CN105777908B

CN105777908B - 重组人血清白蛋白/角质细胞生长因子融合蛋白

Info

Publication number: CN105777908B
Application number: CN201310335662.XA
Authority: CN
Inventors: 于在林; 富岩
Original assignee: Beijing Meifuyuan Bio-Pharm Tech Co Ltd; Tianjin Sino Biotechnology Ltd Fortunerock Inc; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Beijing Meifuyuan Biomedical Technology Co ltd; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2007-06-06
Filing date: 2007-06-06
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2027-06-06
Also published as: CN105777908A

Abstract

本发明提供能刺激皮肤细胞修复具持续作用的重组融合蛋白，用以改善公众健康、美容或用于创伤、疾病的治疗。本发明提供了人血清白蛋白和一种细胞因子多肽利用基因工程方法重组形成的融合蛋白，该融合蛋白，1)可单独或组合使用刺激细胞的修复，特别是可使人体表皮系统中的各种细胞的发育、更新；2)可在体内、体外大大延长这些细胞因子的寿命，以达到含细胞因子产品的最大稳定性和持续作用效果；3)融合形式的细胞因子可以组合使用，能够最大限度地获得使用细胞因子所带来的刺激表皮细胞生长、修复持续作用及增效作用；和4)利用酵母菌发酵生产的发酵液，经简单的加工可直接用于以美容为目的的产品制作。

Description

重组人血清白蛋白/角质细胞生长因子融合蛋白

技术领域

本发明是中国发明专利ZL200710057571.9的分案申请，也是中国发明专利ZL201110211843.2的继续分案申请，也是中国发明专利ZL021428816和ZL2004100428148的继续申请。本发明涉及基因重组及表达的人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法，并涉及单一融合蛋白或不同融合蛋白组合使用的方法。特别涉及利用酵母菌表达生产由人血清白蛋白与人细胞生长因子所形成的融合蛋白(HSA/GF)。细胞生长因子包括：表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF)和类胰岛素生长因子(IGF)等。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿、具有585个氨基酸的血清蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二硫键的单体(参见Brown JR，“白蛋白的结构、功能和应用”Pergamon，纽约，1977)。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90％的抗原性(与血浆中自然状态白蛋白相比)，并且形成不溶性的白蛋白聚合体，不具有白蛋白的生物活性。现在用于临床的白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白(rHSA)的生产已在专利EP330451、EP361991和中国专利申请CN2004010057313.7中公开。

白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，其半衰期寿命为14-20天。综上所述，治疗性蛋白质与白蛋白形成融合蛋白后，融合蛋白将具有极大的优势使之可抵御生物体内酶解作用，并可使治疗性蛋白质在体内体外的寿命大大提高，还可以较高剂量使用。

人源或重组人血清白蛋白在美容产品中的使用也获得了十分有意义的实际应用，并在专利CN01810411.8中有具体的描述。

在药物制剂组成中，白蛋白也常被用作药物的稳定剂，尤其是生物药。

利用基因工程技术，将人血清白蛋白与治疗性蛋白质基因融合在酵母菌中表达为融合蛋白，可增加治疗性蛋白质在血清中和储存时的稳定性，和较长的半衰期，达到蛋白药物的长效化。该项蛋白药物体内修饰公共技术平台，在于在林、富岩中国授权专利ZL02142881.6和ZL200410042814.8中已公开，在此引为参考文献。

发明内容

本发明者通过动物和细胞的体内体外实验证明了人血清白蛋白与细胞生长因子形成的融合蛋白可刺激细胞增生，并具有比单体的细胞生长因子在体内和体外停留更长的时间(长半衰期和持续性)，细胞和动物实验还发现融合蛋白具有与治疗性蛋白单体相同的摩尔生物活性。当复合使用由HSA和不同生长因子形成的融合蛋白(HSA/GF)的组合时，可具有同时刺激多种皮肤细胞的修复和具协同增效作用，而适用于美容、创伤和疾病的治疗，由此完成了本发明。

本发明所涉及的细胞生长因子(GF)包括但不局限于，表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF-2)和类胰岛素细胞生长因子(IGF)。下面就其特性分别简述如下：

①表皮细胞生长因子(Epidiuen cell Growth Factor，EGF)：是EGF是人体分泌的由五十三个氨基酸所组成的具有生物活性的蛋白质，它广泛分布在血液、唾液、尿液等体液中。它具有广泛的生物学活性，能促进表皮细胞的分裂，加速细胞的新陈代谢，使新生的表皮细胞迅速替代老化的细胞(Carpenter，实验细胞研究，164：1-10，1986)。②角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor，KGF，KGF-2)：有多种角质细胞生长因子存在在动物体中。以KGF-2(也叫FGF10)是一种由208个氨基酸组成的碱性蛋白，来源于胚胎上皮细胞、新生或成年间质成纤维细胞的KGF。KGF-2具有促进上皮细胞有丝分裂的作用。能通过吸引成纤维细胞和结缔组织向伤口处移行，促进损伤上皮的修复，表现为温和的促细胞再生作用(Rubin JS等，美国国家科学院院报86：802-806，1989；CN00809802.6)。

③血小板衍生生长因子(Platelet Derived Growth Factor，PDGF)：血小板衍生生长因子是一种具有神经营养活性的生长因子。人PDGF是由A链与B链通过二硫键连接的二聚体。PDGF的A链之间可形成二聚体(PDGFAA)。近期发现，PDGFAA对雄性小鼠生殖系统的发育起着决定性的作用，提示PDGFAA对于生殖系统某些疾病的诊断和治疗可能具有重要意义。PDGF的B链之间也可形成二聚体(PDGFBB)，对于表皮细胞的增值、再生和受损组织的修复具有极强功效，有效促进多种细胞分裂和新皮肤再生，修复受损组织，促进胶原蛋白的生成(Josephs等，科学，225(4662)：636-639，1984；李培旺等，生命科学研究，9：346-350，2005)。

④成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)：主要有酸性(aFGF)和碱性(bFGF)两种分子。FGF是来源于中胚层和神经外胚层的多功能细胞因子(Zhao等，移植，56，1177-1182，1993；Florkiewicz等，纽约科学年报，638：109-126，1991)。具较强的有丝分裂作用。对血管内皮细胞、成纤维细胞等都有促分裂作用。研究表明，通过小鼠、大鼠、家兔等不同的动物模型，观察到FGF等活性多肽具有显著诱导细胞修复，加速创面愈合，减少瘢痕形成的功效。bFGF还能特异地促进体黑色素细胞的分裂。动物试验证明aFGF能促进缺血组织的新生，但由于aFGF在血液中的半衰期太短，而没有在临床试验中显示有明显的效果。

⑤胰岛素样细胞生长因子(Insulin-like Growth Factors，IGFs)：是一类结构上与胰岛素部分同源并具有胰岛素样活性的多肽，既有促细胞分化和增殖活性，又具有胰岛素样作用，对维持正常胰岛素敏感性和血糖稳态调节都有重要作用。国内外许多研究均表明，IGFs与糖尿病慢性并发症的产生密切相关。IGF-1(somatomedin C)的促进生长发育，物质代谢等方面的作用报道较多。IGF-2(somatomedin A；GenBank：MIM147470)，IGF-3(somatomedin B；GenBank：MIM193190)也有新的研究发现。

除以上所简述的细胞生长因子外，还有其它生长因子可以与人血清白蛋白形成融合蛋白，它们可以单独或复合使用，可以和白蛋白单体或白蛋白融合蛋白单独或复合使用，并用以细胞修复以达美容或创伤、疾病治疗的目的。

细胞生长因子在保存中不稳定。以EGF为例，在实际使用过程中，EGF在皮肤伤口环境中也是极不稳定，它被伤口中存在的蛋白酶水解失活，半衰期仅1小时，但皮肤损伤后的愈合过程中，DNA的合成却需要8-12小时。因此，在皮肤或角膜伤口上单次使用EGF对愈合没有明显促进作用。只有多次反复使用才能对愈合起促进疗效。因此，在医学及化妆品领域的实际应用受到很大限制(Manning等，药学研究，6：903-917，1989；CN03011136)。

因此，本发明涉及如下几个方面：

1)HSA/GF融合蛋白

本发明提供一种用基因工程方法生产的人血清白蛋白(HSA)和细胞生长因子(GF)融合蛋白，该融合蛋白是由核苷酸编码的HSA和一种GF形成的融合蛋白，即HSA/GF融合蛋白。根据本发明的方法，任何一种白蛋白或其变异体均可与一种GF形成一种融合蛋白。

GF可以是任何一种蛋白，其可刺激细胞的分化、增生或修复。GF最典型的一个例子是细胞生长因子(GF)在临床上的应用，如hEGF和hKGF已分别被批准用于创伤和溃疡的临床治疗的个例。

本发明的GF可以是下列蛋白质类别中的任何一员，包括但不局限于，表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、神经细胞生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、胰岛素样细胞生长因子(IGF)、干细胞生长因子(SGF)、角质细胞生长因子(KGF)、血小板衍生细胞生长因子(PDGF)、促生长释放因子(GHRF-6)等。

GF可以直接以N末端与HSA的C-末端相连以构成融合蛋白，或可在HSA和GF之问增加一个连接肽(Linker)，以构成融合蛋白：HSA/L/GF或GF/L/HSA(L＝连接肽)。连接肽长度可为2-100，常用的是10-50个氨基酸，优选的是14-30个氨基酸。连接短肽可以使HSA和GF之间有更大的变化空间并有更好的柔韧性或刚性，或因更大的变化空间使GF与受体的结合更容易些。连接肽的结构可为(G₄S)3-4。连接肽的加入可能使融合蛋白在作为药物的使用时产生额外的免疫原性，最优选的是没有连接肽。

融合蛋白可以是分泌型的，其可与特异识别的抗人血清白蛋白抗体相结合。融合蛋白也可与特异识别的GF的抗体相结合。融合蛋白的分泌肽可使用人血清白蛋白的分泌肽或其自然界中存在的多肽或是如果合成的具有将融合蛋白分泌到宿主细胞外功能的多肽。

具体地，本发明利用遗传工程方法构建了一条核苷酸链，该核苷酸链编码一种HSA与人KGF-2所形成的融合蛋白(HSA/hKGF-2)，编码该融合蛋白的核苷酸链与SeqIDNo.1有至少90％的序列同源性，优选的该核苷酸链与SeqID No.1有95％的序列同源性。由该核苷酸链编码的蛋白质多肽的氨基酸序列为SeqID No.2。

具体地，本发明利用遗传工程方法构建了一条核苷酸链，该核苷酸链可编码一种HSA与人EGF形成的融合蛋白(HSA/hEGF)，编码该融合蛋白的核苷酸链与SeqID No.3有至少90％的序列同源性，优选的该核苷酸链与SeqID No.3有至少95％的序列同源性。优选的，该核苷酸序列编码的蛋白质多肽的氨基酸序列为SeqID No.4。

具体地，本发明利用遗传工程方法构建了一条核苷酸链，该核苷酸链可编码一种HSA与人IGF1形成的融合蛋白(HSA/hIGF1)，编码该融合蛋白的核苷酸链与SeqID No.5有至少90％的序列同源性。优选的该核苷酸链与Seq ID No.5有至少95％的序列同源性。优选地，该核苷酸编码的蛋白质氨基酸序列为Seq ID No.6。

具体地，本发明利用遗传工程方法构建了一条核苷酸链，该核苷酸链可编码一种HSA与人bFGF形成的融合蛋白(HSA/hbFGF)。编码该融合蛋白的核苷酸链与SeqID No.7有至少90％的序列同源性，优选地，该核苷酸序列与SeqID No.7有至少95％的序列同源性。优选地，该核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列为SeqID No.8。

具体地，本发明利用遗传工程方法构建了一条核苷酸链，该核苷酸链可编码一种HSA与人aFGF所形成的融合蛋白(HSA/haFGF)。编码该融合蛋白的核苷酸链与Seq IDNo.9有至少90％的序列同源性，优选地，该核苷酸序列与Seq ID9有至少95％的序列同源性。优选地，该核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列为SeqID No.10。

再具体地，本发明利用遗传工程方法构建了一条核苷酸链，该核苷酸链可编码一种HSA与PDGF-B所形成的融合蛋白(HSA/hPDGFB)。编码该融合蛋白的核苷酸链与Seq IDNo.11有至少90％的序列同源性，优选地，该核苷酸序列与Seq ID11有至少95％的序列同源性。优选地，该核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列为SeqID No.12。

与上述的核苷酸有一定程度的序列相似性的核苷酸是指：例如，能编码一种HSA/GF融合蛋白，并在相似的核苷酸序列之间具有至少95％的序列同源性的核苷酸。其包括核苷酸链上每百个核苷酸有5个点突变，并也是编码HSA/GF融合蛋白的核苷酸序列。换句话讲，任何核苷酸链与上述编码HSA/GF融合蛋白的核苷酸链具有95％的序列同源性，即，即便有多达5％的核苷酸个体可以被替换、删减或插入等，均与本发明所指的核苷酸序列相同。无论是在5’或3’端，或在两端之间的任何位点发生的突变，还是以单体或多体发生的突变均在本发明的范围内。

实践上，任何特指的核酸分子，只要具有90％、95％、96％、97％、98％或99％的相似性，就在本发明的保护范围内。而且由核苷酸序列编码的HSA/GF融合蛋白也可由常规已知的计算机软件，如Bestfit软件(Wisconsin)序列分析软件包来获得。Bestfit应用区域同源性比较方法(文献：Smith和Waterman，应用数学进展，2：482-489(1981)来寻找两个序列之间最佳的同源序列。当应用该软件或其它任何具有类似的DNA序列对比分析时，某一特定的序列如与本发明所提出的序列有95％以上的序列同源性，均视为与本发明所述的序列相同源。

GF基因序列可以从不同组织来源的总RNA中用PCR扩增的方法获得，也可以用如果合成全DNA序列的方法来获得。人工合成的基因在其核苷酸编码同一氨基酸是可采用表达系统喜好的核苷酸，HSA/hEGF融合蛋白表达重组酵母菌，已保藏在中国科学院微生物所中国微生物菌种保藏管理委员会获得保藏号：2072，作为本发明中的HSA/GF融合蛋白的代表作。

在室温或更高的温度下，HSA和GF形成的融合蛋白与GF单体相比，在同样条件下，具有2倍以上，优选达5倍或10倍或更优选达20倍以上的贮存期和半衰期。

本发明还涉及用白蛋白作为载体，携带治疗性的蛋白质药物，如GF来美容和治疗各种创伤、疾病或异常，或那些以加强细胞增生、修复为目的的人，如创伤、溃疡患者。在本发明中，HSA/GF融合蛋白可以用于脊椎动物，优选地是人类，并通过不同途径，包括但不局限于涂抹、喷涂、口服、非经肠胃、腹腔膜内、静脉内、动脉内、皮下、舌下、肌内、肠内、唾液腺、鼻内、PEG化、脂质法，通过吸入、注射、阴道、眼内方法给药。HSA/GF也可通过局部性释放(如导管或Stent)，包括皮下、脂肪下、关节下及膜内，并可以做成缓释剂。具体地，融合蛋白可通过涂抹、喷涂给药。

本发明涉及将一个白蛋白分子或其变种或片段与一个GF分子或其变种或片段通过基因工程融合在一起，所形成的融合蛋白较未经融合的GF延长了半衰期。为方便起见，本发明只提及人血清白蛋白(HSA)和细胞生长因子(GF)，即人KGF、人EGF、人IGF、人PDGF、人VEGF和人SGF等形成的融合蛋白。当然其它脊椎动物的白蛋白与GF形成的融合蛋白均可包括在内。优选地，在GF或其变种或片段的N-末端部分，与HSA或其变种、或片段的C-末端部分形成融合蛋白后，在融合蛋白与受体结合时所有负效应达最小化。同样具有信号传导、受体结合作用的由GF形成的融合蛋白，或者含有GF或其一个变体或片段的融合蛋白均包括在本发明中。

本发明中的HSA/GF融合蛋白或其配方均可通过传统方法，包括非经胃肠道(如皮下或肌肉)注射或静脉输注的方式给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。本发明中的融合蛋白HSA/GF可单独使用，而优选地，可与一种或多种可接受的载体或另一种HSA/GF或HSA或多种HSA/GF一起成药物制剂的形式使用。所述载体特别是另一种HSA/GF或多种HSA/GF必需是相互兼容的且对受体自身不产生有害影响的载体。“可接受的”典型的载体为水和盐水，其应是无菌、无热原也无额外免疫原性的。不同HSA/GF之间，当具有相容性、协同增效性或仅起协助制剂作用时，也可考虑共同使用。

HSA/GF融合蛋白可以制剂形式或单元剂量的便捷方式给药，也可经由任何药学领域已知和认可的方法制备，该方法包括将HSA/GF与具有一种或多种辅助成份的载体结合到一起的步骤。概括地讲，将活性成分和液相载体或组合固相载体、助剂或其它试剂均匀地结合而制备制剂，然后根据需要，将产品成型。

适合于非经胃肠道途径使用的HSA/GF制剂包含水相或不含水相的无菌注射液，可含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和助溶剂、或增加药物渗透性与平衡剂。含水或不含水的无菌悬浮液包括悬浮剂和增稠剂。该制剂可贮存于单元剂量或多元剂量的容器中，如密封的安瓿瓶中和小管中，在冰干(冻干法)条件下贮存。使用前加入无菌液态载体，如注射用水，制成临时性注射液和悬浮液。

将HSA/GF融合蛋白送入动物体内后，与GF单体相比，HSA/GF在血液中的半衰期具有长约2倍，优选地是长约4倍，更优选地为长约6倍，再更优选为长约10倍的半衰期。本发明的HSA/GF融合蛋白可以与由自然界分离的或重组型的人血清白蛋白共同使用。优选与重组的人血清白蛋白组成具有疗效的剂量和比率。

可以相信融合后，治疗性蛋白质有较高的半衰期并在使用中在作用部位停留较长的时间，在制成产品时贮存条件和运输的要求降低，可以降低成本，同时较长半衰期也可减少GF的使用剂量和使用次数。

相同的策略也可用于研发具有美容作用功效的稳定的含有融合蛋白的产品。例如皮肤的美容、保湿、除皱、防皱、美白。产品的组合中可含有一种融合蛋白或两种以上融合蛋白，或其它组分(如HSA)作为主剂，还可有增绸剂、保湿剂、乳化剂、防腐剂等。

2)用于HSA/GF融合蛋白表达的宿主系统

本发明中的HSA/GF核苷酸可利用重组克隆技术引入宿主细胞，以使融合蛋白得以表达。一般来说，宿主细胞经遗传工程(转导或转化或转染)方法将携带有本发明中所提到的各种可能组合的HSA/GF载体质粒以侵入方式、病毒感染“噬菌体”等形式转入宿主系统中。工程宿主细胞可以在含常规营养物的培养基中培养，并经过适当修改以利于启动子。以适当的操作方式控制选择转化子或扩增编码HSA/GF的核苷酸链的培养条件，如温度，pH和选择表达细胞。

按本发明所述，重组载体携带有包含编码HSA/GF融合蛋白的核苷酸。重组载体可以是一个表达载体，可在宿主细胞内由携带的核苷酸编码来表达融合蛋白。形式可为，但不局限于，HSA/CPSA、GF/HSA、HSA/L/GF或GF/L/HSA(L＝连接肽)。宿主生物体及体细胞包括，但不局限于，脊椎动物(如人、猴、鼠、兔等)鱼、鸡、昆虫、植物、酵母、真菌和细菌等。

编码HSA/GF的核苷酸是在适当的启动子作用下表达HSA/GF融合蛋白。可利用的适合启动子包括，但不局限于，腺病毒启动子，如腺病毒主要的后期启动子；或异源启动子，如CMV启动子和RSV启动子；诱导型启动子可有MMT启动子、热刺激启动子、白蛋白启动子、ApoAI启动子和人球蛋白启动子；病毒胸腺嘧啶脱氧核苷酶启动子则有疱疹病毒胸腺激酶启动子；反转录病毒LTR启动子包括经修饰后的LTR启动子；β-肌动蛋白启动子；人生长激素启动子。也可用天然启动子来控制核苷酸编码表达HSA/GF融合蛋白。

根据本发明，重组细胞具有表达编码HSA/GF融合蛋白核酸序列的能力。重组工程细胞可以持续地或在有或无诱导剂的存在状态下表达HSA/GF、HSA/L/GF或GF/L/HSA。重组工程细胞形式包括，但不局限于脊椎动物(即人、牛、猪、猴、鼠、兔、鱼、鸡等)昆虫、植物、酵母、真菌和细菌等细胞。

优选的用于表达HSA/GF的酵母属宿主包括，但不局限于，酿酒酵母属(Saccharomyces)、毕氏酵母属(Phichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)、汉森酵母(Hancenula)、孢园酵母属(Tarulaspora)和裂殖酵母属(Schizosaromyces)等。更优选地，宿主系统可为毕氏酵母属巴斯德菌种。具体地讲重组载体质粒可为pPICZ-A、B或C。

根据选用不同的宿主来表达HSA/GF融合蛋白。本发明中表达的蛋白多肽可以是糖基化或非糖基化的。优选地，当在宿主系统中得到表达时，HSA/GF在脊椎动物细胞如中国仓鼠(CHO)中得到表达的蛋白为糖基化蛋白。当表达在毕氏酵母菌中则为非糖基化或部分糖基化的蛋白。

如上所述，在本发明中提到的白蛋白融合蛋白，优选使用基因工程技术构建来表达。获得融合蛋白的优选方法是利用载体质粒，通过转化和转染或感染的方式来表达融合蛋白。特别是利用可转化酵母的表达载体，来转化毕氏酵母，并使融合蛋白分泌到培养液中。

利用酵母菌表达HSA/GF的优势在于，酵母菌体系可以产生高质量成熟的融合蛋白，并可以分泌到培养液中而便于纯化。

酵母菌遗传工程的进展使外源基因可以在酵母菌中得到表达并分泌蛋白产品到细胞外。利用酵母菌表达分泌型蛋白的优点为，但不局限于，高表达产量、蛋白质为可溶性的、正确的折迭和易于大规模生产和纯化。

经由白蛋白天然信号肽，HSA/GF融合蛋白可分泌到酵母菌培养液中。HSA/GF融合蛋白的多肽可由信号肽主导并通过分泌途径而得到加工。白蛋白的前导肽序列可用在酵母菌中，使融合蛋白分泌到酵母菌外。其它分泌肽，如天然的酿酒酵母的α-因子分泌信号肽，也可用于分泌本发明中的融合蛋白。

优选实例为应用巴斯德酵母菌系统来表达本发明中提及的HSA/GF融合蛋白。其优于利用其它表达系统。毕氏酵母菌具有许多高等真核细胞表达系统所具有的优点，例如蛋白质的加工、折迭、转录后的修饰以及如同培养细菌或酿酒酵母一样的易于大规模培养，与其它系统如杆状病毒、脊椎动物细胞培养相比更具有简捷、快速的表达，产量更高。毕氏酵母还有另外一个优势是具有10-100倍高的表达水平。这些特性使得毕氏酵母变成十分有力的蛋白表达系统。

与酿酒酵母菌相比，毕氏酵母菌在对分泌的蛋白质进行糖基化的程度上有着更大的优点。即：毕氏酵母不会有过度糖基化的现象。酿酒酵母和毕氏酵母均有N-连接糖基甘露糖的修饰。然而寡糖化物链加在表达的蛋白上，在毕氏酵母菌中只有8-14个糖基，远短于在酿酒酵母中的50-150甘露糖链。在毕氏酵母菌中连接的糖基化较少发生。酿酒酵母的核心糖基化带有α-1，3连接的末端物，而在毕氏酵母菌中则没有。研究表明由酿酒酵母产生的糖基化蛋白具有较强的抗原反应，而使得这些蛋白不适于用在特别是治疗目的上的使用。当然这也表明减少了用毕氏酵母菌来表达蛋白在糖基化上的担忧。

利用毕氏酵母做为表达系统有许多试剂盒可以使用。如Invitrogen的易选EasySelect^TM毕氏酵母表达试盒。表达载体上有一个AOX1启动子可以使外源基因在毕氏酵母中利用甲醇来诱导表达。同时还有一个抗生素Zeocin抗性基因，可做为选择重组子的标记。在本发明中，表达融合蛋白启动子是非常重要的因素。

在毕氏酵母系统中，AOX1基因启动子是十分强劲的启动子。特别是在毕氏酵母菌中，在毕氏酵母里共编码两种乙醇氧化酶，AOX1和AOX2。AOX1具有在细胞中产生合成大量的乙醇氧化酶(AOX1)的活性。AOX1基因的表达受到紧密控制并由甲醇诱导而达到极高的水平。典型地当用甲醇做为唯一碳源时，在所有的可溶性蛋白中AOX1基因的产物就达30％。AOX1基因已分离得到。AOX1基因启动子也用于本发明的载体质粒中用以驱动编码目的基因的外源蛋白的表达(Ellis等，1985；Koutz等，1989，Tschopp等，1987a)。而AOX2和AOX1基因有97％的同源性，其在甲醇中的生长速度比AOX1基因慢。这种缓慢的生长状态，可以分离到Mut⁺(AOX1)株。除了AOX1基因启动子外，酵母菌中的其它启动子也可用于驱动HSA/GF融合蛋白。这些启动子包括，但不局限于PGK1、GAPDH、Gal1、Cal10、Cyc1、PH05、TRP1、ADH1或ADH2基因启动子。

表达质粒也可同时用于细菌宿主，如大肠肝菌DH5α(Gibcol/BRL)和酵母宿主中。抗生素Zeocin、组氨酸缺陷型培养基作为选择标记已应用在本发明的各实施例中。

表达载体含有编码HSA或HSA/GF融合蛋白的核苷酸，按Invitrogen试剂盒所描述的方法转化酵母菌。经过抗性选择出转化的酵母菌菌落。这些细胞可表达HSA/GF融合蛋白，当接种于适当的培养液中时，分析这些酵母菌表达分泌融合蛋白于培养基中的能力。蛋白质的收获可在细胞连续培养中进行。或在批量培养结束后一并收获，本发明所述的融合蛋白经培养的酵母菌表达后，以能维持蛋白活性和药效活性的蛋白提纯方法来加以分离纯化。

在此还需提及的是，其它表达系统也可用于本发明的HSA/GF融合蛋白的表达，包括，但不局限于，细菌、枯草杆菌(B.Subtitis)、酿酒酵母、克鲁维酵母菌属、汉森酵母、念珠菌属、孢圆酵母属、裂殖酵母属、固囊酵母属(Citeromyces)、Pachysoler，德巴利酵母属(Debaromyces)、梅奇酵母属(Metschumikowia)、红冬孢属(Rhodosporidium)、无色担子孢子属(Leucosporiduum)、葡状子囊菌属(Botryoascus)、锁掷酵母属(Sporidiobolcus)、拟内孢霉属(Endomyucopsis)、动物、植物和昆虫细胞等。

3)HSA/GF融合蛋白单独应用和组合应用

本发明中的任何蛋白可以单独应用外，还提供了一种不同HSA/GF融合蛋白的组合应用。

这种独特的融合蛋白的组合可以提供使用者身体细胞的多种细胞的同时增生、分化成熟、或具有对某一特定类细胞具有协同增效作用。特别地，本发明中的HSA和不同细胞生长因子形成的不同融合蛋白，共同组合使用的结果是同时刺激多种细胞的增生和成熟。应用HSA/GF的定向作用于不同类型的细胞的信号转导途径或多种细胞的产生途径，可以在只需一次使用于使用者身上后，使诸如表皮细胞、角质细胞和肌细胞、纤维细胞等都得到明显的修复和增生。

在本发明中，白蛋白的血浆传递功能和GF的治疗功能因蛋白发生融合而得到整合。当在血液中循环时，由于与白蛋白融合而赋予GF抵抗蛋白酶降解的超级稳定性，结果大大延长了GF在血液中的半衰期。由于大量白蛋白的存在，不同的GF与白蛋白形成融合蛋白，经组合可以减少并形成较小的生物学功能上的相互干扰现象。这种干扰现象常出现在“GF单体”之间的组合。进一步来说，一个与白蛋白融合的GF，可以在血液系统中停留相当长的一段时间而得到缓慢释放，因而减低了在常规方法下，单独使用大剂量单一GF时，带来的急性反应，毒性及副作用。这种融合蛋白缓慢释放作用形式，以本发明中的使用剂量，注射次数减少，而更进一步降低GF注射的副作用。

根据本发明，血清白蛋白与此类GF形成融合蛋白后，可在进入体内后因缓慢释放而减少上述局限性。另外，这样的融合蛋白可以与相对大量的白蛋白组合，可进一步减轻中枢神经系统对直接注射GF进入体内，所引起的强烈可预见的反应。

已知，贮存“裸露”的细胞因子是相当不稳定的，并且在储存中寿命极短。十分清楚地是，细胞因子具有的如此脆弱的稳定性在体外是相当不便的，对使用者来讲是十分昂贵和不便的。事实上白蛋白也常作为添加剂与细胞因子在一起，来保证含有细胞因子的产品具有较长的货架储存寿命、和运输保藏中的产品稳定，以此达到细胞因子的有效作用强度。

本发明使得HSA/GF融合蛋白在血液中半衰期延长，稳定性增加。复合型的HSA/GFs即HSA与hEGF、hKGF、hIGF和hPDGF可共同刺激皮肤中多种细胞的修复和分化。

具体地，HSA/hEGF融合蛋白可以和HSA/hKGF融合蛋白形成复合药剂以作用于创伤患者，其结果患者的表皮细胞和角质细胞等分化增生，结果使创伤快速修复。

可替代的，根据使用者的需要，一种HSA/GF可以与另一种或多种HSA/GF以同时或先后的方式给药。这种组合使用的剂量是达到治疗或明显具有美容目的剂量，并且效果是具有协同增效作用的有效剂量。

本发明提供了成套的使用HSA/GF组合治疗的描述与实践，成套组合包括第一个HSA/GF和与第一个GF相同或不同的第二个HSA/GF。例如，第一个HSA/GF中GF可以是KGF，第二个GF是EGF；或第一个GF是KGF-2，第二个GF是PDGF；或第一个GF是IGF-1，第二个GF可以是FGF等。HSA单体也可以作为第一个或第二个蛋白组分构成制剂，用于组合制剂。

本发明中的HSF/GF融合蛋白单独或它们的组合可用于治疗各种疾病，包括但不局限于，烧伤、烫伤、灼伤(浅II度、深II度、肉芽创面)、新鲜创面(包括各种刀伤、外伤、手术伤口、美容整形创面)、糖尿病或静脉曲张等所致的顽固性溃疡和坏疽、溃疡创面(包括口腔及各种皮肤溃疡等)、疮痈类疾病(如褥疮、痤疮、疖肿等)、角膜外伤、溃疡、电光性眼炎、供皮区创面、放射性损伤创面以及组织器官移植等。优选地，融合蛋白应不含有能引起人类免疫反应的蛋白质序列。

本发明还提供了对需要GF患者的一种使用方法，这种方法是将HSA与GF基因融合而形成融合蛋白并按一定的配比组合而成有效的复合制剂。这种药学制剂可使用药剂学上接受的赋形剂和剂型以达到增加HSA/GF的稳定性。当然医学上能接受的剂型，也包括天然和重组的HSA以及或另外一种或多种HSA/GF融合蛋白。

4)除此之外，本发明也提供了利用酵母菌来更有效地及节省费用地生产制造重组融合的HSA/GF蛋白。本发明也提供了发酵液处理的方法，可用于融合蛋白的分离、纯化或将简单程序处理的发酵液直接用于美容护肤、化妆品的制作和应用。

附图说明

附图1.人工合成hEGF和hIGF-1基因的示意图。

附图2.含有HSA基因的酵母菌表达质粒DNA，并以此质粒(pZYHSA-L)构建HSA与细胞生长因子之间形成带有连接肽(Linker)的融合蛋白基因表达载体质粒。

附图3.A)蛋白质标准分子量(a)、无质粒插入的毕氏酵母菌(b)、酵母菌表达的HSA/hEGF融合蛋白(c)、和大肠杆菌表达的hEGF蛋白(d)；B)酵母菌表达的HSA/hKGF-2融合蛋白(e)、HSA/haFGF融合蛋白(f)和HSA(g)；C)以鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体(Sigma公司)所做的蛋白质免疫印迹实验。酵母菌表达的HSA/hEGF(73kd)(h)融合蛋白；酵母菌表达的人血清白蛋白(65kd)(i)。

附图4.含有不同量的HSA/PDGF-B的发酵液对BalBC3T3细胞的生物活性测定的3次结果的平均值，表明HSA/PDGF-B具有刺激细胞生长的功能。

附图5.生物活性测定结果显示在37℃(A)或50℃(B)下这些融合蛋白在不同温度下的存活期。系列1为hEGF单体；系列2为HSA/hEGF融合蛋白；系列3为HSA/hKGF-2融合蛋白；系列4为HSA/hIGF和HSA/hEGF的组合(各5000IU)。所有的样品均是10000IU。HSA/hEGF、HSA/hIGF-1融合蛋白刺激BalB/C3T3细胞增生的生物活性测定。测定培养液中含有GF单体或融合蛋白或组合应用时的细胞增生数量和协同增效作用。

附图6.动物体内体内注射实验观察HSA/GF融合蛋白在血液中半衰期。

具体实施方式

实施例1：分子克隆技术简述

常规分子克隆技术包括DNA、RNA的提取，琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，DNA片段的连接，限制性内切酶酶切反应均参照文献(Maniatis，et al.，“分子克隆实验手册”冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，1982)。质粒DNA的纯化，DNA片段的回收等均采用商品纯化柱制备。DNA聚合酶链反应(PCR)(参照文献Saikiet al.，科学，230：1350，1985)所用的酶及反应所需的PCR仪均为Perkin Elmer产品。并参照厂家操作程序。DNA测序和DNA扩增所需用的寡聚核苷酸引物由专门机构完成。转受态大肠杆菌由GIBCO/BRL公司购得。本发明所使用的酵母菌菌种均购自Invitrogen公司。转化酵母菌是由电脉冲方式进行，并参照厂家(Bio-Rad)的操作程序。

实施例2：人血清白蛋白(HSA)基因表达及载体质粒的构建

使用发明人在其发明专利ZL02142881.6、ZL200410042814.8和CN200410057313.7中所描述的HSA克隆方法和试验结果。GenBank检索编号AY728024的HSA序列，用于本发明中的HSA基因序列与细胞生长因子基因序列发生基因重组融合蛋白的。使用AY728024序列编码HSA，可使得融合蛋白获得在酵母菌中的意想不到的高效表达。表达质粒(见中国专利ZL021428816附图2)也用于本发明的实施例中。

实施例3：人KGF-2、EGF、IGF1、PDGF-B和bFGF的基因的融合及表达质粒的构建

人角质细胞生长因子(hKGF2)、血小板衍生细胞生长因子-B(hPDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)应用相似于实施例1中所表述的RT-PCR方法，从不同来源的总RNA制备物中扩增。表皮细胞生长因子(hEGF)和胰岛素样细胞生长因子-1(hIGF-1)的分子克隆采用DNA序列(PCR法)全合成法。PCR产物均克隆于pCRII载体质粒中，并经DNA测序分析。

利用RT-PCR技术，从体外培养的人胚胎成纤维细胞总RNA中扩增出人角质细胞生长因子(hKGF-2)的基因序列，并将其克隆入PCR产物载体质粒中。PCR合成寡聚核苷酸引物分别为：

Seq.ID NO.13：5’-GCCTTAGGCTTAGCCCTTGGTCAGGACATGG-3’，和

Seq.ID NO.14：5’-CTCGAGTCATGAGTGGACCACCATTGG-3’

引物的设计是根据BenBank检索编号NM_004465而设计。PCR产物只包括hKGF-2的成熟蛋白多肽编码区域。并在5’端引入HSA的3‘末端序列，包括Bsu36I限制性内切酶位点。在融合蛋白的3’端引入XhoI位点。便于将hKGF-2基因插入pZY-HSA载体，形成HSA/hKGF-2融合基因在酵母表达载体的构建。HSA与hKGF-2基因融合的DNA序列(SeqID NO.1)列于序列表A，融合蛋白氨基酸序列(SeqID NO.2)列于序列表B。

hEGF全长序列是根据GenBank检索编号X04571来设计，并采用酵母菌喜好氨基酸编码碱基，由人工合成PCR扩增而来。hEGF寡聚核苷酸引物的DNA序列分别为：

Seq.ID NO.15：5’-GCCTTAGGCTTAaacagcgactctgaatgtcc-3’.

Seq.ID NO.16：

5’-GGCAGTAACCGTCGTGGGACAGCGGACATTCAGAGTCGCTGTT-3’

Seq.ID NO.17：

5’-CCCACGACGGTTACTGCCTGCACGACGGTGTTTGCATGTACATCGAAGCTC-3’

Seq.ID NO.18：

5’-GCCAACAACACAGTTGCATGCATACTTGTCCAGAGCTTCGATGTACATGC-3’

Seq.ID NO.19：

5’-GCATGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGTGAACGTTGTCAGTACCGTGACC-3’和

Seq.ID NO.20：

5’-AGCGGCCGCTCAACGCAGTTCCCACCATTTCAGGTCACGGTACTGACAACG-3’

DNA人工合成路线和方法见图2所示。PCR的产物经扩增后克隆入pCRII载体质粒中，经DNA序列分析，证明其与文献报道相同。内切酶Bsu36I和NotI识别位点已分别加在hEGF基因的两端(下划线)。将合成的基因序列插入pZY-HSA载体中。HSA/hEGF融合基因的DNA序列(SeqIDNO.3)列于序列表C，融合蛋白氨基酸序列(Seq ID NO.4)列于序列表D。这-DNA核苷酸序列和能表达这一融合蛋白的重组毕氏酵母菌特意保藏在中国微生物所菌种保藏委员会，获得保藏号：2072，作为本发明中的HSA/GF融合蛋白的一个代表。

hbFGF基因全长序列是从人成纤维细胞总RNA中，用RT-PCR的方法扩增、克隆扩增而得。PCR所需的引物DNA序列是根据GenBank检索编码：S81809)来设计的。寡聚核苷酸引物序列为：

Seq.ID NO.21：5’-GCCTTAGGCTTActgggggacc gcgggcgcgg-3’，和

Seq.ID NO.22：5’-AGCGGCCGCTCAGTGAGGGTCGCTCTTCTCCC-3’

Bsu36I和NotI识别位点人为加在克隆的hbFGF基因的两端，经扩增的hbFGF基因DNA序列插入在pZY-HSA表达载体中。融合蛋白/hbFGF核苷酸序列(SeqID NO.5)列于序列表E，融合蛋白氨基酸序列(Seq ID NO.6)列于序列表F。

hIGF-1基因全长以图1方式，人工全合成。设计的PCR寡聚核苷酸引物序列是基于GenBank检索编码：NM000618来设计的：

Seq.ID NO.23：

5’-ACCTTAGGCTTAggaccggagacgctctgcggggctgagctggtggatgctcttc-3’；

Seq.ID NO.24：

5’-cttgttgaaataaaagcccctgtctccacacacgaactgaagagcatccaccagc-3’；

Seq.ID NO.25：

5’-ggcttttatttcaacaagcccacagggtatggctccagcagtcggagggcgcctcag-3’；

Seq.ID NO.26：

5’-acagctccggaagcagcactcatccacgatgcctgtctgaggcgccctccgactgc-3’；

Seq.ID NO.27：

5’-gctgcttccggagctgtgatctaaggaggctggagatgtattgcgcacccctca-3’；

Seq.ID NO.28：5’-AGCGGCCGCtcaagctgacttggcaggcttgaggggtgcgcaataca-3’

RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，克隆于pCRII载体，并经DNA序列分析鉴定后插入pZY-HSA酵母菌表达载体的Bsu36I和NotI位点。获得pZY-HSA/hIGF-1质粒。融合基因的DNA核苷酸序列(Seq ID NO.7)列于序列表G，融合蛋白氨基酸序列(Seq ID NO.8)列于序列表H。

haFGF基因全长序列是从人脑总RNA中，用RT-PCR的方法扩增、克隆扩增而得。PCR所需的引物DNA序列是根据GenBank检索编码：S67291来设计的。寡聚核苷酸引物序列为：

SeqID No.29：5’-GCCTTAGGCTTAgctgaaggggaaatcacc-3’和

SeqID No.30：5’-AGCGGCCGCTCAGAAGAGACTGGCAGG-3’

RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，克隆于pCRII载体，并经DNA序列分析鉴定后插入pZY-HSA酵母菌表达载体的Bsu36I和NotI位点。获得pZY-HSA/haFGF质粒。融合基因的DNA核苷酸序列(Seq ID NO.9)列于序列表I，融合蛋白氨基酸序列(Seq ID NO.10)列于序列表J。

hPDGF-B基因全长序列是从发明人拥有的含该基因全长的DNA质粒中，用PCR的方法扩增、克隆扩增而得。PCR所需的引物DNA序列是根据GenBank检索编码：AH002986来设计的。寡聚核苷酸引物序列为：

SeqID No.31：5’-GCCTTAGGCTTAaatcgctgctgggcgctc-3’和

SeqID No.32：5’-AGCGGCCGCTAGGCTCCAAGGGTCTCC-3’

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，克隆于pCRII载体，并经DNA序列分析鉴定后插入pZY-HSA酵母菌表达载体的Bsu36I和NotI位点。获得pZY-HSA/hPDGF-B质粒。融合基因的DNA核苷酸序列(Seq ID NO.11)列于序列表K，融合蛋白氨基酸序列(Seq ID NO.12)列于序列表L。

实施例4.带有连接肽的HSA/GF融合蛋白表达质粒的构建

在HSA的C-末端含有一个限制性内切酶Bsu36I识别位点，细胞生长因子：hKGF-2，hEGF，hbFGF、hIGF-1、aFGF和hPDGF-B等均可通过基因工程方式将连接肽序列：3(GGGGS)与HSA C-末端蛋白质序列相连，而形成pZYHSA-L表达载体质粒。做法是首先将在pZY-HSA载体质粒上存在的BamHI位点利用BamHI酶切，然后酶处理为平头末端，再连接后转导细菌，达到BamHI位点的消失。将人工合成的特异寡聚核苷酸序列：

Seq ID No.33：5’-

ttaggcttaggaggaggaggatcaggaggaggaggatcaggaggaggaggatccgc-3’和

Seq ID No.34：5’-

ggccgcggatcctcctcctcctgatcctcctcctcctcctgatcctcctcctcctcctaagcc-3’。

将Seq ID No.33和34两个寡聚核苷酸链等摩尔混和，加热，然后缓慢冷却至室温。含连接肽的寡聚核苷酸与经Bsu36I和NotI酶切的pZYHSA载体线性质粒在连接酶的作用下重组。这样就构建了pZYHSA-L表达载体质粒(附图1)。在对各种细胞增生刺激因子基因，用PCR方法分别修饰各种细胞生长因子基因的5’末端为BamHI酶切位点。再直接克隆到经Bsu36I/BamHI双酶切取pYZ-HSA载体质粒中。新插入的各蛋白质因子的序列与编码HSA C-末端蛋白质的序列顺序相连接，这样所有基因均可进入同一阅读框形成基因间的融合而形成新HSA/L/GF DNA分子序列。其可表达带连接肽的HSA融合蛋白，并具有细胞生长因子的生物功能。

实施例5酵母菌的转化

将毕氏酵母菌菌株GS115或X33菌落接种于含5ml YPD培养液的50ml培养基中，以250转/分的速度于30℃下培养过夜。次日取0.2ml过夜培养物再转接入500ml YPD的培养液中，置于2升的三角培养瓶中。在30℃下旋转培养2-3小时，使细胞密度达到OD600＝1.3-1.5。酵母菌经离心方法收集，再重悬于500ml冰预冷的无菌水中洗涤两次。然后酵母菌悬于20ml冰预冷的1M Sortbitol溶液洗涤一次。

在实例3和实施例4中构建的质粒pZY-HSA/hKGF-2、pZY-HSA/hEGF、pZY-HSA/hIGF、pZY-HSA/hbGF、pZY-HSA/aFGF或pZY-HSA/PDGF-B均经Pme I限制性内切酶处理后，形成线性质粒分子。取5ug线性质粒DNA与80ul处理后的酵母菌相混合并置于0.2厘米厚的电极杯内，置于点脉冲仪上。电脉冲条件为电压7500V/CM，电极间隔时间为5-10(ms)。电击处理后，立即加入1ml冰预冷的1M Sorbitol溶液于酵母菌中，然后转入15ml试管中。转化的酵母菌置于30℃培养箱中放置2小时，然后接种涂布在含Zeocin抗生素的YPD平板培养基上。经抗性选择而生长出的克隆，再用分子生物学方法鉴定其基因的插入。蛋白质的表达与分泌则以SDS-PAGE或用特异抗体做蛋白质免疫印迹检测。不同的毕氏酵母菌菌株，如X-33，KM71以及蛋白酶缺陷型酵母菌株，如SMD1168均可用来表达和分泌重组的HSA/GF融合蛋白。

实施例6酵母菌表达及分泌的HSA和HSA/GF融合蛋白的特性

将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养。以300转/分的速度培养至菌体密度达到OD₆₀₀＝2-6。培养物经1500转/分，15分钟条件下离心收集菌体，菌体再重悬于同种基本培养液但不含甘油，改含0.5％甲醇，继续培养，细胞密度达到OD₆₀₀＝1.0。酵母菌在甲醇的诱导下，外源蛋白在启动子的作用下开始表达。其后，每24小时加入100％甲醇至最终浓度为0.5％。在不同的时间点分别收集培养上清液。使用SDS-PAGE变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或蛋白质免疫印迹法测定HSA/GF融合蛋白的表达。

结果表明，HSA/GF融合蛋白均由酵母菌表达，并被分泌到培养液中。鼠抗人血清白蛋白的单克隆抗体(Sigma公司)，用蛋白质免疫印迹实验确定被表达的蛋白质为HSA或HSA/GF融合蛋白。

典型的蛋白质免疫印迹实验是将变性(SDS)凝胶电泳分离的蛋白质，经电泳仪将蛋白质转移到尼龙或醋酸纤维膜上，再以特异抗体(第一抗体)识别相对应的蛋白质。然后带有荧光功能基因的第二抗体，识别并结合于第一抗体，经荧光显色整个特异性结合的复合物，即特异蛋白质在X光片上留下印记。标准蛋白分子量用于决定未知蛋白的分子量。对经酵母菌表达分泌的HSA及HSA/hKGF-1、HSA/hEGF、HSA/hIGF-1、HSA/bFGF和HSA/hPDGF-B，可分别与市售重组蛋白标准品(中检所)的抗原性比较。以抗人EGF的单克隆抗体所做的蛋白质免疫印迹实验表明，融合蛋白HSA/EGF与纯品hEGF(R＆D System公司)具有相同的抗原性，并显示二者之间在免疫反应强度与分子大小上具有相同的比率。同理，以抗人GF抗体进行检测，相同结果也得到证实。附图3为所表达的融合蛋白发酵液电泳结果和使用人血清白蛋白特异抗体(Sigma)与人血清白蛋白/人表皮生长因子(HSA/hEGF)和人血清白蛋白(HSA)单体，所作的Western blot结果。在二者的分子量上，十分明显地表现出HSA的65Kd和HSA/hEGF的73Kd两个分子的迁移率。

实施例7分泌型HSA/GF的纯化与特性

重组的酵母菌细胞(ZY-HSA/GF)或CHO哺乳动物细胞表达的培养上清液中含有分泌出的血清白蛋白的融合蛋白HSA/GF。离心分离菌体后，上清液经2-10％活性炭处理，收集、浓缩并降低盐浓度后，调整PH至7.5左右，浓缩液通过Bio-Rad公司制造的Affi-GelBIue-Gel层析柱。HSA或HSA/GF则与层析柱上的功能集团结合而挂在柱体上。经过洗涤，HSA或HSA/GF则可经由1-5M NaCl梯度洗脱，得到具有75-85％纯的蛋白制剂。如有需要则进一步通过分子筛层析柱，可得纯度提高至95-99％或更纯的蛋白制剂。用于动物试验的样品则将可能的热源如内毒素，借助Affi-Prep polymyxin Support层析柱(Bio-Rad)来去除，以符合体内试验需要。利用常规方法来决定蛋白质的浓度，如Bio-Rad生产的蛋白质浓度测定试剂盒。最后纯化的蛋白质通过0.2uM滤膜以达无菌要求。

实施例8人HSA/GF的细胞生物活性测定试验

实验所用的细胞株是BalB/C3T3细胞株。EGF标准品：购于中国生物制品检定所，活性为6800IU。RPMI-1640培养基(粉剂)：Gibco-BRL完全培养基：含10％胎牛血清(标准HyCloneSH)的R-1640培养基，4℃冰箱保存，维持培养基：含0.5％胎牛血清(标准HyCloneSH)的R-1640培养基，4℃冰箱保存。MTT溶液(Sigma)：用磷酸盐缓冲液配成5.0mg/ml的溶液，0.22um滤膜过滤除菌，4℃冰箱保存；传代后24-48小时用于效价测定96孔细胞培养板(平底，Costar)，DMSO(Sigma)。取对数生长期的BalB/C3T3细胞，用完全培养基制成5.0×10⁴个细胞/ml的单细胞悬液，加入96孔板中，每孔100ul，培养24小时。弃去完全培养基，换成维持培养基，继续培养24小时。标准品和样品的稀释：用维持培养基分别对标准品和样品进行4倍倍比稀释，标准品从100倍开始做8个稀释度；样品做6个稀释度，稀释倍数根据以往测活情况做相应调整。弃去维持培养基，将稀释好的标准品溶液和样品溶液加入96孔细胞培养板中，每孔100ul，每个稀释度做2个重复，空白对照只加维持培养基，继续培养48小时。加入MTT溶液，每孔20ul，继续培养4小时。弃去培养基，每孔加入100ulDMSO裂解液。于显色后5分钟内在酶标仪上测定吸收值，测定波长490nm。用直线回归法计算，分别计算各样品的半效稀释倍数(即能引起标准品50％最大效应的样品稀释倍数)，并按下面公式计算结果：样品效价＝标准品效价×样品的半效稀释倍数/标准品的半效稀释倍数。

将发酵液经活性炭处理、脱盐、除菌后可直接进行HSA/GF融合蛋白的生物活性测定。附图4为含有不同量的HSA/PDGF-B的发酵液对BalBC3T3细胞的生物活性测定的3次结果的平均值，表明HSA/PDGF-B具有刺激细胞生长的功能。附图5显示了各种样品(发酵液或纯化的融合蛋白)在不同处理条件下(如加热)前后，对细胞分化的刺激生物活性。试验显示融合蛋白与纯品hEGF的生物活性在数值上有着相同摩尔浓度活性。在比活与其分子量大小相一致的比例，这一结果表明HSA/hEGF融合蛋白与纯品hEGF具有相同的生物活性。相类似的测定方法用于HSA/hKGF-2、HSA/bFGF、HSA/aFGF、HSA/PDGF -B测定。细胞系可用BalB/C3T3或BalB/MK。

实施例9测定融合蛋白(HSA/GF)在体外生物活性的稳定性

以HSA/FGF为例，对HSA/GF融合蛋白在37℃和50℃条件下，在不同停留时间内，对HSA/GF的稳定性进行了测定。取10000单位由细菌表达的人EGF(系列1)和10000单位HSA/hEGF(系列2)或10000单位HSA/hKGF-2(系列3)或两个融合蛋白HSA/hEGF和HSA/hIGF-1的二者组合(系列4)样品各5000单位，置于含有200微升不含血清及其它组分的RPM1培养液的200微升薄壁试管中，每温度共有10次重复。其中一组置于37℃条件下保温，另一组置于50℃水溶中保温。每7天从各组中取出一支，立即放在-80℃冰箱中保存。待全部样品收集后，以这些样品对BalBC3T3细胞进行生物活性测定。试验同时设置标准对照。结果显示GF单体与HSA形成融合分子后，在不同保藏条件下生物活性不同。在37℃下7周后HSA/GF仍保存其原有的大部生物活性(附图5A)。而EGF单体在1周内即完全丧失生物活性。50℃下4周时生物活性接近半衰期(附图5B)。结果显示细胞生长因子(GF)与血清白蛋白融合后，使之保存，储存时间延长。对环境有更强的抗性及生物稳定性。HSA/hKGF、HSA/hEGF或HSA/PDGF获得类似的试验结果。

实施例10HSA/GF的组合使用具有协同增效作用

当HSA/hEGF和HSA/hIGF组合使用时，进行如实施例8的细胞活性测定，结果显示组合使用HSA/hEGF的生物活性大于同量单体的HSA/hEGF(等摩尔数)的对刺激细胞生长活性。可见组合使用时(附图5)在IGF-1细胞生长因子的存在下，对EGF的细胞生长刺激生物活性有增效作用(两个5000IU合并组合使用时，细胞生物活性大于10000IU)。对照中有HSA、hEGF、hIGF、HSA/hEGF和HSA/hIGF等量细胞分别的细胞生长刺激试验。

实施例11HSA/GF的动物毒性试验

家兔急性眼刺激试验按中国《化妆品卫生规范》进行。家兔2-3kg，健康雌雄均有。0.1ml供试样品，其中含有80％纯度的融合蛋白150微克，直接滴入家兔左眼结膜囊，轻轻闭合。右眼滴入无菌生理盐水0.1ml。分别在1、24、48、72、96小时和1周时分别检查左右眼，进行急性毒性和眼刺激强度等级评定，以4为最严重，以0为无刺激。则结果显示试验动物的眼结膜、虹膜和角膜在供试样品或生理盐水作用下，对眼的刺激强度比较值均在0-0.5之间。结果证明HSA/hGF融合蛋白对动物的无刺激性和无毒性。用活性炭、脱盐和除菌的含有HSA/GF的发酵液进行的眼刺激的初步实验，也未见明显的刺激毒性。

实施例12HSA/GF在动物血液中的残留时间(半衰期测定)

选用2.3-2.6公斤兔子，分别在第一天，注射0.5ml融合蛋白注射液。兔A注射100万单位hEGF(大约10微克蛋白量)；兔B注射100万单位重组HSA/hEGF融合蛋白；兔C注射100万单位的HSA/haFGF；兔D注射100微克人HSA。

注射后，每天收集血样一次，然后用BalBC3T3细胞按实施例8的方法进行测活。初步测定结果列于附图6。EGF单体在第1周时，生物活性就下降到基点。而HSA和GF的融合蛋白则半衰期大大延长为4周左右。

这些结果表明HSA/GF融合蛋白在体内比裸露的GF有更长的半衰期。据此表明，本发明在保护“裸露”的GF上有明显的作用。尤其是，aFGF在已有的临床II期试验中效果不明显，可能的原因被认为aFGF半衰期太短，需要多次注射才可(Stegmann等，CardiacVascular Regeneration，1：5-10，2000)。GF具有较长的半衰期，这在临床上和制作化妆品时应具有极大的应用价值。

实施例11应用发酵技术大规模表达制备HSA/GF融合蛋白

实验中表明应用毕氏酵母表达和规模化生产重组融合蛋白比起其它任何系统都要容易的多。重组株分离到后，重组蛋白表达株可有Mut⁺和Mut^s两种形式。从小规模培养开始，甲醇诱导，在不同培养时间点取样测试蛋白的表达。对于分泌型蛋白在细胞内及培养液中的含量均用SDS-PAGE方法进行分析，对表达产物的生物活性，表达水平和纯度在每一步中均进行监测。结果展示不同发酵液中的各种HSA/GFs融合蛋白的表达水平分别在50-300mg/L。

Claims

1.一种融合蛋白，其特征为人血清白蛋白和细胞生长因子相连构成的融合蛋白；进一步地其特征在于，该融合蛋白为重组人血清白蛋白/角质细胞生长因子融合蛋白，其蛋白质氨基酸序列如Seq ID No.2所示；编码其蛋白质基因的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；

所述获得重组人血清白蛋白/角质细胞生长因子融合蛋白的步骤为：用RT-PCR技术，从体外培养的人胚胎成纤维细胞总RNA中扩增出人角质细胞生长因子(hKGF-2)的基因序列，并将其克隆入PCR产物载体质粒中；

PCR合成寡聚核苷酸引物分别为：

Seq.ID NO.13：5’-GCCTTAGGCTTAGCCCTTGGTCAGGACATGG-3’

Seq.ID NO.14：5’-CTCGAGTCATGAGTGGACCACCATTGG-3’；并在5’端引入HSA的3‘末端序列，包括Bsu36I限制性内切酶位点；在融合蛋白的3’端引入XhoI位点；便于将hKGF-2基因插入pZY-HSA载体，形成HSA/hKGF-2融合基因在酵母表达载体的构建。

2.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是分泌型的。

3.如权利要求1所述融合蛋白，可通过将含有融合蛋白核苷酸序列的载体转化、转染或转导脊椎动物、昆虫、植物细胞、酵母菌、病毒或细菌宿主获得；所述的脊椎动物细胞为中国仓鼠细胞；所述的酵母菌是酿酒酵母、毕氏酵母、念珠菌属酵母、克鲁维亚酵母或裂殖酵母；所述毕氏酵母为毕氏巴斯德酵母。

4.一种用于美容护肤、创伤、疾病治疗的制剂，其特征为含有权利要求1所述融合蛋白。

5.权利要求4所述制剂，其特征在于权利要求1所述融合蛋白与以下这些融合蛋白形成组合，这些融合蛋白是HSA/IGF、HSA/EGF、HSA/PDGF、HSA/FGF。