴道、眼内方法给药。HSA/CPSF也可通过区域性释放(如导管或Stent)，包括皮下、脂肪下，关节下及膜内、并可以做成缓释剂方式、具体地，融合蛋白主要通过注射法给药。
本发明涉及关于将一个白蛋白分子或其变种或片段与一个CPSF分子或其变种或片段通过基因工程融合在一起，所形成的融合蛋白较未经融合的CPSF延长在体内循环半衰期。为方便起见，本发明只提及人血清白蛋白(HSA)和细胞增生刺激因子(CPSF)，即人IL-11，人EPO，人GCSF，人GM-CSF，人IL-3和人TPO等形成的融合蛋白。当然其它脊椎动物的白蛋白与CPSF均可包括在内。优选地，含有CPSF，或其变种或片段的N-末端部分，或其变种，或片段的C-末端部分形成融合蛋白后，并使其与受体结合时所有负效应达最小化。或者由CPSF形成融合蛋白，含有CPSF或其一个变体或片段同样具有信号传导、受体结合作用均包括在本发明中。
本发明中的HSA/CPSF融合蛋白，或其配方均可通过传统方法，包括非经胃肠道(如皮下或肌肉)注射或静脉输注的方式给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。本发明中的融合蛋白HSA/CPSF可单独使用，而优选地，则为一个或多个可接受的载体或另一个HSA/CPSF或HSA或多个HSA/CPSF一起成药物制剂的形式使用。载体特别是另一个HSA/CPSF或多个HSA/CPSF必需在与相互间的兼容性且不对受体自身产生有害意义的“可接受的”典型的载体为水和盐水、无菌、无热原也无额外免疫原性。不同HSA/CPSF之间相溶可有协同，增效或仅起协助制剂也可考虑共同使用。
HSA/CPSF融合蛋白可以制剂形式、单元剂量的便捷方式给药，也可经由任何药学领域已知和认可的方法制备包括将HSA/CPSF与具有一种或多种辅助成份的载体结合到一起的步骤。概括地讲，将活性成分和液相载体或组合固相载体、助剂或其它，均匀地结合而制备该制剂，然后根据需要的话，将产品成型。
适合于非经胃肠道途径使用的HSA/CPSF制剂包含水相或不含水相的无菌注射液，可含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和助溶剂，或增加药物渗透性与平衡剂。含水或不含水的无菌悬浮液(包括悬浮剂和增稠剂)。该制剂可制成单元剂量或多元剂量的容量的容器中，如密封的安瓿瓶中和小管中。在冰干(冻干法)条件下贮存。使用前加入无菌液态载体，如注射用水，临时性注射液和悬浮液。
优选的单元剂量是那些包括有活性成分的日用剂量或单元。日用亚剂量或适当的小份。
将HSA/CPSF融合蛋白送入动物体内后，与CPSF单体相比，HSA/CPSF在血液中的半衰期具有长约2倍。优选地是长约4倍，优选地为长约6倍，更优选为长约10倍的半衰期。本发明的HSA/CPSF融合蛋白可以与由自然界分离的或重组型的人血清白蛋白共同使用。优选为重组的人血清白蛋白，组成具有疗效的剂量和比率。
可以相信融合后，治疗性蛋白质有较高的半衰期和在血液中停留较长的时间。在贮存和运输时可以降低成本效益，同时也可减少药品的使用剂量和使用次数。
相同的策略也可用于研发抗癌作用功效的稳定的重组蛋白。例如将肺癌抑制因子，如p53、pRb、pRb2/p130，IL-2和KLF6等均可与HSA形成融合蛋白。选择上还有胰岛素，胰岛素类的生长因子也可与HSA形成重组融合蛋白用于疾病的治疗处理。由人体或其它途径分离出的具有治疗作用的抗体基因均可与HSA形成融合蛋白，以便于使用和具有治疗目的。抗原性疫苗也可利用这一方法制备让抗原与白蛋白形成融合蛋白释放到体内以增加抗原性，提高免疫反应机能。抗体也可利用与HSA形成融合蛋白释放到体内血液系统，引起机体的免疫反应而达到对抗入侵的外源物，如细菌、真菌、寄生虫、病毒等。另外，抗衰老的蛋白，也可与HSA形成融合蛋白并引入体内对抗衰老。
2)用于HSA/CPSF融合蛋白表达的宿主系统
本发明中的HSA/CPSF核苷酸多肽可利用重组克隆技术引入宿主细胞，以使融合蛋白得以表达。
一般来说，宿主细胞经遗传工程(转导或转化或转染)方式将携带有本发明中所提到的各种可能组合的HSA/CPSF载体质粒侵入方式，病毒感染“噬菌体等形式”转入宿主系统中。工程宿主细胞可以培养在含常规营养物的培养基中，并经过适当修改后已利于启动子，选择转化子或扩增编码HSA/CPSF的核苷酸链，培养条件，如温度，PH和选择表达细胞均以适当操作方式控制。
按本发明所述，重组载体携带有包含编码HSA/CPSF融合蛋白的核苷酸多肽。重组载体可以是一个表达载体，可在宿主细胞内由携带的核苷酸多肽编码来表达融合蛋白。形式可为，但不局限于，HSA/CPSA，CPSF/HSA，HSA/L/CPSF或CPSF/L/HSA(L＝Linker).宿主生物体及体细胞包括，但不局限于，脊椎动物(如人，猴、鼠、兔等)鱼、鸡、昆虫、植物、酵母、真菌和细菌等。
编码HSA/CPSF的核苷酸多肽是在适当的启动子作用下表达HSA/CPSF融合蛋白。可利用的适合启动子包括，但不局限于，腺病毒启动子，如腺病毒主要的后期启动子；或异源启动子，如CMV启动子，RSV启动子，诱导型启动子可有MMT启动子，热刺激启动子。白蛋白启动子，ApoAI启动子，人球蛋白启动子。病毒胸腺嘧啶脱氧核苷酶启动子则有疱疹病毒胸腺激酶启动子。反转录病毒LTR启动子(包括经修饰后的LTR启动子)，β-肌动蛋白启动子，人生长激素启动子。也可用天然启动子来控制核苷多肽编码表达HSA/CPSF融合蛋白。
根据本发明，重组细胞具有表达编码HSA/CPSF融合蛋白核酸序列的能力。重组工程细胞可以持续地或在有或无诱导剂的存在状态下表达HSA/CPSF，HSA/L/CPSF或CPSF/L/HSA.重组工程细胞形式包括，但不局限于脊椎动物，(即人，猴、鼠、兔等)鱼、鸡、昆虫、植物、酵母、真菌和细菌等细胞。
优选的用于表达HSA/CPSF的酵母属宿主包括，但不局限于，酿酒酵母属(Saccharomyces)，毕氏酵母属(Phichia)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，念珠菌属(Candida)，孢园酵母属(Tarulaspora)和裂殖酵母属等。更优选地，宿主系统可为毕氏酵母属巴斯德菌种(保藏单位：ATCC，保藏号：PTA-4607，保藏日：2002年8月21日)。具体地讲重组载体质粒可为pPICZ-A，B或C.
根据选用不同的宿主用来表达HSA/CPSF融合蛋白，本发明中表达的蛋白多肽，可以是糖基化或非糖基化。优选地，当在宿主系统中得到表达时，HSA/CPSF在脊椎动物细胞如中国仓鼠(CHO)中得到表达的蛋白为糖基化蛋白。当表达在毕氏酵母菌中则为非糖基化或部分糖基化。
如上所述，在本发明中提到的白蛋白融合蛋白，优选的使用基因工程技术构建来表达。获得融合蛋白的优选方法是利用载体质粒，通过转化和转染或感染的方式来表达融合蛋白。特别是利用可转化酵母的表达载体，来转化毕氏酵母，并使融合蛋白分泌到培养液中。
利用酵母菌表达HSA/CPSF的优势为，酵母菌系统允许产生高质量成熟的融合蛋白，并分泌到培养液中便于纯化。
酵母菌遗传工程的进展使外源基因可以在酵母菌中得到表达并分泌蛋白产品到细胞外。利用酵母菌表达分泌型蛋白的优点为，但不局限于，高表达产量、蛋白质为可溶性，正确的折迭和易于大规模生产和纯化。
经由白蛋白天然信号肽，HSA/CPSF融合蛋白可分泌到酵母菌培养液中。HSA/CPSF融合蛋白的多肽可由信号肽主导并通过分泌途径而得到加工。白蛋白的前导肽序列可用在酵母菌中，使融合蛋白分泌到酵母菌外。其它分泌肽，如天然的酿酒酵母的α-因子分泌信号肽，也可用于分泌本发明中的融合蛋白。
酵母表达的HSA是可溶性的并且显示出与由血浆中分离的HSA是有相同的二巯健结构。当用于临床时，HSA的用量为克级。因而重组的HSA要具有等同于自然界中分离的HSA。由酵母分泌到培养液中的HSA/CPSF是通过与HSA表达一致的途径来加工。并避免了由酵母细胞抽提物中分离纯化蛋白的难题。酵母细胞是难于裂解的。另外，分泌出的蛋白质纯度也易于提高，因为由酵母分泌出的蛋白仅占全部酵母蛋白的0.5-1％，而且酵母无毒性蛋白伴随。
优选实例为，应用巴斯德酵母菌系统来表达本发明中提及的HSA/CPSF融合蛋白。巴斯德酵母菌是由SALK生物技术工业研究与菲力蒲石油工业研究协作发展出的一个高效重组蛋白表达系统。有关毕氏酵母菌的应用技术已在有关专利中详细阐述了。
利用毕氏酵母菌来表达HSA或HSA/CPSF融合蛋白优于利用其它表达系统。毕氏酵母菌是有许多高等真核细胞表达系统所具有的优点。例如蛋白质的加工、折迭，转录后的修饰以及如同培养细菌或酿酒酵母一样的易于大规模培养。与其它系统如杆状病毒、脊椎动物细胞培养相比更具有简捷、快速表达，产量更高。毕氏酵母还有另外一个优势是可以10-100倍高的表达水平。这些特性使得毕氏酵母变成十分有力的蛋白表达系统。
由于毕氏酵母与酿酒酵母的相关性，许多由酿酒酵母研究发展出的方法和技术均可用于毕氏酵母，包括转化、基因插入、基因取代。更进一步的在酿酒酵母上发展出的遗传专用术语，也可用于毕氏酵母菌。如，组氨酸脱氢酶、在酿酒酵母和毕氏酵母中均是由HIS4基因编码的。毕氏酵母做为甲醇利用酵母能够以甲醇为单一碳源进行代谢。其过程为：首先甲醇的代谢是氧化甲醇，变为甲醛是由乙醇氧化酶将分子氧加到甲醇分子上。这一反应形成氧化氢。为了避免过氧化氢的毒性。甲醇代谢发生在一个特殊的细胞组织中，叫做过氧质体。其可将过氧化氢的毒性与细胞其它部分隔绝。乙醇氧化酶与氧的亲和性极差，使得毕氏酵母菌为了代谢的进行而大量生产乙醇氧化酶(AOX)调控乙醇氧化酶生产的启动子被用来驱动外源(HSA或HSA/CPSF)蛋白在毕氏酵母菌中的表达。
毕氏酵母菌与酿酒酵母菌相比，毕氏酵母菌在对分泌的蛋白质进行糖基化的程度上有着更大的优点。即：毕氏酵母不会有过度糖基化现象。酿酒酵母和毕氏酵母均有N-联接糖基甘露糖修饰。然而寡糖化物链加在表达的蛋白上，在毕氏酵母菌中只有8-14个糖基，而远短于在酿酒酵母中的50-150甘露糖链。在毕氏酵母菌中联接糖基化较少发生。酿酒酵母的核心糖化带有α-1，3联接末端物。而在毕氏酵母菌则没有。研究表明由酿酒酵母产生的糖基化蛋白具有较强的抗原反应，而使得这些蛋白不适于用在特别是治疗目的上的使用。当然也表明这又减少了一个对毕氏酵母菌用来表达蛋白在糖基化上的担忧。
利用毕氏酵母做为表达系统有许多试剂盒可以使用。如Invitrogen的易选EasySelectTM毕氏酵母表达试盒。表达载体上有一个AOX1启动子可以使外源基因在毕氏酵母中利用甲醇来诱导表达。同时还有一个抗生素Zeocin抗性基因，可做为选择重组子的标记。在本发明中，表达融合蛋白启动子是非常重要的因素。
在毕氏酵母系统中，AOX1基因启动子是十分强劲的启动子。特别是在毕氏酵母菌中，在毕氏酵母里共编码两种乙醇氧化酶，AOX1和AOX2。AOX1是负责在细胞中产生合成巨量的乙醇氧化酶(AOX1)活性。AOX1基因的表达是受到紧密控制并由甲醇诱导而达到极高的水平。典型地当用甲醇做为唯一碳源时，在所有的可溶性蛋白中AOX1基因的产物就达30％。AOX1基因已分离得到。AOX1基因启动子也用于本发明中载体质粒中用以驱动编码有目的基因的外源蛋白的表达(Ellis等，1985；Koutz等，1989，Tschopp等，1987a)。而AOX2和AOX1基因有97％的同源性。在甲醇中的生长速度比AOX1基因为慢。这种缓慢生长状态，可以分离到Mut+(AOX1)株。除了AOX1基因启动子外，在酵母菌中其它启动子也可用于驱动HSA/CPSF融合蛋白。这些启动子包括，但不局限于PGK1，Gall，Ca110，Cycl，PH05，TRP1、ADH1或ADH2基因启动子。
表达质粒也可同时用于细菌宿主，如大肠肝菌DH5α(Gibcol/BRL)和酵母宿主中。抗生素Zeocin作为选择标记已应用在本发明的各实施例中。
表达载体含有编码HSA或HSA/CPSF融合蛋白的核苷酸多肽，按Invitrogen试剂盒所描述的方法转化酵母菌。经过抗性选择出转化的酵母菌菌落。这些细胞可表达HSA/CPSF融合蛋白，当接种于适当的培养液中，分析这些酵母菌表达分泌融合蛋白于培养基中的能力。蛋白质的收获可在细胞连续培养中进行。或在批量培养结束后一并收获，本发明所述的融合蛋白经培养的酵母菌表达后，以能维持蛋白活性，药力活性的蛋白提纯方法来加以分离纯化。
在此还需提及的是，其它表达系统也可用于本发明中所提到HSA/CPSF融合蛋白的表达。包括，但不局限于，细菌、枯草杆菌(B.Subtitis)、酿酒酵母(S.Cerevisiae)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)，孢圆酵母属(Tourlaspora)、裂殖酵母属(Schizosaromyces)、固囊酵母属(Citeromyces)、Pachysoler，德巴利酵母属(Debaromyces)、梅奇酵母属(Metschumikowia)、红冬孢属(Rhodosporidium)、无色担子孢子属(Leucosporiduum)、葡状子囊菌属(Botryoascus)、锁掷酵母属(Sporidiobolcus)、拟内孢霉属(Endomyucopsis)、动物、植物和昆虫细胞等。
3)HSA/CPSF融合蛋白组合治疗
本发明还提供了一种不同HSA/CPSF融合蛋白组合应用。
这种独特的融合蛋白组合可以提供刺激患者身体内的多种细胞的同时增生，分化成熟，或具有对某一特定类细胞具有协同增效作用。特别地，本发明中的人血清白蛋白和具有不同造血活性的细胞介素形成融合蛋白，共同组合使用的结果是同时刺激多种血细胞和血小板的增生和成熟。应用HSA/CPSF的定向作用于不同类型的血细胞的信号转导途径或多种血细胞的产生途径，这样在只需一次注射使用于患者身上后，使诸如血小板，红细胞和巨噬白细胞，粒白细胞等都得到大幅增加。
在本发明中，白蛋白的血浆传递功能和CPSF的治疗功能因蛋白发生融合而得到整合。当在血液中循环时，由于与白蛋白融合而授与CPSF一个抵抗蛋白酶降解的超级稳定性，结果大大延长CPSF在血液中的半衰期。由于大量白蛋白的存在，不同的CPSF与白蛋白形成融合蛋白，经组合可以减少并形成较小的生物学功能上的相互干扰现象。这种干扰现象常出现在“CPSF单体”之间的组合。进一步来说，一个与白蛋白融合的CPSF，可以在血液系统中停留相当长的一段时间而得到缓慢释放，因而减低了在常规方法下，单独使用大剂量单一CPSF时，带来的急性反应，毒性及副作用。这种融合蛋白缓慢释放作用形式，以本发明中的使用剂量，注射次数减少，而更进一步降低CPSF注射的付作用。特别是对癌症病人实施化学或放射性治疗前或后，这种组合式使用，在刺激多重血细胞分化增生上是十分有用的。癌症病人常需忍受多次高剂量的CPSF注射，给病人带来极大的损害。例如，在动物和临床试验中，人TPO，SCF和IL-3都表现出极强的体内毒性作用。由于严重的体内毒性作用，SCF已被FDA批准仅用于体外细胞的处理，从而阻碍了SCF被研发为一种有用的临床药物。IL-3的付作用极为明显是剂量依赖型。当病人使用剂量达5毫微克/kg时，付作用有发烧、红疹、腹泻、寒战、肌骨痛、头痛、结膜炎、浮肿、胸痛、呼吸困难、血小扳计数减少、哮碱性细胞计数增加，骨髓纤维化以及肺水肿等(文献，Eder等1997)“IL-3临床研究”干细胞杂志，15：327-333)  。
根据本发明，血清白蛋白与此类CPSF形成融合蛋白后，可在进入体内后因缓慢释放而减少上述局限性。另外，这样的融合蛋白可以与相对大量的白蛋白组合，可进一步减轻中枢神经系统对直接注射CPSF进入体内，所引起的强烈可预见的反应。
已知，贮存“裸露”的细胞介质是相当不稳定的，并且在血液中有极短的寿命。十分清楚地是，治疗性蛋白质具有的如此脆弱稳定性在体内是相当不便的。事实上重复注射蛋白产品或由灌注点滴法给药，此达到药物的有效强度，对病人来讲是十分昂贵和不便的。
本发明使得HSA/CPSF融合蛋白在血液中半衰期延长，稳定性增加。复合型的HSA/CPSFs即HSA与IL-11，hEPO、hGCSF、和hGM-CSF共同作为可刺激血液中多种血细胞的增生。
具体地，HSA/hIL-11融合蛋白可以和HSA/hEPO融合蛋白形成复合刺激作用于血液异常的病人，其结果病人的红细胞和血小板分化增生，结果是计数的增加。
例如，在癌症病人化疗处理之前或之后，注射HSA/hIL-11和HSA/hEPO融合蛋白，刺激细胞和血小板的增生，不必输血病人即可进入下一阶段化疗程序，有利于消灭癌细胞的再生与转移。
具体地，HSA/hIL-3融合蛋白可以和HSA/hEPO融合蛋白共同组合给与血液异常病人，以增加EPO诱导的血红细胞的增生。具体地，HSA/hIL-3可以和HSA/hGCSF融合蛋组合使用，其结果是，使用后血液异常的病人血细胞，嗜中型白细胞和嗜酸性白细胞数目计数增加。
可替代的，根据病人的需要，一种HSA/CPSF可以与另一种或多种HSA/CPSFs同时或先后的方式给药。这种组合是以疗效和达到治疗目的剂量，并对病人的治疗效果具有协同增效的作用的有效剂量。
本发明提供了成套的使用HSA/CPSFs组合治疗的描述与实践，成套组合包括第一个HSA/CPSF和第一个CPSF与第二个可以是相同或不同的HSA/CPSFs。例如，第一个HSA/CPSF中CPSF可以是IL-11和第二个CPSF是EPO；或第一个CPSF是IL-3，第二个CPSF是EPO；或第一个CPSF是IL-11，第二个CPSF是GCSF等。
HSF/CPSF融合蛋白和它们的组合可用于处理各种疾病，包括但不局限于，造血系统异常，如血红素减少，低色素性小，红血球性贫血和一般性贫血；血小板减少，HIV感染，癌症、肾衰弱，以及组织器官移植等。优选地，融合蛋白应不含有能引起人类免疫反应的蛋白质序列。
本发明还提供了对需要CPSF病人的一种使用方法，这种方法是将HSA与CPSF基因融合而形成融合蛋白并按一定的配比组合而成有效的复合组成制剂。这种药学配方可由药剂学上接受的赋形剂和剂型以达到增加HSA/CPSF的稳定性。当然医学上能接受的剂型，也包括天然和重组的人血清白蛋白以及或另外一种或多种HSA/CPSF融合蛋白。
除此外，本发明也提供了利用酵母菌来更有效地及节省费用的生产制造重组融合的HSA/CPSF蛋白。
附图说明附图1.人血清白蛋白，各种细胞增生刺激因子，血清白蛋白与细胞增生
刺激因子形成融合蛋白的DNA核苷酸序列和蛋白质氨基酸序列。附图2.含有人血清白蛋白基因的质粒DNA，并以此质粒构建人血清白蛋
白与细胞增生刺激因子形成融合蛋白的基因表达载体质粒。附图3.以鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体(Sigma公司)所做的蛋白质免
疫印迹(Western Blot)实验。蛋白质上样量为100纳克：A)
分离自人体血液制品中的血清白蛋白(65kd)；B)酵母菌表达
的人血清白蛋白(65kd)；C)人血清白蛋白与粒细胞集落刺激
因子形成的融合蛋白(84.2kd)；D)人血清白蛋白与红细胞增
生素形成融合蛋白(83.5kd)；以及E)人血清白蛋白与白细胞
介素-11形成的融合蛋白(84.5kd)。附图4.以羊抗人白细胞介素-11的多抗抗体(R&D系统公司)以及鼠抗
羊单克隆抗体(R&D系统公司)所做的蛋白质印迹实验。上样量
为100纳克：A)由细菌表达制备的人白细胞介素-11；B)由酵
母菌表达的人血清白蛋白和人白细胞介素-11形成的融合蛋白。附图5.以鼠抗人巨噬粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)单克隆抗体(R&D
系统公司)所做的蛋白质印迹实验。蛋白质上样量为20纳克：A)
由细菌表达制备的GM-CSF；B)由酵母菌表达的人血清白蛋白
和GM-CSF形成的融合蛋白。附图6.人血清白蛋白与白细胞介素-11形成的融合蛋白刺激T1165细
胞增生的生物活性测定。测定培养液中含有(A)或不含有(B)
抗人白细胞介素-6的单克隆抗体。附图7.对人血清白蛋白与红细胞增生素形成的融合蛋白与红细胞增生素
单体所做的生物活性测定结果比较。附图8.生物活性测定结果显示在37℃(A)或50℃(B)下融合蛋白在
不同温度下的存活期。附图9.动物体内实验比较合并使用不同融合蛋白比单独使用融合蛋白或
单独使用细胞增生刺激因子对多种血细胞具有增生刺激的协同
增效作用。附图10.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示纯化的人血清白蛋白与细胞
增生刺激因子形成的融合蛋白的纯度。上样量分别为2微克。A)
人血清白蛋白分离自血液制品；B)由酵母菌表达的人血清白蛋
白制品；C)人血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子形成的融合蛋
白；D)人血清白蛋白与红细胞增生素形成融合蛋白；以及E)
人血清白蛋白与白细胞介素-11形成的融合蛋白。
具体实施方式
实施例1  分子克隆技术简述
常规分子克隆技术包括DNA、RNA的提取，琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，DNA片段的联接，限制性内切酶酶切反应均参照文献(Maniatis，et al.，“分子克隆实验手册”冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，1982)。质粒DNA的纯化，DNA片段的回收等均采用商品纯化柱制备。DNA聚合酶链反应(PCR)(参照文献Saikiet al.，科学，230：1350，1985)所用的酶及反应所需PCR仪均为Perkin Elmer产品。并参照厂家操作程序。DNA测序和DNA扩增所需用的寡聚核苷酸引物由专门机构完成。转受态E.coli细菌由GIBCO/BRL公司购得。本发明所使用的酵母菌菌种均购自Invitrogen公司。转化酵母菌是由电脉冲方式进行，并参照厂家(Bio-Rad)操作程序。
实施例2  人血清白蛋白(HSA)基因表达及载体质粒的构建
以人胎肝中提取的总RNA为模板，利用反转录多聚酶链聚合反映来合成、扩增HSA基因。5微克总RNA在反转录酶(购自GIBCO/BRL公司)的作用下，合成相对应的DNA链，寡聚核苷酸引物为18个T+1N(N为随机核苷酸)。反应条件为45℃20分钟，而后升温至55℃，继续保温40分钟。用于扩增HSA的寡聚核苷酸引物是按GenBank中V00494的DNA序列所设计。
其寡聚核苷酸引物序列为：Seq.ID NO.23：5’- GAATTCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC-3’，和Seq.ID NO.24：5’- GAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3’
两个EcoR I识别位点分别加在HSA基因的两端以用于DNA片段插入适当的载体。PCR反应条件为94℃ 4分钟以灭活反转录酶并变性DNA。然后进入如下35个循环反应：94℃30秒，58℃30秒，72℃扩增2分30秒。循环反应结束时，再给予72℃10分钟的延长反应。凝胶电泳显示PCR扩增产物长约1850碱基对。PCR产物利用TA克隆的方法插入PCRII载体(Invitrogen公司)。所得质粒命名为PCR-HSA。DNA测序结果表明其与发表的人血清白蛋白DNA序列相同。附图1 Seq ID NO.11为HSA基因DNA序列。附图1 Seq ID NO.12为HSA基因蛋白质氨基酸序列。
使用EcoR I酶酶切质粒pCR-HSA，然后经电泳分离纯化HSA DNA，再克隆如pPIC Z-A酵母菌转移载体质粒(Invitrogen)中。经转染DH5α感受态细菌，在含有抗生素Zeocin的低盐LB-琼脂平板上选择出的细菌克隆，其经检定对HSA基因插入的质粒命名为pYZ-HSA(Y：酵母菌；Z：含Zeocin抗生素抗性)。其基因插入方向经Xho I/Nde I酶切决定。pYZ-HSA载体质粒的物理图谱列于附图2。
该质粒具有如下优点：1)带有Zeocin抗性基因可使受其转化的细菌或酵母菌在含有Zeocin抗性素的培养基上生长。Zeocin抗性素是一种新型广谱抗生素。在结构上属于Bleomycin/Phleomycin家族，对于细菌、真菌(包括酵母菌)，植物、脊椎动物细胞均具较强的毒性。但Zeocin对真菌的毒性小于Bleomycin。携带有Zeocin抗性基因的质粒即可在细菌中，又可在真菌的转化中做为选择标记。2)在HSA基因插入的下游，载体带有多个酶切位点。这些酶切位点便于以基因工程方法直接插入功能蛋白基因，与HSA形成融合蛋白。3)在HSA基因插入的下游，还有两个常用短肽myc和6个组氨酸组成的多肽。当其与未知基因融合表达后，可用已知的短肽特异抗体来鉴别蛋白质的表达。也可用商品化的亲合柱层析来纯化所表达的未知蛋白。pYZ-HSA载体质粒为本发明中所有HSA融合蛋白的表达载体。
实施例3 人白细胞介素-11，红细胞增生素，粒细胞集落刺激因子和巨噬粒细胞集落刺激因子的分子克隆
人白细胞介素-11(hIL-11)，红细胞增生素(hEPO)，粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)和巨噬粒细胞集落刺激因子(hGM-CSF)的分子克隆应用相似于实施例1中所表述的RT-PCR方法，从不同来源的总RNA制备物中扩增，并克隆于PCRII载体质粒中，并经DNA测序分析。
hIL-11克隆自人骨髓分裂细胞总RNA样品中。PCR合成寡聚核苷酸引物分别为：
Seq.ID NO.25：5’- CATATGAACTGTGTTTGCCGCCTGGTCC-3’，和
Seq.ID NO.26：5’-GATATGTATGACACATTTAATTCCC-3’
引物的设计是根据文献Paul，SR et al.，PNAS，87：7512-7516，1990而设计。PCR产物也包括hIL-11的编码区域及3’-末端非编码区域。并在5’端引入一个新的限制性内切酶Nde I位点。克隆的hIL-11基因DNA序列(Seq ID NO.13)列于附图1，蛋白质氨基酸序列(Seq ID NO.14)列于附图1。
hEPO全长序列是由人胎肾mRNA制品(Clonetech Inc)中克隆扩增而来。(参照文献Lin，FK et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82：7580，1985)，EPO的PCR合成寡聚核苷酸引物的DNA序列为：
Seq.ID NO.27：5’- GGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCC-3’，和
Seq.ID NO.28：5’- GAATTCTCATCTGTCCCCTGTCCTGC-3’
RT-PCR的产物经扩增后克隆入pCRII载体质粒中，经DNA序列分析，证明其与文献报道相同。内切酶BamHI和EcoRI识别位点已分别加在EPO基因两端。EPO基因的DNA序列(Seq ID NO.15)列于附图1，蛋白质氨基酸序列(Seq ID NO.15)列于附图1。
hG-CSF基因全长序列是从人胎肝总RNA中，用RT-PCR的方法扩增、克隆扩增而得。PCR所需的引物DNA序列是根据文献Nagata，S et al.，Nature，319：415，1986)来设计的。寡聚核苷酸引物序列为：
Seq.ID NO.29：5’- GGATCCATGGCTGGACCTGCCACCC-3’，和
Seq.ID NO.30：5’- GAATTCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’
BamHI和EcoRI识别位点人为加在克隆的G-CSF基因两端，经扩增的G-CSF基因DNA序列(Seq ID NO.17)列于附图1，蛋白质氨基酸序列(Seq ID NO.18)列于附图1。
hGM-CSF基因全长以上述方式克隆于人胎肝细胞总RNA中，参照文献Wong，GG et al.，科学，228：810，1985)设计的PCR寡聚核苷酸引物序列为：
Seq.ID NO.31：5’- GGATCCATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGC-3’，和
Seq.ID NO.32：5’- GAATTCTCACTCCTGGACTGGCTCC-3’
RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，克隆于pCRII载体，并经DNA序列分析鉴定。其DNA序列(Seq ID NO.19)列于附图1，蛋白质氨基酸序列(Seq ID NO.20)列于附图1。
实施例4. 人血清白蛋白与各种细胞增生刺激因子基因的融合及表达质粒的构建
在HSA的C-末端含有一个限制性内切酶Bsu36I识别位点，细胞增生刺激生长因子：hIL-11，hEPO，hG-CSF和hGM-CSF均通过基因工程方式将成熟蛋白序列与HSA C-末端蛋白质序列相联，而形成HSA的融合蛋白，做法是：用特异的寡聚核苷酸为引物，以各种细胞增生刺激因子基因为模板，在PCR方法下修饰各基因的N-末端，使之增加一个Bsu36I酶切位点。在C-末端增加一个XhoI位点。然后将修饰的各种基因再克隆到经Bsu36I/XhoI双酶切取pYZ-HSA载体质粒中。新插入的各因子蛋白质序列与HSA C-末端蛋白质序列编码顺序相连接，而形成新HSA/CPSF DNA分子序列。其可表达HSA融合蛋白，并具有血细胞增生刺激因子的生物功能。
形成HSA/hIL-11融合基因是采用寡聚核苷酸引物：
Seq.ID NO.33：5’-CTGCCTTAGGCTTA CCTGGGCCACCACCTGGCC-3’，
(hIL-11成熟蛋白基因序列以下横线示出)和
Seq.ID NO.34：5’-T GTCGACTCACAGCCGAGTCTTCAGCAGC-3’
由于在hIL-11基因编码区有一个XhoI位点。一个新的SalI限制性内切酶位点加在3’-末端。SalI和XhoI识别序列具有互补性。当PCR产物经鉴定酶切与pYZ-HSA质粒连接后，SalI和XhoI识别位点均消失。新构建成的DNA表达质粒，pZY-HSA/hIL-11。用此质粒转化的酵母菌可表达一种新的HSA与IL-11融合的蛋白质，HSA/hIL-11的DNA序列(SeqID NO.1)和融合蛋白氨基酸序列(Seq ID NO.2)列于附图1。
EPO基因与HSA基因融合是由寡聚核苷酸引物：
Seq.ID NO.35：5’-CTGCCTTAGGCTTA ATCTGTGACAGCCGAGTCC-3’，
(hEPO的蛋白编码区用下横线示出)和
Seq.ID NO.36：5’-CA CTCGAGTCATCTGTCCCCTGTCCTGC-3’
一起修饰EPO基因DNA片段。PCR产物经鉴定后，插入经Bsu36I/XhoI酶切后的pYZ-HSA载体质粒中而形成pZY-HSA/hEPO质粒。经该质粒转化的酵母菌，表达一种HSA与EPO融合蛋白。该融合蛋白的DNA序列Seq IDNO.5，而蛋白质的氨基酸序列Seq ID NO.6列于附图1。
G-CSF基因与HSA基因形成融合分子也是利用PCR引物来完成的：
Seq.ID NO.37：5’-CTGCCTTAGGCTTA ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3’(hG-CSF编码区用下横线示出)和
Seq.ID NO.38：5’- CTCGAGTCAGGGCTGGGCAAGGTGG-3’
(XhoI位点已加在G-CSF的3’-末端)。PCR产物经酶切胶纯化后插入pYZ-HSA载体的Bsu36I和XhoI酶切位点处，构建成pZY-HSA/hGCSF。用此质粒来转化酵母菌表达的HSA与GCSF融合蛋白的DNA序列(Seq IDNO.7)和蛋白质的氨基酸序列(Seq ID NO.8)列于附图1。
GM-CSF基因经过PCR方法修饰后也可形成HSA与GMCSF融合序列。寡聚核苷酸引物序列为，
Seq.ID NO.39：5’-ACTCCTTAGGCTTA GCACCCGCCCGCTCGCCCAGC-3’
(hGM-CSF成熟蛋白的DNA序列以下横线示出)和引物
Seq.ID NO.40：5’- CTCGAGTCACTCCTGGACTGGCTCC-3’
(XhoI位点也以下横线示之)。PCR反应产物经酶切凝胶电泳纯化后，插入pYZ-HSA载体的Bsu36I/XhoI酶切位点处而形成pZY-HSA/hGM-CSF的融合基因的DNA序列(Seq ID NO.9)和该基因产物的编码的蛋白质氨基酸序列(Seq ID NO.10)列于附图1。
实施例5  酵母菌的转化
将毕氏酵母菌菌株GS115菌落接种于含5ml YPD培养液的50ml培养基中，以250转/分的速度于30℃下培养过夜。次日取0.2ml过夜培养物再转接入500ml YPD的培养液中，置于2升的三角培养瓶中。在30℃下旋转培养2-3小时之细胞密度达到OD600＝1.3-1.5。酵母菌经离心方法收集，再重悬于500ml冰预冷的无菌水中洗涤两次。然后酵母菌悬于20ml冰预冷的1M Sortbitol溶液洗涤一次。
实例2中构建的质粒pYZ-HSA和实施例4中构建的质粒pZY-HSA/hIL-11，pZY-HSA/hEPO，pZY-HSA/hGCSF和pZY-HSA/hGMCSF均经Pme I限制性内切酶处理后，形成线性质粒分子。取5ug线性质粒DNA与80ul处理后的酵母菌相混合并置于0.2厘米厚的电极杯内，置于点脉冲仪上。电脉冲条件为电压7500V/CM，电极间隔时间为5-10(ms)。电击处理后，立即加入1ml冰预冷的1M Sorbitol溶液于酵母菌中，然后转入15ml试管中。转化的酵母菌置于30℃培养箱中放置2小时，然后接种涂布在含Zeocin抗生素的YPD平板培养基上。经抗性选择而生长出的克隆，再用分子生物学方法鉴定其基因的插入。蛋白质的表达与分泌则以SDS-PAGE或用特异抗体做蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测。不同的毕氏酵母菌菌株，如X-33，KM71以及蛋白酶缺陷型酵母菌株，如SMD1168均可用来表达和分泌重组的HSA/CPSF融合蛋白。
实施例6  酵母菌表达及分泌的HSA和HSA/CPSF融合蛋白的特性
将数个含有待表达基因的酵母菌落分别培养在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中。以300转/分的速度培养至菌体密度达到OD600＝2-6。培养物经1500转/分，5分钟条件下离心收集菌体，菌体再重悬于同种基本培养液但不含甘油，改含0.5％甲醇，继续培养，细胞密度达到OD600＝1.0。酵母菌在甲醇的诱导下，外源蛋白在启动子的作用下开始表达。其后，每24小时加入100％甲醇至最终浓度为0.5％。在不同的时间点分别收集培养上清液。利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或蛋白质免疫印迹法测定HSA或HSA/CPSF蛋白质的表达。
结果表明，HSA及HSA/CPSF融合蛋白均由酵母菌表达，并被分泌到培养液中。鼠抗人血清白蛋白的单克隆抗体(Sigma)用蛋白质免疫印迹实验的确定被表达的蛋白质为HSA或HSA/CPSF融合蛋白。
典型的蛋白质免疫印迹实验是将变性(SDS)凝胶电泳分离的蛋白质，经电泳仪将蛋白质转移到尼龙或醋酸纤维膜上，再以特异抗体(第一抗体)识别相对应的蛋白质。然后带有荧光功能基因的第二抗体，识别并结合于第一抗体，经荧光显色后，整个特异性结合的复合物，即特异蛋白质在X光片上留下印记。标准蛋白分子量用于决定未知蛋白的分子量。附图3为经酵母菌表达分泌的HSA及HSA/hIL-11、HSA/hEPO、HSA/hGCSF和HSA/hGMCSF均得到表达，并显示具有与从人体血清中分离到的血清白蛋白(Sigma)，在分子量及抗原性上均相同。以抗人白细胞介素-11的单克隆抗体所做的蛋白质免疫印迹实验表明，融合蛋白HSA/hIL-11与纯品hIL-11(R&D System公司)具有相同的抗原性，并显示二者之间在免疫反应强度与分子大小上具有相同的比率，见附图4。同理，以抗人GM-CSF抗体进行检测，相同结果也得到证实，见附图5。
实施例7  分泌型HSA/CPSF的纯化与特性
重组的酵母菌细胞(ZY-HSA/CPSF)培养上清液中含有分泌出的血清白蛋白或血清白蛋白的融合蛋白HSA/CPSF，经收集、浓缩并降低盐浓度后，调整PH至7.5左右，浓缩液通过Bio-Rad公司制造的Affi-GelBlue-Gel层析柱。HSA或HSA/CPSF则与层析柱上的功能集团结合而挂在柱体上。经过洗涤，HSA或HSA/CPSF则可经由1-5M NaCl梯度洗脱，得到具有75-85％纯的蛋白制剂。如有需要则进一步通过分子筛层析柱，可得纯度提高至95-99％或更纯。用于动物试验的样品则将可能的热源如内毒素，借助Affi-Prep polymyxin Support层析柱(Bio-Rad)来去除，以符合体内试验需要。利用常规方法来决定蛋白质的浓度，如Bio-Rad生产的蛋白质浓度测定试剂盒。最后纯化的蛋白质通过0.2uM滤膜以达无菌要求。
实施例8  人白细胞介素-11的细胞分化生物活性的测定
实验所用的细胞株T1165是鼠细胞，其为白介素-6依赖型。利用T1165细胞来测定IL-11的生物学活性是由Paul.SR(PNAS 87：7512)在1990建立的。细胞株培养于RPM1培养基中，含有10％热灭活处理的牛胎血清，2m Mglutamine，抗生素为盘尼西林(100U/ml)和庆大霉素(100mg/ml)(均购自GIBCD/BRL公司)。50μUM巯基乙醇(SIGMA公司)以及重组人白介素-6(IL-6)(GIBCL/BRL)生物测定则是在96孔接种1×105细胞加入200μl不含IL-6的培养基，然后加入不同稀释度的待测样品，在37°5％CO2的条件下放置48小时。最后6小时时，取出加入10μl含0.5mCi的3H-Thymidine进行瞬间标记。处在细胞分化中的新合成的DNA，吸收并将3H-Thymidine掺入DNA链中。细胞培养结束后，收集细胞并通过一种玻璃纤维膜。经洗涤后将膜置于Beckman公司制造的放射性测定仪来测定放射活性。试验分成平行的两组，一组含有抗人IL-6的中和抗体，一组不含中和抗体。加入抗体可消除IL-6对细胞的分化功能。各种对照一并考虑加以设置。附图6显示了各种样品对该细胞分化的刺激生物活性。试验显示融合蛋白与纯品IL-11的生物活性在数值上有着与其分子量大小相一致比例，这一结果表明HSA/IL-11融合蛋白与纯品IL-11具有相同的生物活性。
实施例9  应用酶联免疫(ELISA)方法测定EPO和HSA融合蛋白的生物活性
应用免疫酶联反应(ELISA)测定未知样品中EPO的活性并与已知生物活性的EPO标准品进行比较测定是一种常规方法。R/D系统公司出品的EPO ELISA试剂盒是双抗体夹心方法。在多孔塑料板中，加入EPO抗体(鼠单克隆抗体)，并用共价法将其与孔壁相联。然后加入待测样品或标准品与该抗体反应，EPO分子被特异抗体结合而留在孔板上，经洗涤后抗人EPO多抗(兔)抗体，其与过氧化物酶共价结合，再与被单抗俘获的EPO分子相结合。成为一个复合体，这一复合体决定了EPO在样品标准品中的含量，随后一种化合物加入孔中，经酶的作用而形成一种兰色复合物。反应的终止是加入适量的酸。并由兰色变成稳定的黄色，光吸收值(OD450)测定的结果就显示出样品或标准品中EPO的含量。与标准品曲线相比较，可以计算出未知样品中的EPO生物活性及含量。计算方法参照“第二版国际标准制备(WHO，67/343)。并以由尿液中分离的人EPO融合蛋白的生物活性相比较。结果表明其生物活性仅为EPO单体生物活性的1/10，见附图7。原因可能是HSA分子过大，阻止了EPO融合蛋白与特异抗体相结合。而降低了该检测方法的灵敏度。用蛋白质免疫印迹法则显示出二者之间仅有三倍的差异，其与两者在分子量上的差异相类似。
实施例10  测定融合蛋白(HSA/CPSF)在体外生物活性的稳定性
以HSA/IL-11为例，对HSA/CPSF融合蛋白在37℃和50℃条件下，在不同停留时间内，对HSA/CPSF的稳定性进行了测定。取5微克由细菌表达的人白介素11和5微克HSA/HIL-11融合蛋白，置于含有200微升，不含血清及其它组分的RPM1培养液于200微升薄壁试管中，每温度共有10个重复。其中一组置于37℃条件下保温，另一组置于50℃水溶中保温。每7天从各组中取出一支，立即放在-80℃冰箱中保存。待全部样品收集后，以这些样品对T1165的细胞分化刺激能力进行生物活性测定，同样以新合成的细胞中DNA合成吸收的3H-Thymidine水平来衡量IL-11的含量及活性。试验同时设置对照。附图8显示hIL-11与HSA形成融合分子后，在37℃条件下5周后仍保存其原有的生物活性。而hIL-11单体在两周内即完全丧失生物活性，结果显示细胞增生刺激因子(CPSF)与血清白蛋白融合后，使之保存，储存时间延长。对环境有更强的抗性及生物稳定性。
实施例11  HSA/CPSF组合使用可刺激多种细胞增生并具有协同增效作用
选用2.3-2.6公斤兔子(White-BC)，分别在第一，第三和第六天时，注射200微升重组蛋白制剂。兔A注射150U EPO(大约10微克蛋白质量)和100微克重组血清白蛋白(rHSA)混合制剂；兔B注射120微克IL-11和100微克rHSA的混合物制剂；兔C注射120微克HSA/IL-11和27微克HSA/EPO融合蛋白制剂。兔D注射120微克HSA/IL-11融合蛋白制剂。兔E则注射27微克HSA/EPO和150微克rHSA。
注射后，每5天收集血样一次，然后用血球计数器对红细胞和血小板数量统计计数。结果列于附图9(A、B、C)。以第一天的细胞计数为基点来判读红细胞和血小板计数的变化并制图9。
在附图9中表明，EPO和HSA/EPO融合蛋白均具有刺激红细胞在兔A、兔C中的增生，计数得以增加。兔A注射的是裸露的EPO，在第35天时，形成一个峰值，随后迅速下降，在第55天时回到基点附近。而兔C注射HSA/EPO后，在35天时达到其最高点，但维持其计数值直到试验结束。这些结果表明HSA/EPO融合蛋白在体内比裸露的EPO有更长的半衰期。这一变化趋势在白细胞介素IL-11的动物体内实验中也有相似的表现。在兔B实验中IL-11在刺激血红细胞的增生上也有一些作用。
IL-II和HSA/IL-II融合蛋白刺激血小板增生上在兔B和C中有明显的作用，注射裸露的IL-II于兔B时，在注射20天后形成一个峰值，随后快速下降到第43天时回复到基点附近。而注射HSA/IL-II的兔C已在40天时达到最高值，但血小板计数维持这一数值，直到试验结束。这些结束显示HSA/CPSF融合蛋白与裸露的CPSF相比有更长的血液停留作用效果。
附图9中比较了HSA/EPO和HSA/IL-II组合注射后第35天时，产生对血红细胞和血小板计数增加的明显协同增效作用。以HSA/EPO为例，HSA和EPO的注射量与兔A相比仅为2.7倍。因而如果HSA/EPO的使用也增加到5倍于裸露的EPO蛋白量时，其刺激红细胞增生的能力，将更为强烈。动物实验中表明HSA/CPSFs组合作用对于血液中的红细胞和血小板的增生具有更佳的协同增效作用。据此表明，本发现在临床上应具有极大的应用价值。
实施例12  应用发酵技术大规模表达制备HSA/CPSF融合蛋白
实验中表明应用毕氏酵母表达和规模化生产重组融合蛋白比起其它任何系统都要容易的多。重组株分离到后，重组蛋白表达株可有Mut+和Muts两种形式。从小规模培养开始，甲醇诱导，在不同培养时间点取样测试蛋白的表达。对于分泌型蛋白在细胞内及培养液中的含量均用SDS-PAGE方法进行分析，对表达产物的生物活性，表达水平和纯度在每一步中均进行监测。附图10展示了经纯化后的各种HSA/CPSFs融合蛋白。
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                           序列表<110>于在林<120>对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白<130>ZYU-0602<160>40<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2363<212>DNA<213>智人<400>1atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt    60gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa    120gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt    180gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat    240gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca    300gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct    360gggagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg    420agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa    480aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc    540tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc    600tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag    660agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta    720gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca    780gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac    840agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag    900gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat    960gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc   1020aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ttgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga   1080aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact   1140ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa   1200tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag   1260cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctgttagttc gttacaccaa gaaagtaccc   1320gaagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa   1380tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc   1440ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc   1500tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca   1560tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt   1620tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag   1680cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgctgc ttttgtagag   1740aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt   1800gctgcaagtc aagctgcctt aggcttacct gggccaccac ctggccccct cgagtttccc   1860cagaccctcg ggccgagctg gacagcaccg tgctcctgac ccgctctctc ctggcggaca   1920cgcggcagct ggctgcacag ctgagggaca aattcccagc tgacggggac cacaacctgg   1980attccctgcc caccctggcc atgagtgcgg gggcactggg agctctacag ctcccaggtg   2040tgctgacaag gctgcgagcg gacctactgt cctacctgcg gcacgtgcag tggctgcgcc   2100gggcaggtgg ctcttccctg aagaccctgg agcccgagct gggcaccctg caggcccgac   2160tggaccggct gctgcgccgg ctgcagctcc tgatgtcccg cctggccctg ccccagccac   2220ccccggaccc gccggcgccc ccgctggcgc ccccctcctc agcctggggg ggcatcaggg   2280ccgcccacgc catcctgggg gggctgcacc tgacacttga ctgggccgtg aggggactgc   2340tgctgctgaa gactcggctg tga                                           2363<210>2<211>763<212>PRT<213>智人<400>2Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu1               5                   10                  15Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
        20                  25                  30Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
    35                  40                  45Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50                  55                  60Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu65                  70                  75                  80Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
            85                  90                  95Gly Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
        100                 105                 110Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
    115                 120                 125Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130                 135                 140Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg145                 150                 155                 160Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
            165                 170                 175Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
        180                 185                 190Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
    195                 200                 205Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210                 215                 220Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys225                 230                 235                 240Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
            245                 250                 255Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
        260                 265                 270Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
    275                 280                 285Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290                 295                 300Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala305                 310                 315                 320Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
            325                 330                 335Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
        340                 345                 350Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
    355                 360                 365Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370                 375                 380Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu385                 390                 395                 400Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
            405                 410                 415Glu Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
        420                 425                 430Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
    435                 440                 445Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450                 455                 460Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser465                 470                 475                 480Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
            485                 490                 495Tyr Val Pro Lys Glu Phe ASn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
        500                 505                 510Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
    515                 520                 525Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530                 535                 540Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys545                 550                 555                 560Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
            565                 570                 575Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro
        580                 585                 590Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu
    595                 600                 605Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu
610                 615                 620Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro625                 630                 635                 640Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly
            645                 650                 655Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val
        660                 665                 670Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro
    675                 680                 685Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu
690                 695                 700Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro705                 710                 715                 720Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg
            725                 730                 735Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala
        740                 745                 750Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu
    755                 760<210>3<211>2229<212>DNA<213>智人<400>3atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt     60gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa    120gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt    180gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat    240gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca    300gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct    360gggagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg    420agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa    480aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc    540tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc    600tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag    660agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta    720gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca    780gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac    840agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag    900gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat    960gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc   1020aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ttgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga   1080aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact   1140ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa   1200tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag   1260cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctgttagttc gttacaccaa gaaagtaccc   1320gaagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa   1380tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc   1440ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc   1500tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca   1560tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt   1620tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag   1680cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgctgc ttttgtagag   1740aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt   1800gctgcaagtc aagctgcctt aggcttagct cccatgaccc agacaacgtc cttgaagaca   1860agctgggtta actgctctaa catgatcgat gaaattataa cacacttaaa gcagccacct   1920ttgcctttgc tggacttcaa caacctcaat ggggaagacc aagacattct gatggaaaat   1980aaccttcgaa ggccaaacct ggaggcattc aacagggctg tcaagagttt acagaacgca   2040tcagcaattg agagcattct taaaaatctc ctgccatgtc tgcccctggc cacggccgca   2100cccacgcgac atccaatcca tatcaaggac ggtgactgga atgaattccg gaggaaactg   2160acgttctatc tgaaaaccct tgagaatgcg caggctcaac agacgacttt gagcctcgcg   2220atcttttag                                                           2229<210>4<211>718<212>PRT<213>智人<400>4Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu1               5                   10                  15Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
        20                  25                  30Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
    35                  40                  45Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50                  55                  60Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu65                  70                  75                  80Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
            85                  90                  95Gly Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
        100                 105                 110Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
    115                 120                 125Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130                 135                 140Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg145                 150                 155                 160Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
            165                 170                 175Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
        180                 185                 190Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
    195                 200                 205Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210                 215                 220Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys225                 230                 235                 240Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
            245                 250                 255Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu ASn Gln Asp Ser Ile Ser
        260                 265                 270Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
    275                 280                 285Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290                 295                 300Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala305                 310                 315                 320Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
            325                 330                 335Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
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    355                 360                 365Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370                 375                 380Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu385                 390                 395                 400Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
            405                 410                 415Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
        420                 425                 430Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Glu Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
    435                 440                 445Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450                 455                 460Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val465                 470                 475                 480Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
            485                 490                 495Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
        500                 505                 510Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
    515                 520                 525Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530                 535                 540Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys545                 550                 555                 560Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
            565                 570                 575Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
        580                 585                 590Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
    595                 600                 605Leu<210>13<211>600<212>DNA<213>智人<400>13atgaactgtg tttgccgcct ggtcctggtc gtgctgagcc tgtggccaga tacagctgtc     60gcccctgggc caccacctgg cccccctcga gtttccccag accctcgggc cgagctggac    120agcaccgtgc tcctgacccg ctctctcctg gcggacacgc ggcagctggc tgcacagctg    180agggacaaat tcccagctga cggggaccac aacctggatt ccctgcccac cctggccatg    240agtgcggggg cactgggagc tctacagctc ccaggtgtgc tgacaaggct gcgagcggac    300ctactgtcct acctgcggca cgtgcagtgg ctgcgccggg caggtggctc ttccctgaag    360accctggagc ccgagctggg caccctgcag gcccgactgg accggctgct gcgccggctg    420cagctcctga tgtcccgcct ggccctgccc cagccacccc cggacccgcc ggcgcccccg    480ctggcgcccc cctcctcagc ctgggggggc atcagggccg cccacgccat cctggggggg    540ctgcacctga cacttgactg ggccgtgagg ggactgctgc tgctgaagac tcggctgtga    600<210>14<211>199<212>PRT<213>智人<400>14Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro1               5                   10                  15Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser
        20                  25                  30Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser
    35                  40                  45Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe
50                  55                  60Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met65                  70                  75                  80Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg
            85                  90                  95Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg
        100                 105                 110Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr
    115                 120                 125Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met
130                 135                 140Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro145                 150                 155                 160Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala
            165                 170                 175Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu
        180                 185                 190Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu
        195<210>15<211>582<212>DNA<213>智人<400>15atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct     60ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag    120aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc    180agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg    240atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct    300gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg    360catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctgcga    420gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc    480actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg    540aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga                       582<210>16<211>193<212>PRT<213>智人<400>16Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1               5                   10                  15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
        20                  25                  30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
    35                  40                  45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50                  55                  60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65                  70                  75                  80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
                85              90                  95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
        100                 105                 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
    115                 120                 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu
130                     135                 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145                 150                 155                 160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
            165                 170                 175Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
        180                 185                 190Arg<210>17<211>630<212>DNA<213>智人<400>17ggatccatggctggacctgc cacccagagc cccatgaagc tgatggccct gcagctgctg     60ctgtggcaca gtgcactctg gacagtgcag gaagccaccc ccctgggccc tgccagctcc    120ctgccccaga gcttcctgct caagtgctta gagcaagtga ggaagatcca gggcgatggc    180gcagcgctcc aggagaagct gtgtgccacc tacaagctgt gccaccccga ggagctggtg    240ctgctcggac actctctggg catcccctgg gctcccctga gcagctgccc cagccaggcc    300ctgcagctgg caggctgctt gagccaactc catagcggcc ttttcctcta ccaggggctc    360ctgcaggccc tggaagggat ctcccccgag ttgggtccca ccttggacac actgcagctg    420gacgtcgccg actttgccac caccatctgg cagcagatgg aagaactggg aatggcccct    480gccctgcagc ccacccaggg tgccatgccg gccttcgcct ctgctttcca gcgccgggca    540ggaggggtcc tagttgcctc ccatctgcag agcttcctgg aggtgtcgta ccgcgttcta    600cgccaccttg cccagccctg agccgaattc                                     630<210>18<211>204<212>PRT<213>智人<400>18Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pr0 Met Lys Leu Met Ala Leu Gln1               5                   10                  15Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro
        20                  25                  30Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu
    35                  40                  45Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys
50                  55                  60Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu65                  70                  75                  80Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser
            85                  90                  95Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu
        100                 105                 110Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu
    115                 120                 125Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala
130                 135                 140Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu145                 150                 155                 160Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg
            165                 170                 175Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu
        180                 185                 190Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
    195                 200<210>19<211>448<212>DNA<213>智人<400>19atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc     60cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg    120cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc    180tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag    240cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac    300tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt    360gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag    420ccagtccagg agtgagaccg gccagatg                                       448<210>20<211>144<212>PRT<213>智人<400>20Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile1               5                   10                  15Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His
        20                  25                  30Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp
    35                  40                  45Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe
50                  55                  60Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys65                  70                  75                  80Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met
            85                  90                  95Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
        100                 105                 110Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys
    115                 120                 125Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
130                 135                 140<210>21<211>459<212>DNA<213>智人<400>21atgagccgcc tgcccgtcct gctcctgctc caactcctgg tccgccccgg actccaagct     60cccatgaccc agacaacgtc cttgaagaca agctgggtta actgctctaa catgatcgat    120gaaattataa cacacttaaa gcagccacct ttgcctttgc tggacttcaa caacctcaat    180ggggaagacc aagacattct gatggaaaat aaccttcgaa ggccaaacct ggaggcattc    240aacagggctg tcaagagttt acagaacgca tcagcaattg agagcattct taaaaatctc    300ctgccatgtc tgcccctggc cacggccgca cccacgcgac atccaatcca tatcaaggac    360ggtgactgga atgaattccg gaggaaactg acgttctatc tgaaaaccct tgagaatgcg    420caggctcaac agacgacttt gagcctcgcg atcttttag                           459<210>22<211>152<212>PRT<213>智人<400>22Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro1               5                   10                  15Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp
        20                  25                  30Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln
    35                  40                  45Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln
50                  55                  60Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe65                  70                  75                  80Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile
            85                  90                  95Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr
        100                 105             110Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg
    115                 120                 125Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln
130                 135               140Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe145                 150<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>23gaattcatga agtgggtaac ctttatttcc                                         30<210>24<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>24gaattcttat aagcctaagg cagcttgact tgc                                     33<210>25<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>25catatgaact gtgtttgccg cctggtcc                                           28<210>26<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>26gatatgtatg acacatttaa ttccc                                              25<210>27<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>27ggatccatgg gggtgcacga atgtcc                                         26<210>28<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>28gaattctcat ctgtcccctg tcctgc                                         26<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>29ggatccatgg ctggacctgc caccc                                          25<210>30<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>30gaattctcag ggctgggcaa ggtggc                                         26<210>31<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>31ggatccatgt ggctgcagag cctgctgc                                       28<210>32<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>32gaattctcac tcctggactg gctcc                                          25<210>33<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>33ctgccttagg cttacctggg ccaccacctg gcc                                 33<210>34<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>34tgtcgactca cagccgagtc ttcagcagc                                      29<210>35<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>35ctgccttagg cttaatctgt gacagccgag tcc                                 33<210>36<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>36cactcgagtc atctgtcccc tgtcctgc                                       28<210>37<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>37ctgccttagg cttaaccccc ctgggccctg ccagc                               35<210>38<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>38ctcgagtcag ggctgggcaa ggtgg                                          25<210>39<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>39actccttagg cttagcaccc gcccgctcgc ccagc                               35<210>40<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>克隆引物<400>40ctcgagtcac tcctggactg gctcc                                          25

Claims (13)

1.一种用基因工程方法生产的人血清白蛋白(HSA)和细胞增生刺激因子(CPSF)融合蛋白，其特征是由一个核苷酸多肽编码的人血清白蛋白(HSA)和一种细胞增生刺激因子(CPSF)构成的一种融合蛋白；这种融合蛋白的核苷酸序列与Seq ID No.1，3，5，7，或9有至少90％序列同源性；由Seq IDNo.1，3，5，7，或9编码的蛋白质氨基酸序列则与Seq ID No.2，4，6，8，或10有至少90％序列同源性。
2.根据权利要求1所要求的融合蛋白是由HSA(第一核苷酸多肽)和CPSF(第二核苷酸多肽)共同相连在生物体内得到表达。第一核苷酸序列与Seq IDNo.11有至少90％序列同源性，而由其编码的一个蛋白质氨基酸序列多肽与Seq ID No.12有至少90％序列同源性；第二核苷酸序列其编码一个CPSF处于第一核苷酸序列的5′或3′末端；第二核苷酸序列与Seq ID.No.13，15，17，19或21有至少90％序列同源性；由第二核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列与Seq ID No.14，16，18，20或22有至少90％序列同源性。
3.一种用基因工程方法生产的人血清白蛋白(HSA)和细胞增生刺激因子(CPSF)融合蛋白，其特征是由一个核苷酸多肽编码的人血清白蛋白(HSA)和一种细胞增生刺激因子(CPSF)构成的一种融合蛋白，CPSF可以是下列中的任何蛋白质类别的一员，包括但不局限于，1）集落刺激因子有：粒白细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬性白细胞集落刺激因子(GM-CSF)，嗜酸性白细胞集落刺激因子(EOS-CSF)(即IL-5)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF即CSF-1)，复合性CSF(即IL-3)和EPO；2)白细胞介素有：白细胞介素-1，-2，-4，-6，-7，-9，-10，-11，-12，-13和白细胞介素-18；3)非集落刺激因子又非白细胞介素有：Steel因子(SLF：C-Kit类似物，干细胞因子和肥大细胞生长因子)，血红增活性因子(EPA)，乳铁蛋白(LF)，H-亚单位铁蛋白(即酸性异铁蛋白)，前列腺素(PG)E1和E2，肿瘤坏死因子(TNF)-α和-β，干扰素(IFN)-α，-β，和-γ，转移因子(TGF)-β，活性素，抑制素，白血球抑制因子和Oncostatin-M；4)Chemokines有：巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1-α(即干细胞抑制因子)，巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1-β，巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-2-α(即GRO-β)，GRO-α，M1P-2-β(即GRO-r)，血小板因子-4，巨噬细胞趋势性和活性因子，以及IP-10因子；另外还有，5)人生长因子：如肝细胞生长因子；表皮细胞生长因子；神经细胞生长因子；内皮细胞生长因子等。
4.根据权利要求1所指出的核苷酸序列，进一步地可有第三个核苷酸序列编码一个联接氨基酸多肽(LINKER)，来联接HSA和CPSF，以构成融合蛋白：HSA-L-CPSF或CPSF-L-HSA.这个氨基酸多肽联接链(L)可以是(G4S)3-4联接物或可以是2-100个氨基酸链长，或可以是5-50个氨基酸链长。优选地可以是14-30个氨基酸链长。
5.根据权利要求1中由Seq ID No.1，3，5，7，或9核苷酸序列所编码的Seq IDNo.2，4，6，8，或10蛋白质氨基酸序列的融合蛋白可以和人血清白蛋白特异抗体相结合。
6.任何重组表达载体质粒携带有权利要求1中的核苷酸序列用于在宿主系统中表达融合蛋白；宿主系统包括但不局限于，脊椎动物，鱼，昆虫，植物、酵母菌和细菌体或其细胞。
7.权利要求6中的宿主系统中的酵母菌其可以是酿酒酵母(Saccharomyces)，毕氏酵母(Pichia)，念珠菌属(Candida)，克鲁维亚酵母(Kluverornyces)，孢圆母属(Torulaspora)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)等；优选地是毕氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)(保藏单位：ATCC，保藏号：PTA-4607，保藏日：2002年8月21日)。
8.根据上述权利要求1中的重组融合蛋白，其蛋白质是由重组酵母菌表达和糖基化；这一重组融合蛋白也可在脊椎动物细胞中得到相同的表达；脊椎动物细胞可以是中国仓鼠(Chinese Hamster Ovary，CHO)细胞。
9.根据上述权利要求1中的重组融合蛋白，当储存在相同条件下融合蛋白与CPSF单体相比，其货架寿命至少长2-10倍；融合蛋白与CPSF单体相比在体内给药后在血液中至少有2-10倍长的半衰期。
10.一种制剂组合其含有至少两种不同的HSA/CPSFs融合蛋白在临床中使用。
11.根据上述权利要求10中的制剂组合，其可是HSA/hIL-11融合蛋白和HSA/hEPO融合蛋白的组成，或也可以是HSA/hIL-3融合蛋白和HSA/hEPO融合蛋白的组合，或是HSA/hIL-11，HSA/hEPO，HSA/hG-CSF和HSA/hGM-CSF的组合使用；组合使用具有治疗疗效并有协同增效作用。
12.人血清白蛋白与人的具治疗作用蛋白均可利用基因工程方法重组形成融合蛋白并可用于治疗目的，或延长具治疗作用蛋白质在体内的半衰期，或降低具治疗作用蛋白质对生物体的毒性或刺激性；重组形成的融合蛋白对治疗目的具正相关性。
13.在上述权利要求12中延长半衰期，降低对生物体的毒性或刺激性，是指融合蛋白与具治疗作用蛋白质单体相比具相同疗效时的使用剂量。
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