CN1251532A - 凝血和肿瘤治疗的组织因子方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明包含令人惊奇的发现,即组织因子(TF)组分及其变体经全身性施用后可特异性地定位于血管化肿瘤内的血管中。因此,本发明提供了可用于产生特异性凝血和用于肿瘤治疗的方法和组合物,所述组合物中含有凝血缺损组织因子。本发明的TF组分和方法可作为具有改善的半寿期的TF缀合物单独使用,或与其它药剂,如常规的化学治疗药物、靶向的免疫毒素、靶向的凝血配体联合使用,和/或与因子Ⅶa(FⅦa)或FⅦa激活物联合使用。

Description

凝血和肿瘤治疗的组织因子方法和组合物
本申请是涉及1997年3月27日提交的临时申请流水号60/042,427(代理人案卷号UTSD：517PZ3)；1997年1月27日提交的临时申请流水号60/036,205(代理人案卷号UTSD：517PZ2)；和1997年1月22日提交的临时申请流水号60/035,920(代理人案卷号UTSD：517PZ1)之主题的非临时申请，毫无疑问，上述各临时申请的全部内容都列入本文作为参考。美国政府依据国立卫生研究院的准予号ROI-CA59569，ROI-CA54168和POI-HL16411拥有对本发明的权利。1.发明领域
本发明一般涉及血管和凝血领域，本发明更具体地包括一个奇怪的发现，即组织因子成分可定位于肿瘤血管系统并导致特异性凝血。本发明特别地提供了用经修饰的组织因子(TF)成分以及TF与其它分子的联合影响特异性凝血和治疗肿瘤的方法和组合物。2.相关技术的描述
肿瘤细胞对多种化学治疗剂的耐受性是临床肿瘤学的主要问题所在，因此，尽管最近30年来，肿瘤疾病化学疗法已取得很多进展，但是很多最流行的人类癌症形式仍然不能有效地进行化学治疗干预。
在任何治疗方案中，必须提及一个值得注意的根本问题，即“全细胞杀伤”的概念。此概念认为为了具有有效的治疗方案，不论是外科手术还是化学治疗法还是两者兼备，都必须对所有所谓的“克隆发生性”恶性细胞，即能无限制地生长并取代任何可被除去的肿瘤块的细胞进行全细胞杀伤。由于最终需要开发可达到全细胞杀伤的治疗剂和方案，因此，相对于其它肿瘤而言，某些类型的肿瘤更能经得起治疗的考验。例如，软组织肿瘤(如淋巴瘤)和血液及血液形成器官的肿瘤(如白血病)一般比诸如癌之类的实体肿瘤对化学疗法反应性更强。
软组织和基于血液的肿瘤对化学疗法敏感的一个原因是化学疗法干预在身体上更易于接近淋巴瘤和白血病细胞。简而言之，相对于软组织肿瘤和基于血液的肿瘤而言，大多数化学治疗剂更难到达实体肿瘤块的所有细胞，因此，更难达到全细胞杀伤。增加化学治疗剂的剂量经常会导致毒副作用，这一般会限制常规抗肿瘤剂的效力。
长期以来十分明显的是：特别需要开发新的治疗实体肿瘤的策略。一个这种策略是使用“免疫毒素”，其中使用抗肿瘤细胞抗体将毒素传递给肿瘤细胞。然而，与上述化学治疗法一样，此方法也有某些缺点。例如，抗原阴性或抗原缺损的细胞可存活并重新集群为肿瘤或导致进一步转移。在治疗实体肿瘤时，肿瘤块一般不允许抗体和免疫毒素大小的分子透过，因此，仅开发免疫毒素不能够特别显著改善癌症治疗状况。
后来，一些研究人员开发了靶向实体肿瘤血管系统的方法。靶向肿瘤血管的好处在于不会导致抗性肿瘤细胞或其群体的产生。另外，向血管系统传递靶向药剂不会存在与药剂进入相关的问题，破坏血管应能导致抗肿瘤效应的扩大，因为很多肿瘤细胞依靠单个血管供应其氧和营养。血管靶向策略的例子描述于Burrows等(1992)，Burrows和Thorpe(1993)和WO93/17715。将抗细胞剂靶向传递给肿瘤血管系统提供了十分有希望的策略，然而，这些分子毒素部分的使用仍为改善血管靶向留有余地。
WO96/01653中报道了靶向破坏肿瘤血管系统的另一方法，其中使用针对肿瘤血管系统标记物的抗体将促凝剂传递给实体肿瘤的血管系统。以此方法靶向传递促凝剂的优点在于不太可能因存在任何背景错误靶向而导致显著的毒副作用，这种背景错误靶向可能是由于靶向抗体与正常组织细胞任何低水平的交叉反应性所致。用于这种定向抗肿瘤疗法的抗体-促凝剂构建体被称为“凝血配体(coaguligand)”(WO 96/01653)。
尽管将促凝剂特异性传递给肿瘤血管标志着惊人的进步，在多种人类疾病和障碍的治疗方面应用或操纵凝血已经实践了一段时间。例如，Morrissey和Comp建议联合使用截短的组织因子(tTF)和因子VIIa(FVIIa)治疗血液凝结受损的患者，如血友病患者(美国专利号5,374,617；5,504,064；和5,504,067)。Roy和Vehar还研制出了可中和内源性组织因子、并可在治疗例如心肌梗塞时用作抗促凝剂的组织因子突变体(美国专利号5,346,991和5,589,363)。
在与组织因子(TF)相关的其它研究中，Edgington及其同事们已阐明：与正常的黑素细胞相比，恶性转移的人黑素瘤细胞表达高水平的TF，即血浆凝血蛋白酶级联反应的主要细胞起始因子(WO94/28017；WO94/05328；美国专利5,437,864)。据报道抑制TF功能以及随后局部蛋白酶产生的减少可导致血管系统中残留的肿瘤细胞数目显著减少，这暗示着TF表达和肿瘤细胞的转移表型之间有着直接的联系。Edgington及其同事们提出成功植入肿瘤细胞需要TF功能，而干预TF功能、或特异性地干预TF在细胞表面的表达对于抑制转移是有用的，因此这些作者建议用针对组织因子的抗体治疗癌症。发明简述
与Edgington及其同事们的上述观察结果和使用抗TF抗体治疗癌症形成鲜明对照的是，本发明人已证实，可使用截短的TF成分和TF变体本身治疗实体肿瘤。部分基于本发明人惊人的发现发展了本发明，所述发现为仅在全身性施用之后，截短的TF会特异性地定位于血管化肿瘤内的血管中。从以前对TF分子的详细研究中不可能推测出在缺乏任何靶向部分时的这种定位。本文所述的TF自我定位特性与以前描述的使用TF治疗诸如血友病患者内出血障碍形成对照，后一疗法中TF的传递和作用既不定位也局限于局部应用的特定部位。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了促进动物或患者前血栓形成性(prothrombotic)血管凝血的方法，此方法一般包括给动物施用含有一种凝血缺损组织因子(TF)化合物的组合物，施用的量应能有效地优先或特异性地促进前血栓形成性血管凝血。
除了在随后特别地指出上限的情况外，整个申请上下文中所用的术语“一个”(或“一种”)的意思是“至少一个(种)”，“至少第一个(种)”，“一个(种)或多个(种)”或“多个(种)”所指的组分或步骤，因此，“一种凝血缺损组织因子”指的是“至少第一种凝血缺损组织因子”。本领域技术人员参照本发明的内容可知道关于任何单个药剂量的可操作范围和混合参数。
前血栓形成性血管可能与伴有良性生长或血管化肿瘤的多种血管源疾病中的任何一种相关。在本发明的上下文中，术语“血管化肿瘤”指的是血管化的恶性肿瘤。本发明特别有利于治疗至少约为中等大小的血管化肿瘤和治疗大的血管化肿瘤。
组合物一般是药理学可接受的，优选通过例如静脉内注射全身性施用于动物。
本发明的方法还被描述为治疗患有与前血栓形成性血管相关之疾病的动物或人患者的方法，此方法包括给动物施用至少第一种凝血组合物，所述组合物含有至少第一种凝血缺损组织因子化合物，施用的量应能有效地优先或特异性地促进与良性或恶性疾病位点相关的前血栓形成性血管凝血。
本发明的实质也可被限定为含有至少一种生物学有效量的至少第一种凝血缺损组织因子化合物的组合物，该组合物可用于制备药物，所述药物可用于优先或特异性地促进动物、特别是与良性或恶性疾病位点相关之动物的前血栓形成性血管凝血。
在本发明的方法、药物和用途中，一个优点在于：只要将凝血组合物提供到动物的全身循环中，就会导致组织因子化合物特异性地或优先地定位于疾病位点。
本文公开的优选方法是用于促进患有血管化肿瘤的动物或人受试者的肿瘤血管系统凝血的方法，所述方法一般包括给动物施用一种或多种含有一种或多种凝血缺损组织因子化合物的组合物，施用的量应足以特异性地或优先地促进肿瘤血管系统凝血。治疗中等大小或大的血管化肿瘤特别有利。
这些治疗方法可被描述为治疗患有血管化肿瘤的动物的方法，所述方法包括给动物施用生物学有效量的至少一种凝血组合物，所述组合物含有其量足以特异性地或优先地促进肿瘤血管系统凝血的至少第一种凝血缺损组织因子化合物。
进一步的描述是治疗患有血管化肿瘤的动物或患者的方法，所述方法包括给动物全身性施用一种或多种组合物，所述组合物含有一种或多种凝血缺损组织因子化合物，施用的量和时间能使得有效地特异性或优先地促进血管化肿瘤血管系统的凝血。
本发明的抗肿瘤效应被特别地描述于下述方法中，该方法的特征在于给患有肿瘤的动物施用含有至少一种凝血缺损组织因子化合物的组合物，施用的量应能有效促进肿瘤血管系统的凝血，并能特异性地或优先地导致肿瘤中的组织坏死。
本发明的这些方面也提供了含有至少一种生物学有效量的至少第一种凝血缺损组织因子化合物的组合物，所述组合物可用于制备能优先或特异性地促进与动物恶性血管化肿瘤相关的前血栓形成性血管凝血的药物；因而，其中所述药物可通过导致肿瘤血管凝血和肿瘤坏死而用于治疗患有癌症的动物。
本文中用于促进前血栓形成性血管或肿瘤血管系统凝血上下文，和/或用于促进足以导致如肿瘤的疾病位点中组织坏死的凝血上下文中的术语“优先地”和“特异性地”指的是：组织因子化合物或TF-第二种药剂组合行使的功能是获得基本上局限于疾病位点(如肿瘤区域)的凝血和/或组织坏死，而基本上不会导致正常的健康组织凝血或组织坏死。
因此，凝血缺损组织因子化合物或其联合在疾病或肿瘤位点产生了凝血和/或组织破坏效应，而对正常健康的细胞或组织只产生很小的，或不产生凝血或组织破坏效应，因此，凝血和/或组织破坏定位于疾病或肿瘤位点，而不会大量或显著地扩展至其它主要或重要的血管或组织。因此，在本发明的方法中，健康细胞和组织的功能基本上保持未受损的状态。
本发明中“凝血缺损组织因子”一般是当在如适当的磷脂环境中检测时，活性比全长的天然组织因子至少约低100倍的组织因子化合物。组织因子化合物仍然具有活性，优选被描述为当在如适当的磷脂环境中检测时，活性比全长的天然组织因子约低100倍至1,000,000倍的组织因子化合物。
当在如适当的磷脂环境中检测时，优选凝血受损的组织因子化合物的活性比全长的天然组织因子至少约低1,000倍；更优选所述活性比全长的天然组织因子至少约低10,000倍；最优选所述活性比全长的天然组织因子至少约低100,000倍。
“活性至少约低100,000倍”不是最小值，当在如适当的磷脂环境中检测时，组织因子化合物的活性比全长的天然组织因子可以至少约低500,000倍或约1,000,000倍。
人组织因子化合物一般以用于人为佳，当然，也不排除使用其它种的TF，包括大肠杆菌TF。为了简化制备，优选通过重组表达制备凝血缺损组织因子化合物，但此方法不是必需的。
通过在结合至磷脂表面和/或插入磷脂膜或脂质双层方面产生缺陷可使组织因子变成凝血缺损型，优选的例子是“截短的组织因子”。如美国专利5,504,064中所限定(其中化合物具有不同用途)，“截短的组织因子”一般具有不同于天然组织因子的氨基酸序列，不同之处在于其中截短的组织因子蛋白上缺失了功能为将天然组织因子与磷脂膜结合的足够的跨膜氨基酸，因此截短的组织因子蛋白不与磷脂膜结合。
截短的组织因子的具体例子是约含有天然TF序列前219个邻接氨基酸的组织因子化合物，进一步的例子是实质上由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的组织因子化合物。尽管欲用于不同方法中，但美国专利5,504,067中将截短的组织因子限定为具有始于第1位结束于确定的组织因子序列大致第219位的氨基酸序列的组织因子蛋白。
也可以使用二聚体形式的凝血缺损组织因子，包括同二聚体和异二聚体组织因子。本文公开的TF二聚体的例子是基本上由SEQ IDNO：3(H6-tTF219-cys-C’二聚体)，SEQ ID NO：6(H6-tTF220-cys-C’二聚体)，SEQ ID NO：7(H6-tTF221-cys-C’二聚体)或SEQ IDNO：2(H6-N’-cys-tTF219二聚体)氨基酸序列的二聚体组成的TF二聚体。本发明的某些方面优选使用下文详细描述的化学缀合的二聚体，而在特定实施方案中也可以使用读框一致地连接在一起的重组产生的二聚体。
本文使用的凝血受损组织因子化合物也可以是聚合体或多聚体形式的组织因子。
在某些实施方案中，组织因子化合物是激活因子VII的能力缺损的突变组织因子。尽管单独使用也是有用的，但最优选将这种突变体与生物学有效量的至少一种因子VIIa或因子VIIa激活剂的共同施用联合使用，例如与其量足以增加动物肿瘤血管系统凝血和肿瘤坏死的因子VIIa一起使用。
这种突变体可以是在SEQ ID NO：1约第157位至约第167位氨基酸区域中包含突变的突变体。非限制性突变体的例子是在SEQ IDNO：1中，第158位Trp变成Arg；第162位Ser变成Ala；第164位Gly变成Ala；或第158位Trp变成Arg和第162位Ser变成Ala的突变体。这种突变体的确定的例子是基本上由SEQ ID NO：8或SEQID NO：9的氨基酸序列组成的突变体。
任何截短的、二聚体、多聚体和/或突变体凝血缺损组织因子化合物可进一步被修饰以增加TF分子的寿命、半寿期或“生物半寿期”。可对多肽结构进行多种修饰以达到这种特性的改变。
经修饰增加了其生物半寿期的TF的具体例子是与载体分子(如蛋白质载体)有效地结合、优选共价连接的那些组织因子化合物。优选载体为惰性载体，例如(仅仅是举例)白蛋白或球蛋白。载体也可以是如多糖和合成聚合物的非蛋白质载体。
与抗体或其部分有效结合的TF构建体是本文优选的生物半寿期有所提高的凝血缺损TF形式。然而，在本文提供的抗癌治疗策略中所用第一药剂的上下文中，TF与不能显著特异性结合肿瘤细胞肿瘤血管系统或肿瘤基质组分的抗体连接，即其中组织因子化合物不与“抗肿瘤”抗体连接，所得组织因子化合物不是“靶向肿瘤的TF化合物”。
在这种TF-抗体缀合物中，组织因子化合物可与所谓“不相关特异性”的IgG分子有效结合，即所述IgG分子对肿瘤细胞、肿瘤血管系统或肿瘤基质组分不具有免疫结合亲和性。组织因子化合物也可与抗体Fc部分有效结合，所述部分在抗体特异性方面不具有特异性靶向功能。涉及的其它构建体是其中组织因子化合物被导入IgG分子以取代CH3区域的那些构建体。
本发明非常有效的TF疗法可以有利地与一种或多种其它疗法联合。例如，诸疗法中可进一步包括给动物或患者施用生物学或治疗有效量的至少第二种治疗化合物，如至少一种选自因子VIIa、因子VIIa激活剂和至少第一种抗癌剂的第二种治疗化合物。
所述至少第一种抗癌剂可以是“化学治疗剂”。本文所用术语“化学治疗剂”指的是治疗恶性肿瘤所用的典型化学治疗剂或药物。虽然包括免疫毒素的其它化合物也可用术语化学治疗剂描述，因为它们可产生抗癌效应，但为了简单起见，还是使用了该术语。然而，“化学治疗剂”在本领域中逐渐具有不同的含义，并根据此标准含义使用该术语。因此，本发明上下文中的“化学治疗剂”一般不是指免疫毒素，放射性治疗剂等等，尽管它们在使用上有重叠。
表II中列出了很多化学治疗剂的例子。尽管与本发明联合使用时剂量可大大降低，但本领域技术人员易于理解化学治疗剂的使用和适当剂量。本文优选的化学治疗剂是表鬼臼毒素吡喃葡糖苷。也可被称为“化学治疗剂”的新的一类药物是诱导细胞凋亡的药剂。包括基因、载体和反义构建体的任何一种或多种这类药物适当时也可与本发明联合使用。
适当的抗癌药剂还包括特异性靶向的毒性药剂，例如，抗癌抗体，优选为含有可与肿瘤细胞、肿瘤血管系统或肿瘤基质组分特异性结合的抗体的抗体构建体或缀合物，其中抗体与至少第一种细胞毒性剂或抗细胞药剂、或与例如至少第一种凝血因子有效结合或缀合。
例如(仅是举例)，靶向构建体或缀合物可以是能与下述成员特异性结合的抗体构建体或缀合物：肿瘤细胞表面分子；肿瘤血管系统组分，如E-选择蛋白，P-选择蛋白，VCAM-1，ICAM-1，endoglin或整联蛋白；吸附于或定位于血管系统或基质中的组分，如VEGF，FGF或TGFβ；其表达可在肿瘤环境中天然或人工地被诱导的组分，如E-选择蛋白，P-选择蛋白或MHC II类抗原。非抗体靶向的药剂包括生长因子，如VEGF和FGF；含有三肽R-G-D并能与肿瘤血管系统特异性结合的肽，和其它靶向组分，如膜联蛋白和相关配体。
抗体构建体和缀合物可有效地与至少第一种细胞毒性的或要不然为抗细胞的药剂结合。它们也可有效地与至少第一种凝血因子结合。尽管对于毒素而言一般优选共价键，但在与促凝剂结合时，使用双特异性构建体也是有利的(如使用两种抗体结合区域)。在这种“免疫毒素”或“凝血配体”中可使用本领域已知的任何一种或多种毒性剂或促凝剂，组织因子或组织因子衍生物也可用作凝血配体的部分，其中凝血配体是第二种“抗癌剂”。
因此，本发明另外还提供了治疗患有血管化肿瘤的动物或患者的方法，所述方法一般包括给动物全身性施用一种或多种凝血缺损组织因子化合物和一种或多种抗癌剂，施用的联合剂量应能有效使肿瘤血管系统凝血并特异性诱导肿瘤坏死。抗癌剂可以是如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷的化学治疗剂，抗体，含有可与肿瘤细胞、肿瘤血管系统或肿瘤基质组分特异性结合、有效连接于细胞毒性药剂或凝血因子的抗体的抗体构建体或缀合物。
无论抗癌剂是化学治疗剂还是基于抗体的构建体，都可以由单一组合物或者两种或多种不同的组合物给动物共同施用一种或多种抗癌剂。也可以交错或连续施用一种或多种组织因子化合物和一种或多种抗癌剂。“连续施用”需要以“生物有效的时间间隔”给动物施用TF和抗癌剂。例如，可在施用抗癌剂之前的生物有效时间给动物施用组织因子化合物，或在施用组织因子化合物之前的生物有效时间给动物施用抗癌剂。当首先施用组织因子化合物时，一般在施用抗癌剂之前的足以允许组织因子化合物优先定位于肿瘤血管系统内的生物有效时间给药。
本发明还包括使用至少一种因子VIIa或因子VIIa激活剂以增加确定主要治疗目的的任何一种或多种凝血缺损组织因子(TF)化合物的效力的方法，这类方法一般包括另外给动物或患者施用治疗有效量的因子VIIa或因子VIIa激活剂。
在这种实施方案中，一般优选使用因子VIIa本身，所用因子VIIa基本上由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成。
另外，给动物施用凝血缺损的组织因子化合物的同时可施用因子VIIa或因子VIIa激活剂。照此方式，可以预先形成的组织因子-因子VIIa复合物的形式给动物或患者施用因子VIIa。在某些实施方案中，组织因子-因子VIIa复合物是等摩尔的复合物。
另外，可使用交错或连续施用的方式给动物施用凝血缺损的组织因子化合物和因子VIIa化合物。一般优选先施用组织因子化合物，并且优选在施用因子VIIa化合物之前的生物有效时间给动物施用组织因子化合物。这种有效的预先施用组织因子化合物一般在施用因子VIIa化合物之前足以允许组织因子化合物优先定位于肿瘤血管系统内的生物有效时间进行。
因此，本发明的这些方法还可被描述为促进患有血管化肿瘤的动物或患者的肿瘤血管系统凝血的方法，所述方法包括给动物或患者全身性提供凝血缺损组织因子化合物和因子VIIa或因子VIIa激活剂，施用的联合剂量应足以优先或特异性地促进肿瘤血管系统凝血。
优选在提供因子VIIa之前的时间给受试动物提供凝血缺损组织因子化合物，其中施用因子VIIa之前的时间间隔对于组织因子化合物优先或特异性地定位于肿瘤血管系统是有效的。
其它方法被描述为治疗患有血管化肿瘤的动物的方法，所述方法包括给动物全身性施用凝血缺损组织因子化合物和因子VIIa，施用的联合剂量应能有效促进肿瘤血管系统凝血和特异地导致肿瘤坏死。一般优选预先施用组织因子，以使组织因子化合物优先定位于肿瘤血管系统内，并形成供随后与因子VIIa联合的库。
所有这种因子VIIa联合疗法可与任何凝血缺损组织因子化合物，如截短的、二聚体的和/或突变的组织因子和/或半寿期增加的组织因子一起使用。这些方法可特别用于与激活因子VIIa的能力缺损的组织因子的联合。
本发明的联合疗法也包括使用一种或多种凝血缺损组织因子化合物、一种或多种抗癌剂和因子VIIa或因子VIIa激活剂的三重联合。
本发明还提供了新的组合物，该组合物的形式为含有一种或多种经修饰增加了半寿期的凝血缺损组织因子化合物，其中所述修饰不是由组织因子化合物与能结合肿瘤细胞、肿瘤血管系统或肿瘤基质组分的抗体的结合组成。
“增加了半寿期的组织因子化合物”包括上述所有凝血缺损组织因子化合物，如截短的、二聚体的、聚合的和/或突变的组织因子。
增加了半寿期的组织因子化合物优选包括与载体分子有效结合，如共价结合的凝血缺损组织因子化合物。本文优选蛋白质载体，例如白蛋白或球蛋白，但非蛋白质载体也可以。
一类增加了半寿期的凝血缺损组织因子化合物是与抗体或其部分(如IgG分子或抗体的Fc部分)有效结合的组织因子化合物。导入至IgG分子的邻接部分，如取代CH3区域的组织因子也可以。
本发明还提供了一系列可与本发明方法结合使用的新的治疗试剂盒。某些试剂盒优选在适当的容器中包含至少第一种凝血缺损组织因子化合物与至少第一种抗癌剂的联合。
凝血缺损组织因子化合物可以是本文所述的一种或多种凝血缺损组织因子，如截短的、二聚体的、聚合的和/或突变的组织因子，包括激活因子VII的能力缺损的突变组织因子。若试剂盒中使用了这种因子VII激活突变体，则试剂盒中还可任选包括生物学有效量的因子VIIa。
如上所述使用术语“抗癌剂”，该术语覆盖了化学治疗剂，如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷；和基于抗体的抗癌剂，如含有可与肿瘤细胞、肿瘤血管系统或肿瘤基质组分特异性结合的抗体的抗体缀合物，其中所述抗体与细胞毒性剂或凝血因子(包括组织因子或组织因子衍生物)有效结合。
本发明其它的治疗试剂盒一般优选在适当的容器装置中包括激活因子VII的能力缺损的突变组织因子化合物以及因子VIIa。以前人们认为这一类型突变体的活性缺损使得它们在治疗上不能用于诱导凝血，而只能作为野生型TF的拮抗剂起作用并抑制凝血。以前仅建议过将具有显著活性的截短的组织因子与因子VIIa进行联合，用于治疗出血障碍。
因此，本发明提供了突变组织因子化合物与因子VIIa的新联合，所述化合物相对于截短的组织因子而言，其凝血活性受损情况更加严重，优选是由于激活因子VII的能力缺损。施用给动物之后，因子VIIa变成“外源性因子VIIa”。因此，这些试剂盒优选在适当的容器装置中包括生物学有效量的激活因子VIIa的能力缺损的突变组织因子化合物以及生物学有效量的至少一种因子VIIa或因子VIIa激活剂。在这种试剂盒中因子VIIa激活剂可替代因子VIIa，或者除了因子VIIa外，还可使用因子VIIa激活剂。也可加入补充试剂。
可用于这种试剂盒中的TF突变体的例子是在SEQ ID NO：1中约第157位到约第167位的氨基酸区域中包括突变的突变体。所述突变体的例子是在SEQ ID NO：1中，第158位Trp变成Arg；第162位Ser变成Ala；第164位Gly变成Ala；或第158位Trp变成Arg和第162位Ser变成Ala的那些突变体。这种突变体TF的其它例子是基本上由SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的突变体。
本发明也提供了优选在适当容器中包含至少第一种凝血缺损的组织因子化合物、至少第一种抗癌剂和因子VIIa或因子VIIa激活剂的联合治疗试剂盒。图的简述
下述诸图构成了本发明说明书的一部分，它可进一步阐明本发明的某些方面。参照一幅或多幅图、结合本文提供的具体实施方案的详细描述可更好地理解本发明。
图1：全长TF对血浆凝血的诱导，血液(A)显示出与细胞膜(B)接触。
图2：TF域结构。所示的是胞外域(A；氨基酸1-219)和细胞膜(B)部分，NH2域(10)以交叉影线表示，因子VII/VIIa结合区域(20)以影线表示，跨膜域(40)始于氨基酸220(30)并跨越细胞膜。TF的跨膜域被缺失或者已变得无功能，以产生本发明的功能性tTF。在某些tTF组合物中，NH2域也可被缺失或者变得无功能。
图3：tTF诱导的肿瘤血管系统凝血模型。血液(A)显示出与肿瘤血管内皮细胞(C)的细胞膜(B)接触。前血栓形成性肿瘤内皮细胞表面具有因子IX、X(显示出)或TFPI/Xa加上磷脂酰丝氨酸(PS-)，它们与tTF-VII或tTF-VIIa结合，导致凝血。
图4A和图4B。图4A：与细胞结合的tTF诱导凝血。4℃下将A20细胞(105个细胞，100μl)与抗体(0.33μg)和tTF(0.17μg)一起保温1小时，向细胞中加入氯化钙(12.5mM)和柠檬酸盐化的小鼠血浆，记录第一条血纤蛋白链形成的时间(凝血时间，秒；水平轴)，垂直轴表示样品号。样品1包括未加入抗体或tTF(对照)，样品2包括B21-2/10H10抗体，样品3包括tTF，样品4包括B21-2/OX7抗体加上tTF，样品5包括CAMPATH-2/10H10抗体加上tTF，样品6包括10H10F(ab’)2抗体加上tTF，样品7包括10H10Fab’抗体加上tTF，样品8包括B21-2F(ab’)2抗体加上tTF，样品9包括B21-2Fab’抗体加上tTF，样品10包括B21-2/10H10抗体加上tTF。图4B：结合的tTF分子的数目与血浆凝血时间之间的关系。4℃，在叠氮化钠存在下将A20细胞(105个细胞，100μl)与不同浓度的B21-2/10H10加上过量的tTF保温1小时，然后洗涤，升温至37℃。向细胞中加入氯化钙(12.5mM)和柠檬酸盐化的小鼠血浆(不同于A的一批)，记录第一条血纤蛋白链形成的时间(凝血时间，秒；垂直轴)，在使用125I-tTF的平行研究中测定与细胞结合的tTF分子数目(O)(对数规模；水平轴)，数值表示为3次测量的平均值与SD。
图5：通过与细胞相关的tTF219，H6-N’-cys-tTF219和H6-tTF219-cys-C’使小鼠血浆凝血。室温下用识别I-Ad和tTF的“捕获”双特异性抗体B21-2/10H10处理A20淋巴瘤细胞(I-Ad阳性)。洗涤细胞，以一定的tTF浓度范围加入两种不同的tTF219制品[标准tTF219(O)和tTF219(▲)]，H6-N’-cys-tTF219(□)或H6-tTF219-cys-C’(●)(浓度，M；水平轴)，洗涤细胞，升温至37℃。加入钙和柠檬酸盐化的小鼠血浆，记录第一条血纤蛋白链形成的时间(凝血时间，秒；垂直轴)。
图6：通过与细胞相关的H6-tTF220-cys-C’和tTF220-cys-C’使小鼠血浆凝血。室温下用识别I-Ad和tTF的“捕获”双特异性抗体B21-2/10H10处理A20淋巴瘤细胞(I-Ad阳性)。洗涤细胞，以一定的浓度范围加入标准tTF219(■)，H6-tTF220-cys-C’(O)和tTF220-cys-C’(●)(浓度，M；水平轴)。洗涤细胞，升温至37℃。加入钙和柠檬酸盐化的小鼠血浆，记录第一条血纤蛋白链形成的时间(凝血时间，秒；垂直轴)。
图7：通过与细胞相关的H6-tTF221-cys-C’，tTF221-cys-C’和H6-tTF221-cys-C’二聚体使小鼠血浆凝血。室温下用识别I-Ad和tTF的“捕获”双特异性抗体B21-2/10H10处理A20淋巴瘤细胞(I-Ad阳性)。洗涤细胞，以一定的浓度范围加入标准tTF219(O)，H6-tTF221-cys-C’(●)，tTF221-cys-C’(□)或H6-tTF221-cys-C’二聚体(▲)(浓度，M；水平轴)。洗涤细胞，升温至37℃。加入钙和柠檬酸盐化的小鼠血浆，记录第一条血纤蛋白链形成的时间(凝血时间，秒；垂直轴)。
图8：通过与细胞相关的H6-N’-cys-tTF219和H6-N’-cys-tTF219二聚体使小鼠血浆凝血。室温下用识别I-Ad和tTF的“捕获”双特异性抗体B21-2/10H10处理A20淋巴瘤细胞(I-Ad阳性)。洗涤细胞，以一定的浓度范围加入标准tTF219(O)，H6-N’-cys-tTF219(■)和H6-N’-cys-tTF219二聚体(●)(浓度，M；水平轴)。洗涤细胞，升温至37℃。加入钙和柠檬酸盐化的小鼠血浆，记录第一条血纤蛋白链形成的时间(凝血时间，秒；垂直轴)。
图9：通过tTF219使大的C1300 Muγ肿瘤的血管形成血栓。给皮下携有大的(＞1000cm3)C1300 Muγ肿瘤的Nu/Nu小鼠静脉内注射16-20μg tTF219。24小时后，麻醉小鼠，无痛致死，取出肿瘤和器官，评价石蜡组织切片中形成血栓的血管的存在，计数肿瘤切片中血栓化血管和畅通血管的数目，垂直轴表示血栓化肿瘤血管的百分比，影线条表示注射tTF219的小鼠，空心条表示注射PBS的小鼠。
图10：通过tTF219使大的C1300肿瘤的血管形成血栓。给皮下携有大的(＞1000mm3)C1300肿瘤的Nu/nu小鼠静脉内注射16-20μgtTF219。24小时后，麻醉小鼠，无痛致死，取出肿瘤和器官，评价石蜡组织切片中形成血栓的血管的存在，计数肿瘤切片中血栓化血管和畅通血管的数目，垂直轴表示血栓化肿瘤血管的百分比，影线条表示注射tTF219的小鼠，空心条表示注射PBS的小鼠。
图11：通过tTF219使大的3LL肿瘤的血管形成血栓。给皮下携有大的(＞800mm3)3LL肿瘤的C57BL/6小鼠静脉内注射16-20μgtTF219。24小时后，麻醉小鼠，无痛致死，取出肿瘤和器官，评价石蜡组织切片中形成血栓的血管的存在，计数肿瘤切片中血栓化血管和畅通血管的数目，垂直轴表示血栓化肿瘤血管的百分比，影线条表示注射tTF219的小鼠，空心条表示注射PBS的小鼠。
图12A和图12B：通过tTF219抑制小鼠C1300 Muγ肿瘤的生长。图12A：间隔6天，给长了0.8至1.0cm直径C1300(Muγ)肿瘤的小鼠两次静脉内注射B21-2/10H10-tTF凝血配体(●)(箭头)，对照组小鼠仅接受等剂量的tTF(□)，CAMPATH-2/10H10加上tTF(Δ)，或磷酸缓冲盐溶液(O)。接受B21-2/OX7和tTF的小鼠与仅接受tTF的动物具有类似的肿瘤反应，仅施用B21-2/10H10不影响肿瘤生长。每组含有12至27只小鼠。点表示每组平均肿瘤体积(±SEM)，垂直轴表示平均肿瘤体积(cm3)，水平轴表示第一次治疗后的天数。图12B：用16-20μg tTF219(■)或磷酸缓冲盐溶液(O)静脉内注射皮下携有小(350mm3)C1300 Muγ肿瘤的Nu/nu小鼠，1周后重复治疗。每天测量肿瘤，计算肿瘤体积(+一个标准偏差)。每个治疗组含有8至10只小鼠。垂直轴表示平均肿瘤体积(cm3)，水平轴表示第一次治疗后的天数。
图13：通过tTF219抑制小鼠H460肿瘤的生长。用16-20μgtTF219(■)或磷酸缓冲盐溶液(O)静脉内注射皮下携有小(350mm3)H460肿瘤的Nu/nu小鼠，1周后重复治疗。注射时间以箭头表示，每天测量肿瘤，计算肿瘤体积(+一个标准偏差)。每个治疗组含有8至10只小鼠。垂直轴表示平均肿瘤体积(cm3)，水平轴表示第一次治疗后的天数。
图14：通过tTF219抑制小鼠HT29肿瘤的生长。用16μg或64μgtTF219(□)或PBS(●)静脉内注射皮下携有大(1200mm3)HT29肿瘤的Nu/nu小鼠。每天测量肿瘤(注射后的天数；水平轴)，计算肿瘤体积(+一个标准偏差)(肿瘤体积，mm3；垂直轴)。每个治疗组含有3至4只小鼠。
图15：通过与细胞相关的IgG-H6-N’-cys-tTF219使小鼠血浆凝血。用识别I-Ad和tTF的“捕获”双特异性抗体B21-2/10H10处理A20淋巴瘤细胞(I-Ad阳性)。室温下以一定的浓度范围加入IgG-H6-N’-cys-tTF219(Δ)，H6-N’-cys-tTF219(■)或tTF219(O)(浓度，M；水平轴)。洗涤细胞，升温至37℃。加入钙和柠檬酸盐化的小鼠血浆，记录第一条血纤蛋白链形成的时间(凝血时间，秒；垂直轴)。
图16：通过与细胞相关的IgG-H6-N’-cys-tTF219和IgG-H6-tTF219-cys-C’使小鼠血浆凝血。通过将B21-2 IgG(针对I-Ad)与H6-N’-cys-tTF219(▲)或H6-tTF219-cys-C’(■)连接制备免疫球蛋白-tTF缀合物。室温下以一定的浓度范围将缀合物加入A20淋巴瘤细胞(I-Ad阳性)中，并与tTF219(●)相比较(浓度，M；水平轴)。洗涤细胞，升温至37℃。加入钙和柠檬酸盐化的小鼠血浆，记录第一条血纤蛋白链形成的时间(秒)，垂直轴表示相对于对照的凝血时间百分比。
图17：通过显色试验测定与细胞相关的IgG-H6-N’-cys-tTF219和Fab’-H6-N’-cys-tTF219使因子X转变为因子Xa的情况。用识别I-Ad和tTF的“捕获”双特异性抗体B21-2/10H10处理A20细胞(I-Ad阳性)，室温下以一定的浓度范围加入IgG-H6-N’-cys-tTF219(O)或Fab’-H6-N’-cys-tTF219(Δ)，也加入B21-2/10H10+H6-N’-cys-tTF219(×)和Mac51/10H10+H6-N’-cys-tTF219(对照，■)(浓度，M；水平轴)。洗涤细胞，升温至37℃。加入钙和“Proplex T”(ProplexT含有因子II，VII，IX和X)。通过加入生色团释放底物S-2765测定Xa的产生，并测定409nm下的光密度(OD409nm；垂直轴)。
图18：通过免疫球蛋白-tTF缀合物抑制小鼠内C1300 Muγ肿瘤的生长。用与OX7 Fab’/10H10 Fab双特异性“载体”抗体复合的tTF21916-20μg(Δ)静脉内注射皮下携有小(300mm3)C1300 Muγ肿瘤的Nu/nu小鼠，其它小鼠仅接受tTF219(■)或稀释剂(PBS，O)。1周后重复治疗。治疗的那天以箭头表示。每天测量肿瘤，计算肿瘤体积(+一个标准偏差)。每个治疗组含有7至10只小鼠。垂直轴表示平均肿瘤体积(cm3)，水平轴表示第一次治疗后的天数。
图19：通过表鬼臼毒素吡喃葡糖苷增强免疫球蛋白-tTF的抗肿瘤活性。用tTF219与“载体”双特异性抗体Mac51 Fab’/10H10 Fab的复合物(■)单次静脉内注射皮下携有L540人Hodgkin肿瘤的SCID小鼠，另一些小鼠在用免疫球蛋白-tTF缀合物治疗的前2天，前1天和当天腹膜内接受480μg表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(▲)，又一些小鼠仅接受表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(O)或稀释剂(PBS，Δ)。每天测量肿瘤，计算肿瘤体积(+一个标准偏差)。垂直轴表示平均肿瘤体积(cm3)，水平轴表示治疗后的天数。
图20：因子VIIa增强血浆凝血。室温下用识别I-Ad和tTF的“捕获”双特异性抗体B21-2/10H10处理A20淋巴瘤细胞(I-Ad阳性)。洗涤细胞，以因子VIIa下列浓度范围仅加入tTF219(O)或加入tTF219和因子VIIa：0.1nM(■)；0.3nM(●)；0.9nM(Δ)；2.7nM(▲)；和13.5nM(+)(浓度，M；水平轴)。洗涤细胞，升温至37℃。加入钙和柠檬酸盐化的小鼠血浆，记录第一条血纤蛋白链形成的时间(凝血时间，秒；垂直轴)。
图21：细胞相关的tTF219(W158R)和tTF219(G164A)突变体使小鼠血浆微弱凝血。室温下用识别I-Ad和tTF的“捕获”双特异性抗体B21-2/10H10处理A20淋巴瘤细胞(I-Ad阳性)。洗涤细胞，以一定的浓度范围加入tTF219(O)，tTF219(W158R)(●)或tTF219(G164A)(□)(浓度，M；水平轴)。洗涤细胞，升温至37℃。加入钙和柠檬酸盐化的小鼠血浆，记录第一条血纤蛋白链形成的时间(凝血时间，秒；垂直轴)。
图22：通过因子VIIa恢复突变体tTF219(G164A)和(W158R)的凝血诱导活性。室温下用识别I-Ad和tTF的“捕获”双特异性抗体B21-2/10H10处理A20淋巴瘤细胞(I-Ad阳性)。洗涤细胞，对细胞不处理(Δ)或用tTF219(O)；tTF219(G164A)(■)或tTF219(W158R)(●)处理；各加入一定浓度范围的因子VIIa(浓度，nM；水平轴)。洗涤细胞，升温至37℃。加入钙和柠檬酸盐化的小鼠血浆，记录第一条血纤蛋白链形成的时间(凝血时间，秒；垂直轴)。
图23：tTF219：VIIa和tTF219(G164A)：VIIa复合物在携有HT29人结肠癌的小鼠中的抗肿瘤活性。从左至右的条表示：盐水(1)；tTF(2)；因子VIIa(3)；tTF+因子VIIa(4)；G164A(5)；和G164A+因子VIIa(6)。垂直轴表示所测肿瘤坏死的平均百分比。序列概述
SEQ ID NO：1     tTF219的氨基酸序列
SEQ ID NO：2     H6-N’-cys-tTF219的氨基酸序列
SEQ ID NO：3     H6-tTF219-cys-C’的氨基酸序列
SEQ ID NO：4     N’-cys-tTF219的氨基酸序列
SEQ ID NO：5     tTF219-cys-C’的氨基酸序列
SEQ ID NO：6     H6-tTF220-cys-C’的氨基酸序列
SEQ ID NO：7     H6-tTF221-cys-C’的氨基酸序列
SEQ ID NO：8     tTF219(W158R)的氨基酸序列
SEQ ID NO：9     tTF219(G164A)的氨基酸序列
SEQ ID NO：10    tTF的cDNA序列
SEQ ID NO：11    组织因子的全长基因组序列
SEQ ID NO：12    组织因子的氨基酸序列
SEQ ID NO：13    因子VII DNA
SEQ ID NO：14    因子VII氨基酸
SEQ ID NO：15    tTF扩增的5’引物
SEQ ID NO：16    tTF扩增的3’引物
SEQ ID NO：17    5’引物GlytTF互补DNA扩增引物
SEQ ID NO：18    制备tTF和连接子DNA 5’端一半部分的5’引物
SEQ ID NO：19    制备tTF和连接子DNA 5’端一半部分的3’引物
SEQ ID NO：20    制备连接子DNA 3’端一半部分和tTF DNA的5’引物
SEQ ID NO：21    制备连接子DNA 3’端一半部分和tTF DNA的3’引物
SEQ ID NO：22    构建Cys[tTF]连接子[tTF]所用的5’引物
SEQ ID NO：23    构建Cys[tTF]连接子[tTF]所用的3’引物
SEQ ID NO：24    [tTF]连接子[tTF]cys所用的5’引物
SEQ ID NO：25    [tTF]连接子[tTF]cys所用的3’引物
SEQ ID NO：26    [tTF]G164A形成所用的引物
SEQ ID NO：27    [tTF]W158R S162A所用的引物作为例证的实施方案的描述
实体肿瘤和癌占所有人类癌症的90％以上(Shockley等，1991)。在淋巴瘤和白血病疗法中研究了单克隆抗体和免疫毒素的治疗性用途(Lowder等，1987；Vitetta等，1991)，但它们在针对癌和其它实体肿瘤的临床试验中却是无效的(Byers和Baldwin，1988；Abrams和Oldham，1985)。
基于抗体的疗法无效的主要原因是大分子不易于转运至实体肿瘤中(Sands，1988；Epenetos等，1986)。甚至当这些分子进入肿瘤块时，它们也不能均匀分布，因为其中存在肿瘤细胞(Dvorak等，1991)间的紧密连接、纤维状基质(Baxter等，1991)、间质压力梯度(Jain，1990)和结合位点屏障(Juweid等，1992)。
开发治疗实体肿瘤的新策略时，涉及靶向肿瘤血管系统而不是肿瘤细胞自身的方法可提供与众不同的优点。诱导穿过肿瘤(如通过肿瘤血管系统特异性血纤蛋白形成)的血流阻塞会干扰肿瘤位点的流入和流出过程，从而导致抗肿瘤效应。通过特异性暴露于促凝剂，使肿瘤相关血管中的前促凝剂-纤溶剂平衡向凝血过程偏移，可阻止血液供应给肿瘤，因此，制备了抗体-促凝剂构建体和双特异性抗体，并已用于将促凝剂特异性传递至肿瘤环境中(WO96/01653)。
然而，对特异性的需要尽管不象免疫毒素那样要求严格，但仍然是很重要的。为了达到特异性目的，一般认为效应分子，不论是毒素还是促凝剂，都需要与靶向分子(如对肿瘤环境具有特异性的抗体或其它配体)缀合或功能性结合。这种靶向实体可针对肿瘤细胞自身，但目前认为优选使用针对肿瘤血管系统或肿瘤基质之组分的靶向分子。已鉴定出大量适当的靶向分子，所述分子在肿瘤血管系统和/或基质细胞上或环境中可特异性或优先表达、定位、吸附或被诱导。
尽管肿瘤血管系统和基质靶向方法可以十分有效，但应认识到，实施这种靶向方法学仍需要某些知识，并需要制备适当的缀合物或同等分子复合物。例如，将促凝剂靶向肿瘤血管系统时，必须鉴定出适当的血管抗原，制备可与靶抗原结合的抗体或配体，选择适当的促凝剂，将促凝剂与抗体或配体连接或形成两种组分的功能性结合，使用不会导致药剂显著地错误定向的剂量实施定位方案。尽管这种方法可以简单地和成功地实施，但人们会发现，开发包括较少的制备性步骤因此花费更少的方法学将是有利的。
本发明提供了不需要如抗体之类靶向分子而达到特异性血液凝血(如肿瘤特异性凝血)的新方法。通过施用含有凝血缺损组织因子的组合物可做到这一点，已发现尽管所述组织因子缺乏任何可识别的肿瘤靶向组分，但它可特异性地促进肿瘤血管系统的凝血。本发明使得可以将这种凝血缺损的TF组分作为改善了半寿期的TF缀合物单独施用，与常规化学治疗剂联合施用，与靶向免疫毒素或凝血配体联合施用，与因子VIIa(FVIIa)或FVIIa激活剂联合施用或与上述任何联合一起施用。A.组织因子
组织因子(TF)是凝血酶原(血液凝血)级联反应的主要起始受体(Davie等，1991)。TF是一种单链的、含263个氨基酸的膜糖蛋白(SEQ ID NO：12)，其一级序列与趋化因子受体家族(Edgington等，1991)具有结构相似性。TF是一种跨膜细胞表面受体，作为因子VIIa的受体和辅因子起作用。TF与因子VIIa结合，在细胞表面形成蛋白水解活性复合物(Ruf和Edgington，1991b，1994；Ruf等，1991，1992a，1992b)。此复合物通过有限的蛋白水解快速激活丝氨酸蛋白酶酶原因子IX和X，导致凝血酶形成并最终导致凝血(图21)。
因此，TF是外源性凝血途径的激活剂，在正常生理条件下它不与血液直接接触(Osterud等，1986；Nemerson，1988；Broze，1992；Ruf和Edgington，1994)。然而，当血管被某些细胞因子或内毒素损害或激活时，TF会通过(亚)内皮细胞(Weiss等，1989)或通过某些血细胞(Warr等，1990)暴露于血液中，然后，TF会与正常条件下以低浓度循环于血液中的因子VIIa复合(Wildgoose等，1992)，TF/因子VIIa复合物通过将因子X激活为因子Xa而起始凝血级联反应，该级联反应最终导致血纤蛋白的形成(图1)。为了发生这一系列事件，TF：VIIa复合物必须与磷脂表面结合，籍此装配含有因子IX或X的凝血起始复合物(Ruf和Edgington，1991a；Ruf等，1992c；Paborsky等，1991；Bach等，1986；Krishnaswamy等，1992；tenCate等，1993)。
只有有限数目的细胞组成型表达TF。肺和中枢神经系统含有高水平的TF活性，在肺支气管粘膜和肺泡上皮细胞以及神经系统的胶质细胞和星形胶质细胞中发现了TF。据报道，心肌细胞、肾小球、以及肠、膀胱和呼吸道的某些上皮或粘膜组织中也表达TF，因此可以看出，TF一般组成型表达于身体组织和外部环境之间的组织屏障处(Drake等，1989；Ruf和Edgington，1994)。
TF也存在于器官之间的组织边界，如肝、脾和肾的器官被膜中，TF还存在于动脉和小静脉外膜。以此方式表达TF使得TF可行使阻断内部出血的作用，因此，有必要指出的是血友病患者中作为出血主要位点的关节和骨骼肌中缺乏TF。
正常条件下，在血细胞或形成血管系统的内皮细胞表面，TF一般没有任何显著程度的表达，而通过感染性因子可诱导血管系统内的(亚)内皮细胞和单核细胞表达TF，例如，单核细胞经细胞因子和T细胞诱导可表达TF。血管系统中TF的表达一般会导致弥散性血管内凝血或血液凝块或血栓形成的局部起始。在此上下文中，值得注意的是组织受损、感染或遭到其它攻击之后必需凝血的身体所有位点都必须能得到TF，因此，所有这种组织位点应能同等地得到TF，而一般不应积存在身体的任何特定局部区域。
某些研究已描述了TF和某些类型肿瘤中致瘤性表型发展之间的联系(Ruf和Edgington，1994)。实际上，据报道，TF水平增加是恶性黑素瘤转移潜力的一个预示性指征(Mueller等，1992)。据推论凝血级联反应的普遍激活会损害血管系统，导致肿瘤细胞或肿瘤细胞衍生的小泡进入全身循环，使得这种肿瘤细胞根植下来，导致转移性肿瘤过量生长。
不论基本机理如何，上述研究使Edgington及其同事建议在癌症治疗中使用针对TF的抗体(WO94/05328)，因此，这些作者认为对TF具有结合亲和力的抗体在癌症治疗中有治疗实用性，对认为有发展为转移性肿瘤这种危险的患者尤其有用。这一意图导致人们对能产生可与人TF反应的单克隆抗体的杂交瘤进行开发(美国专利5,223,427)。
除了在癌症治疗中的用途外，也建议在抑制过量凝血中使用抗TF抗体，所述抗体也可用于治疗败血症性休克和减轻炎症反应(Morrissey等，1988；美国专利5,223,427)，或用于治疗心肌梗塞，其中抗体被用作TF拮抗剂(美国专利5,589,173)。美国专利5,589,173中特别公开了联合使用抗TF抗体和其它溶栓剂以溶解堵塞的血栓。使用这种抗体的具体方法是在其中血液要从患者体内取出的诸如心肺旁路程序的外科手术过程中抑制体外循环过程中的凝血(美国专利5,437,864)。
下文将要更完整地陈述的是(B部分)：已克隆出人TF并使用了一段时间(Morrissey等，1987；Edgington等，1991；美国专利5,110,730)。在某些早期研究中，统统被鉴定为人TF的相同蛋白质可能指的是人TF重链蛋白或TF重链。该基因编码长度为295个氨基酸的多肽前体，该前体包含具有可选择的裂解位点的肽前导序列，现在已知该前体可导致形成长度为263个氨基酸的蛋白质。据报道，人TF在CHO细胞中的重组表达可导致TF产生，据称产生的水平为已报道的重组跨膜受体在哺乳动物细胞中产生的最高表达水平之一(Rehemtulla等，1991)。
已构建出仅含有TF的细胞表面或胞外域(Stone等，1995)、而缺乏其跨膜区和胞质区的重组形式TF。这种‘截短的’TF(tTF)长度为219个氨基酸，是一种可溶性蛋白质，相对于天然跨膜TF而言，它在适当磷脂膜环境中激活因子X的活性要低约105倍(Ruf等，1991b)。这一活性差异的原因在于当与带负电的磷脂表面结合时，TF：VIIa复合物能更有效地结合并激活因子IX和X(Ruf等，1991b；Paborsky等，1991)。
尽管tTF的凝血能力显著受损，但当tTF通过一些其它方法与磷脂或膜环境结合或功能性结合时可促进血液凝血。例如，本文阐明使用将tTF与质膜抗原结合的双特异性抗体可恢复有用的凝血活性。这使得一个发明人研制出了通过使用靶向构建体将tTF或其变体特异性传递至肿瘤血管或基质而在体内特异性地使肿瘤血管凝血的方法(WO96/01653)。静脉内施用这种“凝血配体”会导致促凝剂定位于肿瘤中，在肿瘤血管中形成血栓，并最终导致肿瘤坏死。
使用例如双特异性靶向抗体-tTF组合物将促凝剂聪明地靶向传递至肿瘤血管系统这种方法的开发可被看成是对传统免疫毒素疗法的改善。实际上，这种凝血配体治疗在30分钟之内即可诱导肿瘤血管中的血栓形成，而施用免疫毒素之后大约需6小时才可达到相同效果。另外，凝血配体疗法没有显著的副作用。尽管靶向传递如tTF的促凝剂惊人地有效，但仍需要制备“靶向构建体”。
已报道对TF进行了目的非常不同的其它研究，以鉴定tTF不依赖于其与靶向试剂结合的用途。在此方面，tTF最近被认为是用于治疗如血友病之类障碍的候选药物。此项工作由在这种疗法中使用apo-TF的尝试发展起来。apo-TF是TF的去脂质化制剂，根据此分子可自发和优先地将其自身掺入或结合至损害位点所暴露的膜表面的假说，建议将它灌注到血友病患者体内。因此，推断apo-TF可能在这种疗法中有用，而不会导致显著副作用(O’Brien等，1988；美国专利5,017,556)。
建议在慢性出血障碍中使用apo-TF疗法，所述障碍的特征在于遗传性和后天性地趋向于出血。美国专利5,017,556中描述了诸如与因子VIII，IX或XI缺损相关的障碍；或与因子V，VIII，IX，XI，XII和XIII抑制剂的获得相关的障碍。人们承认，特征在于基本上缺乏组织因子天然脂质并在施用前基本上不具有前促凝剂活性的apo-TF的使用，得到的结果与推断会导致毒性的预期结果相反。目前看来美国专利5,017,556中描述的结果一般代表本领域中的异常现象，这些研究与本领域其他研究人员的工作有冲突。
实际上，在将根据上述的研究投入实践的尝试中，观察到实验动物中出现了副作用，如弥散性血管间凝血(DIC)，由此得出结论：静脉内施用apo-TF太危险以致于不能使用(Sakai和Kisiel，1990；美国专利5,374,617；5,504,064和5,504,067)。
人们并不认为可溶的截短形式TF的开发能解决与TF或apo-TF相关的问题，例如，现已不考虑将tTF作为TF的替代物，因为当用正常血浆检测时，tTF几乎没有前促凝剂活性(Paborsky等，1991；美国专利5,374,617)。
因此，在本发明之前，tTF潜在的用途仅局限于使用例如抗体靶向传递tTF，当与恢复充足活性必需的其它辅助分子联合使用时，tTF可能的用途被局限于治疗有限数量的障碍(美国专利5,374,617)。在某些受限的环境中，已通过将tTF的使用与凝血因子因子VIIa的施用联合起来而利用了第二种可能性。因子VIIa和tTF的联合使用导致恢复了足以使此联合用于治疗出血障碍(如血友病)的凝血活性。然而，与WO96/01653中讨论的如tTF的促凝剂的靶向传递形成对照的是，tTF和因子VIIa联合疗法未包括特异性靶向的概念，因此，该疗法被建议仅用于治疗凝血受损的患者(美国专利5,374,617；5,504,064和5,504,067)。
最易于用这种受损凝血机制表示的患者组是血友病患者，包括血友病A和血友病B患者，和针对凝血因子的抗体滴度比较高的患者。另外，已建议将tTF和因子VIIa联合疗法用于治疗具有严重创伤、手术后出血或甚至硬变的患者(美国专利5,374,617；5,504,064和5,504,067)。在这些疗法中，通过灌注全身性施用和局部施用都被推荐使用。因此，这些疗法可以被看成是用两种凝血类型的“因子”补加至体内以克服对凝血级联反应中这些或其它相关分子的任何天然限制，从而阻断特定位点的出血。
Roy等人也建议使用某些组织因子突变体治疗心肌梗塞，特别是预防冠状动脉的再堵塞(美国专利5,346,991)。照此，组织因子突变体是被用作“溶栓剂”，被描述为能裂解血纤蛋白-血小板血栓以使血液重新流过受影响血管的药物。所述TF突变体被设计为能中和内源性TF的作用，它们在心肌梗塞疗法中的用途是允许早期再灌注，防止重新堵塞，因而限制组织坏死。
再造上文所述天然环境的人工方法与天然过程有关，其中组织因子被描述为可在器官之间的边界组成型存在以使其行使起始分子的功能，从而阻止出血。然而，当然需要在不会将凝血途径的平衡倾斜为广泛凝血的情况下达到这种对血友病患者的出血进行限制的目的，因为广泛凝血对这种患者是有害的，它会抑制对有问题的特定组织或器官的氧供给。因此，tTF的广泛循环和活性是不合乎需要的，实际上从上述研究中看，也不希望这种现象发生。
尽管tTF以前未显示出具有任何优先定位于给定位点的能力，并且已知相对于天然全长的组织因子而言，tTF的凝血能力大大减小，但本发明阐明了当给患有实体肿瘤的动物全身性施用tTF时，tTF会诱导肿瘤血液供给的特异性凝血，导致肿瘤退化。因此，本发明的各个方面均基于tTF能使肿瘤血管选择性形成血栓这一发现。A1.凝血缺损的TF
本发明人在使用tTF作为对照的抗体-促凝剂(“凝血配体”)肿瘤靶向研究过程中惊奇地发现：tTF特异性地定位于肿瘤内足以导致抗肿瘤效应。由此最初的发现，本发明人发展了本文公开的本发明的多个方面。因此，由第一次使用的最初的tTF发展了本发明可用的组织因子化合物或构建体，这样，目前可使用多种TF构建体，包括很多不同形式的tTF，较长但仍缺损的TF，突变体TF，经修饰或缀合而改善了其半寿期的任何截短的、变异的或突变的TF，及其所有功能等价物。然而，应理解本发明可用的各个TF构建体由“凝血缺损”这一需求统一。如下文详述，在设计候选的凝血缺损TF时，有多个结构上的考虑可被使用，可使用多种测定法进一步证实候选TF确实适用于本发明的治疗方面。假如使用例如分子生物学产生多种化合物的技术是本领域技术人员熟知的常规技术，并且假如本文提供了深入的结构和功能指导，普通技术人员在本发明上下文中应易于制备和使用大量不同的凝血缺损TF。
如本文中详述，多种TF中的任一种或多种也可以与其它药剂联合用于实体肿瘤和与前血栓形成性血管相关的其它疾病的有利治疗。除了与如外科手术和放射疗法这类标准疗法联合外，本发明的凝血方法也可与施用典型的化学治疗药物，其它免疫毒素或凝血配体联合，或可与另外的凝血因子，如因子VIIa联合。
假定本发明的联合疗法有望得到相加的、增强的甚或协同的抗肿瘤效应，本领域技术人员也易于意识到在本发明的上下文中仍然可使用在本文所述的体外和体内试验中具有弱于最适之特性的TF构建体。例如，候选的凝血缺损TF构建体可具有针对本文推荐范围的较低端的凝血活性，这种分子仍证实可与化学治疗剂、凝血因子或其它抗癌剂联合使用。同样，在使用实验动物的细致体内研究后及以低剂量开始的临床研究中，被认为具有足以导致副作用顾虑的高凝血活性的候选凝血缺损TF构建体仍证实是有用的。因此，提供下列有关凝血缺损TF分子的指标仅是为了举例，本领域技术人员易于理解不与本文提供的结构和数量指标精确吻合的TF分子在本发明上下文中仍具有显著的治疗实用性。尽管确定这一事实一般经常需要在动物体内进行试验，但这种试验对于本领域技术人员而言是常规的，仅需要给药和监测。A2.对凝血缺损TF结构上的考虑
本领域技术人员易于理解可用于本发明的TF分子实质上不能够是天然的TF。这是很显然的，因为天然TF及其密切相关的变体对促进凝血特别有效。这样，给动物或患者施用这类分子后，会导致广泛凝血并会致死，因此，应避免使用完整的天然TF制剂。同样，也不能相信通过操纵其物理环境而调节TF活性的尝试在本发明的上下文中会特别富有成效。例如，应该避免使用O’Brien及其同事的apo-TF法(1988)，因为使用该方法预期会导致DIC。
本文提供的图2是涉及天然TF分子域的指导性模型。本发明的目的是提供实质上不与质膜结合的TF分子。通常，截短分子是得到不与膜结合的经修饰的TF的最直接方法。下文将更详细地描述这些类型的截短构建体，然而，分子的实际截短或缩短不是产生有效TF变体的唯一机制。例如，可在分子中正常跨越膜的C末端区域导入突变，以防止适当的膜插入。可通过插入多个其它氨基酸，或将已存在的残基进行突变来达到这种膜驱逐，因此，在此方面可考虑的修饰是可降低分子C末端部分疏水性而使此区域的热动力学特性不再有利于膜插入的那些修饰。
在考虑对天然TF分子进行结构上的修饰时，本领域技术人员应能意识到需要保留分子中足以使所得TF变体能行使促进至少一些凝血功能的重要部分。一项重要考虑是TF分子应基本上保留其结合因子VII或因子VIIa的能力。参照图2，可看出VII/VIIa结合区域一般是分子的中间部位，因此，本发明建议使用的所有TF变体应基本上保留这种区域。下文将更详细地讨论此结合区域的具体位置和突变体或单独或与其它药剂联合的任选使用。
然而，估计天然TF N末端区域的某些序列部分并非必需，因此，可在此区域中导入突变，或可使用缺失突变体(N末端截短)作为本文使用的候选TF分子。根据这些指导，本领域技术人员会理解下列例举的截短的、二聚体的、多聚体的和突变的TF构建体绝非限制性的，其它很多功能等同的分子也是易于制备和使用的。A3.例举的凝血缺损TF构建体
下列例举的包括截短的、二聚体的、多聚体的和突变形式的组织因子组分可以以独特的多肽存在，或者也可如下文所述与如免疫球蛋白之类的惰性载体缀合。i.截短的组织因子
本文中，就TF所用的术语“截短的”指的是缺乏某些氨基酸序列的特定TF构建体，因此，术语“截短的”指的是长度较短的组织因子构建体，该术语将这些化合物与膜连接或结合降低了的其它组织因子构建体区分开。因此，尽管经修饰但基本上为全长的TF可能被认为是截短的TF的功能等价物(“功能上截短的”)，但本文所用术语“截短的”的典型含义是指除去了的氨基酸序列足以影响特性改变，从而使TF分子变成膜结合缺损型。
因此，截短的TF蛋白或多肽相对于天然组织因子而言，已从分子中除去足够数量的跨膜氨基酸序列，从而不同于天然TF。在此上下文中的“足够数量”是原本足以使TF分子进入膜，或者介导TF蛋白与膜功能性结合的跨膜氨基酸序列的量。因此，除去这种“足够数量的跨膜跨越序列”产生了磷脂膜结合能力缺损的截短组织因子蛋白或多肽，从而使该蛋白质实质上是可溶性的蛋白质，其不与磷脂膜显著结合，在标准的TF试验中基本上不能将因子VII转变为因子VIIa，但仍保留了所谓的催化活性，包括在因子VIIa的存在下激活因子X的活性。美国专利5,504,067特别地列入本文作为参考以进一步描述这种截短的组织因子蛋白。
下文将描述特定的截短组织因子构建体的制备。优选用于本发明的组织因子一般缺乏蛋白质的跨膜和胞质区(SEQ ID NO：12的氨基酸220-263)，然而，截短的TF分子不必局限于长度为219个氨基酸的分子，因此，也可使用长度约为210至约230个氨基酸的构建体，具体地说，构建体的长度可以是约210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229或约230个氨基酸。通常，应理解这一意图是从截短的分子上实质上缺失约23个氨基酸的跨膜区，因此，在长度长于约218至222个氨基酸的截短TF构建体中，其后的重要序列部分一般由形成天然TF分子胞质区域的约21个氨基酸组成。在这一点上，截短的TF构建体的长度可以约为231，232，233，234，235，236，237，238，239，240或241个氨基酸。
在某些优选的实施方案中，tTF可称为成熟组织因子蛋白的胞外域，因此，在例举的优选实施方案中，tTF可具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，该序列含有成熟蛋白质(SEQ ID NO：12)的残基1-219。SEQ ID NO：1可由例如SEQ ID NO：10编码。当然，SEQ ID NO：1仅是tTF的一个例子，如本文所公开，衍生自核酸序列SEQ ID NO：11或相关序列、具有所需的对因子VII或因子VIIa高亲和结合特性并具有一般性降低的前凝血辅因子活性的任何组织因子蛋白都是有用的。ii.二聚体组织因子构建体
以前已表明J82膀胱癌细胞表面上的天然组织因子可以以二聚体的形式存在(Fair等，1987)。一个因子VI I或因子VIIa分子与一个组织因子分子的结合也可能便于另一个因子VII或因子VIIa与另一个组织因子的结合(Fair等，1987；Bach等，1986)。另外，组织因子显示出与细胞因子受体家族成员的结构同源性(Edgington等，1991)，一些所述受体可二聚体化而形成活性受体(Davies和Wlodawer，1995)。因此，估计本发明截短组织因子组分的二聚体可能是有用的。
因此，可以二聚体形式制备本文所述的任何截短的、突变的或凝血缺损的组织因子构建体或其等价物以用于本发明。本领域技术人员应知道，利用分子生物学和重组表达的标准技术可制备这种TF二聚体，其中两个编码区被制成读框一致的形式，并由表达载体表达。同样，也可使用多种化学缀合技术制备TF二聚体，缀合前可对单个TF单体进行衍生化。上述所有技术都是本领域技术人员熟知的。
如有必要，可通过生物学可释放键，如可选择性裂解的连接子或氨基酸序列连接组织因子二聚体或多聚体。例如，可使用肽连接子，该连接子包括优先定位于肿瘤环境或在该环境中具有活性的酶的裂解位点。这种肽连接子的形式例如是可被尿激酶、纤溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa或金属蛋白酶(如胶原酶，明胶酶或溶基质素)裂解的肽连接子。
在某些实施方案中，组织因子二聚体可另外含有受阻的疏水性膜插入部分，以在后来促进组织因子与磷脂膜的功能性结合，但仅在某些确定的条件下才会如此。如在截短组织因子的上下文中所述，疏水性膜结合序列一般是因其疏水特性而可促进与磷脂环境结合的一段氨基酸序列。同样，也可使用脂肪酸提供潜在的膜插入部分。这种膜插入序列可位于TF分子的N末端或C末端，或连接在分子的任何其它位点，只要这种连接不会阻碍TF构建体的功能特性即可。受阻的插入部分的含义是它能维持无功能，直至TF构建体位于肿瘤环境内，并使得可以达到疏水性附着，甚至可进一步地促进与膜的物理结合。同样，估计在这一点上生物学可释放键和可选择性裂解的序列也特别有用，所述键或序列仅在定位于肿瘤环境内并暴露于特定酶或其它生物活性分子才被裂解或修饰。
例如，发明人已构建了对应于C’-cys-tTF219二聚体(SEQ IDNO：3的二聚体)，C’-cys-tTF220二聚体(SEQ ID NO：6的二聚体)，C’-cys-tTF221二聚体(SEQ ID NO：7的二聚体)，和H6-N’-cys-tTF219二聚体(SEQ ID NO：2的二聚体)的二聚体tTF。然而，现在应懂得上述各个序列仅是举例，而不以任何方式限制本发明可产生和使用的二聚体结构。iii.三聚体和多聚体组织因子构建体
在其它实施方案中，本发明的tTF构建体可以是多聚体或聚合体。在此上下文中，“聚合体构建体”含有3或多个本发明的组织因子构建体。“多聚体或聚合体TF构建体”是含有第一个TF分子或衍生物与至少第二个和第三个TF分子或衍生物有效结合的构建体，优选其中所得的多聚体或聚合体构建体与野生型TF相比仍是凝血活性缺损型。在优选实施方案中，可用于本发明的多聚体和聚合体TF构建体是截短TF分子的多聚体或聚合体，它可任选地与其它凝血缺损的TF构建体或变体联合。多聚体可含有约3至20个这种TF分子，优选含有约3至约15或约10个，最优选含有约3至约10个这种TF分子。一般，本发明包括至少约3，4，5，6，7，8，9或10个左右这种TF分子的TF多聚体。必要时，多聚体或聚合体中的各个TF单位也可通过选择性裂解的肽连接子或其它生物学可释放的键连接。同样，与上文就TF二聚体论述的一样，使用重组操作和表达或使用标准的合成化学可很容易制备构建体。iv.因子VII激活突变体
在本发明上下文中有用的其它TF构建体是激活因子VII的能力缺损的突变体。这种突变体实用的基础在于这样一个事实，即它们也是“凝血缺损的”。本文中将这种“因子VII激活突变体”一般确定为可结合功能性因子VII/VIIa、蛋白水解性地激活因子X、但基本上不具有蛋白水解性地激活因子VII的能力的TF突变体。因此，这种构建体是缺乏因子VII激活活性的TF突变体。
这种因子VII激活突变体促进肿瘤特异性凝血的功能是基于TF构建体定位于肿瘤血管系统和血浆中低水平因子VIIa的存在。施用这种因子VII激活突变体后，该突变体与本发明的任何TF构建体一样，一般会定位于血管化肿瘤的血管系统内。定位前，由于其不能将因子VII转变为因子VIIa，因此TF突变体一般不能促进任何其它身体部位的凝血，然而，定位和积累于肿瘤区域内后，突变体会遇到足够的血浆中的因子VIIa，从而起始外源性凝血途径，导致肿瘤特异性血栓形成。
下文将更完整地描述，最优选使用的因子VII激活突变体是与因子VIIa的共同施用相联合。尽管如上文所述，这种突变体本身是有用的，但如果已知因子VIIa在血浆中仅以低水平存在(约1ng/ml，而血浆中的因子VII约为500ng/ml)，则突变体一般达不到最佳活性(美国专利5,374,617；5,504,064和5,504,067)。因此，共同施用外源性因子VIIa和因子VII激活突变体非常优于仅施用突变体。若希望这些突变体几乎没有副作用，则它们与因子VIIa的同时、之前或之后施用的联合使用是本发明特别有利的方面。
可结合本发明的任一方面制备和使用多种因子VII激活突变体的任一种或多种。大量科学知识揭示TF分子上存在因子VII/VIIa的识别位点，例如，可参照Ruf和Edgington(199la)，Ruf等(1992c)和WO 94/07515和WO94/28017的论文，上述各文献都特别地列入本文作为参考以提供有关问题的指导。因此，可认为因子VII激活区域一般位于TF分子的约氨基酸157至约氨基酸167之间。然而，估计此区域外部的残基也与因子VII激活活性相关，因此，可以考虑在一般位于TF序列的约氨基酸106和约氨基酸209之间的任何一个或多个残基处导入突变(WO94/07515)。关于优选的区域，一般可以考虑突变氨基酸147，152，154，156，157，158，159，160，16l，162，163，164，165，166和/或167中的任何一个或多个。至于此区域外一般优选的候选突变，指的是下列氨基酸取代：S16，T17，S39，T30，S32，D34，V67，L104，B105，T106，R131，R136，V145，V146，F147，V198，N199，R200和K201，也可以考虑氨基酸A34，E34和R34(WO94/28017)。
如上所述，当指的是SEQ ID NO：12时，优选通过改变一般位于氨基酸序列内约第157位至约第167位的区域中的一个或多个氨基酸使组织因子激活因子VII的能力缺损。例举的突变体是第158位Trp变成Arg(SEQ ID NO：8)；第162位Ser变成Ala；第164位Gly变成Ala(SEQ ID NO：9)的突变体；和其中第158位Trp变成Arg和第162位Ser变成Ala的双突变体。当然这只是例举的突变，可以预想具有改变的氨基酸组成、具有所需的结合因子VII/VIIa的特性，但不激活凝血级联反应的任何组织因子突变体在本发明上下文中都是有用的。A4.凝血缺损的体外定量评估
本发明的组织因子构建体，不论是截短的、突变的、截短并突变的、二聚体的、多聚体的、与惰性载体缀合以增加其半寿期的，还是上述情况的任何组合，它们与天然野生型组织因子相比都是凝血缺损的。本文所用术语“凝血缺损”指的是TF构建体促进凝血的能力受损，这样它们施用于动物或人患者的全身性循环就不会导致显著的副作用或限制的毒性。简单地通过在实验动物中进行试验，即可容易地分析TF构建体以确定它是否符合该定义。然而，下面提供详细的指导，以帮助本领域技术人员在预先鉴定和选择适当的候选凝血缺损TF构建体时，能够有效并便宜地进行任何实验动物研究。
在定量方面，凝血缺损的TF比全长的天然TF活性要低100倍或更多，即当在适当磷脂环境中检测时，它们比全长的天然TF诱导血浆凝血的能力低100倍或更多。
更优选地，在适当磷脂环境中，缺损的TF诱导血浆凝血的能力要比全长的野生型TF低1000倍或更多；甚至更优选在这种环境中，TF诱导血浆凝血的能力要比全长的野生型TF低10,000倍或更多；最优选在适当磷脂环境中，缺损的TF诱导血浆凝血的能力要比全长的天然TF低100,000倍或更多。应理解“100,000倍”一般对应于本发明优选的构建体之一，即长度为219个氨基酸的截短组织因子(SEQ  ID NO：1)。
“诱导血浆凝血的能力低X倍或更多”这一定义的内在含义是研究对象TF仍能够诱导血浆凝血这一概念。显然，经修饰后完全不能诱导凝血的TF一般在本发明的上下文中是无用的。在受控的磷脂试验中比野生型TF活性低约500,000倍的TF估计仍然可用于本发明。类似地，在适当磷脂环境中，诱导血浆凝血的能力比全长的天然TF低约500,000倍至约1,000,000倍的所有TF变体和突变体预计在某些实施方案中仍然有用。然而，一般认为活性受损1,000,000倍(106)一般大致是本发明可考虑使用的最低活性。另外，会发现活性为所述范围的较低端的TF构建体在某些确定的治疗方案或联合疗法中可能最具实用性。本领域普通技术人员易于确定具体选择哪种TF变体和治疗策略。
尽管各个TF成分有某些优选的和/或最适的用途和联合，但本发明中可使用的凝血缺损TF一般比野生型TF活性低约100倍至约1,000,000倍；更优选低约1,000倍至约100,000倍；并可归类为活性低至所述范围中的任何数目，包括低约10,000倍。范围自身也可在约1,000倍至1,000,000倍，或约10,000倍和500,000倍或等等之间变化。
在定量检测候选凝血缺损组织因子时可使用大量体外血浆凝血活性试验中的任一种或多种，例如，测定固有的血浆凝血活性的一种方法如下所述：
1)约37℃下，在塑料管中加入约50μl血浆(人或小鼠)；
2)37℃下，加入溶于适当缓冲液(如无钙磷酸盐或HEPES缓冲盐水，pH7.4)中一定浓度范围的约50μl重新脂质化的全长TF(优选商购，如American Diagnostics Inc.，Greenwich，CT)，向其它管中加入溶于相同缓冲液中一定浓度范围的组织因子候选的截短或突变形式；
3)约37℃下，加入约50μl 30mM CaCl2；
4)纪录第一条血纤蛋白链形成的时间；和
5)绘制全长TF浓度(mol/l)对凝血时间的标准曲线，绘制候选的突变体TF浓度(mol/l)对凝血时间的曲线。通过比较达到约等于凝血时间最大降低值一半的凝血时间各自需要的浓度，计算全长TF和“受试TF”之间活性的差异。在摩尔数水平上，“受试”的突变体TF诱导血浆凝血的活性应比全长TF低100倍以上。
可进行多种类型的此类试验，这一点对本领域技术人员而言是不言而喻的。例如，可依据组织因子和候选组织因子构建体与细胞膜或磷脂表面的结合进行这些试验，这种结合是利用抗体或其它配体达到的。在这种试验中，当候选或受试的截短TF或TF突变体利用抗体或其它配体与细胞膜或磷脂表面结合时，其诱导血浆凝血的活性应比野生型TF低100倍以上。由于组织因子突变体不能使因子VII有效转变为因子VIIa，因此必需在血浆中加入因子VIIa以得到此活性水平。在例举的试验中，可使用下列方法测定这种活性：
1)在大约室温下，将处于如磷酸缓冲盐水的缓冲液中的细胞，如A20小鼠淋巴瘤细胞(I-Ad阳性)(如4×106个细胞/ml，50μl)与结合促进剂一起保温约1小时，所述促进剂如双特异性抗体(50μg/ml，25μl)，对A20细胞而言，该促进剂由与抗体(例如针对TF上非抑制性表位的10H10抗体)的Fab’臂连接的抗体(例如针对I-Ad的B21-2抗体)的Fab’臂组成；
2)制备相同的一套试管，管中含有细胞，但不含双特异性抗体或其它结合剂；
3)室温下有效地洗涤细胞(如洗两次)，将细胞重新悬浮于约50μl磷酸盐缓冲盐水中；
4)约室温下，加入不同浓度溶于磷酸盐缓冲盐水中的候选TF突变体(约50μl)。双特异性抗体或其它结合剂捕获TF突变体，并将TF突变体带到离细胞表面很近的地方。当需要确定因子VIIa存在下的活性时，除了加入TF突变体外，还应加入因子VIIa(1-10nM)。用磷酸盐缓冲盐水将每管总体积调节至约150μl。将各管置于约室温下保温约1小时；
5)将细胞升温至约37℃；
6)约37℃下，加入氯化钙(约50mM，50μl)和柠檬酸盐化的小鼠或人血浆(约50μl)；
7)记录第一条血纤蛋白链形成的时间；和
8)针对包被或未包被结合剂(如双特异性抗体)的细胞，将凝血时间(秒)对TF突变体的浓度(mol/l)作图。计算出约等于凝血时间最大降低值一半的凝血时间(通常为50-100秒)的TF突变体浓度，计算由双特异性抗体所致的凝血活性的增强，应超过100倍。
可以想象，使用类似于上述的试验可检测本发明制备的候选TF组分以证实它们的功能性得到了维持，而它们促进凝血的能力受损，活性受损必需水平是至少约100倍，优选约为1,000倍，更优选约为10,000倍，最优选约为100,000倍。
在期望其它药剂最终与候选的凝血缺损TF联合使用的实施方案中，重要的是其它因子或药剂应包括在体外试验中。特别相关的例子是分析因子VII激活突变体，优选应与加入因子VIIa相结合分析该突变体，然而，因子VIIa并非可以此方法检测的唯一添加组分。通常，其它药剂可称为“其它候选药剂”。为了鉴定其它候选药剂，或使本发明所用候选药剂的优选用量最优化，应平行进行上述试验，即先在缺乏其它候选药剂的情况下测定或确定凝血，然后在组合物中加入候选物质，重新测定凝血时间和/或程度。与TF突变体或变体联合起作用会导致整个凝血水平比用天然TF观察到的约低100倍至1,000,000倍的其它候选物质也是可用于本发明上下文中的适当联合。
本领域技术人员应理解上述每种体外试验及其各种变化形式中的每一个都较容易建立和进行。以此方式，可检测一系列候选TF变体以及TF与其它药剂的联合，选择最理想的候选药剂供进一步研究，特别是在动物或人试验中进行实验性检测。
尽管我们相信上述试验对本发明特别有用，但预计本文可使用的体外试验并不局限于这类试验，因此，可进行所需要的任何类型的凝血或前凝血试验。例如，为了进一步详细了解tTF和前凝血试验，熟练技术人员可参照美国专利5,437,864；5,223,427和5,110,730和PCT公开号WO94/28017；WO94/05328和WO94/07515，所述文献都特别地列入本文作为参考以进一步补充本发明有关试验的内容。A5.证实性的体内研究
本领域技术人员应理解，在用于人受试者之前，一般应在体内环境中检测候选的凝血缺损组织因子突变体、变体或它们与其它药剂的联合。这种在动物中进行的临床前检测是本领域的常规技术。为了进行这种证实性试验，所需要的只是为本技术领域所接受的患有所述疾病的动物模型，如携有实体肿瘤的动物。在此方面，可使用任何动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、狗、黑猩猩等。在癌症治疗方面，使用小动物(如小鼠)的研究被广泛接受用来预测在人体中的临床效力，因此在本发明上下文中优选这种动物模型，因为至少与其它实验动物相比，它们更易于得到，且相对较便宜。
进行实验动物试验的方法是本领域技术人员熟知的，进行这种试验所需要的只是建立等同的治疗组，给一个组施用受试化合物，而在其余组中对等同的动物平行进行多种对照研究。在研究过程中监测动物，最终处死动物以分析治疗效果。
本发明最有用的特征之一是可用于治疗血管化肿瘤，因此，可进行抗肿瘤研究以测定肿瘤血管系统内的特异性血栓形成和整体抗肿瘤效果。作为此项研究的一部分，也应监测效果的特异性，包括其它血管和组织中的凝血情况，还应仔细监测动物的一般健康状况。
在实体肿瘤的治疗中，预计有效的TF构建体和构建体的有效量是一般会导致血管化肿瘤内至少约10％血管表现出血栓形成，而非肿瘤血管无显著血栓形成的那些构建体和用量；优选在实体肿瘤块内观察到至少约20％、约30％、约40％、或约50％血管中有血栓形成，而没有显著的非定位的血栓形成。在治疗大肿瘤时，本发明人常规观察到了这种阳性结果。实际上，已分析的一些肿瘤中至少约60％，约70％，约80％，约85％，约90％，约95％或甚至达到并包括约99％肿瘤血管形成血栓。当然，表现出血栓形成的血管越多，这种疗法就越优选，只要对肿瘤相关的血管系统保持特异性、相对特异性或优先的效果，并且其它组织中的凝血不会明显到足以导致显著伤害动物的程度即可。
诱导肿瘤血管内的血栓形成之后，周围肿瘤组织变得坏死，因此，也可根据特异性诱导的肿瘤坏死的范围来评估本发明构建体或其剂量的成功使用。另外，可相对于身体所有其它部位健康组织的维持来评估肿瘤内细胞死亡的范围。根据本发明，当其施用会导致至少约10％肿瘤组织坏死(10％坏死)时，TF药剂、联合或最适剂量就具有治疗实用性。另外，优选在肿瘤区域内引起至少约20％，约30％，约40％或约50％坏死，而不产生显著的不利副作用。本发明人再次观察到了这种有利的效果。当然，优选使用能诱导至少约60％，约70％，约80％，约85％，约90％，约95％或甚至达到并包括约99％肿瘤坏死的构建体和剂量，只要所用构建体和剂量不会在动物中导致显著的副作用或其它不良反应即可。
本领域技术人员易于进行和适当评估上述所有测定，例如，护理专家和医生可利用得自实验动物的这些数据以使用于治疗人的适当剂量最优化。在患有晚期疾病的受试者中，可以允许存在某种程度的副作用。然而，可用更适度的剂量治疗早期疾病患者以得到无副作用的显著治疗效果。在这种实验动物研究中观察到的效果应优选在统计学上显著于对照水平，并且在不同研究中可以重复。
本领域技术人员应进一步理解，在上述有效范围的较低值端导致肿瘤特异性血栓形成和坏死的TF构建体、联合和剂量仍可以用于本发明。例如，在期望连续施用活性药剂的实施方案中，使用仅导致约10％血栓形成和/或坏死的最初剂量构建体仍是有用的，这特别是因为经常观察到这种最初的减少会“引发”肿瘤在后续的再次治疗中遭受进一步的破坏性攻击。在任何情况下，即使最终不能达到高达约40％左右的肿瘤抑制(总目标)，仍应理解对血栓形成和坏死的任何诱导仍然是有用的，因为它代表着患者状况比治疗前更有改善。
正如上文就体外检测系统讨论的那样，一般应理解欲一起使用的药剂联合应一起受检测并最优化。例如，本发明的因子VIIa激活突变体就属于这种类型，一般应与同时、之前或随后施用的外源性因子VIIa结合起来进行检测。类似地，可与一种或多种化学治疗药物、免疫毒素、凝血配体等等联合起来直接分析本发明的各个TF构建体。可根据上述指导确定和评估这些药剂的联合效果。A6.生物学功能等价物
如上文所讨论，可用于本发明的tTF组分是促进凝血的活性比野生型TF一般低至少100倍的tTF。在其它实施方案中，tTF促进凝血的活性比野生型TF低至少1000倍，在又一些实施方案中，tTF促进凝血的活性比野生型TF低至少10,000倍或甚至100,000倍，比野生型TF活性约低106倍左右是所需的最低活性。
例举的TF是缺乏跨膜和胞质区(氨基酸220-263)的TF，本发明的一例tTF由SEQ ID NO：1给出，它含有野生型组织因子(SEQ IDNO：12)的氨基酸1-219。当然这只是tTF的一个例子，其它tTF构建体也是可以的，例如，含有SEQ ID NO：12的氨基酸1-220；2-219，3-219或致使该分子缺乏野生型组织因子跨膜域和/或胞质域(否则即成为功能差不多的分子)的任何其它截短形式的构建体。如上文详述，突变体也是可以的。
使用上文提供的详细指导，可制备其它的TF等价物。可对TF的结构作修饰和改变，仍能得到具有类似或所需特性的分子。例如，某些氨基酸可取代蛋白质结构中的其它氨基酸，而在相互作用的结合能力(例如与因子VIIa的结合)方面没有明显损失。由于蛋白质相互作用的能力和特性确定了蛋白质的生物学功能活性，因此可在蛋白质序列(当然也可以是更为基本的DNA序列)中进行某些氨基酸序列取代，从而得到具有类似(激动剂)特性的蛋白质。因此，预计可在TF(SEQ ID NO：12)蛋白质和肽(或更为基本的DNA序列，SEQ IDN0：11)序列中进行多种改变，而不会使其生物学实用性或活性明显损失。
本领域技术人员也深入领会到，生物学功能等同的蛋白质或肽这一定义的内在含义是在分子确定部分内可作的、仍导致分子具有可接受水平的等同生物活性的改变数目存在限制。因此，本文将生物学功能等同的肽定义为其中某些，不是大多数或所有氨基酸可被取代的肽。当然，根据本发明可很容易制备和使用具有不同取代的多种不同的蛋白质/肽。
氨基酸取代一般基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等等。对氨基酸侧链取代基大小、形状和类型的分析揭示出精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸大小相似；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有大体上相似的形状。因此，根据这些考虑，本文将精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸确定为生物学功能等价物。
在进行更多的量变时，可考虑氨基酸的水疗指数。根据其疏水性和带电特性确定了各个氨基酸的水疗指数(hydropathicindex)，即：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域技术人员一般都懂得氨基酸水疗指数在赋予蛋白质相互作用性生物学功能方面的重要性(Kyte和Doolittle，1982，列入本文作为参考)。已知某些氨基酸可取代具有类似水疗指数或评分的其它氨基酸，而仍保留了类似的生物活性。在根据水疗指数进行改变时，优选水疗指数为±2之间的氨基酸的取代，特别优选水疗指数为±1之间的氨基酸的取代，甚至更特别优选水疗指数为±0.5之间的氨基酸的取代。
因此，应理解可用氨基酸取代具有类似亲水性值的另一种氨基酸，而仍得到生物学等价蛋白质。如美国专利4,554,101(列入本文作为参考)所述，已为氨基酸残基指定了下列亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。
在根据亲水性值进行改变时，优选亲水性值为±2之间的氨基酸的取代，特别优选亲水性值为±1之间的氨基酸的取代，甚至更特别优选亲水性值为±0.5之间的氨基酸的取代。B.组织因子多核苷酸
B1.DNA区段
编码本发明TF的多核苷酸可编码完整的TF蛋白，只要它是符合本文所述的详细指导的凝血缺损型、功能性TF蛋白域，或任何TF多肽、突变体或变体即可。无论需要制备的是截短的TF，突变的TF还是截短和突变的TF，基本有用的DNA区段和基因一般是相同的。当可得到完整TF分子的人DNA时，如果想对人进行临床治疗，一般优选使用这种人构建体。然而，也不排斥使用其它TF基因，只要所产生的蛋白质在施用于人患者时不会产生显著的免疫反应或其它不利反应即可。美国专利5,110,730中所述的方法和组合物特别地列入本文作为参考，以进一步补充申请人涉及本文可用基因和DNA区段的内容。
多核苷酸可衍生自基因组DNA，即直接由特定生物体的基因组克隆。然而，在其它实施方案中，多核苷酸也可以是互补的DNA(cDNA)。cDNA是使用信使RNA(mRNA)为模板制备的DNA，因此，cDNA不含有任何间断的编码序列，通常几乎只含有相应蛋白质的编码区。在其它实施方案中，可合成产生多核苷酸。正如本领域技术人员所知，一般优选在重组表达中使用cDNA构建体，只要这种构建体比较易于操作和使用即可。然而，也不排斥使用长达和包括全长序列的较长基因组克隆。
尽管本发明令人惊奇的特征是TF构建体能优先和特异性地定位于实体肿瘤的血管系统中，并在其中诱导特异性的抗肿瘤效应，但预计也可使用表达TF产物的重组载体将TF蛋白和多肽传递至肿瘤环境。参照涉及适当构建体和方案的某些科学文献，可很容易实践这种针对癌症治疗的“基因疗法”。例如，可以使用病毒载体，如逆转录病毒载体，单纯疱疹病毒，HSV(美国专利5,288,641)，巨细胞病毒，腺相关病毒，AAV(美国专利5,139,941)，和/或腺病毒载体。
SEQ ID NO：11中给出了TF的人基因组DNA序列，其相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：12中。如需要表达因子VII，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中分别提供了其DNA和氨基酸序列。
估计存在序列不同于本文所公开序列的TF天然变体，因此，本发明不局限于使用所提供的TF的多核苷酸序列，相反，还包括使用任何天然变体。本发明也包含应用上文所述的结构上和量化功能上的考虑之后精心设计的这些序列经化学合成的突变体。
另一种类型的序列变体由密码子变异产生。由于20种正常氨基酸中的大多数具有几个密码子，很多不同的DNA可编码TF。参照表I可鉴定这种变体。表I氨基酸                密码子丙氨酸      Ala  A  GCA  GCC  GCG  GCU半胱氨酸    Cys  C  UGC  UGU天冬氨酸    Asp  D  GAC  GAU谷氨酸      Glu  E  GAA  GAG苯丙氨酸    Phe  F  UUC  UUU甘氨酸      Gly  G  GGA  GGC  GGG  GGU组氨酸      His  H  CAC  CAU异亮氨酸    Ile  I  AUA  AUC  AUU赖氨酸      Lys  K  AAA  AAG亮氨酸      Leu  L  UUA  UUG  CUA  CUC  CUG  CUU甲硫氨酸    Met  M  AUG天冬酰胺    Asn  N  AAC  AAU脯氨酸      Pro  P  CCA  CCC  CCG  CCU谷氨酰胺    Gln  Q  CAA  CAG精氨酸      Arg  R  AGA  AGG  CGA  CGC  CGG  CGU丝氨酸      Ser  S  AGC  AGU  UCA  UCC  UCG  UCU苏氨酸      Thr  T  ACA  ACC  ACG  ACU缬氨酸      Val  V  GUA  GUC  GUG  GUU色氨酸      Trp  W  UGG酪氨酸      Tyr  Y  UAC UAU
B2.诱变
位点特异性诱变是一项有用技术，可通过特异性诱变基本的DNA而用于制备各个肽，或生物学功能等同的蛋白质或肽。通过将一个或多个核苷酸序列变化导DNA，本技术还能够很容易地用于制备和检测体现了一个或多个上述考虑的序列变体。位点特异性诱变可通过使用编码所需突变之DNA序列的特定寡核苷酸序列，以及足够数目的邻接核苷酸以提供大小和序列复杂度足以在被跨越的缺失接合处两侧形成稳定双链体的引物序列，从而产生突变体。一般优选长度约为17至25个核苷酸的引物，其中待改变序列的接合处两侧约有5至10个残基。
本领域技术人员熟知位点特异性诱变技术，应理解该技术一般利用既以单链又以双链形式存在的噬菌体载体。对位点特异性诱变有用的典型载体包括如M13噬菌体的载体。这些噬菌体载体可以商购，本领域技术人员一般熟知它们的用法。双链质粒也是位点特异性诱变中常规使用的，它省略了将所需基因从噬菌体转移至质粒这一步骤。
通常，通过首先得到单链载体，或使双链载体的两条链解链来进行位点特异性诱变，其中载体的序列中包括编码所需蛋白质的DNA序列。合成制备携有所需突变序列的寡核苷酸引物，然后将此引物与单链DNA制品退火，使用如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段之类的DNA聚合酶处理以完成携有突变的链的合成，因此，形成了异源双链体，其中一条链编码原始的未突变的序列，第二条链携有所需的突变。然后使用这种异源双链体载体转化适当的细胞，如大肠杆菌细胞，并选择包括携有突变序列排列之重组载体的克隆。
使用位点特异性诱变制备选定基因的序列变体不失为产生潜在有用类型变体的一种方式，但这并不意味着局限于此，因为还可通过其它途径得到基因的序列变体。例如，可用如羟基胺之类的诱变剂处理编码所需基因的重组载体，以得到序列变体。适当的技术也描述于美国专利4,888,286(列入本文作为参考)中。
尽管上述方法适用于诱变，但目前一般优选使用聚合酶链反应(PCRTM)，此项技术提供了快速、有效地将所需突变导入给定DNA序列中的方法。下文具体描述了如何使用PCRTM将点突变导入序列中，这可以用于改变由给定序列编码的氨基酸。此方法经改动也适于将限制性酶位点导入DNA分子。
在此方法中，可将合成的寡核苷酸设计成能在扩增区段的一个末端掺入点突变。PCRTM之后，通过用Klenow片段处理使扩增片段成为平端，然后连接平端片段并亚克隆至载体中以便于序列分析。
为了制备需要诱变的模板DNA，可使用预突变区域侧翼的限制性位点将DNA亚克隆至高拷贝数的载体，如pUC19中，然后使用质粒微量制备法制备模板DNA。使用自动合成仪合成适当的寡核苷酸引物，该引物基于母序列，但含有所需的点突变，其5’末端侧翼是限制性酶位点。一般要求引物与模板DNA有15个碱基左右是同源的。可通过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化引物，但用于PCRTM中时，并不绝对需要这么做。然后，应使寡核苷酸的5’末端磷酸化。
应使用含有所需点突变的寡核苷酸引物，通过PCRTM扩增模板DNA。扩增缓冲液中的MgCl2浓度一般约为15mM，一般应按下述进行约20-25轮PCRTM循环：95℃变性35秒；50℃杂交2分钟；72℃延伸2分钟。PCRTM一般包括于72℃，最后一次延伸循环约10分钟。最后的延伸步骤之后，应在反应混合物中加入约5个单位的Klenow片段，于约30℃再保温15分钟。需要有Klenow片段的外切核酸酶活性，以使末端成为平端并适于平端克隆。
一般通过非变性的琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳分析所得的反应混合物，以证实扩增已产生预定的产物。通过除去大多数矿物油，用氯仿抽提以除去残留的油，用经缓冲的苯酚抽提，然后用100％乙醇沉淀浓缩来处理反应混合物。接着，用在寡核苷酸所用侧翼序列处能够切割的限制性酶消化约一半的扩增片段，在低融点琼脂糖凝胶上纯化经消化的片段。
为了亚克隆片段和检查点突变，可通过平端连接将两种扩增片段亚克隆至经适当消化的载体中。然后用于转化大肠杆菌，随后使用微量制备法从中制备质粒DNA，通过DNA测序分析质粒DNA中的扩增部分以证实产生了正确的点突变，这一点是至关重要的，因为Taq DNA聚合酶也可将额外的突变导入DNA片段中。
使用连续的PCRTM步骤也可实现点突变的导入。在此方案中，使包含突变的两种片段互相退火，并通过相互引发的合成而延伸。然后通过第二个PCRTM步骤扩增此片段，从而避免上述方案中需要的平端连接。在此方法中，如上所述进行模板DNA的制备、寡核苷酸引物的产生和第一次PCRTM扩增。然而，在此方法中，选定的寡核苷酸与模板DNA应有约15至20个碱基的一段序列是同源的，它们互相之间也必须重叠约10个碱基或更多个碱基。
在第二次PCRTM扩增中，可使用各个扩增片段和各个侧翼序列引物，并使用上述条件进行约20至25轮PCRTM循环。可使用上述步骤再次亚克隆片段并检查点突变是否正确。
在使用上述任一方法时，一般优选通过扩增尽可能小的片段来导入突变。当然，也应仔细考虑如寡核苷酸的解链温度这样的参数，该参数一般受寡核苷酸的GC含量和长度的影响。本领域技术人员熟知这些方法的实施及其最优化(必要时)，有关内容进一步描述于多种出版物中，如分子生物学最新方法，1995(列入本文作为参考)。
B3.表达构建体和蛋白质的产生
贯穿本申请的术语“表达构建体”包括含有可编码基因产物的核酸的任何类型基因构建体，其内部分或全部核酸编码序列能被转录。转录物一般被翻译成蛋白质，因此，表达优选包括TF基因的转录和TF mRNA翻译成TF蛋白质产物。
目前，蛋白质生产领域的技术人员经常使用的技术是得到所谓“重组”形式的蛋白质，在重组细胞中表达该蛋白质和从所述细胞中得到蛋白质。此技术基于从DNA文库中“克隆”编码蛋白质的DNA分子，即得到不同于DNA其它部分的特定DNA分子。通过例如克隆cDNA分子，或克隆基因组类DNA分子可做到这一点。诸如此类的技术适于产生本发明的特定TF组分。下文和美国专利5,298,599(列入本文作为参考)中进一步详细讨论了重组的融合蛋白，以进一步阐明融合蛋白的生产和使用。
为了表达TF，一旦得到适当的(必要时为全长的)克隆，不论该克隆是基于cDNA还是基于基因组，都可开始制备重组生产TF所用的表达系统。可通过重组表达领域的技术人员普遍熟知的技术进行DNA区段的改造，以在原核或真核系统中表达。相信实际上任何表达系统都可用于表达这些蛋白质。
如Rehemtulla等人(1991)所述，可在真核表达系统，如CHO细胞中成功表达这种蛋白质，然而，可以想象如大肠杆菌pQE-60之类的细菌表达系统对大规模制备和随后纯化蛋白质或肽特别有用。可在细菌系统中表达编码TF的cDNA，其中编码的蛋白质被表达成与β-半乳糖苷酶、遍在蛋白、Schistosoma japonicum谷胱甘肽S-转移酶等的融合蛋白。人们相信，在易于使用和所得物质的量方面，细菌表达优于真核表达。美国专利5,298,599和5,346,991的技术也列入本文作为参考以进一步补充本文公开的可溶性组织因子的生产方法，其中美国专利5,346,99l特别地掺入以进一步补充有关组织因子突变体和变体的产生和生产方面的内容。
为了使构建体能够表达TF转录物，编码TF多核苷酸的多核苷酸应处于启动子的转录控制之下。“启动子”指的是可被宿主细胞的合成机制、或导入的合成机制识别的DNA序列，其对于启动基因的特异性转录是必需的。短语“处于转录控制之下”指的是启动子相对于多核苷酸而言处于正确的位置以控制RNA聚合酶起始和多核苷酸的表达。本文所用术语启动子指的是在RNA聚合酶II的起始位点周围成簇的一组转录控制组件。
有关微生物表达，美国专利5,583,013；5,221,619；4,785,420；4,704,362；和4,366,246被列入本文作为参考，以在本申请公开内容中进一步补充在重组宿主细胞中表达基因的有关内容。
B4.纯化组织因子和相关组分
一旦肽已被表达，可使用本领域技术人员熟知的蛋白质纯化技术分离和纯化之。如下文所述，这种组分可单独使用或与抗体，化学治疗剂和作为治疗剂的效应物配体联合使用以治疗肿瘤。本发明例举的肽示于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：9，当然，应理解这只是举例，这些序列的任何突变、改变或天然变体都可以用于本发明。
本领域技术人员熟知蛋白质纯化技术，这些技术包括细胞环境的分级分离以将所需蛋白质与混合物的其它组分分开。特别适于制备纯肽的分析方法是离子交换层析，排阻层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电聚焦等等。特别有效的纯化肽的方法是快速蛋白质液相层析或甚至是HPLC。
本领域技术人员熟知适用于蛋白质纯化的多种其它技术，这些技术包括例如用硫酸铵、PEG、抗体等或通过热变性沉淀，接着离心；进行层析，如离子交换层析，凝胶过滤层析，反相层析，羟基磷灰石层析和亲和层析；等电聚焦；凝胶电泳；和这些和其它技术的联合。正如本领域技术人员一般知道的那样，相信进行多种纯化步骤的次序可以改变，或某些步骤可省略，而仍可成为制备基本上纯化了的蛋白质或肽的合适方法。
如本文详述，纯化经表达的TF构建体以用于本发明的一般优选的技术包括产生含有亲和纯化标记物的TF分子，和使用亲和分离基质以得到与大多数或所有污染类分开的TF构建体。本领域技术人员熟知很多这种融合蛋白标记物，并且这种表达和分离方案易于实施。使用释放的蛋白质或多肽之前，也可以使用裂解原始亲和标记物的技术，通过在亲和标记物和所需蛋白质之间插入对蛋白酶敏感的连接子即可实施这项技术。这种方法学实际上可用于本发明的各个方面，美国专利5,298,599也在此方面作出说明。然而，已知很多这种标记物不会损害已表达蛋白质行使其生物学功能的能力，本发明使用TF构建体之前不必要除去标记物。C.药物组合物和试剂盒
本发明的药物组合物一般含有溶解于或分散于药理学可接受载体或含水介质中的有效量的tTF。
短语“制药学或药理学上可接受的”指的是当施用于动物或人(适当时)时，不会产生有害的、变应性的或其它不良反应的分子实体和组合物。本文所用的“制药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂，分散介质，包被剂，抗细菌和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂等等。本领域技术人员熟知这类介质和试剂对药物活性物质的应用。在此范围内，除了活性成分与任何常规介质或试剂不相容，否则，预计它们能用于治疗组合物中。补加的活性成分也可掺入组合物中。
C1.非肠道制剂
本发明的tTF经常被配制成供非肠道给药，如配制成供静脉内、肌内、皮下注射或其它这种途径，包括直接滴注至肿瘤或疾病位点。本领域技术人员参照本发明所公开的内容应知道含有靶向肿瘤的促凝剂作为活性成分的含水组合物的制备。这种组合物一般被制成可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备成适用于在注射前通过加入液体而制成溶液或悬浮液的固体形式；制品也可被乳化。
可在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备活性化合物作为游离碱或药理学可接受盐的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散剂。在普通储存和使用条件下，这些制品中含有防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包含麻油，花生油或含水丙二醇的制剂；和用于新鲜制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。所有情况下都必须是无菌形式，并且液体的流动程度必须是易于注射的。在制备和储存条件下制剂必须很稳定，必须能够防止微生物、如细菌和真菌的污染作用。
tTF组合物可配制成中性或盐形式的组合物，制药学上可接受的盐包括酸加成的盐(与蛋白质游离的氨基基团形成)，以及与如盐酸或磷酸之类的无机酸，或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成的盐。与游离羧基基团形成的盐也可衍生自如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁等无机碱，和如异丙基胺、三甲基胺、组氨酸，普鲁卡因等有机碱。
载体也可以是含有例如水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)，其适当的混合物和蔬菜油的溶剂或分散介质。通过使用包被，如用卵磷脂包被，在分散剂的情况下通过维持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂可保持适当的流动性。通过多种抗细菌和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类，氯代丁醇，苯酚，山梨酸，乙基汞硫代水杨酸钠等可抑制微生物作用。在很多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶，可延长注射组合物的吸收。
通过将于适当溶剂的所需量活性化合物与所需的多种上述其它成分混合，接着过滤灭菌，即可制备无菌的注射溶液。一般通过将多种无菌的活性成分掺入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌载体中来制备分散剂。至于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，由此从先前经无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
通过配制，可以与剂量配制相容的方式，以治疗有效的量施用溶液。可以多种剂量形式容易地施用制剂，如上述注射溶液类型，但也可使用药物释放胶囊等。
本发明的合适药物组合物一般包括与可接受的药物稀释剂或赋形剂(如无菌水溶液)混合以达到使用所需终浓度范围的一定量的凝血缺损TF。制备技术一般是本领域众所周知的，例如可参照Remington药物科学，第16版，Mack出版公司，1980(列入本文作为参考)。应理解内毒素污染应该控制到最低程度，达到安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。另外，给人施用时，制品应该符合FDA局生物制品标准所需的无菌、热原性、全面安全性和纯度标准。
使用如本文所述研究中所示的动物模型易于确定治疗有效剂量。经常使用携有实体肿瘤的实验动物使适当的治疗剂量最优化，然后才转用至临床环境。已知这种模型在预测有效的抗癌策略方面非常可靠。例如，如实施例中所用的携有实体肿瘤的小鼠被广泛用于临床前试验中。发明人已使用被本领域所接受的这种小鼠模型来确定抗肿瘤效果好、毒性最低的tTF工作范围。
除了将化合物制成非肠道给药、如静脉内或肌内注射的形式外，其它制药学上可接受的形式也是可以的，如片剂或其它供口服给药的固体，缓释胶囊，脂质体形式等。也可根据治疗的疾病使用其它药物制剂，例如，局部制剂适于治疗如皮炎和银屑病之类的病理学疾病；眼制剂适于糖尿病性视网膜病。
如本文详述，预计对凝血缺损TF构建体进行加工使其具有较长的体内半寿期会带来一些好处。这些技术包括但不限于加工或修饰TF分子自身，和使TF构建体与惰性载体(如包括免疫球蛋白和Fc部分的多种蛋白质或非蛋白质组分)缀合。本文将这类组分称为具有较长半寿期的TF构建体。应理解较长半寿期并不与“缓释”所用的药物组合物同样久远。设计缓释制剂的目的一般是想在较长的一段时间内维持恒定的药物水平。增加如本发明TF构建体之类药物的半寿期的目的是想通过给药达到较高的血浆水平，这种水平可维持较长时间，但一般根据构建体的药物动力学发生衰减。尽管TF构建体及其联合的缓释制剂在本发明中不是优选的，但本发明并不以任何方式排斥使用它们。
C2.治疗试剂盒
本发明也提供了含有本文所述tTF构建体的治疗试剂盒。这种试剂盒一般在适当的容器中含有本发明至少一种凝血缺损TF构建体的药理学可接受制剂，该试剂盒也可含有其它制药学上可接受的制剂，如含有下述的制剂：靶向tTF构建体的成分；其它的凝血因子，尤其是因子VIIa；用于例如抗原诱导的双特异性抗体，T细胞，或其它功能性成分；用于抗原抑制的成分，如环孢菌素(必要时)；独特的抗肿瘤位点抗体或免疫毒素；和一系列化学治疗药物中的任何一种或多种。
试剂盒可具有单个容器，其中含有tTF，含或不含任何其它成分，或者，试剂盒也可具有多个不同的容器，各含所需的试剂。含有制备双特异性凝血配体或免疫毒素所必需的分离成分的试剂盒也是可以的。本发明的某些优选试剂盒包括激活因子VII之能力受损的凝血缺损TF构建体，所述构建体被包装在试剂盒中以与外源性因子VIIa的共同施用联合使用。在这种试剂盒中，TF突变体和因子VIIa可以预先复合，它们或者是等摩尔量联合，或者其中一个成分比另一成分过量；或者在施用于患者之前，将试剂盒中的TF和因子VIIa组分各自分开保存于不同的容器中。其它优选的试剂盒包括任何凝血缺损TF与“典型的”化学治疗剂的联合。这是总体上适用于制备所有这类TF试剂盒和试剂盒组合的各项考虑的例子。
当试剂盒的组分在一种或多种液体溶液中被提供时，该液体溶液是水溶液，特别优选是无菌水溶液。然而，试剂盒中的组分也可以干粉末的形式供给。当各试剂或组分以干粉末的形式提供时，可通过加入适当的溶剂使粉末重溶。可以预想也可以在另一个容器中提供溶剂。
试剂盒的容器一般包括至少一只小管，试管，烧瓶，瓶，注射器或其它容器，其中注入、优选适当地等分注入tTF和任何其它所需试剂。当包括其它组分时，试剂盒一般含有第二只小管或其它容器，其中注入所述组分，使得能施用分开设计的剂量。试剂盒也可包含第二个/第三个容器以在其中装入无菌的药理学可接受缓冲液或其它稀释剂。
试剂盒也可含有可用来将tTF施用于动物或患者的容器，如一个或多个针头或注射器，或甚至是滴眼管、取液器或其它诸如此类的装置，由此可将制剂注射至动物体内或施用于身体的患病部位。本发明的试剂盒一般也可包括含有小管等和其它组件以供出售的密封容器，例如其中装入所需小管和其它装置的注射或吹气造型的塑料容器。D.治疗
D1.前血栓形成性血管
本发明提供的组合物和方法可广泛用于治疗具有作为疾病成分的“前血栓形成性血管”的任何疾病，如良性或恶性肿瘤。这种血管系统相关疾病最特别地包括实体恶性肿瘤，以及良性肿瘤，如BPH。然而，也不排除治疗糖尿病性视网膜病，血管再狭窄，动静脉畸形(AVM)，脑膜瘤，血管瘤，新血管性青光眼和银屑病；以及血管纤维瘤，关节炎，动脉粥样硬化斑，角膜移植新血管形成，血友病性关节，肥大型疤痕，osler-weber综合征，生脓肉芽肿，晶状体后纤维组织形成，硬皮病，沙眼，血管粘连，滑膜炎，皮炎，甚至是子宫内膜异位。
本发明基于TF构建体或TF与其它试剂的联合使用，其中TF构建体或其联合具有足够的凝血酶原活性以干扰特异的疾病相关血管(如血管化肿瘤之血管)中的前凝血环境，导致血栓形成。正常组织内的血管环境是溶纤性的，而肿瘤血管是前凝血性的，即更倾向于导致血栓形成。肿瘤血管中的前凝血变化部分是由内皮细胞激活细胞因子IL-1和TNFα的局部释放引起的。大多数肿瘤细胞和激活的巨噬细胞可分泌IL-1，浸润至肿瘤的宿主细胞(包括激活的淋巴细胞，巨噬细胞，NK细胞和LAK细胞)可分泌TNFα。
IL-1和TNFα诱导血管内皮细胞发生多种变化，包括上调组织因子，下调纤溶酶原激活物和上调纤溶酶原激活物的抑制剂，PAI-1(Nawroth和Stern，1986；Nawroth等，1988)。衍生自肿瘤的因子(Murray等，1991；Ogawa等，1990)，也许是VEGF使这些作用进一步放大。这些和其它变化的总结果是内皮细胞变得更能支持血栓形成，更不能溶解血纤蛋白，更倾向于导致血栓形成。
因此，鉴于上述科学现象，发明人预计，当施用凝血缺损TF时，它们具有足够的残留凝血酶原活性，能将实际上一般是前血栓形成性的血管中的凝血级联反应平衡朝血栓形成倾斜(图3)。尽管为了实施本发明不必要机械地理解科学推理，但应理解上述解释是一个机理，本发明可能通过此机理得到实现。此机理较少地基于TF在血管化肿瘤之血管内的特异性定位(这一点与其它血管相反)，但仍令人惊奇的是，TF的等量生物分布(如果实际上发生的话)居然会导致疾病位点内(如实体肿瘤内)不均等的凝血效果。假定肿瘤的固有特性一般是维持血管网络并继续血管形成进程，显然，肿瘤相关血管不可能会更倾向于导致血栓形成以致于它们自发地或容易支持凝血，因为这种凝血必然会导致肿瘤细胞的氧和营养供给受到阻断，并会导致肿瘤自我解体。这显然是不会发生的。
易于理解的是不论对在疾病相关血管中诱导特异性凝血的机理如何理解，本发明在治疗如血管化肿瘤的疾病方面具有显著的实用性，然而，发明人进一步推理出构成TF构建体可能存在的令人惊奇的作用之基础的另一种机理，即相对于身体其它组织或位点而言，TF优先选择性地结合某些血管内皮细胞(图3)。因此，注射后，tTF应选择性地结合肿瘤血管内皮细胞，这可以使它与液体表面接触，并促进肿瘤血管内凝血起始复合物的装配。可能由于肿瘤血管的前血栓形成特性，使因子VIIa，IXa，Xa，组织因子途径抑制剂(TFPI)或其它可与TF相互作用的分子的局部浓度有所增加，因此促进了定位。
使用本发明的方法，通过标记tTF，将它注射至携有肿瘤的小鼠体内，测定它是否确实定位于肿瘤血管中，即可检测tTF的定位。尽管在科学上有兴趣，但假定不论构成此现象之基础的精确作用机理如何，施用凝血缺损的TF构建体都可有利地导致特异性的抗肿瘤效果，则本发明实施中就没必要进行这种研究。
凝血缺损TF分子促进前血栓形成性血管凝血的本发明的用途不同于以前就TF构建体(如与因子VIIa联合的tTF)推荐的用途。tTF和因子VIIa曾被建议联合用于治疗出血障碍，如血友病(美国专利5,374,617；5,504,064；和5,504,067)。美国专利5,346,991和5,589,363中也描述了在治疗心肌梗塞时使用K165A和K166A TF突变体抑制凝血，并提供了生产这些TF突变体的重组DNA序列和载体。
应直接意识到前一方法学的目标与本发明所针对的前血栓形成性血管截然相反。“前血栓形成性”血管处于更倾向于凝血的动力学状态，但其中凝血不会发生于自然环境中。这种血管例如是血管化肿瘤内分类为前血栓形成性的，但肿瘤内维持了足够的血液供应以支持肿瘤的维持和过度生长。与之形成对照的是，具有出血障碍的个体内的靶位点支持凝血的能力本质上显著缺损。主要用于血友病患者的tTF和因子VIIa联合方法学也被建议用于控制术后出血或者其中外来攻击使必需的凝血过程失效的严重外伤。这又不类似于本发明的意图。
相信本发明最重要的用途是治疗血管化恶性肿瘤。然而，除了上述多种疾病和障碍外，本发明也包括用于其它良性生长的疗法。良性生长的具体例子是良性前列腺增生(BPH)，根据下文所述的特定剂量和治疗方案可治疗该疾病。BPH的治疗也可与本领域最近实践的其它治疗联合，例如，当然也包括将免疫毒素靶向定位于BPH内的标记物，如PSA。
D2.癌症和治疗
最优选将本发明的tTF定位和特异性凝血开发用于tTF治疗癌症和肿瘤的治疗用途。这些应用中可只使用tTF或与化学治疗剂和/或免疫毒素或凝血配体联合使用tTF。本发明提供的组合物和方法可广泛用于治疗具有血管成分的任何恶性肿瘤。典型的血管化肿瘤是需要血管成分提供氧和营养的实体肿瘤，尤其是癌。使用本发明可治疗的实体肿瘤的例子包括但不限于肺癌，乳腺癌，卵巢癌，胃癌，胰腺癌，喉癌，食道癌，睾丸癌，肝癌，腮腺癌，胆道癌，结肠癌，直肠癌，宫颈癌，子宫癌，子宫内膜癌，肾脏癌，膀胱癌，前列腺癌，甲状腺癌，鳞状细胞癌，腺癌，小细胞癌，黑素瘤，神经蚀质瘤，成神经细胞瘤等。
预期本发明也可用于治疗患有实体肿瘤的任何患者，然而，由于本发明可特别成功地用于治疗中等大小或大的实体肿瘤，因此，用本文提供的方法和组合物进行治疗，可能会使这类患者得到更显著的好处。一般说来，本发明可用于治疗约0.3-0.5cm和更大的肿瘤，但本发明较好的应用是治疗大于0.5cm的肿瘤。根据在可接受的动物模型中进行的研究，相信约1.0或约1.2cm的肿瘤代表本发明TF构建体能最有效进攻的实体肿瘤大小。因此，携有大小约为1.0至约2.0cm之肿瘤的患者是本发明TF疗法中的优选治疗组患者，但也可治疗大到并包括在人体中发现的最大肿瘤的肿瘤。
尽管本发明一般并不打算用作防治性或预防性治疗，但本发明的应用当然也不局限于治疗患有中等大小或大肿瘤的患者。有很多推论构成本发明广度方面的基础。例如，中等大小或更大的初期肿瘤患者也可能具有多个被认为是小的或甚至处于转移性肿瘤根植较早期的其它转移性肿瘤。如果本发明的TF构建体和联合广泛施用于患者的全身循环中，则它们自然对次生的、较小的和转移性的肿瘤也具有效果，尽管这并不是治疗的主要意图。另外，甚至在肿瘤块作为一个整体是单个小肿瘤的情况下，使用本发明的疗法也会产生某些有利的抗肿瘤效果。
上文有关使用本发明的最适患者的指导旨在说明某些患者分布图可能有助于选择本发明可治疗的患者，或使用其它抗癌治疗策略可更好地治疗的患者。不过，某类患者中存在更优选或更有效的疗法这一事实不会以任何方式否定本发明治疗患有血管化肿瘤的所有患者这一基本用途。进一步的考虑是，本发明的TF疗法所提供的对肿瘤的最初攻击的任何可测和即时效果可能较小，但可使肿瘤易接受更进一步的治疗，从而使后续治疗能够达到整体的协同效应甚或导致全面缓和或治愈。
不能相信任何特定类型的肿瘤要排除在使用本发明的疗法之外。由于该疗法的意图是使肿瘤血管系统凝血，又因为所有实体肿瘤中的血管系统基本上或完全相同，因此应理解本发明的方法学可广泛或全面地用于治疗所有实体肿瘤，而不论肿瘤细胞自身的特定表型或基因型如何。然而，肿瘤细胞的类型可能与本发明和第二种治疗剂，特别是抗肿瘤细胞免疫毒素和/或凝血配体的联合使用相关。
本领域技术人员应理解某些类型的肿瘤更适于使用本发明诱导血栓形成和坏死。在实验动物中观察到这一现象，这在人治疗中也可能发生，例如，已知HT29模型肿瘤系统相对较难凝血；而C1300肿瘤模型一般更加适于诱导血栓形成和随后的坏死。在实验动物体内进行临床前研究和对治疗任何特定患者或患者组的剂量进行最优化时都要考虑到这些因素。
如上文涉及体内定量研究的讨论中所述，有实际的目标可用作进行临床治疗之前的临床前试验的指标，然而，相对于全面的实用性而言，这更是一件花费少的事，并且是选择最有利的化合物和剂量的一种机制。有关它们的基本实用性，可导致任何持续可测的血栓形成和抗肿瘤效应的任何构建体或其联合仍可确定为有用的发明。应可在约10％至约40-50％的肿瘤血管和肿瘤组织中观察到血栓形成和坏死效应，可观察到的这种效应可高达约50％至约99％。也应理解，甚至在TF构建体及其联合的抗肿瘤效应接近上述范围的最低值的情况下，相对于针对特定肿瘤目标的所有其它已知疗法而言，此疗法可能仍同样有效或甚至更有效。不幸的是，临床医生显然知道某些中期或晚期肿瘤不能得到有效治疗，但仍不能否定本发明疗法的实用性，特别是当该疗法与普遍建议的其它策略一样有效时更是如此。
设计凝血缺损TF构建体及其联合的适当剂量时，由本文所述的动物研究可很容易推断出临床施用所需的适当剂量。为了达到这一转换，应考虑每单位重量的实验动物施用的药剂量，还应考虑实验动物和人患者之间的身体表面积差异。所有这种计算对本领域技术人员而言是众所周知和常规的。例如，若每只小鼠(总体重约为20g)采取的成功剂量为16μg，采用上文所述的计算，即可得出可用于人患者的相当剂量约为2mg。因此，使用此资料，发明人估计可用于人施用的凝血缺损TF的有用剂量为每个患者约0.2毫克至200毫克TF构建体。除了所提及的范围外，应理解，根据上文提供的参数和详细指导，本发明也包含对活性或最适范围作进一步改变。
因此，估计剂量一般约为0.2mg至180毫克；约0.5至160毫克；约1至150毫克；约5至125毫克；约10至100毫克；约15至80毫克；约20至65毫克；约30至50毫克；约40mg；或使用上述任一例举的剂量或特定范围内的任何中间值的任何特定范围。尽管本发明优选1mg，2mg，3mg，4mg和约5mg左右的剂量，但应理解，较低的剂量更适于与其它药剂联合，并且也可耐受高剂量，尤其是用于本发明的TF药剂自身无细胞毒性时，而即使存在某些不利的副作用，也不会必然导致不能被正常的稳态机制抵制的凝血，相信这可以使对健康组织显著毒性的机会变小。
本发明治疗方案的意图一般是产生最大的抗肿瘤效应，同时将剂量保持在与不可接受的毒性相关的水平之下。除了改变剂量本身以外，也可以改变施用方案以使治疗策略最优化。本发明优选的治疗策略是在约7天的期间内，服用约0.2mg至200mg TF构建体或其联合约3次。例如，可在约第1天，第3或4天和第6或7天给药。至于施用特定剂量自身，优选给患者全身性提供制药学上可接受的组合物。一般优选静脉内注射，最优选的方法是在约1或2小时左右的时间内进行连续灌注。尽管在使用本发明治疗前不需要确定这种参数，但应说明的是，本文所述的各项研究中，在注射约30分钟内，即在实体肿瘤的血管中特异地观察到至少一些血栓形成，并且肿瘤细胞自身在约3至4小时内开始死亡。一般在下面的约24小时内可观察到广泛的肿瘤坏死，其中可观察到高达90％及以上的坏死。E.联合疗法
本发明的方法可与一般用于治疗患者表现出的特定疾病或障碍的任何其它方法联合。例如，在治疗实体肿瘤方面，本发明的方法可与常规方法，如外科手术，放射性疗法等联合使用。只要特定的治疗方法自身不是有害的，或与TF疗法的效力相抵消，即可与本发明联合应用。当一种或多种药剂与TF疗法联合使用时，联合的结果不需要是独立进行各个治疗时所观察到的效果的加成，尽管这显然是合乎需要的，也不特殊要求联合治疗表现出协同效应，尽管这当然是可能的和有利的。
至于外科手术，任何外科手术干预都可以与本发明联合实践。在放射性疗法方面，涉及可在肿瘤细胞内局部诱导DNA损害的任何机制，如γ-照射，X射线，UV照射，微波，甚至电子发射等。也包括将放射性同位素直接运送至肿瘤细胞中，这可以与靶向抗体或其它靶向方式联合使用。已证实细胞因子疗法是联合治疗方案的有效成员。多种细胞因子可用于这种联合方法中，细胞因子的例子包括IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，TGF-β，GM-CSF，M-CSF，G-CSF，TNFα，TNFβ，LAF，TCGF，BCGF，TRF，BAF，BDG，MP，LIF，OSM，TMF，PDGF，IFN-α，IFN-β，IFNγ。根据与如患者状况和细胞因子相对毒性之类临床指征一致的标准方案施用细胞因子。
E1.化学治疗联合和治疗
在某些实施方案中，本发明显示，当与化学治疗剂联合施用时，tTF的抗肿瘤活性有所增强。药物增强tTF的抗肿瘤活性的机理尚未被精确确定，但本发明人相信，药物可杀死增殖中的肿瘤细胞，产生会导致吞噬细胞浸润肿瘤的坏死区域。由浸润细胞释放的IL-1，TNFα和其它细胞因子再激活肿瘤血管内皮，使其更能支持由一般为较弱凝血酶原的tTF所致的凝血，因此，药物增强了tTF的血栓形成作用。
TF和抗癌药物作用增强的另一种可能性是tTF诱导了肿瘤血管内形成血栓，从而将药物捕获在肿瘤内。尽管从身体其它部位清除了药物，但它仍存在于肿瘤内，因此，肿瘤细胞暴露于更高浓度的药物中达更长时间。将药物捕获于肿瘤内也可降低药物的剂量，使治疗更为安全有效。
不论获得增强的肿瘤破坏的机理如何，本发明的联合治疗方面对有效治疗疾病具有明显的实用性。为了将本发明与施用化学治疗剂联合使用，可以能在动物体内有效导致联合抗肿瘤作用的方式，简单地给动物施用凝血缺损的TF构建体与化学治疗剂的联合。因此，应以有效的量和能有效导致它们联合存在于肿瘤血管系统内和在肿瘤环境中联合作用的时间提供这些药剂。为了达到这一目的，可以单个组合物或作为使用不同施用途径的两种不同组合物给动物共同施用TF和化学治疗剂。
或者，可以在化学治疗剂治疗之前或之后间隔数分钟至数周进行TF治疗。在分开给动物施用化学治疗因子和TF的实施方案中，一般应确保每次给药之间间隔时间并不太长，以使化学治疗剂和TF组合物仍能对肿瘤产生有利的联合效应。在这种情况下，预计肿瘤与两种药剂将在约5分钟至约1周内互相接触，更优选在约12至72小时内互相接触，最优选延迟时间仅为约12至48小时。在一些情况下，各次给药间隔时间为几天(2，3，4，5，6或7)或甚至几周(1，2，3，4，5，6，7或8)时可能需要显著延长治疗的时间。也可以想见需要施用不止一次TF或化学治疗剂。为了使肿瘤退化，以能有效抑制肿瘤生长的联合剂量传递两种药剂，而不用管施用的次数如何。
多种化学治疗剂可用于本文公开的联合治疗方法，仅作为例子的化学治疗剂包括表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(VP-16)，阿霉素，5-氟尿嘧啶(5FU)，喜树碱，放线菌素D，丝裂霉素C，顺铂(CDDP)和甚至是过氧化氢。在某些实施方案中，已显示出当与本发明的tTF组合物联合施用时，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷的使用可有效地使肿瘤变小。
本领域技术人员应理解，化学治疗剂的适当剂量一般就是单独施用或与其它化学治疗剂联合施用化学治疗剂的临床疗法中已使用的大致剂量。例如，可使用如顺铂之类药剂和其它DNA烷基化药剂。顺铂被广泛用于治疗癌症，其临床应用所用的有效剂量为每3周给药20mg/m2达5天，共3个疗程。顺铂不能被口服吸收，因此必须经由静脉内、皮下、肿瘤内或腹膜内注射来传递。
其它有用的药剂包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物，这种化学治疗化合物包括阿霉素，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，异搏定，鬼臼毒素等。广泛用于治疗肿瘤的临床背景时，对于阿霉素而言，以25-75mg/m2的剂量范围，每隔21天通过大剂量静脉内注射给药，对表鬼臼毒素吡喃葡糖苷而言，以35-50mg/m2的剂量静脉内给药或以双倍于静脉内剂量的剂量口服。
也可使用破坏多核苷酸前体的合成和精确性的药剂。特别有用的是已经过深入检测并易于得到的药剂。例如，致瘤性组织优先使用如5-氟尿嘧啶(5FU)之类药剂，使得此药剂对靶向致瘤性细胞特别有用。尽管5-FU毒性很大，但它可适用于宽范围的载体，包括局部使用，然而，一般使用剂量范围是3至15mg/kg/天的静脉内给药。
表II列出了可用于联合疗法的化学治疗剂的例子，其中所列的各个药剂仅是例子而不会以任何方式限制药剂的范围。熟练技术人员可参照“Remington药物科学”第15版，第33章，特别是p624-652。根据治疗对象的病情必需对剂量作一些改变。在任何情况下，负责给药的人会确定各个受试者的适当剂量。另外，为了给人施用，制品必需符合FDA生物制品标准所需的无菌、热原性、全面安全性和纯度标准。
表II用于致瘤性疾病的化学治疗剂
 类别 药剂类型 非专有名称(其它名称) 疾病
烷化剂 氮芥类 氮芥(HN2) 何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤
环磷酰胺异环磷酰胺 急性和慢性淋巴细胞白血病，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，多发性骨髓瘤，成神经细胞瘤，乳腺癌，卵巢癌，肺癌，肾胚细胞瘤，宫颈癌，睾丸癌，软组织肉瘤
苯丙氨酸氮芥(L-溶肉瘤素) 多发性骨髓瘤，乳腺癌，卵巢癌
苯丁酸氮芥 慢性淋巴细胞白血病，原发性巨球蛋白血症，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤
Ethylenimenes和甲基蜜胺类 六甲基蜜胺 卵巢癌
三胺硫磷 膀胱癌，乳腺癌，卵巢癌
烷基磺酸盐 二甲磺酸丁酯 慢性粒细胞白血病
亚硝基脲三嗪 亚硝基脲氮芥(BCNU) 何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，原发性脑瘤，多发性骨髓瘤，恶性黑素瘤
环己亚硝脲(CCNU) 何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，原发性脑瘤，小细胞肺癌
甲环亚硝脲(甲基-CCNU) 原发性脑瘤，胃癌，结肠癌
链脲霉素三嗪咪唑胺(DTIC；二甲基三氮烯基咪唑甲酰胺) 恶性胰腺胰岛瘤，恶性类癌瘤恶性黑素瘤，何杰金氏病，软组织肉瘤
表II-续
类别 药剂类型 非专有名称(其它名称) 疾病
抗代谢物 叶酸类似物 氨甲蝶呤 急性淋巴细胞白血病，绒膜癌，蕈样霉菌病，乳腺癌，头颈癌，肺癌，骨原性肉瘤
嘧啶类似物 氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)5-氟脱氧尿苷(FUdR) 乳腺癌，结肠癌，胃癌，胰腺癌，卵巢癌，头颈癌，泌尿膀胱癌，恶化前的皮肤损害(局部)
阿糖胞苷 急性粒细胞和急性淋巴细胞白血病
嘌呤类似物和相关抑制剂 巯基嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP) 急性淋巴细胞、急性粒细胞和慢性粒细胞白血病
硫代鸟嘌呤(6-硫代鸟嘌呤；TG) 急性淋巴细胞、急性粒细胞和慢性粒细胞白血病
戊制菌素(2-脱氧助间型霉素) 多毛细胞白血病，蕈样霉菌病，慢性淋巴细胞白血病
天然产物 长春花生物碱 长春花碱(VLB) 何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，乳腺癌，睾丸癌
长春新碱 急性淋巴细胞白血病，成神经细胞瘤，肾胚细胞瘤，横纹肌肉瘤，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，小细胞肺癌
表鬼臼毒素类 表鬼臼毒素吡喃葡糖苷Tertiposide 睾丸癌，小细胞肺癌和其它肺癌，乳腺癌，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，急性粒细胞白血病，卡波西氏肉瘤
放线菌素D 绒膜癌，肾胚细胞瘤，横纹肌肉瘤，睾丸癌，卡波西氏肉瘤
柔红霉素 急性粒细胞和急性淋巴细胞白血病
抗生素 阿霉素博来霉素 软组织肉瘤，骨原性肉瘤和其它肉瘤，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，急性白血病，乳腺癌，生殖泌尿器癌，甲状腺癌，肺癌，胃癌，成神经细胞瘤睾丸癌，头颈癌，皮肤癌，食道癌，肺癌和生殖泌尿道癌；何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤
表II-续
类别 药剂类型 非专有名称(其它名称) 疾病
光辉霉素 睾丸癌，恶性高钙血症
丝裂霉素(丝裂霉素C) 胃癌，宫颈癌，结肠癌，乳腺癌，胰腺癌，膀胱癌，头颈癌
酶 L-天冬酰胺酶 急性淋巴细胞白血病
生物反应修饰物 α干扰素 毛细胞白血病，卡波西氏肉瘤，黑素瘤，类癌瘤，肾细胞癌，卵巢癌，膀胱癌，非何杰金氏淋巴瘤，蕈样霉菌病，多发性骨髓瘤，慢性粒细胞白血病
各种各样的药剂 铂配位复合物 顺铂(cis-DDP)碳铂 睾丸癌，卵巢癌，膀胱癌，头颈癌，肺癌，甲状腺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，成神经细胞瘤，骨原肉瘤
蒽二酮 二羟基蒽酮 急性粒细胞白血病，乳腺癌
取代的脲 羟基脲 慢性粒细胞白血病，真性红细胞增多症，原发性血小板增多症，恶性黑素瘤
甲基苄肼衍生物肾上腺皮质药剂 甲基苄肼(N-甲基肼，MIH)邻对滴滴滴(o，p’-DDD) 何杰金氏病肾上腺皮质病
抑制剂 氨苯乙哌啶酮 乳腺癌
激素和拮抗剂 肾上腺皮质类固醇类 去氢皮质素(几种其它的功能等同的制品也可以) 急性和慢性淋巴细胞白血病，非何杰金氏淋巴瘤，何杰金氏病，乳腺癌
孕酮类 己酸羟孕酮甲孕酮去氢甲孕酮 子宫内膜癌，乳腺癌
雌激素类 己烯雌酚炔雌醇(其它制品也可以) 乳腺癌，前列腺癌
抗雌激素 他莫昔芬 乳腺癌
雄激素类 丙酸睾酮氟甲睾酮(其它制品也可以) 乳腺癌
抗雄激素促性腺素释放激素类似物 氟利坦亮丙瑞林 前列腺癌前列腺癌
E2.免疫毒素和凝血配体的联合和疗法
本发明的任一种或多种凝血缺损的TF构建体可与免疫毒素(IT)和/或凝血配体联合使用，所述免疫毒素和/或凝血配体的靶向部分(如抗体或配体)针对的是肿瘤细胞、肿瘤血管系统或肿瘤基质相对特异的标记物。同上文讨论的化学治疗剂一样，联合使用凝血缺损的TF构建体和靶向毒性剂(IT)或促凝剂(凝血配体)会产生针对肿瘤环境中不同目标的不同药剂。这应该导致累加的、明显大于累加的或甚至协同的效果。
有关例举的免疫毒素和凝血配体的制备和使用，下列专利申请的内容被特定地列入本文作为参考以进一步补充本发明的教导：美国流水号07/846,349；08/295,868；08/205,330；08/350,212；08/273,567和08/482,369。
与本发明的tTF构建体联合使用的第二种药剂的至少一个结合区域是能将毒素或促凝剂传递至肿瘤区域(即能定位于肿瘤位点内)的组分。由于促凝剂分布的稍广泛并不与严重的副作用相关，因此，相对于免疫毒素而言，对凝血配体靶向成分的要求较不严格。靶向药剂可以针对肿瘤细胞组分；肿瘤血管系统组分；与肿瘤细胞结合、或一般性相关联的组分；与肿瘤血管系统结合、或一般性相关联的组分；肿瘤胞外基质或基质的组分或者与基质结合的组分；甚至可以针对肿瘤血管系统内发现的细胞类型。
对于凝血配体，非常严格靶向的负担(如使用免疫毒素时所要求的)有所减轻，因此，达到特异性靶向意味着相对于非肿瘤位点的血管系统而言，肿瘤血管系统内的凝血有所促进。因此，对于靶向剂的生物分布特性而言，凝血配体的特异性靶向是功能性术语而不是纯粹的物理术语，有用的靶可能不是全部局限于肿瘤，给药后，在身体的其它位点仍可发现能有效促进肿瘤特异性凝血的靶向配体。
i.肿瘤细胞靶
使用具有能与肿瘤细胞相对特异之标记物结合的区域的配体或双特异性配体可靶向构成肿瘤的恶性细胞。毒素会杀死肿瘤细胞，由于与肿瘤细胞的结合会使相关的促凝剂定位于肿瘤，因此可达到特异性凝血的目的。
已记载过很多所谓的“肿瘤抗原”，其中的任一个都可用作本发明联合方面的靶。下文列出了大量实体肿瘤相关抗原的例子，本领域技术人员熟知针对这种抗原的抗体的制备和使用，例举的抗体包括得自妇科肿瘤位点：OC 125；OC 133；OMI；Mo v1；Mo v2；3C2；4C7；ID3；DU-PAN-2；F 36/22；4F7/7A10；OV-TL3；B72.3；DF3；2C8/2F7；MF 116；Mov18；CEA 11-H5；CA 19-9(1116NS 19-9)；H17-E2；791T/36；NDOG2；H317；4D5，3H4，7C2，6E9，2C4，7F3，2H11，3E8，5B8，7D3，SB8；HMFG2；3.14.A3；乳腺肿瘤位点：DF3；NCRC-11；3C6F9；MBE6；CLNH5；MAC 40/43；EMA；HMFG1 HFMG2；3.15.C3；M3，M8，M24；M18；67-D-11；D547Sp，D75P3，H222；Anti-EGF；LR-3；TA1；H59；10-3D-2；HmAB1，2；MBR 1，2，3；24.17.1；24.17.2(3E1.2)；F36/22.M7/105；C11，G3，H7；B6.2；B1.1；Cam 17.1；SM3；SM4；C-Mul(566)；4D5 3H4，7C2，6E9，2C4，7F3，2H11，3E8，5B8，7D3，5B8；OC 125；MO v2；DU-PAN-2；4F7/7A10；DF3；B72.3；cccccCEA 11；H17-E2；3.14.A3；FO23C5；结肠直肠肿瘤位点：B72.3；(17-1A)1083-17-1A；CO17-1A；ZCE-025；AB2；HT-29-15；250-30.6；44X14；A7；GA73.3；791T/36；28A32；28.19.8；X MMCO-791；DU-PAN-2；ID3；CEA 11-H5；2C8/2F7；CA-19-9(1116NS 19-9)；PR5C5；PR4D2；PR4D1；黑素瘤位点：4.1；8.2 M17；96.5；118.1，133.2，(113.2)；L1，L10，R10(R19)；I12；K5；6.1；R24；5.1；225.28S；465.12S；9.2.27；F11；376.96S；465.12S；15.75；15.95；Me1-14；Me1-12；Me3-TB7；225.28SD；763.24TS；705F6；436910；M148；胃肠肿瘤：ID3；DU-PAN-2；OV-TL3；B72.3；CEA 11-H5；3.14.A3；CCOLI；CA-19-9(1116NS 19-9)and CA50；OC125；肺肿瘤：4D5 3H4，7C2，6E9，2C4，7F3，2H11，3E8，5B8，7D3，SB8；MO v2；B72.3；DU-PAN-2；CEA 11-H5；MUC 8-22；MUC 2-63；MUC 2-39；MUC 7-39；和各种各样的肿瘤：PAb 240；PAb 246；PAb 1801；ERIC.1；M148；FMH25；6.1；CA1；3F8；4F7/7A10；2C8/2F7；CEA 11-H5.
确定可靶向的肿瘤的另一种方法是根据肿瘤细胞自身的特性，而不是描述由细胞表达的抗原的生物化学特性。因此，熟练技术人员可参照ATCC目录列举一些公众可得到的(得自ATCC目录)人类肿瘤细胞系，细胞系例有：J82；RT4；ScaBER；T24；TCCSUP；5637；SK-N-MC；SK-N-SH；SW 1088；SW 1783；U-87 MG；U-118 MG；U-138 MG；U-373 MG；Y79；BT-20；BT-474；MCF7；MDA-MB-134-VI；MDA-MD-157；MDA-MB-175-VII；MDA-MB-361；SK-BR-3；C-33A；HT-3；ME-180；MS751；SiHa；JEG-3；Caco-2；HT-29；SK-CO-1；HuTu 80；A-253；FaDu；A-498；A-704；Caki-1；Caki-2；SK-NEP-1；SW 839；SK-HEP-1：A-427；Calu-1；Calu-3；Calu-6；SK-LU-1；SK-MES-1；SW 900；EB1；EB2；P3HR-1；HT-144；Malme-3M；RPMI-7951；SK-MEL-1；SK-MEL-2；SK-MEL-3；SK-MEL-5；SK-MEL-24；SK-MEL-28；SK-MEL-31；Caov-3；Caov-4；SK-OV-3；SW 626；Capan-1；Capan-2；DU 145；A-204；Saos-2；SK-ES-1；SK-LMS-1；SW 684；SW 872；SW 982；SW 1353；U-2 OS；Malme-3；KATO III；Cate-1B；Tera-1；Tera-2；SW579；AN3 CA；HEC-1-A；HEC-1-B；SK-UT-1；SK-UT-1B；SW 954；SW 962；NCI-H69；NCI-H128；BT-483；BT-549；DU4475；HBL-100；Hs 578Bst；Hs 578T；MDA-MB-330；MDA-MB-415；MDA-MB-435S；MDA-MB-436；MDA-MB-453；MDA-MB-468；T-47D；Hs 766T；Hs 746T；Hs 695T；Hs 683；Hs 294T；Hs 602；JAR；Hs 445；Hs 700T；H4；Hs 696；Hs 913T；Hs729；FHs 738Lu；FHs 173We；FHs 738B1；NIH：0VCAR-3；Hs 67；RD-ES；ChaGo K-1；WERI-Rb-1；NCI-H446；NCI-H209；NCI-H146；NCI-H441；NCI-H82；H9；NCI-H460；NCI-H596；NCI-H676B；NCI-H345；NCI-H820；NCI-H520；NCI-H661；NCI-H510A；D283 Med；Daoy；D341 Med；AML-193和MV4-11.
可查阅以后任一年的ATCC目录以鉴定其它适当的细胞系。如果需要特定的细胞类型，此特定领域的技术人员也应知道得到这种细胞的方法，和/或其可立即得到的来源。因此，科技文献分析可很容易揭示出针对需要靶向的任何肿瘤细胞类型可作的适当细胞选择。
(a)抗肿瘤细胞抗体
识别肿瘤抗原靶的直接方法是使用对特定抗原具有结合亲和力的抗体。已知有大量针对实体肿瘤抗原的抗体，上文列出了某些有用的抗肿瘤抗体。然而，本领域技术人员显然明白上述某些抗体可能不具有适当的生物化学特性，或没有足够的肿瘤特异性，因而不具有治疗用途，例如可识别胞质抗原的MUC8-22。这一类抗体一般仅用于研究性的实施方案，如模型系统或筛选试验中。
一般说来，可用于本发明这些方面的抗体优选识别细胞表面易接近的抗原和由肿瘤细胞优先或特异性表达的抗原。这种抗体也优选表现出高亲和性特性，如表现出Kd＜200nM，优选＜100nM，而与维持生命的正常组织(如选自心脏，肾脏，脑，肝脏，骨髓，结肠，乳房，前列腺，甲状腺，胆囊，肺，肾上腺，肌肉，神经纤维，胰腺，皮肤或人体中其它维持生命的器官或组织中的一种或多种组织)没有显著的反应性。从低反应性的观点看来，对本发明最重要的“维持生命”的组织包括心脏，肾脏，中枢和外周神经系统组织和肝脏。本文所用术语“显著反应性”指的是当抗体或抗体片段在适于免疫组织化学反应的条件下应用于特定组织时，不会引发染色或仅引发微弱的染色，其中在大多为阴性细胞的区域内分散仅少数几个阳性细胞。
用于本发明的特别令人满意的抗体是对实体肿瘤具有高选择性的抗体，例如，与在很多乳腺癌、肺癌和结肠直肠癌表面选择性发现的TAG72和HER-2原癌基因蛋白结合的抗体(Thor等，1986；Colcher等，1987；Shepard等，1991)；MOv18和OV-TL3以及可与乳粘蛋白核心蛋白和人乳脂球蛋白结合的抗体(Miotti等，1985；Burchell等，1983)；可与高Mr黑素瘤抗原结合的抗体9.2.27(Reisfeld等，1982)。其它有用的抗体是针对在几乎所有卵巢癌中均均匀表达的叶酸结合蛋白的抗体；针对在鳞状细胞癌和大多数神经蚀质瘤中过量表达的erb家族癌基因的抗体；和已知是不断进行的临床前和临床评价对象的其它抗体。
在本领域常规实施的临床前试验之后，相信抗体B3，KSI/4，CC49，260F9，XMMCO-791，D612和SM3特别适用于临床实施方案。B3(美国专利5,242,813；Brinkmann等，1991)的ATCC登记号是HB10573；KS1/4可按美国专利4,975,369所述制备；D612(美国专利5,183,756)的ATCC登记号是HB9796。
确定肿瘤相关靶的另一种方法是根据肿瘤细胞的特性，而不是描述由细胞表达的抗原的生物化学特性。因此，发明人预计优先与肿瘤细胞结合的任何抗体都可用作免疫毒素或凝血配体的靶向成分。优先结合肿瘤细胞的基础仍是抗体对肿瘤细胞表现出高亲和性，而与上文所述的维持生命的正常细胞或组织不具有显著的反应性。
本发明还提供了几种制备可用于本文所述靶向凝血法的抗体的方法。为了产生肿瘤细胞特异性的抗体，可用含有肿瘤细胞抗原的组合物免疫动物，并如下文详述，选择具有适当特异性的所得抗体。免疫组合物可含有上述任何抗原的纯化的、或部分纯化的制品；富含上述任何抗原的组合物，如膜制品；上述任何细胞；或包括上述任何细胞类型的细胞混合物或群体。
当然，不论抗体的来源如何，在实施本发明以治疗人时，以首先确保临床靶向的肿瘤会表达最终选定的抗原为佳。利用非常简单直接的试验，包括对肿瘤组织样品(例如外科活检样品)进行抗原检测，或检测循环排出的抗原可做到这一点。在如ELISA(酶联免疫吸附试验)之类免疫学筛选试验中可很容易进行上述检测，所述试验中，为了确定对肿瘤的反应性，检测了得自杂交瘤“库”的抗体的结合亲和性。然后，选择显示出适当肿瘤选择性和亲和性的抗体以制备本发明的双特异性抗体。
由于众所周知的交叉反应性现象，预计有用的抗体除了可由最初抗原得自人细胞的免疫方案产生外，还可由其中最初使用的抗原得自动物(如小鼠或灵长类动物)的免疫方案产生。当使用来源于人的抗原时，抗原可得自人肿瘤细胞系，或可通过特定的所研究患者的生物样品来制备抗原。实际上，产生为患者肿瘤“量身定做”的抗体的方法是已知的(Stevenson等，1990)，预计能用于本发明。
(b)其它肿瘤细胞靶和结合配体
除了使用抗体外，还可使用其它配体，通过与肿瘤细胞抗原结合，而将促凝剂导向肿瘤位点。对于身为过量表达的受体(雌激素受体，EGF受体)或突变受体的肿瘤抗原，相应的配体可用作靶向剂。
与内皮细胞受体配体类似，可能有可特异性地或优先地与肿瘤细胞结合的成分存在。例如，假如肿瘤抗原是一种过量表达的受体，则肿瘤细胞在体内可能被特异性配体包被。这样的话，配体似乎能被针对该配体的抗体或受体自身一种形式靶向。这些类型的靶向剂的具体例子是针对TIE-1或TIE-2配体的抗体，针对血小板因子4的抗体，及白细胞粘附结合蛋白。
ii.其它疾病靶
在其它实施方案中，可使用TF与IT或凝血配体的联合，所述IT或凝血配体能与特异性地或优先地在疾病位点而不是肿瘤位点表达的靶分子结合。
与其它患病细胞相关的靶分子的例子包括例如；与银屑病相关的白细胞粘附分子；与增殖性糖尿病性视网膜病相关的FGF；与多种疾病的活化内皮细胞相关的血小板因子4；和与血管增殖性疾病相关的VEGF。相信在疾病位点特异性诱导凝血，和任选通过靶向毒素传递，可使患有任一种上述疾病的动物或患者获得好处。
已知具有共同的血管依赖性病理学的疾病(如Klagsburn和Folkman(1990)所述)也可按本文所述治疗。特别是可以使用靶向血管内皮细胞的配体或靶向基质的配体使疾病位点凝血。目前特别包括BPH，糖尿病性视网膜病，血管再狭窄，血管粘连，AVM，脑膜瘤，血管瘤，血管再生性青光眼，类风湿性关节炎和银屑病的治疗。
iii.疾病相关的血管系统细胞靶
血管系统的细胞可作为本发明所用的靶。在这些情况下，免疫毒素或凝血配体的至少一个结合区域能结合由疾病相关的血管系统内皮细胞优先表达的可接近标记物。由于血管内皮细胞接近疾病区域和局部异常生理过程的产物，使得血管标记物的开发利用成为可能。例如，肿瘤血管内皮细胞暴露于肿瘤细胞和肿瘤衍生的产物，所述产物可改变内皮细胞的表型。
已知肿瘤细胞可合成衍生自肿瘤的产物，如淋巴因子，单核因子，集落刺激因子，生长因子和血管生成因子，它们对附近的血管内皮细胞起作用(Kandel等，1991；Folkman，1985a，1985b)，还可产生细胞因子(Burrows等，1991；Ruco等，1990；Borden等，1990)。肿瘤产物与内皮细胞结合，并选择性地诱导某些分子的表达。使用本发明某些方面送递肿瘤内皮细胞特异性毒素和/或促凝剂可靶向的就是这些被诱导的分子。肿瘤中的血管内皮细胞以比各种正常组织中的血管内皮细胞大30倍的速率增殖(Denekamp等，1982)，这表明与增殖相关的决定簇也可用作肿瘤血管内皮细胞的标记物。
在本发明的某些实施方案中，免疫毒素或凝血配体的靶向成分是对肿瘤血管系统具有相对高水平的特异性的成分。这些靶向成分可限定为与肿瘤内皮细胞上表达、但在正常内皮细胞的表面很少或不表达的分子可结合的成分。通过本领域技术人员熟知的组织切片免疫染色标准方法可评估这种特异性。在凝血配体方面，一般建议可使用本发明双特异性配体或抗体靶向的分子是在肿瘤血管系统上的表达水平比正常内皮细胞中高的那些分子。
(a)疾病血管内皮细胞标记物
已知在疾病位点或环境中的血管内皮细胞表面优先表达的分子在本文被称为“天然的疾病相关性血管内皮细胞标记物”。使用此术语简单地指在与增加的或不适当的血管生成或内皮细胞增殖相关的疾病中表达的内皮细胞成分。一个具体例子是对肿瘤衍生的因子反应而原位表达的肿瘤内皮细胞成分。这些成分也被称为“天然诱导的肿瘤内皮细胞标记物”。
VEGF/VPF(血管内皮细胞生长因子/血管通透因子)和FGF(成纤维细胞生长因子)家族的成分在肿瘤血管系统内或上密集，因此，相应的受体为进攻肿瘤血管系统提供了潜在的靶，例如已知啮齿类动物和人中，VEGF受体在肿瘤内皮细胞上被上调，与正常组织中的内皮细胞正好相反(Thieme等，1995)，这可能是氧不足(肿瘤微环境的特征)的后果(Leith等，1992)。FGF受体在暴露于低氧的内皮细胞上也被上调3倍，因此相信它在肿瘤中也会被上调(Bicknell和Harris等，1992)。
内皮细胞上的TGF β(转化生长因子β)受体(endoglin)在分裂中的细胞上被上调，这提供了另一个靶。本发明人之一发现，endoglin在培养着的被激活的和分裂中的HUVEC上被上调，在人组织的新血管形成位点(包括宽范围的实体肿瘤和胎盘)的内皮细胞上高水平表达。与之形成对照的是，包括肿瘤发生前损害在内的大多数非恶性成年组织的内皮细胞含有很少的或不含endoglin。重要的是，相信endoglin的表达与乳腺的瘤形成进程相关联，良性的纤维腺瘤和早期的癌会结合低水平的TEC-4和TEC-11抗体，而晚期的管内癌和侵入性癌会结合高水平的这些抗体即可证明这一点。
其它天然的疾病相关性血管内皮细胞标记物包括TIE，VCAM-1，P-选择蛋白，E-选择蛋白(ELAM-1)，αvβ3整联蛋白，多效蛋白(pleiotropin)和内皮唾液酸蛋白，可使用本发明靶向其中的任一个。
(b)细胞因子可诱导的血管内皮细胞标记物
由于经常导致身体局部功能异常的疾病过程的特征，处理疾病位点而同时使其它组织相对不受影响的方法是可行的。对于作为独特的实体在动物体内存在的恶性和良性肿瘤而言尤为如此。例如，可处理肿瘤环境以产生特异于肿瘤血管内皮细胞的其它标记物。这些方法一般模拟实体肿瘤中天然进行的过程，还包括局部产生信号传递剂，如生长因子或细胞因子，它们可诱导某些分子在附近的血管内皮细胞表面特异性表达。
本文将可被人工诱导而在疾病或肿瘤环境的血管内皮细胞表面表达的分子组称为“可诱导的内皮细胞标记物”，或具体地称为“可诱导的肿瘤内皮细胞标记物”。此术语可用于指经人工诱导，即通过人为操作导致被诱导的标记物，而不是作为动物疾病或肿瘤发展过程的一部分被诱导的标记物。尽管“天然标记物”也可以被例如肿瘤衍生物所诱导，但为了简化，本申请选择上文所定义的术语“可诱导的标记物”。
因此，尽管对于实践本发明并非必需，但对疾病相关性血管系统表面的血管内皮细胞抗原靶进行选择性诱导的技术是可行的，如果需要的话，可将此技术用于本发明。这些技术包括操纵抗原表达或细胞表面呈递，以使靶抗原在疾病相关性血管系统的表面表达或可得到，而在正常内皮细胞的表面不表达，或不可接近或得到而进行结合，或至少是降低到较低的程度。
肿瘤内皮细胞标记物可被肿瘤衍生的细胞因子(Burrows等，1991；Ruco等，1990)和血管生成因子(Mignatti等，1991)诱导。在肿瘤内皮细胞中可被特异性地诱导、然后使用本发明提供的双特异性凝血配体可靶向的细胞表面标记物的例子包括表III中所列的那些(Bevilacqua等，1987；Dustin等，1986；Osborn等，1989；Collins等，1984)。
表III中还列出了推测标记物的诱导机制；诱导性或“中间体细胞因子”，如IL-1和IFN-γ；和其靶向会导致细胞因子释放的白细胞细胞类型和相关细胞因子激活分子。诱导特异性标记物时，一般需要双特异的“细胞因子诱导性”或“抗原诱导性”抗体。此抗体可选择性地诱导适当细胞因子释放于肿瘤地点，因此选择性地诱导血管内皮细胞表达所需的靶抗原。双特异性抗体与肿瘤块细胞和产生细胞因子的白细胞交联，从而激活白细胞以释放细胞因子。
上述双特异性抗体的制备和使用部分依据下列事实：即识别CD3，CD14，CD16和CD28的交联抗体以前已显示出可通过与第二种抗原交联而选择性地引发细胞因子产生(Qian等，1991)。在本发明的上下文中，由于只有成功地与肿瘤细胞交联的白细胞方可被激活以释放细胞因子，因此，细胞因子的释放仅局限于肿瘤部位。所需标记物，如E-选择蛋白的表达也类似地局限于肿瘤血管系统的内皮细胞。
                                              表III
                                      有可能被诱导的血管靶
可诱导的内皮细胞分子  ACRO-NYM      亚型/别名(分子家族)   诱导的细胞因子 产生那些细胞因子的白细胞 与单克隆抗体交联时可激活细胞产生细胞因子的白细胞分子
内皮细胞-白细胞粘附分子-1    ELAM-1E-选择蛋白 --(选择蛋白)  IL-1，TNF-a，(TNF-β)(细菌内毒素)   单核细胞       CD14
  巨噬细胞       CD14
  肥大细胞     IgE的FcR
血管细胞粘附分子-1    VCAM-1 可诱导的细胞粘附分子-110(INCAM-110)(免疫球蛋白家族)  (细菌内毒素)IL-1，TNF-a   单核细胞       CD14
  巨噬细胞       CD14
  肥大细胞     IgE的FcR
 TNF-β，IL-4  辅助T细胞   CD2，CD3，CD28
      TNF   NK细胞   IgG的FcR(CD16)
                                               表III(续)
可诱导的内皮细胞分子  ACRO-NYM      亚型/别名(分子家族) 诱导的细胞因子 产生那些细胞因子的白细胞 与单克隆抗体交联时可激活细胞产生细胞因子的白细胞分子
细胞间粘附分子-1   ICAM-1 --(免疫球蛋白家族)    IL-1，TNFa(细菌内毒素)   单核细胞       CD14
  巨噬细胞       CD15
  肥大细胞     IgE的FcR
  TNF-β，IFNg   T辅助细胞   CD2，CD3，CD28
   NK细胞   IgG的FcR(CD16)
白细胞粘附分子-1的试剂     LAM-1试剂     MEL-14试剂(小鼠)   II-1，TNFa(细菌内毒素)   单核细胞       CD14
  巨噬细胞       CD14
  肥大细胞     IgE的FcR
主要组织相容性复合物II类抗原   MHC II类 HLA-DRHLA-DP  -人HLA-DQI-A     -小鼠I-E     IFN-g  辅助T细胞   CD2，CD3，CD28
   NK细胞   IgG的FcR(CD16)
重要的是，应指出在表III所列的可诱导的标记物中，E-选择蛋白和MHC II类抗原，如HLA-DR，HLA-DP和HLA-DQ(Collins等，1984)，是用于临床实施方案的最优选的靶。表III中的其它粘附分子似乎在正常组织，一般在淋巴器官内和内皮细胞上有不同程度的表达，使得它们的靶向仅在动物模型中或它们在正常组织中的表达可被抑制而没有显著副作用的情况下才可能合适。E-选择蛋白或MHCII类抗原的靶向是优选的，因为在肿瘤相关内皮细胞中可最直接地选择性促进这些抗原的表达。
E-选择蛋白
对正常内皮细胞表面不表达的抗原进行靶向是诱导方法最简单的形式。E-选择蛋白是不在正常内皮细胞血管系统或其它人细胞类型中表达的粘附分子(Cotran等，1986)，但可通过如IL-1，TNF，淋巴毒素和细菌内毒素之类细胞因子的作用而在内皮细胞表面被诱导(Bevilacqua等，1987)。E-选择蛋白不能被IFN-γ诱导(Wu等，1990)，因此，通过选择性传递这种细胞因子，或通过使用可导致这种细胞因子在肿瘤环境中选择性释放的组合物，可在肿瘤内皮细胞中选择性诱导E-选择蛋白的表达。
双特异性抗体是能导致一种或多种上述或其它适当的细胞因子在肿瘤位点、而不是身体其它位点选择性释放的组合物的一个例子。本文将这种双特异性抗体称为“诱导抗原的抗体”，当然，它们不同于具有靶向和凝血成分的本发明的任何双特异性抗体。诱导抗原的抗体被设计成可将细胞因子效应细胞(如单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，T细胞和/或NK细胞或肥大细胞)与被靶向的实体肿瘤块的肿瘤细胞交联，然后，这种交联会引起细胞因子释放，其释放局限于交联位点，即肿瘤内。
有效的诱导抗原的抗体一方面识别选定的肿瘤细胞表面抗原，另一方面识别选定白细胞细胞类型表面的选定“激活细胞因子”的抗原。术语“激活细胞因子”的抗原被用于指白细胞表面多种已知分子中的任一种，当它结合效应分子，如抗体或其片段或者天然因子或其合成类似物时，可促进白细胞释放细胞因子，所述效应分子是可溶性因子或另一细胞上的膜结合的反受体。激活细胞因子的分子的例子包括可激活IL-1和TNFα释放的CD14(LPS受体)和IgE的FcR；和可分别激活IFNγ和TNFβ释放的CD16，CD2或CD3或CD28。
一旦被导入携有肿瘤的动物的血流中，这种诱导抗原的双特异性抗体会结合肿瘤内的肿瘤细胞，将肿瘤细胞与浸润肿瘤的效应细胞(如单核细胞/巨噬细胞)交联，然后引起细胞因子在肿瘤内选择性释放。然而，重要的是，没有肿瘤和白细胞的交联，诱导抗原的抗体就不会引起细胞因子的释放，因此，在摘除肿瘤的身体部位不会释放细胞因子，被细胞因子诱导的分子(如E-选择蛋白)的表达仅在肿瘤内皮细胞内出现。
已知有大量有用的“激活细胞因子”的抗原，当它们与适当的双特异性抗体交联时会导致交联的白细胞释放细胞因子。用于此目的的普遍优选靶是发现于单核细胞和巨噬细胞表面的CD14。当CD14被交联时，会刺激单核细胞/巨噬细胞释放IL-1(Schutt等，1988；Chen等，1990)，可能还释放其它的细胞因子，它们反过来会刺激E-选择蛋白在附近的血管系统中出现。与E-选择蛋白诱导和靶向相关的其它可能的交联靶包括肥大细胞上发现的IgE的FcR；NK细胞上发现的IgG的FcR(CD16)；以及T细胞表面发现的CD2，CD3或CD28。其中，一般优选CD14靶向，因为与其它白细胞细胞类型相反，实体肿瘤中单核细胞/巨噬细胞浸润相对有优势。
在一例诱导实施方案中，用双特异性(Fab’-Fab’)抗CD14/抗肿瘤抗体(如针对高Mr黑素瘤抗原OV-TL3的抗-CEA，9.2.27抗体或针对卵巢相关抗原的MOv18抗体)注射携有实体肿瘤的动物。抗体由于其结合肿瘤的活性而定位于肿瘤中，然后通过交联它们的CD14抗原而激活肿瘤中的单核细胞和巨噬细胞(Schutt等，1988；Chen等，1990)。被激活的单核细胞/巨噬细胞具有杀肿瘤活性(Palleroni等，1991)，并释放可快速地在肿瘤血管内皮细胞上诱导E-选择蛋白抗原的IL-1和TNF(Bevilacqua等，1987；Pober等，1991)。
MHC II类抗原
可用于本发明的第二组优选的可诱导标记物是MHC II类抗原(Collins等，1984)，包括HLA-DR，HLA-DP和HLA-DQ。II类抗原在多个物种(包括人在内)的大多数正常组织中的血管内皮细胞上表达。体外研究(Collins等，1984；Daar等，1984；O’Connell等，1990)和体内研究(Groenewegen等，1985)表明，血管内皮细胞表达II类抗原需要IFN-γ的持续存在，IFN-γ由TH1细胞产生，较低程度上由NK细胞和CD8+T细胞产生。
MHC II类抗原不是血管内皮细胞所独有的，它也在B细胞、激活的T细胞、单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞和某些上皮细胞上组成型表达，这一点在小鼠(Hammerling，1976)和人(Daar等，1984)中得到验证。由于MHC II类抗原在“正常”内皮细胞上的表达，因此它们的靶向不象E-选择蛋白那样十分简单。然而，通过联合使用能有效抑制II类分子在正常组织中表达的免疫抑制剂，如环孢菌素A(CsA)，即有可能进行MHC II类抗原的诱导和靶向(Groenewegen等，1985)。CsA是通过防止激活T细胞和NK细胞(Groenewegen等，1985；DeFranco，1991)、由此将IFN-γ的基础水平降低至维持II类分子在内皮细胞上表达所需的水平之下而起作用的。
有多种与CsA相关的其它环孢菌素，包括环孢菌素A，B，C，D，G等等，它们也具有免疫抑制作用，可能会显示出抑制II类表达的能力。可能具有类似作用的其它试剂包括FK506和纳巴霉素。
因此，MHC II类抗原诱导和靶向实施方案的实践需要用一定剂量的CsA或能有效抑制II类表达的其它II类免疫抑制剂预处理携有肿瘤的动物。当使用CsA时，剂量一般约为10至30mg/kg体重。一旦II类抗原在正常组织中被抑制，即可同样通过使用双特异性抗体而在肿瘤内皮细胞中选择性诱导II类抗原。
在这种情况下，诱导抗原的双特异性抗体应对肿瘤细胞标记物和能诱导IFN-γ产生的效应细胞之表面存在的激活抗原具有特异性。这种效应细胞一般是辅助性T细胞(TH)或天然杀伤(NK)细胞。在这些实施方案中，T细胞或NK细胞(如果使用CD16的话)必需存在于肿瘤中以产生细胞因子中间体，因为II类抗原的表达可使用IFN-γ达到，而用其它细胞因子不能达到。因此，为了实践本发明的这一方面，理想的是选择CD2，CD3，CD28，或最优选选择CD28作为激活细胞因子的抗原，以通过诱导抗原的双特异性抗体进行靶向。
应在肿瘤中被激活的T细胞是那些与血管系统相邻的T细胞，因为细胞最容易到达这一区域，而且双特异性抗体也最密集。被激活的T细胞应还分泌可在相邻肿瘤血管系统上诱导II类抗原的IFN-γ。
本发明优选使用双特异性(Fab’-Fab’)抗体，该抗体的一个臂针对的是肿瘤抗原，另一个臂针对的是CD28。此抗体交联肿瘤内T细胞上的CD28抗原，当它与第二信号(通过例如一般由肿瘤细胞分泌的IL-1提供(Burrows等，1991；Ruco等，1990))联合时，显示出可通过不依赖于CA2+的非CsA抑制性途径激活T细胞(Hess等，1991；June等，1987；Bjorndahl等，1989)。
本领域技术人员熟知如何制备针对多种激活细胞因子之分子的抗体，例如，目前，几个实验室已描述了能诱导白细胞产生细胞因子的抗CD14和抗CD28单克隆抗体的制备和使用(分别参见Schutt等，1988；Chen等，1990和June等，1990)的综述。另外，通过其它机制和其它激活抗原刺激白细胞释放细胞因子的单克隆抗体的制备也是已知的(Clark等，1986；Geppert等，1990)。
在其它实施方案中，发明人预计可用其它方法抑制II类分子的表达，并在肿瘤部位选择性地引发II类分子表达。避免同时使用CsA和双特异性激活抗体的此方法利用了下述事实，即通过使用抗CD4抗体，可抑制T细胞产生IFN-γ，从而有效抑制II类分子的表达(Street等，1989)。使用此实施方案，通过施用抗CD4抗体可抑制IFN-γ产生，导致II类分子的表达全面地被抑制。然后使用例如仅在肿瘤内可被激活的肿瘤特异性T细胞，可仅在肿瘤位点诱导II类分子。
在这种治疗模式中，一般用能有效抑制IFN-γ产生、从而抑制II类分子表达的一定剂量抗CD4预处理动物或人患者。预计有效剂量是例如约4至10mg/kg体重左右。II类分子的表达被抑制之后，即制备能产生IFN-γ的T细胞克隆(如Th1或细胞毒性T淋巴细胞，CTL)并将该克隆导入血流中，所述克隆对肿瘤细胞表面表达的抗原有特异性。这些T细胞因其识别抗原的能力而定位于肿瘤块上，并通过这种识别释放IFN-γ。以此方式，细胞因子的释放同样局限于肿瘤中，因此使II类分子的表达限制在肿瘤血管系统中。
可产生IFN-γ的T细胞克隆可得自外周血(Mazzocchi等，1990)，然而，优选的来源是得自肿瘤块内(Fox等，1990)。本发明优选的制备这种T细胞克隆的方法是从患者体内摘出部分肿瘤块；分离细胞，必要时可使用胶原酶消化；使用密度梯度离心，然后通过例如用特异性抗体和补体处理除去其它白细胞亚型，以富集浸润肿瘤的白细胞；然后在体外扩展浸润肿瘤的白细胞以得到产生IFN-γ的克隆。此克隆必需与患者免疫学相容，因此患者应能很好地耐受此克隆。
建议通过每14天确定各个克隆的细胞因子分泌模式而从扩展的白细胞中进一步选择高产IFN-γ的T细胞克隆，这样做特别有利。为此，对静息克隆进行促分裂性或抗原性刺激约24小时，并使用例如特异性夹心ELISA技术(Cherwinski等，1989)检测其培养物上清液中IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-5和IL-10的存在。选择分泌高水平IL-2和IFN-γ(TH1克隆的特征性细胞因子分泌模式)的克隆，使用增殖试验进一步证实肿瘤特异性。
另外，优选将抗CD4 Fab用作抗CD4抗体，因为它在注射后24小时内会从体内消除，因而不会导致对随后施用的识别肿瘤的T细胞克隆的抑制。本领域技术人员一般已知具有肿瘤特异性的T细胞克隆的制备，例如可由浸润实体黑素瘤肿瘤的淋巴细胞产生和鉴定T细胞克隆(Maeda等，1991)。
在使用任一种MHC II类抑制-诱导方法时，静脉内注射的抗II类抗体不会到达除肝脏和脾脏以外的正常器官中的上皮细胞或单核细胞/巨噬细胞，这一事实可能会带来其它的好处。这可能是因为大多数正常器官中的血管内皮细胞比较紧密，不象在肝脏和脾脏中的那样有孔，因此抗体必须扩散经过基底膜以到达II类阳性细胞。同样，例如交联后可产生的任何B细胞消除不可能造成严重的问题，因为这些细胞是由II类阴性祖细胞补充的(Lowe等，1986)，甚至B细胞杀伤(如B淋巴瘤患者中会出现)也不会导致明显的伤害(Vitetta等，1991)。
总的说来，尽管本发明的肿瘤凝血组合物和抗体非常简单，不需要在操作过程中诱导抗原，但预计也可将本发明与诱导抗原的双特异性抗体联合使用，这种抗体一般在本发明的双特异性凝血配体之前施用。
一般说来，更具有“免疫原性”的肿瘤应更适于涉及例如通过抗CD28/抗肿瘤双特异性抗体交联肿瘤中T细胞的MHC II类方法，因为这些肿瘤更可能被T细胞浸润，这是该方法有效的先决条件。免疫原性的实体肿瘤的例子包括肾癌，黑素瘤，少数乳腺癌和结肠癌，可能还有胰腺癌，胃癌，肝癌，肺癌和胶质细胞肿瘤。这些肿瘤之所以被称为“免疫原性的”是因为有证据表明它们可在宿主中引发免疫应答，已发现它们经得起细胞免疫疗法(Yamaue等，1990)。对黑素瘤和大肠癌而言，此时最优选使用的抗体是B72.3(抗TAG-72)和PRSC5/PR4C2(抗Lewis a)或9.2.27(抗高Mr黑素瘤抗原)。
对所有来源的大多数实体肿瘤而言，利用巨噬细胞/单核细胞中间体的抗CD14方法更加适合，这是因为大多数肿瘤中富含巨噬细胞。富含巨噬细胞的肿瘤的例子包括大多数乳腺癌，结肠癌和肺癌。此时优选使用的抗肿瘤抗体的例子是抗HER-2，B72.3，SM-3，HMFG-2和SWA11(Smith等，1989)。
(c)促凝剂可诱导的标记物
促凝剂也可起诱导某些标记物的作用，所述促凝剂如凝血酶，因子IX/IXa，因子X/Xa，纤溶酶和金属蛋白酶，如间质胶原酶，溶基质素和明胶酶。特别是凝血酶可诱导E-选择蛋白，P-选择蛋白，PDGF和ICAM-1(Sugama等，1992；Shankar等，1994)。
因此，为了进行诱导，可利用抗促凝剂/抗肿瘤双特异性抗体。该抗体可通过其肿瘤结合活性而定位于肿瘤中，然后，双特异性抗体可将促凝剂(如凝血酶)集中于肿瘤中，导致在肿瘤血管内皮细胞上诱导E-选择蛋白和P-选择蛋白(Sugama等，1991；Shankar等，1994)。
或者，截短的组织因子对肿瘤细胞或内皮细胞的靶向会诱导凝血酶沉积在肿瘤内。由于凝血酶被沉积，E-选择蛋白和P-选择蛋白将在肿瘤血管内皮细胞上被诱导。
(d)针对血管内皮细胞标记物的抗体
识别不论是在天然环境中被诱导还是通过人工方法诱导的疾病相关血管系统靶的简单方法是使用对特定细胞表面受体，分子或抗原具有结合亲合性的抗体。这些抗体包括针对已知存在于例如肿瘤血管内皮细胞上的所有细胞表面成分的抗体，针对对肿瘤衍生的因子反应而被诱导或过量表达的成分的抗体，针对人工操作之后被诱导的成分的抗体。
抗vWF识别抗原VIII R Ag，对其存在的肿瘤类型100％染色，对肿瘤内血管100％染色，在正常血管中呈现强染色模式。FB5识别抗原内皮唾液酸蛋白，对其存在的肿瘤类型50％染色，对肿瘤内血管10-30％染色，并在淋巴器官的正常血管中呈现染色模式。TP3识别抗原80KDa骨肉瘤相关抗原蛋白，对其存在的肿瘤类型50％染色，对肿瘤内血管10-30％染色，并在小血管的正常血管中呈现强染色模式。BC-1识别抗原纤连蛋白同种型，对其存在的肿瘤类型60％染色，对肿瘤内血管10-30％染色，但未在正常血管中呈现染色模式。TV-1识别抗原纤连蛋白，对其存在的肿瘤类型100％染色，对肿瘤内血管100％染色，并在所有正常血管中呈现强染色模式。LM 609识别αvβe玻连蛋白受体，对其存在的肿瘤类型85％染色，对肿瘤内血管70-80％染色，并在正常血管中呈现中度染色模式。TEC-11识别endoglin，对其存在的肿瘤类型100％染色，对肿瘤内血管100％染色，在大多数正常血管中呈现弱染色模式。TEC110识别抗原VEGF，对其存在的肿瘤类型100％染色，对肿瘤内血管100％染色，在大多数正常血管中呈现弱染色模式。
在抗EC mAb对人肿瘤的比较研究中，发现TEC110、TV-1和TEC11在胃肠，腮腺，乳腺，卵巢，子宫，肺和何杰金氏类型的肿瘤中呈阳性，而FB-5在胃肠和肺肿瘤中具有微弱的染色，在所列其它肿瘤中呈阴性。TP-3在胃肠肿瘤中呈阳性，而在腮腺肿瘤类型、卵巢肿瘤和何杰金氏类型的肿瘤中较少呈阳性。BC-1在胃肠肿瘤以及生殖和呼吸道肿瘤中呈阳性，IM609在胃肠、卵巢、子宫、肺和何杰金氏肿瘤以及生殖和呼吸道肿瘤中呈阳性。
可用于本发明的两种其它抗体是Rettig等(1992)和Wang等(1993)所描述的针对在人肿瘤血管系统中表达、而在大多数正常组织中不表达、未知功能的不相关抗原的抗体。
本发明也可使用Kim等(1993)所述的抗体，这是因为此抗体可在体内抑制血管生成和抑制肿瘤生长。
也可使用以前未显示出特异于人肿瘤的抗体。例如，Venkateswaran等(1992)描述了抗FGF MAb的制备，Xu等(1992)开发和鉴定了针对FGF受体(flg)同种型的16个同种型和区域特异性多克隆和单克隆抗体系列。Massoglia等(1987)也报道了针对FGF受体的MAb。
(e)产生针对疾病血管系统的抗体
除了利用已知的抗体，如上文所述的抗体和科学文献中已知和公开的那些抗体外，还可使用下文详述的标准免疫方法产生新的抗体。为了产生针对已知的疾病相关性血管标记物抗原的抗体，可用含有该抗原的免疫原性组合物免疫动物。所述组合物可以是膜制品，其中包括或富含抗原；分离自细胞或膜的相对纯化形式的抗原；使用例如天然抗原提取物或得自重组宿主细胞的重组形式抗原，通过多种纯化步骤得到的高度纯化形式的抗原。
本发明也提供了产生针对疾病相关性血管系统内皮细胞上所存在抗原的抗体的其它方法，此方法甚至在不知道抗原的生物化学特性的情况下也是适用的。通过产生针对肿瘤血管系统内皮细胞的抗体可举例说明这些方法。以此方式产生抗体的第一种方法使用得自动物或人患者肿瘤位点的血管内皮细胞制品，只需简单地用这种细胞的制品免疫实验动物并收集所产生的抗体。此方法最有用的形式是当随后选择特异性抗体时，使用常规的杂交瘤技术和针对肿瘤血管内皮细胞进行筛选即可做到。
上述方法的一个发展是体外模拟肿瘤血管系统现象、并且不需要细胞纯化的情形。使用此方法时，在细胞培养中而非动物体内使内皮细胞接触肿瘤衍生的产物，所述产物例如可得自肿瘤条件培养基。此方法一般包括用肿瘤条件培养基刺激内皮细胞，并利用受刺激的内皮细胞作为免疫原以制备抗体集合物。同样需使用例如常规的单克隆抗体技术，或如由分离自经免疫动物脾脏的RNA制备的组合免疫球蛋白噬菌粒文库之类的其它技术选择特异性抗体。应选择相对于正常成人组织而言。更优先识别肿瘤刺激的血管内皮细胞并与肿瘤相关的内皮细胞更强烈反应的特异性抗体。
(f)抗endoglin抗体
本发明人之一已制备和分离了对肿瘤血管内皮细胞具有相对特异性的抗体。使用上述方法(美国流水号08/457,229和08/457,031，都列入本文作为参考)得到了被称为肿瘤内皮细胞抗体4和肿瘤内皮细胞抗体11(TEC4和TEC11)的MAb。TEC4和TEC11可识别的抗原最终被确定为分子endoglin。endoglin上由TEC4和TEC11识别的表位存在于被刺激的HUVE细胞的细胞表面上，未受刺激的细胞表面上仅有极少数存在(或免疫学上可接近)。以前已针对endoglin产生了MAb，然而，通过FACS或间接免疫荧光术分析与HUVEC或TCM-激活的HUVEC细胞表面决定簇的反应性，结果表明由TEC4和TEC11识别的表位不同于以前称为44G4的抗体的表位(Gougos和Letarte，1988)。
(g)使用血管内皮细胞结合配体
已知可与内皮细胞表面分子(如生长因子受体)结合或相互作用的生物学配体也可用作靶向成分。
在此意义上可用作靶的生长因子或配体包括VEGF/VPF，FGF，TGFβ，结合TIE的配体，肿瘤相关的纤连蛋白同种型，分散因子，肝细胞生长因子(HGF)，血小板因子4(PF4)，PDGF和TIMP。
特别优选的靶是VEGF/VPF，FGF家族的蛋白质和TGFβ。Abraham等(1986)克隆了FGF，因此可得到重组蛋白形式的FGF。如Ferrara等(1991)所报道，已克隆了具有121，165，189和206个氨基酸的4种VEGF。
(h)结合配体的靶向
抗体或特异性靶向配体也可针对与疾病位点(如肿瘤)的血管内皮细胞表面结合的任何成分。这种成分的例子是可与内皮细胞上已存在的特异性细胞表面受体结合，或可与这种细胞上由于对肿瘤环境作出反应而诱导或过量表达的受体结合的肿瘤衍生的配体和抗原，如生长因子。肿瘤血管系统相关靶也被称为肿瘤衍生的内皮细胞结合因子。
成功的疾病靶向所需的特异性水平可以达到，部分因为局部内皮细胞可被诱导表达或显露出在正常内皮细胞上不存在或低量表达或隐藏的受体。至于肿瘤，还会导致进一步的特异性，因为肿瘤中的内皮细胞会捕获肿瘤衍生的因子，将它们结合至细胞表面，降低了其它组织可得到的配体量。由于分布在血液和组织流体库中而进一步稀释了因子或配体联合，结合这一点，预计正常组织中的内皮细胞可结合的这种因子相对很少，因此，在操作上，细胞表面的结合配体或因子能用作肿瘤内皮细胞标记物。
除了由肿瘤细胞自身产生外，肿瘤内皮细胞结合因子也可源自已浸润肿瘤的其它细胞类型，如巨噬细胞和肥大细胞，或可由在肿瘤内被激活的血小板产生。
可用作肿瘤血管系统相关性靶向剂的其它生长因子或配体包括EGF，FGF，VEGF，TGFβ，HGF(NaKamura，1991)，angiotropin，TGF-α，TNF-α，PD-ECGF和TIE结合配体(Bicknell和Harris，1992)。本发明优选的靶向剂是VEGF/VPF，FGF家族蛋白质，转化生长因子-β(TGF-β)；TGF-α；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；angiotropin；血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；TIE结合配体；多效蛋白(pleiotropin)。另外，本发明的某些方面也可以使用特异性靶向肿瘤血管系统的非抗体靶向成分，如膜联蛋白和含有三肽序列R-G-D的肽(Pasqualini等，1997)。
本发明的另一方面是使用特异于仅在配体-受体复合物中存在的表位的靶向抗体，或得自该抗体的结合区域，各个(游离)配体和未结合形式的受体上不存在所述表位。这些抗体识别和结合独特的构象，所述构象是当配体(如生长因子)与其受体(如生长因子受体)结合形成特异性结合的复合物时产生的。这种表位不存在于非复合形式的配体或受体上。
发明人预计可结合这些抗体的配体-受体复合物存在于肿瘤相关内皮细胞上的量比非肿瘤相关内皮细胞上的量显著要高。因此，这种抗体可用作靶向剂，并可进一步增强本发明双特异性促凝剂的特异性。
(i)受体构建体
内皮细胞表面受体的可溶性结合域也可用作本发明的靶向配体，这一概念一般基于众所周知的夹心结合现象，这一现象已被多种体外和体内结合方案采用。基本上，由于内皮细胞表达特异性受体，因此细胞结合和吸附相应的配体，然后配体可用于结合被导入系统中的其它受体构建体。
在上述章节中已鉴定了有用的内皮细胞受体范围，其中特别优选的靶是VEGF/VPF，FGF，TGFβ，TIE-1和TIE-2。可操作这些受体中的每一个以形成可用作靶向配体的可溶性结合域。
iv.疾病相关的基质细胞靶
(a)胞外基质靶
Birembaut等(1985)描述了基底膜标记物在肿瘤病理学中的用途。这些研究表明：在肿瘤病理学中，基底膜(BM)标记物，IV型胶原，层粘连蛋白(LM)，硫酸乙酰肝素粘蛋白(HSP)和纤连蛋白(FN)的分布被破坏。Burtin等(1983)也描述了人转移性淋巴结中基底膜和结缔组织抗原的变化。
本发明可使用的优选靶是RIBS。据Ugarova等(1993)报道：构象变化出现于血纤蛋白原中，是由血纤蛋白原与血小板膜糖蛋白GPIIb-IIIa的相互作用引起的。血纤蛋白原与激活的血小板上膜糖蛋白GPIIb-IIIa的结合会导致血小板聚集，这种相互作用导致血纤蛋白原的构象发生变化，受体诱导的结合位点(RIBS)的表达就可以证明这一点，这种结合位点是由结合形式而非游离形式的配体表达的表位。
Ugarova等(1993)已定位了两个RIBS表位，一个序列位于γ112-119，它由MAb 9F9识别；第二个是位于Aα 95-98的RGDF序列，它由mAb 155B16识别。通过将血纤蛋白原吸附至塑料表面，并用纤溶酶消化该分子也可暴露这些表位。表位的蛋白酶解暴露与裂解Aα链的羧基末端以形成片段X2一致。血纤蛋白原内Aα95-98位RGDF序列的不可接近性表明此序列不参与该分子与GPIIb-IIIa的最初结合。
血纤蛋白原与其受体的结合改变了Aα链羧基末端方向的构象，暴露出位于该分子D和E区域之间的卷曲螺旋颈圈区段的序列，产生RIBS表位。实践中，建议将RIBS序列用作凝血配体靶向的表位，因此，使用Mab 9F9和155B16是有利的，使用Zamarron等(1991)所述的抗体也可能是有利的。
(b)其它的细胞靶
用于本发明的联合的其它优点在于：通过将它们靶向疾病区域内发现的细胞类型，可使用它们将促凝剂导入疾病相关的血管系统。
血小板通过粘附至受伤的血管壁并在受伤位点积累而参与止血和凝血。尽管血管受伤位点处的血小板沉积在生理条件下负责初步止血，但它在病理条件下会导致血管堵塞，结果导致缺血性组织损伤和血栓栓塞。
血小板与其环境的相互作用及其互相之间的相互作用代表了在细胞表面上起始的复杂过程，因此，表面膜提供了包括血管壁和血浆成分的外部介质与血小板内部之间的反应界面。
使用本发明可靶向p-155，p-155是激活的血小板上表达的多聚体血小板蛋白(Hayward等，1991)。血小板通过经受复杂的生物化学和形态学的变化而对大量刺激物作出反应，这些变化涉及包括粘附、聚集和凝血在内的生理学进程。血小板激活产生了可由单克隆抗体识别的膜变化。单克隆抗体JS-1(Hayward等，1991)是可用作凝血配体部分的这样一种抗体。
配体诱导的结合位点(LIBS)是仅在配体的结合导致受体改变形状、介导随后的生物学事件之后，而出现于细胞表面受体上的位点。可将它们看作RIBS的对应物，它们也是本发明优选使用的靶。
Frelinger等(1990；1991)已研制出了13种抗LIBS抗体，根据本发明，其中任何一种都可用于将促凝剂传递至疾病或肿瘤位点。也可使用Dewerchin等(1991)所述的鼠单克隆抗血小板抗体MA-TSPI-1(针对人血小板反应蛋白)和MA-PMI-2，MA-PMI-1和MA-LIBS-1(针对人血小板糖蛋白IIb/IIIa上的LIBS)，也可使用Heynen等(1994)所述的RUU2.41和LIBS-1；Tomiyama等(1992)所述的OP-G2；和Ab-15。
也可以使用很多其它的靶，如平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和浸润性淋巴细胞和白细胞上的抗原。
v.毒素
对某些应用而言，可预想第二种治疗剂是与抗体或生长因子结合的药剂，尤其是具有杀死内皮细胞或抑制其生长或细胞分裂这种能力的细胞毒性剂或抗细胞剂。通常，本发明的第二方面包括可与靶向剂(优选抗体)缀合、并能以活性形式传递至被靶向的内皮细胞或基质的任何药剂的使用。例举的抗细胞剂包括化学治疗剂，放射性同位素以及细胞毒素。有关化学治疗剂，发明人建议特别优选使用的药剂如：激素，如类固醇；抗代谢物，如阿糖胞苷，氟尿嘧啶，氨甲碟呤或氨基碟呤；anthracycline；丝裂霉素C；长春花生物碱；秋水仙胺；表鬼臼毒素吡喃葡糖苷；光辉霉素；或抗肿瘤烷化剂，如苯丁酸氮芥或苯丙氨酸氮芥。其它实施方案包括如细胞因子、生长因子、细菌内毒素或细菌内毒素的脂质A部分之类的药剂。在任何情况下，建议必要时，可使用已知的缀合技术将上述药剂成功地与靶向剂(优选与抗体)缀合，以使它们按需要靶向、内在化、释放或呈递至被靶向的内皮细胞位点处的血液成分(例见Ghose等，1983和Ghose等，1987)。
在某些优选的实施方案中，免疫毒素一般包括衍生自植物、真菌或细菌的毒素，如A链毒素、核糖体灭活蛋白、α-八叠球菌、曲霉菌素、局限曲菌素、核糖核酸酶、白喉毒素或假单胞菌外毒素，需指出这只是一些例子。免疫毒素领域的技术人员熟知毒素-抗体构建体的使用以及免疫毒素与抗体的结合。其中特别优选与抗体结合的毒素是去糖基化的蓖麻毒蛋白A链。去糖基化的蓖麻毒蛋白A链被优选的原因在于其具有十分强的效力，较长的半寿期，并且在临床级别和规模上制备它也便宜易行。
(a)制备靶向剂-毒素缀合物
尽管免疫毒素的制备一般是本领域已知的(例见美国专利4,340,535和欧洲专利44167，都列入本文作为参考)，本发明人仍意识到通过在制备免疫毒素和纯化该毒素以供随后临床施用的过程中使用某些优选的技术可获得某些好处。例如，尽管基于IgG的免疫毒素与其Fab’配对物相比一般表现出更好的结合能力和更慢的血液清除速率，但基于Fab’片段的免疫毒素与基于IgG的免疫毒素相比一般表现出更好的组织穿透能力。
另外，尽管已知多种类型的含有二硫键的连接子可成功地用于将毒素部分与靶向剂缀合，但基于不同的药理学特征和能力，某些连接子一般优于其它连接子。例如，优选含有空间上“受阻”的二硫键的连接子，因为这种连接子在体内更加稳定，可防止毒素部分在结合至作用位点之前就被释放下来。另外，尽管通过使用大量毒素部分中的任一种可实现本发明的某些好处，但发明人发现，使用蓖麻毒蛋白A链，甚至更优选使用去糖基化的A链，将会带来特别的好处。
已知多种细胞毒性剂可与抗内皮细胞抗体缀合，例子包括来自植物、真菌或甚至细菌的多种有用毒素，例如包括多种A链毒素，特别是蓖麻毒蛋白A链，如皂草素或gelonin的核糖体灭活蛋白，α-八叠球菌，曲霉菌素，局限曲菌素，如胎盘核糖核酸酶的核糖核酸酶，血管生成素(angiogenic)，白喉毒素和假单胞菌外毒素，所述的仅是一些例子。本发明最优选的毒素部分是已被处理以修饰或除去糖残基的毒素A链，即所谓的去糖基化A链。发明人通过使用目前可从Inland Laboratories，Austin，TX商购的去糖基化蓖麻毒蛋白A链(dgA)取得了最大的成功。
然而，从药理学的观点看，需要利用仍可提供适当生物反应的最小的分子，因此，可能会希望利用能提供足够抗细胞反应的较小A链肽。为此，其他人已发现，通过利用Nagarase(Sigma)除去30个N-末端氨基酸可使蓖麻毒蛋白A链被“截短”，但仍保留足够的毒素活性。建议必要时可在本发明的缀合物中使用这种截短的A链。
或者，可能会发现对毒素A链部分应用重组DNA技术会为本发明提供其它显著的优点。参照其他人的文献(O’Hare等，1987；Lamb等，1985；Halling等，1985)，已能够克隆和表达有生物学活性的蓖麻毒蛋白A链，这样，目前已有可能鉴定和制备仍表现出适当毒素活性的较小肽或变异肽。另外，蓖麻毒蛋白A链目前已被克隆，这一事实使得可利用定点诱变，通过定点诱变可容易地制备和筛选A链衍生的肽，并得到其它有用的部分以用于本发明。
缀合物的毒素A链区域与靶向剂区域的交联是本发明的一个重要方面。在某些情况下，需要利用具有二硫键功能的交联剂以使缀合物具有生物活性，这么做的原因尚不清楚，但可能是由于需要在靶向剂将毒素“传递至”被靶向的细胞时某些毒素部分能够容易地从靶向剂上释放下来。交联剂的类型，以及如何进行交联将会改变所得缀合物的药物动力学。归根结底，在希望毒素可以释放的情况下，人们期望的缀合物是在除了预定作用位点以外的所有身体部位中的条件下能够保持完整，而在所述作用位点处具有良好的“释放”特性。因此，具体交联方案，特别包括所用的具体交联剂和被交联的结构具有一定的意义。
取决于用作融合蛋白一部分的特定毒素化合物，可能会需要提供与靶向剂和毒素化合物可操纵地结合的肽间隔区，所述间隔区能折叠成以二硫键键合的环结构，然后，环内的蛋白酶裂解会产生异二聚体多肽，其中靶向剂和毒素化合物仅通过单个二硫键连接。例见Lord等(1992)，这种毒素的一个例子是蓖麻毒蛋白A链毒素。
当利用其它一些毒素化合物时，可提供不能被裂解的肽间隔区，以可操作地连接融合蛋白的靶向剂和毒素化合物。可与不能被裂解的肽间隔区结合使用的毒素是自身可通过蛋白水解切割而转变为细胞毒性的二硫键键合形式(例见Ogata等，1990)，这种毒素化合物的例子是假单胞菌外毒素化合物。
本文可使用的核酸包含编码所需靶向剂的核酸序列和编码所需毒素的核酸序列。这种编码靶向剂和编码毒素的核酸序列连接的方式能使得核酸的翻译可产生本发明的靶向剂/毒素化合物。
(b)其它药剂与靶向剂的结合
预计本发明其它IT方面的大多数治疗应用包括将毒素部分靶向肿瘤内皮细胞或基质，这是因为与其它潜在的药剂相比，大多数毒素提供细胞杀伤效应的能力更强。然而，也存在某些情况，例如当靶抗原通过与靶向剂/毒素化合物(如免疫毒素)有效致毒相一致的途径不能内在化时，就需要靶向化学治疗剂，如抗肿瘤药物，其它细胞因子，抗代谢物，烷化剂，激素等。这些药剂优于与非靶向剂缀合的对应物的优点在于靶向剂(如抗体)提供了额外的选择性。有关所述药剂的例子，有类固醇，阿糖胞苷，氨甲蝶呤，氨基蝶呤，anthracyclines，丝裂霉素C，长春花生物碱，秋水仙胺，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，光辉霉素等。当然，所列出的仅是一些例子，因为使药剂与靶向剂(如抗体)结合从而特异性传递至组织的技术已完善建立(例见Ghose和Blair，1987)。
目前，已成功地将多种化学治疗剂和其它药剂与抗体缀合在一起，并显示出起到药物的作用(例见Vaickus等，1991)。已研究的抗肿瘤剂包括例如阿霉素，柔红霉素，氨甲蝶呤，长春花碱和多种其它药剂(Dillman等，1988；Pietersz等，1988)。另外，已描述了其它药剂的结合，所述药剂如新制癌素(Kimura等，1983)，大分子霉素(Manabe等，1984)，三亚胺醌(Ghose，1982)和α-鹅膏毒环肽(Davis和Preston，1981)。
vi.凝血配体
本发明任选使用的第二种靶向剂也可包括能促进凝血的靶向成分，这种“促进靶向凝血的药剂”或“凝血配体”包括能与一种或多种凝血因子可操作结合的上述任何靶向剂。靶向剂可与能直接或间接刺激凝血的因子直接连接，或者靶向剂可连接第二个结合区域，所述区域可结合并释放能直接或间接刺激凝血的凝血因子。
(a)凝血因子
如本文详述，例举的凝血因子是本发明的tTF，二聚体、多聚体和突变体分子类型。
本发明可使用多种如下文所述的其它凝血因子。当凝血因子与第一种结合或靶向剂共价连接时，使用不同于其功能性凝血位点的位点来连接分子。在下文各章节中也描述了不同于凝血因子的活性位点或功能性区域的适当连接区域。
凝血因子
本发明中也可使用凝血酶，因子V/Va和衍生物，因子VIII/VIIIa和衍生物，因子IX/IXa和衍生物，因子X/Xa和衍生物，因子XI/XIa和衍生物，因子XII/XIIa和衍生物，因子XIII/XIIIa和衍生物，因子X激活物和因子V激活物。
蛇毒促凝剂
Williams和Esnouf于1962年证明Russell蝰蛇毒含有促凝剂蛋白，Kisiel(1979)分离出可激活因子V的蛇毒糖蛋白；Di Scipio等(1977)证明得自蛇毒的蛋白酶可激活人因子X。因子X激活物是可用于本发明的成分。
特异于Russell蝰蛇毒中存在的因子X激活物的单克隆抗体也已经产生(例如Pukrittayakamee等，1983的MP1)，可使用该单克隆抗体将药剂传递至体内特定的靶位点。
前列腺素和合成的酶
血栓烷A2是通过血小板微粒体中的环加氧酶和血栓烷合成酶的相继作用而由内过氧化物形成的。血小板易于产生血栓烷A2，血栓烷A2利用其引起血小板聚集的能力而成为有效的血管收缩剂(Whittle等，1981)。
血栓烷A2及其活性类似物都可以用于本发明。Bhagwat等(1985)描述了产生血栓烷A2的合成方案。本文特别包括使用Ohuchida等(1981)描述的血栓烷A2类似物(尤其是化合物2)。
血栓烷合成酶和能合成可激活血小板的前列腺素的其它酶也可用作本发明上下文中的“促凝剂”。Shen和Tai(1986)描述了血栓烷合成酶的单克隆抗体，以及该合成酶的免疫亲和纯化；Wang等(1991)报道了人血栓烷合成酶的cDNA。
纤溶抑制剂
α2-抗纤溶酶或α2-纤溶酶抑制剂是人血浆中天然存在的蛋白酶抑制剂，能有效抑制由纤溶酶原激活物诱导的血纤蛋白块的裂解(Moroi和Aoki，1976)。α2-抗纤溶酶是特别有效的抑制剂，可以用于本发明。
首选按Moroi和Aoki(1976)所述纯化α2-抗纤溶酶，也可使用其它纯化方案，如使用纤溶酶原-Sepharose上的亲和层析，DEAE-Sephadex上的离子交换层析和伴刀豆球蛋白A-Sepharose上的层析；或使用Sepharose柱上的亲和层析，所述柱上携有经弹性蛋白酶消化的纤溶酶原制剂，该制剂在纤溶酶A链上含有三个N-末端三联环结构(LBSI)，接着进行凝胶过滤(Wiman和Collen，1977；Wiman，1980)。
由于α2-抗纤溶酶的cDNA序列是可以得到的(Tone等，1977)，因此，产生α2-抗纤溶酶的优选方法是通过重组表达。
针对α2-抗纤溶酶的单克隆抗体也是可以得到的，该抗体可用于本发明的双特异性结合配体实施方案中。例如，Hattey等(1987)描述了两种针对α2-抗纤溶酶的MAb，即MPW2AP和MPW3AP。据报道这两种抗体与天然α2-抗纤溶酶的反应同样良好，因此它们都可用来将外源性的α2-抗纤溶酶传递至靶位点，或积累内源性α2-抗纤溶酶并将其集中于靶向区域内。也可使用由Mimuro及其同事描述的其它抗体，如JTPI-2。
(b)结合凝血因子的药剂
可与本发明的TF一起使用的另一组靶向凝血配体中的靶向区域不直接与凝血因子连接，但与可结合凝血因子的第二个结合区域连接。
当利用第二个结合区域结合和传递凝血因子时，选择的结合区域应使其识别凝血因子上不会显著损害其诱导凝血之能力的位点。适于以此方式结合的凝血因子区域一般与上文所述的适于共价连接靶向区域的区域相同。
然而，由于此类双特异性配体有望在将凝血因子传递至肿瘤位点或区域后将其释放出来，因此，凝血因子上适于结合第二种结合剂或抗体的区域更具灵活性。
可以此方式使用的适当的第二结合区域一般是对凝血因子具有结合特异性的抗体的抗原结合位点，所述抗体包括抗体的功能性部分，如scFv，Fv，Fab’，Fab和F(ab’)2片段。
含有针对组织因子、凝血酶、前激肽释放酶、因子V/Va、因子VIII/VIIIa、因子IX/IXa、因子X/Xa、因子XI/XIa、因子XII/XIIa、因子XIII/XIIIa、Russell蝰蛇毒、血栓烷A2或α2-抗纤溶酶的抗体或其片段的双特异性结合配体是本发明此方面的示范实施方案。
(c)TF前药
例举的tTF前药具有下列结构：tTF1-219(X)n1(Y)n2Z配体，其中tTF1-219表示TF减去胞质域和跨膜域；X表示疏水性的跨膜域，长度为n1个氨基酸(AA)(n＝1-20个AA)；Y表示亲水性的蛋白酶识别序列，长度为n2个氨基酸(足够的AA以确保适当的蛋白酶识别)；Z表示二硫键、硫酯键或其它连接基团，如(Cys)1-2；配体表示可识别肿瘤细胞、肿瘤EC、结缔组织(基质)或基底层标记物的抗体或其它靶向部分。
可静脉内注射tTF前药以使其定位于疾病位点(如肿瘤)。一旦定位于患病组织内，则内源性蛋白酶(如金属蛋白酶，凝血酶，因子Xa，因子VIIa，因子IXa，纤溶酶)会从前药上裂解下亲水性的蛋白酶识别序列，使疏水性的跨膜序列插入局部细胞膜。一旦尾部插入膜内，tTF即会重新获得其诱导凝血的特性，导致患病组织在血管系统内形成凝血块。
(d)双特异性抗体
一般而言，本领域技术人员熟知双特异性抗体的制备，例见Glennie等(1987)。双特异性抗体已被临床用于例如治疗癌症患者(Bauer等，1991)。制备双特异性抗体的一种方法包括分开制备对靶向的肿瘤细胞抗原和促凝剂(或其它所需靶，如激活性抗原)具有特异性的抗体。
双特异性抗体也已被特别地开发用作免疫治疗剂。如前文中有关抗原诱导的部分中所提及，已开发了某些这种抗体，以使淋巴细胞和肿瘤抗原交联(Nelson，1991；Segal等，1992)。例子包括嵌合分子，该分子可结合T细胞(如在CD3上)和肿瘤抗原，并通过在靶细胞附近物理交联TCR/CD3复合物而引发淋巴细胞激活(Staerz等，1985；Perez等，1985；1986a；1986b；Ting等，1988)。
实际上，据报道，癌症、淋巴瘤、白血病和黑素瘤的肿瘤细胞对双特异性抗体介导的T细胞杀伤敏感(Nelson，1991；Segal等，1992；deLeij等，1991)。这些类型的双特异性抗体已被用于几个I期临床试验以针对多种多样肿瘤目标。可按文献所述施用双特异性交联抗体，所述文献如deLeij等(1991)；Clark等(1991)；Rivoltini等(1992)；Bolhuis等(1992)和Nitta等(1990)。
尽管本领域已知多种制备双特异性抗体的方法，但Glennie等(1987)的方法包括制备两种选定抗体的消化性F(ab’γ)2片段，接着对各个片段进行还原以得到分离的Fab’γSH片段。然后，用如邻苯二马来酰亚胺的交联试剂使欲偶联的两个配对物之一上的SH基团烷基化，从而在一个配对物上提供游离的马来酰亚胺基团。然后可通过硫酯键将此配对物与另一个配对物缀合，得到所需的F(ab’γ)2异缀合物。
因其制备容易，产量高和再现性好，Glennie等(1987)的方法经常是制备双特异性抗体的优选方法，然而，也可以使用很多其它方法，这些方法是发明人可以预想到的。例如，已知的其它一些技术中用SPDP或蛋白质A进行交联，或制备三特异性构建体(Titus等，1987；Tutt等，1991)。
产生双特异性抗体的另一种方法是通过融合两种杂交瘤以形成四倍体瘤(quadroma)(Flavell等，1991，1992；Pimm等，1992；French等，1991；Embleton等，1991)。本文所用术语“四倍体瘤”描述的是两种B细胞杂交瘤的生产性融合体。使用目前的标准技术，将两种产生抗体的杂交瘤融合在一起，得到子代细胞，然后选择出维持两套克隆型免疫球蛋白基因之表达的那些细胞。
产生四倍体瘤的优选方法包括选择出至少一种亲代杂交瘤的酶缺损突变体，然后，将第一种突变的杂交瘤细胞系与已被致死性暴露于如碘乙酰胺以防其持续存活的第二种杂交瘤的细胞融合。通过细胞融合，通过从被致死性处理过的杂交瘤处获得补偿酶缺损的基因，从而挽救第一种杂交瘤，而通过与第一种杂交瘤的融合也挽救了第二种杂交瘤。优选(但并非要求)相同同种型、但属于不同亚类的免疫球蛋白融合。如果用其它试验分离优选的四倍体瘤，则可使用混合亚类的抗体。
更详细地说，培育和筛选四倍体瘤的一个方法包括得到分泌第一种选定MAb的杂交瘤细胞系，并使其缺损必需的代谢酶，即次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)。为了得到该杂交瘤的缺损突变体，在浓度渐增的8-氮鸟嘌呤(1×10-7M至1×10-5M)的存在下培养细胞。通过有限稀释亚克隆突变体，并测试其对次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)的敏感性。培养基可由例如添加了10％FCS，2mM L-谷氨酰胺和1mM青霉素-链霉素的DMEM组成。
通过标准的细胞融合技术(Galfre等，1981)，或通过使用Clark等(1988)所述的方案，利用产生第二种所需MAb的互补杂交瘤细胞系来产生四倍体瘤。简单地说，将4.5×107个HAT敏感型的第一种细胞与2.8×107个HAT抗性的第二种细胞混合，所述第二种细胞已于融合前，在冰上用致死剂量的不可逆生化抑制剂碘乙酰胺(5mM于磷酸盐缓冲盐水中)预处理30分钟。使用聚乙二醇(PEG)诱导细胞融合，将细胞平铺在96孔微量培养板上，使用含有HAT的培养基选择四倍体瘤。使用例如固相同种型特异性ELISA和同种型特异性免疫荧光染色鉴定含有双特异性抗体的培养物。
在一个鉴定双特异性抗体的鉴定实施方案中，微量培养板(Falcon，Becton Dickinson Labware)的孔被一种试剂包被，所述试剂可与亲代杂交瘤抗体中的一种特异性相互作用，但缺乏与两种抗体的交叉反应性。洗涤培养板，封闭，并向各个孔中加入需检测的上清液(SN)。室温下将培养板保温2小时，弃上清液，洗涤板，室温下加入经稀释的碱性磷酸酶-抗抗体缀合物达2小时。洗涤板，在各个孔中加入磷酸酶底物，如对硝基苯基磷酸盐(Sigma，St.Louis)。保温培养板，在各个孔中加入3N NaOH以终止反应，使用ELISA读数器测定OD410的值。
在另一个鉴定实施方案中，使用经聚-L-赖氨酸预处理的微量培养板将靶细胞之一结合至各个孔中，然后使用例如1％的戊二醛固定细胞，检测双特异性抗体结合完整细胞的能力。另外，本发明中也可结合使用FACS，免疫荧光染色，独特型特异性抗体，抗原结合竞争试验和抗体鉴定领域公知的其它方法来鉴定优选的四倍体瘤。
分离四倍体瘤之后，从其它细胞产物中纯化出双特异性抗体，通过免疫球蛋白纯化领域技术人员公知的多种蛋白质分离方法可实现纯化目的。制备和鉴定抗体的方法是本领域众所周知的(例见抗体：实验室手册，1988)。
例如，可以将得自选定四倍体瘤的上清液穿过蛋白质A或蛋白质G Sepharose柱以结合IgG(取决于其类型)。然后用例如pH5.0的柠檬酸盐缓冲液洗脱结合的抗体，对等渗的缓冲液透析含有BsAb的洗脱级分。或者，也可将洗脱物穿过抗免疫球蛋白-Sepharose柱，然后用3.5M氯化镁洗脱BsAb。然后可通过例如如上所述的同种型特异性ELISA和靶细胞的免疫荧光染色试验检测以此方式纯化的BsAb的结合活性。
也可通过SDS-PAGE电泳，接着用银或考马斯蓝染色，从而鉴定和分离经纯化的BsAb和亲代抗体。当亲代抗体之一的分子量比另一种更高时即有可能如此，其中BsAb带迁移至两种亲代抗体的中间。样品的还原证实了其中存在两种不同表观分子量的重链。
另外，目前一般可以使用重组技术制备抗体，也可制备编码具有所需双特异性之抗体的重组抗体基因(Van Duk等，1989)。因此，选择出具有最优选结合特性的单克隆抗体之后，可通过例如噬菌体表达文库的免疫学筛选分离出这些抗体的相应基因(Oi和Morrison，1986；Winter和Milstein，1991)，然后，通过Fab编码域的重排，可很容易得到适当的嵌合构建体。
vii.联合治疗
与免疫毒素或凝血配体联合的组织因子组合物可用于多种人类癌症和甚至其它障碍(如良性前列腺增生和类风湿性关节炎)的临床治疗中，在所述癌症和障碍中中期或较长期地阻断血流将是有利的。
本申请所公开的组织因子组合物与免疫毒素和凝血配体的联合被认为是抗肿瘤疗法中特别有用的工具。由本文所提供的包括动物研究的数据，以及淋巴瘤治疗相关领域的知识(Glennie等，1988)，可直接得出T-细胞靶向(Nolan和Kennedy，1990)和药物靶向(Paulus，1985)的适当剂量和治疗方案。
本发明建议：在治疗癌症时，与上述组织因子构建体一起使用的免疫毒素和凝血配体当经由IV途径以每周约1次的频率施用时，其有效剂量约为0.1mg/kg至2mg/kg，优选约为0.8mg/kg至1.2mg/kg。根据被治疗的受试者的病情必需对剂量作一些改动。在任何情况下，负责给药的人员会确定各个受试者的适当剂量。这种最优化和调整可在本领域中常规进行，并不需要额外的实验。
当然，在广泛使用前需进行进一步的动物研究和临床试验。本领域技术人员参照本发明会知道进行临床试验的多个要素，包括患者疗法和监测。提供的下列资料可作为建立这种试验的一般性指南。
预计选定用于联合研究的患者对至少一个常规疗程没有反应，并且，通过体格检查、实验室技术或放射显影方法测定出该患者具有可见的可测疾病。当鼠单克隆抗体部分被用于免疫毒素或凝血配体时，患者应对小鼠免疫球蛋白没有变态反应史。在开始该研究之前至少2周应停止任何化学疗法。
至于与免疫毒素或凝血配体一起施用组织因子构建体，人们认为使用存在于中枢静脉内的具有三联腔门的导管较有利。应使用例如0.22μ的滤膜过滤治疗混合物，并用例如盐水适当稀释至终体积为100ml。使用前，也应以类似方法过滤检测样品，过滤之前和之后通过测定A280评估样品浓度。预计回收率应为87至99％，然后可根据蛋白质的损失进行调整。
这些组织因子和IT或凝血配体的联合可在约4至24小时的期间内施用，且每个患者以2至7天的间隔接受2至4次输注。也可以在7天的期间内以稳定的输注速率施用。输注的剂量水平应取决于是否观察到任何毒性。因此，如果任何单次输注之后，或稳定速率输注的特定时间点达到II级毒性，应终止进一步的给药或停止稳定速率输注直至毒性改善为止。应将剂量逐渐增加的组织因子与免疫毒素或凝血配体施用于患者组直至任一组中约60％的患者显示出不可接受的III级或IV级毒性。为此值2/3的剂量可确定为安全剂量。
当然，治疗之前和治疗后每隔不超过1个月应进行体格检查、肿瘤测量和实验室检测。实验室检测应包括全血计数，血清肌酸酐，肌酸激酶，电解质，脲，氮，SGOT，胆红素，白蛋白和总血清蛋白。应通过放射免疫测定法评价治疗后不超过60天取的血清样品中完整组织因子、免疫毒素和/或凝血配体或其组分和针对其任何部分的抗体的存在。使用任何标准测定法，例如ELISA或RIA，对血清进行免疫学分析，可评价治疗剂的药物动力学和清除情况。
为了评价抗肿瘤反应，应在最后一次输注后48小时至1周内和第30天检查患者。当存在可触知的疾病时，应在治疗过程中的每一天，治疗完成后的1周内，和第30天测定所有肿瘤块的两个正交直径。为了测量不可触知的疾病，应在48小时至1周内和第30天，遍及胸、腹和骨盆以1cm为间隔进行系列CT扫描。也应使用疾病位点活检标本或适当时使用血液或流体样品，在组织学上和/或通过流式细胞术评价组织样品。
可通过能接受的测量确定临床反应。例如，治疗后1个月所有可测肿瘤消失可被确定为完全反应。而治疗后1个月所有可评估的肿瘤结的正交直径乘积的总和降低50％或以上，并且无肿瘤位点显示出增大，即可被确定为部分反应。类似地，治疗后1个月所有可测病变的正交直径乘积减少50％或以上，并且一个或多个位点有恶化即可被确定为混合反应。F.半寿期延长的TF
本文阐明，通过将tTF与延缓tTF从体内清除出去的载体分子(如免疫球蛋白)缀合，可增强tTF的抗肿瘤活性。例如，tTF与免疫球蛋白的连接可通过延长tTF的体内半寿期，使tTF保留时间更长并有更长时间诱导肿瘤血管中的血栓形成，从而增强抗肿瘤活性。半寿期的延长或者是由于tTF大小的增加超过肾小球过滤限度造成的；或者是由于缀合物在肾脏内被积极地再吸收(这是免疫球蛋白Fc片段的一个特性)造成的(Spiegelberg和Weigle，1965)。也可能是免疫球蛋白组分改变了tTF的构象，使其变得更具有活性或更稳定。除免疫球蛋白以外，其它载体分子也可产生类似的效果，因此也包含在本发明中。
F1.修饰
假定对通过tTF与免疫球蛋白的连接观察到的半寿期延长第一种解释只是所致大小的增加导致血浆半寿期延长，则发明人预计在本发明中可有利地使用能增加TF构建体大小的其它修饰，只要延长性修饰基本上不使经修饰的TF构建体恢复膜结合功能即可。只要无这种可能性(这可很容易检测)，实际上任何一般性的惰性的生物学可接受的分子均可与TF构建体缀合，以制备体内半寿期有所增加的经修饰TF。
也可以修饰TF自身结构以使其变得更加稳定，或可能的话降低其在体内的分解代谢速率。这种修饰的一个机制是使用d-氨基酸替代TF分子中的1-氨基酸。本领域技术人员应理解，导入这种修饰之后需要精确地检测所得分子，以确保其仍保留所需的生物学特性。其它的稳定化修饰包括在N末端或C末端或两端加上稳定化的部分，这一般用于延长生物分子的半寿期。例如，可以通过酰化或氨基化来修饰TF构建体的末端。可将多种此类修饰一起使用，TF分子的部分也可以被模拟肽的化学结构替代，所述结构可维持生物学功能，并仍能改善分子的稳定性。
F2.缀合物
i.蛋白质
可用于将所需蛋白质与载体蛋白缀合的技术被广泛用于科学界。一般应理解，在制备这种TF缀合物以用于本发明时，被选定作为载体分子的蛋白质应具有某些确定的特性。例如，它当然必须是生物学相容的，施用于患者后不会导致任何显著的不良作用。另外，一般需要载体蛋白相对比较惰性，并且是非免疫原性的，这两个特性会维持TF功能，并且使所得构建体不会被肾脏排出。例举的蛋白质是白蛋白和球蛋白。
ii.非蛋白质
同上述蛋白质缀合物一样，本发明的TF分子也可与非蛋白质因子缀合以改善其在体内的半寿期。对这种缀合物中所用非蛋白质分子的选择对本领域技术人员而言也是容易实现的。例如，可以使用包括多糖和PEG在内的多种天然或合成聚合物中的任何一种或多种。
在制备缀合物的过程中，不论是蛋白质与否，应注意满足的条件是：被导入的缀合物基本上不会使经修饰的TF分子与质膜再次结合，导致增加了凝血能力、并在施用后产生有害副作用的分子产生。作为一般性的原则，我们相信这些实施方案中应尽量避免疏水性的加合物或缀合物。
iii.免疫缀合物
当使用抗体与本发明的tTF组分缀合时，对抗体的选择一般取决于TF-抗体缀合物的用途。例如，当除了仅使用TF分子外，还使用TF免疫缀合物时，就应考虑肿瘤的类型，例如是否优先靶向肿瘤细胞，或者是否更优先靶向肿瘤血管系统或肿瘤基质。当TF免疫缀合物自身是主要的治疗剂时，免疫缀合物在任何意义上都不是“被靶向的免疫缀合物”。在这些方面，TF分子与抗体或其部分的缀合可简单地进行，以产生与原始TF分子相比其半寿期和/或生物可利用性有所改善的构建体。在任何情况下，通过特定类型抗体的应用可获得一些好处，例如，与其Fab’对应物相比，基于IgG的抗体有望表现出更好的结合能力和更慢的血液清除速率，而基于Fab’片段的组分一般表现出更好的组织穿透能力。
(a)单克隆抗体
制备和鉴定抗体的方法是本领域众所周知的(例见抗体：实验室手册，冷泉港实验室，1988)。
产生单克隆抗体(MAb)的方法一般沿着与制备多克隆抗体相同的途径开始。简单地说，多克隆抗体是这样制备的：用本发明的免疫原性组合物免疫动物，之前是否需要经过免疫耐受得取决于所用的抗原组成和方案(如耐受正常的细胞群体，然后用肿瘤细胞群体免疫)，再从经免疫的动物中收集抗血清。多种动物可用于制备抗血清，用于产生抗抗血清的典型动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。由于兔的血量相对较多，所以优选利用兔产生多克隆抗体。
正如本领域技术人员众所周知的，给定组合物的免疫原性各不相同，因此，经常必须强化宿主的免疫系统，通过将肽或多肽免疫原与载体偶联可以实现此目的。例举和优选的载体是匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。也可将其它白蛋白用作载体，如卵白蛋白，小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白。将多肽与载体蛋白缀合的方法是本领域技术人员众所周知的，包括用戊二醛，间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)，碳二亚胺和双重氮化联苯胺(bis-biazotized benzidine)。
本领域还熟知，使用免疫应答的非特异性刺激物(已知为佐剂)可增强特定免疫原组合物的免疫原性。例举的和优选的佐剂包括完全弗式佐剂(含有被杀死的结核杆菌的免疫应答非特异性刺激物)，不完全弗式佐剂和氢氧化铝佐剂。
产生多克隆抗体中所用免疫原组合物的量随免疫原的特性以及免疫所用动物的不同而不同。可使用多种途径施用免疫原(皮下，肌内，真皮内，静脉内和腹膜内)。可通过在免疫后的多个时间点取经免疫动物的血样监测多克隆抗体的产生，也可以进行第二次加强免疫注射。重复加强免疫和滴度测定的过程直至获得适当的滴度。当达到所需的滴度水平时，可对经免疫动物进行取血，分离血清并储存，和/或可使用该动物产生Mab。
通过使用众所周知的技术，如美国专利4,196,265(列入本文作为参考)中例举的技术可很容易制备MAb。所述技术一般包括用选定的免疫原组合物(如纯化的或部分纯化的肿瘤细胞或血管内皮细胞蛋白，多肽，肽或完整细胞组分)免疫合适的动物。以能有效刺激产生抗体之细胞的方式施用免疫组合物。如小鼠和大鼠的啮齿类动物是优选的动物，然而，也可以使用兔、绵羊、青蛙的细胞。使用大鼠可能有些好处(Goding，1986，p60-61)，但优选使用小鼠，最优选BALB/c小鼠，因为它是最常规使用的，一般有较高的稳定融合百分比。
免疫后，选择具有产生抗体之潜力的体细胞，具体为B淋巴细胞(B细胞)，以用于产生MAb。这些细胞可得自活检的脾脏、扁桃体或淋巴结，或得自外周血样品。优选脾细胞和外周血细胞，因为前者富含产生抗体的细胞，所述细胞处于分裂着的浆母细胞期，优选后者则是因为外周血易于得到。经常需免疫一组动物，取出具有最高抗体滴度的动物脾脏，用注射器匀浆脾脏以得到脾淋巴细胞。经免疫小鼠的脾脏一般约含有5×107至2×108个淋巴细胞。
然后，将得自经免疫动物的可产生抗体的B淋巴细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞融合，所述骨髓瘤细胞来源的种类一般与经免疫动物的种类相同。适用于产生杂交瘤的融合方案中的骨髓瘤细胞系优选是不产生抗体的，具有高融合效力，存在酶缺损，使其不能在某些选择性培养基中生长，所述培养基仅支持所需融合细胞(杂交瘤)生长。
可使用大量骨髓瘤细胞中的任一种，这一点是本领域众所周知的(Goding，p65-66，1986；Campbell，p75-83，1984)。例如，当免疫动物是小鼠时，可使用P3-X63/Ag8，X63-Ag8.653，NS1/1.Ag41，Sp210-Ag14，FO，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XXO Bul；对大鼠而言，可使用R210.RCY3，Y3-Ag1.2.3，IR983F，4B210或上述小鼠细胞系中的任一种；至于人细胞融合，可使用U-266，GM1500-GRG2，LICR-LON-HMy2和UC729-6。
产生抗体的脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂合体的产生方法一般包括在可促进细胞膜融合的试剂(化学或电学的)的存在下，以4∶1的比例将体细胞与骨髓瘤细胞混合，但所述比例可以在20∶1至1∶1之间变化。Kohler和Milstein(1975；1976)已描述了使用仙台病毒的融合方法，Gefter等(1977)描述了使用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v)PEG的融合方法。电诱导的融合方法也是适用的(Goding，p71-74，1986)。
融合操作通常以约1×10-6至1×10-8的低频率产生存活的杂合体，然而，这不是问题所在，因为通过在选择性培养基中培养，存活的融合杂合体与亲代未融合的细胞(尤其是正常情况下可持续地无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)能区分开。选择性培养基一般是在组织培养基中含有可阻断核苷酸从头合成的试剂。例举的和优选的试剂是氨基蝶呤，氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤能阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸仅能阻断嘌呤的合成。当使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤时，要在培养基中添加次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，则在培养基中添加次黄嘌呤。
优选的选择性培养基是HAT。只有能进行核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞中补救途径的关键酶，如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)具有缺陷，因而它们不能存活。B细胞可进行此途径，但它们在培养中的寿命有限，一般在约2周内死亡。因此，仅有的能在选择性培养基中存活的细胞是由骨髓瘤和B细胞形成的杂合体。
这种培养提供了杂交瘤群体，从中可选择出特定的杂交瘤。一般通过在微滴定板中进行单克隆稀释而培养细胞，接着检测各个克隆上清液(2至3周后)中的目的反应性，从而选择杂交瘤。检测试验应该比较灵敏、简单和快速，如放射性免疫测定法，酶免疫测定法，细胞毒性测定法，噬斑测定法，点免疫结合测定法等。
然后，可连续稀释选定的杂交瘤并克隆成能产生抗体的各个细胞系，再无限增殖各克隆以提供MAb。可经两种基本方法利用细胞系产生MAb。其中之一是将杂交瘤的样品注射至(经常为腹腔内)组织相容性动物，该动物类型与提供体细胞和骨髓瘤细胞以供最初融合所用的动物类型相同。被注射的动物长出分泌特定单克隆抗体的肿瘤，该抗体由融合的细胞杂合体产生。然后可抽出动物的体液，如血清或腹水液，以得到高浓度的MAb。另一种方法是在体外培养单个细胞系，其中MAb一般会分泌至培养基中，从中可很容易得到高浓度的MAb。必要时，可使用过滤、离心和多种层析方法(如HPLC或亲和层析)，对由这两种方法之一产生的MAb进一步纯化。
发明人预计也可使用分子克隆方法产生单克隆抗体。为此，可由分离自免疫动物脾脏的RNA制备组合免疫球蛋白噬菌粒文库，通过使用表达抗原的细胞和对照细胞(如正常与肿瘤细胞)进行淘选来选择表达适当抗体的噬菌粒。此方法相对于常规杂交瘤技术的优点在于一轮中可产生和筛选多约104倍的抗体，通过H和L链的组合产生了新的特异性，这进一步增加了发现适当抗体的机会。
当本发明使用MAb时，它们可来源于人，鼠，猴，大鼠，仓鼠，鸡或甚至兔。本发明包括使用人抗体，来源于小鼠、大鼠或其它种、携有人恒定和/或可变区域的“人源化”或嵌合抗体，和其它重组抗体及其片段。当然，由于其易于制备和易于获得试剂，因此一般优选鼠单克隆抗体。
(b)功能性抗体结合区
  Fab
通过用非特异性的巯基蛋白酶，即木瓜蛋白酶蛋白水解整个免疫球蛋白，可得到Fab片段。必须首先用半胱氨酸、2-巯基乙醇或二硫苏糖醇还原其活性位点中的巯基基团以激活木瓜蛋白酶。应通过用EDTA(2mM)螯合除去酶储液中的重金属，以确保最大的酶活性。一般以1∶100的重量比将酶和底物混合在一起。保温后，可以用碘乙酰胺使巯基不可逆地烷基化或简单地通过透析而终止反应。应通过SDS-PAGE监测消化的完成情况，并通过蛋白质A-Sepharose或离子交换层析将多种组分分开。
F(ab’)2
由兔和人源的IgG制备F(ab’)2片段的常规步骤是用胃蛋白酶有限水解(方法7.3.2)，条件是37℃，醋酸盐缓冲液(pH4.5)中的抗体过量100倍(w/w)，这样抗体在重链之间二硫键的C末端一侧被切割。小鼠IgG的消化速率随亚类的不同而不同，难以得到高产量的不含一些未消化或完全降解的IgG的活性F(ab’)2片段。更具体地说，IgG2b对完全降解高度敏感。其它亚类需要不同的保温条件以得到最佳结果。
用胃蛋白酶消化大鼠IgG需要的条件包括在0.1M醋酸盐缓冲液，pH4.5中透析，然后与1％w/w胃蛋白酶一起保温4小时；如果首先于4℃对0.1M甲酸盐缓冲液，pH2.8透析16小时，接着对醋酸盐缓冲液进行透析，则可改善IgG1和IgG2a的消化。IgG2b于37℃在含葡萄球菌V8蛋白酶(3％w/w)的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.8)中保温4小时会得到更一致的结果。
iv.第二代TF免疫缀合物
发明人预计，本文所述有利研究中所用的tTF-免疫球蛋白构建体中的免疫球蛋白Fc部分可能实际上是导致体内半寿期增加的抗体分子相关部分。可以合理地假定，与Fc区域的缀合可导致TF-Fc缀合物在肾脏内的积极再吸收，使缀合物回复至全身性循环。籍此，可将本发明的任何凝血缺损的TF构建体或变体与Fc区域缀合以增加所得缀合物的体内半寿期。
可以使用多种方法产生纯度足以使其与TF构建体缀合的Fc区域，例如，化学裂解抗体以提供确定的区域或部分是众所周知的，也易于实施，也可以使用重组技术制备大量Fc区域，或者，实际上在制备表达所需融合蛋白的重组载体之后可制备整个TF-Fc缀合物。
也可以对免疫球蛋白共有的结构进行进一步的操作以提供半寿期有所增加的第二代TF构建体。例如，可以考虑用截短的组织因子或其变体取代IgG分子的CH3区域。一般说来，产生这种杂合体分子的最有效机制是使用分子克隆技术和重组表达。所有这些技术一般都是本领域技术人员众所周知的，下文将更详细地描述这些技术。
F3.连接方式
可以任何可操作的方式使上述组分与组织因子组分连接，以使各个区域行使其预定的功能，而对组织因子的功能没有显著的损害。因此，连接组分应能延长构建体的半寿期，组织因子应能促进血液凝结。
i.生物化学交联剂
上述任一组分与组织因子组分连接所利用的技术一般与为制备免疫毒素而开发的技术相同。一般的指导思想认为适用于免疫毒素的任何生化交联剂也可以用于本发明，也可考虑使用其它连接剂。
可使用交联剂来形成将两个不同分子(如稳定剂和促凝剂)的功能性基团连接到一起的分子桥。为了逐步连接两个不同的蛋白质，可使用不会形成不需要的同聚物的异双功能交联剂。
表IV异-双功能交联剂
连接剂 对下列物质有活性 优点和应用 间隔区臂的长度/交联后
SMPT 伯胺  巯基 较强的稳定性 11.2A
SPDP 伯胺  巯基 巯基化，可裂解的交联 6.8A
LC-SPDP 伯胺  巯基 间隔区臂延长 15.6A
磺基LC-SPDP 伯胺  巯基 间隔区臂延长，可溶于水 15.6A
SMCC 伯胺  巯基 稳定的马来酰亚胺反应基团，酶-抗体缀合，半抗原-载体蛋白质缀合 11.6A
磺基-SMCC 伯胺  巯基 稳定的马来酰亚胺反应基团，可溶于水，酶-抗体缀合 11.6A
MBS 伯胺  巯基 酶-抗体缀合，半抗原-载体蛋白质缀合 9.9A
磺基-MBS 伯胺  巯基 可溶于水 9.9A
SIAB 伯胺  巯基 酶-抗体缀合 10.6A
磺基-SIAB 伯胺  巯基 可溶于水 10.6A
SMPB 伯胺  巯基 间隔区臂延长，酶-抗体缀合 14.5A
磺基-SMPB 伯胺  巯基 间隔区臂延长，可溶于水 14.5A
EDC/磺基-NHS 伯胺  羧基 半抗原-载体缀合 0
ABH 糖类，无选择性 与糖基反应 11.9A
例举的异双功能交联剂含有两个反应基团：一个与伯胺基团反应(如N-羟基琥珀酰亚胺)，另一个与巯基反应(如吡啶基二硫化物，马来酰亚胺，卤素等)。通过伯胺反应基团，交联剂可与一种蛋白质(如选定抗体或片段)的赖氨酸残基反应，而通过巯基反应基团，已与第一种蛋白质连接的交联剂可与另一种蛋白质(如促凝剂)的半胱氨酸残基(游离的巯基)反应。
因此，可以看出，优选的组织因子组分一般具有，或被衍生化而具有可用于交联的官能团。不应认为这种需求是局限性的，因为多种基团可以此方式使用。例如，伯胺或仲胺基团，酰肼或肼基团，羧基醇，磷酸，或烷基化基团都可用于结合或交联。有关连接技术的综述，可参见Ghose和Blair(1987)。
交联剂两个反应基团之间的间隔区臂可具有不同的长度和化学组成。较长的间隔区臂可使缀合物组分具有较好的灵活性，而桥中的一些特定组分(如苯基)可使反应基团仍具有额外的稳定性，或使化学连接对多方面作用的耐受性有所增加(如使二硫键对还原剂有耐受性)。也可以使用肽间隔区，如L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala。
优选使用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知含有二硫键的多种类型连接子可成功地用于缀合靶向剂和促凝剂。经证实，含有空间受阻的二硫键的连接子在体内的稳定性更强，可防止组织因子在结合至作用位点之前释放出来，因此，这些连接子是一组优选的连接剂。
免疫毒素中可用的最优选交联剂之一是SMPT，它是含有二硫键的双功能交联剂，所述二硫键在空间上受相邻苯环和甲基的阻碍。人们相信二硫键在空间上受阻可以起到保护二硫键免受组织和血液中可能存在的硫醇盐阴离子(如谷胱甘肽)的进攻的作用，从而有助于防止缀合物在将结合的药剂传递至肿瘤位点之前发生脱偶联。预计也可以在本发明双特异性凝血配体中使用SMPT试剂。
SMPT交联试剂与很多其它已知的交联试剂一样，具有交联诸如半胱氨酸的SH或伯胺(如赖氨酸的ε氨基)之类官能团的能力。另一类可能的交联剂包括含有可裂解的二硫键的异双功能光反应性叠氮基苯，如磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基-水杨酰胺基)乙基-1，3’-二硫丙酸。N-羟基-琥珀酰亚胺基基团与伯氨基反应，叠氮基苯(通过光解)与任何氨基酸残基非选择性地反应。
除了受阻的交联剂外，本发明中也可以使用不受阻的交联剂。其它不含有或不产生受保护的二硫键的有用交联剂包括SATA，SPDP和2-亚氨基硫杂戊环(2-iminothiolane)(Wawrzynczak和Thorpe，1987)，这类交联剂的使用是本领域所熟知的。
一旦缀合后，一般应纯化tTF以将缀合物与未缀合的靶向剂或促凝剂以及其它污染物分开。可使用大量纯化技术来提供纯度足够高的缀合物以使它们在临床上有用。一般最常用基于大小分离的纯化方法，如凝胶过滤，凝胶渗透或高效液相层析。也可以使用其它层析技术，如Blue-Sepharose分离法。
ii.重组融合蛋白
本发明的tTF组分也可以是通过分子生物学技术制备的融合蛋白，使用重组DNA技术达到此目的目前是本领域技术人员的标准操作，这些方法包括例如体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/基因重组。另外，可使用自动合成仪进行DNA和RNA的合成(例见Sambrook等，1989；和Ausubel等，1989所述的技术)。
这种融合蛋白的制备一般要求制备第一和第二DNA编码区，并读框一致地将所述区域功能性连接在一起，以制备编码所需融合蛋白的单一编码区。在本发明中，tTF或TF突变体DNA序列一般与编码惰性蛋白质载体，免疫球蛋白，Fc区域等的DNA序列读框一致地连接。融合蛋白的TF部分或惰性部分被制成N末端区域还是C末端区域一般并不特别相关。至于第二代TF免疫球蛋白分子，可将TF编码序列进一步插入免疫球蛋白的编码区内，以使TF序列在功能上破坏免疫球蛋白序列，被编码的蛋白质可被认为是“三合体(tribrid)”。
一旦得到了所需的编码区，即可制备表达载体。表达载体在插入的DNA区域上游含有一个或多个启动子，其功能是促进DNA转录，因此促进所编码的重组蛋白质的表达。这就是“重组表达”的含义，在说明书别处已经讨论过。
F4.检测
至于本发明的其它方面，一旦为了提供体内半寿期有所增加的构建体而制成了候选的TF构建体，一般应检测该构建体以确保所得化合物所需特性。用于测定这种功能变化的多种试验是常规的，本领域技术人员可很容易实施。
在仅为了增加其大小而设计的TF构建体中，对增加大小的证实完全是常规技术。例如，可简单地使用被设计成依据大小分离生物组分的任何方法学来分离候选组分，可分析分离的产物以确定已产生了大小有所增加的TF构建体。例如，可以用分离凝胶和分离柱，如凝胶过滤柱。分离缀合和未缀合组分的混合物过程中使用凝胶过滤柱在本发明的其它方面(例如产生相对高水平缀合物、免疫毒素或凝血配体时)也是有用的。
由于本发明的此类缀合物的目的是提供体内半寿期有所增加的凝血缺的TF分子，因此一般应检测候选的TF修饰变体或缀合物以证实此特性的存在。这种测定法也是常规技术。第一种简单的测定法是在体外试验中确定候选的经修饰或缀合的TF的半寿期。这种测定法一般包括混合血清中的候选分子，并测定该分子相对于凝血缺损组织因子的原始样品而言，是否以相对完整的形式保留较长一段时间。可再次从混合物中取出等分试样并测定其大小，并优选测定其生物学功能。
生物学半寿期或“清除”的体内试验也是易于进行的。在这些系统中，一般优选用可检测的标记物标记受试的候选TF构建体，施用于动物之后跟踪标记物的存在，优选施用的途径是最终治疗策略欲采用的途径。作为此方法的一部分，应取体液样品，尤其是血清和/或尿样，并分析样品中与TF构建体结合的标记物的存在，这可以指出构建体在体内自然环境中的寿命。
因此，本文所述治疗方法中可使用一种或多种半寿期有所增加的TF分子或其联合。建议给药剂量一般为每位患者约0.2mg至200mg，与上述的原始TF构建体一样。然而，由于这些TF分子已被修饰，有效剂量甚至可以更低，如约0.1mg左右。当以施用药物的次数使用半寿期增加的TF时，更可能改变的是治疗方案而不是给药的剂量。例如，当建议在治疗期间第1，3和7天使用原始TF构建体时，对于具有更长半寿期的相应改良TF而言，则只需在第1和7天给药。在任何情况下，本领域技术人员都可以很容易地确定有关给药剂量和次数的所有这种最优化。G.TF和因子VIIa联合
本发明人进一步阐明，在因子VIIa的存在下，与A20细胞结合的tTF诱导凝血的活性显著增强。与早期研究相同的是，这些体外结果也可以同样出现于体内环境中。本文提供的研究阐明：通过共同施用因子VIIa，多种凝血缺损TF构建体的抗肿瘤活性都有所增强。甚至使用众所周知难以凝血的HT29肿瘤实验动物模型，共同施用凝血缺损TF构建体和外源因子VIIa都会导致肿瘤组织发生相当多的坏死。
此数据可被解释为tTF可结合因子VII，但不能有效地介导其被Xa和相邻的因子VIIa分子激活为因子VIIa。提供预先形成的(外源性)因子VIIa来源可克服此阻碍，使得凝血更加有效。凝血缺损TF和因子VIIa联合治疗的成功一般基于TF构建体在肿瘤血管系统内令人惊奇的定位。缺乏这种令人惊奇的定位和特异性的功能作用，共同施用因子VIIa在肿瘤治疗中就没有意义，甚至可能会是有害的，因为它可能会在多种健康组织中促进不期望的血栓形成。以非靶向的方式联合使用tTF和因子VIIa以前被建议用于治疗血友病患者和具有其它出血障碍的患者，所述患者的凝血级联反应具有基本的损伤。在本发明中，凝血级联反应一般是完全起作用的，治疗性干预将此活性集中于身体确定的区域内。
因此，本发明的另一目的是通过结合使用TF和另外施用的因子VIIa来增加本发明任一TF构建体的抗肿瘤效应。由于tTF可结合肿瘤血管内皮细胞，因此，可以用tTF注射携有肿瘤的动物，等一段时间以使过量的tTF被清除，然后注射因子VIIa以放大tTF在肿瘤血管内的血栓形成作用。以此方式，可以看出tTF或其它凝血缺损TF构建体能在肿瘤内形成储备库，使得随后施用因子VIIa能够增加和维持抗肿瘤效应。
本发明其它的观察结果是因子VII激活突变体tTF(G164A)和tTF(W158R)的血栓形成活性被因子VIIa大大地修复。这些突变位于tTF中对于因子VII转变为因子VIIa至关重要的一个区域内。至于tTF自身，本文的研究表明，在凝血复合物形成时增加预先形成的因子VIIa可克服此障碍。本发明利用这些和上述观察结果以提供癌症的体内疗法。
实际上，本文提供的研究证实，共同施用TF的因子VII激活突变体和预先形成的因子VIIa会对肿瘤产生大量坏死性损害，甚至对本发明疗法不是最适应的小肿瘤模型也是如此。本发明的此方面特别令人惊奇，因为以前人们不相信这种突变体除了可能竞争性抑制TF而可能用于抑制或降低凝血这样的治疗价值外，还会在任何具体实施中有治疗价值。除了这种假设外，只是科学兴趣激发了人们制备这种突变体，它们可在某些体外研究中用作对照。只有本发明人的研究使得这种突变体在临床上有用，它们或者可用于靶向传递(WO96/01653)，或者可用于本发明甚至更令人惊奇的联合应用中。
在特定的实施方案中，本发明的此应用首先包括给携有肿瘤的动物注射tTF(G164A)，tTF(W158R)或其等价物。然后使tTF突变体定位于肿瘤血管，多余的被清除，接着注射因子VIIa，这可以使定位的tTF突变体表现血栓形成活性。这一策略的优点是使用非常安全。tTF突变体实际是无毒的，因子VIIa自身也一样。因此，先施用tTF突变体再施用因子VIIa对宿主是无害的，但能有效地诱导肿瘤血管中的血栓形成。
G1.因子VIIa
可按Fair(1983)，美国专利5,374,617，5,504,064和5,504,067(都列入本文作为参考)所述制备因子VII。Hagen等(1986)报道了人因子VII cDNA序列的编码区，其中第1至60位的氨基酸序列对应于分泌前会被细胞除去的前-原/前导序列。成熟的因子VII多肽链由氨基酸61至466组成。通过裂解精氨酸212和异亮氨酸213之间的单个肽键可将因子VII转变为其活性形式因子VIIa。
通过将纯化的蛋白质与固定于Affi-GelTM15珠(Bio-Rad)上的因子Xa一起保温，可在体外将因子VII转变为因子VIIa。通过对已还原的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可监测转变。在50mMEDTA的存在下，用终浓度为0.2mM的显色底物N-甲氧羰基-D-环己基甘氨酰-甘氨酰-精氨酰对硝基苯胺醋酸酯(SpectrozymeTM因子Xa，American Diagnostica，Greenwich，CT)可检测因子VIIa制品中的游离因子Xa。
重组的因子VIIa也可购自Novo Biolabs(Danbury，CT)。
G2.治疗
本发明中因子VIIa的用途不局限于其显著改善本文所述因子VII激活突变体实用性的能力。同样预计因子VIIa可与凝血缺损组织因子分子联合使用，所述分子同首次使用的截短tTF具有相同活性。在这种治疗实施方案中，TF构建体的剂量一般是每位患者约0.2mg至200mg，参照此信息可最佳地确定因子VIIa的适当剂量。
例如，可能需要形成其中TF构建体和因子VIIa比例为1∶1的预复合物，并将预复合的组分施用于动物。如果必需这么做，一般应将足以使等摩尔复合物形成的一定量的TF和一定量的因子VIIa混合。为了达到此目的，优选使用2-3倍摩尔过量的因子VIIa，以确保各个TF分子被充分复合。然后可使用任何适当的技术，如凝胶过滤，简单地将未复合的TF和因子VIIa与复合的混合物分开。形成TF：VIIa复合物之后，可以每位患者约0.2mg至200mg的剂量给需要治疗的患者简单地施用该复合物。
如上所述，一般优选提前给患者施用凝血缺损TF构建体，使得TF有足够的时间特异性地定位于肿瘤内。预施用之后，可设计适当的因子VIIa剂量，该剂量应足以与定位于肿瘤血管系统内的TF协调和复合。同样，也可设计因子VIIa的剂量以使肿瘤环境中形成1∶1摩尔比例的TF和因子VIIa。由于这两种分子的分子量差异，一般建议加入约为TF毫克量2倍的因子VIIa毫克量。
然而，上述分析只是为了举例，一般可导致凝血改善的任何剂量的因子VIIa显然都具有临床重要性。在此方面，应注意的是本文所提供的研究实际上使用与因子VIIa相比为16∶1过量的TF，这一般是约为32倍摩尔过量的TF构建体，然而，在肿瘤中特异地观察到显著的凝血和坏死。因此，因子VIIa的有效剂量范围显然十分宽，例如，可考虑给患者施用剂量为每位患者约0.01mg至约500mg的因子VIIa。
上述各个分析同样适用于经突变损害了其激活因子VII之能力的组织因子构建体的使用。假定上述推测是基于结合的比例，相信不必联合使用特别增加水平的因子VIIa和所述激活突变体。然而，假定相信施用因子VIIa自身不是特别有害，则使用增加剂量的因子VIIa的效力当然是明显的。
尽管相信上文提供的详细指导足以使本领域技术人员明白如何实践本发明的这些方面，但也应参考其它定量分析以辅助TF和因子VIIa施用剂量的最优化。例如，可参照美国专利5,374,617；5,504,064；和5,504,067，所述专利描述了因子VIIa的治疗活性剂量范围和血浆水平。
据Morrissey和Comp报道：在出血障碍中，当全身性施用时，施用凝血缺损组织因子的有效剂量应能在血浆中达到100ng/ml至50μg/ml的有效水平，或优选为1μg/ml至10μg/ml的水平或为60至600μg/kg体重；或当局部施用时，可达到10μg/ml至50μg/ml的有效水平，或10μg/ml至50μg/ml的优选水平(美国专利5,504,064)。
当局部施用时，施用因子VIIa的剂量应能在血浆中有效产生20ng/ml至10μg/ml(1.2至600μg/kg)的有效水平，或优选为40ng/ml至700μg/ml(2.4至240μg/kg)的水平，或1μg因子VIIa/ml至10μg因子VIIa/ml的水平。
通常，可施用凝血缺损组织因子和因子VII激活物以产生达10μg凝血缺损组织因子/ml血浆和40ng-700μg因子VIIa/ml血浆的水平。尽管这些研究是在出血障碍中进行的，但它们也与本发明内容相关，因为水平必须是有效的，但需经适当监测以避免因凝血缺损组织因子和激活的因子VIIa水平提高导致全身毒性，因此，因子VII激活物的施用剂量应能在血浆中有效达到如上文所定义的因子VIIa有效水平。
G3.因子VII激活物
如美国专利5,504,064(列入本文作为参考)所述，也可施用内源性因子VII激活物以替代因子VIIa自身。如上述专利中所述，施用凝血缺损组织因子之前、之时或优选稍后立即在体内形成因子VIIa。在这种实施方案中，通过联合注入因子VIIa激活物、如因子Xa(FXa)与磷脂(PCPS)，可将内源性的因子VII转变为因子VIIa。
因子VII的体内激活物包括因子Xa/PCPS，因子IXa/PCPS，凝血酶，因子XIIa，和得自Oxyuranus scutellatus毒液的因子VII激活物与PCPS的联合。这些激活物已显示出可在体外将因子VII激活为因子VIIa。也可直接测定Xa/PCPS在体内将因子VII激活为因子VIIa的激活作用。通常，以1至10μg/ml载体的剂量施用因子VII激活物(美国专利5,504,064)。
可以多种形式提供磷脂，如磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸载体(PCPS)。PCPS载体的制备和施用Xa/PCPS的方法描述于Giles等(1988)(列入本文作为参考)。也可用其它磷脂制品替代PCPS，只要它们可加速因子VII被因子Xa激活即可。可按下文所述监测效力，因此确定最佳组成和剂量的测定。
据报道，可提高黑猩猩体内因子VIIa水平的Xa/PCPS高度有效的剂量为每kg体重26pmol因子Xa+40pmol PCPS。此剂量使内源性因子VIIa的水平增加18倍(达146ng/ml)。对狗使用较小的剂量观察到勉强可测的效果，其中每kg体重注入12pmol因子Xa+19pmolPCPS使内源性因子VIIa水平增加了3倍。因此，每kg体重至少12pmol因子Xa的因子Xa剂量应该有用，优选每kg体重26pmol因子Xa。类似地，每kg体重至少19pmol PCPS的PCPS剂量应是有用的，优选每kg体重40pmol PCPS(美国专利5,504,064)。
静脉内施用之后，通过在大剂量注入激活物之后的不同时间(2，5，10，20，30，60，90和120分钟)取出柠檬酸盐化的血样，由血样制备不含血小板的血浆，即可监测任何可注入的因子VII激活物的效力。然后通过进行基于凝血缺损组织因子的因子VIIa凝血试验，可测定柠檬酸盐化的血浆样品中内源性因子VIIa的量。内源性因子VIIa的所需水平与共同注入纯化的因子VII和凝血缺损组织因子时所提到的血浆因子VIIa目标水平应该相同。因此，无需过多实验即可在体内检测其它因子VII激活物产生因子VIIa的情况，并且，使用基于凝血缺损组织因子的血浆样品因子VIIa试验，可调整剂量使其产生所需水平的因子VIIa。然后可将适当剂量的因子VII激活物(产生所需水平的内源性因子VIIa)与推荐用量的凝血缺损组织因子联合使用。
可安排给药时间以使因子VIIa水平长时间提高，优选一直给药至获得所需的抗肿瘤效应，然后按需要重复施用以控制出血。据报道，因子VIIa的体内半寿期约为2小时，但半寿期随治疗方式和各个患者的不同而不同，因此，应该用基于凝血缺损组织因子的凝血试验测定给定治疗方式中血浆内因子VIIa的半寿期。H.实施例
下列实施例可阐明本发明优选的实施方案。本领域技术人员应理解，下列实施例公开的技术代表的是由发明人发现的在本发明实践过程中能较好地起作用的技术，因此可认为所述技术构成了本发明实践的优选模式。然而，本领域技术人员参照本发明公开的内容应理解：可在不背离本发明精神和范围的前提下，对所公开的具体实施方案作很多修改，仍可得到类似或相似的结果。实施例I合成截短的组织因子
本文中的tTF指的是成熟组织因子蛋白的胞外域(成熟蛋白质的氨基酸1-219；SEQ ID NO：1)，SEQ ID NO：1由例如SEQ ID NO：10编码。A.H6[tTF]
H6 Ala Met Ala[tTF]。按下述制备tTF的互补DNA(cDNA)：使用J-82细胞(人膀胱癌)的RNA克隆tTF。使用GlassMaxTMRNA微量分离试剂(Gibco BRL)分离总RNA，使用GeneAmp RNA PCR试剂盒(Perkin Elmer)将RNA逆转录为cDNA，使用含有下列两个引物的相同试剂盒扩增tTF cDNA：5’引物：5′GTC ATG CCA TGG CC T CAG GCA CTA CAA  (SEQ ID NO：15)3’引物：5′TGA CAA GCT TA T TCT CTG AAT TCC CCT TTC T(SEQ ID NO：16)
下划线的序列编码tTF的N末端，5’引物中的其余序列是NcoI限制性位点，可使tTF克隆至表达载体中。3’引物的序列是可将tTF克隆至表达载体的HindIII位点。按厂商的建议进行PCR扩增，简单地说，使用75μM dNTP；0.6μM引物，1.5mM MgCl2，95℃30”，55℃30”和72℃30”，共进行30轮循环。
使用表达载体H6pQE-60(Qiagen)将tTF表达成以非天然状态存在于大肠杆菌包涵体中的融合蛋白。使用大肠杆菌表达载体H6pQE-60表达tTF(Lee等，1994)。将经PCR扩增的tTF cDNA插入NcoI和HindIII位点之间，H6pQE-60具有嵌入的(His)6编码序列，以使表达的蛋白质在N末端具有(His)6序列，这样可在Ni-NTA柱上纯化。另外，融合蛋白具有凝血酶裂解位点和TF的残基1-219。
为了纯化tTF，将含有tTF的H6pQE-60 DNA转化至大肠杆菌TG-1细胞中，将细胞培养至OD600＝0.5，加入IPTG使之浓度为30μM以诱导tTF产生。于30℃振荡18小时之后收集细胞，在6M Gu-HCl中使细胞沉淀物变性，将裂解物上样于Ni-NTA柱(Qiagen)。用6M尿素洗涤结合的tTF，室温下用梯度为6M-1M的尿素将tTF重新折叠16小时。用洗涤缓冲液(0.05 NaH2PO4，0.3M NaCl，10％甘油)洗涤柱，再用0.2M溶于洗涤缓冲液中的咪唑(imidozole)洗脱tTF。浓缩洗脱下来的tTF，并上样于G-75柱，收集tTF单体。B.tTF
Gly[tTF]。按与上一部分所述相同的方法制备GlytTF互补DNA(cDNA)，不同之处在于在PCR中用下列引物替代5’引物：5’引物：5′GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG CT T CTG GCA CTA CAA ATA CT(SEQ ID NO：17)
下划线的序列编码tTF的N末端，其余序列编码NcoI限制性位点和凝血酶裂解位点。
H6 pQE-60表达载体和蛋白质纯化方法与上文相同，不同之处在于用凝血酶处理最终的蛋白质产物以除去H6肽。在500份tTF中加入1份凝血酶(Sigma)(w/w)，室温下裂解18小时可达到此目的。通过使混合物穿过Benzamidine Sepharose 6B凝血酶亲和柱(Pharmacia)，从tTF中除去凝血酶。所得tTF被称为tTF219，它由TF残基1-219加上N末端的一个额外甘氨酸组成。当通过SDS-PAGE分析时，它作为分子量为26KDa的单一带迁移，通过Edman降解进一步证实了N末端的序列。该蛋白质具有SEQ ID NO：1所示的序列。C.半胱氨酸修饰的tTF
通过利用在成熟tTF N’末端前面编码一个Cys的5’引物进行PCR以突变tTF219，可制备(His)6-N’-cys’tTF219-tTF，下文简称为H6-N’-cys-tTF219。类似地，使用在tTF氨基酸219之后编码一个Cys的3’引物制备H6-tTF219-cys-C’。它们的表达和纯化与tTF219相同，不同之处在于重折叠之后使用Ellman试剂(5’5’-二硫代-双-2-硝基苯甲酸)将N’或C’末端的Cys转变为稳定激活的二硫基。两种产物具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列。通过凝血酶裂解除去(His)6标记物并将蛋白质转变为具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示序列的N’-cys-tTF219和tTF219-cys-C’。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定出产物纯度＞95％。
使用编码tTF氨基酸219之后的Ile-Cys和Ile-Phe-Cys的3’引物进行PCR以突变tTF219，可制备H6-tTF220-cys-C’和H6-tTF221-cys-C’。表达、重折叠和纯化操作与H6-tTF219-cys-C’相同，这两种蛋白质具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的序列。实施例II合成组织因子二聚体
本发明人推论组织因子二聚体在起始凝血方面可能会比单体更加有效，J82膀胱癌细胞表面上的天然组织因子可能是以二聚体的形式存在(Fair等，1987)。一个因子VII或因子VIIa分子与一个组织因子分子的结合可能也有助于另一个因子VII或因子VIIa与另一个组织因子的结合(Fair等，1987；Bach等，1986)。另外，组织因子显示出与细胞因子受体家族成员具有结构同源性(Edgington等，1991)，其中一些成员可二聚体化而形成活性受体(Davies和Wlodawer，1995)，因此，本发明人按下述合成了TF二聚体。尽管下文中在化学缀合方面描述了二聚体的合成，但发明人预计也可使用重组和其它方法来产生本发明二聚体。A.[tTF]连接子[tTF]
制备具有Gly[tTF](Gly)4Ser(Gly)4Ser(Gly)4Ser[tTF]结构的Gly[tTF]连接子[tTF]。
按下述，分别PCR扩增两个DNA片段，连接片段并插入载体中：
PCR1：制备tTF和连接子DNA的5’那半部分。PCR中的引物序列如下：5’引物：5′GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT CTT GCG GCACTA CAA ATA CT(SEQ ID NO：18)3’引物：5′CGC GGA TCC ACC GCC ACC AGA TCC ACC GCC TCC TTC TCTGAA TTC CCC TTT CT(SEQ ID NO：19)
Gly[tTF]DNA被用作DNA模板，其它PCR条件如tTF章节所述。
PCR2：制备连接子DNA的3’那半部分和tTF DNA。PCR中的引物序列如下：5’引物：5′CGC GGA TCC GGC GGT GGA GGC TCT TCA GGC ACT ACA AATACT GT(SEQ ID NO：20)3’引物：5′TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T(SEQ ID NO：21)
tTF DNA被用作PCR的模板。用NcoI和BamH消化PCR1的产物，用HindIII和BamHI消化PCR2的产物。将经消化的PCR1和PCR2 DNA与经NcoI和HindIII消化的H6pQE60 DNA连接。
至于载体构建体和蛋白质的纯化，其方法与Gly[tTF]章节中所述的相同。B.Cys[tTF]连接子[tTF]
构建具有SerGlyCys[tTF2-219](Gly)4Ser(Gly)4Ser(Gly)4Ser[tTF]结构的Cys[tTF]连接子[tTF]。使用下列引物通过PCR制备DNA：5’引物：5′GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT CTT GCG GCACTA CAA ATA CT(SEQ ID NO：22)3’引物：5′TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T(SEQ ID NO：23)
[tTF]连接子[tTF]DNA被用作模板，其余的PCR条件如tTF章节所述。至于载体构建体和蛋白质的纯化，其方法与H6C[tTF]纯化中所述的完全相同。C.[tTF]连接子[tTF]cys
制备具有蛋白质结构[tTF](Gly)4Ser(Gly)4Ser (Gly)4Ser[tTF]Cys的[tTF]连接子[tTF]cys二聚体。使用下列引物通过PCR制备DNA：5’引物：5′GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT GCA CTA CAAATA CT(SEQ ID NO：24)3’引物：5 ′TGA CAA GCT TAG CAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T(SEQ IDNO：25).
[tTF]连接子[tTF]DNA被用作模板，其余的PCR条件如tTF章节所述。按与[tTF]cys纯化一节中所述相同的方法进行载体构建体和蛋白质的纯化。D.化学缀合的二聚体
已用Ellman试剂处理，使游离的Cys转变为被激活的二硫基的[tTF]Cys单体被一半摩尔当量的二硫苏糖醇还原，这可以在一半分子中产生游离的Cys残基。化学缀合单体以形成[tTF]Cys-Cys[tTF]二聚体，通过于室温下，在被保护的[tTF]Cys中加入等摩尔量的DTT达1小时以使[tTF]Cys C末端的半胱氨酸去保护并暴露即可以做到这一点。在DTT/[tTF]Cys混合物中加入等摩尔量被保护的[tTF]Cys，室温下持续保温18小时。在G-75凝胶过滤柱上纯化二聚体。类似地制备H6-tTF220-cys-C’，H6-tTF221-cys-C’和H6-N’-cys-tTF219的二聚体。使用相同的方法化学缀合Cys[tTF]单体以形成二聚体。实施例III合成组织因子突变体
描述了3种tTF突变体，所述突变体缺乏将与tTF结合的因子VII转变为因子VIIa的能力。血浆中的因子VIIa比因子VII少300倍(Morrissey等，1993)，因此，循环中的tTF突变体起始凝血的能力较差，因此表现出很低的毒性。然而，正如本文令人惊奇的阐明，一旦tTF突变体定位于肿瘤位点，即可注入因子VIIa以与tTF所结合的因子VII交换。已突变蛋白质具有SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：9所示的序列，在因子VIIa的存在下是有活性的。A.[tTF]G164A
“[tTF]G164A”具有突变蛋白质的结构，其中tTF219的氨基酸164(Gly)被Ala取代。Chameleon双链定点诱变试剂盒(Stratagene)被用于产生该突变体。DNA模板是Gly[tTF]DNA，诱变引物的序列如下：
  5′CAA GTT CAG CCA AGA AAAC(SEQ ID NO：26)
G164A突变体由SEQ ID NO：9表示，在Gly[tTF]的纯化过程中使用上述的载体构建体和蛋白质纯化方法。B.[tTF]W158R
tTF219的氨基酸158位的色氨酸被突变为精氨酸，该突变是用编码此变化的引物经PCRTM完成的。表达、重折叠和纯化操作与tTF219的相同。该已突变蛋白质具有SEQ ID NO：8的序列。C.[tTF]W158R S162A
[tTF]W158R S162A是一种双重突变体，其中tTF219的氨基酸158(Trp)被精氨酸取代，氨基酸162(Ser)被丙氨酸取代。使用就[tTF]G164A和[tTF]W158R所述相同的诱变方法，诱变引物是：
5′ACA CTT TAT TAT CGG AAA TCT TCA GCT TCA GGA AAG
(SEQ ID NO：27)
上述载体构建体和蛋白质纯化的方法与Gly[tTF]的纯化方法相同。实施例IV制备tTF双特异性抗体加合物并合成组织因子缀合物A.制备tTF双特异性抗体加合物
构建双特异性抗体，它具有特异于tTF上非抑制性表位的10H10抗体的一个Fab’臂，以及与该臂连接的具有不相关特异性的抗体(OX7，Mac51，CAMPATH-2)的一个Fab’臂。当与tTF混合时，双特异性抗体即经由10H10臂结合tTF，形成非共价的加合物。根据略加改动的Brennan等(1985；列入本文作为参考)的方法合成双特异性抗体。
简单地说，通过用胃蛋白酶(A型；EC3.4.23.1)消化，由IgG抗体得到F(ab’)2片段，再通过在Sephadex G100上层析将该片段纯化至均质。20℃下，在含有1mM EDTA(PBSE缓冲液)和9mM NaAsO2的0.1M磷酸钠缓冲液，pH6.8中，用5mM 2-巯基乙醇将F(ab’)2片段还原16小时。加入Ellman试剂(ER)使其终浓度为25mM，20℃3小时后，在处于PBSE中的Sephadex G25柱上将Ellman衍生化的Fab’片段(Fab’-ER)与未反应的ER分开。
为了形成双特异性抗体，在Amicon超滤杯中将衍生自一种抗体的Fab’-ER浓缩至约2.5mg/ml，用10mM 2-巯基乙醇在20℃下还原1小时。将所得Fab’-SH穿过处于PBSE中的Sephadex G25柱以进行过滤，并与制备自第二抗体的1∶1摩尔过量的Fab’-ER混合。通过超滤将混合物浓缩至约3mg/ml，20℃下搅拌16小时。在处于PBS中的Sephadex G100柱上分级分离反应产物，将含有双特异性抗体(110KDa)的级分浓缩至1mg/ml，4℃下，储存于0.02％叠氮钠中。
为了形成tTF双特异性抗体加合物，将双特异性抗体与等摩尔量的tTF或其衍生物在4℃下混合1小时。在凝胶过滤柱上洗脱分子量约为130KDa的加合物，它相当于一分子tTF与一分子双特异性抗体连接。1.制备IgG-H6-N’-cys-tTF219和IgG-H6-tTF219-cys-C’
在26mg溶于经N2冲洗过的磷酸盐缓冲液中、浓度为10mg/ml的IgG中加入溶于0.1ml干DMF中的250μg SMPT(Pharmacia)。室温下搅拌30分钟之后，将溶液上样于用相同缓冲液平衡过的Sephadex G25(F)柱(1.6cm直径×30cm)。将衍生化的IgG至收集10-12ml，通过超滤(Amicon，YM2膜)浓缩至约3.5ml。通过于室温下，0.2mM DTT的存在下保温以还原H6-N’-cys-tTF219或H6-tTF219-cys-C’(15mg)，直至所有Ellman试剂均释放出来(即412nm下的OD达到最大值)，然后上样于用N2冲洗过的缓冲液平衡过的Sephadex G25(F)柱(1.6cm直径×30cm)中。
在衍生化的IgG溶液中直接加入Cys-tTF(约15ml)，通过超滤将混合物浓缩为约5ml，室温下保温18小时，然后通过在SephacrylS200上进行凝胶过滤层析来分离，收集含有分子量175,000-200,000之物质的峰。此组分由与一个或两个tTF分子连接的一个IgG分子组成。此缀合物具有下列结构：
Figure A9880343301361
2.制备Fab’-H6-N’-cys-tTF219
用10mM巯基乙胺还原IgG的F(ab’)2片段，从而产生Fab’片段。通过在Sephadex G25上进行凝胶过滤将所得的Fab’片段与还原剂分开。以20μM的浓度混合等摩尔量新鲜还原的Fab’片段和经Ellman修饰的H6-N’-cys-tTF219，偶联反应发生后，412nm处的光吸收会增加，这是因为缀合引起释放了3-羧化-4-硝基硫代苯酚盐(3-carboxylato-4-nitrothiophenolate)阴离子。缀合物具有下列结构：Fab’-SS-tTFB.合成组织因子缀合物1.化学衍生化和抗体缀合
通过经由二硫键连接化学衍生化的抗体与化学衍生化的tTF，合成抗体tTF缀合物。
将抗体与5倍摩尔过量的琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)在室温下反应1小时，以形成衍生化抗体，其中每个抗体分子平均有2个吡啶基二硫基，通过凝胶渗透层析纯化衍生化的抗体。
将与抗体相比为2.5倍摩尔过量的tTF与45倍摩尔过量的2-亚氨基硫戊杂环(2IT)在室温下反应1小时，产生每个tTF分子平均具有1.5个巯基基团的tTF。也通过凝胶渗透层析纯化衍生化的tTF，并立即与衍生化的抗体混合。
使混合物于室温下反应72小时，然后上样于Sephacryl S-300柱中，以将抗体-tTF缀合物与游离的tTF和释放的吡啶-2-硫酮分开。通过在抗tTF柱上进行亲和层析将缀合物与游离的抗体分开。如SDS-PAGE所评估，最终缀合物产物中占优势的分子类型是单一取代的抗体-tTF缀合物(Mr约为176,000)，只有较少量的多取代缀合物(Mr≥约202,000)。2.半胱氨酸修饰的tTF与衍生化抗体的缀合
经由二硫键直接偶联半胱氨酸修饰的tTF与化学衍生化的抗体，合成抗体-C[TF]和[tTF]C缀合物。
将抗体与12倍摩尔过量的2IT于室温下反应1小时，产生每个抗体分子平均具有1.5个巯基的衍生化抗体。通过凝胶渗透层析纯化衍生化的抗体，并立即与2倍摩尔过量的经半胱氨酸修饰的tTF混合。使混合物于室温下反应24小时，然后如上所述通过凝胶渗透和亲和层析纯化缀合物。
如SDS-PAGE所评估，最终缀合物中占优势的分子类型是单一取代的缀合物(Mr约为176,000)，只有较少量的多取代缀合物(Mr≥约202,000)。3.半胱氨酸修饰的tTF与Fab’片段的缀合
制备抗体Fab’-C[tTF]和[tTF]C缀合物。这种缀合物在体内更加有效，因为因其有限的内化能力使得它们在细胞表面维持的时间比二价缀合物更长。将Fab’片段与2倍摩尔过量的经半胱氨酸修饰的tTF混合24小时，然后如上所述通过凝胶渗透和亲和层析纯化缀合物。实施例V组织因子使肿瘤血管形成梗塞A.方法1.体外凝血试验
利用此试验来证明，tTF、其多种衍生物和突变体、以及免疫球蛋白-tTF缀合物一旦定位于细胞表面，即获得凝血诱导活性。将A20淋巴瘤细胞(I-Ad阳性)(2×106个细胞/ml，50μl)与一种双特异性抗体(50μg/ml，25μl)在室温下保温1小时，所述双特异性抗体由针对I-Ad的B21-2抗体的Fab’臂与针对tTF上非抑制性表位的10H10抗体的Fab’臂相连接组成。室温下洗涤细胞，加入不同浓度的tTF、其衍生物或突变体、或免疫球蛋白-tTF缀合物，于室温下达1小时。该双特异性抗体捕获tTF或与免疫球蛋白相连的tTF，使其紧挨细胞表面，在此处进行凝血。
室温下再次洗涤细胞，重新悬浮于75μl PBS中，升温至37℃。加入钙(12.5mM)和柠檬酸盐化的小鼠或人血浆(30μl)，记录第一条血纤蛋白链形成的时间。将凝血时间对tTF浓度作图，将曲线与使用标准tTF219制品制得的标准曲线比较。
在一些研究中，将多种浓度的重组人因子VIIa与tTF219及其突变体加在一起，以测定因子VIIa的存在是否增强了凝血速率。2.因子Xa产生试验
除体外凝血试验外，此试验也是有用的，或可替代体外凝血试验，用于阐明tTF和免疫球蛋白-tTF缀合物一旦定位于细胞表面，即可获得凝血诱导活性。此试验利用因子Xa的生色底物(S-2765)来测定因子X至Xa的转变。
将A20细胞(2×107个细胞)悬浮于10ml含有0.2％w/v叠氮钠的培养基中。在2.5ml细胞悬浮液中加入6.8μgB21-2/10H10“捕获”双特异性抗体，于室温下达50分钟。洗涤细胞，将细胞重新悬浮于2.5ml含有0.2％w/v叠氮钠的培养基中。以不同的浓度将100μl溶解于相同培养基中的tTF和免疫球蛋白-tTF缀合物加入96孔微滴定板的孔中，然后向孔中加入100μl细胞/双特异性抗体悬浮液，室温下将板保温50分钟。
将板离心，弃上清液，将细胞沉淀物重新悬浮于250μl洗涤缓冲液(150mM NaCl；50mM Tris-HCl，pH8；0.2％w/v牛血清白蛋白)中。再次洗涤细胞，将细胞重新悬浮于100μl稀释了12.5倍的Proplex T(Baxter，Inc.)中，该Proplex中含有于稀释缓冲液(添加了12.5mM氯化钙的洗涤缓冲液)中的因子II，VII，IX和X。将平板于37℃保温30分钟，在每孔中加入于洗涤缓冲液中的终止溶液(12.5mM乙二胺四乙酸钠(EDTA))。离心平板，在得自每孔的100μl上清液中加入11μl S-2765(N-α-苄基氧羰基-D-Arg-L-Gly-L-Arg-酰基对硝基苯胺二氢氯化物，Chromogenix AB，Sweden)。测定各溶液在409nm处的光密度，将结果与使用标准tTF219制得的标准曲线比较。3.体内肿瘤血栓形成
使用此模型来阐明tTF和免疫球蛋白-tTF缀合物可在体内诱导肿瘤血管形成血栓和导致肿瘤血管发生梗塞。
肿瘤检测系统有四种类型：i)在C57BL/6小鼠皮下生长的3LL小鼠肺癌；ii)在BALB/c nu/nu小鼠皮下生长的C1300小鼠成神经细胞瘤；iii)在BALB/c nu/nu小鼠皮下生长的HT29人结肠癌；和iv)在BALB/c nu/nu小鼠皮下生长的C1300 Muγ小鼠成神经细胞瘤。C1300 Muγ肿瘤是衍生自C1300肿瘤的、可分泌γ干扰素的转染体(Watanabe等，1989)。
另外，按下述使用和修饰C1300(Muγ)肿瘤模型(Burrows等，1992；列入本文作为参考)：(i)使用抗体B21-2靶向I-Ad；(ii)使用在BALB/c nu/nu小鼠体内持续生长的C1300(Muγ)肿瘤细胞，C1300(Muγ)12肿瘤细胞的一个亚系；和(iii)小鼠的饮用水中不加四环素以防止肠细菌诱导胃肠上皮细胞上的I-Ad。与免疫毒素不同，凝血配体和组织因子构建体不会损害表达I-Ad的肠上皮细胞。4.肿瘤的建立
为了建立肿瘤，将106至1.5×107个肿瘤细胞皮下注射至小鼠的右前肋，当肿瘤生长至不同大小时，将小鼠随机划分为不同的研究组。然后给小鼠静脉内注射0.5mg/kg tTF，或与IgG、Fab’或双特异性抗体连接的tTF。其它小鼠仅接受等量的IgG，Fab’或双特异性抗体。在约45秒的时间内，缓慢注射至一尾静脉中，通常接着注射200μl盐水。
一些研究中研究了施用癌症化学治疗药物对tTF使肿瘤血管形成血栓之作用的影响。给皮下携有直径为1.0cm的HT29人结肠肿瘤的小鼠腹膜内注射阿霉素(1mg/kg/天)，喜树碱(1mg/kg/天)，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(20mg/kg/天)，或γ干扰素(2×105个单位/kg/天)2天，然后注射tTF，注射tTF的当天再次注射上述药物。
注射了tTF或免疫球蛋白-tTF缀合物24小时之后，用metophane麻醉小鼠，通过用肝素化的盐水灌流除去小鼠的血。切下肿瘤和正常组织，立即用3％(v/v)福尔马林固定。切出石蜡切片，用苏木精和伊红染色。计数含有红细胞、具有开腔的血管和含有血栓的血管。切出石蜡切片，用苏木精和伊红染色或用MartiusScarlet Blue(MSB)三色染色以检测血纤蛋白。5.抗肿瘤效应
使用被接受的动物模型测定施用tTF或免疫球蛋白-tTF缀合物是否可抑制小鼠体内实体肿瘤的生长。肿瘤检测系统是：i)在SCID小鼠体内生长的L540人Hodgkin氏病肿瘤；ii)在nu/nu小鼠体内生长的C1300 Muγ(分泌干扰素)成神经细胞瘤；iii)在nu/nu小鼠体内生长的H460人非小细胞肺癌。为了建立实体肿瘤，将1.5×107个肿瘤细胞皮下注射至SCID或BALB/c nu/nu小鼠(Charles RiverLabs.，Wilmingham，MA)的右前肋。当肿瘤生长至不同直径时，将小鼠随机划分为不同的实验组，每组含4至9只小鼠。
然后给小鼠静脉内注射0.5mg/kg tTF，或与双特异性抗体连接的tTF。其它小鼠仅接受等量的双特异性抗体。耗时约45秒以上注射至一尾静脉中，接着注射200μl盐水。6天后重复注入。以规则的间隔测定正交的肿瘤直径，计算肿瘤体积。B.结果1.通过tTF和突变体体外凝血
为了将tTF靶向肿瘤血管内皮细胞上的I-Ad，发明人制备了一种双特异性抗体，该抗体具有特异于I-Ad的B21-2抗体的Fab’臂，此臂与特异于tTF C组件上非抑制性表位的10H10抗体的Fab’臂相连接。此双特异性抗体B21-2/10H10在体外介导tTF以抗原特异性的方式结合A20小鼠B淋巴瘤细胞上的I-Ad。当向已通过B21-2/10H10与tTF结合的A20细胞中加入小鼠血浆时，血浆快速凝血。在经抗体处理的细胞中加入血浆36秒后即可看到血纤蛋白链，而在未经处理的细胞中加入血浆164秒后才可看见血纤蛋白链(图4A)。仅当tTF与细胞结合时，才可观察到这一增强的凝血现象：对于仅与tTF保温的细胞而言，未观察到对凝血时间的影响，对于与同二聚体F(ab’)2、Fab’片段或tTF加上仅具有tTF与A20细胞结合所需两种特异性之一的双特异性抗体保温的细胞而言，结果也是如此。
按实施例I制备的tTF219与得自Thomas Edgington博士(TheScripps Research Institute，La Jolla，CA)的“标准”tTF219制品，在经由B21-2/10H10双特异性抗体与A20淋巴瘤细胞结合之后，它们诱导小鼠或人血浆凝血的能力相同(图5)。当实施例I中的tTF219制品和“标准”的tTF都以3×10-9M的浓度应用于细胞时，小鼠血浆在50秒内凝血，因此，按本文所述制备的tTF219似乎正确地进行了重新折叠并具有完整的活性。
与细胞结合的tTF分子数目的对数和细胞使血浆凝血的速率之间存在线性关系(图4B)。在仅存在细胞的情况下，血浆在190秒内凝血，而在每个细胞结合300,000个tTF分子的情况下，凝血时间为40秒。甚至在每个细胞仅结合有20,000个分子的情况下，凝血时间(140秒)也快于未经处理的细胞。这些体外研究表明，通过抗体介导的与细胞表面II类抗原的结合，使得接近于细胞表面，这样可增强tTF的血栓形成效力。
一旦经由双特异性抗体与A20细胞结合，H6-N’-cys-tTF219和H6-tTF219-cys-C’诱导血浆凝血的活性与tTF相同。当以3×10-9M的浓度使用H6-N’-cys-tTF219和H6-tTF219-cys-C’时(与tTF浓度相同)，血浆在50秒内凝血(图5)。因此，突变tTF而在N’或C’末端导入(His)6序列和Cys残基不会降低其诱导凝血的活性。
一旦经由双特异性抗体B21-2/10H10定位于A20细胞的表面上，H6-tTF220-cys-C’，tTF220-cys-C’，H6-tTF221-cys-C’和tTF221-cys-C’在诱导血浆凝血方面与tTF219活性相同。所有样品均为5×10-10M，血浆在50秒内凝血(图6和图7)。2.通过tTF二聚体在体外凝血
一旦经由双特异性抗体B21-2/10H10定位于A20细胞的表面上，H6-N’-cys-tTF219二聚体在诱导血浆凝血方面与tTF219本身活性相同。浓度为1-2×10-10M的两种样品在50秒内诱导凝血(图8)。与之形成对照的是，H6-tTF221-cys-C’二聚体比H6-tTF221-cys-C’单体或tTF219本身的活性低4倍。浓度为4×10-9M的H6-tTF221-cys-C’二聚体在50秒内诱导血浆凝血，而只需使用浓度为1×10-9M的相应单体即可产生相同的凝血效果。3.体内肿瘤血栓形成
进行组织学研究，以确定静脉内施用B21-2/10H10-tTF凝血配体是否可诱导皮下携有直径为0.8至1.0cm的C1300(Muγ)成神经细胞瘤的小鼠的肿瘤血管系统选择性地形成血栓(图9)。在30分钟内，所有穿过肿瘤的血管皆形成血栓，含有堵塞的血小板聚集物，聚集的红细胞和血纤蛋白。此时，肿瘤细胞在组织学上无法与未经处理的小鼠的肿瘤细胞区分开。
然而，4小时后，有肿瘤细胞受损的迹象。大多数肿瘤细胞已彼此分开，并具有固缩核，肿瘤间质通常含有红细胞。24小时过后，肿瘤显示出高度坏死，72小时过后，肿瘤整个中心区凝聚成无定形的碎片。这些研究表明，B21-2/10H10-tTF凝血配体对肿瘤血管的显著堵塞作用是通过与肿瘤血管内皮细胞上的II类抗原结合所介导的。
奇怪的是，观察到在较晚的时间，在肿瘤血管中具有可觉察的tTF非特异性血栓形成作用：在24小时前用tTF或与对照双特异性抗体OX7/10H10混合的tTF注射的小鼠的肿瘤中，在30分钟内肿瘤开始呈现变黑、受损的外观，到24小时时，这种外观逐渐变得更加明显。组织学研究揭示，注射tTF21924小时之后，实际上肿瘤所有区域中的所有血管都形成血栓(图9)。血管中含有血小板聚集物、聚集的红细胞和血纤蛋白。大多数肿瘤细胞已彼此分开，并产生固缩核，肿瘤的很多区域都已坏死，这些现象在肿瘤核心最为显著，在肿瘤间质中普遍可观察到红细胞。
可能肿瘤血管系统存在的凝血酶原活性(Zacharski等，1993)使得这些血管对甚至由未靶向的tTF引起的血栓形成更加敏感。或者，可能是由衍生自肿瘤的IFNγ诱导了增强的前促凝剂变化。
当给携有大C1300肿瘤(＞1000mm3)的小鼠施用tTF219时，可得到类似的结果。另外，在注射24小时后，实际上所有血管都形成血栓(图10)，因此，所观察到的对C1300 Muγ肿瘤的作用与肿瘤细胞分泌γ干扰素无关。
在携有大(＞800mm3)3LL肿瘤的C57BL/6小鼠中进行进一步的研究。又观察到肿瘤血管中的血栓形成，但在某种程度上没有用C1300和C1300Muγ肿瘤观察到的显著。平均62％的3LL肿瘤血管形成血栓(图11)。
施用tTF219很大程度上未能显著影响小(＜500mm3)C1300和C1300Muγ肿瘤中的血管，因此，随着肿瘤的生长，它们对tTF219引起的血栓形成更加敏感。这可能是因为由肿瘤细胞或浸润肿瘤的宿主细胞释放的细胞因子激活了肿瘤血管内皮细胞，诱导血管中前促凝剂变化所致。
凝血配体治疗能被很好地耐受，小鼠未减重并保持正常的外观和活性水平。当治疗剂量为0.6mg/kg B21-2/10H10加上0.5mg/kgtTF时，40只小鼠中，仅在2只中观察到毒性(尾静脉的血栓形成)，重要的是应指出，携有肿瘤的小鼠在施用凝血配体或游离的tTF之后30分钟或24小时，其肝脏，肾脏，肺，肠，心脏，脑，肾上腺，胰腺或脾脏的石蜡切片中均看不见血栓、组织学或形态学的异常。另外，在经治疗的动物中未观察到毒性的迹象(行为变化，体征，体重变化)。4.抗肿瘤作用
发明人接着研究了静脉内施用B21-2/10H10-tTF凝血配体是否可抑制小鼠大肿瘤(直径为0.8-1.0cm)的生长。3个独立研究的综合结果表明，接受B21-2/10H10-tTF凝血配体的小鼠肿瘤完全萎缩达4个月或更长时间。这些抗肿瘤效应显著大于所有其它治疗组(图12A)。
奇怪的是，发明人发现B21-2/10H10-tTF凝血配体的抗肿瘤效应部分归功于tTF的非靶向作用。接受tTF或与对照双特异性抗体(CAMPATH II/10H10或B21-2/OX7)混合的tTF的小鼠内，肿瘤明显比仅接受抗体或盐水的小鼠内肿瘤生长得更慢(图12A；图12B)。
给携有小(300mm3)C1300Muγ肿瘤的小鼠静脉内注射16-20μgtTF219，1周后重复治疗。用tTF219第一次治疗对肿瘤生长有微弱的抑制作用，这与在上述小肿瘤中观察到的无显著的血栓形成是一致的(图12B)。第二次治疗对肿瘤生长具有明显更大的，统计学上显著(p＜0.01)的作用，这可能是因为肿瘤的大小有所增加。用tTF219第二次治疗1周后，肿瘤大小为仅接受稀释剂的小鼠肿瘤的60％。第二次注射更加有效可能是因为上文观察到的tTF219对大肿瘤内血管有更强的血栓形成作用。
在携有H460人肺癌的小鼠中观察到了类似的抗肿瘤作用(图13)。当肿瘤较小(250mm3)时第一次用tTF219进行治疗，此时对生长速率没什么影响。当肿瘤较大(900mm3)时第二次用tTF219进行治疗，导致肿瘤在再次生长之前萎缩至550mm3。
在携有HT29人结肠癌的小鼠中也观察到抗肿瘤作用(图14)。给两肋携有大(1200mm3)肿瘤的Nu/nu小鼠静脉内注射tTF219或PBS(对照)，每天监测肿瘤的生长，共监测10天。用tTF219治疗的小鼠肿瘤在治疗后约7天内不再持续生长，而用PBS治疗的小鼠肿瘤持续不受抑制地生长。
在接受B21-2/10H10-tTF凝血配体治疗之后未显示出完全肿瘤萎缩的动物中，由肿瘤周边细胞存活的微小边缘长成肿瘤。对这些肿瘤的免疫组化检查揭示出肿瘤侵袭边缘的血管内皮细胞缺乏可测的II类抗原，这与能允许局部肿瘤细胞存活的凝血配体不能使这些血管形成血栓是一致的，因此，共同施用对肿瘤细胞自身起作用的药物可能会改善效力，这一点已被另一种抗血管疗法所证实(Burrows和Thorpe，1992；Burrows和Thorpe，1993；Burrows和Thorpe，1994；美国流水号07/846,349；08/205,330；08/295,868；和08/350,212)。
发明人以前阐明：当施用于携有大C1300Muγ肿瘤的小鼠时，针对肿瘤细胞自身的强细胞毒性的蓖麻毒蛋白A链免疫毒素实际上不具有抗肿瘤活性(Burrows和Thorpe，1993；美国流水号07/846,349；08/205,330；08/295,868；和08/350,212)。缺乏活性的原因可能是免疫毒素不能靠近大肿瘤块的肿瘤细胞，因此证实了凝血配体疗法具有相当的效力。
使用凝血配体的研究证实了肿瘤血管系统中凝血级联反应选择性起始的治疗效力(美国流水号08/273,567；08/482,369；08/485,482；08/487,427；08/479,733；08/472,631；08/479,727和08/481,904)。因此，通过将凝血酶原靶向肿瘤内皮细胞标记物而诱导肿瘤梗塞是有效的抗癌策略，甚至可导致原发性实体肿瘤和血管化转移的根除。
靶向研究最初的令人惊奇的成果是成功地使用了tTF或tTF与不相关特异性之抗体的免疫缀合物。尽管仅接受tTF的小鼠不具有完全的肿瘤萎缩，显然，tTF令人惊奇的抗肿瘤活性使得它和功能相关的TF衍生物可用于治疗实体肿瘤。本文所述这种组分的好处很多，包括使用这种TF没有副作用。另外，本领域技术人员熟知产生本发明提供的tTF型组分的方法。这种组分可单独用于治疗实体肿瘤，也可与其它抗癌剂联合治疗实体肿瘤。实施例VI通过免疫球蛋白-TF缀合物使小鼠血浆凝血
当借助于双特异性抗体B21-2/10H10定位于A20细胞表面时，IgG-H6-N’-cys-tTF219具有诱导小鼠血浆凝血的活性。当以5×10-9M的浓度施用tTF时，50秒内可诱导凝血，这与使用1×10-9M非缀合的tTF219和H6-N’-cys-tTF219的结果相当(图15)。因此，相对于未缀合的H6-N’-cys-tTF219或tTF219自身而言，IgG-H6-N’-cys-tTF219的凝血诱导活性降低了5倍。
IgG的缀合使活性稍有降低可能是因为IgG-H6-N’-cys-tTF219的IgG部分阻碍了B21-2/10H10双特异性抗体接近tTF部分(即相对于检测方法而言是人为的降低)。这可能不是因为IgG-H6-N’-cys-tTF219的IgG部分干扰了凝血起始复合物的形成，因为在早期的工作中，发明人发现类似构建体B21-2 IgG-H6-N’-cys-tTF219中的tTF部分与经由B21-2/10H10而与A20细胞上的I-Ad抗原结合的tTF活性一样(图16)。类似地，B21-2 IgG-H6-tTF219-cys-C’与N’连接的缀合物诱导凝血的活性相同(图16)。
检测IgG-H6-N’-cys-tTF219和Fab’-H6-N’-cys-tTF219一旦借助于双特异性抗体B21-2/10H10而定位于A20淋巴瘤细胞表面上时，在因子II，VII和IX的存在下将因子X转变为Xa的能力。Fab’-tTF构建体在诱导Xa形成方面与H6-N’-cys-tTF219自身活性相同。IgG-tTF构建体比H6-N’-cys-tTF219自身的活性稍低(2倍)(图17)。实施例VII通过免疫球蛋白-TF缀合物抑制C1300 Muγ肿瘤的生长
用tTF219或tTF219与不针对肿瘤环境组分的双特异性抗体OX7Fab’/10H10 Fab’的复合物治疗皮下携有小(300mm3)C1300Muγ肿瘤的小鼠，6天后重复治疗(图18)。双特异性抗体被简单设计为可将tTF219的分子量由25KDa增加至135 KDa，以延长其循环半寿期，但并非旨在赋予tTF靶向的功能。
用免疫球蛋白-tTF缀合物治疗的小鼠体内的肿瘤比仅接受tTF219的小鼠体内的肿瘤生长得更加缓慢。第一次注射后14天，肿瘤大小是仅接受稀释剂的对照的55％。在仅接受tTF219的小鼠中，肿瘤大小是仅接受稀释剂的对照的75％(图18)。实施例VIII通过表鬼臼毒素吡喃葡糖苷增强免疫球蛋白-tTF缀合物的抗肿瘤活性
用tTF219与双特异性抗体的复合物和常规的抗癌药物表鬼臼毒素吡喃葡糖苷一起治疗携有L540人Hodgkin疾病肿瘤的小鼠。表鬼臼毒素吡喃葡糖苷大大增强了免疫球蛋白-tTF缀合物的作用。仅在这一肿瘤模型中，仅接受抗体-tTF复合物的小鼠相对于仅接受稀释剂的小鼠肿瘤而言未显示出肿瘤生长的降低(图19)。
与之形成对照的是，接受表鬼臼毒素吡喃葡糖苷和免疫球蛋白-tTF缀合物的小鼠内肿瘤大小萎缩，17天内未重新开始生长。在研究结束时(第20天)，接受表鬼臼毒素吡喃葡糖苷和免疫球蛋白-tTF的小鼠内肿瘤大小平均为900mm3，相比之下，用稀释剂治疗的小鼠为2300mm3，仅用免疫球蛋白-tTF治疗的小鼠为2000mm3。在仅接受表鬼臼毒素吡喃葡糖苷的小鼠中，第14天肿瘤平均为1400mm3(图19)。这些结果表明，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷可使肿瘤血管倾向于由tTF或免疫球蛋白-tTF缀合物形成血栓。不论机制如何，结果清楚地显示了tTF或TF缀合物与典型化学治疗剂的有利联合。实施例IX通过VIIa增强血浆凝血
游离的因子VIIa的存在大大增强了与细胞结合的tTF219诱导小鼠或人血浆凝血的能力(图20)。缺乏因子VIIa时，用B21-2/10H10双特异性抗体和10-10M tTF219处理的A20细胞在60秒内使血浆凝血，而当存在13.5nM因子VIIa时，它使血浆在20秒内凝血(图20)。这表明在因子VIIa的存在下，tTF诱导凝血的效力约增加了100倍。甚至在只有0.1nM因子VIIa的存在下，也可观察到tTF诱导凝血的效力约增加了2至5倍。
这一发现导致了本发明的一些方面，即将因子VIIa与tTF或其衍生物一起、或者与免疫球蛋白-tTF缀合物一起共同施用，以增强体内肿瘤血管的血栓形成。实施例X通过TF因子VII激活突变体减少小鼠血浆的凝血
据报道，tTF219W158和G164的突变可显著降低TF诱导重新钙化的血浆发生凝血的能力(Ruf等，1992；Martin等，1995)。TF的残基157-167对于加速因子VII激活为因子VIIa似乎是至关重要的，但对于因子VII与TF的结合似乎并不重要。发明人将W158突变为R，G164突变为A，并测定突变体一旦通过双特异性抗体B21-2/10H10定位于A20细胞的表面上时是否即获得使血浆凝血的能力。我们发现突变体诱导血浆凝血的效力比tTF219低30至50倍(图21)。实施例XI通过因子VIIa恢复因子VII激活突变体的凝血能力
突变的tTF219(G164A)是很弱的tTF219凝血突变体(Ruf等，1992)。突变存在于据认为对因子VII转变为因子VIIa至关重要的TF区域(氨基酸157-167)，因此，推断在被双特异性抗体和tTF219(G164A)包被的细胞中加入因子VIIa会诱导血浆凝血。在因子VIIa的存在下，先被B21-2/10H10包被，接着被tTF219(G164A)包被的A20细胞诱导血浆凝血的能力增强(图22)，这一事实可支持上述观点。相对于加入相同浓度的tTF219和因子VIIa而言，加入浓度为1nM或更高的因子VIIa时凝血时间仅稍微更慢一些。
突变的tTF219(W158R)与tTF219(G164A)的结果相似。相对于加入相同浓度的tTF219和因子VIIa而言，在先被B21-2/10H10包被、接着被tTF219包被的A20细胞中加入浓度为1nM或更高的因子VIIa时，凝血时间仅稍微变慢一些。
这些结果支持本发明某些方面的内容，即当将tTF219(G164A)或tTF219(W158R)与因子VIIa共同施用于携有肿瘤的动物时，会诱导肿瘤血管形成血栓。预想此方法比较有利，因为分开施用tTF219(G164A)，tTF219(W158R)或因子VIIa实际上对小鼠无毒性，相同结果可合理地推及至人。共同施用突变体tTF和因子VIIa有望不会导致毒性，而仍可导致肿瘤血管发生有效的血栓形成。因此，一起施用突变体tTF和因子VIIa预计会导致比施用tTF219加因子VIIa有所改善的治疗指标。实施例XII激活突变体和因子VIIa有所增强的抗肿瘤活性
为了进行这些研究，发明人选择了HT29(人结肠癌)异种移植肿瘤模型。给BALB/c nu/nu小鼠皮下注射HT29细胞(107个细胞/小鼠)。监测肿瘤大小，当肿瘤大小为0.5至1.0cm3时处理动物。给动物静脉内注射下列物质之一：tTF219(16μg)，tTF219(16μg)+因子VIIa(1μg)，tTF219(G164A)(64μg)，tTF219(G164A)(64μg)+因子VIIa(1μg)，仅因子VIIa(1μg)，或盐水。
处理24小时之后处死动物，用盐水和肝素灌注，并放血。收集肿瘤和器官，用福尔马林固定，制备组织切片。定量测定肿瘤切片上坏死的平均面积，并将此面积计算为切片上肿瘤总面积的百分比。
在这些小HT29肿瘤中，对用盐水、因子VIIa、tTF219或tTF219(G164A)治疗的动物肿瘤切片的分析显示出有一些坏死(图23)。tTF诱导的肿瘤坏死是最显著的，但在这种情况下，它不象使用不同肿瘤模型和/或大肿瘤的早期研究结果那样令人震惊。用tTF219+因子VIIa或tTF219(G164A)+因子VIIa治疗过的动物的肿瘤切片分析显示出有相当程度的坏死(分别为12.5％和17.7％；图23)，新形成血栓的血管和坏死的面积之间有密切的关系。因此，因子VIIa和TF、甚至体外凝血活性有特别缺损的TF构建体的联合使用是本发明特别有利的方面。由于HT29肿瘤模型一般难以形成血栓，且这些肿瘤较小，因此，这些结果在其它体系和人中可能甚至会更加令人惊奇。
参照本发明的内容，无需过多的实验即可制备和实施本文公开和要求的所有组合物和/或方法。尽管以优选实施方案的方式描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员显而易见的是，在不违背本发明概念、精神和范围的情况下，可对本文所述的组合物和/或方法和方法的步骤或各步骤的顺序作一些改动。更具体地，在化学和生理上都相关的某些药剂显然可替代本文所述的药剂，而能获得相同或相似的结果。对本领域技术人员而言显而易见的所有这种相似的替代和修饰都包括在所附权利要求书确定的本发明精神、范围和概念内。参考文献
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                    序列表1)一般资料：(i)申请人：
 (A)姓名：Board of Regents，The University of Texas
          System
 (B)街道：201 West 7th Street
 (C)城市：Austin
 (D)州：Texas
 (E)国家：美国
 (F)邮政编码：78701(ii)发明题目：凝血和肿瘤治疗的组织因子方法和组合物(iii)序列数：27(iv)计算机可读形式：
 (A)介质类型：软盘
 (B)计算机：IBM PC兼容
 (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
 (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(v)目前的申请资料：
 (A)申请号：未知(vi)在先申请资料：
 (A)申请号：US 60/042,427
 (B)申请日：27-MAR-1997(vi)在先申请资料：
 (A)申请号：US 60/036,205
 (B)申请日：27-JAN-1997(vi)在先申请资料：
 (A)申请号：US 60/035,920
 (B)申请日：22-JAN-1997(2)SEQ ID NO：1的资料：(i)序列特征：
 (A)长度：620个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：
 (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Thr His Arg Thr His Arg Ala1               5                   10                  15Ser Asn Thr His Arg Val Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Thr Tyr
           20                  25                  30Arg Ala Ser Asn Leu Glu Thr His Arg Thr Arg Pro Leu Tyr Ser Ser
       35                  40                  45Glu Arg Thr His Arg Ala Ser Asn Pro His GLu Leu Tyr Ser Thr His
50                  55                  60Arg Ile Leu Glu Leu Glu Gly Leu Thr Arg Pro Gly Leu Pro Arg Leu65                  70                  75                  80Tyr ser Pro Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly Leu Asn Val Ala Leu
            85                  90                  95Thr Tyr Arg Thr His Arg Val Ala Leu Gly Leu Asn Ile Leu Glu Ser
        100                 105                 110Glu Arg Thr His Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ala Ser
    115                 120                 125Pro Thr Arg Pro Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Cys Tyr Ser
130                 135                 140Pro His Glu Thr Tyr Arg Thr His Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Thr145                 150                 155                 160His Arg Gly Leu Cys Tyr Ser Ala Ser Pro Leu Glu Thr His Arg Ala
            165                 170                 175Ser Pro Gly Leu Ile Leu Glu Val Ala Leu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro
        180                 185                 190Val Ala Leu Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Thr His Arg Thr Tyr Arg Leu
    195                 200                 205Glu Ala Leu Ala Ala Arg Gly Val Ala Leu Pro His Glu Ser Glu Arg
210                 215                 220Thr Tyr Arg Pro Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Val Ala225                 230                 235                 240Leu Gly Leu Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala
            245                 250                 255Leu Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Pro Arg Leu Glu Thr Tyr Arg Gly Leu
        260                 265                 270Ala Ser Asn Ser Glu Arg Pro Arg Gly Leu Pro His Glu Thr His Arg
    275                 280                 285Pro Arg Thr Tyr Arg Leu Glu Gly Leu Thr His Arg Ala Ser Asn Leu
290                 295                 300Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Pro Arg Thr His Arg Ile Leu Glu Gly305                 310                 315                 320Leu Asn Ser Glu Arg Pro His Glu Gly Leu Gly Leu Asn Val Ala Leu
            325                 330                 335Gly Leu Tyr Thr His Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ala Ser Asn Val
        340                 345                 350Ala Leu Thr His Arg Val Ala Leu Gly Leu Ala Ser Pro Gly Leu Ala
    355                 360                 365Arg Gly Thr His Arg Leu Glu Val Ala Leu Ala Arg Gly Ala Arg Gly
370                 375                 380Ala Ser Asn Ala Ser Asn Thr His Arg Pro His Glu Leu Glu Ser Glu385                 390                 395                 400Arg Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Pro Val Ala Leu Pro His Glu Gly
            405                 410                 415Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Leu Glu Ile Leu Glu Thr Tyr Arg
        420                 425                 430Thr His Arg Leu Glu Thr Tyr Arg Thr Tyr Arg Thr Arg Pro Leu Tyr
    435                 440                 445Ser Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr
450                 455                 460Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Thr His Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Thr465                 470                 475                 480His Arg Ala Ser Asn Thr His Arg Ala Ser Asn Gly Leu Pro His Glu
            485                 490                 495Leu Glu Ile Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ala Ser Pro Leu Tyr
        500                 505                 510Ser Gly Leu Tyr Gly Leu Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Pro
    515                 520                 525His Glu Ser Glu Arg Val Ala Leu Gly Leu Asn Ala Leu Ala Val Ala
530                 535                 540Leu Ile Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr His Arg Val545                 550                 555                 560Ala Leu Ala Ser Asn Ala Arg Gly Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Thr His
            565                 570                 575Arg Ala Ser Pro Ser Glu Arg Pro Arg Val Ala Leu Gly Leu Cys Tyr
        580                 585                 590Ser Met Glu Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Gly Leu Leu Tyr Ser Gly
    595                 600                 605Leu Tyr Gly Leu Pro His Glu Ala Arg Gly Gly Leu
610                 615                 620(2)SEQ ID NO：2的资料：(i)序列特征：
 (A)长度：234个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：
 (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：His His His His His His Ala Met Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Cys1               5                   10                  15Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr
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   50                  55                  60Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys65                  70                  75                  80Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly
               85                  90                  95Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser
           100                 105                 110Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile
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               165                 170                 175Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile
           180                 l85                 190Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile
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   210                 215                 220Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu225                 230(2)SEQ ID NO：3的资料：(i)序列特征：
 (A)长度：234个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：
 (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：His His His His His His Ala Met Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly1               5                   10                  15Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn
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       35                  40                  45Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe
   50                  55                  60Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp65                  70                  75                  80Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn
               85                  90                  95Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro
           100                 105                 110Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln
       115                 120                 125Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu
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               165                 170                 175Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp
           180                 185                 190Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro
       195                 200                 205Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met
   210                 215                 220Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Cys225                 230(2)SEQ ID NO：4的资料：(i)序列特征：
 (A)长度：220个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：
 (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Ser Cys Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys1               5                   10                  15Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn
           20                  25                  30Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser
       35                  40                  45Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile
   50                  55                  60Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro65                  70                  75                  80Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu
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           100                 105                 110Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val
       115                 120                 125Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu
   130                 135                 140Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys145                 150                 155                 160Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe
               165                 170                 175Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala
           180                 185                 190Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val
       195                 200                 205Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
   210                 215                 220(2)SEQ ID NO：5的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：220个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
1               5                   10                  15
Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
            20                  25                  30
Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys
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Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val
    50                  55                  60
Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala
65                  70                  75                  80
Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn
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Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
            100                 105                 110
Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
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Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg
    130                 135                 140
Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
                165                 170                 175
Ile Asp Val Asp Iys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
            180                 185                 190
Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
        195                 200                 205
Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Cys
    210                 215                 220(2)SEQ ID NO：6的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：235个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
His His His His His His Ala Met Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn
            20                  25                  30
Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr
        35                  40                  45
Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe
    50                  55                  60
Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp
65                  70                  75                  80
Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn
                85                  90                  95
Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln
        115                 120                 125
Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu
    130                 135                 140
Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val
145                 150                 155                 160
Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser
                165                 170                 175
Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp
            180                 l85                 190
Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro
        195                 200                 205
Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met
    210                 215                 220
Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Cys
225                 230                 235(2)SEQ ID NO：7的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：236个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
His His His His His His Ala Met Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn
            20                  25                  30
Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr
        35                  40                  45
Thr Val Gln Ile Ser Tnr Lys Ser Gly Asp lrp Lys Ser Lys Cys Phe
    50                  55                  60
Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp
65                  70                  75                  80
Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn
                85                  90                  95
Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln
        115                 120                 125
Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu
    130                 135                 140
Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val
145                 150                 155                 160
Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser
                165                 170                 175
Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp
            180                 185                 190
Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro
        195                 200                 205
Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met
    210                 215                 220
Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Cys
225                 230                 235(2)SEQ ID N0：8的资料：(i)序列特征：
 (A)长度：219个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (C)链型：
 (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
1               5                   10                  15
Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
            20                  25                  30
Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys
        35                  40                  45
Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val
    50                  55                  60
Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala
65                  70                  75                  80
Gly Asn val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn
                85                  90                  95
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
            100                 105                 110
Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
        115                 120                 125
Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg
    130                 135                 140
Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Arg Lys Ser
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
                165                 170                 175
Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
            180                 185                 190
Ile Pro Ser Arg Thr val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
        195                 200                 205
Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
    210                 215(2)SEQ ID NO：9的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：219个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
Ser Gly Thr Thr Asn Thr val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
1               5                   10                  15
Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
            20                  25                  30
Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys
        35                  40                  45
Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val
    50                  55                  60
Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala
65                  70                  75                  80
Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn
                85                  90                  95
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
            100                 105                 110
Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
        115                 120                 125
Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg
    130                 135                 140
Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ser Ala Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
                165                 170                 175
Ile Asp val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
            180                 185                 190
Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
        195                 200                 205
Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
    210                 215(2)SEQ ID NO：10的资料：(i)序列特征：
    (A)长度：657个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
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  (A)长度：263个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1               5                   10                  15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
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        260(2)SEQ ID NO：13的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：1440个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：TCAACAGGCA GGGGCAGCAC TGCAGAGATT TCATCATGGT CTCCCAGGCC CTCAGGCTCC        60TCTGCCTTCT GCTTGGGCTT CAGGGCTGCC TGGCTGCAGG CGGGGTCGCT AAGGCCTCAG       120GAGGAGAAAC ACGGGACATG CCGTGGAAGC CGGGGCCTCA CAGAGTCTTC GTAACCCAGG       180AGGAAGCCCA CGGCGTCCTG CACCGGCGCC GGCGCGCCAA CGCGTTCCTG GAGGAGCTGC       240GGCCGGGCTC CCTGGAGAGG GAGTGCAAGG AGGAGCAGTG CTCCTTCGAG GAGGCCCGGG       300AGATCTTCAA GGACGCGGAG AGGACGAAGC TGTTCTGGAT TTCTTACAGT GATGGGGACC       360AGTGTGCCTC AAGTCCATGC CAGAATGGGG GCTCCTGCAA GGACCAGCTC CAGTCCTATA       420TCTGCTTCTG CCTCCCTGCC TTCGAGGGCC GGAACTGTGA GACGCACAAG GATGACCAGC       480TGATCTGTGT GAACGAGAAC GGCGGCTGTG AGCAGTACTG CAGTGACCAC ACGGGCACCA       540AGCGCTCCTG TCGGTGCCAC GAGGGGTACT CTCTGCTGGC AGACGGGGTG TCCTGCACAC       600CCACAGTTGA ATATCCATGT GGAAAAATAC CTATTCTAGA AAAAAGAAAT GCCAGCAAAC       660CCCAAGGCCG AATTGTGGGG GGCAAGGTGT GCCCCAAAGG GGAGTGTCCA TGGCAGGTCC       720TGTTGTTGGT GAATGGAGCT CAGTTGTGTG GGGGGACCCT GATCAACACC ATCTGGGTGG       780TCTCCGCGGC CCACTGTTTC GACAAAATCA AGAACTGGAG GAACCTGATC GCGGTGCTGG       840GCGAGCACGA CCTCAGCGAG CACGACGGGG ATGAGCAGAG CCGGCGGGTG GCGCAGGTCA       900TCATCCCCAG CACGTACGTC CCGGGCACCA CCAACCACGA CATCGCGCTG CTCCGCCTGC       960ACCAGCCCGT GGTCCTCACT GACCATGTGG TGCCCCTCTG CCTGCCCGAA CGGACGTTCT      1020CTGAGAGGAC GCTGGCCTTC GTGCGCTTCT CATTGGTCAG CGGCTGGGGC CAGCTGCTGG      1080ACCGTGGCGC CACGGCCCTG GAGCTCATGG TGCTCAACGT GCCCCGGCTG ATGACCCAGG      1140ACTGCCTGCA GCAGTCACGG AAGGTGGGAG ACTCCCCAAA TATCACGGAG TACATGTTCT      1200GTGCCGGCTA CTCGGATGGC AGCAAGGACT CCTGCAAGGG GGACAGTGGA GGCCCACATG      1260CCACCCACTA CCGGGGCACG TGGTACCTGA CGGGCATCGT CAGCTGGGGC CAGGGCTGCG      1320CAACCGTGGG CCACTTTGGG GTGTACACCA GGGTCTCCCA GTACATCGAG TGGCTGCAAA      1380AGCTCATGCG CTCAGAGCCA CGCCCAGGAG TCCTCCTGCG AGCCCCATTT CCCTAGCCCA      1440(2)SEQ ID N0：14的资料：(i)序列特征：
  (A)长度：466个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln1               5                   10                  15Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr
           20                  25                  30Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gln
       35                  40                  45Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe
   50                  55                  60Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu65                  70                  75                  80Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile phe Lys Asp Ala Glu Arg
               85                  90                  95Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser
           100                 105                 110Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr
       115                 120                 125Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His
   130                 135                 140Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln145                 150                 155                 160Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu
               165                 170                 175Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu
           180                 185                 190Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys
       195                 200                 205Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys
210                 215                 220Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly225                 230                 235                 240Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp
            245                 250                 255Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp
        260                 265                 270Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val
    275                 280                 285Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala
290                 295                 300Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro305                 310                 315                 320Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val
            325                 330                 335Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala
        340                 345                 350Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln
    355                 360                 365Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr
370                 375                 380Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys385                 390                 395                 400Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp
            405                 410                 415Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly
        420                 425                 430His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln
    435                 440                 445Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro
450                 455                 460Phe Pro465(2)SEQ ID NO：15的资料：(i)序列特征：
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Claims (66)

1.组合物，该组合物中含有生物学有效量的至少第一种经修饰增加了生物半寿期的凝血缺损组织因子化合物；其中所述修饰不是由组织因子化合物与能结合肿瘤细胞、肿瘤血管系统或肿瘤基质之组分的抗体或其抗原结合区域的连接组成。
2.权利要求1的组合物，可用于促进动物前血栓形成性血管优先凝血所用的药物中。
3.含有生物学有效量的至少第一种凝血缺损组织因子化合物的组合物，可用于促进动物内前血栓形成性血管优先凝血所用的药物中。
4.权利要求3的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物是经修饰增加了生物半寿期的凝血缺损组织因子化合物；其中所述修饰并不是将组织因子化合物与可结合肿瘤细胞、肿瘤血管系统或肿瘤基质组分的抗体或其抗原结合区域进行连接。
5.权利要求1，2或4中任一项的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物已通过与载体分子有效连接被修饰而增加了生物半寿期。
6.权利要求5的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物与非蛋白质载体分子有效连接。
7.权利要求5的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物与蛋白质载体分子有效连接。
8.权利要求7的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物与白蛋白或球蛋白载体分子有效连接。
9.权利要求7的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物与不特异性结合肿瘤细胞、肿瘤血管系统或肿瘤基质组分的抗体或其部分有效连接。
10.权利要求9的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物与不结合肿瘤细胞、肿瘤血管系统或肿瘤基质组分的IgG抗体有效连接。
11.权利要求9的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物与抗体的Fc部分有效连接。
12.权利要求9的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物被有效地插入IgG分子中以替代CH3域。
13.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物的活性比全长的天然组织因子低至少约100倍。
14.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物的活性比全长的天然组织因子低约100倍至1,000,000倍。
15.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物的活性比全长的天然组织因子低至少约1000倍。
16.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物的活性比全长的天然组织因子低至少约10,000倍。
17.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物的活性比全长的天然组织因子低至少约100,000倍。
18.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物的活性比全长的天然组织因子低至少约500,000倍。
19.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物的活性比全长的天然组织因子低至少约1,000,000倍。
20.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物是激活因子VII的能力缺损的突变组织因子化合物。
21.权利要求20的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物是在SEQ ID NO：1的约第157至167位的氨基酸区域中包括至少一个突变的突变组织因子化合物。
22.权利要求21的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物是其中第158位Trp变成Arg；第162位Ser变成Ala；第164位Gly变成Ala；或第158位Trp变成Arg且第162位Ser变成Ala的突变组织因子化合物。
23.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物是结合至磷脂表面的能力缺损的组织因子化合物。
24.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物是截短的组织因子化合物。
25.权利要求24的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物是约为219个氨基酸长的截短组织因子化合物。
26.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物至少是二聚体的组织因子化合物。
27.权利要求26的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物是同二聚体或异二聚体的组织因子化合物。
28.权利要求26的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物是聚合体形式的组织因子化合物。
29.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物是：
(a)基本上由SEQ ID N0：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的突变的组织因子化合物；或
(b)基本上由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的截短组织因子化合物。
30.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物是人组织因子化合物。
31.上述任一权利要求的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物是通过重组表达制备的组织因子化合物。
32.上述任一权利要求的组合物，其中所述组合物含有至少第二种不同类型的凝血缺损组织因子化合物。
33.上述任一权利要求的组合物，其中所述组合物与生物学有效量的至少一种因子VIIa或因子VIIa的激活物联合。
34.权利要求33的组合物，其中所述组合物与因子VIIa联合。
35.权利要求34的组合物，其中所述因子VIIa基本上由SEQ IDNO：18的氨基酸序列组成。
36.权利要求33的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物和所述因子VIIa或因子VIIa的激活物被配制成单一组合物。
37.权利要求36的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物与因子VIIa以预先形成的组织因子-因子VIIa复合物的形式联合。
38.权利要求33的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物和所述因子VIIa或因子VIIa的激活物被配制在不同组合物中。
39.上述任一权利要求的组合物，其中所述组合物与治疗有效量的至少第一种抗癌剂联合。
40.权利要求39的组合物，其中所述至少第一种抗癌剂是化学治疗剂。
41.权利要求40的组合物，其中所述至少第一种抗癌剂是表II所列的化学治疗剂。
42.权利要求41的组合物，其中所述至少第一种抗癌剂是表鬼臼毒素吡喃葡糖苷。
43.权利要求39的组合物，其中所述至少第一种抗癌剂是含有能与肿瘤细胞、肿瘤血管系统或肿瘤基质之组分特异性结合的抗体或抗原结合区域的抗体构建体，所述抗体与细胞毒性剂或凝血因子有效连接。
44.权利要求43的组合物，其中所述至少第一种抗癌剂是能特异性结合肿瘤血管系统组分的抗体构建体。
45.权利要求43的组合物，其中所述至少第一种抗癌剂是能特异性结合肿瘤基质组分的抗体构建体。
46.权利要求43的组合物，其中所述至少第一种抗癌剂是含有细胞毒性剂的抗体构建体。
47.权利要求43的组合物，其中所述至少第一种抗癌剂是含有凝血因子的抗体构建体。
48.权利要求47的组合物，其中所述至少第一种抗癌剂是含有组织因子或组织因子衍生物的抗体构建体。
49.权利要求39至48中任一项的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物和所述至少第一种抗癌剂被配制在单一组合物中。
50.权利要求39至48中任一项的组合物，其中所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物和所述至少第一种抗癌剂被配制成不同的组合物。
51.权利要求39至50中任一项的组合物，其中所述组合物含有至少第二种不同类型的抗癌剂。
52.权利要求2至38中任一项的组合物，其中所述药物可用于促进动物中与良性生长相关的前血栓形成性血管优先凝血。
53.权利要求2至51中任一项的组合物，其中所述药物可用于促进动物中与血管化的恶性肿瘤相关的前血栓形成性血管优先凝血。
54.权利要求53的组合物，其中所述药物可用于促进动物中与中等大小或大的血管化恶性肿瘤相关的前血栓形成性血管优先凝血。
55.权利要求2至54中任一项的组合物，其中所述药物被配制成供所述动物全身性施用。
56.权利要求2至55中任一项的组合物，其中所述药物被配制成供所述动物静脉内注射。
57.权利要求2至56中任一项的组合物，其中所述药物旨在供人受试者施用。
58.根据上述权利要求中任一项的组合物在制备药物中的用途，其中所述药物可用于促进动物中与血管化恶性肿瘤相关的前血栓形成性血管优先凝血并可导致肿瘤坏死。
59.根据权利要求2至38中任一项的组合物在制备药物中的用途，其中所述药物可用于促进动物前血栓形成性血管优先凝血。
60.在适当容器中包含下述的一种治疗试剂盒：
(a)激活因子VII的能力有缺损的至少第一种突变组织因子化合物与至少一种因子VIIa或因子VIIa激活物的生物学有效联合；或
(b)至少第一种凝血缺损组织因子化合物与至少第一种抗癌剂的生物学有效联合。
61.权利要求60的试剂盒，所述试剂盒含有激活因子VII的能力有缺损的至少第一种突变组织因子化合物与至少一种因子VIIa或因子VIIa激活物的生物学有效联合。
62.权利要求60的试剂盒，所述试剂盒含有至少第一种凝血缺损组织因子化合物与至少第一种抗癌剂的生物学有效联合。
63.权利要求60的试剂盒，所述试剂盒含有至少第一种凝血缺损组织因子化合物、至少第一种抗癌剂和至少一种因子VIIa或因子VIIa激活物的生物学有效联合。
64.治疗具有血管化肿瘤的动物的方法，所述方法包括给所述动物全身性施用生物学有效量的至少第一种组合物，该组合物中含有至少第一种凝血缺损组织因子化合物，所述化合物的量能有效促进肿瘤血管系统中的特异性凝血并导致肿瘤坏死。
65.权利要求64的方法，另外包括给所述动物施用生物学有效量的至少第二种治疗化合物，所述化合物选自因子VIIa、因子VIIa激活物和抗癌剂。
66.权利要求65的方法，其中先给所述动物施用所述至少第一种凝血缺损组织因子化合物，然后在能使得有效定位于所述肿瘤血管系统的时间施用所述至少第二种治疗化合物。
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