JP2009055838A

JP2009055838A - 融合タンパク質、該融合タンパク質に関連する遺伝子、ベクター、形質転換体及び抗炎症性医薬組成物

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Publication number: JP2009055838A
Application number: JP2007225833A
Authority: JP
Inventors: Masaki Odagiri; 優樹小田切; Shiyoutairo Ikuta; 祥太朗生田
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 2007-08-31
Filing date: 2007-08-31
Publication date: 2009-03-19
Also published as: EP2031054A1; US20090098630A1

Abstract

【課題】チオレドキシンの有する活性を長期に維持することができる新規融合タンパク質を提供する。
【解決手段】チオレドキシンと、ヒト血清アルブミンを含む融合タンパク質に関する。特定のアミノ酸配列を有するチオレドキシンと特定のアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミンとの融合タンパク質であり、該融合タンパク質はチオレドキシンの有する活性を長期に維持することができる。該融合タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、形質転換体、発現した融合タンパク質及び抗炎症性医薬組成物を提供。
【選択図】図５

Description

本発明は、新規な融合タンパク質、該融合タンパク質に関連する遺伝子、ベクター、形質転換体及び抗炎症性医薬組成物に関し、より詳細には、チオレドキシンの有する活性を長期に維持し得るチオレドキシンとヒト血清アルブミンとの融合タンパク質、該融合タンパク質に関連する遺伝子、ベクター、形質転換体及び抗炎症性医薬組成物に関する。

チオレドキシンは、分子量１万〜１．３万の電子伝達タンパク質であり、リボヌクレオチドレダクターゼがリボヌクレオシド二リン酸をデオキシリボヌクレオシド二リン酸に還元する直接の電子供与体である。また、チオレドキシンは、機能性の一対のチオール（ＳＨ）基を有し、リボヌクレオチドの還元に伴いＳ−Ｓ結合を形成する。
このようなチオレドキシンは、生体において、様々な部位の虚血再灌流障害を軽減することが報告されている。また、抗酸化、抗炎症など多岐にわたる生理作用が明らかにされている（特許文献１〜３）。このことから、チオレドキシンは、有用なタンパク質製剤の１つとして期待されている。
しかし、チオレドキシンは、血中滞留性が悪いという問題がある。
特開２０００−１０３７４３号公報特開２００４−１３７２１２号公報特開２００５−０２９５２１号公報

本発明は、チオレドキシンの有する活性を長時間にわたって、安定的に維持することができる新規な融合タンパク質、該融合タンパク質に関連する遺伝子、ベクター、形質転換体及び抗炎症性医薬組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、チオレドキシンを有用なタンパク質製剤として利用することの試みとして、まず、その血中半減期の短さに焦点をあて、短い期間での反復投与の煩雑性を回避すべく、このタンパク質の持続的な効果を得るために、より長く血中に滞留させる方法を鋭意検討した結果、生体内において、種々の血清分子のキャリアとしての機能を果たし、安全性、生体適合性、生体分解性、血中滞留性に富む血清アルブミンを利用し得ることを見出し、チオレドキシンに血清アルブミンを融合させることにより、意外にも、血中半減期を延長させ、チオレドキシンの投与間隔を延ばすことができることを突き止め、本発明の完成に至った。

すなわち、本発明の融合タンパク質は、チオレドキシンと、ヒト血清アルブミンとを含むことを特徴とする。

この融合タンパク質においては、前記チオレドキシンが、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を含むことが好ましい。
また、前記ヒト血清アルブミンが、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なアミノ酸配列からなるタンパク質を含むことが好ましい。
さらに、（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なアミノ酸配列からなるタンパク質を含むことが好ましい。

また、前記チオレドキシンが
（ａ）配列番号４に示される塩基配列、又は
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列の一部に対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡがコードするタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする塩基配列によってコードされることが好ましい。
前記ヒト血清アルブミンが、
（ａ）配列番号５に示される塩基配列、又は
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列の一部に対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡがコードするタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする塩基配列によってコードされることが好ましい。

さらに、本発明の遺伝子は、
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列により表されるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記配列番号３に示されるアミノ酸配列により表されるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするアミノ酸配列により表されるタンパク質をコードすることを特徴とする。

また、本発明は、この遺伝子を含むベクター、このベクターを含む形質転換体、この形質転換体が産生する融合タンパク質、上述した融合タンパク質を主成分として含有する抗炎症性医薬組成物である。

本発明の融合タンパク質は、チオレドキシンをヒト血清アルブミンとの融合タンパク質とすることによって、チオレドキシンの有する活性を長期にわたって安定的に維持することができる。
また、本発明のベクター及び形質転換体は、遺伝子組換え法による上記融合タンパク質の容易な産生を可能とする。
さらに、本発明の抗炎症性医薬組成物は、抗炎症性作用を長期にわたって安定的に維持することができる。

本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つのチオレドキシンと、少なくとも１つのヒト血清アルブミンとが連結されて構成されている。
ここで、チオレドキシンとは、分子量１２ｋＤ、活性部位としてＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを有するタンパク質であって、この活性部位にある２つのシステインでジスルフィド結合を形成したものを酸化型、ジチオールを形成したものを還元型と称する。このチオレドキシンは、還元型が酸化型になることによって、基質タンパク質のジスルフィド結合を還元することができる機能を有する。

チオレドキシンの主なアミノ酸配列としては、配列番号１に示す１０４個のアミノ酸配列が挙げられる。ただし、本発明におけるチオレドキシンは、活性部位としてＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを有し、還元型が酸化型になることによって、基質タンパク質のジスルフィド結合を還元することができる機能を有する限りにおいては、これらアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたものであってもよい。
本発明においては、置換、欠失、挿入及び／又は付加するアミノ酸の個数は、例えば、１〜１０個程度が適当である。
また、チオレドキシンは、配列番号４に示される塩基配列がコードするタンパク質であってもよい。この塩基配列は、配列番号４に示される塩基配列の一部に対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であってもよい。

ヒト血清アルブミンとは、体内において血液及び細胞間液をはじめ幅広く分布しているタンパク質であって、主に血流中で正常な浸透圧を維持し、血中の液体含量を維持する機能を有するタンパク質をいう。なお、ヒト血清アルブミンに限らず、ヒト以外の哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）由来の血清アルブミンであってもよい。ヒト血清アルブミンは、例えば、外科手術、ショック、火傷及び浮腫を起こす低タンパク質血症などの血管からの液体の損失があり得る治療において用いられている。
ヒト血清アルブミンの主なアミノ酸配列としては、配列番号２に示す５８５個のアミノ酸配列が挙げられる。ただし、本発明におけるヒト血清アルブミンは、血流中で正常な浸透圧を維持し、血中の液体含量を維持する機能を有する限りにおいては、これらアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたものであってもよい。

また、ヒト血清アルブミンは、配列番号５に示される塩基配列がコードするタンパク質であってもよい。この塩基配列は、配列番号５に示される塩基配列の一部に対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質であってもよい。

なお、これらのアミノ酸のうち、例えば、Ｃ末端となる場合、そのＣ末端がエステル化、アミド化等されていてもよいし、アミノ酸に含有されているＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨ基等がホルミル基等の適当な保護基で保護される等、若干の化学的修飾が行われていてもよい。

本発明の融合タンパク質におけるチオレドキシンと、ヒト血清アルブミンとの結合は、各々のタンパク質が有する機能及び二次構造に影響がない限りにおいては、いかなる結合の態様をとってもよい。具体的には、チオレドキシンに、ヒト血清アルブミンが直接結合された態様、リンカー又はスペーサ等を介して結合された態様、さらにキャリアタンパク質又はタグポリペプチド等が本発明の各タンパク質、リンカー又はスペーサ等に結合された態様等が挙げられる。

ここで、リンカー又はスペーサは、例えば、１以上のアミノ酸により構成することができ（以下、本明細書では「リンカーポリペプチド」と称する）、上述したように各々のタンパク質が有する機能及び二次構造に影響がない限りにおいては特に限定されるものではない。例えば、残基の大きさが小さいグリシン、メチオニン及びセリン、好ましくはグリシンを基本構成とするものが好ましい。リンカーポリペプチドのアミノ酸の個数は１〜３０個程度であることが適しており、７〜１５個程度が好ましい。

また、リンカーポリペプチドのアミノ酸配列は、本発明の融合タンパク質を産生するためのベクターの製造、つまり、ライゲーションが容易となる観点から、コードする塩基配列に制限酵素切断部位を含むことが好ましい。例えば、チオレドキシンをコードする塩基配列の３’末端側と、ヒト血清アルブミンをコードする塩基配列の５’末端側それぞれに、制限酵素切断部位の粘着末端を付加し、これらの粘着末端をライゲーションにより結合させることにより、これらをコードする遺伝子を結合させることができる。この場合、扱う遺伝子が２つに増加し、ライゲーションを行う箇所が１箇所増えるものの、各遺伝子の鎖長はさほど長いものではないため、ライゲーションを比較的容易に行うことができる。結合した粘着末端はリンカーポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を形成する。
具体的には、制限酵素がＡｖａＩである場合、リンカーポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｌｅｕ−Ｇｌｙであり、このアミノ酸配列をコードする塩基配列（ＡｖａＩの制限酵素切断部位の塩基配列でもある）は、ＣＣＣＧＡＧ、ＣＣＣＧＧＧ、ＣＴＣＧＡＧ又はＣＴＣＧＧＧである。

このような制限酵素切断部位としては、例えば、ＡｃｃＩ、ＡｆａＩ、ＡｐａＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｎＩ、ＢｇｌＩ、ＢｌｎＩ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、ＤｒａＩ、ＥａｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦｂａＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｅＩ、ＨａｅＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｐＩ、ＮａｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｃａＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｔｕＩ、ＴａｑＩ、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩ等が挙げられる。なお、制限酵素切断部位は、リンカーポリペプチドの一部を直接コードするので、制限酵素切断部位の５’末端及び／又は３’末端側に数個の塩基を適宜付加することにより、リンカーポリペプチドをコードする塩基配列を設計することができる。特に、上述したようにグリシン、メチオニン及びセリン、好ましくはグリシンを多く含むように設計することが好ましい。
具体的には、制限酵素がＡｖａＩである場合、その塩基配列としてＣＴＣＧＧＧを選択し、５’末端側にＧＧを、３’末端側には１つの適当な塩基を付加することにより、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙをコードする塩基配列とすることができる。

したがって、本発明の融合タンパク質の好ましい実施態様の１つとして、配列番号３に示すアミノ酸配列が挙げられる。このアミノ酸配列は、チオレドキシンのアミノ酸配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）が、制限酵素ＡｖａＩを含む塩基配列がコードするリンカーポリペプチドのアミノ酸配列（［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］_２）を介して、ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）が結合した配列である。
配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、実質的に、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の機能を損なわない限り、これらアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたものであってもよい。また、例えば、以下の（１）〜（３）のいずれか１に該当するポリペプチドが、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列のいずれかの末端に付加されていてもよい。

（１）後述する組換えＤＮＡ法において、ベクターを製造する際に利用する、制限酵素切断部位（又はその粘着末端）によってコードされたポリペプチド、
（２）後述する組換えＤＮＡ法において、タンパク質を産生するために、ベクターにあらかじめ備えられているタンパク質合成を開始するための塩基配列及び合成を終了するための塩基配列によりコードされたポリペプチド、
（３）後述する組換えＤＮＡ法において、産生したタンパク質を分離精製するために利用されるポリペプチド。例えば、カラムに結合可能なアミノ酸配列を有するポリペプチド。

また、キャリアタンパク質としては、当該分野において公知の任意のキャリアタンパク質を用いることができ、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、オボアルブミン（ＯＶＡ)等が挙げられる。タグポリペプチドとしては、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、スーパーオキシドジスムターゼ(ＳＯＤ)、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。
なお、チオレドキシンは、ヒト血清アルブミンにおけるアミノ酸配列のＮ末端側又はＣ末端側のいずれに連結されていてもよい。また、両末端側に連結されていてもよい。

上述した配列番号４又は５で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列とは、例えば、配列番号４又は５に示す塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法等の公知の方法を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えば、相同性が高いＤＮＡ同士、少なくとも配列番号４又は５で示される塩基配列と５０％程度以上、好ましくは６０％程度以上、８０％程度以上、９０％程度以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズする条件が挙げられる。具体的には、０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、６０〜７０℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。

本発明の融合タンパク質は、自体公知の組換えＤＮＡ法又は化学合成法によって製造することができる。例えば、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをベクターに組込み、このベクターで宿主細胞を形質転換し、この形質転換細胞をこの融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養し、発現させ、得られた融合タンパク質を細胞から又は培養液中から回収することによって製造することができる。ただし、ベクターへの導入の際のライゲーションの容易さを考慮すると、遺伝子の鎖長が比較的短いことが好適であるため、適当に分割された遺伝子をベクターへ同時又は段階的に導入してもよい。ベクターへの遺伝子導入は、公知の手段で行なうことができる。具体的には、ベクター中の特定の制限酵素部位を特定の制限酵素によって切断し、その切断部位に本発明の遺伝子を挿入するのが好ましい。

なお、制限酵素で処理する際には、誤ってチオレドキシン及びヒト血清アルブミンをコードする塩基配列を消化しないように、制限酵素を選択及び／又はチオレドキシン及びヒト血清アルブミンをコードする塩基配列の設計をすることが必要である。例えば、配列番号４のチオレドキシンをコードする塩基配列、配列番号５のヒト血清アルブミンをコードする塩基配列を有する遺伝子は、制限酵素ＡｖａＩ、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩによって消化されないため、これらの制限酵素で処理することが適している。

ベクターは、当該分野において公知の任意のベクターを用いることができ、用いようとする宿主細胞との適切な組合せを考慮して適宜選択することが適している。ベクターとしては、導入された細胞内で自律的に増殖できるウイルスベクター、プラスミド、ファージ又はコスミド等であれば特に限定されない。適切な選択マーカー(例えば、薬剤耐性遺伝子等)及び/又はプロモーター、他の種々の発現調節エレメント(例えば、ターミネーター、エンハンサー等)を含んでもよい。ベクターとしては、例えば、操作を容易化する点で、組換えベクターを目的として構築されたプラスミドが好ましい。宿主細胞としては、ベクターが安定的、自律的に複製でき、さらに、外来性遺伝子の形質を安定的に発現できるものであれば特に限定されない。例えば、大腸菌(Escherichia coli)細胞のような原核細胞、酵母(例えば、Saccharomyces cerevisiae)、昆虫、植物細胞及び動物細胞のような真核細胞等が挙げられる。宿主細胞にベクターを導入する方法としては、周知の方法、例えば、接合法、エレクトロポレーション法、コンピテントセル法が挙げられる。
本発明の融合タンパク質の発現に適切な条件（例えば、培地、培養温度など)は、宿主細胞、発現に用いたベクター等を考慮して適宜決定することができる。
また、本発明の融合タンパク質の化学合成は、当該分野において公知の方法によって行うことができ、例えば、Merrifieldの固相合成法、市販のポリペプチド合成機を用いた方法が挙げられる。

上述した本発明の融合タンパク質は、例えば、本発明の融合タンパク質を有効成分として含む医薬組成物として利用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質をヒトを含む哺乳動物に直接投与することにより、長時間にわたって、安定的に、ヒト等の免疫応答を誘導又は抑制し、抗炎症作用をもたらすことが可能になる。
この場合には、本発明の融合タンパク質をそのまま使用してもよいが、通常は、製剤学及び薬理学的に許容し得る製剤用添加剤、賦形剤等を用いて本発明の融合タンパク質を有効成分として含む医薬組成物として製造し、用いることが好ましい。

この医薬組成物の投与経路としては、特に限定されず、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜、経口、吸入等いかなる投与経路であってもよいが、非経口投与経路、特に注射による投与経路とすることが好ましい。
本発明の医薬組成物の剤形は、上記経路での投与に適切な形態とすることができ、例えば、注射剤、パッチ剤、パップ剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、錠剤、カプセル剤、トローチ、舌下錠、クリーム剤、ローション剤、粉剤等が挙げられる。また、生分解性のリポソーム、マイクロカプセル又はマイクロスフェア内に封入されていてもよいし、凍結乾燥形態で製剤化されていてもよい。

特に、注射剤とする場合には、融合タンパク質を溶液又は懸濁液とすればよく、さらに、例えば、ｐＨ調整剤、電解質、糖類、ビタミン類、薬理学的に許容される塩もしくは脂肪酸及び／又はアミノ酸等の当該分野で通常用いられる添加剤を適宜添加してもよい。
溶液又は懸濁液とする場合には、例えば、日本薬局方で規定される溶液であればどのようなものでも用いることができ、主に水（注射用水）、生理食塩水及び各種緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）等を用いることができる。

ｐＨ調節剤としては、一般に注射剤のｐＨ調節剤として用いられるものであればよい。例えば、クエン酸、酒石酸、酢酸、乳酸等の有機酸、例えば、塩酸、リン酸等の無機酸、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。

電解質としては、従来より輸液に用いられている各種水溶性塩を用いることができる。例えば、生体の機能や体液の電解質バランスを維持するうえで必要とされる各種無機成分（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン等）の水溶性塩（例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩等）が挙げられる。

糖類としては、従来より各種の輸液に使用されているものを用いることができる。例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類、ラクトース、マルトース等の二糖類、グリセロール等の多価アルコール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール、デキストラン４０またはデキストラン８０等のデキストラン類、蔗糖等が挙げられる。

ビタミン類としては、水溶性／脂溶性の各種ビタミンを用いることができる。例えば、ビタミンＡ、プロビタミンＡ、ビタミンＤ、プロビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ナイアシン、ビタミンＢ６群、パントテン酸、ビオチン、ミオ−イノシトール、コリン、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＰまたはビタミンＵ等が挙げられる。

薬理学的に許容される塩もしくは脂肪酸としては、例えば、ナトリウム及びカリウムなどのアルカリ金属、カルシウム及びマグネシウムなどのアルカリ土類金属、ギ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、カプリル酸、コハク酸及びリンゴ酸などの有機酸、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン及びジシククロヘキシルアミンなどの有機塩基などが挙げられる。

アミノ酸としては、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンなどが挙げられる。また、Ｎ−アセチルメチオニンなどのアミノ酸誘導体を添加してもよい。

注射剤の製造方法は、通常の製剤学的手法に従って行うことができる。つまり、本発明の融合タンパク質含有の医薬組成物は、各種緩衝液、一般に市販されている輸液（例えば、総合アミノ酸輸液、電解質輸液等）又はそれらと同様の成分を含む水溶液等を用いて、最終的に融合タンパク質の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ程度以上、１００ｍｇ／ｍＬ程度以下となるように、ｐＨが４．５〜８．７程度となるように、希釈及び／又は溶解することによって調製することができる。
また、１単位形態あたりの融合タンパク質は、特に限定されないが、例えば、１〜１０００ｍｇ程度、好ましくは１０〜１００ｍｇ程度含有する注射剤として調製することが適している。

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
以下の手順で本発明の融合タンパク質を製造した。
（１）チオレドキシンのＤＮＡ断片の調製
チオレドキシン遺伝子は、Ｕ９３７細胞からｍＲＮＡを抽出後、逆転写反応によりＤＮＡライブラリーを調製した。このＤＮＡライブラリーに対して、配列番号６のセンスプライマーと配列番号７のアンチセンスプライマーを合成プライマーとし、ポリメラーゼ（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２，東洋紡製）を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件としては、ＤＮＡを９４℃で２分間処理した後、変性（９４℃、１５秒）、アニーリング（６５℃、３０秒）及びエクステンション（６８℃、１分）の反応を３０サイクル行った。このＰＣＲによって、チオレドキシンをコードする塩基配列（配列番号４）の５’末端にＡｖａＩが、３’末端にＥｃｏＲＩが付加されたＤＮＡ断片を得た。
センスプライマー
配列番号６：ggtaccctcg agaaaagaga tgcacacaag agtgaggttg c 41
アンチセンスプライマー
配列番号７：cagctgcccg agccaccacc acctaagcct aaggcagctt gacttgc 47

（２）ヒト血清アルブミンのＤＮＡ断片の調製
プラスミドｐＰＩＣ９にヒト血清アルブミンの遺伝子が導入されたプラスミド（以下、ｐＰＩＣ９−ＨＳＡ）を鋳型とし、下記に示す配列番号８のセンスプライマーと配列番号９のアンチセンスプライマーを合成プライマーとしてポリメラーゼ（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２、東洋紡績社製）を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件としては、ＤＮＡを９４℃で２分間処理した後、変性（９４℃、１５秒）、アニーリング（６５℃、３０秒）及びエクステンション（６８℃、１分）の反応を３０サイクル行った。このＰＣＲによって、ヒト血清アルブミンをコードする塩基配列（配列番号５）の５’末端にＸｈｏＩが、３’末端にＡｖａＩが付加されたＤＮＡ断片を得た。
センスプライマー
配列番号８：gttaacctcg ggcggtggcg gaagtgtgaa gcagatcgag agcaag 46
アンチセンスプライマー
配列番号９：gagagaattc gaattccaag tttaaatagc caatggctgg 40

（３）プラスミドの作成
ＰＣＲによって増幅されたヒト血清アルブミン及びチオレドキシンのＤＮＡ断片は、フェノール抽出を行った後、エタノール沈殿により精製した。そして、ヒト血清アルブミンのＤＮＡ断片は制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造製）及びＡｖａＩ（東洋紡製）で、チオレドキシンのＤＮＡ断片はＡｖａＩ及びＥｃｏＲＩ（東洋紡製）で消化した。制限酵素処理後のＤＮＡ断片は、アガロース電気泳動を行い、それぞれのＤＮＡ断片に相当するバンド（アルブミンをコードするＤＮＡ断片；ＨＳＡ及びチオレドキシンをコードするＤＮＡ断片；Ｔｒｘ，）を切り出し、ゲル抽出用のキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてゲル抽出を行った。ゲル抽出により得られたＤＮＡ断片（ＨＳＡ、Ｔｒｘ及びｐＰＩＣ９）は、ＤＮＡライゲーションキット（ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎｋｉｔＶｅｒ．２．１、宝酒造製）を用いて１６℃で３０分ライゲーション反応を行うことにより、プラスミドｐＰＩＣ９にアルブミン及びチオレドキシンをコードするＤＮＡ断片を結合した組換えプラスミド（ｐＰＩＣ９−ＨＳＡ−Ｔｒｘ）を作製した。

（４）プラスミドの確認
上記（３）で得られたｐＰＩＣ９−ＨＳＡ−ＴｒｘをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（宝酒造製）に導入して形質転換を行った。ｐＰＩＣ９−ＨＳＡ−Ｔｒｘが導入された形質転換体は、アンピシリン添加培地中でスクリーニングし、得られた形質転換体より、プラスミドを精製した（ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ製）。そのプラスミドをＢｇｌＩＩ（宝酒造製）による消化、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ（東洋紡製）による二重消化並びにＡｖａＩ及びＥｃｏＲＩ（東洋紡製）による二重消化を行い、制限酵素地図を作成した。その結果、上記で得られたプラスミドは、目的のプラスミドであることを確認した。

（５）プラスミド中の塩基配列の確認
さらに、実施例１の（３）で得られたｐＰＩＣ９−ＨＳＡ−Ｔｒｘ中におけるヒト血清アルブミン及びチオレドキシンを含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を、配列番号１０のα−ファクターシーケンシングプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、配列番号１１〜１７のシーケンスプライマーを用いて、ＡＢＩｐｒｉｓｍ３１０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により確認した。
その結果、ｐＰＩＣ９−ＨＳＡ−Ｔｒｘには、配列番号４及び５の塩基配列を有することを確認した。
α−ファクターシーケンシングプライマー
配列番号１０：tactattgcc agcattgctg c 21
シーケンスプライマー
配列番号１１：cctatggtga aatggctgac tgctgtgc 27
配列番号１２：gccagaagac atccttactt ttatgccccg c 31
配列番号１３：gacagggcgg accttgccaa gtatatctg 29
配列番号１４：cccactgcat tgccgaagtg gaaaatgatg 30
配列番号１５：gttcgttaca ccaagaaagt accccaagtg 30
配列番号１６：catgcagata tatgcacact ttctgag 27
配列番号１７：gcagatcgag agcaagactg cttttcagga agcc 34

（６）融合タンパク質の製造
ｐＰＩＣ９−ＨＳＡ−Ｔｒｘを制限酵素ＳａｌＩで消化し、フェノール抽出した後、エタノール沈殿により精製した。次に、エレクトロポレーション装置（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ製）を用いて、ピキア酵母（ＧＳ１１５株）のＨＩＳ４遺伝子座へ相同組換えにより形質転換を行った。形質転換したピキア酵母は、ＢＭＧＹ液体培地中で４８時間培養し、その後、ＢＭＭＹ培地中で２４時間毎に１％メタノールを添加しながら９６時間培養した。そして、遠心分離（６，０００ｇ、１０分間）により酵母を分離した後、培養液に３０％（ｖ／ｖ）となるように硫酸アンモニウムを添加し、遠心分離することにより、不純物を沈殿させた。上清にさらに８０％（ｖ／ｖ）となるように硫酸アンモニウムを添加することにより、ｐＨを５．５に調整し、一晩攪拌した。そして、遠心分離（１５，０００Ｇ、２０分）により目的のタンパク質質を沈殿させた。沈殿したタンパク質質を２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶解及び透析を行った後、ＨｉＴｒａｐＱＸＬカラム（ＧＥヘルスケア社製）に結合させ、０→５００ｍＭＮａＣｌの濃度勾配により融合タンパク質を溶出させた。その後、この溶出液を１．５Ｍ硫酸アンモニウム／５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で透析した後、ＨｉＴｒａｐＰｈｅｎｙｌＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）に通し、１．５→０Ｍ硫酸の濃度勾配により融合タンパク質を溶出させた。その後、活性炭により脱脂を行うことにより、本発明の融合タンパク質を得た。

比較例１：遺伝子組換えヒト血清アルブミン
下記の実験例１〜５において、本発明の融合タンパク質の比較として、遺伝子組換えヒト血清アルブミン（バイファ社提供）を用いた。

比較例２：天然ヒト血清アルブミン
下記の実験例１〜５において、本発明の融合タンパク質の比較として、天然ヒト血清アルブミン（化血研製）を用いた。

比較例３：チオレドキシン
下記の実験例２及び３〜５において、本発明の融合タンパク質の比較として、チオレドキシン（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ社製）を用いた。

比較例４：リン酸緩衝液
下記の実験例４において、本発明の融合タンパク質の溶液の比較として、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いた。

実験例１：ゲル電気泳動による融合タンパク質の確認
製造した融合タンパク質質について、１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。対照として、遺伝子組換えヒト血清アルブミン（比較例１）、天然のヒト血清アルブミン（比較例２）及びチオレドキシン（比較例３）を用いた。測定は、１，４−ジチオスレイオール（ＤＴＴ）を添加することにより還元処理を行ったものと、行わなかったものの両方を行った。その結果を図１に示す。
図１の結果から融合タンパク質は遺伝子組換えヒト血清アルブミン（比較例１）及び天然のヒト血清アルブミン（比較例２）に比べ、高分子量側にバンドが観察されたことから、融合タンパク質はヒト血清アルブミンにチオレドキシンが結合していることが示唆された。

実験例２：ウエスタンブロット解析による融合タンパク質の確認
製造した融合タンパク質質について、抗ヒト血清アルブミン抗体及び抗チオレドキシン抗体を用いたウエスタンブロット解析を行った。対照として、ヒト血清アルブミン（比較例１）及びチオレドキシン（比較例３）を用いた。その結果を図２に示す。
図２によれば、抗ヒト血清アルブミン抗体により、遺伝子組換えヒト血清アルブミン（比較例１）及び融合タンパク質においてバンドが認められた。また、抗チオレドキシン抗体を用いたウエスタンブロットでは、チオレドキシン（比較例３）及び融合タンパク質においてバンドが認められた。このことから、融合タンパク質はヒト血清アルブミンにチオレドキシンが結合していることが示唆された。

実験例３：ＥＬＩＳＡによる融合タンパク質の確認
抗ヒト血清アルブミン抗体及び抗チオレドキシン抗体を用いたＥＬＩＳＡを行った。対照として、遺伝子組換えヒト血清アルブミン（比較例１）を用いた。その結果を図３に示す。
図３によれば、遺伝子組換えヒト血清アルブミン（比較例１）及び融合タンパク質は抗ヒト血清アルブミン抗体に対し同程度の反応性を示した。一方、抗チオレドキシン抗体はヒト血清アルブミンには全く結合しなかったが、融合タンパク質に対して大きく反応することが明らかとなった。
このことから、融合タンパク質はヒト血清アルブミンにチオレドキシンが結合していることが示唆された。

実験例４：融合タンパク質におけるチオレドキシン活性の確認
融合タンパク質におけるチオレドキシン活性について確認した。具体的には、融合タンパク質のリン酸カルシウム（ｐＨ７．０）溶液にインスリンを５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させ、さらにＤＴＴを５ｍＭとなるように添加することにより、インスリンを還元させ、沈殿するインスリンを６５０ｎｍにおける吸光度の経時変化により評価した。対照として、遺伝子組換えヒト血清アルブミン（比較例１）及びチオレドキシン（比較例３）及びＰＢＳ（比較例４）を用いた。その結果を図４に示す。
図４によれば、チオレドキシン（比較例３）は４分後からインスリンを沈殿させ、１０分後にプラトーに達した。融合タンパク質は１０分後から沈殿が観察され、１９分後にプラトーに達した。一方、遺伝子組換えヒト血清アルブミン（比較例１）及びＰＢＳ（比較例３）ではインスリンの沈殿は認められなかった。
従って、融合タンパク質はチオレドキシン活性を十分有していることが明らかとなった。

実験例５：融合タンパク質の血中滞留性の確認
融合タンパク質の血中滞留性について確認した。具体的には、まず、融合タンパク質のリジン残基に放射性インジウム同位体（１１１Ｉｎ）で標識した。そして、この融合タンパク質を、マウスに経尾静脈投与（投与量；０．１ｍｇ／ｋｇ）し、血漿中濃度推移を放射線量測定器により測定した。対照としてアルブミン及びチオレドキシンをそれぞれ１１１Ｉｎで標識したものをマウスに投与し、同様に測定した。その結果を図５に示す。
図５によれば、融合タンパク質の血中消失機構は遺伝子組換えアルブミン（比較例１）と同程度であったが、チオレドキシン（比較例３）は血中から速やかに消失していた。従って、チオレドキシンはアルブミンとの融合タンパク質にすることで血中滞留性が飛躍的に改善することが明らかとなった。

本発明に係る融合タンパク質は、チオレドキシンをヒト血清アルブミンとの融合タンパク質とすることによって、チオレドキシンの有する活性を長期に維持することができる。したがって、長期に安定したタンパク質製剤を提供することができる。また、本発明に係るベクター及び形質転換体は、遺伝子組換え法による上記融合タンパク質の容易な産生を可能とする。

実験例１における融合タンパク質の電気泳動結果を示す図である。実験例２における融合タンパク質のウエスタンブロット解析（一次抗体として抗アルブミン抗体及び抗チオレドキシン抗体を用いた）結果を示す図である。実験例３における融合タンパク質のＥＬＩＳＡによる結果を示す図である。実験例４における融合タンパク質のチオレドキシン活性結果を示す図である。実験例５における融合タンパク質の血中滞留結果を示す図である。

Claims

チオレドキシンと、ヒト血清アルブミンとを含む融合タンパク質。
前記チオレドキシンが、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を含む請求項１に記載の融合タンパク質。
前記ヒト血清アルブミンが、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なアミノ酸配列からなるタンパク質を含む請求項１に記載の融合タンパク質。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なアミノ酸配列からなるタンパク質を含む請求項１に記載の融合タンパク質。
前記チオレドキシンが
（ａ）配列番号４に示される塩基配列、又は
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列の一部に対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡがコードするタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする塩基配列によってコードされる請求項１に記載の融合タンパク質。
前記ヒト血清アルブミンが、
（ａ）配列番号５に示される塩基配列、又は
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列の一部に対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡがコードするタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする塩基配列によってコードされる請求項１に記載の融合タンパク質。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列により表されるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記配列番号３に示されるアミノ酸配列により表されるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするアミノ酸配列により表されるタンパク質をコードする遺伝子。
請求項７に記載の遺伝子を含むベクター。
請求項８に記載のベクターを含む形質転換体。
請求項９に記載の形質転換体が産生する融合タンパク質。
請求項１〜６のいずれか１つに記載の融合タンパク質を主成分として含有する抗炎症性医薬組成物。