ES2197458T3 - Metodos de factor de tejido y composiciones para coagulacion y tratamientos de tumores. - Google Patents
Metodos de factor de tejido y composiciones para coagulacion y tratamientos de tumores.Info
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Abstract
La invención se refiere al sorprendente descubrimiento de que composiciones del Tejido Factor (TF) y variantes de éste se localizan específicamente en los vasos sanguíneos de un tumor vascularizado después de una administración sistémica. La invención además proporciona procedimientos y composiciones que comprenden Tejido Factor deficiente en coagulantes empleados para efectuar en una coagulación específica y para empleo en el tratamiento de tumores. Las composiciones TF y procedimientos del la presente invención se puede emplear en solitario, como coadyuvantes TF con vida media mejorada o en combinación con otros agentes tales como medicamentos quimioterapéuticos convencionales, e inmunotoxinas marcadas, coaguligandos marcados y/o en combinación con el factor VIIa (FVIIa) o activadores FBVIIa.
Description
Método de factor de tejido y composiciones para
coagulación y tratamiento de tumores.
La presente invención se refiere en general a los
campos de los vasos sanguíneos y de la coagulación. Más
particularmente abarca el sorprendente hallazgo de que las
composiciones de Factor de Tejido pueden localizar la vasculatura
del tumor y causar coagulación específica. Se dan a conocer
particularmente métodos y composiciones para efectuar coagulación
específica y para tratar tumores con composiciones de Factor de
Tejido (FT) y combinaciones de Factor de Tejido y otras
moléculas.
La resistencia de las células de los tumores a
varias sustancias quimioterapéuticas representa un problema
importante en la oncología clínica. Por lo tanto, aunque se han
realizado muchos avances en la quimioterapia de la enfermedad
neoplásica durante los últimos 30 años, la mayoría de las formas más
prevalentes de cáncer humano todavía resisten la intervención
quimioterapéutica efectiva.
Un problema subyacente significativo que se debe
atacar en cualquier régimen de tratamiento es el concepto de
``eliminación total de las células''. Este concepto sostiene que con
el fin de tener un régimen de tratamiento efectivo, ya sea el
enfoque quirúrgico o quimioterapéutico o ambos, debe haber una
eliminación total de las células, de las llamadas células malignas
``clonogénicas'', esto es, células que tienen la capacidad de crecer
de manera incontrolada y reemplazar cualquier masa tumoral que
pudiera haberse eliminado. Debido a la necesidad final de
desarrollar sustancias terapéuticas y regímenes que logren una
eliminación total de las células, ciertos tipos de tumores han sido
más receptivos que otros a la terapia. Por ejemplo, los tumores de
tejido blando (por ejemplo, linfomas), y los tumores de la sangre y
de los órganos formadores de sangre (por ejemplo, leucemias)
generalmente han respondido mejor a la terapia quimioterapéutica que
los tumores sólidos tales como los carcinomas.
Una razón de la susceptibilidad de los tumores
blandos y basados en sangre a la quimioterapia es la mayor
accesibilidad física de las células de linfoma y leucémicas a la
intervención quimioterapéutica. Simplemente, es mucho más difícil
para la mayoría de las sustancias quimioterapéuticas alcanzar todas
las células de una masa de tumor sólido que a los tumores blandos y
los tumores basados en sangre, y por lo tanto es mucho más difícil
lograr una eliminación total de células. Aumentar la dosis de
agentes quimioterapéuticos frecuentemente da como resultado efectos
secundarios tóxicos, los cuales generalmente limitan la efectividad
de las sustancias convencionales antitumor.
Desde hace tiempo ha estado claro que existe una
necesidad significativa del desarrollo de estrategias novedosas para
el tratamiento de los tumores sólidos. Una de estas estrategias es
el uso de ``inmunotoxinas'', en la cual se usa un anticuerpo de
célula antitumor para administrar una toxina a las células del
tumor. Sin embargo, al igual que con el enfoque quimioterapéutico
descrito anteriormente, éste también sufre de ciertas desventajas.
Por ejemplo, las células de antígeno-negativo o
deficientes de antígeno pueden sobrevivir y volver a poblar el tumor
o conducir a otras metástasis. También, en el tratamiento de tumores
sólidos, la masa del tumor generalmente es impermeable a moléculas
del tamaño de los anticuerpos y las inmunotoxinas. Por lo tanto, el
desarrollo de las inmunotoxinas solas no conduce a mejoras
particularmente significativas en el tratamiento del cáncer.
Ciertos investigadores desarrollaron entonces el
enfoque de tomar como objetivo vasculatura de los tumores sólidos.
Al tener como objetivo los vasos sanguíneos de los tumores, se
tienen ciertas ventajas porque no es probable conducir al desarrollo
de células tumorales resistentes o poblaciones de las mismas.
Además, la administración de sustancias objetivo a la vasculatura no
tiene problemas relacionados con la accesibilidad, y la destrucción
de los vasos sanguíneos conducirá a una amplificación del efecto
antitumor ya que muchas células tumorales dependen de un solo vaso
para su suministro de oxígeno y de nutrientes. Estrategias con
objetivo vascular a título de ejemplo se describen en Burrows y
colaboradores (1992), en Burrows y Thorpe (1993) y en WO 93/17715.
Esta administración dirigida de sustancias anticelulares a la
vasculatura del tumor da a conocer estrategias bastante
prometedoras, sin embargo, el uso de partes de toxina de estas
moléculas todavía deja lugar para el mejoramiento en el objetivo
vascular.
Otro enfoque para la destrucción dirigida de la
vasculatura del tumor se ha dado a conocer en la Patente WO
96/01653, en la cual se usan anticuerpos contra los marcadores de la
vasculatura del tumor para administrar coagulantes a la vasculatura
de los tumores sólidos. La administración dirigida de coagulantes de
esta manera tiene la ventaja de que no es probable que resulten
efectos secundarios tóxicos significativos de ningún fondo que falle
el objetivo que podría resultar debido a cualquier reactividad
cruzada de bajo nivel de los anticuerpos dirigidos con las células
de tejidos normales. Las construcciones de
anticuerpos-coagulantes para su uso en esta terapia
antitumor dirigida se han llamado ``coaguligandos'' (WO
96/01653).
Aunque la administración específica de un
coagulante a un vaso de un tumor marca un avance sorprendente, el
uso o manipulación de la coagulación en relación con el tratamiento
de varias enfermedades y desórdenes humanos se ha practicado durante
algún tiempo. A manera de ejemplo solamente, Morrissey y Comp han
propuesto el uso de Factor de Tejido truncado (tTF) en combinación
con el Factor VIIa (FVIIa) en el tratamiento de pacientes, tales
como hemofílicos, en los cuales se impide la coagulación de la
sangre (Patentes U.S.A. números 5.374.617; 5.504.064; y 5.504.067).
Roy y Vehar también han desarrollado mutantes de Factor de Tejido
que neutralizan el Factor de Tejido endógeno y se pueden usar como
anticoagulantes, por ejemplo, en el tratamiento de infarto de
miocardio (Patentes U.S.A. números 5.346.991 y 5.589.363).
En otros estudios referentes al Factor de Tejido
(FT), Edgington y colegas han demostrado que, en contraste con los
melanocitos normales, las células de melanoma humano con metástasis
maligna expresan altos niveles de Factor de Tejido, el iniciador
celular mayor de las cascadas de proteasa de coagulación del plasma
(WO 94/28017; WO 94/05328; Patente U.S.A. número 5.437.864). Se
informó de que la inhibición de la función de Factor de Tejido y la
reducción posterior en la generación de proteasa local dio como
resultado números reducidos significativamente de células tumorales
retenidas en la vasculatura. Esto conduce a la sugerencia de que hay
una correlación directa entre la expresión del Factor de Tejido y el
fenotipo metastásico de las células tumorales. Edgington y
colaboradores propusieron que se requiere una función del Factor de
Tejido para la implantación exitosa de células tumorales y que la
interferencia con la función del Factor de Tejido, o la
interferencia específica con la expresión en la superficie celular
del Factor de Tejido, es útil para inhibir la metástasis. Estos
autores por lo tanto han propuesto tratar el cáncer con anticuerpos
dirigidos contra el Factor de Tejido.
En contraste directo con las observaciones
anteriores de Edgington y colegas y los usos de anticuerpos
antifactor de Tejido para tratar el cáncer, los presentes inventores
han demostrado que las composiciones de Factor de Tejido truncado y
variantes de Factor de Tejido pueden, en sí mismas, emplearse en el
tratamiento de tumores sólidos. La presente invención se desarrolló,
en parte, a partir del descubrimiento sorprendente de los inventores
de que el Factor de Tejido truncado específicamente localiza a los
vasos sanguíneos dentro de un tumor vascularizado simplemente
después de la administración sistémica. Esta localización en
ausencia de cualquier fracción objetivo no podría haberse previsto a
partir de los estudios detallados anteriores de la molécula del
Factor de Tejido. La naturaleza autolocalizante del Factor de
Tejido, como se describe en la presente descripción, también
contrasta con los usos anteriormente descritos del Factor de Tejido
en el tratamiento de desórdenes de la sangre, por ejemplo, en
hemofílicos, en los cuales la administración y la acción del Factor
de Tejido ya sea no localizada o se limita a la aplicación tópica en
un área específica.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la
presente invención da a conocer métodos para favorecer la
coagulación en vasos sanguíneos protrombóticos de un animal o
paciente, estos métodos generalmente comprenden administrar al
animal una composición que comprende un compuesto de Factor de
Tejido de coagulación deficiente en una cantidad efectiva para
promover la coagulación preferentemente, o específicamente, en los
vasos sanguíneos protrombóticos.
Como se usa a través de toda la descripción, los
términos ``un'' y ``una'' se usan en el sentido de que significan
``como mínimo una (uno)'' ``como mínimo un primero o una primera'',
``uno, una o más'' o ``una pluralidad'' de los componentes o etapas
mencionados, excepto en los casos en donde se establece un límite
superior específicamente después de eso. Por lo tanto ``un Factor de
Tejido de coagulación deficiente'' significa ``como mínimo un primer
Factor de Tejido de coagulación deficiente''. Los límites y
parámetros operables de combinaciones, así como con las cantidades
de cualquier sustancia única, serán conocidas por los técnicos con
experiencia ordinaria en el campo a la luz de la presente
descripción.
Los vasos sanguíneos protrombóticos pueden estar
asociados con cualquiera de una serie de enfermedades angiogénicas,
con un crecimiento benigno o con un tumor vascularizado. En el
contexto de la presente invención, el término ``un tumor
vascularizado'' significa un tumor maligno vascularizado. La
presente invención es particularmente ventajosa para tratar tumores
vascularizados de como mínimo aproximadamente tamaño mediano y para
tratar tumores vascularizados grandes.
La composición generalmente es farmacéuticamente
aceptable y preferentemente será administrada al animal
sistémicamente, tal como a través de inyección intravenosa.
Los métodos se describen además como métodos para
tratar un paciente animal o humano que tiene una enfermedad asociada
con vasos sanguíneos protrombóticos, que comprenden administrar al
animal una cantidad de como mínimo una primera composición
coagulante que comprende como mínimo un primer compuesto de Factor
de Tejido de coagulación deficiente eficaz para preferente o
específicamente promover la coagulación en los vasos sanguíneos
protrombóticos asociados con el sitio de la enfermedad benigna o
maligna.
La esencia de la invención también se puede
definir como una composición que comprende como mínimo una cantidad
biológicamente efectiva de como mínimo un primer compuesto de Factor
de Tejido de coagulación deficiente para su uso en la preparación de
un medicamento para su uso en promover la coagulación preferente o
específicamente en vasos sanguíneos protrombóticos de un animal,
particularmente los asociados con un sitio de enfermedad benigno o
maligno.
En los medicamentos y usos de la presente
invención, una de las ventajas está en el hecho de que la simple
disposición de la composición coagulante en la circulación sistémica
del animal da como resultado la localización específica o
preferencial del compuesto de Factor de Tejido con respecto al sitio
de la enfermedad.
Los métodos preferentes descritos en la presente
invención son para su uso en promover la coagulación en la
vasculatura del tumor de un sujeto animal o humano que tiene un
tumor vascularizado, estos métodos generalmente comprenden
administrar al animal una o más composiciones que comprenden uno o
más compuestos de Factor de Tejido de coagulación deficiente en una
cantidad suficiente para específica o preferencialmente promover la
coagulación en la vasculatura del tumor. El tratamiento de tumores
vascularizados de tamaño mediano o grande es particularmente
ventajoso.
Los métodos de tratamiento se pueden describir
como métodos para tratar a un animal que tiene un tumor
vascularizado, que comprenden administrar al animal una cantidad
biológicamente efectiva de como mínimo una composición coagulante
que comprende una cantidad de como mínimo un primer compuesto de
Factor de Tejido de coagulación deficiente suficiente para
específica o preferencialmente promover la coagulación en la
vasculatura del tumor.
Otra descripción es de un método para tratar a un
animal o paciente que tiene un tumor vascularizado, el cual
comprende sistémicamente administrar al animal una o más
composiciones que comprenden uno o una pluralidad de compuestos de
Factor de Tejido de coagulación deficiente en una cantidad o
cantidades y durante un período de tiempo efectivo para promover la
coagulación específica o preferencialmente en la vasculatura del
tumor vascularizado.
Los efectos antitumor de la presente invención se
describen particularmente en los métodos caracterizados, ya que
comprenden administrar al animal, con un tumor, una composición que
comprende como mínimo un compuesto de Factor de Tejido de
coagulación deficiente en una cantidad efectiva para promover la
coagulación en la vasculatura del tumor y para específica o
preferencialmente causar necrosis del tejido en el tumor.
Estos aspectos de la invención también dan a
conocer una composición que comprende como mínimo una cantidad
biológicamente efectiva de como mínimo un primer compuesto de Factor
de Tejido de coagulación deficiente para su uso en la preparación de
un medicamento para su uso en promover la coagulación
preferencialmente, o específicamente, en los vasos sanguíneos
protrombóticos asociados con un tumor vascularizado maligno de un
animal; de manera que el medicamento se destina por lo tanto para su
uso en el tratamiento de un animal afectado por cáncer, causando la
coagulación de los vasos sanguíneos del tumor y la necrosis del
tumor.
Los términos ``preferencialmente'' y
``específicamente'', como se usan en la presente descripción en el
contexto de promover la coagulación en vasos sanguíneos
protrombóticos o la vasculatura de un tumor, y/o como se usan en el
contexto de promover la coagulación suficiente para causar necrosis
del tejido en un sitio de enfermedad tal como un tumor, significan
que el compuesto del Factor de Tejido o la combinación de Factor de
Tejido-segunda sustancia funciona para lograr la
coagulación y/o la necrosis del tejido que está sustancialmente
confinado en el sitio de la enfermedad, tal como la región del
tumor, y no se extiende sustancialmente causando la coagulación o la
necrosis del tejido en tejidos sanos, normales.
El compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente o las combinaciones del mismo ejercen de este modo
efectos coaguladores y/o destructores del tejido en un sitio de
localización de la enfermedad o del tumor y por lo tanto tienen poco
o ningún efecto coagulante o destructor del tejido en células o
tejidos normales, sanos. La coagulación y/o destrucción del tejido
por lo tanto se localizan en el sitio de enfermedad o tumor y no se
extienden sustancialmente o significativamente a otros vasos
sanguíneos o tejidos grandes o importantes. Por lo tanto, en los
métodos de la invención se mantiene la función de las células y
tejidos sanos sustancialmente sin daño.
Los ``Factores de Tejido de coagulación
deficiente'' de la invención generalmente serán compuestos de Factor
de Tejido que son como mínimo cien veces menos activos que el Factor
de Tejido original, de tamaño completo, por ejemplo, cuando se
prueba en un ambiente fosfolípido adecuado. Los compuestos de Factor
de Tejido todavía tendrán actividad, y se describen preferiblemente
como siendo aproximadamente de cien veces a aproximadamente un
millón de veces menos activos que el Factor de Tejido original de
tamaño completo, por ejemplo, cuando se prueba en un ambiente
fosfolípido adecuado.
Los compuestos de Factor de Tejido de coagulación
deteriorada preferiblemente serán como mínimo aproximadamente mil
veces menos activos que el Factor de Tejido original, de tamaño
completo; más preferiblemente serán como mínimo diez mil veces menos
activos que el Factor de Tejido original de tamaño completo; aún más
preferiblemente serán como mínimo aproximadamente cien mil veces
menos activos que el Factor de Tejido natural de tamaño completo,
por ejemplo, cuando se prueba en un ambiente fosfolípido
adecuado.
El ``como mínimo aproximadamente cien mil veces
menos activo'' no es el mínimo, y los compuestos de Factor de Tejido
pueden ser como mínimo aproximadamente quinientas mil veces o
aproximadamente un millón de veces menos activos que el Factor de
Tejido original de tamaño completo, por ejemplo, cuando se prueba en
un ambiente fosfolípido adecuado.
Los compuestos de Factor de Tejido humano
generalmente se preferirán para usos humanos, pero no se excluye el
uso de otras especies de Factor de Tejido, que incluyen Factor de
Tejido de E. coli. Para facilidad de preparación, los
compuestos de Factor de Tejido de coagulación deficiente también
serán preferiblemente preparados mediante expresión recombinante,
aunque esto no es esencial.
El Factor de Tejido puede volver la coagulación
deficiente siendo deficiente para enlazarse con una superficie de
fosfolípido y/o deficiente para insertarse en una membrana de
fosfolípido o bicapa de lípido. Los ejemplos preferentes son los
``Factores de Tejido truncados''. Como se define en la Patente
U.S.A. número 5.504.064, en la cual los compuestos se usan para
diferentes propósitos, ``los factores de tejido truncado''
generalmente tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de la
del Factor de Tejido original porque suficientes aminoácidos de
transmembrana que funcionan para enlazar el Factor de Tejido
original con las membranas de fosfolípido faltan en la proteína del
Factor de Tejido truncado, de manera que la proteína del Factor de
Tejido truncado no se enlaza con las membranas de fosfolípido.
Ejemplos particulares de Factores de Tejido
truncados son compuestos de Factor de Tejido que comprenden
aproximadamente los primeros 219 aminoácidos contiguos de la
secuencia de Factor de Tejido original, como se ejemplificó además
mediante un compuesto de Factor de Tejido que consiste esencialmente
en la secuencia de aminoácidos de la Secuencia de Identificación No.
1 (SEQ ID NO:1). Aunque se destina para su uso en diferentes
métodos, la Patente U.S.A. número 5.504.067 define a los Factores de
Tejido truncados como proteínas de Factor de Tejido que tienen una
secuencia de aminoácidos que comienza en la posición 1 y que termina
cerca de la posición 219 de la secuencia de Factor de Tejido
definida.
También se pueden emplear los Factores de Tejido
de coagulación deficiente diméricos, incluyendo Factores de Tejido
homodiméricos y heterodiméricos. Los dímeros de factores de tejido a
título de ejemplo se describen en la presente descripción como
aquéllos que consisten esencialmente en dímeros de la secuencia de
aminoácidos de la Secuencia de Identificación No.3 (dímero
H_{6}-tTF_{219} -cys-C'),
Secuencia de Identificación No.6 (dímero
H_{6}-tTF_{220}-cys-C'),
Secuencia de Identificación No.7 (dímero
H_{6}-tTF_{221}-cys-C'),
o Secuencia de Identificación No.2 (dímero
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}).
Los dímeros químicamente conjugados, como se describen en detalle
más adelante en la presente descripción, son preferentes para su uso
en ciertos aspectos de la presente invención, aunque los dímeros
producidos de manera recombinante, en estructura con enlazadores
dentro de una estructura, también están destinados a su uso en
realizaciones particulares.
Los compuestos de Factor de Tejido de coagulación
deteriorada para su uso con la presente invención, también pueden
ser Factores de Tejido poliméricos o multiméricos.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Factor
de Tejido será un Factor de Tejido mutante deficiente en la
capacidad de activar al Factor VII. Aunque útil solo, los usos más
preferentes de estos mutantes serán en conjunto con la
administración conjunta de una cantidad biológicamente eficaz de
como mínimo un Factor VIIa o un activador del Factor VIIa, tal como
cuando se usa con una cantidad de Factor VIIa suficiente para
aumentar la coagulación de la vasculatura del tumor y la necrosis
del tumor en el animal.
Estos mutantes pueden ser los que incluyen una
mutación en la región de aminoácidos entre aproximadamente la
posición 157 y aproximadamente la posición 167 de la Secuencia de
Identificación No. 1. A título de ejemplo, pero de ninguna manera
limitante, son los mutantes en los que, dentro de la Secuencia de
Identificación No.1, Trp en la posición 158 se cambia por Arg; en
donde Ser en la posición 162 se cambia por Ala; en donde Gly en la
posición 164 se cambia por Ala; o en donde Trp en la posición 158 se
cambia por Arg y Ser en la posición 162 se cambia por Ala. Ejemplos
definidos de estos mutantes son los que consisten esencialmente en
la secuencia de aminoácidos de la Secuencia de Identificación No. 8
ó la Secuencia de Identificación No.9.
Cualquiera de los compuestos de Factor de Tejido
de coagulación deficiente truncado, dimérico, multimérico y/o
mutante puede además modificarse para aumentar la longevidad, vida
media o ``vida media biológica'' de la molécula de Factor de Tejido.
Se pueden hacer varias modificaciones de la estructura de
polipéptido con el fin de efectuar este cambio en las
propiedades.
Ejemplos particulares de los Factores de Tejido
modificados para aumentar su vida media biológica son los compuestos
de Factor de Tejido que han sido operativamente unidos, y
preferiblemente enlazados covalentemente, a una molécula portadora,
tal como una portadora de proteína. Las portadoras preferiblemente
son portadoras inertes, tales como, a manera de ejemplo solamente,
una albúmina o una globulina. También se consideran las portadoras
no proteínas tales como los polisacáridos y los polímeros
sintéticos.
La unión operativa de una construcción de Factor
de Tejido a un anticuerpo o parte del mismo es una forma actualmente
preferente de Factor de Tejido de coagulación deficiente con vida
media biológica aumentada. Sin embargo, en el contexto de la primera
sustancia para su uso en las estrategias de tratamiento contra
cáncer dadas a conocer en la presente descripción, el Factor de
Tejido estará enlazado a un anticuerpo que no muestra enlace
específico significativo con un componente de una célula tumoral,
vasculatura tumoral o estroma tumoral. Esto es, en donde el
compuesto de Factor de Tejido no está unido a un anticuerpo
``anti-tumor'', y cuando el compuesto de Factor de
Tejido resultante no es un compuesto de ``Factor de Tejido dirigido
al tumor''.
En estos conjugados de Factor de
Tejido-anticuerpo, el compuesto de Factor de Tejido
puede estar unido operativamente a una molécula de IgG de la llamada
``especificidad irrelevante'', es decir, una que no tiene afinidad
inmunoenlazante para un componente de una célula tumoral,
vasculatura tumoral o estroma tumoral. Los compuestos de Factor de
Tejido igualmente se pueden unir operativamente a una parte Fc de un
anticuerpo, el cual no tiene función objetivo específica en el
contexto de la especificidad de anticuerpo. Otras construcciones
tenidas en cuenta son aquéllas en las que el compuesto de Factor de
Tejido se ha introducido en una molécula de IgG en lugar del dominio
C_{H}3.
Los tratamientos de Factor de Tejido
sorprendentemente eficaces de la presente invención se pueden
combinar de manera ventajosa con uno o más de otros tratamientos.
Por ejemplo, los métodos de tratamiento pueden comprender además
administrar a un animal o paciente una cantidad biológica o
terapéuticamente eficaz de como mínimo un segundo compuesto
terapéutico, tal como, como mínimo, uno de un segundo compuesto
terapéutico seleccionado entre el grupo que consiste en Factor VIIa,
un activador del Factor VIIa y como mínimo una primera sustancia o
agente anticáncer.
La como mínimo una primera sustancia anticáncer
puede ser una ``sustancia quimioterapéutica''. Tal como se usa en la
presente descripción, el término ``sustancia quimioterapéutica'' se
usa para referirse a una sustancia o fármaco quimioterapéutico
clásico usado en el tratamiento de tumores malignos. Este término se
usa por simplicidad independientemente del hecho de que se pueden
describir técnicamente otros compuestos, incluyendo inmunotoxinas,
como una sustancia quimioterapéutica porque ejercen un efecto
anticáncer. Sin embargo, ``quimioterapéutico'' ha llegado a tener un
significado diferente en la técnica y se está usando de acuerdo con
este significado estándar. ``Quimioterapéutico'' en el contexto de
la presente solicitud, por lo tanto, no se refiere generalmente a
inmunotoxinas, sustancias radioterapéuticas y similares, a pesar de
su solape operativo.
Varias sustancias quimioterapéuticas a título de
ejemplo se indican en la Tabla II. Los técnicos en la materia
fácilmente entenderán los usos y dosis apropiados de las sustancias
quimioterapéuticas, aunque las dosis se pueden reducir
satisfactoriamente cuando se usan en combinación con la presente
invención. Una sustancia quimioterapéutica actualmente preferente es
etoposida. Una nueva clase de fármacos que también se pueden llamar
``sustancias quimioterapéuticas'' son sustancias que inducen la
apoptosis. También se pueden usar uno o más de estos fármacos,
incluyendo genes, vectores y construcciones antisentido, según sea
adecuado, junto con la presente invención.
Las sustancias anticáncer adecuadas incluyen
además sustancias tóxicas específicamente dirigidas. Por ejemplo
anticuerpos anticáncer y, preferiblemente, construcciones
anticuerpos conjugados comprenden un anticuerpo que específicamente
se enlaza a un componente de una célula tumoral, vasculatura tumoral
o estroma tumoral, en donde el anticuerpo se une operativamente o se
conjuga con como mínimo una primera sustancia citotóxica o
anticelular o, por ejemplo, como mínimo a un primer factor de
coagulación.
A título de ejemplo solamente, la construcción o
conjugado objetivo puede ser una construcción o conjugado de
anticuerpo que específicamente se enlaza a una molécula de
superficie de célula tumoral; a un componente de vasculatura
tumoral, tal como la E-selectina,
P-selectina, VCAM-1,
ICAM-1, endoglina o una integrina; a un componente
adsorbido o localizado en la vasculatura o estroma, tal como VEGF,
FGF o TGF\beta; a un componente cuya expresión se induce natural o
artificialmente en el ambiente del tumor, tal como
E-selectina, P-selectina o un
antígeno MHC Clase II. Las sustancias objetivo que no son anticuerpo
incluyen factores de crecimiento, tales como VEGF y FGF; péptidos
que contienen el tripéptido R-G-D,
que se unen específicamente a la vasculatura del tumor, y otros
componentes objetivo tales como las anexinas y los ligandos
relacionados.
Las construcciones y conjugados de anticuerpos
pueden estar operativamente unidos a como mínimo una primera
sustancia citotóxica o de otro modo anticelular. También se pueden
unir operativamente a como mínimo un primer factor de coagulación.
En unión con coagulantes, también se pueden emplear ventajosamente
construcciones biespecíficas (por ejemplo, usando dos regiones de
enlace de anticuerpos), aunque los enlaces covalentes se prefieren
generalmente para usarlos con las toxinas. Una o más de las
sustancias tóxicas o coagulantes conocidas en la técnica se pueden
emplear en estas ``inmunotoxinas'' o ``coaguligandos'', y también se
pueden emplear Factor de Tejido o derivados de Factor de Tejido como
parte de los coaguligandos, donde el coaguligando es la segunda
``sustancia anticáncer''.
La presente invención da a conocer, por lo tanto,
además métodos para tratar a un animal o paciente que tiene un tumor
vascularizado, estos métodos generalmente comprenden administrar
sistémicamente a un animal uno o más compuestos de Factor de Tejido
de coagulación deficiente y una o más sustancias anticáncer en una
cantidad combinada eficaz para coagular la vasculatura del tumor y
específicamente inducir la necrosis del tumor. La sustancia
anticáncer puede ser una sustancia quimioterapéutica, como la
ejemplificada por etoposida, un anticuerpo, o una construcción de
anticuerpo o conjugado que comprende un anticuerpo que
específicamente se enlaza a un componente de una célula tumoral, una
vasculatura tumoral o estroma tumoral operativamente unido a una
sustancia citotóxica o a un factor de coagulación.
Ya sea que la sustancia anticáncer es una
quimioterapia o una construcción basada en anticuerpo, la una o más
sustancias anticáncer se pueden administrar al animal
simultáneamente, por ejemplo, a partir de una sola composición o de
dos o más composiciones distintas. También se considera la
administración escalonada o secuencial de uno o más compuestos de
Factor de Tejido y una o más sustancias anticáncer. La
``administración secuencial'' requiere que el Factor de Tejido y la
sustancia anticáncer se administren al animal en ``intervalos de
tiempo biológicamente eficaces''. Por ejemplo, los compuestos del
Factor de Tejido se pueden administrar al animal en un momento
biológicamente eficaz antes de la sustancia o sustancias anticáncer,
o la sustancia o sustancias anticáncer se pueden administrar al
animal en un momento biológicamente eficaz antes del compuesto o los
compuestos de Factor de Tejido. Cuando se administra primero un
compuesto de Factor de Tejido, generalmente se le dará en un momento
biológicamente eficaz suficiente para permitir que el compuesto del
Factor de Tejido preferencialmente se localice dentro de la
vasculatura del tumor antes de la administración de la sustancia o
sustancias anticáncer.
La presente invención además incluye métodos para
usar como mínimo un Factor VIIa o un activador del Factor VIIa para
aumentar la efectividad de uno o más de los compuestos de Factor de
Tejido de coagulación deficiente que definen la terapia primaria.
Estos métodos generalmente comprenden administrar además a un animal
o paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del Factor VIIa o un
activador del Factor VIIa.
En estas realizaciones, se preferirá generalmente
el uso del Factor VIIa solo. El Factor VIIa empleado puede consistir
esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la Secuencia de
Identificación No.14.
De nuevo, el Factor VIIa o el activador del
Factor VIIa se puede administrar al animal simultáneamente con el
compuesto del Factor de Tejido de coagulación deficiente. Como tal,
el Factor VIIa se puede administrar al animal o paciente en un
complejo preformado de Factor de Tejido-Factor VIIa.
En ciertas realizaciones, el complejo de Factor de
Tejido-Factor VIIa será un complejo equimolar.
Además, el compuesto de Factor de Tejido de
coagulación deficiente y el compuesto de Factor VIIa se pueden
administrar al animal usando administración escalonada o secuencial.
La primera administración del compuesto de Factor de Tejido
generalmente se preferirá y será preferible administrarla al animal
en un tiempo biológicamente efectivo antes del compuesto del Factor
VIIa. Esta administración previa efectiva del compuesto de Factor de
Tejido generalmente será en un momento biológicamente efectivo para
permitir que el compuesto de Factor de Tejido preferencialmente se
localice dentro de la vasculatura del tumor antes de la
administración del compuesto del Factor VIIa.
Estos métodos, por lo tanto, se pueden describir
como métodos para promover la coagulación en la vasculatura del
tumor de un animal o paciente que tiene un tumor vascularizado, que
comprende proporcionar sistémicamente al animal o paciente un
compuesto de Factor de Tejido de coagulación deficiente y Factor
VIIa o un activador del Factor VIIa en una cantidad combinada
suficiente para preferencialmente o específicamente promover la
coagulación en la vasculatura del tumor.
Al animal sujeto preferiblemente se le
proporcionará compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente en un momento anterior a proporcionarle el Factor VIIa,
de manera que el intervalo de tiempo anterior a la administración
del Factor VIIa es efectivo para que el compuesto de Factor de
Tejido preferencialmente o específicamente se localice dentro de la
vasculatura del tumor.
Se describen otros métodos como los métodos para
tratar a un animal que tiene un tumor vascularizado, que comprenden
la administración sistémica al animal de un compuesto de Factor de
Tejido de coagulación deficiente y Factor VIIa en una cantidad
combinada efectiva para promover la coagulación en la vasculatura
del tumor y específicamente causar necrosis en el tumor. La
preadministración del Factor de Tejido generalmente se prefiere de
modo que el compuesto de Factor de Tejido preferencialmente se
localice dentro de la vasculatura del tumor y forme una reserva para
la combinación posterior del Factor VIIa.
Todos estos tratamientos combinados de Factor
VIIa se pueden usar con cualquier compuesto de Factor de Tejido de
coagulación deficiente, tal como truncado, dimérico, y/o mutante y/o
aquellos con vida media aumentada. Estos métodos son particularmente
útiles para combinación con compuestos de Factor de Tejido que son
deficientes en su capacidad para activar el Factor VII.
Los métodos de tratamiento combinados de la
invención también abarcan combinaciones triples que usan uno o más
compuestos de Factor de Tejido de coagulación deficiente, una o más
sustancias anticáncer y Factor VIIa o un activador del Factor
VIIa.
La presente invención da a conocer además
composiciones novedosas en forma de composiciones que comprenden uno
o más compuestos de Factor de Tejido de coagulación deficiente que
han sido modificados para aumentar su vida media, diferentes de
otros en los que la modificación consiste en unir el compuesto de
Factor de Tejido a un anticuerpo que se une a un componente de una
célula tumoral, vasculatura tumoral o estroma tumoral.
Los ``compuestos de Factor de Tejido de vida
media aumentada'' abarcan todos los compuestos de Factor de Tejido
de coagulación deficiente descritos anteriormente, tales como los
factores de tejido truncados, diméricos, poliméricos, y/o mutantes
que se han modificado al aumentar su vida media.
Los compuestos de Factor de Tejido de vida media
aumentada preferiblemente comprenden un compuesto de Factor de
Tejido de coagulación deficiente que está unido operativamente, por
ejemplo, unido covalentemente, a una molécula portadora. Las
portadoras de proteína se prefieren actualmente, como se
ejemplifican por albúminas o globulinas, aunque también se
consideran portadoras no proteínas.
Una clase de compuestos de Factor de Tejido de
coagulación deficiente de vida media aumentada son aquellos que
están unidos operativamente a un anticuerpo o parte del mismo, tales
como una molécula de IgG o a una parte Fc de un anticuerpo. También
se consideran los factores de tejido introducidos en una parte
contigua de una molécula de IgG, por ejemplo, en el lugar del
dominio C_{H}3.
La invención da a conocer todavía además una
serie de equipos terapéuticos novedosos para su uso junto con los
métodos descritos. Estos equipos comprenderán, preferiblemente en
elementos contenedores convenientes, como mínimo un primer compuesto
de Factor de Tejido de coagulación deficiente en combinación con
como mínimo una primera sustancia anticáncer.
Los compuestos de Factor de Tejido de coagulación
deficiente pueden ser uno o más de los factores de tejido de
coagulación deficiente descritos en la presente descripción, tales
como los Factores de Tejido truncados, diméricos, poliméricos, y/o
mutantes, que incluyen factores de tejido mutantes deficientes en la
capacidad para activar el Factor VII. Cuando se emplean los mutantes
de activación del Factor VII en el equipo o ``kit'', éste
opcionalmente puede además comprender una cantidad biológicamente
eficaz de Factor VIIa.
El término ``sustancia anticáncer'' se usa como
se ha descrito anteriormente y cubre sustancias quimioterapéuticas,
tales como etoposida; y sustancias anticáncer basadas en
anticuerpos, tales como conjugados de anticuerpo que comprenden un
anticuerpo que específicamente se enlaza a un componente de una
célula tumoral, vasculatura tumoral o estroma tumoral operativamente
unida a una sustancia citotóxica o a un factor de coagulación, que
incluye un Factor de Tejido o un derivado de Factor de Tejido.
Otros equipos terapéuticos de la invención
comprenden generalmente, preferencialmente en elementos contenedores
convenientes, un compuesto de Factor de Tejido mutante que es
deficiente en su capacidad para activar el Factor VII en combinación
con el Factor VIIa. Anteriormente, se había pensado que los mutantes
de esta categoría carecían de actividad por lo que no podrían usarse
terapéuticamente para inducir la coagulación, sino solamente para
actuar como un antagonista del Factor de Tejido de tipo natural e
inhibir la coagulación. Solamente la combinación del Factor de
Tejido truncado sustancialmente activo con el Factor VIIa se ha
propuesto previamente, en relación con el tratamiento de desórdenes
sanguíneos.
La presente invención da a conocer de este modo
la combinación novedosa de un compuesto de Factor de Tejido mutante
que está más significativamente deteriorado en su capacidad
coagulante que el Factor de Tejido truncado, preferiblemente en
virtud de ser deficiente en la capacidad para activar el Factor VII,
junto con el Factor VIIa. El Factor VIIa se volverá ``Factor VIIa
exógeno'' después de la administración a un animal. Estos equipos,
por lo tanto, comprenden preferiblemente, en un elemento contenedor
conveniente, una cantidad biológicamente eficaz de un compuesto de
Factor de Tejido mutante deficiente en su capacidad para activar el
Factor VII en combinación con una cantidad biológicamente eficaz de
como mínimo un Factor VIIa o un activador del Factor VIIa. Los
activadores del Factor VIIa se pueden sustituir por el Factor VIIa
en estos equipos, o se pueden emplear en adición con el Factor VIIa.
También se pueden añadir sustancias suplementarias.
Los mutantes de Factor de Tejido para su uso en
estos equipos se ejemplifican mediante los que incluyen una mutación
en la región de aminoácidos entre aproximadamente la posición 157 y
aproximadamente la posición 167 de la Secuencia de Identificación
No.1. Esto se ejemplifica mediante los mutantes en los que, dentro
de la Secuencia de Identificación No.1, la Trp en la posición 158
cambia a Arg; en donde Ser en la posición 162 cambia a Ala; en donde
Gly en la posición 164 cambia a Ala; o en donde Trp en la posición
158 cambia a Arg y Ser en la posición 162 cambia a Ala. Otros
ejemplos son los factores de tejido mutantes que consisten
esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la Secuencia de
Identificación No.8 o Secuencia de Identificación No.9.
Los equipos de tratamiento combinado que
comprenden, preferiblemente en un elemento contenedor conveniente,
como mínimo el primer compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente, como mínimo una primera sustancia anticáncer y Factor
VIIa o un activador del Factor VIIa, también son dados a conocer por
la invención.
Los siguientes dibujos forman parte de la
presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar
adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La
invención se puede entender mejor haciendo referencia a uno o más de
estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las
realizaciones específicas presentadas en esta patente.
Figura 1: Inducción de coagulación de plasma
mediante Factor de Tejido de tamaño completo. La sangre (A) se
muestra en contacto con la membrana celular (B).
Figura 2: La estructura de dominio del Factor de
Tejido. Se representan el dominio extracelular (A; aminoácidos
1-219), y la membrana celular (B). El dominio
NH_{2} (10) se representa como sombreado cruzado, la región de
enlace del factor VII/VIIa (20) se representa como sombreado. El
dominio de transmembrana (40) comienza en el aminoácido 220 (30) y
abarca la membrana celular. El dominio de transmembrana del Factor
de Tejido se suprime o se vuelve no funcional de otra manera para
generar un (FTt) funcional de la presente invención. En ciertas
composiciones de (FTt) el dominio NH_{2} también se puede suprimir
o volver no funcional.
Figura 3: Modelo para la coagulación inducida por
Factor de Tejido truncado de vasculatura tumoral. La sangre (A) se
representa en contacto con la membrana celular (B) del endotelio
vascular del tumor (C). El endotelio del tumor protrombótico tiene
factor IX, X (mostrado) o TFPI/Xa más serina fosfatidilo (PS^{-})
en su superficie, el cual enlaza tTF-VII o
tTF-VIIa, conduciendo a la coagulación.
Las figuras 4A y 4B. Figura 4A: Inducción de
coagulación por el Factor de Tejido truncado ligado a la célula. Se
incubaron células A20 (10^{5} células, 100 \mul) con anticuerpos
(0,33 \mug) y Factor de Tejido truncado (0,17 \mug) durante una
hora a 4ºC. Se añadieron cloruro de calcio (12,5 mM) y plasma de
ratón citrado a las células y se registró el tiempo para que se
formaran las primeras hebras de fibrina (tiempo de coagulación,
segundos; eje horizontal). Se muestra el número de muestra en el eje
vertical. La muestra 1 no incluye anticuerpos añadidos o Factor de
Tejido truncado (control), la muestra 2 incluye anticuerpo
B21-2/10H10, la muestra 3 incluye Factor de Tejido
truncado, la muestra 4 incluye anticuerpo B21-2/OX7
más Factor de Tejido truncado, la muestra 5 incluye anticuerpo
CAMPATH-2/10H10 más Factor de Tejido truncado, la
muestra 6 incluye anticuerpo 10H10 F(ab')_{2} más Factor de
Tejido truncado, la muestra 7 incluye anticuerpo 10H10 Fab' más
Factor de Tejido truncado, la muestra 8 incluye anticuerpo
B21-2 F(ab')_{2} más Factor de Tejido
truncado, la muestra 9 incluye anticuerpo B21-2 Fab'
más Factor de Tejido truncado, la muestra 10 incluye anticuerpo
B21-2/10H10 más Factor de Tejido truncado. Figura
4B: Relación entre el número de moléculas de Factor de Tejido
truncado ligadas y tiempo de coagulación del plasma. Se incubaron
células A20 (10^{5} células, 100 \mul) con concentraciones
variantes de B21-2/10H10 más un exceso de Factor de
Tejido truncado durante una hora a 4ºC en presencia de azida de
sodio y luego se lavaron, se calentaron a 37ºC. Se añadieron cloruro
de calcio (12,5mM) y plasma de ratón citrado (un lote diferente del
de A) a las células y se registró el tiempo para que se formaran las
primeras hebras de fibrina (tiempo de coagulación, segundos; eje
vertical). El número de moléculas de Factor de Tejido truncado unido
a las células (\medcirc) se determinó en un estudio paralelo con
^{125}I-tTF (escala log; eje horizontal). Los
valores representan el promedio de las tres medidas, con desviación
estándar.
Figura 5: Coagulación de plasma de ratón mediante
tTF_{219},
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
y
H_{6}-tTF_{219}-cys-C'
asociados con las células. Se trataron células de linfoma A20
(I-A^{d} positivo) a temperatura ambiente con el
anticuerpo biespecífico ``de captura'', B21-2/10H10,
reconociendo tanto a I-A^{d} como al Factor de
Tejido truncado. Las células se lavaron y se añadieron dos
preparaciones diferentes de Factor de Tejido truncado 219
[tTF_{219} (\medcirc) estándar y tTF_{219}
(\blacktriangle)],
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
(\Box) o H_{6}-tTF_{219}
-cys-C' (\newmoon) a un rango de concentraciones
de Factor de Tejido truncado (concentración, M; eje horizontal). Las
células se lavaron y se calentaron a 37ºC. Se añadieron calcio y
plasma de ratón citrado y se registró el tiempo para que se formaran
las primeras hebras de fibrina (tiempo de coagulación, segundos; eje
vertical).
Figura 6: Coagulación de plasma de ratón mediante
H_{6}-tTF_{220}-cys-C'
y tTF_{220}-cys-C' asociados con
la célula. Se trataron células de linfoma A20
(I-A^{d} positivo) a temperatura ambiente con el
anticuerpo biespecífico ``de captura'', B21-2/10H10,
reconociendo tanto a I-A^{d} como al Factor de
Tejido truncado. Las células se lavaron y se añadieron tTF_{219}
estándar (\blacksquare),
H_{6}-tTF_{220}-cys-C'
(\medcirc) y tTF_{220}-cys-C'
(\newmoon) a un rango de concentraciones (concentración, M; eje
horizontal). Las células se lavaron y se calentaron a 37ºC. Se
añadió calcio y plasma de ratón citrado y se registró el tiempo para
que se formaran las primeras hebras de fibrina (tiempo de
coagulación, segundos; eje vertical).
Figura 7: Coagulación de plasma de ratón mediante
H_{6}-tTF_{221}-cys-C',
tTF_{221}-cys-C' y dímero de
H_{6}-tTF_{221}-cys-C'
asociados con las células. Se trataron células de linfoma A20
(I-A^{d} positivo) a temperatura ambiente con
anticuerpo biespecífico de ``captura'', B21-2/10H10,
reconociendo tanto I-A^{d} como Factor de Tejido
truncado. Las células se lavaron y se añadieron tTF_{219} estándar
(\medcirc), H_{6}-
tTF_{221}-cys-C' (\newmoon),
tTF_{221}-cys-C' (\Box), o
dímero de
H_{6}-tTF_{221}-cys-C'
(\blacktriangle) a un rango de concentraciones (concentración, M;
eje horizontal). Las células se lavaron y se calentaron a 37ºC. Se
añadieron calcio y plasma de ratón citrado y se registró el tiempo
para que se formaran las primeras hebras de fibrina (tiempo de
coagulación, segundos; eje vertical).
Figura 8: Coagulación de plasma de ratón mediante
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
y dímero de
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
asociados con la célula. Se trataron células de linfoma A20
(I-A^{d} positivo) a temperatura ambiente con el
anticuerpo biespecífico de ``captura'', B21-2/10H10,
reconociendo tanto el I-A^{d} como el Factor de
Tejido truncado. Las células se lavaron y se añadieron tTF_{219}
estándar (\medcirc),
H_{6}-N'-cys- tTF_{219}
(\blacksquare) y dímero de
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
(\newmoon) en un rango de concentraciones (concentración, M; eje
horizontal). Las células se lavaron y se calentaron a 37ºC. Se
añadieron calcio y plasma de ratón citrado y se registró el tiempo
para que las primeras hebras de fibrina se formaran (tiempo de
coagulación, segundos; eje vertical).
Figura 9: Trombosis de vasos en tumores grandes
C1300 Mu\gamma mediante tTF_{219}. Ratones Nu/Nu que tenían
tumores C1300 Mu\gamma subcutáneos grandes (>1000 cm^{3}) se
inyectaron intravenosamente con 16-20 \mug de
tTF_{219}. Veinticuatro horas después, los ratones fueron
anestesiados, se desangraron y se les retiraron los tumores y los
órganos. Se evaluaron secciones parafínicas de los tejidos para
determinar la presencia de vasos con trombosis. La cantidad de vasos
con trombosis y vasos abiertos en secciones de tumores se contaron.
El porcentaje de vasos tumorales con trombosis se muestra en el eje
vertical. La barra sombreada representa ratones inyectados con
tTF_{219}, la barra abierta representa ratones inyectados con PBS
(``solución salina regulada de fosfato'').
Figura 10: Trombosis de vasos en tumores grandes
C1300 mediante tTF_{219}. Ratones Nu/Nu que tenían tumores C1300
subcutáneos grandes (>1000 mm^{3}) se inyectaron
intravenosamente con 16-20 \mug de tTF_{219}.
Veinticuatro horas después, los ratones fueron anestesiados, se
desangraron y se les retiraron los tumores y los órganos. Se
evaluaron secciones parafínicas de los tejidos para determinar la
presencia de vasos con trombosis. La cantidad de vasos con trombosis
y vasos abiertos en secciones de tumores se contaron. El porcentaje
de vasos tumorales con trombosis se muestra en el eje vertical. La
barra sombreada representa ratones inyectados con tTF_{219}, la
barra abierta representa ratones inyectados con solución salina
regulada de fosfato.
Figura 11: Trombosis de vasos en tumores grandes
3LL mediante tTF_{219}. Ratones C57BL/6 que tenían tumores 3LL
subcutáneos grandes (>800 mm^{3}) se inyectaron
intravenosamente con 16-20 \mug de tTF_{219}.
Veinticuatro horas después, los ratones fueron anestesiados, se
desangraron y se les retiraron los tumores y los órganos. Se
evaluaron secciones parafínicas de los tejidos para determinar la
presencia de vasos con trombosis. La cantidad de vasos con trombosis
y vasos abiertos en secciones de tumores se contaron. El porcentaje
de vasos tumorales con trombosis se muestra en el eje vertical. La
barra sombreada representa ratones inyectados con tTF_{219}, la
barra abierta representa ratones inyectados con solución salina
regulada de fosfato.
Figuras 12A y 12B: Inhibición del crecimiento de
tumores C1300 Mu\gamma en ratones mediante tTF_{219}. Figura
12A: A ratones con tumores C1300 (Mu\gamma) de 0,8 a 1,0
centímetros de diámetro se les aplicaron dos inyecciones
intravenosas del coaguligando
B21-2/10H10-tTF (\newmoon)
separadas por seis días (flechas). A los ratones en el grupo de
control se les aplicaron dosis equivalentes de Factor de Tejido
truncado solo (\Box), CAMPATH-2/10H10 más tTF
(\Delta) o solución salina tamponada de fosfato (\medcirc). Los
ratones que recibieron B21-2/OX7 y tTF tuvieron
respuestas de tumores similares a los animales que recibieron tTF
solo. La administración de B21-2/10H10 no afectó
sólo el crecimiento del tumor. Cada grupo contenía de 12 a 27
ratones. Los puntos representan el volumen medio del tumor por grupo
(\pm SEM). El volumen promedio del tumor (cm^{3}) se muestra en
el eje vertical, días después del primer tratamiento se muestra en
el eje horizontal. Figura 12B: A ratones Nu/nu que tenían tumores
C1300 Mu\gamma subcutáneos pequeños (350 mm^{3}) se les inyectó
intravenosamente con 16-20 microgramos de
tTF_{219} (\blacksquare) o solución salina regulada de fosfato
(\medcirc). El tratamiento se repitió una semana después. Los
tumores se midieron diariamente y se calcularon los volúmenes del
tumor (+ una desviación estándar). El número de ratones por grupo de
tratamiento fue de 8-10. El volumen promedio del
tumor (cm^{3}) se muestra en el eje vertical, días después del
primer tratamiento se muestra en el eje horizontal.
Figura 13: Inhibición del crecimiento de tumores
H460 en ratones mediante tTF_{219}. A ratones Nu/nu que tenían
tumores H460 subcutáneos pequeños (350 mm^{3}) se les inyectó
intravenosamente con 16-20 microgramos de
tTF_{219} (\blacksquare) o solución salina regulada de fosfato
(\medcirc). El tratamiento se repitió una semana después. El
tiempo de las inyecciones se designa por flechas. Los tumores se
midieron diariamente y se calcularon los volúmenes de los tumores (+
una desviación estándar). El número de ratones por grupo de
tratamiento fue de 8-10. El volumen promedio del
tumor (cm^{3}) se muestra en el eje vertical, días después el
primer tratamiento se muestra en el eje horizontal.
Figura 14: Inhibición del crecimiento de tumores
HT29 en ratones mediante tTF_{219}. A ratones Nu/nu que tenían
tumores HT29 subcutáneos grandes (1200 mm^{3}) se les inyectó
intravenosamente con 16 microgramos o 64 microgramos de tTF_{219}
(\Box) o solución salina regulada de fosfato (\newmoon). A los
tumores se les midió diariamente (días después de la inyección; eje
horizontal), y se calcularon los volúmenes de los tumores (+ una
desviación estándar (volumen del tumor, mm^{3}; eje vertical). El
número de ratones por grupo de tratamiento fue de
3-4.
Figura 15: Coagulación de plasma de ratón
mediante
IgG-H_{6}-N'-cys-
tTF_{219} asociada con células. Se trataron células de linfoma A20
(I-A^{d} positivo) con el anticuerpo biespecífico
de ``captura'', B21-2/10H10, reconociendo tanto
I-A^{d} como tTF_{219}. Se añadieron
IgG-H_{6}-N'-cys-
tTF_{219} (\Delta),
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
(\blacksquare) o tTF_{219} (\medcirc) a un rango de
concentraciones a temperatura ambiente (concentración, M; eje
horizontal). Las células se lavaron y se calentaron a 37ºC. Se
añadió calcio y plasma de ratón citrado y se registró el tiempo para
que se formaran las primeras hebras de fibrina (tiempo de
coagulación, segundos; eje vertical).
Figura 16: Coagulación del plasma de ratón por
IgG-H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
e
IgG-H_{6}-tTF_{219}-cys-C'
asociadas con las células. Se prepararon conjugados de
inmunoglobulina-tTF enlazando B21-2
IgG (respecto a I-A^{d}) a
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
(\blacktriangle) o
H_{6}-tTF_{219}-cys-C'
(\blacksquare). Se añadieron los conjugados a un rango de
concentraciones a células de linfoma A20 (I-A^{d}
positivo) a temperatura ambiente, y se compararon con tTF_{219}
(\newmoon) (concentración, M; eje horizontal). Las células se
lavaron y calentaron a 37ºC. Se añadieron calcio y plasma de ratón
citrado. Se registró el tiempo (segundos) para que se formaran las
primeras hebras de fibrina. El eje vertical muestra el tiempo de
coagulación como un porcentaje del control.
Figura 17: Conversión del Factor X al Factor Xa
mediante
IgG-H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
asociado con células y
Fab'-H_{6}-N'-cys-
tTF_{219}, medido mediante una prueba de cromógeno. Se trataron
células A20 (I-A^{d} positivo) con el anticuerpo
biespecífico de ``captura'', B21-2/10H10,
reconociendo tanto I-A^{d} como tTF, se añadió con
IgG-H_{6}-N'-cys-
tTF_{219} (\medcirc) o
Fab'-H6-N'-cys-tTF_{219}
(\bigtriangleup), los cuales se añadieron a un rango de
concentraciones a temperatura ambiente. También se añadieron
B21-2/10H10 más
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
(X) y Mac51/10H10 más
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
(control, \blacksquare) (concentración, M; eje horizontal). Las
células se lavaron y se calentaron a 37ºC. Se añadieron calcio y
``proplex t'' (el proplex t contiene factores II, VII, IX y X). La
producción de Xa se midió añadiendo el sustrato que libera
cromóforo, S-2765, y midiendo la densidad óptica a
409 nm (OD_{409}nm; eje vertical).
Figura 18: Inhibición del crecimiento de tumores
C1300 Mu\gamma en ratones mediante conjugado de
inmunoglobulina-tTF. A ratones Nu/nu que tenían
tumores C1300 Mu\gamma subcutáneos pequeños (300 mm^{3}) se les
inyectó intravenosamente con 16-20 microgramos de
tTF_{219} acomplejado con anticuerpo ``portador'' biespecífico OX7
Fab'/10H10 Fab (\Delta). Otros ratones recibieron tTF_{219} solo
(\blacksquare), o diluyente (PBS, \medcirc). El tratamiento se
repitió una semana después. Los tratamientos diarios se designan
por flechas. Los tumores se midieron diariamente y se calcularon
los volúmenes de los tumores (más una desviación estándar). El
número de ratones por grupo de tratamiento fue de
7-10. El volumen promedio de tumor (cm^{3}) se
muestra en el eje vertical, días después del primer tratamiento se
muestra en el eje horizontal.
Figura 19: Aumento de la actividad antitumor de
la inmunoglobulina-tTF mediante la etoposida. A
ratones SCID que tenían tumores de Hodgkin humanos L540 subcutáneos
se les aplicó una sola inyección intravenosa de un complejo de
tTF_{219} y el anticuerpo biespecífico ``portador'' Mac51
Fab'/10H10 Fab' (\blacksquare). Otros ratones recibieron 480
\mug de etoposida intraperitonealmente dos días después, un día
después y en el día del tratamiento con el conjugado de
inmunoglobulina-tTF (\blacktriangle). Otros
ratones recibieron etoposida sola (\medcirc) o diluyente
(solución salina regulada de fosfato, \Delta). Los tumores se
midieron diariamente y se calcularon los volúmenes de los tumores
(+ una desviación estándar). El volumen promedio del tumor
(cm^{3}) se muestra en el eje vertical, días después del
tratamiento se muestra en el eje horizontal.
Figura 20: Aumento de la coagulación de plasma
mediante el Factor VIIa. Se trataron células de linfoma A20
(I-A^{d} positivo) a temperatura ambiente con el
anticuerpo biespecífico de ``captura'', B21-2/10H10,
reconociendo tanto I-A^{d} como tTF. Las células
se lavaron y se añadieron tTF_{219} solo (\medcirc) o
tTF_{219} con Factor VIIa en un rango de concentraciones de
Factor VIIa, como sigue: 0,1 nM (\blacksquare); 0,3 nM
(\newmoon); 0,9 nM (\Delta); 2,7 nM (\blacktriangle); y 13,5
nM (+) (concentración, M; eje horizontal). Las células se lavaron y
calentaron a 37ºC. Se añadieron calcio y plasma de ratón citrado y
se registró el tiempo para que se formaran las primeras hebras de
fibrina (tiempo de coagulación, segundos; eje vertical).
Figura 21: Coagulación débil de plasma de ratón
mediante mutantes tTF_{219} (W158R) y tTF_{219} (G164A)
asociados con las células. Se trataron células de linfoma A20
(I-A^{d} positivo) a temperatura ambiente con el
anticuerpo biespecífico de ``captura'', B21-2/10H10,
reconociendo tanto I-A^{d} como tTF. Las células
se lavaron y se añadieron tTF_{219} (\medcirc), tTF_{219}
(W158R) (\newmoon) o tTF_{219} (G164A) (\Box) a un rango de
concentraciones (concentración, M; eje horizontal). Las células se
lavaron y calentaron a 37ºC. Se añadieron calcio y plasma de ratón
citrado y se registró el tiempo para que se formaran las primeras
hebras de fibrina (tiempo de coagulación, segundos; eje
vertical).
Figura 22: Restauración de la actividad inductora
de coagulación del mutante tTF_{219} (G164A) y (W158R) mediante el
Factor VIIa. Se trataron células de linfoma A20
(I-A^{d} positivo) a temperatura ambiente con el
anticuerpo biespecífico de ``captura'', B21-2/10H10,
reconociendo tanto I-A^{d} como tTF. Las células
se lavaron y no se trataron (\Delta) o se trataron con:
tTF_{219} (\medcirc); tTF_{219} (G164A) (\blacksquare) o
tTF_{219} (W158R) (\newmoon); cada uno con la adición de Factor
VIIa a un rango de concentraciones (concentración, nM; eje
horizontal). Las células se lavaron y calentaron a 37ºC. Se
añadieron calcio y plasma de ratón citrado y se registró el tiempo
para que se formaran las primeras hebras de fibrina (tiempo de
coagulación, segundos; eje vertical).
Figura 23: Actividad antitumor de complejos
tTF219: VIIa y tTF219 (G164A):VIIa en ratones que tienen carcinomas
colorrectales humanos HT29. De izquierda a derecha, las barras
representan: solución salina (1); tTF (2); Factor VIIa (3); tTF más
Factor VIIa (4); G164A (5); y G164A más Factor VIIa (6). El eje
vertical muestra el porcentaje promedio de necrosis en los tumores
examinados.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
SEQ ID NO: 1 \+ Secuencia de Aminoácidos de tTF _{219} \cr SEQ ID
NO: 2 \+ Secuencia de Aminoácidos de
H _{6} -N'-cys-TF _{219} \cr
SEQ ID NO: 3 \+ Secuencia de Aminoácidos de
H _{6} -tTF _{219} -cys-C'\cr
SEQ ID NO: 4 \+ Secuencia de Aminoácidos de
N'-cys-tTF _{219} \cr SEQ ID NO: 5
\+ Secuencia de Aminoácidos de
tTF _{219} -cys-C'\cr SEQ ID NO: 6
\+ Secuencia de Aminoácidos de
H _{6} -tTF _{220} -cys-C'\cr
SEQ ID NO: 7 \+ Secuencia de Aminoácidos de
H _{6} -tTF _{221} -cys-C'\cr
SEQ ID NO: 8 \+ Secuencia de Aminoácidos de tTF _{219} (W 158
R)\cr SEQ ID NO: 9 \+ Secuencia de Aminoácidos de tTF _{219} (G
164 A)\cr SEQ ID NO: 10 \+ Secuencia de ADNc para tTF\cr SEQ ID
NO: 11 \+ Secuencia genómica completa de Factor de Tejido\cr SEQ
ID NO: 12 \+ Secuencia de aminoácido del Factor de Tejido\cr SEQ
ID NO: 13 \+ Factor VII ADN\cr SEQ ID NO: 14 \+ Aminoácidos del
Factor VII\cr SEQ ID NO: 15 \+ 5' cebador para amplificación de
tTF\cr SEQ ID NO: 16 \+ 3' cebador para amplificación de tTF\cr
SEQ ID NO: 17 \+ 5' cebador GlytTF cebador de amplificación de ADN
complementario\cr SEQ ID NO: 18 \+ 5' cebador para preparación de
tTF y la mitad 5' del ADN enlazador\cr SEQ ID NO: 19 \+ 3' cebador
para la preparación de tTF y la mitad 5' del ADN enlazador\cr SEQ
ID NO: 20 \+ 5' cebador para la preparación de la mitad 3' del AND
enlazador y el ADN tTF\cr SEQ ID NO: 21 \+ 3' cebador para la
preparación de la mitad 3' del ADN enlazador y el ADN tTF\cr SEQ ID
NO: 22 \+ 5' cebador para Cys [tTF] enlazador [tTF]
construcción\cr SEQ ID NO: 23 \+ 3' cebador para Cys [tTF]
enlazador [tTF]construcción\cr SEQ ID NO: 24 \+ 5' cebador
para [tTF] enlazador [tTF] cys\cr SEQ ID NO: 25 \+ 3' cebador para
[tTF] enlazador [tTF] cys\cr SEQ ID NO: 26 \+ Cebador para la
formación de [tTF] G164A\cr SEQ ID NO: 27 \hskip1cm \+
Cebador para [tTF] W158R
S162A\cr}
Los tumores sólidos y el carcinoma son más del 90
por ciento de todos los cánceres en el humano (Shockley y
colaboradores, 1991). Los usos terapéuticos de los anticuerpos
monoclonales y las inmunotoxinas se han investigado en terapia de
linfomas y leucemias (Lowder y colaboradores, 1987; Vitetta y
colaboradores, 1991), pero han sido desilusionantemente ineficaces
en ensayos clínicos contra carcinomas y otros tumores sólidos (Byers
y Baldwin, 1988; Abrams y Oldham, 1985).
Una razón principal para la ineficacia de los
tratamientos basados en anticuerpos es que las macromoléculas no se
transportan fácilmente hacia los tumores sólidos (Sands, 1988;
Epenetos y colaboradores, 1986). Aún cuando estas moléculas llegan a
la masa tumoral, fallan en distribuirse de manera pareja debido a la
presencia de uniones fuertes entre las células tumorales (Dvorak y
colaboradores, 1991), estroma fibroso (Baxter y colaboradores,
1991), gradientes de presión intersticial (Jain, 1990) y barreras de
sitio de unión (Juweid y colaboradores, 1992).
Para desarrollar nuevas estrategias para tratar
tumores sólidos, los métodos que involucran dirigirse a la
vasculatura del tumor, en vez de a las mismas células tumorales,
ofrecen distintas ventajas. Induciendo un bloqueo del flujo de
sangre a través del tumor, por ejemplo, a través de la formación de
fibrina específica de la vasculatura del tumor, se interferiría con
los procesos de influjo y exflujo en un sitio de localización del
tumor, dando como resultado un efecto antitumor. Detener el
suministro de sangre hacia un tumor se puede llevar a cabo a través
de cambiar el equilibrio procoagulante, fibronilítico en los vasos
asociados con el tumor a favor de procesos coagulantes mediante la
exposición específica a sustancias coagulantes. De conformidad con
lo anterior, se han generado y usado en la administración específica
de un coagulante al ambiente del tumor, construcciones de
anticuerpos coagulantes y anticuerpos biespecíficos (WO
96/01653).
Sin embargo, el requisito para la especificidad,
aunque no es tan estricta como en las inmunotoxinas, todavía es
importante. Para lograr la especificidad, generalmente se ha creído
que una molécula efectora, ya sea una toxina o un coagulante,
necesita estar conjugada o asociada funcionalmente con una molécula
objetivo, tal como un anticuerpo u otro ligando con especificidad
para el ambiente del tumor. Estas entidades objetivo se pueden
dirigir a las mismas células del tumor, aunque ahora se cree que es
preferible usar moléculas objetivo dirigidas contra componentes de
la vasculatura del tumor o estroma del tumor. Se han identificado
varias moléculas objetivo adecuadas que son específica o
preferencialmente expresadas, localizadas, adsorbidas o inducidas en
las células o en el ambiente de la vasculatura del tumor y/o
estroma.
Aunque los métodos que se dirigen a la
vasculatura y estroma del tumor pueden ser bastante efectivos, se
reconocerá que la práctica de esta metodología objetivo todavía
requiere ciertos conocimientos y requiere la preparación de
conjugados convenientes o complejos moleculares coordinados. Por
ejemplo, para dirigir un coagulante a la vasculatura del tumor, se
debe identificar un antígeno vascular adecuado, preparar un
anticuerpo o ligando que se enlace con el antígeno objetivo, elegir
un coagulante adecuado, enlazar el coagulante con el anticuerpo o
ligando o formar de otro modo una asociación funcional de los dos
componentes, y conducir los protocolos de localización usando dosis
que no den como resultado una dirección incorrecta significativa de
la sustancia. Aunque estos métodos se pueden practicar fácilmente y
con éxito, se puede ver que las ventajas serían resultado del
desarrollo de metodología que incluyera menos etapas preparativas y
por lo tanto pudiera realizarse de una manera más efectiva en
coste.
La presente invención da a conocer composiciones
para utilizar en estos nuevos métodos para efectuar coagulación de
sangre específica, como se ejemplifica por la coagulación específica
de tumor, sin la necesidad de moléculas objetivo, tales como los
anticuerpos. Esto se logra administrando composiciones que
comprenden Factor de Tejido de coagulante deficiente, el cual se ha
descubierto que promueve específicamente la coagulación en la
vasculatura del tumor, a pesar del hecho de que carece de cualquier
componente objetivo de tumor reconocido. La presente invención da a
conocer que estas composiciones de Factor de Tejido de coagulación
deteriorada pueden administrarse solas, como conjugados de Factor de
Tejido con vida media mejorada, en combinación con quimioterapia
convencional, en combinación con inmunotoxinas o coaguligandos
objetivo, en combinación con Factor VIIa (FVIIa) o activadores del
Factor FVIIa o cualquiera de las anteriores combinaciones.
El Factor de Tejido (FT) es el receptor de
iniciación más importante para las cascadas trombogénicas
(coagulación de sangre) (Davie, y colaboradores, 1991). El Factor de
Tejido es una sola cadena, glicoproteína de membrana de 263
aminoácidos (SEQ ID NO:12), y su secuencia primaria tiene
similaridad estructural con la familia del receptor quimiocina
(Edgington y colaboradores, 1991). El Factor de Tejido es un
receptor de superficie celular de transmembrana y funciona como el
receptor y cofactor para el Factor VIIa. El Factor de Tejido enlaza
el Factor VIIa para formar un complejo activo proteolíticamente en
la superficie celular (Ruf y Edgington, 1991b, 1994; Ruf y
colaboradores, 1991, 1992a, 1992b). Este complejo rápidamente activa
los zimógenos de proteasa serina Factores IX y X mediante
proteólisis limitada, conduciendo a la formación de trombina y,
finalmente, a un coágulo de sangre (figura 21).
De este modo, el Factor de Tejido es un activador
de la trayectoria extrínseca de la coagulación de sangre y no está
en contacto directo con la sangre en condiciones fisiológicamente
normales (Osterud y colaboradores, 1986; Nemerson, 1988; Broze,
1992; Ruf y Edgington, 1994). En el daño vascular o la activación
por ciertas citoquinas o endotoxina, sin embargo, el Factor de
Tejido se expondrá a la sangre, ya sea mediante las células (sub)
endoteliales (Weiss y colaboradores, 1989) o mediante ciertas
células sanguíneas (Warr y colaboradores, 1990). El Factor de Tejido
se acomplejará con el Factor VIIa, el cual bajo condiciones normales
circula a bajas concentraciones en la sangre (Wildgoose y
colaboradores, 1992), y el complejo TF/Factor VIIa comenzará la
cascada de coagulación a través de la activación del Factor X en
Factor Xa. La cascada finalmente dará como resultado la formación de
fibrina (figura 1). Para que ocurra esta secuencia de eventos, el
complejo TF:VIIa tiene que estar asociado con una superficie de
fosfolípido sobre la cual los complejos de iniciación de la
coagulación con los Factores IX o X se puedan ensamblar (Ruf y
Edgington, 1991a; Ruf y colaboradores 1992c; Paborsky y
colaboradores 1991; Bach y colaboradores 1986; Krishnaswamy y
colaboradores 1992; ten Cate y colaboradores 1993).
Un número limitado de células constitutivamente
expresan el Factor de Tejido. Los tejidos del pulmón y del sistema
nervioso central contienen altos niveles de actividad de Factor de
Tejido, encontrándose Factor de Tejido en mucosa bronquial y células
epiteliales alveolares en el pulmón y en células gliales y
astrocitos en el sistema nervioso. La expresión del Factor de Tejido
también se ha presentado en miocitos cardiacos, glomérulos renales,
y en ciertos tejidos epiteliales o de mucosa del intestino, la
vejiga y las vías respiratorias. De este modo se puede ver que el
Factor de Tejido se expresa generalmente constitutivamente como
barreras de tejido entre los tejidos del cuerpo y el ambiente
externo (Drake y colaboradores, 1989; Ruf y Edgington, 1994).
El Factor de Tejido también está presente en
límites de tejido entre órganos, tales como en las cápsulas de
órganos del hígado, el bazo y el riñón, y también está presente en
la adventicia de arterias y venas. La expresión del Factor de Tejido
de esta manera permite que el Factor de Tejido funcione para detener
la hemorragia interna. Por lo tanto es importante notar que el
Factor de Tejido está ausente en las articulaciones y el músculo
esquelítico de hemofílicos, los cuales son los primeros sitios de
hemorragia en estos pacientes.
El Factor de Tejido típicamente no se expresa en
ningún grado en células de la sangre o en la superficie de células
endoteliales que forman la vasculatura bajo condiciones normales,
pero su expresión mediante células (sub) endoteliales y monocitos
dentro de la vasculatura puede ser inducida por agentes infecciosos.
Los monocitos, por ejemplo, se inducen para expresar Factor de
Tejido mediante citoquinas y células T. La expresión de Factor de
Tejido en la vasculatura típicamente dará como resultado coagulación
intravascular diseminada o iniciación localizada de coágulos
sanguíneos o trombogénesis. En este contexto, es importante notar
que el Factor de Tejido debe estar disponible en todos los sitios
del cuerpo en donde la coagulación sería necesaria después del daño,
infección del tejido o de otras agresiones. Por lo tanto, el Factor
de Tejido deberá estar igualmente disponible en todos aquellos
sitios de tejido y no deberá reservarse generalmente dentro de una
área particular localizada del cuerpo.
Ciertos estudios han conducido a la delineación
de una relación entre el Factor de Tejido y el desarrollo del
fenotipo neoplástico en ciertos tipos de tumores (Ruff y Edgington,
1994). De hecho, se han dado a conocer niveles crecientes de Factor
de Tejido como un indicador de pronóstico de potencial metastásico
de melanoma maligno (Mueller, y colaboradores, 1992). Se ha razonado
que una activación generalizada de la cascada de coagulación podría
dañar la vasculatura conduciendo al acceso de las células del tumor
o vesículas derivadas de las células del tumor a la circulación
general, permitiendo que estas células tumorales maduren y causen
crecimiento del tumor metastásico.
Independientemente del mecanismo subyacente, los
estudios descritos anteriormente han conducido a Edgington y
colaboradores a proponer el uso de anticuerpos dirigidos contra el
Factor de Tejido en el tratamiento contra el cáncer (WO 94/05328).
Estos autores, por lo tanto, han propuesto que los anticuerpos con
afinidad de enlace para Factor de Tejido tienen utilidad terapéutica
en el tratamiento contra el cáncer, particularmente en relación con
los pacientes que se cree que están en riesgo del desarrollo de
tumores metastásicos. Este intento ha conducido al desarrollo de
hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que reaccionan con
Factor de Tejido humano (Patente U.S.A. número 5.223.427).
Además del uso en el tratamiento contra el
cáncer, los anticuerpos antifactor de Tejido también se han
propuesto para su uso en la inhibición de coagulación excesiva, la
cual también se puede usar en relación con el tratamiento de choque
séptico y en moderar respuestas inflamatorias (Morrissey y
colaboradores, 1988; Patente U.S.A. número 5.223.427), o en el
tratamiento de infarto de miocardio, en donde los anticuerpos se
usan como antagonistas del Factor de Tejido (Patente U.S.A. número
5.589.173). El uso combinado de anticuerpo antifactor de Tejido y
otras sustancias trombolíticas para disolver trombos ocluyentes se
describe particularmente en la Patente U.S.A. número 5.589.173. Un
método específico para usar estos anticuerpos está en la inhibición
de la coagulación en el procedimiento de circulación extracorpórea
en el cual la sangre se retira de un paciente durante un
procedimiento quirúrgico, tal como un procedimiento de desviación
cardiopulmonar (Patente U.S.A. número 5.437.864).
Como se desarrolla más completamente más adelante
(Sección B), se ha clonado el Factor de Tejido humano y está
disponible durante algún tiempo (Morrissey y colaboradores, 1987;
Edgington y colaboradores, 1991; Patente U.S.A. número 5.110.730).
En ciertos estudios anteriores, la misma proteína actualmente
identificada como Factor de Tejido humano se da a conocer como
proteína de cadena pesada de Factor de Tejido humano o la cadena
pesada de Factor de Tejido. El gen codifica un precursor de
polipéptido de un tamaño de 295 aminoácidos, que incluye un
delantero péptido con sitios alternativos de disociación, el cual se
sabe que conduce la formación de una proteína de 263 aminoácidos de
tamaño. La expresión recombinante del Factor de Tejido humano en
células CHO se ha informado que conduce a la producción de Factor de
Tejido a un nivel que se describe como que es uno de los niveles de
expresión más altos dados a conocer para un receptor de
transmembrana recombinante después de la producción en células de
mamíferos (Rehemtulla y colaboradores, 1991).
Se ha construido una forma recombinante de Factor
de Tejido que contiene solamente la superficie celular o el dominio
extracelular (Stone, y colaboradores, 1995) y carece de la
transmembrana y las regiones citoplásmicas del Factor de Tejido.
Este Factor de Tejido ``truncado'' (tTF) tiene un tamaño de 219
aminoácidos y es una proteína soluble con aproximadamente 10^{5}
veces menos Factor X-activante de actividad relativa
al Factor de Tejido de transmembrana original en un ambiente de
membrana de fosfolípido adecuado (Ruf, y colaboradores, 1991b). Esta
diferencia de actividad se debe a que el complejo TF:VIIa liga y
activa a los Factores IX y X mucho más eficientemente cuando se
asocia con una superficie de fosfolípido cargado negativamente (Ruf,
y colaboradores, 1991b; Paborsky, y colaboradores, 1991).
A pesar del deterioro significativo de la
capacidad coagulante del Factor de Tejido truncado, el Factor de
Tejido truncado puede promover la coagulación de la sangre cuando se
ata o está funcionalmente asociado por algún otro medio con un
fosfolípido o ambiente de membrana. Por ejemplo, se demuestra en la
presente descripción que usando un anticuerpo biespecífico que
enlaza el Factor de Tejido truncado a un antígeno de membrana de
plasma, se permite la restauración de actividad coagulante útil.
Esto llevó a uno de los presentes inventores a desarrollar métodos
para la coagulación específica de tumor vascular en vivo usando
construcciones objetivo para administrar Factor de Tejido truncado o
variantes del mismo específicamente a la vasculación del tumor o
estroma (WO 96/01653). La administración intravenosa de este
``coaguligando'' conduce a la localización de los coagulantes dentro
del tumor, trombosis de los vasos del tumor, y necrosis resultante
del tumor.
El desarrollo de la administración inteligente,
dirigida de coagulantes a la vasculatura del tumor, como se
ejemplifica usando una composición de anticuerpo objetivo
biespecífico y Factor de Tejido truncado, se puede ver que
representa un mejoramiento sobre la terapia de inmunotoxina clásica.
De hecho, este tratamiento de coaguligando induce trombosis de los
vasos del tumor en menos de 30 minutos, en comparación con
aproximadamente 6 horas necesarias para lograr el mismo efecto
después de la administración de una inmunotoxina. Además, no hay
efectos colaterales notables como resultado del tratamiento de
coaguligando. Aunque la administración dirigida de un coagulante tal
como el Factor de Tejido truncado fue sorprendentemente efectivo,
éste todavía requiere la preparación de la ``construcción
objetivo''.
Otros estudios de Factor de Tejido con objetivos
muy diferentes también se han dado a conocer para identificar usos
del Factor de Tejido truncado que no dependen en su asociación con
la sustancia objetivo. Con respecto a esto, el Factor de Tejido
truncado últimamente se ha considerado como un candidato para su uso
en el tratamiento de desórdenes tales como la hemofilia. Este
trabajo puede haberse desarrollado a partir de los intentos para
usar apo-factor de Tejido en estos tratamientos.
Apo-TF es una preparación deslipidada del Factor de
Tejido que se propuso para infusión en los hemofílicos, basándose en
la hipótesis de que esta molécula espontánea y preferiblemente se
incorporaría o se asociaría con superficies de membrana expuestas y
disponibles en sitios de lesiones. De este modo, se razonó que el
apo-TF podría ser útil en estos tratamientos, sin
conducir a efectos colaterales significativos (O'Brien y
colaboradores, 1988; Patente U.S.A. número 5.017.556).
La terapia apo-TF se ha propuesto
para su uso en desórdenes de hemorragias crónicas caracterizados por
una tendencia hacia la hemorragia, tanto hereditaria como adquirida.
La Patente U.S.A. número 5.017.556 describe estos desórdenes como
los relacionados con la deficiencia de los Factores VIII, IX ó XI; o
aquellos relacionados con la adquisición de inhibidores a Factores
V, VIII, IX, XI, XII y XIII. El uso de apo-TF,
caracterizado como sustancialmente desprovisto del lípido que se
presenta de manera natural del Factor de Tejido y no poseyendo
sustancialmente ninguna actividad procoagulante antes de la
administración, se reconoce que está en contraste con los resultados
esperados, los cuales se ha razonado que conducen a la toxicidad.
Ahora parece que los resultados descritos en La Patente U.S.A.
número 5.017.556 generalmente representan una anomalía en la
técnica, y estos estudios han sido contradichos por otros
investigadores que traajan en este campo.
De hecho, durante intentos para llevar a la
práctica los estudios basados sobre lo descrito anteriormente, se
observaron animales experimentales para desarrollar efectos
colaterales tales como coagulación intervascular diseminada (CID).
Esto condujo a la conclusión de que la administración intravenosa de
apo-TF es demasiado peligrosa para ser usada (Sakai
y Kisiel, 1990; Patentes U.S.A. números 5.374.617; 5.504.064; y
5.504.067).
El desarrollo de una forma soluble, truncada, de
Factor de Tejido no se ha reconocido como que resuelva los problemas
asociados con el Factor de Tejido o el apo-TF. Por
ejemplo, se ha rechazado el Factor de Tejido truncado como una
alternativa al Factor de Tejido, debido al hecho de que se ha
caracterizado porque casi no tiene actividad procoagulante cuando se
prueba con plasma normal (Paborsky y colaboradores, 1991; Patente
U.S.A. número 5.374.617).
Los usos potenciales para el Factor de Tejido
truncado posibles antes de la presente invención se confinaban
entonces a la administración dirigida del Factor de Tejido truncado,
por ejemplo, usando anticuerpos, y el posible uso del Factor de
Tejido truncado para tratar una cantidad limitada de desórdenes
usado en combinación con otras moléculas accesorias necesarias para
la restauración de suficiente actividad (Patente U.S.A. número
5.374.617). Esta segunda posibilidad se ha explotado en ciertas
circunstancias limitadas combinando el uso de Factor de Tejido
truncado con la administración del factor de coagulación, Factor
VIIa. El uso combinado del Factor VIIa con el Factor de Tejido
truncado da como resultado la restauración de suficiente actividad
coagulante para que esta combinación esté en uso para tratar
desórdenes de la sangre, tales como la hemofilia. Sin embargo, en
contraste con la administración dirigida de coagulantes tales como
el Factor de Tejido truncado comentado en la WO 96/01653, la terapia
de combinación del Factor de Tejido truncado y el Factor VIIa no
incluye conceptos de dirección específica. Esta terapia por lo tanto
se ha propuesto para su uso solamente en relación con pacientes en
los cuales la coagulación está deteriorada (Patentes U.S.A. números
5.374.617; 5.504.064; y 5.504.067).
El grupo de pacientes más fácilmente identificado
con estos mecanismos de coagulación deteriorada son los hemofílicos,
incluyendo aquellos que sufren hemofilia A y hemofilia B, y aquellos
que tienen altos contajes de anticuerpos dirigidos a los factores de
coagulación. Además, este tratamiento combinado de Factor de Tejido
truncado y Factor VIIa se ha propuesto para su uso en relación con
pacientes que padecen de trauma severo, sangrado postoperatorio o
hasta cirrosis (Patentes U.S.A. números 5.374.617; 5.504.064; y
5.504.067). Se han propuesto tanto la administración sistémica
mediante infusión como la aplicación tópica como útiles en estas
terapias. Así, estas terapias se puede ver que suplementan al cuerpo
con dos ``Factores'' del tipo de coagulación con el fin de superar
cualquier limitación natural de éstas u otras moléculas relacionadas
en la cascada de coagulación con el fin de detener el sangrado en un
sitio específico.
Roy y colaboradores también han propuesto el uso
de ciertos mutantes de Factor de Tejido en el tratamiento del
infarto de miocardio, particularmente en la prevención de la
reoclusión de las arterias coronarias (Patente U.S.A. número
5.346.991). Como tal, los mutantes del Factor de Tejido se están
usando como ``sustancias trombolíticas'', y se describen como
medicamentos capaces de lisar un trombo de
fibrina-plaqueta con el fin de permitir que la
sangre fluya de nuevo a través de un vaso sanguíneo afectado. Los
mutantes de Factor de Tejido descritos se designan con la intención
de ser capaces de neutralizar los efectos del Factor de Tejido
endógeno. Su uso en relación con la terapia del infarto de miocardio
se dice que permite la rápida reperfusión, evita la reoclusión y por
lo tanto limita la necrosis del tejido.
Los elementos artificiales para recrear el
ambiente natural en el contexto descrito anteriormente se enlaza con
los procesos naturales, en donde el Factor de Tejido se describe
como que está constitutivamente presente en los límites entre los
órganos con el fin de permitir que funcionen como una molécula
iniciadora para detener el sangrado. Sin embargo, esta limitación de
episodios de sangrado en hemofílicos naturalmente necesita lograrse
sin inclinar el equilibrio de las trayectorias de coagulación hacia
coagulación amplia, lo cual sería perjudicial para estos pacientes e
inhibiría el suministro de oxígeno al tejido u órgano particular en
cuestión. Por lo tanto, la circulación amplia y la actividad del
Factor de Tejido truncado sería indeseable y de hecho no se
esperaría que ocurriera a partir de los estudios descritos
anteriormente.
Aunque el Factor de Tejido truncado no se ha
demostrado anteriormente que tenga ninguna capacidad para localizar
preferencialmente dentro de un sitio dado, y a pesar de que se sabe
muy disminuida la capacidad coagulante relativa al Factor de Tejido
original, de tamaño completo, la presente invención demuestra que
cuando se administra sistemáticamente a animales con tumores
sólidos, el Factor de Tejido truncado induce coagulación específica
del suministro de sangre del tumor, dando como resultado la
regresión del tumor. Los distintos aspectos de la presente invención
por lo tanto se basan en el descubrimiento de la trombosis selectiva
de los vasos del tumor mediante el Factor de Tejido truncado.
El hallazgo sorprendente de los inventores del
Factor de Tejido truncado específicamente localizado dentro del
tumor suficientemente para causar efecto antitumor, se descubrió
durante los estudios usando el Factor de Tejido truncado como un
control en estudios dirigidos a tumores con anticuerpo coagulante
(``coaguligando''). A partir de este descubrimiento inicial, los
inventores desarrollaron los distintos aspectos de la invención
descritos en la presente descripción. Los compuestos de Factor de
Tejido o construcciones para su uso en la presente invención se han
desarrollado de este modo a partir del Factor de Tejido truncado
original empleado primero. De conformidad con esto, ahora se pueden
emplear varias construcciones de Factor de Tejido, incluyendo muchas
formas diferentes de Factor de Tejido truncado, Factores de Tejido
más largos pero todavía deteriorados, Factores de Tejido mutantes.
Cualquier Factor de Tejido truncado, variante o mutante modificado o
conjugado de otro modo para mejorar su vida media, y todos los
equivalentes funcionales de los mismos. Sin embargo, se entenderá
que cada construcción de Factor de Tejido para su uso en la
invención se unifica mediante la necesidad de ser ``de coagulación
deficiente''. Como se detalla en la presente descripción más
adelante, hay varias consideraciones estructurales que se pueden
emplear en el diseño de los Factores de Tejido candidatos de
coagulación deficiente, y están disponibles varias pruebas para
confirmar que los Factores de Tejido candidatos son convenientes
para su uso en los aspectos del tratamiento de la presente
invención. Dado que las habilidades tecnológicas para crear una
variedad de compuestos, por ejemplo, usando biología molecular, y de
rutina para las personas con experiencia ordinaria en esta técnica,
y dado que hay guía estructural y funcional extensa dada a conocer
en la presente descripción, el técnico en la materia fácilmente
sería capaz de hacer y usar varios Factores de Tejido de coagulación
deficiente diferentes en el contexto de la presente invención.
También, tal como se describe en detalle
significativo en la presente descripción, uno o más de una variedad
de Factores de Tejido también se pueden combinar con otras
sustancias para su uso en el tratamiento ventajoso de tumores
sólidos y otras enfermedades asociadas con vasos de fluido
protrombótico. Además de la combinación con tratamientos estándares,
tales como cirugía y radioterapia, el enfoque de coagulación de la
presente invención también se puede combinar con la administración
de fármacos quimioterapéuticos clásicos distintos de las
inmunotoxinas o coaguligandos, o con factores de coagulación
adicional, como se ejemplifica mediante el Factor VIIa.
Dado que se espera que los tratamientos
combinados den un efecto aditivo, aumentado o hasta sinérgico
antitumor, los expertos en la técnica también fácilmente apreciarán
que las construcciones de Factor de Tejido que tienen menos que las
propiedades óptimas en los tipos de ensayos in vitro y en
vivo descritas en la presente descripción todavía se pueden usar en
el contexto de la presente invención. Por ejemplo, si una
construcción de Factor de Tejido de coagulación deficiente candidato
tiene actividad coagulante hacia el extremo inferior de la escala
recomendada en la presente descripción, una molécula así todavía
puede demostrar que es útil en combinación con factores de
coagulación, quimioterapias u otras sustancias anticáncer.
Igualmente, las construcciones de Factor de Tejido de coagulación
deficiente candidatas que se pueden considerar que tienen una
actividad coagulante suficientemente alta para causar problemas con
respecto a efectos colaterales, todavía se puede demostrar que es
útil después de estudios cuidadosos en vivo usando animales
experimentales y en estudios clínicos comenzando con dosis bajas.
Por lo tanto, las siguientes pautas concernientes a las moléculas de
Factor de Tejido de coagulación deficiente se dan a conocer
solamente como enseñanzas a título de ejemplo, y los técnicos con
experiencia ordinaria en el campo fácilmente apreciarán que las
moléculas de Factor de Tejido que no encajan directamente dentro de
las pautas estructurales y cuantitativas presentadas en la presente
descripción todavía pueden tener utilidad terapéutica significativa
en el contexto de la presente invención. Aunque determinar este
hecho frecuentemente puede requerir generalmente pruebas en vivo en
animales, estas pruebas son de rutina para aquellos con experiencia
ordinaria en esta técnica y simplemente requieren administración y
supervisión.
Los técnicos con experiencia en la técnica
fácilmente apreciarán que las moléculas del Factor de Tejido para su
uso en la presente invención no pueden ser sustancialmente Factor de
Tejido original. Esto es evidente ya que el Factor de Tejido
original y las variantes cercanas del mismo son particularmente
activos para promover la coagulación. Por lo tanto, después de la
administración a un animal o paciente, esto llevaría a extender la
coagulación y sería letal. Por lo tanto, deberán evitarse las
formulaciones de Factor de Tejido original, intacto. Igualmente, no
se cree que los intentos para modular la actividad del Factor de
Tejido manipulando su ambiente físico sean particularmente
productivos en el contexto de la presente invención. Por ejemplo
deberá evitarse el enfoque apo-TF de O'Brien y
colaboradores (1988) debido a que se espera que resulte la DIC
(``coagulación intervascular diseminada'').
La figura 2 se da a conocer en la presente
descripción como un modelo instructivo referente al dominio de la
molécula del Factor de Tejido original. Es un objetivo de la
invención dar a conocer moléculas del Factor de Tejido que no se
asocien sustancialmente con la membrana del plasma. Naturalmente, el
truncado de la molécula es la manera más directa en la cual se logra
un Factor de Tejido modificado que no se enlaza a la membrana. Estos
tipos de construcciones truncadas se describen más completamente más
adelante. Sin embargo, el truncado real o el acortamiento de la
molécula no es el único mecanismo mediante el cual se pueden crear
variantes de Factor de Tejido operativo. A manera de ejemplo
solamente, se pueden introducir mutaciones en la región terminal C
de la molécula que normalmente atraviesa la membrana con el fin de
evitar la inserción de membrana adecuada. Se tiene en cuenta que la
inserción de varios aminoácidos adicionales, o la mutación de estos
residuos ya presentes, se puede usar para efectuar dicha expulsión
de membrana. Por lo tanto, se pueden considerar modificaciones con
respecto a esto que reducen la hidrofobicidad de la parte terminal C
de la molécula de manera que las propiedades termodinámicas de esta
región ya no sean favorables a la inserción de la membrana.
Considerando hacer modificaciones estructurales a
la molécula de Factor de Tejido original, los expertos en la técnica
se darán cuenta de la necesidad de mantener partes significativas de
la molécula suficientes para que la variante de Factor de Tejido
resultante sea capaz de funcionar para promover como mínimo alguna
coagulación. Una consideración importante es que la molécula de
Factor de Tejido deberá retener sustancialmente su capacidad para
enlazarse al Factor VII o al Factor VIIa. Haciendo referencia a la
figura 2, se verá que la región de enlace VII/VIIa generalmente es
central a la molécula y esta región deberá por lo tanto mantenerse
sustancialmente en todas las variantes de Factor de Tejido
propuestas para su uso en la presente invención. La localización
particular de esta región de enlace y el uso opcional de mutantes,
ya sea solos o en combinación con otras sustancias, se plantea en
mayor detalle más adelante.
Sin embargo, ciertas partes de secuencias a
partir de la región terminal N del Factor de Tejido original también
se considera prescindible. Por lo tanto, se pueden introducir
mutaciones en esta región o se pueden emplear mutantes de supresión
(truncados de la terminal N) en las moléculas de Factor de Tejido
candidatas para su uso con la presente descripción. Dadas estas
pautas, los expertos en la técnica apreciarán que las siguientes
construcciones de Factor de Tejido truncado, dimérico, multimérico y
mutante a título de ejemplo, de ninguna manera son limitantes y que
se pueden preparar y usar fácilmente muchas otras moléculas
funcionalmente equivalentes.
Las siguientes composiciones de Factor de Tejido
a título de ejemplo, incluyendo las versiones truncada, dimérica,
multimérica y mutada, pueden existir como polipéptidos distintos o
se pueden conjugar a portadores inertes, tales como
inmunoglobulinas, como se describe más adelante en la presente
descripción.
Como se usa en la presente descripción, el
término ``truncados'' cuando se usa en relación con el Factor de
Tejido significa que la construcción de Factor de Tejido particular
carece de ciertas secuencias de aminoácidos. El término truncado de
este modo significa construcciones de Factor de Tejido de tamaño más
corto, y diferencia estos compuestos de otras construcciones de
Factor de Tejido que tienen asociación o enlace de membrana
reducida. Aunque los Factores de Tejido modificados pero
sustancialmente de tamaño completo se pueden, de este modo,
considerar como equivalentes funcionales de Factores de Tejido
truncados (``funcionalmente truncados''), el término ``truncado'' se
usa en la presente descripción en su sentido clásico para significar
que la molécula de Factor de Tejido se vuelve deficiente de enlace
con membrana eliminando suficientes secuencias de aminoácido para
efectuar este cambio de característica.
De conformidad con lo anterior, una proteína de
Factor de Tejido truncado o polipéptido es la que difiere del Factor
de Tejido original en que una cantidad suficiente de la secuencia de
aminoácidos de transmembrana se ha retirado de la molécula, en
comparación con el Factor de Tejido original. En este contexto una
``cantidad suficiente'' es una cantidad de secuencia de aminoácidos
de transmembrana originalmente suficiente para introducir la
molécula de Factor de Tejido en la membrana, o enlazar de otro modo
la membrana funcional media de la proteína de Factor de Tejido. La
eliminación de esta ``cantidad suficiente de secuencia de extensión
de transmembrana'' crea, por lo tanto, una proteína o un polipéptido
de Factor de Tejido truncado deficiente en capacidad de enlace con
membrana de fosfolípido, de manera que la proteína sustancialmente
es una proteína soluble que no se enlaza significativamente a
membranas fosfolípidas; y que sustancialmente falla en convertir el
Factor VII en Factor VIIa en un ensayo de Factor de Tejido estándar,
y de este modo retiene la llamada actividad catalítica que incluye
activación del Factor X en presencia del Factor VIIa. La Patente
U.S.A. número 5.504.067 describe adicionalmente estas proteínas de
Factor de Tejido truncado.
La preparación de las construcciones de Factor de
Tejido truncadas particulares se describen en la presente
descripción más adelante. Preferiblemente, los Factores de Tejido
para su uso en la presente invención generalmente carecen de las
regiones de transmembrana y citosólica (aminoácidos
220-263 de SEQ ID NO:12) de la proteína. Sin
embargo, no hay necesidad para que las moléculas de Factor de Tejido
truncado se limiten a moléculas del tamaño de 219 aminoácidos. Por
lo tanto, construcciones de entre aproximadamente 210 y
aproximadamente 230 aminoácidos de tamaño se pueden usar. En
particular, las construcciones pueden tener aproximadamente 210,
211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223,
224, 225, 226, 227, 228, 229, o aproximadamente 230 aminoácidos de
tamaño. Naturalmente, se entenderá que la intención es suprimir
sustancialmente la región de transmembrana de aproximadamente 23
aminoácidos a partir de la molécula truncada. Por lo tanto, en las
construcciones de Factor de Tejido truncado que son más largas que
de 218 a 222 aminoácidos de tamaño, las partes de secuencias
significativas después de eso generalmente estarán comprendidas por
aproximadamente los 21 aminoácidos que forman el dominio citosólico
de la molécula de Factor de Tejido original. Con respecto a esto,
las construcciones de Factor de Tejido truncado pueden tener entre
aproximadamente 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, o
aproximadamente 241 aminoácidos de tamaño.
En ciertas realizaciones preferentes, el Factor
de Tejido truncado se puede designar como el dominio extracelular de
la proteína del Factor de Tejido maduro. Por lo tanto, en
realizaciones preferentes a título de ejemplo, el Factor de Tejido
truncado puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1,
que comprende los residuos 1-219 de la proteína
madura (SEQ ID NO:12). SEQ ID NO:1 puede estar codificada por, por
ejemplo, SEQ ID NO:10. Desde luego, SEQ ID NO:1 solamente es un
ejemplo de Factor de Tejido truncado y cualquier proteína de Factor
de Tejido derivada de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID
NO:11, o las secuencias relacionadas, que posea las propiedades
deseables de alta afinidad de enlace con el Factor VII o con el
Factor VIIa y posea una actividad de cofactor de procoagulación
reducida generalmente también será útil como se describe en la
presente descripción.
Previamente se ha demostrado que es posible que
el Factor de Tejido original en la superficie de las células del
carcinoma de vejiga J82 exista como un dímero (Fair y colaboradores,
1987). El enlace de una molécula de Factor VII o Factor VIIa a una
molécula de Factor de Tejido también puede facilitar el enlace de
otro Factor VII o Factor VIIa a otro Factor de Tejido (Fair y
colaboradores, 1987; Bach y colaboradores, 1986). Además, el Factor
de Tejido muestra homología estructural a los miembros de la familia
del receptor citoquina (Edgington y colaboradores, 1991) alguno de
los cuales se dimeriza para formar receptores activos (Davies y
Wlodawer, 1995). De tal manera se tiene en cuenta que las
composiciones de Factor de Tejido truncado de la presente invención
pueden ser útiles como dímeros.
De conformidad con lo anterior, cualquiera de las
construcciones de Factor de Tejido truncadas, mutadas o de otro modo
de coagulación deficiente descritas en la presente descripción, o un
equivalente de las mismas, se puede preparar en una forma dimérica
para su uso en la presente invención. Como es conocido por los
expertos en la técnica, estos dímeros de Factor de Tejido se pueden
preparar empleando las técnicas estándar de biología molecular y de
expresión recombinante, en las cuales se preparan dos regiones de
codificación en cuadro y se expresan a partir de un vector de
expresión. Igualmente, se pueden emplear varias tecnologías de
conjugación química en relación con la preparación de dímeros de
Factor de Tejido. Los monómeros de Factor de Tejido individuales se
pueden derivar antes de la conjugación. Todas estas técnicas serían
fácilmente conocidas por los expertos en la técnica.
Si se desea, los dímeros o multímeros de Factor
de Tejido se pueden unir mediante un enlace biológicamente
liberable, tal como un enlace o secuencia de aminoácido
selectivamente disociable. Por ejemplo, se tienen en cuenta
enlazadores de péptido que incluyen un sitio de disociación para una
enzima preferencialmente localizada o activa dentro de un entorno
tumoral. Formas a título de ejemplo de estos enlazadores de péptido
son las que son disociadas por uroquinasa, plasmina, trombina,
Factor IXa, Factor Xa, o una metaloproteinasa, tal como colagenasa,
gelatinasa o estromelisina.
En ciertas realizaciones, los dímeros del Factor
de Tejido pueden comprender además una fracción de inserción de
membrana hidrofóbica obstaculizada, para después alentar la
asociación funcional del Factor de Tejido con la membrana
fosfolípida, pero solamente bajo ciertas condiciones definidas. Como
se describe en el contexto de los Factores de Tejido truncados, las
secuencias de asociación de membrana hidrofóbica generalmente son
tramos de aminoácidos que promueven la asociación con el ambiente
fosfolípido debido a su naturaleza hidrofóbica. Igualmente, se
pueden usar ácidos grasos para proporcionar la fracción de inserción
de membrana potencial. Estas secuencias de inserción de membrana se
pueden localizar ya sea en el término N o en el término C de la
molécula de Factor de Tejido, o generalmente anexarse a cualquier
otro punto de la molécula en tanto su unión a la misma no impida las
propiedades funcionales de la construcción de Factor de Tejido. El
intento de la fracción de inserción impedida es que siga siendo no
funcional hasta que la construcción de Factor de Tejido se localice
dentro del ambiente del tumor, y permita que el apéndice hidrofóbico
se vuelva accesible y aún además promueva la asociación física con
la membrana. De nuevo, se tiene en cuenta que los enlaces
biológicamente liberables y las secuencias selectivamente
disociables serán particularmente útiles en este aspecto, únicamente
siendo el enlace o secuencia disociado o de otro modo modificado
después de su localización adentro del ambiente del tumor y
exposición a enzimas particulares o a otras moléculas
bioactivas.
A título de ejemplo solamente, los inventores han
construido Factor de Tejido truncado dimérico correspondiente a un
dímero de C'-cys-tTF_{219} (dímero
de la SEQ ID NO:3); un dímero de C'-cys- tTF_{220}
(dímero de la SEQ ID NO:6); un dímero de
C'-cys-tTF_{221} (dímero de la SEQ
ID NO:7); y un dimero de
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
(dímero de la SEQ ID NO:2). Sin embargo ahora se entenderá que cada
una de las anteriores secuencias son a título de ejemplo y de ningún
modo limitantes de las estructuras diméricas que se pueden crear y
usar de acuerdo con la presente invención.
En otras realizaciones, las construcciones de
Factor de Tejido truncado de la presente invención pueden ser
multiméricas o poliméricas. En este contexto, una ``construcción
polimérica'' contiene 3 o más construcciones de Factor de Tejido de
la presente invención. Una ``construcción de Factor de Tejido
multimérico o polimérico'' es una construcción que comprende una
primera molécula de Factor de Tejido o derivada operativamente unida
a como mínimo una segunda y una tercera moléculas de Factor de
Tejido o derivada, y preferiblemente, en donde la construcción
multimérica o polimérica resultante todavía es deficiente en la
actividad coagulante en comparación con el Factor de Tejido de tipo
natural. En realizaciones preferentes, las construcciones de Factor
de Tejido mutliméricas y poliméricas para su uso en esta invención
son multímeros o polímeros de moléculas de Factor de Tejido
truncadas, las cuales se pueden combinar opcionalmente con otras
construcciones o variantes de Factor de Tejido de coagulación
deficiente. Los multímeros pueden comprender entre aproximadamente 3
y aproximadamente 20 de estas moléculas de Factor de Tejido, siendo
preferente entre aproximadamente 3 y aproximadamente 15 ó
aproximadamente 10 y más preferentemente entre aproximadamente 3 y
aproximadamente 10. Naturalmente, los multímeros de Factor de Tejido
de como mínimo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o así, se
incluyen dentro de la presente invención. Las unidades de Factor de
Tejido individuales dentro de los multímeros o polímeros también se
pueden enlazar mediante enlazadores de péptido selectivamente
disociables u otros enlaces biológicos liberables como se desee. De
nuevo, como con los dímeros de Factor de Tejido presentados
anteriormente, las construcciones se pueden hacer fácilmente usando
ya sea manipulación recombinante y expresión o usando química
sintética estándar.
Todavía otras construcciones de Factor de Tejido
útiles en el contexto de la presente invención son los mutantes
deficientes en la capacidad para activar el Factor VII. La base de
la utilidad de estos mutantes está en el hecho de que también son
``de coagulación deficiente''. Estos ``mutantes de activación del
Factor VII'' generalmente se definen en la presente descripción como
mutantes de Factor de Tejido que enlazan el factor funcional
VII/VIIa, proteolíticamente activan el Factor X, pero están
sustancialmente libres de capacidad para activar proteolíticamente
el Factor VII. De conformidad con lo anterior, estas construcciones
son mutantes de Factor de Tejido que carecen de la actividad de
activación del Factor VII.
La capacidad de estos mutantes de activación del
Factor VII para funcionar promoviendo coagulación específica del
tumor, se basa tanto en la localización de la construcción del
Factor de Tejido en la vasculatura del tumor, como en la presencia
del Factor VIIa a niveles bajos en el plasma. Después de la
administración de este mutante de activación Factor VII, el mutante
generalmente localizaría dentro de la vasculatura de un tumor
vascularizado, como lo haría cualquier construcción de Factor de
Tejido de la invención. Antes de la localización, el mutante de
Factor de Tejido sería incapaz de promover la coagulación en
cualquier otro sitio del cuerpo, en base a su incapacidad de
convertir el Factor VII en Factor VIIa. Sin embargo, después de la
localización y acumulación dentro de la región del tumor, el mutante
encontrará entonces suficiente Factor VIIa del plasma con el fin de
iniciar la trayectoria de coagulación extrínseca, conduciendo a la
trombosis específica del tumor.
Como se desarrolla más completamente más
adelante, el uso más preferente de los mutantes de activación del
Factor VII está en combinación con la
co-administración del Factor VIIa. Aunque útiles
dentro y fuera de los mismos, como se describe anteriormente, estos
mutantes generalmente tendrán menos que una actividad óptima dado
que el Factor VIIa se sabe que está presente en plasma solamente a
niveles bajos (aproximadamente 1 nanogramo/mililitro, en contraste
con aproximadamente 500 nanogramos/mililitro del Factor VII en
plasma; Las Patentes U.S.A. números 5.374.617; 5.504.064; y
5.504.067). Por lo tanto, la co-administración de
Factor VIIa exógeno junto con el mutante de activación del Factor
VII se prefiere considerablemente sobre la administración de los
mutantes solos. Ya que se espera que estos mutantes no tengan casi
efectos colaterales, su uso combinado con administración simultánea,
precedente, o subsecuente del Factor VIIa es un aspecto
particularmente ventajoso de la presente invención.
Uno o más de una variedad de mutantes de
activación del Factor VII se pueden preparar y usar en relación con
algún aspecto de la presente invención. Hay una cantidad
significativa de conocimientos científicos relacionados con los
sitios de reconocimiento de la molécula de Factor de Tejido para el
Factor VII/VIIa. A manera de ejemplo solamente, se puede hacer
referencia a los artículos por Ruf y Edgington (1991a), Ruf y
colaboradores (1992c), y a WO 94/07515 y WO 94/28017, cada una
específicamente incorporada en la presente descripción mediante
referencia para guía adicional en estos temas. Así se entenderá que
la región de activación del Factor VII generalmente está entre
aproximadamente el aminoácido 157 y aproximadamente el aminoácido
167 de la molécula de Factor de Tejido. Sin embargo, se tiene en
cuenta que los residuos fuera de esta región también pueden
demostrar que son importantes para la actividad de activación del
Factor VII, y se puede considerar la introducción de mutaciones en
uno o más de los residuos generalmente localizados entre
aproximadamente el aminoácido 106 y aproximadamente el aminoácido
209 de la secuencia de Factor de Tejido (WO 94/07515). En términos
de la región preferente, se puede considerar generalmente mutar uno
o más de los aminoácidos 147, 152, 154, 156, 157, 158, 159, 160,
161, 162, 163, 164, 165, 166 y/o 167. Con referencia a las
mutaciones candidatas preferentes generalmente fuera de esta región,
se puede hacer referencia a las siguientes substituciones de
aminoácidos: S16, T17, S39, T30, S32, D34, V67, L104, B105, T106,
R131, R136, V145, V146, F147, V198, N199, R200 y K201,
considerándose también los aminoácidos A34, E34 y R34 (WO
94/28017).
Tal como se ha indicado, preferiblemente los
Factores de Tejido se vuelven deficientes en su capacidad para
activar el Factor VII alterando uno o más aminoácidos de la región
generalmente entre aproximadamente la posición 157 y aproximadamente
la posición 167 en la secuencia de aminoácidos, cuando se hace
referencia a la SEQ ID NO:12. Mutantes a título de ejemplo son
aquellos en donde la Trp en la posición 158 se cambia por Arg (SEQ
ID NO:8); en donde Ser en la posición 162 se cambia por Ala; en
donde Gly en la posición 164 se cambia por Ala (SEQ ID NO:9); y el
mutante doble en donde Trp en la posición 158 cambia por Arg y Ser
en la posición 162 cambia por Ala. Desde luego éstas son mutaciones
a título de ejemplo y se considera que cualquier mutante de Factor
de Tejido que tiene una composición de aminoácidos alterada que
tiene las características deseables de enlazarse al Factor VII/VIIa,
pero no activar la cascada de coagulación, será útil en el contexto
de la presente invención.
Las construcciones de Factor de Tejido a utilizar
en la presente invención, ya sean truncadas, mutadas, truncadas y
mutadas, diméricas, multiméricas, conjugadas con portadores inertes
para aumentar su vida media, o cualquier combinación de las
anteriores, cada una es de coagulación deficiente en comparación con
el Factor de Tejido original natural. Mediante el término
``coagulación deficiente'', como se usa en la presente descripción,
se entiende que las construcciones de Factor de Tejido tienen una
capacidad deteriorada para promover la coagulación, de manera que su
administración en la circulación sistémica de un animal o un
paciente humano no conduce a efectos colaterales significativos o a
toxicidad limitante. Una construcción de Factor de Tejido se puede
analizar fácilmente con el fin de determinar si satisface esta
definición, simplemente conduciendo una prueba en un animal
experimental. Sin embargo, se da a conocer la guía detallada
siguiente para ayudar a los expertos en la técnica en la
caracterización anterior y selección de candidatos apropiados de
construcciones de Factor de Tejido de coagulación deficiente, con el
fin de que se pueda llevar a cabo cualquier estudio de animal
experimental eficientemente y con coste eficiente.
En términos cuantitativos, los Factores de Tejido
de coagulación deficiente serán cien veces o más menos activos que
el Factor de Tejido original, de tamaño completo, esto es, serán
cien veces o más menos capaces de inducir la coagulación del plasma
que el Factor de Tejido original, de tamaño completo, cuando se
prueba en un ambiente fosfolípido adecuado.
Más preferiblemente, los Factores de Tejido
deteriorados deberán ser mil veces o más menos capaces de inducir la
coagulación del plasma que el Factor de Tejido de tipo original, de
tamaño completo, en un ambiente fosfolípido adecuado; aún más
preferiblemente, los Factores de Tejido deberán ser diez mil veces o
más menos capaces de inducir la coagulación del plasma que el Factor
de Tejido de tipo natural, de tamaño completo, en tal ambiente; y
más preferiblemente, los Factores de Tejido deteriorados deberán ser
cien mil veces o más menos capaces de inducir coagulación del plasma
que su Factor de Tejido original, de tamaño completo, en un ambiente
fosfolípido adecuado. Se apreciará que esta expresión ``cien mil
veces'' generalmente corresponde a una de las construcciones
actualmente preferente, el Factor de Tejido truncado de 219
aminoácidos de tamaño (SEQ ID NO: 1).
Inherente dentro de la definición de ``X veces o
más menos capaz de inducir la coagulación del plasma'' está el
concepto de que el Factor de Tejido objeto de la investigación
todavía es capaz de inducir la coagulación del plasma.
Evidentemente, un Factor de Tejido que ha sido modificado para
volverse completamente incapaz de inducir la coagulación
generalmente no será útil en el contexto de la presente invención.
Los Factores de Tejido que son menos activos que el Factor de Tejido
del tipo natural en pruebas controladas de fosfolípido por
aproximadamente 500.000 veces, todavía se considera que tienen
utilidad en relación con la presente descripción. De manera similar,
todas las variantes y mutantes de Factor de Tejido que estén entre
aproximadamente 500.000 veces y aproximadamente un millón de veces
menos capaces de inducir la coagulación del plasma que su Factor de
Tejido original, de tamaño completo, en un ambiente fosfolípido
adecuado, todavía se considera que tienen utilidad en ciertas
realizaciones. Sin embargo, generalmente se considera que una
incapacidad de actividad de un millón de veces (10^{6})
generalmente será aproximadamente la menos activa que se pudiera
considerar para su uso en la presente invención. Además, aquellas
construcciones de Factor de Tejido que están hacia el extremo menos
activo del rango establecido, pueden encontrar más utilidad en
relación con ciertos regímenes de tratamientos definidos o en
terapias combinadas. La elección particular de variante de Factor de
Tejido y estrategia terapéutica será fácilmente determinada por un
experto en la técnica.
Independientemente de que haya ciertos usos
preferentes y/u óptimos y combinaciones de los distintos elementos
de Factores de Tejido, los Factores de Tejido de coagulación
deficiente para su uso en la presente invención generalmente estarán
aproximadamente entre 100 veces y aproximadamente un millón de veces
menos activos que el Factor de Tejido del tipo natural; más
preferiblemente, estarán entre aproximadamente 1000 veces y
aproximadamente 100.000 veces menos activos; y se pueden categorizar
como menos activos mediante cualquier número dentro de los rangos
establecidos, incluyendo aproximadamente diez mil veces. Los mismos
rangos también se pueden variar entre aproximadamente 1000 veces y
un millón de veces, o entre 10.000 veces y 500.000 veces, o algo
similar.
Se pueden emplear uno o más de varios ensayos de
actividad de coagulación de plasma in vitro en relación con
la prueba cuantitativa de Factores de Tejido de coagulación
deficiente. Por ejemplo, un método de conducir un ensayo de
actividad de coagulación de plasma innato es el siguiente:
- 1)
- añadir aproximadamente 50 microlitros de plasma (humano o de ratón) a tubos de plástico a aproximadamente 37ºC;
- 2)
- añadir aproximadamente 50 microlitros de Factor de Tejido de tamaño completo relipidado (preferiblemente de una fuente comercial, tal como American Diagnostics Inc., Greenwich, CT) a un rango de concentraciones en un regulador conveniente tal como fosfato libre de calcio o solución salina regulada HEPES, pH 7,4 a 37ºC. Añadir a otros tubos el candidato de Factor de Tejido en versión truncada o mutante a un rango de concentraciones en el mismo regulador.
- 3)
- añadir aproximadamente 50 microlitros de 30 mM de CaCl_{2} a aproximadamente 37ºC;
- 4)
- registrar el tiempo para que se formen las primeras hebras de fibrina; y
- 5)
- construir una curva estándar de la concentración de Factor de Tejido de tamaño completo (mol por litro) respecto al tiempo de coagulación. Construir una curva de la concentración de Factor de Tejido mutante candidato (mol por litro) respecto al tiempo de coagulación. Calcular la diferencia de actividad entre el Factor de Tejido de tamaño completo y el Factor de Tejido de ``prueba'' comparando la concentración necesaria de cada uno para dar un tiempo de coagulación equivalente a aproximadamente la mitad de la máxima disminución en el tiempo de coagulación. El Factor de Tejido mutante de ``prueba'' deberá ser más de 100 veces menos capaz que el Factor de Tejido de tamaño completo en una base molar para inducir la coagulación del plasma.
Se pueden llevar a cabo variaciones de este tipo
de ensayo, como sería evidente a una persona con experiencia
ordinaria en la técnica. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo
pruebas basadas en la unión del Factor de Tejido y la construcción
de Factor de Tejido candidata a una membrana celular o superficie
fosfolípida, por ejemplo, usando un anticuerpo u otro ligando para
efectuar esta unión. En estas pruebas, el candidato o Factor de
Tejido truncado de prueba o mutante de Factor de Tejido deberá ser
más de 100 veces menos efectivo para inducir la coagulación del
plasma que el Factor de Tejido de tipo natural, cuando se une por
medio de un anticuerpo o de otro ligando a una membrana celular o
superficie de fosfolípido. Con los mutantes de Factor de Tejido que
no permiten que el Factor VII se convierta de manera eficiente en
Factor VIIa, puede ser necesario añadir Factor VIIa al plasma para
obtener este nivel de actividad. En un ejemplo de ensayo, esta
actividad se puede medir usando el siguiente método:
- 1)
- Se incuban células tales como células de linfoma de ratón A20 (I-A^{d} positivo) (por ejemplo 4 x 10^{6} células/mililitro, 50 microlitros) en un regulador, tal como solución salina regulada de fosfato, durante aproximadamente una hora a aproximadamente temperatura ambiente con una sustancia promotora de la unión, tal como un anticuerpo biespecífico (50 microgramos/mililitro, 25 microlitros), por ejemplo, en términos de células A20, que consisten en un brazo Fab' de un anticuerpo tal como el anticuerpo B21-2 dirigido contra I-A^{d}, enlazado con el brazo Fab' de un anticuerpo tal como el anticuerpo 10H10 dirigido contra un epítope no inhibitorio en el Factor de Tejido;
- 2)
- Preparar un conjunto idéntico de tubos que contiene células, pero ningún anticuerpo biespecífico ni otra sustancia ligante (``tethering'');
- 3)
- Lavar las células efectivamente, por ejemplo, dos veces a temperatura ambiente, y resuspender las células en aproximadamente 50 microlitros de solución salina regulada de fosfato;
- 4)
- Añadir concentraciones variantes de los mutantes de Factor de Tejido candidatos en solución salina regulada de fosfato (aproximadamente 50 microlitros) a aproximadamente temperatura ambiente. El anticuerpo biespecífico u otra sustancia ligante captura al mutante del Factor de Tejido y lo pone en cercana aproximación con la superficie celular. Se añade el Factor VIIa (1-10 nM) además del mutante del Factor de Tejido cuando se desea para determinar la actividad en presencia del Factor VIIa. Se ajusta el volumen total por tubo a aproximadamente 150 microlitros con solución salina regulada de fosfato. Se incuban los tubos durante aproximadamente una hora a aproximadamente temperatura ambiente;
- 5)
- Se calientan las células a aproximadamente 37ºC.
- 6)
- Se añade cloruro de calcio (aproximadamente 50 mM, 50 microlitros) y plasma de ratón o humano citrado (aproximadamente 50 microlitros) a aproximadamente 37ºC.
- 7)
- Se registra el tiempo para que se formen las primeras hebras de fibrina; y
- 8)
- Se traza el gráfico del tiempo de coagulación (en segundos) con respecto a la concentración de mutante de Factor de Tejido (mol por litro) para células recubiertas o no recubiertas con sustancia ligante, por ejemplo, anticuerpo biespecífico. Se calcula la concentración de mutante de Factor de Tejido que da un tiempo de coagulación equivalente a aproximadamente la mitad de la disminución máxima en el tiempo de coagulación (usualmente de 50 a 100 segundos). Se calcula el aumento en la actividad de coagulación dada por el anticuerpo biespecífico y deberá ser de 100 veces más.
Se considera que las composiciones de Factor de
Tejido candidatas preparadas por la presente invención se pueden
probar usando ensayos similares a los descritos anteriormente para
confirmar que su funcionalidad se ha mantenido, pero que su
capacidad para promover la coagulación se ha deteriorado en como
mínimo la cantidad requerida de aproximadamente 100 veces y
preferiblemente en aproximadamente 1.000 veces, más preferiblemente
en aproximadamente 10.000 veces, y más preferiblemente en
aproximadamente 100.000 veces.
En realizaciones donde se tiene en cuenta que una
sustancia adicional deberá usarse finalmente en combinación con el
Factor de Tejido de coagulación deficiente candidato, es importante
que el factor adicional o sustancia se incluya en el ensayo in
vitro. Un ejemplo particularmente relevante es el análisis de un
mutante de activación del Factor VII, el cual preferiblemente deberá
analizarse junto con la adición del Factor VIIa. Sin embargo, el
Factor VIIa no es el único componente adicional que se puede probar
de esta manera. En general, las sustancias adicionales se pueden
llamar ``candidatos adicionales''. Para identificar un candidato
adicional, o para optimizar cantidades preferentes de los candidatos
para su uso en la presente invención, se pueden llevar a cabo
pruebas tales como las descritas anteriormente en paralelo. Es
decir, se mediría o determinaría la coagulación en ausencia del
candidato adicional, y luego se añadiría la sustancia candidato a la
composición y redeterminaría el tiempo y/o la duración de la
coagulación de la sangre. Una sustancia candidata adicional que
funcione en combinación con un mutante de Factor de Tejido o
variante daría como resultado un nivel global de coagulación entre
aproximadamente 100 veces y aproximadamente 1.000.000 veces más baja
que la observada con Factor de Tejido original, de nuevo sería una
combinación adecuada para su uso en el contexto de la presente
invención.
Los técnicos con experiencia ordinaria en el
campo entenderán que cada una de las pruebas anteriores in
vitro y variaciones de las mismas son relativamente simples de
establecer y realizar. De esta manera, se puede probar un panel de
variantes de Factor de Tejido candidatos y combinaciones de Factores
de Tejido con otras sustancias y los candidatos más prometedores se
pueden seleccionar para estudios posteriores, particularmente para
pruebas experimentales en un ensayo animal o humano.
Independientemente de que se cree que los ensayos
anteriores son particularmente útiles en relación con la presente
invención, las pruebas in vitro destinadas a su uso con la
presente descripción no se limitan a estos ensayos. De conformidad
con lo anterior, se puede llevar a cabo cualquier tipo de ensayo de
coagulación o procoagulación que se desee. Por ejemplo, para mayores
detalles con respecto al Factor de Tejido truncado y los ensayos de
procoagulación, los expertos se refieren a Las Patentes U.S.A.
números 5.437.864; 5.223.427; y 5.110.730 y la Patente Internacional
con números de publicación WO 94/28017; WO 94/05328; y WO 94/07515,
cada una de las cuales completa la presente descripción con respecto
a las pruebas.
Los expertos en la técnica entenderán que los
mutantes del Factor de Tejido de coagulación deficiente candidatos,
variantes o combinaciones de los mismos con sustancias adicionales,
generalmente deberán probarse en un escenario en vivo antes de
usarse en un sujeto humano. Estas pruebas preclínicas en animales
son rutina en la técnica. Para llevar a cabo estas pruebas
confirmatorias, todo lo que se requiere es un modelo de animal
aceptado en la técnica de la enfermedad en cuestión, tal como un
animal que tenga un tumor sólido. Se puede usar cualquier animal en
este contexto, tal como, por ejemplo, un ratón, rata, conejillo de
Indias, hámster, conejo, perro, chimpancé, o similar. En el contexto
del tratamiento contra el cáncer, los estudios que usan animales
pequeños, tales como ratones, se aceptan ampliamente porque son
predictivos de la eficacia clínica en humanos, y estos modelos de
animales por lo tanto se prefieren en el contexto de la presente
invención, ya que son fácilmente disponibles y relativamente poco
caros, como mínimo en comparación con otros animales
experimentales.
La manera de llevar a cabo una prueba animal
experimental será directamente la de la experiencia ordinaria en la
técnica. Todo lo que se requiere para llevar a cabo esta prueba es
establecer grupos de tratamiento equivalentes, y administrar los
compuestos de prueba a un grupo mientras se llevan a cabo varios
estudios de control en paralelo en los animales equivalentes en el
grupo o grupos restantes. Se supervisan los animales durante el
curso del estudio y, finalmente, se sacrifican los animales para
analizar los efectos del tratamiento.
Una de las características más útiles de la
presente invención es su aplicación al tratamiento de tumores
vascularizados. De conformidad con lo anterior, se pueden llevar a
cabo estudios antitumor para determinar la trombosis específica
dentro de la vasculatura del tumor y los efectos globales antitumor.
Como parte de estos estudios, también se puede supervisar la
especificidad de los efectos, incluyendo evidencia de coagulación en
otros vasos y tejidos y el buen estado general de los animales se
deberá supervisar cuidadosamente.
En el contexto del tratamiento de los tumores
sólidos, se tiene en cuenta que las construcciones de Factor de
Tejido efectivas y las cantidades efectivas de las construcciones
serán aquellas construcciones y cantidades que den como resultado
generalmente como mínimo aproximadamente el 10% de los vasos dentro
de un tumor vascularizado que exhibe trombosis, en ausencia de
trombosis significativa en vasos fuera del tumor; preferiblemente la
trombosis se observará en como mínimo aproximadamente el 20%,
aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, o aproximadamente el
50% también de los vasos sanguíneos dentro de la masa tumoral
sólida, sin trombosis significativa no localizada. En el tratamiento
de tumores grandes, los presentes inventores han observado
rutinariamente estos efectos positivos. Sin duda, se han analizado
tumores en los cuales como mínimo aproximadamente 60%,
aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%,
aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o hasta e incluyendo
aproximadamente 99% de los vasos del tumor se han vuelto
trombóticos. Naturalmente, a mayor numero de vasos que exhiba
trombosis, más preferente es el tratamiento, en tanto el efecto siga
siendo específico, relativamente específico o preferencial a la
vasculatura asociada con el tumor y en tanto la coagulación no sea
aparente en otros tejidos a un grado suficiente para causar daño
significativo al animal.
Después de la inducción de la trombosis dentro de
los vasos sanguíneos del tumor, los tejidos del tumor se vuelven
necróticos. El uso con éxito de las construcciones a utilizar en la
invención, o las dosis de las mismas, pueden así también valorarse
en términos de la expansión de la necrosis inducida específicamente
en el tumor. De nuevo, la expansión de la muerte celular en el tumor
se valorará en relación con el mantenimiento de los tejidos sanos en
todas las demás áreas del cuerpo. Las sustancias de Factor de
Tejido, combinaciones o dosis óptimas tendrán utilidad terapéutica
de acuerdo con la presente invención cuando su administración dé
como resultado como mínimo aproximadamente que el 10% del tejido del
tumor se vuelva necrótico (10% de necrosis). De nuevo, es preferible
obtener como mínimo aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%,
aproximadamente el 40% o aproximadamente el 50% de necrosis en la
región del tumor, sin efectos colaterales significativos adversos.
Estos efectos benéficos han sido de nuevo observados por los
presentes inventores. Naturalmente, será preferible usar
construcciones y dosis capaces de inducir como mínimo el 60%,
aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el
85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, hasta
incluyendo el 99% de la necrosis del tumor, en tanto las
construcciones y dosis usadas no den como resultado efectos
colaterales significativos o algunas otras reacciones no deseadas en
el animal.
Todas las determinaciones anteriores se pueden
hacer fácilmente y valorar adecuadamente por los técnicos con
experiencia ordinaria en el campo. Por ejemplo, los científicos y
los médicos asistentes podrían utilizar estos datos a partir de
animales experimentales en la optimización de dosis adecuadas para
el tratamiento humano. En sujetos con enfermedad avanzada, se puede
tolerar cierto grado de efectos colaterales. Sin embargo, los
pacientes en etapas tempranas de la enfermedad se pueden tratar con
dosis más moderadas con el fin de obtener un efecto terapéutico
significativo en ausencia de efectos colaterales. Los efectos
observados en estos estudios de animales experimentales deberán ser
preferiblemente significativos estadísticamente sobre los niveles de
control y deberán ser reproducibles de estudio en estudio.
Las personas con experiencia ordinaria en la
técnica entenderán además que las construcciones de Factor de
Tejido, combinaciones y dosis que den como resultado trombosis
específica del tumor y necrosis hacia el extremo inferior de los
rangos efectivos mencionados anteriormente, todavía sin embargo
pueden ser útiles en relación con la presente invención. Por
ejemplo, en realizaciones en donde se tiene en cuenta una aplicación
continua de las sustancias activas, una dosis inicial de una
construcción que sólo dé como resultado aproximadamente el 10% de
trombosis y/o necrosis será sin embargo útil, particularmente como
se observa frecuentemente que esta reducción inicial ``ceba'' el
tumor para un asalto destructivo posterior después de la
reaplicación posterior de la terapia. En cualquier caso, aún si
supera aproximadamente el 40% o así la inhibición del tumor no se
logra finalmente (lo cual es la meta general), se entenderá que
cualquier inducción de trombosis y necrosis es útil porque
representa un avance sobre el estado del paciente antes del
tratamiento.
Como se discutió anteriormente en relación con el
sistema de pruebas in vitro, naturalmente se entenderá que
las combinaciones de sustancias destinadas para su uso juntas
deberán probarse y utilizarse juntas. A manera de ejemplo solamente,
el mutante de activación del Factor VIIa de la presente invención se
incluye en esta categoría y generalmente deberá probarse junto con
la administración simultánea, anterior o posterior del Factor VIIa
exógeno. De manera similar, las construcciones de Factor de Tejido
individuales de la presente invención se pueden analizar
directamente en combinación con uno o más fármacos
quimioterapéuticos, inmunotoxinas, coaguligandos o similares. Los
análisis de los efectos combinados de estas sustancias se
determinarían y valorarían de acuerdo con las pautas presentadas
anteriormente.
Como se discutió, las composiciones de Factor de
Tejido truncado útiles en la presente invención son aquellas que
generalmente promoverán la coagulación como mínimo 100 veces menos
efectivamente que el tipo natural de Factor de Tejido. En otras
realizaciones, el Factor de Tejido truncado promueve la coagulación
como mínimo 1.000 veces menos efectivamente, en otras realizaciones
el Factor de Tejido truncado promueve la coagulación como mínimo
10^{4} o hasta 10^{5} veces menos efectivamente que el Factor de
Tejido del tipo natural, siendo los Factores de Tejido que son de
aproximadamente 10^{6} veces o menos activas que el Factor de
Tejido de tipo natural aproximadamente la actividad mínima
pretendida requerida.
Los Factores de Tejido a título de ejemplo son
aquellos que carecen de región de transmembrana y citosólica
(aminoácidos 220-263). Un Factor de Tejido truncado
de la presente invención está dado en la SEQ ID NO:1 y contiene los
aminoácidos 1-219 del Factor de Tejido tipo natural
(SEQ ID NO: 12). Desde luego éste es solamente un ejemplo de Factor
de Tejido truncado y se tienen en cuenta otras construcciones de
Factor de Tejido truncados, por ejemplo, una construcción que
comprende los aminoácidos 1-220;
2-219, 3-219 o cualquier otro
truncado de la secuencia de identificación número 12 que deje a la
molécula carente del dominio de transmembrana y/o dominios
cistosólicos del Factor de Tejido del tipo natural de otro modo
dando como resultado una molécula funcionalmente comparativa.
También se tienen en cuenta mutantes, como se ha descrito en detalle
anteriormente.
Usando la guía detallada dada a conocer
anteriormente, aún otros equivalentes de los Factores de Tejido se
pueden hacer. Se pueden hacer modificaciones y cambios en la
estructura del Factor de Tejido y todavía obtener una molécula que
tenga características parecidas o de otro modo deseables. Por
ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros
aminoácidos en una estructura de proteína sin pérdida apreciable de
capacidad de enlace interactivo, tales como, por ejemplo, enlazarse
al Factor VIIa. Ya que ésta es la capacidad interactiva y natural de
una proteína que define esa actividad funcional biológica de la
proteína, se pueden hacer ciertas sustituciones de secuencias de
aminoácidos en una secuencia de proteína (o desde luego, la
secuencia de ADN subyacente) y, sin embargo, obtener una proteína
con propiedades iguales (agonísticas). De este modo se tiene en
cuenta que se pueden hacer varios cambios en la secuencia del Factor
de Tejido (SEQ ID NO: 12) proteínas y péptidos (o secuencia de ADN
subyacente, SEQ ID NO: 11) sin pérdida apreciable de su utilidad o
actividad biológica.
También comprende el técnico experimentado que,
inherente en la definición de una proteína o péptido biológicamente
funcional equivalente, está el concepto de que hay un límite al
número de cambios que se pueden hacer dentro de una parte definida
de la molécula y todavía obtener como resultado una molécula con un
nivel aceptable de actividad biológica equivalente. Los péptidos
biológicamente funcionales equivalentes se definen así en la
presente descripción como los péptidos en los cuales ciertos
aminoácidos, no la mayoría ni todos, se pueden sustituir. Desde
luego, se puede hacer fácilmente una pluralidad de distintas
proteínas/péptidos con diferentes sustituciones y usarlos de acuerdo
con la invención.
Las sustituciones de aminoácidos generalmente se
basan en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena
lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad,
hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Un análisis del tamaño,
forma y tipo de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos
revela que la arginina, lisina e histidina son residuos cargados
positivamente; que la alanina, glicina y serina son de un tamaño
similar; y que la fenilalanina, el triptofano y la tirosina tienen
generalmente forma similar. Por lo tanto, basándose en estas
consideraciones, la arginina, lisina e histidina; alanina, glicina y
serina; y fenilalanina, triptofano y tirosina; se definen en la
presente descripción como equivalentes biológicamente
funcionales.
Haciendo más cambios cuantitativos, se puede
considerar el índice hidropático de los aminoácidos. A cada
aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base a su
hidrofobicidad y características de carga, éstas son: isoleucina
(+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8);
cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina
(-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina
(-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5);
glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina
(-3,9); y arginina (-4,5).
La importancia del índice de aminoácidos
hidropáticos para conferir función biológica interactiva sobre una
proteína generalmente se entiende en la técnica (Kyte y Doolittle,
1982, incorporada en la presente descripción mediante referencia).
Se sabe que ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros
aminoácidos que tienen un índice o calificación hidropática similar
y todavía retienen una actividad biológica similar. Al hacer cambios
basándose en el índice hidropático, se prefiere la sustitución de
aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de \pm2,
aquellos que están dentro de \pm1 se prefieren particularmente, y
aquellos dentro de \pm0,5 todavía se prefieren más
particularmente.
Se entiende que un aminoácido se puede sustituir
por otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar y sigue
obteniendo una proteína biológicamente equivalente. Como se detalla
en la Patente U.S.A. número 4.554.101 (incorporada en la presente
descripción mediante referencia), se han asignado los siguientes
valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina
(+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato (+3,0
\pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2);
glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1); alanina
(-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina
(-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3);
fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).
Al hacer cambios basándose en los valores de
hidrofilicidad, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos
valores de hidrofilicidad están dentro de \pm2, aquellos que están
dentro de \pm1 se prefieren particularmente, y los que están
dentro de \pm0,5 todavía se prefieren más particularmente.
Los polinucleótidos, que codifican los Factores
de Tejido de la presente invención pueden codificar una proteína de
Factor de Tejido entera, en tanto sea de coagulación deficiente, un
dominio de proteína de Factor de Tejido funcional, o cualquier
polipéptido de Factor de Tejido mutante o variante de acuerdo con la
guía detallada presentada en la presente descripción. Si uno desea
preparar un Factor de Tejido truncado, un Factor de Tejido mutante o
un Factor de Tejido truncado y mutado, el segmento de ADN útil
subyacente y el gen generalmente serán el mismo. Ya que el ADN
humano está disponible para la molécula de Factor de Tejido entero,
generalmente se preferirá usar esta construcción humana, dado que se
pretende el tratamiento clínico en humanos. Sin embargo, de ninguna
manera se excluye el uso de otros genes de Factor de Tejido, en
tanto la proteína producida no produce reacciones inmunológicas o
adversas después de la administración a un paciente humano. Los
métodos y composiciones descritas en la Patente U.S.A. número
5.110.730 se incorporan específicamente en la presente descripción
mediante referencia para los propósitos de complementar
adicionalmente la descripción de los solicitantes con referencia a
los genes y segmentos de ADN para su uso con la misma.
Los polinucleótidos se pueden derivar de ADN
genómico, es decir, clonado directamente a partir del genoma de un
organismo particular. En otras realizaciones, sin embargo, los
polinucleótidos pueden ser ADN complementario (ADNc). El ADNc es ADN
preparado usando el ARN mensajero (ARNm) como patrón. De este modo,
un ADNc no contiene ninguna secuencia de codificación interrumpida y
generalmente contiene casi exclusivamente la región o regiones de
codificación para la proteína correspondiente. En otras
realizaciones, se puede producir sintéticamente el polinucleótido.
Como es sabido por los expertos en la técnica, generalmente se
prefiere usar la construcción de ADNc en la expresión recombinante,
dado que esas construcciones son fáciles de manipular y usar. El uso
de clones genómicos más largos, hasta e incluyendo secuencias de
tamaño completo, de ninguna manera está excluido.
Aunque una característica sorprendente de la
presente invención es que las construcciones de Factor de Tejido
preferencialmente se localizan específicamente en la vasculatura de
un tumor sólido e inducen efectos específicos antitumor en el mismo,
también se tiene en cuenta que las proteínas de Factor de Tejido y
los polipéptidos se pueden administrar al ambiente del tumor usando
un vector recombinante que expresa los productos del Factor de
Tejido. Estas aproximaciones de ``terapia de genes'' al tratamiento
contra el cáncer se pueden practicar fácilmente haciendo referencia
a ciertas referencias científicas que se refieren a construcciones y
protocolos adecuados. A manera de ejemplo solamente, se puede usar
un vector viral, tal como un vector retroviral, virus de herpes
simplex, VHS (Patente U.S.A. número 5.288.641), citomegalovirus;
virus adenoasociado, VAA (Patente U.S.A. número 5.139.941); y/o un
vector adenoviral.
La secuencia de ADN humano genómico para el
Factor de Tejido se da a conocer en la SEQ ID NO: 11, con la
secuencia de aminoácidos correspondiente que se da a conocer en la
SEQ ID NO: 12. Si uno desea expresar el Factor VII, el ADN y las
secuencias de aminoácidos se dan a conocer en SEQ ID NO: 13 y SEQ ID
NO: 14 respectivamente.
Se tiene en cuenta que las variantes naturales
del Factor de Tejido existen y que tienen diferentes secuencias que
las descritas en la presente descripción. De este modo, la presente
invención no se limita al uso de la secuencia de polinucleótido
proporcionada para el Factor de Tejido sino, en vez de eso, incluye
el uso de cualquier variante que se presenta en forma natural. La
presente invención también abarca mutantes químicamente sintetizados
de estas secuencias, inteligentemente diseñadas después de una
aplicación de las consideraciones estructurales y funcionales
cuantificadas detalladas anteriormente.
Otra clase de variantes de secuencia son
resultado de la variación de codones. Debido a que hay varios
codones para la mayoría de los 20 aminoácidos normales, muchos ADN
diferentes pueden codificar el Factor de Tejido. La referencia a la
Tabla I permitirá que se identifiquen estas variantes.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{lllllllll}\hline
Aminoácidos \+\multicolumn{8}{c}{Codones}\\\hline Alanina \qquad
\+ \qquad Ala \+ A \+ GCA \+ GCC \+ GCG \+ GCU \+ \+ \\
Cisteína \qquad \+ \qquad Cys \+ C \+ UGC \+ UGU \+ \+ \+ \+ \\
Ácido Aspártico \qquad \+ \qquad Asp \+ D \+ GAC \+ GAU \+ \+ \+
\+ \\ Ácido Glutámico \qquad \+ \qquad Glu \+ E \+ GAA \+ GAG
\+ \+ \+ \+ \\ Fenilalanina \qquad \+ \qquad Phe \+ F \+ UUC \+
UUU \+ \+ \+ \+ \\ Glicina \qquad \+ \qquad Gly \+ G \+ GGA \+
GGC \+ GGG \+ GGU \+ \+ \\ Histidina \qquad \+ \qquad His \+ H
\+ CAC \+ CAU \+ \+ \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
TABLA I
(continuación)
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{lllllllll}\hline
Aminoácidos \+\multicolumn{8}{c}{Codones}\\\hline Isoleucina
\qquad \+ \qquad Ile \+ I \+ AUA \+ AUC \+ AUU \+ \+ \+ \\
Lisina \qquad \+ \qquad Lys \+ K \+ AAA \+ AAG \+ \+ \+ \+ \\
Leucina \qquad \+ \qquad Leu \+ L \+ UUA \+ UUG \+ CUA \+ CUC
\+ CUG \+ CUU \\ Metionina \qquad \+ \qquad Met \+ M \+ AUG \+
\+ \+ \+ \+ \\ Asparagina \qquad \+ \qquad Asn \+ N \+ AAC \+
AAU \+ \+ \+ \+ \\ Prolina \qquad \+ \qquad Pro \+ P \+ CCA \+
CCC \+ CCG \+ CCU \+ \+ \\ Glutamina \qquad \+ \qquad Gln \+ Q
\+ CAA \+ CAG \+ \+ \+ \+ \\ Arginina \qquad \+ \qquad Arg \+ R
\+ AGA \+ AGG \+ CGA \+ CGC \+ CGG \+ CGU \\ Serina \qquad \+
\qquad Ser \+ S \+ AGC \+ AGU \+ UCA \+ UCC \+ UCG \+ UCU \\
Treonina \qquad \+ \qquad Thr \+ T \+ ACA \+ ACC \+ ACG \+ ACU
\+ \+ \\ Valina \qquad \+ \qquad Val \+ V \+ GUA \+ GUC \+ GUG
\+ GUU \+ \+ \\ Triptofano \qquad \+ \qquad Trp \+ W \+ UGG \+
\+ \+ \+ \+ \\ Tirosina \qquad \+ \qquad Tyr \+ Y \+ UAC \+ UAU
\+ \+ \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
La mutagénesis del sitio específico es una
técnica útil en la preparación de péptidos individuales, o proteínas
o péptidos equivalentes biológicamente funcionales, a través de la
mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica además da a
conocer una capacidad fácil para preparar y probar variantes de
secuencia, que incorpora una o más de las consideraciones
anteriores, introduciendo uno o más cambios de secuencia de
nucleótidos en el ADN. La mutagénesis del sitio específico permite
la producción de mutantes a través del uso de secuencias de
oligonucleótidos específicos que codifican la secuencia del ADN de
la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos
adyacentes, para proporcionar una secuencia cebadora de tamaño
suficiente y complejidad de secuencia para formar un dúplex estable
en ambos lados de la unión de supresión que se está atravesando.
Típicamente, se prefiere un cebador de aproximadamente 17 a 25
nucleótidos de tamaño, con aproximadamente de 5 a 10 residuos en
ambos lados de la unión de la secuencia que se está alterando.
La técnica de la mutagénesis de sitio específico
se conoce bien en la técnica. Como se apreciará, la técnica
típicamente emplea un vector bacteriófago que existe tanto en forma
de cadena simple como de cadena doble. Los vectores típicos útiles
en la mutagénesis de sitio dirigido incluyen vectores tales como el
fago M13. Estos vectores fagos están disponibles comercialmente y su
uso generalmente es muy conocido para los expertos en la técnica.
Los plásmidos de cadena doble también se emplean de manera rutinaria
en la mutagénesis dirigida al sitio, lo cual elimina la etapa de
transferir el gen de interés de un fago al plásmido.
En general se realiza la mutagénesis de sitio
dirigido obteniendo primero un vector de cadena simple, o fusionando
dos cadenas de vector de cadena doble que incluyen dentro de su
secuencia una secuencia de ADN que codifica la proteína deseada. Un
cebador de oligonucleótido que tiene la secuencia mutada deseada se
prepara sintéticamente. Este cebador se reasocia a continuación con
la preparación de ADN de cadena simple, y se somete a enzimas de
polimerización de ADN tales como fragmento I Klenow de polimerasa de
E. Coli, con el fin de completar la síntesis de la cadena que
lleva la mutación. De este modo, se forma un heterodúplex en donde
una cadena codifica la secuencia original no mutada y la segunda
cadena lleva la mutación deseada. Este vector heterodúplex se usa
entonces para transformar las células adecuadas, tales como células
de E.coli, }y se seleccionan clones que incluyen vectores
recombinantes que lleven la configuración de la secuencia
mutada.
La preparación de variantes de secuencia del gen
seleccionado usando mutagénesis de sitio dirigido se da a conocer
como un medio de producir especies potencialmente útiles y no se
supone que sea limitante, ya que hay otras maneras en las cuales se
pueden obtener variantes de secuencia de los genes. Por ejemplo, los
vectores recombinantes que codifican el gen deseado se pueden tratar
con sustancias mutagénicas, tales como hidroxilamina, para obtener
variantes de secuencia. También se describen técnicas convenientes
en la Patente U.S.A. número 4.888.286, incorporada en la presente
descripción mediante referencia.
Aunque los métodos anteriores son convenientes
para su uso en mutagénesis, el uso de la reacción de cadena de
polimerasa (PCR^{MR}) se prefiere generalmente ahora. Esta
tecnología ofrece un método rápido y eficiente para introducir las
mutaciones deseadas en una secuencia de ADN dada. El siguiente texto
describe particularmente el uso de la reacción de cadena de
polimerasa para introducir mutaciones puntuales en una secuencia, ya
que se puede usar para cambiar el aminoácido codificado por la
secuencia dada. Las adaptaciones de este método también son
convenientes para introducir sitios de enzima de restricción en una
molécula de ADN.
En este método, se diseñan oligonucleótidos
sintéticos para incorporar una mutación puntual en un extremo de un
segmento amplificado. Después de la reacción de cadena de
polimerasa, los fragmentos amplificados son despuntados tratándolos
con fragmentos de Klenow, y los fragmentos despuntados se ligan y
subclonan en un vector para facilitar el análisis de secuencias.
Para preparar el ADN patrón que se desea
mutagenizar, el ADN se subclona en un vector de número de copias
alto, tal como pUC19, usando los sitios de restricción que flanquean
el área que se va a mutar. El ADN patrón se prepara usando una
minipreparación de plásmido. Los cebadores de oligonucleótidos
adecuados que se basan en la secuencia padre, pero que contienen la
mutación puntual deseada y que están flanqueados en el extremo 5'
mediante un sitio de enzima de restricción, se sintetizan usando un
sintetizador automático. Generalmente se requiere que el cebador sea
homólogo al ADN patrón durante aproximadamente 15 bases más o menos.
Los cebadores se pueden purificar mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida desnaturalizante, aunque esto no es absolutamente
necesario para su uso en la reacción de cadena de polimerasa. El
extremo 5' de los oligonucleótidos deberá entonces ser
fosforilado.
El ADN patrón deberá amplificarse mediante
reacción de cadena de polimerasa, usando los cebadores de
oligonucleótidos que contienen las mutaciones puntuales deseadas. La
concentración de MgCl_{2} en la solución regulada de amplificación
será generalmente de aproximadamente 15 mM. Generalmente deberán
llevarse a cabo de 20 a 25 ciclos de reacción de cadena de
polimerasa como sigue: desnaturalización, 35 segundos a 95ºC;
hibridización, 2 minutos a 50ºC; y extensión, 2 minutos a 72ºC. La
reacción de cadena de polimerasa generalmente incluirá un último
ciclo de extensión de aproximadamente 10 minutos a 72ºC. Después de
la etapa final de extensión, aproximadamente 5 unidades de
fragmentos de Klenow deberán añadirse a la mezcla de la reacción e
incubarse durante otros 15 minutos a aproximadamente 30ºC. La
actividad de exonucleasa de los fragmentos de Klenow se requiere
para hacer que los extremos se laven y sean convenientes para la
clonación despuntada.
La mezcla de la reacción resultante generalmente
deberá analizarse mediante electroforesis en gel de agarosa o
acrilamida no desnaturalizante para verificar que la amplificación
ha producido el producto predicho. Entonces se procedería a la
mezcla de la reacción eliminando la mayoría de los aceites
minerales, extrayendo con cloroformo para eliminar el aceite
restante, extrayendo con fenol regulado y luego concentrando
mediante precipitación con etanol al 100%. A continuación, deberán
digerirse aproximadamente la mitad de los fragmentos amplificados
con una enzima de restricción que corte todas las secuencias de
flanco usadas en los oligonucleótidos. Los fragmentos digeridos se
purifican sobre un gel de agarosa de baja gelificación/fusión.
Para subclonar los fragmentos y verificar la
mutación puntual, se subclonarían los dos fragmentos amplificados en
un vector digerido adecuado mediante ligación despuntada. Esto se
usaría para transformar E. coli, a partir de lo cual el ADN
del plásmido subsecuentemente podría prepararse usando una
minipreparación. La parte amplificada del ADN del plásmido se
analizaría mediante secuenciamiento de ADN para confirmar que se
generó la mutación puntual correcta. Esto es importante ya que la
polimerasa del ADN Taq puede introducir mutaciones adicionales en
los fragmentos de ADN.
La introducción de una mutación puntual también
se puede efectuar usando etapas de reacción de cadena de polimerasa
secuenciales. En este procedimiento, los dos fragmentos que abarcan
la mutación se fijan entre sí y se extienden mediante síntesis
iniciada mutuamente. Este fragmento se amplifica entonces mediante
una segunda etapa de reacción de cadena de polimerasa, evitando
mediante esto la ligación despuntada requerida en el protocolo
anterior. En este método, la preparación del ADN patrón, la
generación de los cebadores de oligonucleótidos y la primera
amplificación de reacción de cadena de polimerasa se realizan como
se ha descrito anteriormente. Sin embargo, en este proceso los
oligonucleótidos elegidos deberán ser homólogos al ADN patrón
durante un tramo de aproximadamente entre 15 y 20 bases y debe
también solaparse uno con el otro durante aproximadamente diez bases
o más.
En la segunda amplificación de reacción de cadena
de polimerasa, se usaría cada fragmento amplificado y cada cebador
de secuencia de flanco y se llevaría a cabo reacción de cadena de
polimerasa durante entre aproximadamente 20 y aproximadamente 25
ciclos, usando las condiciones que se han descrito anteriormente. De
nuevo se subclonarían los fragmentos y se verificaría que la
mutación puntual fue correcta mediante el uso de las etapas
señaladas anteriormente.
Usando cualquiera de los métodos anteriores,
generalmente se prefiere introducir la mutación amplificando un
fragmento tan pequeño como sea posible. Desde luego, los parámetros
como la temperatura de fusión del oligonucleótido, estarán
generalmente influenciados por el contenido de GC y el tamaño del
oligo, deberá también considerarse cuidadosamente. La ejecución de
estos métodos, y su optimización si es necesario, será conocida por
los expertos en la técnica, y se describe adicionalmente en varias
publicaciones, tales como Current Protocols in Molecular Biology,
1995.
En toda esta solicitud, el término ``construcción
de expresión'' significa que incluye cualquier tipo de construcción
genética que contiene un ácido nucleico que codifica un producto de
gen en el cual parte o toda la secuencia que codifica el ácido
nucleico es capaz de ser transcrita. La transcripción generalmente
será traducida en una proteína. De este modo, la expresión
preferiblemente incluye tanto la transcripción de un gen de Factor
de Tejido como la traducción de un factor de un ARNm de Factor de
Tejido en un producto de proteína de Factor de Tejido.
Una técnica frecuentemente empleada por los
expertos en el campo de la producción de proteínas hoy en día es
obtener la llamada versión ``recombinante'' de la proteína, para
expresarla en una célula recombinante y obtener la proteína a partir
de estas células. Estas técnicas se basan en la ``clonación'' de una
molécula de ADN que codifica la proteína a partir de una biblioteca
de ADN, es decir, obteniendo una molécula de ADN específica distinta
de otras partes del ADN. Esto se puede lograr mediante, por ejemplo,
clonar una molécula de ADNc, o clonar una molécula de ADN parecida a
genómica. Las técnicas tales como éstas serían adecuadas para la
producción de composiciones de Factor de Tejido particulares de
acuerdo con la presente invención. Las proteínas de fusión
recombinantes se comentan en mayor detalle más adelante en la
presente descripción, y la Patente U.S.A. número 5.298.599 es
ejemplo además de la producción y uso de proteína de fusión.
Para la expresión del Factor de Tejido, en cuanto
se ha obtenido un clon o clones convenientes (de tamaño completo si
se desea), ya sean de ADNc basado o genómico, se puede continuar
preparando un sistema de expresión para la preparación recombinante
de los Factores de Tejido. La ingeniería de los segmentos del ADN
para la expresión en un sistema procariótico o eucariótico se puede
llevar a cabo mediante técnicas generalmente conocidas para los
expertos en el campo de la expresión recombinante. Se cree que
virtualmente se puede emplear cualquier sistema de expresión en la
expresión de estas proteínas.
Estas proteínas se pueden expresar con éxito en
sistemas de expresión eucariótico, por ejemplo, células CHO, como se
describe por Rehemtulla y colaboradores (1991), sin embargo, se
considera que los sistemas de expresión bacteriana, tales como el
pQE-60 de E. coli serán particularmente
útiles para la preparación a gran escala y la purificación posterior
de proteínas o péptidos. Los ADNc para el Factor de Tejido se pueden
expresar en sistemas bacterianos, estando expresadas las proteínas
codificadas como fusiones con \beta-galactosidasa,
ubiquitina, S-transferasa de glutationa
deSchistosoma japonicum y similares. Se cree que la expresión
bacteriana tendrá ventajas sobre la expresión eucariota en términos
de facilidad de uso y cantidad de materiales obtenidos mediante la
misma. Las técnicas de las Patentes U.S.A. números 5.298.599 y
5.346.991 se incorporan también en la presente descripción mediante
referencia para complementar adicionalmente los métodos de
producción del Factor de Tejido soluble descritos en la presente
descripción, incorporándose particularmente la Patente U.S.A. número
5.346.991 para los fines de complementar todavía más la descripción
con respecto a la creación y producción de mutantes y variantes del
Factor de Tejido.
Con el fin de que la construcción efectúe la
expresión de una transcripción de Factor de Tejido, el
polinucleótido que codifica al polinucleótido del Factor de Tejido
estará bajo el control de transcripción de un promotor. Un
``promotor'' se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la
maquinaria sintética de la célula huésped, o la maquinaría sintética
introducida, que se requiere para iniciar la transcripción
específica de un gen. La frase ``bajo control de transcripción''
significa que el promotor está en el lugar correcto en relación con
el polinucleótido para controlar la iniciación y expresión de
polimerasa del ARN del polinucleótido. El término promotor se usará
aquí para referirse a un grupo de módulos de control de
transcripción que están agrupados alrededor del sitio de iniciación
del ARN polimerasa II.
En términos de la expresión microbiana, las
Patentes U.S.A. números 5.583.013; 5.221.619; 4.785.420; 4.704.362;
y 4.366.246 complementan adicionalmente la presente descripción en
relación con la expresión de genes en células huéspedes
recombinantes.
En cuanto los péptidos se han expresado, se
pueden aislar y purificar usando técnicas de purificación de
proteínas muy conocidas para los expertos en la técnica. Estas
composiciones se emplearán solas o en combinación con anticuerpos,
quimioterapias y ligandos efectores como sustancias terapéuticas en
el tratamiento de tumores como se detalla más adelante en la
presente descripción. Los péptidos a título de ejemplo de la
presente invención se muestran en las SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:9,
desde luego se entiende que éstos son sólo ejemplos y también se
tiene en cuenta cualquier mutación, alteración o variantes que se
presentan de manera natural de estas secuencias, como útiles en
conjunción con la presente invención.
Las técnicas de purificación de proteína son muy
conocidas para los expertos en el campo. Estas técnicas tienden a
involucrar el fraccionamiento del medio celular para separar la
proteína de interés de otros componentes de la mezcla. Los métodos
analíticos particularmente convenientes para la preparación de un
péptido puro son la cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía de exclusión, electroforesis en gel de poliacrilamida,
enfoque isoeléctrico y similares. Un método particularmente
eficiente para purificar péptidos es la cromatografía líquida de
proteína rápida o incluso la cromatografía líquida de alta
presión.
Varias otras técnicas convenientes para su uso en
la purificación de proteínas serán muy conocidas por los expertos en
el campo. Éstas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de
amonio, PEG, anticuerpos y similares o mediante desnaturalización
por calor, seguido por centrifugación; etapas de cromatografía tales
como intercambio iónico, filtración en gel, fase inversa,
hidroxilapatita y cromatografía de afinidad; enfoque isoeléctrico;
electroforesis en gel; y combinaciones de éstas y otras técnicas.
Como se conoce generalmente en la técnica, se cree que se puede
cambiar el orden de conducir las distintas etapas de purificación, o
que ciertas etapas se pueden omitir, y de todos modos tendría como
resultado un método conveniente para la preparación de una proteína
o péptido sustancialmente purificado.
Como se describe en la presente descripción en
detalle, las técnicas generalmente preferentes para purificar
construcciones de Factor de Tejido expresadas para su uso en la
presente invención comprenden la generación de una molécula de
Factor de Tejido que incluye una etiqueta de purificación de
afinidad y el uso de una matriz de separación de afinidad para
obtener la construcción de Factor de Tejido libre de la mayoría o de
todas las especies contaminantes. Muchas de estas etiquetas de
proteínas de fusión son conocidas para los técnicos con experiencia
ordinaria en el campo y estos protocolos de expresión y separación
se pueden llevar a cabo fácilmente. También hay tecnología
disponible para disociar la etiqueta de afinidad original antes del
uso de la proteína liberada o polipéptido, la cual se puede efectuar
insertando un enlazador de proteasa sensible entre la etiqueta de
afinidad y la proteína de interés. Esta metodología sin duda se
emplea en relación con aspectos de la presente invención. La Patente
U.S.A. número 5,298,599 también es instructiva respecto a esto. Sin
embargo, también se sabe que muchas de estas etiquetas no impiden la
capacidad de la proteína expresada para llevar a cabo sus funciones
biológicas, y la eliminación de la etiqueta no se requiere
necesariamente antes del uso de la construcción del Factor de Tejido
en la presente invención.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención generalmente comprenderán una cantidad efectiva de Factor
de Tejido truncado disuelto o disperso en un portador
farmacéuticamente aceptable o medio acuoso.
Las frases ``farmacéutica o farmacológicamente
aceptable'' se refieren a las entidades moleculares y composiciones
que no producen un reacción adversa, alérgica o de otro modo
contraria cuando se administra a un animal, o a un humano, según sea
lo apropiado. Como se usa en la presente descripción, ``portador
farmacéuticamente aceptable'' incluye cualquiera y todos los
disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, sustancias
antibacterianas y antihongos, sustancias isotónicas y retardantes de
la absorción y similares. El uso de estos medios y sustancias para
sustancias farmacéuticas activas es muy conocido en la técnica.
Excepto en la medida en que algún medio o sustancia convencional sea
incompatible con el ingrediente activo, se considera su uso en las
composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar
ingredientes activos suplementarios en las composiciones.
El Factor de Tejido truncado de la presente
invención frecuentemente se formulará para administración
parenteral, por ejemplo, formulado para inyección vía intravenosa,
intramuscular, subcutánea u otra de estas rutas, incluyendo
instilación directa en un tumor o sitio enfermo. La preparación de
una composición acuosa que contiene una sustancia coagulante
dirigida al tumor como un ingrediente activo será conocida por los
expertos en la técnica a la luz de la presente descripción.
Típicamente, estas composiciones se pueden preparar como
inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también
se pueden preparar formas sólidas convenientes para su uso para
preparar soluciones o suspensiones después de la adición de un
líquido antes de la inyección; y las preparaciones también se pueden
emulsificar.
Las soluciones de los compuestos activos como
base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar
en agua convenientemente mezclada con un tensoactivo, tal como
hidroxipropilcelulosa. Se pueden preparar dispersiones en glicerol,
glicoles de polietileno líquidos, y mezclas de los mismos y en
aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas
preparaciones contienen un conservador para evitar el crecimiento de
microorganismos.
Las formas farmacéuticas convenientes para el uso
inyectable incluyen soluciones o dispersiones estériles acuosas;
formulaciones que incluyen aceite de ajonjolí, aceite de cacahuate o
propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación
extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. En
todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta
el grado de que exista inyectabilidad fácil. Debe ser estable bajo
las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe preservar
contra la acción contaminante de los microorganismos, tales como
bacterias y hongos.
Las composiciones de Factor de Tejido truncado se
pueden formular en una composición en forma de sal o en forma
neutra. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales
ácidas de adición (formadas con los grupos amino libres de la
proteína) y las cuales se forman con ácidos inorgánicos tales como,
por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos como
el acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales
formadas con grupos carboxilo libres también se pueden derivar de
bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio,
potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como
isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.
El portador también puede ser un disolvente o un
medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol
(por ejemplo glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y
similares), mezclas convenientes de los mismos, y aceites vegetales.
Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso
de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento
del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y
mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de
microorganismos se puede aplicar con respecto a distintas sustancias
antibacterianas y antihongos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol,
fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será
preferible incluir sustancias isotónicas, por ejemplo, azúcares o
cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones
inyectables se puede aplicar mediante el uso de composiciones de
sustancias que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de
aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan
incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el
disolvente adecuado con varios de los otros ingredientes enumerados
anteriormente, según se requiera, seguidos por esterilización por
filtración. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando los
distintos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril
que contiene el medio de dispersión básica y los otros ingredientes
requeridos de los enumerados anteriormente. En caso de los polvos
estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles,
los métodos preferentes de preparación son técnicas de secado al
vacío, y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo
más algún ingrediente adicional deseado a partir de la solución
filtrada estéril previamente del mismo.
Después de la formulación, las soluciones se
administrarán de una manera compatible con la formulación de la
dosis y en una cantidad que sea terapéuticamente efectiva. Las
formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de
dosis, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas
anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación
del fármaco y similares.
Las composiciones farmacéuticas convenientes de
acuerdo con la invención generalmente incluirán una cantidad del
Factor de Tejido de coagulación deficiente mezclado con un diluyente
o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como solución acuosa
estéril, para dar un rango de concentraciones finales, dependiendo
del uso pretendido. Las técnicas de preparación generalmente son muy
conocidas en la técnica como se ejemplifica por Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16ª Ed. Mack Publishing Company, 1980.
Deberá apreciarse que la contaminación de endotoxina deberá
mantenerse mínima a un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5
nanogramos/miligramo de proteína. Más aún, para la administración
humana, las preparaciones deberán satisfacer esterilidad,
pirogenicidad, seguridad general y estándares de pureza según lo
requiere la Oficina de Normas Biológicas de la FDA (``Food and Drug
Administration'').
Las dosis terapéuticamente efectivas son
fácilmente determinables usando un modelo animal, como se muestra en
los estudios detallados en la presente descripción. Los animales
experimentales que tienen tumores sólidos frecuentemente se usan
para optimizar las dosis terapéuticas adecuadas antes de trasladar a
un ambiente clínico. Estos modelos se sabe que son muy confiables
para predecir estrategias anticáncer efectivas. Por ejemplo, los
ratones que tienen tumores sólidos, tales como los usados en los
Ejemplos, se usan ampliamente en pruebas preclínicas. Los inventores
han usado estos modelos de ratón aceptados en la técnica para
determinar los rangos de trabajo del Factor de Tejido truncado que
dan efectos antitumor benéficos con toxicidad mínima.
Además de los compuestos formulados para la
administración parenteral, tales como inyección intravenosa o
intramuscular, también se tienen en cuenta otras formas
farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, tabletas u otros sólidos
para administración oral, cápsulas de liberación retardada, formas
liposomales y similares. Otras formulaciones farmacéuticas también
se pueden usar, dependiendo de la condición que se va a tratar. Por
ejemplo, las formulaciones tópicas son adecuadas para tratar
condiciones patológicas tales como dermatitis y psoriasis; y
formulaciones oftálmicas para retinopatía diabética.
Como se describe en detalle en la presente
descripción, se tiene en cuenta que ciertos beneficios serán
resultado de la manipulación de las construcciones de Factor de
Tejido de coagulación deficiente para proporcionarles una vida media
en vivo más larga. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan, a la
manipulación o modificación de la molécula de Factor de Tejido
misma, y también la conjugación de construcciones de Factor de
Tejido a portadores inertes, tales como distintas proteínas o
componentes no proteínicos, incluyendo inmunoglobulinas y partes Fc.
Estas composiciones se llaman aquí construcciones de Factor de
Tejido con vida media más larga. Se entenderá que la vida media más
larga no es lo mismo que las composiciones farmacéuticas para su uso
en ``liberación lenta''. Las formulaciones de liberación lenta
generalmente se diseñan para dar un nivel de fármaco constante
durante un periodo extendido. Al aumentar la vida media de un
fármaco, tal como una construcción de Factor de Tejido de acuerdo
con la presente invención, se pretende que tenga como resultado un
nivel de plasma alto después de la administración, y que estos
niveles se mantengan durante un tiempo más largo, pero estos niveles
generalmente decaen dependiendo de la
fármaco-cinética de la construcción. Aunque
actualmente no se prefiere, las formulaciones de liberación lenta de
la construcción de Factor de Tejido y combinaciones de las mismas de
ninguna manera se excluyen del uso en la presente invención.
La presente invención también da a conocer
equipos terapéuticos que comprenden las construcciones de Factor de
Tejido truncado descritas en la presente descripción. Estos equipos
generalmente contendrán, en un medio contenedor conveniente, una
formulación farmacéuticamente aceptable de como mínimo una
construcción de Factor de Tejido de coagulación deficiente de
acuerdo con la invención. Los equipos también pueden contener otras
formulaciones farmacéuticamente aceptables, tales como las que
contengan componentes para dirigirse a las construcciones de Factor
de Tejido truncado; factores de extra coagulación, particularmente
el Factor VIIa; anticuerpos biespecíficos, células T, u otros
componentes funcionales para su uso, por ejemplo, en inducción de
antígeno; componentes para su uso en supresión de antígeno, tales
como una ciclosporina, si es necesario; anticuerpos o inmunotoxinas
de sitio antitumor distintas; y cualquiera de uno o más de un rango
de fármacos quimioterapéuticos.
Los equipos pueden tener un solo elemento
contenedor que contenga el Factor de Tejido truncado, con o sin
componentes adicionales, o puede tener distintos elementos
contenedores para cada sustancia deseada. También se consideran los
equipos que comprenden los componentes separados necesarios para
hacer un ligando o inmunotoxina coagulante biespecífico. Ciertos
equipos preferentes de la presente invención incluyen una
construcción de Factor de Tejido de coagulación deficiente que está
deteriorado en su capacidad para activar el Factor VII, empaquetado
en un equipo para su uso en combinación con la coadministración de
Factor VIIa exógeno. En estos equipos el mutante de Factor de Tejido
y el Factor VIIa pueden estar preacomplejados, ya sea en una
combinación de equivalente molar, o con un componente en exceso del
otro; o cada uno de los componentes de Factor de Tejido y Factor
VIIa del equipo se puede mantener por separado dentro de distintos
contenedores antes de la administración a un paciente. Otros equipos
preferentes incluyen un Factor de Tejido de coagulación deficiente
en combinación con una sustancia quimioterapéutica ``clásica''. Esto
es a título de ejemplo de las consideraciones que son aplicables a
la preparación de estos equipos de Factor de Tejido y combinaciones
de equipos en general.
Cuando los componentes del equipo se proporcionan
en una o más soluciones líquidas, la solución líquida es una
solución acuosa, siendo una solución acuosa estéril particularmente
preferente. Sin embargo, los componentes del equipo se pueden
proporcionar como polvos secos. Cuando los reactivos o componentes
se proporcionan como polvo seco, el polvo se puede reconstituir
mediante la adición de un disolvente conveniente. Se considera que
el disolvente también se puede proporcionar en otro elemento
contenedor.
El elemento contenedor del equipo generalmente
incluirá como mínimo un frasco, tubo de ensayo, matraz, botella,
jeringa u otro elemento contenedor, en el cual se puede colocar el
Factor de Tejido truncado, y cualquier otra sustancia deseada y,
preferiblemente, en cuotas adecuadas. Cuando se incluyen componentes
adicionales, el equipo también contendrá generalmente un segundo
frasco u otro contenedor en el cual éstos se colocan, habilitando la
administración de dosis designadas separadas. Los equipos también
pueden comprender un segundo/tercero elementos contenedores para
contener un regulador estéril, farmacéuticamente aceptable, u otro
diluyente.
Los equipos también pueden contener un elemento
mediante el cual se administre el Factor de Tejido truncado a un
animal o paciente, por ejemplo, una o más agujas o jeringas, o hasta
un gotero de ojos, pipeta, u otro de estos aparatos, a partir del
cual se pueda inyectar la formulación en el animal o aplicar en una
área deseada del cuerpo. Los equipos de la presente invención
también incluirán típicamente un elemento para contener los frascos,
o similares, y otro componente, en confinamiento estrecho para la
venta comercial, tal como, por ejemplo, contenedores de plástico
moldeados por inyección o por soplado, en los cuales se colocan y
retienen los frascos y otros aparatos deseados.
Las composiciones a utilizar en esta invención
son ampliamente aplicables al tratamiento de cualquier enfermedad,
tal como un tumor benigno o maligno, que tiene como un componente de
la enfermedad ``vasos protrombóticos''. Estas enfermedades asociadas
con la vasculatura más particularmente incluyen tumores sólidos,
malignos, y también tumores benignos, tales como BPH. Sin embargo,
el tratamiento de la retinopatía diabética, la restenosis vascular,
malformaciones arteriovenosas (MAV), meningioma, hemangioma,
glaucoma neovascular y psoriasis; y también angiofibrona, artritis,
placas ateroscleróticas, neovascularización de injerto córneo,
articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, síndrome de
Osler-Weber, granuloma piogénico, fibroplasia
retrolental, escleroderma, tracoma, adhesiones vasculares,
sinovitis, dermatitis y hasta endometriosis tampoco se excluyen.
La presente invención se basa en el uso de
construcciones de Factor de Tejido o Factor de Tejido en combinación
con otras sustancias, en las que la construcción de Factor de Tejido
o combinación tiene suficiente actividad trombogénica para perturbar
el ambiente procoagulante dentro de los vasos específicos asociados
con la enfermedad, tales como los de un tumor vascularizado, en la
dirección de trombosis. El ambiente en vasos en tejidos normales es
fibrinolítico, mientras que en los vasos tumorales es procoagulante,
es decir, se predispone hacia la trombosis. Los cambios
procoagulantes en los vasos tumorales son resultado en parte de una
liberación local de las citoquinas endoteliales que activan las
células, IL-1 y TNF\alpha. La interleucina 1 es
secretada por la mayoría de las células tumorales y por macrófagos
activados. La TNF\alpha es secretada por las células huéspedes que
se han infiltrado en el tumor, incluyendo linfocitos activados,
macrófagos, células NK y células LAK.
La interleucina 1 y el TNF\alpha inducen una
variedad de cambios en el endotelio vascular, incluyendo la
sobrerregulación del Factor de Tejido, la subregulación de
activadores plasminógenos y la sobrerregulación del inhibidor de
activadores plasminógenos, PAI-1 (Nawroth y Stern,
1986; Nawroth y colaboradores, 1988). Estos efectos se magnifican
adicionalmente por factores derivados del tumor (Murray y
colaboradores, 1991; Ogawa y colaboradores, 1990), posiblemente
VEGF. El resultado colectivo de éstos y otros cambios es que el
endotelio se vuelve más capaz para soportar la formación de los
trombos y menos capaz de disolver fibrina, produciendo una
predisposición hacia la trombosis.
Por lo tanto, a la luz de los fenómenos
científicos descritos anteriormente, los inventores tienen en cuenta
que cuando se administran Factores de Tejido de coagulación
deficiente, tienen suficiente actividad trombogénica residual para
inclinar el equilibrio de la cascada de coagulación hacia la
trombosis en los vasos que generalmente son de naturaleza
protrombóticos (figura 3). Aunque no es necesario un entendimiento
mecanístico del razonamiento científico con el fin de practicar la
presente invención, se entenderá que la explicación anterior es un
mecanismo mediante el cual puede funcionar la invención. Este
mecanismo se basa menos en la localización específica de los
Factores de Tejido dentro de los vasos de un tumor vascularizado, en
oposición a otros vasos, pero sin embargo es sorprendente que una
biodistribución igual del Factor de Tejido, si esto ocurre, puede
dar lugar a un efecto desigual en la coagulación dentro de los
sitios de enfermedad tales como dentro de tumores sólidos. Dado como
es, naturalmente, una propiedad inherente del tumor mantener una red
de vasos sanguíneos y continuar en el proceso angiogénico, es
evidente que los vasos sanguíneos asociados al tumor no pueden estar
tan predispuestos hacia la trombosis que espontánea o fácilmente
soportan la coagulación, ya que la coagulación necesariamente daría
como resultado la detención de oxígeno y nutrientes a las células
tumorales y causaría que el tumor se autodestruyera. Evidentemente,
esto no ocurre.
Se apreciará fácilmente que la presente invención
tiene utilidad significativa en el tratamiento de enfermedades,
tales como tumores vascularizados, independientemente de un
entendimiento de los mecanismos mediante los cuales se puede inducir
la coagulación específica en los vasos asociados con la enfermedad.
Sin embargo, los inventores razonan adicionalmente que otro
mecanismo que subraya la posible acción sorprendente de las
construcciones de Factor de Tejido es que los Factores de Tejido
selectivamente se unen a ciertas células endoteliales vasculares en
preferencia a las que están en otros tejidos o sitios del cuerpo
(figura 3). De conformidad con lo anterior, si el Factor de Tejido
truncado selectivamente se une al endotelio vascular del tumor
después de la inyección, esto lo pondría en contacto con una
superficie lípida y promovería el ensamble de complejos de
iniciación de la coagulación en los vasos del tumor. Tal vez, debido
a la naturaleza protrombótica de los vasos tumorales, hay un
incremento en la concentración local de los Factores VIIa, IXa, Xa,
el inhibidor de trayectoria del Factor de Tejido (ITFT) u otras
moléculas que interactúan con el Factor del Tejido, alentando así la
localización.
Los métodos se pueden emplear para probar la
localización del Factor de Tejido truncado etiquetando el Factor de
Tejido truncado, inyectándolo en ratones que tienen tumores, y
determinando si en realidad se localiza dentro de los vasos del
tumor. Aunque tiene interés científico, llevar a cabo estos estudios
no es necesario para practicar la presente invención, dado que la
administración de construcciones de Factor de Tejido de coagulación
deficiente da como resultado ventajosamente en efectos antitumor
específicos independientes del mecanismo preciso de acción que
subyace a este fenómeno.
Los presentes usos de las moléculas de Factor de
Tejido de coagulación deficiente para promover la coagulación en
vasos sanguíneos protrombóticos son distintos a los usos anteriores
propuestos para las construcciones de Factor de Tejido, tales como
el Factor de Tejido truncado en combinación con el Factor VIIa. Se
han propuesto el Factor de Tejido truncado y el Factor VIIa para el
uso combinado en el tratamiento de desórdenes de la sangre, tales
como hemofilia (Patentes U.S.A. números 5.374.617; 5.504.064; y
5.504.067). Las Patentes U.S.A. números 5.346.991 y 5.589.363
también describen el uso de los mutantes K165A y K166A para inhibir
la coagulación en el tratamiento de infarto de miocardio, y
proporcionar secuencias de AND recombinante y vectores para su
producción.
De inmediato se apreciará que los objetivos de la
metodología anterior están en contraste directo con los vasos
sanguíneos protrombóticos objetivos de la presente invención. Los
vasos sanguíneos ``protrombóticos'' están en un estado dinámico que
los predispone a la coagulación, pero en el cual la coagulación no
se presenta en el ambiente natural. Esto se ejemplifica con los
vasos sanguíneos dentro de un tumor vascularizado categorizados como
protrombóticos, pero en los que el tumor mantiene un suministro de
sangre suficiente y necesario para soportar el mantenimiento y
crecimiento del tumor. Por el contrario, los sitios objetivo dentro
de un individuo con un desorden de la sangre, son por su misma
naturaleza significativamente deficientes en su capacidad para
soportar la coagulación. La metodología combinada de Factor de
Tejido truncado y Factor VIIa dirigida principalmente para su uso en
hemofílicos se ha propuesto para su uso junto con el control de
sangrado postoperatorio o traumatismo severo en el cual una lesión
externa ha evitado que sea efectivo el proceso de coagulación
necesario. Esto a su vez es diferente que la intención de la
presente invención.
El uso más importante de la presente invención se
cree que está en relación con el tratamiento de tumores malignos,
vascularizados. Sin embargo, además de distintas enfermedades y
desórdenes numerados anteriormente, la invención también está
destinada a su uso en terapia de otros crecimientos benignos. Un
ejemplo particular de esto es la hiperplasia prostática benigna
(HPB), la cual se puede tratar de acuerdo con las dosis particulares
y regímenes de tratamiento presentados más adelante. Para el
tratamiento de la hiperplasia prostática benigna también se puede
combinar con otros tratamientos actualmente practicados en la
técnica. Por ejemplo, se tiene en cuenta ciertamente el ataque de
inmunotoxinas a marcadores localizados dentro de la hiperplasia
prostática benigna, tales como PSA.
La localización del Factor de Tejido truncado y
la coagulación específica se explota más preferiblemente para usos
terapéuticos del Factor de Tejido truncado en el tratamiento de
cánceres y tumores. Estos usos pueden emplear Factor de Tejido
truncado solo o en combinación con sustancias quimioterapéuticas y/o
inmunotoxinas o coaguligandos. Las composiciones y métodos dados a
conocer por esta invención son ampliamente aplicables al tratamiento
de cualquier tumor maligno que tenga un componente vascular. Los
tumores vascularizados típicos son los tumores sólidos,
particularmente carcinomas, los cuales requieren un componente
vascular para la provisión de oxígeno y nutrientes. Los tumores
sólidos a título de ejemplo que se pueden tratar usando la invención
incluyen, pero no se limitan a, carcinomas del pulmón, pecho,
ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado,
parótida, vías biliares, colon, recto, cérvix, útero, endometrio,
riñón, vejiga, próstata, tiroides, carcinomas de células escamosas,
adenocarcinomas, carcinomas de células pequeñas, melanomas, gliomas,
neuroblastomas, y similares.
La presente invención está destinada a su uso en
el tratamiento de cualquier paciente que presente un tumor sólido.
Sin embargo, en lo que la presente invención es particularmente
exitosa es en el tratamiento de tumores sólidos de tamaños moderados
o grandes, los pacientes en estas categorías es probable que reciban
más beneficios significativos de tratamientos de acuerdo con los
métodos y composiciones dados a conocer en la presente descripción.
En general, la invención se puede usar para tratar tumores de
aproximadamente 0,3-0,5 centímetros y más, aunque es
un uso mejor de la invención tratar tumores mayores de 0,5
centímetros de tamaño. De los estudios ya conducidos en modelos
animales aceptables, se cree que los tumores de aproximadamente 1,0
o aproximadamente 1,2 centímetros representan el tamaño de tumores
sólidos que son más efectivamente atacados por las construcciones de
Factor de Tejido de la presente invención. Por lo tanto, los
pacientes que presentan tumores de entre 1,0 y aproximadamente 2,0
centímetros de tamaño estarán en el grupo de tratamiento preferente
de pacientes en relación con las presentes terapias de Factor de
Tejido, aunque los tumores hasta e incluyendo los tumores más
grandes encontrados en humanos también se pueden tratar.
Aunque los presentes métodos no están destinados
generalmente como tratamiento preventivo o profiláctico, el uso de
la invención tampoco se limita al tratamiento de pacientes que
tienen tumores de tamaños moderados o grandes. Hay muchas razones
bajo este aspecto de la amplitud de la invención. Por ejemplo, un
paciente que presenta un tumor primario de tamaño moderado o mayor
puede tener también varios otros tumores metastásicos que se
consideran de tamaño pequeño o hasta en las etapas tempranas del
implante de tumores metastáticos. Dado que las construcciones de
Factor de Tejido y las combinaciones de la invención se administran
generalmente en la circulación sistémica de un paciente,
naturalmente tendrán efectos en los tumores secundarios, más
pequeños y metastáticos, aunque esto no debe ser la intención
primaria del tratamiento. Además, aún en situaciones en donde la
masa del tumor como un todo es un solo tumor pequeño, ciertos
beneficios de efectos antitumor resultarán del uso de los presentes
tratamientos.
La guía dada a conocer anteriormente con respecto
a los pacientes más convenientes para el uso en relación con la
presente invención está destinada como enseñanza de que ciertos
perfiles de pacientes pueden ayudar en la selección de pacientes que
pueden ser tratados mediante la presente invención o que, tal vez,
es mejor tratarlos usando otras estrategias de tratamiento
anticáncer. Sin embargo, el hecho de que un tratamiento o de otro
modo más efectivo preferente se perciba que existe en relación con
cierta categoría de pacientes, de ningún modo niega la utilidad
básica de la presente invención en relación con los tratamientos de
todos los pacientes que tienen un tumor vascularizado. Otra
consideración es el hecho de que el asalto inicial sobre un tumor,
proporcionado por la terapia de Factor de Tejido de la presente
invención, puede ser menor en cualquier efecto inmediato y medible,
pero puede predisponer al tumor a otros tratamientos terapéuticos de
manera que el tratamiento posterior dé como resultado un efecto
sinérgico global o aún conduzca a la remisión total o cura.
No se cree que debería excluirse algún tipo
particular de tumor de los tratamientos que usan la presente
invención. Como el intento de la terapia es coagular la vasculatura
del tumor, y como la vasculatura es sustancial o enteramente la
misma en todos los tumores sólidos, se entenderá que la presente
metodología es amplia o enteramente aplicable al tratamiento de
todos los tumores sólidos, independientemente del fenotipo o
genotipo particular de las mismas células tumorales. Sin embargo, el
tipo de células tumorales puede ser importante para el uso de la
invención en combinación con sustancias terapéuticas secundarias,
particularmente inmunotoxinas y/o coaguligandos de células
antitumor.
Los técnicos con experiencia ordinaria en el
campo entenderán que ciertos tipos de tumores pueden ser más dóciles
a la inducción de trombosis y necrosis usando la presente invención.
El fenómeno se observa en animales experimentales, y puede
presentarse en tratamientos humanos. Por ejemplo, se sabe que el
sistema de tumor modelo HT29 es relativamente difícil de coagular;
mientras que el modelo de tumor C1300 generalmente es más dócil para
la inducción de trombosis y posterior necrosis. Estas
consideraciones se tomarán en cuenta para conducir tanto los
estudios preclínicos en animales experimentales como en optimizar
las dosis para su uso en el tratamiento de cualquier paciente
particular o grupo de pacientes.
Como se detalla anteriormente en las discusiones
referentes a los estudios cuantitativos en vivo, hay objetivos
reales que se pueden usar como directrices en relación con las
pruebas preclínicas antes de proceder al tratamiento clínico. Sin
embargo, esto es más un asunto de efectividad del costo que de
utilidad global, y es un mecanismo para seleccionar los compuestos y
dosis más ventajosos. Con respecto a su utilidad básica, cualquier
construcción o combinación de las mismas que dé como resultado una
trombosis consistente detectable y efectos antitumor todavía
definirá una invención útil. Podrán observarse efectos trombóticos y
necróticos entre aproximadamente 10% y aproximadamente
40-50% de los vasos de sangre del tumor y de los
tejidos del tumor, observándose hasta entre aproximadamente 50% y
aproximadamente 99% de estos efectos. También se entenderá que aún
en circunstancias en donde los efectos antitumor de la construcción
de Factor de Tejido y combinaciones están hacia el extremo inferior
de este rango, puede ser que esta terapia sea igualmente o hasta más
efectiva que todas las otras terapias conocidas en el contexto de
los objetivos de tumor particulares. Desafortunadamente, es evidente
a un médico que ciertos tumores no se pueden tratar efectivamente a
plazo medio o a largo plazo, pero esto no niega la utilidad de la
presente terapia, particularmente cuando es tan efectiva como otras
estrategias generalmente propuestas.
Para diseñar dosis apropiadas de las
construcciones y combinaciones de Factor de Tejido de coagulación
deficiente, fácilmente se puede extrapolar de los estudios animales
descritos en la presente descripción con el fin de llegar a dosis
adecuadas para la administración clínica. Para lograr esta
conversión, se consideraría la masa de los sustancias administradas
por masa unitaria del animal experimental, y luego se considerarían
las diferencias en el área de superficie corporal entre el animal
experimental y el paciente humano. Todos estos cálculos son muy
conocidos y de rutina para los expertos en la técnica. Por ejemplo,
tomando la dosis exitosa de 16 microgramos por ratón (peso corporal
total de aproximadamente 20 gramos), y aplicando el cálculo señalado
anteriormente, la dosis equivalente para su uso en un paciente
humano sería de aproximadamente 2 miligramos. De conformidad con lo
anterior, usando esta información, los inventores tienen en cuenta
que dosis útiles de Factor de Tejido de coagulación deficiente para
su uso en la administración humana sería entre aproximadamente 0,2
miligramos y aproximadamente 200 miligramos de la construcción de
Factor de Tejido por paciente. No obstante este rango establecido,
se entenderá que, dados los parámetros y la guía detallada
presentada anteriormente, todavía se abarcarán otras variaciones en
los rangos activos u óptimos dentro de la presente invención.
Las dosis tenidas en cuenta por lo tanto
generalmente estarán entre aproximadamente 0,2 miligramos y
aproximadamente 180 miligramos; entre 0,5 y aproximadamente 160
miligramos; entre 1 y aproximadamente 150 miligramos; entre
aproximadamente 5 y aproximadamente 125 miligramos; entre
aproximadamente 10 y aproximadamente 100 miligramos; entre
aproximadamente 15 y aproximadamente 80 miligramos; entre
aproximadamente 20 y aproximadamente 65 miligramos; entre
aproximadamente 30 y aproximadamente 50 miligramos; aproximadamente
40 miligramos; o en cualquier rango particular usando cualquiera de
las dosis a título de ejemplo citadas anteriormente o cualquier
valor intermedio entre los rangos establecidos particulares. Aunque
las dosis alrededor de 1 miligramo, 2 miligramos, 3 miligramos, 4
miligramos y 5 miligramos se prefieren actualmente, se entenderá que
dosis menores pueden ser más adecuadas en combinación con otras
sustancias, y que todavía se pueden tolerar dosis más altas,
particularmente dado el hecho de que las sustancias de Factor de
Tejido para su uso en la invención no son por sí mismas citotóxicas
y aún si se presenta algún efecto colateral adverso, éste no
necesariamente daría como resultado la coagulación que no pudiera
ser contrarrestada por mecanismos homeostáticos normales, lo que se
cree que disminuye las oportunidades de toxicidad significativa en
tejidos sanos.
La intención de los regímenes terapéuticos es
generalmente producir los máximos efectos antitumor y al mismo
tiempo mantener la dosis debajo de los niveles asociados con
toxicidad inaceptable. Además de variar la misma dosis, el régimen
de administración también se puede adaptar para optimizar la
estrategia de tratamiento. Una estrategia de tratamiento actualmente
preferente es administrar entre aproximadamente 0,2 miligramos, y
aproximadamente 200 miligramos de la construcción de Factor de
Tejido o combinación de los mismos aproximadamente 3 veces en
aproximadamente un periodo de 7 días. Por ejemplo, las dosis se
darían aproximadamente el día 1, día 3 ó 4 y día 6 ó 7. Para
administrar las mismas dosis particulares, se preferiría
proporcionar una composición farmacéuticamente aceptable al paciente
sistémicamente. Generalmente se prefiere la inyección intravenosa, y
el método más preferente es emplear una infusión continua durante un
periodo de tiempo aproximadamente 1 ó 2 horas más o menos. Aunque no
se requiere determinar estos parámetros antes del tratamiento usando
la presente invención, deberá indicarse que los estudios detallados
en la presente descripción dan como resultado como mínimo algo de
trombosis, observándose específicamente en los vasos sanguíneos de
un tumor sólido dentro de aproximadamente 30 minutos de la
inyección, y las células del tumor mismas comienzan a morir dentro
de aproximadamente 3 a 4 horas. Generalmente se observa la extensión
de la necrosis del tumor en las siguientes aproximadamente 24 horas,
hasta e incluyendo más del 90% de necrosis.
Los métodos se pueden combinar con cualquier otro
método generalmente empleado en el tratamiento de la enfermedad o
desorden particular que el paciente presenta. Por ejemplo, en
relación con el tratamiento de tumores sólidos, los métodos se
pueden usar en combinación con enfoques clásicos, tales como
cirugía, radioterapia y similares. En tanto un enfoque terapéutico
no se sepa que es perjudicial en sí mismo, o contrarreste la
efectividad de la terapia del Factor de Tejido, se tiene en cuenta
su combinación con la presente invención. Cuando se usan una o más
sustancias en combinación con la terapia de Factor de Tejido, no se
requiere que los resultados combinados se sumen de los efectos
observados cuando cada tratamiento se lleva a cabo por separado,
aunque esto es evidentemente deseable, y no hay requerimiento
particular para que el tratamiento combinado exhiba efectos
sinérgicos, aunque esto es ciertamente posible y ventajoso.
En términos de cirugía, cualquier intervención
quirúrgica se puede practicar en combinación con la presente
invención. En relación con la radioterapia, se tiene en cuenta
cualquier mecanismo para inducir el daño de ADN localmente dentro de
las células del tumor, tal como la irradiación \gamma, rayos X,
irradiación ultravioleta, microondas y hasta emisiones electrónicas
y similares. La administración dirigida de radioisótopos a las
células del tumor también se tiene en cuenta, y esto se puede usar
en relación con un anticuerpo diana u otros elementos diana u
objetivos. La terapia de citoquina también ha demostrado ser
compañero efectivo para regímenes terapéuticos combinados. Se pueden
emplear varias citoquinas en estos enfoques combinados. Ejemplos de
citoquinas incluyen IL-1\alpha
IL-1\beta, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10, IL-11,
IL-12, IL-13,
TGF-\beta, GM-CSF,
M-CSF, G-CSF, TNF\alpha,
TNF\beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF,
IFN-\alpha, IFN-\beta,
IFN-\gamma. Las citoquinas se administran de
acuerdo con regímenes estándar, consistentes con indicaciones
clínicas tales como el estado del paciente y la toxicidad relativa
de la citoquina.
En ciertas realizaciones, la presente invención
muestra que la actividad antitumor del Factor de Tejido truncado
aumenta cuando se administra en combinación con una sustancia
quimioterapéutica. Los mecanismos mediante los cuales los fármacos
aumentan la actividad antitumor del Factor de Tejido truncado no se
han definido con precisión, pero los inventores creen que el fármaco
mata las células del tumor proliferantes creando áreas necróticas
que causan que las células fagocíticas infiltren el tumor.
IL-1, TNF\alpha y otras citoquinas liberadas por
las células infiltrantes activan entonces el endotelio vascular del
tumor haciendo más posible soportar la coagulación por el Factor de
Tejido truncado, un trombógeno generalmente débil. El fármaco así
aumenta la acción trombótica del Factor de Tejido truncado.
Otra posibilidad para las acciones aumentadas del
Factor de Tejido y los fármacos anticáncer es que el Factor de
Tejido truncado induce la formación de trombos en los vasos del
tumor, atrapando así el fármaco dentro del tumor. Aunque el fármaco
se elimina del resto del cuerpo, permanece dentro del tumor. Las
células del tumor se exponen entonces a una concentración mayor del
fármaco durante un periodo de tiempo mayor. Este atrapamiento del
fármaco dentro del tumor también puede hacer posible reducir la
dosis del fármaco, haciendo el tratamiento más seguro así como más
efectivo.
Independientemente de los mecanismos mediante los
cuales se logra la destrucción aumentada del tumor, los aspectos del
tratamiento combinado tienen utilidad evidente en el tratamiento
efectivo de la enfermedad. Para usar la presente invención en
combinación con la administración de una sustancia
quimioterapéutica, simplemente se administraría a un animal una
construcción de Factor de Tejido de coagulación deficiente en
combinación con la sustancia quimioterapéutica de una manera
efectiva para dar como resultado sus acciones combinadas antitumor
dentro del animal. Estas sustancias por lo tanto se proporcionarían
en una cantidad efectiva y durante un periodo de tiempo efectivo
para dar como resultado su presencia combinada dentro de la
vasculatura del tumor y sus acciones combinadas en el ambiente del
tumor. Para lograr esta meta, el Factor de Tejido y las sustancias
quimioterapéuticas se pueden administrar al animal simultáneamente,
ya sea en una sola composición o como dos composiciones distintas
usando diferentes rutas de administración.
De manera alternativa, el tratamiento de Factor
de Tejido puede preceder o seguir al tratamiento de sustancia
quimioterapéutica en intervalos que van de minutos a semanas. En
realizaciones en donde el factor quimioterapéutico y el Factor de
Tejido se aplicaron por separado al animal, generalmente se
aseguraría que un período de tiempo significativo no expiró entre el
tiempo de cada administración, de manera que la sustancia
quimioterapéutica y la composición de Factor de Tejido todavía
serían capaces de ejercer un efecto combinado ventajosamente sobre
el tumor. En estos casos, se tiene en cuenta que se tendría contacto
del tumor con ambas sustancias dentro de aproximadamente 5 minutos
hasta aproximadamente una semana de cada uno y, más preferiblemente,
dentro de 12-72 horas del otro, siendo lo más
preferente un tiempo de retardo de solamente aproximadamente
12-48 horas. En algunas situaciones, puede ser
deseable extender el período de tiempo para tratamiento
significativamente, en donde varios días (2, 3, 4, 5, 6 ó 7) o hasta
varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) transcurran entre las
administraciones respectivas. También es concebible que se desee más
de una administración del Factor de Tejido o de la sustancia
quimioterapéutica. Para lograr la regresión del tumor, ambas
sustancias se administran en una cantidad combinada efectiva para
inhibir su crecimiento independientemente de los tiempos para la
administración.
Una variedad de sustancias quimioterapéuticas se
destina para el uso en los métodos de tratamiento combinados
descritos en la presente descripción. Las sustancias
quimioterapéuticas tenidas en cuenta a título de ejemplo incluyen,
por ejemplo, etoposida (VP-16), adriamicina,
5-fluorouracil (5FU), camptotecina,
actinomicina-D, mitomicina C, cisplatin (CDDP) y
hasta peróxido de hidrógeno. En ciertas realizaciones, el uso de
etoposida ya ha mostrado ser efectivo en la regresión del tamaño del
tumor cuando se administra en combinación con las composiciones de
Factor de Tejido truncado de la presente invención.
Como lo entenderán los expertos en la técnica,
una dosis adecuada de sustancias quimioterapéuticas generalmente
será alrededor de las ya empleadas en terapias clínicas en donde las
sustancias quimioterapéuticas se administran solas o en combinación
con otras sustancias quimioterapéuticas. A título de ejemplo
solamente, se pueden usar sustancias tales como la cisplatina, y
otras sustancias alquilantes de ADN. La cisplatina se ha usado
ampliamente para tratar cáncer, con dosis eficaces usadas en
aplicaciones clínicas de 20 mg/m^{2} durante 5 días cada tres
semanas durante un total de tres cursos. La Cisplatina no se absorbe
oralmente y por lo tanto se debe aplicar por inyección
intravenosamente, subcutáneamente, intratumoralmente, o
intraperitonealmente.
Otras sustancias útiles incluyen compuestos que
interfieren con la replicación del ADN, mitosis y segregación
cromosomal. Estos compuestos quimioterapéuticos incluyen
adriamicina, también conocida como doxorrubicina, etoposida,
verapamil, podofilotoxina, y similares. Ampliamente usados en un
escenario clínico para el tratamiento de neoplasmas, estos
compuestos se administran a través de inyecciones de bolo
intravenosamente a dosis que varían de 25-75
mg/m^{2} en intervalos de 21 días para la adriamicina, hasta
35-50 mg/m^{2} para etoposida intravenosamente o
el doble de la dosis intravenosa oralmente.
Las sustancias que interrumpen la síntesis y la
fidelidad de los precursores de polinucleótido también se pueden
usar. Particularmente útiles son las sustancias que han sufrido
pruebas extensivas y están fácilmente disponibles. Como tales, se
usan preferencialmente sustancias tales como
5-fluorouracil (5-FU) para el tejido
neoplásico, haciendo esta sustancia particularmente útil para
dirigirse a células neoplásicas. Aunque bastante tóxico, el
5-fluorouracil, es aplicable en un rango amplio de
portadores, incluyendo tópicos, sin embargo la administración
intravenosa con dosis que varía de 3 a 15 mg/kg/día se usa
comúnmente.
Las sustancias quimioterapéuticas a título de
ejemplo que son útiles en relación con la terapia combinada se
indican en la Tabla II. Cada una de las sustancias indicadas en la
misma son a título de ejemplo y de ningún modo limitantes. El
técnico experto es remitido a ``Remington's Pharmaceutical
Sciences'' décima quinta edición, capítulo 33, en particular páginas
624-652. Se presentará alguna variación en dosis
necesariamente dependiendo del estado del sujeto que se está
tratando. La persona responsable para la administración, en
cualquier caso, determinará la dosis adecuada para el sujeto
individual. Más aún, para administración humana, las preparaciones
deben satisfacer las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad
general y pureza que requiere la Oficina de Normas Biológicas de la
administración de alimentos y fármacos de los Estados Unidos de
Norteamérica.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{l|l|l|l}\hline
Clase \+ Tipo de \+ Nombres no \+ Enfermedad \\ \+ Sustancia
\+ Registrados \+ \\ \+ \+ (otros \+ \\ \+ \+ nombres) \+
\\\hline \+ \+ Mecloroetamina \+ Enfermedad de Hodgkin, linfomas
\\ \+ \+ (HN _{2} ) \+ que no son de Hodgkin \\\dddcline{3}{4}
\+ \+ Ciclofosfamida \+ Leucemias linfocíticas aguda y \\ \+ \+
Ifosfamida \+ crónica, enfermedad de Hodgkin, \\ \+ \+ \+
linfomas que no son de Hodgkin, \\ \+ \+ \+ mieloma múltiple, \\
\+ \+ \+ neuroblastoma, seno, ovario, \\ \+ Mostazas \+ \+
pulmón, tumor de Wilms, Cérvix, \\ \+ de \+ \+ testículos,
sarcomas de tejido \\ \+ Nitrógeno \+ \+blando \\\dddcline{3}{4}
\+ \+ Melfalan (L- \+ Mieloma múltiple, seno, ovario \\ \+ \+
sarcolisina) \+ \\\dddcline{3}{4} \+ \+ \+ Leucemia linfocítica
crónica, \\ \+ \+ Clorambucil \+ macroglobulinemia primaria, \\
\+ \+ \+ enfermedad de Hodgkin, linfomas \\ \+ \+ \+ que no
son de Hodgkin \\\dddcline{2}{4} \+ Etileni- \+ Hematilmela- \+
Ovario \\ \+ menas y \+ mina \+ \\ \+ Metilme- \+ \+
\\\dddcline{3}{4} Sustancias \+ laminas \+ Tiotepa \+ Vejiga,
seno, ovario, \\\dddcline{2}{4} alquilantes \+ Sulfonato \+ \+ \\
\+ de \+ Busulfan \+ Leucemia granulocítica crónica \\ \+
alquilo \+ \+ \\\dddcline{2}{4} \+ \+ \+ Enfermedad de Hodgkin,
linfomas \\ \+ \+ Carmustina \+ que no son de Hodgkin, tumores
\\ \+ \+ (BCNU) \+ primarios del cerebro, mieloma \\ \+ \+
\+ múltiple, melanoma maligno \\\dddcline{3}{4} \+ \+ \+
Enfermedad de Hodgkin, linfomas \\ \+ Nitrosou- \+ Lomustine \+
que no son de Hodgkin, tumores \\ \+ reas \+ (CCNU) \+ del
cerebro primarios, pulmón \\ \+ \+ \+ de célula pequeña
\\\dddcline{3}{4} \+ \+ Semustina \+ Tumores de cerebro
primarios, \\ \+ \+ (metil- CCNU) \+ estómago, colon
\\\dddcline{3}{4} \+ \+ Estreptozocina \+ Insulinoma pancreático
maligno, \\ \+ \+ (estreptozoto- \+ carcinoide maligno \\ \+
\+ cina) \+ \\ \+ Triazinas \+ Dacarbazina \+ Melanoma maligno,
enfermedad de \\ \+ \+ (DTIC; \+ Hodgkin, sarcomas de tejido \\
\+ \+ dimetiltria- \+ blando \\ \+ \+ zenoimidazol- \+ \\ \+
\+ carboxamide) \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
TABLA II
(continuación)
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{l|l|l|l}\hline
Clase \+ Tipo de \+ Nombres no \+ Enfermedad \\ \+ Sustancia
\+ Registrados \+ \\ \+ \+ (otros \+ \\ \+ \+ nombres) \+
\\\hline \+ \+ Metotrexato \+ Leucemia linfocítica aguda, \\
\+ Análogos \+ (ametopterina) \+ coriocarcinoma, micosis \\
Antimetabo- \+ de Ácido \+ \+ fungoides, seno, cabeza y \\ litos
\+ Fólico \+ \+ cuello, pulmón, sarcoma \\ \+ \+ \+
osteogénico \\\dddcline{2}{4} \+ \+ Fluoracil \+ Seno, colon,
estómago, \\ \+ \+ (5-fluoroura- \+ páncreas,
ovario, cabeza y \\ \+ \+ cil; 5-FU) \+ cuello,
vejiga urinaria, \\ \+ Análogos \+ Floxuridina \+ lesiones de la
piel premalignas \\ \+ de \+ (fluorodeso- \+ (tópicas) \\ \+
Pirimi- \+ xiuridina; \+ \\ \+ dina \+ FUdR) \+
\\\dddcline{3}{4} \+ \+ Citarabine \+ Leucemias granulocítica
aguda y \\ \+ \+ (citosina \+ linfocítica aguda \\ \+ \+
arabinosida) \+ \\\hline \+ \+ Mercaptopurina \+ Leucemias
linfocítica aguda, \\ \+ \+ (6-mercaptopu- \+
granulocítica aguda y \\ \+ \+ rina; 6-MP) \+
granulocítica crónica \\\dddcline{2}{4} \+ Análogos \+ Tioguanina
\+ Leucemias linfociticas agudas, \\ \+ de Purina \+
(6-tioguanina; \+ granulocítica aguda y \\ \+ e
\+ TG) \+ granulocítica crónica \\ \+ Inhibido- \+ \+
\\\dddcline{3}{4} \+ res \+ Pentostatin \+ Leucemia de células
pilosas, \\ \+ Relacio- \+ (2-deoxicofor- \+
micosis fungoide, leucemia \\ \+ nados \+ micina) \+ linfocítica
crónica \\\hline \+ \+ Vinblastina \+ Enfermedad de Hodgkin,
linfomas \\ \+ \+ (VLB) \+ que no son de Hodgkin, seno, \\ \+
\+ \+ testículos \\\dddcline{3}{4} \+ Alcaloi- \+ \+ Leucemia
linfocítica aguda, \\ \+ des vinca \+ \+ neuroblastoma, tumor de
Wilms, \\ \+ \+ Vincristina \+ rabdomiosarcoma, enfermedad de \\
\+ \+ \+ Hodgkin, linfomas que no son de \\ \+ \+ \+
Hodgkin, pulmón de célula \\ \+ \+ \+ pequeña \\\dddcline{2}{4}
\+ \+ \+ Testículos, pulmón de célula \\ \+ Epipodo- \+
Etoposida \+ pequeña y otros pulmones, seno, \\ \+ filotoxi- \+
Tertiposida \+ enfermedad de Hodgkin, linfomas \\ \+ nas \+ \+
que no son de Hodgkin, leucemia \\ \+ \+ \+ granulocítica aguda,
sarcoma de \\ \+ \+ \+ Kaposi \\\dddcline{2}{4} Productos \+ \+
\+ \\ naturales \+ \+ Dactinomicina \+ Coriocarcinoma, tumor de
Wilms, \\ \+ \+ (actinomicina \+ rabdomiosarcoma, testículos, \\
\+ \+ D) \+ sarcoma de Kaposi \\\dddcline{3}{4} \+ \+
Daunorrubicina \+ Leucemias granulocítica aguda y \\ \+ \+
(daunomicina; \+ linfocítica aguda \\ \+ \+ rubidomicina) \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
TABLA II
(continuación)
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{l|l|l|l}\hline
Clase \+ Tipo de \+ Nombres no \+ Enfermedad \\ \+ Sustancia
\+ Registrados \+ \\ \+ \+ (otros \+ \\ \+ \+ nombres) \+
\\\hline Productos \+ \+ \+ Sarcomas de tejido blando, \\
naturales \+ \+ \+ osteogénico y otros; enfermedad \\ (sigue)
\+ Antibió- \+ Doxorrubicina \+ de Hodgkin, linfomas que no son \\
\+ ticos \+ \+ de Hodgkin, leucemias agudas, \\ \+ \+ \+
seno, genitourinario, tiroides, \\ \+ \+ \+ pulmón, estómago,
neuroblastoma \\ \+ \+ \+ \\ \+ \+ \+ Testículos, cabeza y
cuello, \\ \+ \+ Bleomicina \+ piel, esófago, pulmón y vías \\
\+ \+ \+ genitourinarias; enfermedad de \\ \+ \+ \+ Hodgkin,
linfomas que no son de \\ \+ \+ \+ Hodgkin \\\hline \+ \+
Plicamicina \+ Testículos, hipercalcemia \\ \+ \+ (mitramicina)
\+ maligna \\\dddcline{3}{4} \+ \+ Mitomicina \+ Estómago,
cérvix, colon, seno, \\ \+ \+ (mitomicina C) \+ páncreas,
vejiga, cabeza y \\ \+ \+ \+ cuello \\\dddcline{2}{4} \+
Enzimas \+ L-Asparaginasa \+ Leucemia linfocítica
aguda \\\dddcline{2}{4} \+ Modifica- \+ \+ Leucemia de células
pilosas, \\ \+ dores de \+ \+ sarcoma de Kaposi, melanoma, \\
\+ Respues- \+ Interferón \+ carcinoide, célula renal, \\ \+ tas
\+ alfa \+ ovario, vejiga, linfomas que no \\ \+ Biológi- \+
\+ son de Hodgkin, micosis \\ \+ cas \+ \+ fungoides, mieloma
múltiple, \\ \+ \+ \+ leucemia granulocítica crónica \\\hline
\+ Complejos \+ \+ Testículos, ovario, vejiga, \\ \+ de \+
Cisplatin \+ cabeza y cuello, pulmón, \\ \+ Coordina- \+
( cis -DDP) \+ tiroides, cérvix, endometrio, \\ \+ ción \+
Carboplatin \+ neuroblastoma, sarcoma \\ \+ Platino \+ \+
osteogénico \\\dddcline{2}{4} \+ Antrace- \+ Mitoxantrona \+
Leucemia granulocítica aguda, \\ Sustancias \+ nediona \+ \+
seno \\\dddcline{2}{4} varias \+ Urea \+ \+ Leucemia
granulocítica crónica, \\ \+ Sustitui- \+ Hidroxiurea \+
policitemia vera, trombocitosis \\ \+ da \+ \+ esental, melanoma
maligno \\\dddcline{2}{4} \+ Derivado \+ Procarbazina \+ \\ \+
Metil \+ (N-metilhidra- \+ Enfermedad de Hodgkin
\\ \+ hidrazina \+ zina, MHI) \+ \\ \+ \+ \+ \\ \+ Adreno- \+
Mitotano \+ \\ \+ cortical \+ (o,p'-DDD) \+
Corteza adrenal
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
TABLA II
(continuación)
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{l|l|l|l}\hline
Clase \+ Tipo de \+ Nombres no \+ Enfermedad \\ \+ Sustancia
\+ Registrados \+ \\ \+ \+ (otros \+ \\ \+ \+ nombres) \+
\\\hline \+ Supresor \+ Aminogluteti- \+ Seno \\ \+ \+ mida
\+ \\\hline \+ Adreno- \+ Prednisona \+ Leucemias linfocítica
aguda y \\ \+ cortico- \+ (otras varias \+ crónica, linfomas que
no son de \\ \+ esteroi- \+ preparaciones \+ Hodgkin, enfermedad
de Hodgkin, \\ \+ des \+ equivalentes \+ seno \\ \+ \+
disponibles) \+ \\\dddcline{2}{4} \+ \+ Hidroxiproges- \+ \\ \+
\+ terona \+ \\ \+ Progesti- \+ caproato \+ Endometrio, seno \\
\+ na \+ Medroxiproges- \+ \\ Hormonas y \+ \+ terona \+ \\
antagonis- \+ \+ Acetato de \+ \\ tas \+ \+ Megestrol \+
\\\dddcline{2}{4} \+ \+ Dietilestil- \+ \\ \+ \+ bestrol \+ \\
\+ \+ Etinil \+ \\ \+ Estrógeno \+ estradiol \+ Seno,
próstata \\ \+ \+ (otras \+ \\ \+ \+ preparaciones \+ \\ \+
\+ disponibles) \+ \\\dddcline{2}{4} \+ Anties- \+ Tamoxifén \+
Seno \\ \+ trógeno \+ \+ \\\dddcline{2}{4} \+ \+ Testosterona
\+ Seno \\ \+ Andróge- \+ propionato \+ \\ \+ nos \+
Fluoximestero- \+ \\ \+ \+ na (otras \+ \\ \+ \+ preparaciones
\+ \\ \+ \+ disponibles) \+ \\\dddcline{2}{4} \+ Antian- \+
Flutamida \+ Próstata \\ \+ drógeno \+ Leuprolida \+ Próstata
\\ \+ Análogo \+ \+ \\ \+ de \+ \+ \\ \+ hormona \+ \+ \\ \+
que \+ \+ \\ \+ libera \+ \+ \\ \+ Gonado- \+ \+ \\ \+ tropina
\+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Se pueden usar una o más construcciones de Factor
de Tejido de coagulación deficiente de la invención en combinación
con inmunotoxinas (ITs) y/o coaguligandos en los cuales la parte
objetivo de los mismos (por ejemplo, anticuerpo o ligando) se dirige
a un marcador relativamente específico de las células tumorales, la
vasculatura del tumor o el estroma del tumor. En común con las
sustancias quimioterapéuticas comentadas anteriormente, es posible
que el uso de una construcción de Factor de Tejido de coagulación
deficiente en combinación con una sustancia tóxica dirigida (IT) o
coagulante (coaguligando) dará como resultado que sustancias
distintas se dirijan contra diferentes objetivos dentro del ambiente
del tumor. Esto debería conducir a resultados aditivos, marcadamente
mayores que los aditivos o hasta sinérgicos.
En relación con la preparación y uso de
inmunotoxinas a título de ejemplo y coaguligandos, las siguientes
descripciones de solicitudes de patentes complementan además los
presentes conocimientos: Patentes U.S.A. con números de serie
07/846.349; 08/295.868; 08/205.330; 08/350.212; 08/273.567; y
08/482.369.
Como mínimo una región de enlace de las segundas
sustancias empleadas en combinación con las construcciones de Factor
de Tejido truncado de la presente invención será un componente capaz
de administrar una toxina o una sustancia coagulante a la región del
tumor, es decir, capaz de localizarse dentro de un sitio de
localización del tumor. Ya que una distribución algo más amplia de
la sustancia coagulante no se asociará con efectos secundarios
severos, hay un requisito menos estricto impuesto sobre el elemento
objetivo de los coaguligandos que con las inmunotoxinas. La
sustancia objetivo se puede dirigir a componentes de las células del
tumor; componentes de la vasculatura del tumor; componentes que se
unen o que se asocian generalmente con células del tumor;
componentes que se unen o que están generalmente asociadas con, la
vasculatura del tumor; componentes de la matriz extracelular del
tumor o estroma o aquellos unidos a los mismos; y hasta tipos de
células encontradas dentro de la vasculatura del tumor.
Con los coaguligandos, disminuye la carga de las
restricciones del objetivo, por ejemplo, que se imponen cuando se
usan inmunotoxinas. Por lo tanto, lograr objetivos específicos
significa que la coagulación se promueve en la vasculatura del tumor
en relación con la vasculatura en sitios que no son de localización
del tumor. De este modo, el objetivo específico de un coaguligando
es un término funcional en vez de un término puramente físico en
relación con las propiedades de la biodistribución de la sustancia
objetivo, y no es improbable que los objetivos útiles no puedan
estar completamente restringidos al tumor, y que los ligandos
objetivos que son efectivos para promover la coagulación específica
del tumor, sin embargo, se puedan encontrar en otros sitios del
cuerpo después la administración.
Las células malignas que configuran al tumor se
pueden atacar usando un ligando o un ligando biespecífico que tenga
una región capaz de unirse a un marcador relativamente específico de
la célula del tumor. Las toxinas matan las células del tumor y, en
ese enlace con las células del tumor se localizará una sustancia
coagulante asociada al tumor, y se logrará la coagulación
específica.
Se han descrito muchos de los llamados
``antígenos del tumor'', cualquiera de los cuales se puede emplear
como objetivo en relación con los aspectos combinados de la presente
invención. A continuación se numera un gran número de antígenos
asociados con tumores sólidos a título de ejemplo. La preparación y
uso de anticuerpos contra esos antígenos está muy bien dentro de la
experiencia de la técnica, y los anticuerpos a título de ejemplo
incluyen sitios de localización de tumores ginecológicos: OC 125; OC
133; OMI; Mo v1; Mo v2; 3C2; 4C7; ID_{3};
DU-PAN-2; F 36/22;
4F_{7}/7A_{10}; OV-TL3; B72.3; DF_{3};
2C_{8}/2F_{7}; MF 116; Mov18; CEA 11-H5; CA
19-9(1116NS 19-9);
H17-E2; 791T/36; NDOG_{2}; H317, 4D5, 3H4, 7C2,
6E9, 2C4, 7F3, 2H11, 3E8, 5B8, 7D3, SB8; HMFG2; 3.14.A3; sitios de
localización de tumor de senos: DF3; NCRC-11; 3C6F9;
MBE6; CLNH5; MAC 40/43; EMA; HMFG1 HFMG2; 3.15.C3; M3, M8, M24;
M18; 67-D-11; D547Sp, D75P3, H222;
Anti-EGF; LR-3; TA1; H59;
10-3D-2; HmAB1,2; MBR 1,2,3;
24\cdot17\cdot1; 24\cdot17\cdot2 (3E1.2); F36/22.M7/105;
C11, G3, H7; B6\cdot2; B1\cdot1; Cam 17\cdot1; SM3; SM4;
C-Mul (566); 4D5 3H4, 7C2, 6E9, 2C4, 7F3, 2H11, 3E8,
5B8, 7D3, 5B8; OC 125; MO v2;
DU-PAN-2; 4F_{7}/7A_{10};
DF_{3}; B72\cdot3; cccccCEA 11; H17-E2;
3\cdot14\cdotA3; FO23C5; de sitios de localización de tumor
colorrectales: B72\cdot3; (17-1A)
1083-17-1A; CO17-1A;
ZCE-025; AB2;
HT-29-15; 250-30.6;
44X14; A7; GA73\cdot3; 791T/36; 28A32; 28.19.8; X
MMCO-791; DU-PAN-2;
ID_{3}; CEA 11-H5; 2C_{8}/2F_{7};
CA-19-9 (1116NS
19-9); PR5C5; PR4D2; PR4D1; de sitios de melanoma
4\cdot1; 8.2M_{17}, 96\cdot5; 118.1, 132.2, (113\cdot2);
L_{1}, L_{10}, R_{10}(R_{19}); I_{12}; K_{5};
6\cdot1; R24; 5\cdot1; 225.28S; 465.12S; 9\cdot2\cdot27;
F11; 376.96S; 465.12S; 15\cdot75; 15\cdot95;
Mel-14; Mel-12;
Me3-TB7; 225.28SD; 763.24TS; 705F6; 436910; M148;
de tumores gastrointestinales: ID3;
DU-PAN-2; OV-TL3;
B72\cdot3; CEA 11-H5; 3\cdot14\cdotA3; CCOLI;
CA-19-9 (1116NS
19-9) y CA50; OC125; de tumores de pulmón: 4D5 3H4,
7C2, 6E9, 2C4, 7F3, 2H11, 3E8, 5B8, 7D3, SB8; MO v2; B72\cdot3;
DU-PAN-2; CEA 11-H5;
MUC 8-22; MUC 2-63; MUC
2-39; MUC 7-39; y de tumores
misceláneos: PAb 240; PAb 246; PAb 1801; ERIC\cdot1; M148; FMH25;
6\cdot1; CA1; 3F8; 4F_{7}/7A_{10}; 2C_{8}/2F_{7}; CEA
11-H5.
Otro medio de definir un tumor dirigible es en
términos de las características célula del tumor en sí misma, en vez
de describir las propiedades bioquímicas de un antígeno expresado
por la célula. De conformidad con lo anterior, el técnico experto se
refiere al catálogo ATCC para el fin de ejemplificar líneas de
células tumorales humanas que están disponibles para el público (del
catálogo ATCC). Las líneas celulares a título de ejemplo incluyen
J82; RT4; ScaBER; T24; TCCSUP; 5637;
SK-N-MC;
SK-N-SH; SW 1088; SW 1783;
U-87 MG; U-118 MG;
U-138 MG; U-373 MG; Y79;
BT-20; BT-474; MCF7;
MDA-MB-134-VI;
MDA-MD-157;
MDA-MB-175-VII;
MDA-MB-361;
SK-BR-3; C-33 A;
HT-3; ME-180; MS751; SiHa;
JEG-3; Caco-2;
HT-29; SK-CO-1; HuTu
80; A-253; FaDu; A-498;
A-704; Caki-1;
Caki-2; SK-NEP-1; SW
839; SK-HEP-1;
A-427; Calu-1;
Calu-3; Calu-6;
SK-LU-1;
SK-MES-1; SW 900; EB1; EB2;
P3HR-1; HT-144;
Malme-3M; RPMI-7951;
SK-MEL-1;
SK-MEL-2;
SK-MEL-3;
SK-MEL-5;
SK-MEL-24;
SK-MEL-28;
SK-MEL-31; Caov-3;
Caov-4; SK-OV-3; SW
626; Capan-1; Capan-2; DU 145;
A-204; Saos-2;
SK-ES-1;
SK-LMS-1; SW 684; SW872; SW982;
SW1353; U-2 OS; Malme-3; KATO III;
Cate-1B; Tera-1;
Tera-2; SW579; AN3 CA;
HEC-1-A;
HEC-1-B;
SK-UT-1;
SK-UT-1B; SW 954; SW 962;
NCI-H69; NCI-H128;
BT-483; BT-549; DU4475;
HBL-100; Hs 578Bst; Hs 578T;
MDA-MB-330;
MDA-MB-415;
MDA-MB-435S;
MDA-MB-436;
MDA-MB-453;
MDA-MB-468; T-47D;
Hs766T; Hs 746T; Hs 695T; Hs 683; Hs 294T; Hs 602; JAR; Hs 445; Hs
700T; H4; Hs 696; Hs913T; Hs 729; FHs 738Lu; FHs 173We; FHs 738 B1;
NIH:0VCAR-3; Hs 67; RD-ES; ChaGo
K-1; WERI-Rb-1;
NCI-H446; NCI-H209;
NCI-H146; NCI-H441;
NCI-H82; H9; NCI-H460;
NCI-H596; NCI-H676B;
NCI-H345; NCI-H820;
NCI-H520; NCI-H661;
NCI-H510A; D283 Med; Daoy; D341 Med;
AML-193 y MV4-11.
Se puede consultar el catálogo ATCC de cualquier
año posterior para identificar otras líneas celulares adecuadas.
También, si se desea un tipo celular particular, el medio para
obtener estas células, y/o su fuente disponible instantánea, será
muy conocida para los expertos en la técnica particular. Un análisis
de la literatura científica revelará fácilmente una elección
adecuada de célula para cualquier tipo de célula tumoral deseada que
se va a atacar.
Un elemento directo para reconocer un objetivo
antígeno del tumor es a través del uso de un anticuerpo que tiene
una afinidad de unión para el antígeno particular. Se conocen un
gran número de anticuerpos que se dirigen contra antígenos de
tumores sólidos. Ciertos anticuerpos antitumor útiles están
mencionados anteriormente. Sin embargo, como los expertos en la
técnica podrán darse cuenta rápidamente, ciertos anticuerpos
mencionados no tendrán las propiedades bioquímicas adecuadas, o
pueden no tener suficiente especificidad tumoral, para ser útiles
terapéuticamente. Un ejemplo es MUC8-22 que reconoce
un antígeno citoplásmico. Los anticuerpos tales como estos
generalmente serán útiles solamente en ambientes de investigación,
tales como en sistemas de modelos o ensayos de análisis.
Hablando generalmente, los anticuerpos útiles en
estos aspectos de la presente invención preferiblemente reconocerán
antígenos que son accesibles sobre la superficie celular y que están
preferencialmente, o específicamente, expresados por células
tumorales. Estos anticuerpos preferiblemente también exhibirán
propiedades de gran afinidad, tales como exhibir un K_{d} de
<200 nM, y preferiblemente, de <100 nM, y no mostrarán
reactividad significativa con tejidos normales vitales, tales como
uno o más tejidos seleccionados del corazón, riñón, cerebro, hígado,
médula ósea, colon, seno, próstata, tiroides, vesícula biliar,
pulmón, adrenales, músculo, fibras nerviosas, páncreas, piel, u
otros órganos o tejidos vitales en el cuerpo humano. Los tejidos
``vitales'' que son más importantes para los fines de la presente
invención, desde el punto de vista de baja reactividad, incluyen
corazón, riñón, tejidos del sistema nervioso central y periférico e
hígado. El término ``reactividad significativa'', como se usa en la
presente descripción, se refiere a un anticuerpo o fragmento de
anticuerpo, que, cuando se aplica al tejido particular bajo
condiciones convenientes para inmunohistoquímica, obtendrá ya sea
ningún manchado o un manchado despreciable con solamente pocas
células positivas dispersas entre un campo de la mayoría de células
negativas.
Los anticuerpos particularmente prometedores
destinados a su uso en la presente invención son los que tienen
selectividad alta para el tumor sólido. Por ejemplo, los anticuerpos
que se enlazan con TAG 72 y la proteína
proto-oncógena HER-2, que se
encuentran selectivamente sobre las superficies de muchos cánceres
del seno, pulmón y colorrectal (Thor y colaboradores, 1986; Colcher
y colaboradores, 1987; Shepard y colaboradores, 1991); MOv18 y
OV-TL3 y anticuerpos que se enlazan a la proteína
de núcleo de mucina de la leche y al glóbulo de grasa de leche
humana (Miotti y colaboradores, 1985; Burchell y colaboradores,
1983); y el anticuerpo 9.2.27 que se une a los antígenos de melanoma
M_{r} alto (Reisfeld y colaboradores, 1982). Otros anticuerpos
útiles son aquellos contra la proteína que se enlaza a folato, que
se sabe que se expresa homogéneamente en casi todos los carcinomas
de ovarios; aquellos contra la familia erb de oncógenos que
se sobreexpresan en carcinomas de células escamosas y la mayoría de
los gliomas; y otros anticuerpos conocidos para ser sujetos de
evaluación preclínica y clínica continua.
Los anticuerpos B3, KSI/4, CC49, 260F9,
XMMCO-791, D612 y SM3 se cree que son
particularmente convenientes para su uso en realizaciones clínicas,
siguiendo la rutina de pruebas preclínicas estándar practicada en la
técnica. B3 (Patente U.S.A. número 5.242.813; Brinkmann y
colaboradores, 1991) tiene el número de acceso ATCC HB 10573; KS1/4
se puede hacer como se describe en la Patente U.S.A. 4.975.369; y
D612 (Patente U.S.A. número 5.183.756) tiene el número de acceso de
ATCC, HB 9796.
Otros medios para definir los objetivos asociados
al tumor están en términos de las características de la célula del
tumor, en vez de describir las propiedades bioquímicas de un
antígeno expresado por la célula. De conformidad con lo anterior los
inventores tienen en cuenta que cualquier anticuerpo que se enlaza
preferencialmente a una célula del tumor se puede usar como el
componente objetivo de una inmunotoxina o coaguligando. El enlace de
célula tumoral preferencial de nuevo se basa en el anticuerpo que
exhibe alta afinidad para la célula del tumor y que no tiene
reactividad significativa con las células o tejidos normales
vitales, como se definió anteriormente.
La invención también da a conocer varios medios
para generar un anticuerpo para su uso en los métodos de coagulación
dirigida descritos en la presente descripción. Para generar un
anticuerpo específico de célula tumoral, se inmunizaría un animal
con una composición que comprende un antígeno de célula tumoral y,
como se describe más completamente adelante, se selecciona un
anticuerpo resultante con especificidad adecuada. La composición
inmunizante puede contener una preparación purificada, o
parcialmente purificada, de cualquiera de los antígenos mencionados
anteriormente; una composición, tal como una preparación de
membrana, enriquecida para cualquiera de los antígenos mencionados
anteriormente; cualquiera de las células mencionadas en la lista
anterior; o una mezcla o población de células que incluyan
cualquiera de los tipos de células mencionados anteriormente.
Desde luego, independientemente de la fuente del
anticuerpo, en la práctica de la invención en tratamiento humano, es
preferible asegurar por adelantado que el tumor objetivo
clínicamente exprese el antígeno finalmente seleccionado. Esto se
logra por medio de un ensayo bastante directo, que involucra probar
antigénicamente una muestra de tejido del tumor, por ejemplo, una
biopsia quirúrgica, o tal vez probar la circulación oculta del
antígeno. Esto se puede llevar a cabo fácilmente en un ensayo de
análisis inmunológico tal como un ensayo ELISA (inmunosorbente de
enzima enlazante), en donde la afinidad del enlace de anticuerpos a
partir de un ``banco'' de hibridomas se prueba para determinar su
reactividad contra el tumor. Los anticuerpos que demuestran
selectividad y afinidad del tumor adecuadas se seleccionan para la
preparación de los anticuerpos biespecíficos de la presente
invención.
Debido al fenómeno muy conocido de la reactividad
cruzada, se tiene en cuenta que anticuerpos útiles pueden ser
resultado de protocolos de inmunización en los cuales los antígenos
originalmente empleados se derivaron de un animal, tal como un ratón
o un primate, además de aquéllos en los cuales se obtuvieron
antígenos originales a partir de una célula humana. Cuando se usan
antígenos de origen humano, se pueden obtener de una línea celular
de tumor humano, o se pueden preparar obteniendo una muestra
biológica de un paciente particular en cuestión. Sin duda, se
conocen métodos para el desarrollo de anticuerpos que se hacen ``a
la medida del cliente'' para el tumor del paciente (Stevenson y
colaboradores, 1990) y se tienen en cuenta para su uso en relación
con esta invención.
Además del uso de anticuerpos, se pueden emplear
otros ligandos para dirigir una sustancia coagulante a un sitio de
localización del tumor ligando a un antígeno de célula tumoral. Para
los antígenos del tumor que tienen receptores sobreexpresados
(receptor estrógeno, receptor EGF), o receptores mutantes, se
podrían usar los ligandos correspondientes como sustancias
objetivo.
De una manera análoga a los ligandos receptores
de células endoteliales, puede haber muchos componentes que se
enlacen específicamente, o preferencialmente, a las células
tumorales. Por ejemplo, si un antígeno del tumor es receptor
sobreexpresado, la célula tumoral se puede recubrir con un ligando
específico en vivo. Parece que el ligando podría entonces dirigirse
con un anticuerpo contra el ligando, o con una forma del mismo
receptor. Ejemplos específicos de este tipo de sustancias objetivo
son anticuerpos contra TIE-1 o ligandos
TIE-2, anticuerpos contra el factor de plaqueta 4, y
proteína enlazante de adhesión de leucocito.
En otras realizaciones, se pueden emplear los
factores de tejido en combinación con las inmunotoxinas o
coaguligandos que se enlazan a una molécula objetivo que se expresa
específica o preferencialmente en un sitio de enfermedad distinto de
un tumor.
Las moléculas objetivo a título de ejemplo
asociadas con otras células enfermas incluyen, por ejemplo,
moléculas de adhesión de leucocito, que se asocian con psoriasis;
FGF, que se asocia con retinopatía diabética proliferativa; factor 4
de plaqueta, que se asocia con el endotelio activado de varias
enfermedades; y VEGF, que se asocia con enfermedad proliferativa
vascular. Se cree que un animal o paciente que tiene cualquiera de
las enfermedades anteriores se beneficiaría de la inducción
específica de coagulación en el sitio de la enfermedad y
opcionalmente de la administración de toxina dirigida.
Las enfermedades que se sabe que tienen una
patología angiodependiente común, como se describen en Klagsburn y
Folkman (1990), también se pueden tratar como se describe en la
presente descripción. En particular, un ligando dirigido a célula
endotelial vascular o un ligando dirigido a estroma se usarán para
lograr la coagulación en el sitio de enfermedad. El tratamiento de
BPH, retinopatía diabética, restenosis vascular, adhesiones
vasculares, AVM, meningioma, hemangioma, glaucoma neovascular,
artritis reumatoide y psoriasis se tienen en cuenta particularmente
en este momento.
Las células de la vasculatura están destinadas
como objetivos para su uso en la presente invención. En estos casos,
como mínimo una región de enlace de la inmunotoxina o coaguligando
será capaz de enlazar a un marcador accesible preferencialmente
expresado por las células endoteliales de la vasculatura asociadas
con la enfermedad. La explotación de los marcadores vasculares es
posible debido a la proximidad de las células endoteliales
vasculares al área de la enfermedad y a los productos de los
procesos fisiológicos aberrantes locales. Por ejemplo, las células
endoteliales vasculares del tumor se exponen a células tumorales y a
productos derivados del tumor que cambian el perfil fenotípico de
las células endoteliales.
Se sabe que las células tumorales elaboran
productos derivados del tumor, tales como linfocinas, monocinas,
factores estimulantes de colonia, factores de crecimiento y factores
angiogénicos, que actúan en las células endoteliales vasculares
cercanas (Kandel y colaboradores, 1991; Folkman y colaboradores,
1985a, 1985b) y citoquinas (Burrows y colaboradores, 1991; Ruco y
colaboradores, 1990; Borden y colaboradores, 1990). Los productos
tumorales se unen a las células endoteliales y sirven para inducir
selectivamente la expresión de ciertas moléculas. En estas moléculas
inducidas que se pueden atacar usando la toxina específica del
endotelio tumoral y/o la administración de coagulante dada a conocer
por ciertos aspectos de la presente invención. Las células
endoteliales vasculares en tumores proliferan a una velocidad 30
veces mayor que aquéllas en tejidos normales misceláneos (Denekamp y
colaboradores, 1982), sugiriendo que los determinantes enlazados con
la proliferación también servirían como marcadores para células
endoteliales vasculares del tumor.
En ciertas realizaciones de la invención, el
componente objetivo de las inmunotoxinas o coaguligandos será un
componente que tenga un grado relativamente alto de especificidad
para la vasculatura del tumor. Estos componentes objetivos se pueden
definir como componentes que se unen a moléculas expresadas en el
endotelio del tumor, pero que tienen poca o ninguna expresión en la
superficie de las células endoteliales normales. Esta especificidad
se puede valorar mediante procedimientos estándares de inmunotinción
de secciones de tejido, las cuales son rutinarias para los expertos
en la técnica. En términos de coaguligandos, generalmente se propone
que las moléculas que se van a atacar usando los ligandos
biespecíficos o anticuerpos de esta invención serán aquellas que se
expresan en la vasculatura del tumor a un nivel más alto que sobre
células endoteliales normales.
Moléculas que se conocen por expresarse
preferencialmente en la superficie de células endoteliales
vasculares en un sitio o ambiente de enfermedad se denominan en la
presente descripción ``marcadores de células endoteliales vasculares
asociadas con la enfermedad natural''. Este término se usa por
simplicidad para referirse a los componentes de células endoteliales
que se expresan en enfermedades relacionadas con la angiogénesis
incrementada o inadecuada o la proliferación celular endotelial. Un
ejemplo particular son los componentes de células endoteliales del
tumor que se expresan in situ como respuesta a factores
derivados del tumor. Estos componentes también se llaman
``marcadores de células endoteliales del tumor inducidas
naturalmente''.
Tanto el factor de crecimiento endotelial
vascular/factor de permeabilidad vascular como los componentes de la
familia de FGF (factor de crecimiento de fibroblastos) se concentran
en la vasculatura del tumor. Los receptores correspondientes, por lo
tanto, proporcionan un blanco potencial para ataque en la
vasculatura del tumor. Por ejemplo se sabe que los receptores del
factor de crecimiento endotelial vascular se sobrerregulan en las
células endoteliales del tumor, al contrario de las células
endoteliales en tejidos normales, tanto en roedores como en el
hombre (Thieme y colaboradores, 1995). Posiblemente, ésta es una
consecuencia de hipoxia - -una característica del
microambiente del tumor (Leith y colaboradores, 1992). Los
receptores del factor de crecimiento de fibroblastos también se
sobrerregulan 3 veces en las células endoteliales expuestas a
hipoxia, y se cree que se sobrerregulan en tumores (Bicknell y
Harris y colaboradores, 1992).
El receptor (endoglina) del TGF (factor de
crecimiento transformante) \beta sobre las células endoteliales se
sobrerregula en las células de división, proporcionando otro
objetivo. Uno de los presentes inventores encontró que la endoglina
se sobrerregula en HUVEC activado y de división en cultivo, y se
expresa fuertemente en tejidos humanos sobre células endoteliales en
sitios de neovascularización, incluyendo un rango amplio de tumores
sólidos y placenta fetal. En contraste, las células endoteliales en
la mayoría de los tejidos misceláneos no malignos de adultos,
incluyendo lesiones preneoplásicas, contienen poca o ninguna
endoglina. De manera importante, se cree que la expresión de
endoglina se correlaciona con la progresión neoplástica en el seno,
como se muestra por fibroadenomas benignos y carcinomas tempranos
que se enlazan a niveles bajos de anticuerpos TEC-4
y TEC-11, y carcinomas intraductales de etapa tardía
y carcinomas invasivos que se enlazan a altos niveles de estos
anticuerpos.
Otros marcadores de células endoteliales
vasculares asociados con enfermedades naturales incluyen TIE,
VCAM-1, P-selectina,
E-selectina (ELAM-1),
\alpha_{V}\beta_{3} integrina, pleitropina y endosialina, cada una
de las cuales puede ser atacada usando la invención.
Debido a la naturaleza de los procesos de
enfermedad, que frecuentemente dan como resultado disfunción
localizada dentro del cuerpo, hay métodos disponibles para manipular
el sitio de la enfermedad al mismo tiempo que dejan otros tejidos
relativamente no afectados. Esto es particularmente cierto en
tumores malignos y benignos, los cuales existen como entidades
distintas dentro del cuerpo de un animal. Por ejemplo, el ambiente
del tumor se puede manipular para crear marcadores adicionales que
sean específicos para las células endoteliales vasculares del tumor.
Estos métodos generalmente imitan a los que se presentan
naturalmente en los tumores sólidos, y también involucran la
producción local de sustancias señalantes, tales como factores de
crecimiento o citoquinas, que inducen la expresión específica de
ciertas moléculas en la superficie de las células endoteliales
vasculares cercanas.
El grupo de moléculas que se pueden inducir
artificialmente para ser expresadas en la superficie de las células
endoteliales vasculares en una enfermedad o entorno tumoral se
llaman en la presente descripción ``marcadores de células
endoteliales inducibles'', o específicamente, ``marcadores de
células endoteliales del tumor inducibles''. Este término se usa
para referirse a los marcadores que se inducen artificialmente, es
decir, se inducen como resultado de la manipulación por la mano del
hombre, en vez de los que se inducen como parte de una enfermedad o
proceso de desarrollo del tumor en un animal. El término ``marcador
inducible'', como se define anteriormente, se elige por simple
referencia en el contexto de la presente solicitud,
independientemente del hecho de que ``los marcadores naturales''
también se inducen, por ejemplo, por sustancias derivadas del
tumor.
De este modo, aunque no se requiere para
practicar la invención, hay técnicas disponibles para la obtención
selectiva de objetivos de antígenos endoteliales vasculares sobre la
superficie de la vasculatura asociada con enfermedad que, si se
desea, se pueden usar junto con la invención. Estas técnicas
involucran la manipulación de la expresión antigénica, o la
presentación en la superficie celular, de manera que se expresa un
antígeno objetivo o se vuelve disponible sobre la superficie de la
vasculatura asociada con la enfermedad y no se expresa o de otro
modo se vuelve accesible o disponible para enlace, o como mínimo en
un menor grado, sobre la superficie del endotelio normal.
Los marcadores del endotelio tumoral se pueden
inducir por citoquinas derivadas del tumor (Burrows y colaboradores,
1991; Ruco y colaboradores, 1990) y por factores angiogénicos
(Mignatti y colaboradores, 1991). Ejemplos de marcadores de
superficie celular que se pueden inducir específicamente en el
endotelio del tumor y luego atacar usando un ligando coagulante
biespecífico, como lo da a conocer la invención, incluyen los
mencionados en la Tabla III (Bevilacqua y colaboradores, 1987;
Dustin y colaboradores, 1986; Osborn y colaboradores, 1989; Collins
y colaboradores, 1984).
En la Tabla III también se presentan los
mecanismos para la inducción de los marcadores propuestos; la
``citoquina inducente'' o ``citoquina intermedia'', tal como la
IL-1 e IFN-\gamma; y el tipo de
célula de leucocito y la molécula de activación de citoquina
asociada, cuyo objetivo dará como resultado la liberación de la
citoquina. En la inducción de un marcador específico, generalmente
se requiere un anticuerpo ``que induce citoquinas'' o ``que induce
antígeno''. El anticuerpo selectivamente inducirá la liberación de
la citoquina adecuada en el lugar del tumor, induciendo de este modo
selectivamente la expresión del antígeno objetivo deseado mediante
las células endoteliales vasculares. Este anticuerpo biespecífico
reticula las células de la masa tumoral y los leucocitos que
producen citoquina, activando mediante esto a los leucocitos para
que liberen la citoquina.
La preparación y uso de anticuerpos biespecíficos
tales como éstos se basan en parte en el hecho de que la
reticulación de anticuerpos que reconocen CD3, CD14, CD16 y CD28
previamente se ha mostrado que obtienen producción de citoquina
selectivamente después de la reticulación con el segundo antígeno
(Qian y colaboradores, 1991). En el contexto de la presente
invención, ya que solamente los leucocitos reticulados con célula
tumoral exitosamente serán activados para liberar la citoquina, la
liberación de citoquina se restringirá al lugar del tumor. De este
modo, la expresión del marcador deseado, tal como la
E-selectina, se limitará de manera similar al
endotelio de la vasculatura del tumor.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\small\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|}\hline
Moléculas \+ Acrónimo \+ subtipos/alias \+ Citoquinas de \+
Leucocitos que \+ Moléculas de \\ inducibles de \+ \+ (familia
\+ inducción \+ producen estas \+ leucocito que, \\ células \+
\+ molecular) \+ \+ citoquinas \+ cuando se reticulan \\
endoteliales \+ \+ \+ \+ \+ por anticuerpos \\ \+ \+ \+ \+
\+ monoclonales, \\ \+ \+ \+ \+ \+ activan las células \\
\+ \+ \+ \+ \+ para producir \\ \+ \+ \+ \+ \+ citoquinas
\\\hline Molécula de \+ ELAM-1 \+ - - \+
IL-1, TNF-a, (TNF \+ monocitos \+
CD14 \\\dddcline{5}{6} adhesión de \+ \+ (Selectina) \+
- \beta ) (Endotoxina \+ macrófagos \+ CD14 \\\dddcline{5}{6}
leucocito-endotelial-1 \+
E-selectina \+ \+ bacteriana) \+ células cebadas
\+ FcR para IgE \\\hline Molécula de \+ VCAM-1
\+ Molécula de \+ (Endotoxina \+ monocitos \+ CD14
\\\dddcline{5}{6} adhesión \+ \+ adhesión celular \+ bacteriana)
IL-1, \+ macrófagos \+ CD14 \\\dddcline{5}{6}
vascular de la \+ \+ inducible 110 \+ TNF-a \+
células cebadas \+ FcR para IgE \\\dddcline{4}{6}
célula-1 \+ \+ (INCAM-110) \+
TNF- \beta , IL-4 \+ células T \+
CD2, CD3, CD28 \\ \+ \+ (Familia de \+ \+ ayudantes \+
\\\dddcline{4}{6} \+ \+ inmunoglobulina) \+ TNF \+ células NK
\+ FcR para IgG (CD16) \\\hline Molécula de \+
ICAM-1 \+ - - \+ IL-1,
TNF-a \+ monocitos \+ CD14 \\\dddcline{5}{6}
adhesión \+ \+ (Familia de \+ (Endotoxina \+ macrófagos \+ CD15
\\\dddcline{5}{6} intercelular-1 \+ \+
inmunoglobulina) \+ bacteriana) \+ células cebadas \+ FcR para
IgE \\\dddcline{4}{6} \+ \+ \+ TNF- \beta , IFNg
\+ células T \+ CD2, CD3, CD28 \\ \+ \+ \+ \+ ayudantes \+
\\\hline \+ \+ \+ \+ células NK \+ FcR para IgG (CD16)
\\\hline Sustancia para la \+ Sustancia \+ Sustancia
MEL-14 \+ IL-1, TNFa \+ monocitos
\+ CD14 \\\dddcline{5}{6} molécula de adhe- \+
LAM-1 \+ (ratón) \+ (Endotoxina \+ macrófagos \+
CD14 \\\dddcline{5}{6} sión de leucocito 1 \+ \+ \+ bacteriana)
\+ células cebadas \+ FcR para IgE \\\hline Antígeno de \+ MHC
Clase \+ HLA-DR \+ IFN-g \+
células T \+ CD2, CD3, CD28 \\ complejo de \+ II \+
HLA-DP \hfill -Humano \+ \+ ayudantes \+
\\ histocompatibi- \+ \+ HLA - DQ \+ \+ \+ \\
lidad mayor \+ \+ \+ \+ \+ \\ clase II \+ \+ IA
\hfill -Ratón \+ \+ \+ \\ \+ \+ IE \+ \+ \+
\\\dddcline{5}{6} \+ \+ \+ \+ células NK \+ FcR para IgG
(CD16)
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Es importante notar que, de los marcadores
inducibles posibles mencionados en la Tabla III, la
E-selectina, y los antígenos MHC Clase II, tales
como HLA-DR, HLA-DP y
HLA-DQ (Collins y colaboradores, 1984), son por
mucho los objetivos más preferentes para su uso en relación con las
realizaciones clínicas. Las otras moléculas de adhesión de la Tabla
III parecen expresarse en grados variantes en tejidos normales,
generalmente en órganos linfoides o en endotelio, haciendo su blanco
tal vez adecuado solamente en modelos animales o en casos en los que
su expresión sobre tejidos normales se puede inhibir sin efectos
secundarios significativos. Se prefiere dirigir
E-selectina o un antígeno MHC Clase II, ya que la
expresión de estos antígenos probablemente será la más directa para
promover selectivamente en endotelio asociado a tumor.
El objetivo de un antígeno que no se expresa
sobre las superficies de endotelio normal es la forma más directa de
los métodos de inducción. La E-selectina es una
molécula de adhesión que no se expresa en vasculatura endotelial
normal o en otros tipos de células humanas. (Cotran y colaboradores,
1986), pero se puede inducir en la superficie de células
endoteliales a través de la acción de citoquinas tales como
IL-1, TNF, linfotoxina y endotoxina bacteriana
(Bevilacqua y colaboradores, 1987). No se induce por
IFN-\gamma (Wu y colaboradores, 1990). La
expresión de E-selectina se puede inducir de este
modo selectivamente en endotelio tumoral a través de la
administración selectiva de una citoquina, o por el usode una
composición que causa la liberación selectiva de estas citoquinas en
el entorno tumoral.
Los anticuerpos biespecíficos son un ejemplo de
una composición capaz de causar la liberación selectiva de una o más
de las anteriores u otras citoquinas adecuadas en el sitio de
localización del tumor, pero ninguna otra parte en el cuerpo. Estos
anticuerpos biespecíficos se llaman en la presente descripción
``anticuerpos que inducen antígeno'' y son, desde luego, distintos
de cualquier anticuerpo biespecífico de la invención que tengan
componentes de blanco y coagulantes. Los anticuerpos que inducen
antígeno se diseñan para reticular células efectoras de citoquina,
tales como células de linaje monocito/macrófago, células T y/o
células NK o células cebadas, con células tumorales de la masa
tumoral sólida objetivo. Esta reticulación efectuaría una liberación
de citoquina que se localiza en el sitio de la reticulación, es
decir, el tumor.
Los anticuerpos efectivos para inducir antígeno
reconocen un antígeno de superficie celular del tumor, por un lado,
y por otro lado, reconocen un antígeno ``que activa a la citoquina''
en la superficie de un tipo de célula de leucocito seleccionada. El
término antígeno ``que activa a la citoquina'' se usa para referirse
a cualquiera de las moléculas conocidas sobre las superficies de los
leucocitos que, cuando son enlazados por una molécula efectora, tal
como un anticuerpo o fragmento del mismo o una sustancia que se
presenta naturalmente o un análogo sintético de la misma, ya sea un
factor soluble o un receptor contador unido a la membrana u otra
célula, promueve la liberación de una citoquina mediante la célula
de leucocito. Ejemplos de moléculas que activan la citoquina
incluyen CD14 (el receptor LPS) y FcR para IgE, los cuales activarán
la liberación de IL-1 y TNF\alpha; y CD16, CD2 ó
CD3 ó CD28, las cuales activan la liberación de IFN\gamma y
TNF\beta, respectivamente.
En cuanto se introduce en la corriente sanguínea
de un animal que tiene un tumor, este anticuerpo biespecífico que
induce antígeno se unirá a las células del tumor dentro del tumor,
reticulará esas células tumorales con células efectoras, por
ejemplo, monocitos/macrófagos, que han infiltrado el tumor, y
después de eso efectuarán la liberación selectiva de citoquina
dentro del tumor. Sin embargo, de manera importante sin la
reticulación del tumor y el leucocito, el anticuerpo que induce el
antígeno no efectuará la liberación de la citoquina. De este modo,
no se presentará ninguna liberación de citoquina en partes del
cuerpo eliminadas del tumor y, por lo tanto, la expresión de
moléculas inducidas por citoquina, por ejemplo,
E-selectina, se presentará solamente dentro del
endotelio del tumor.
Se conocen muchos antígenos ``activantes de
citoquina'' útiles, los cuales, cuando se reticulan con anticuerpo
biespecífico adecuado, darán como resultado la liberación de
citoquinas por el leucocito reticulado. El objetivo generalmente
preferente para este propósito es CD14, el cual se encuentra sobre
la superficie de monocitos y macrófagos. Cuando la CD14 se reticula
estimula a los monocitos/macrófagos para liberar
IL-1 (Schutt y colaboradores, 1988; Chen y
colaboradores, 1990), y posiblemente otras citoquinas, las cuales, a
su vez, estimulan la aparición de E-selectina sobre
la vasculatura cercana. Otros objetivos posibles para reticulación
en relación con la inducción de E-selectina y
direccionamiento incluyen FcR para IgE, encontrada en las células
cebadas; FcR para IgG (CD16), encontrada en células NK; así como
CD2, CD3 o CD28, encontradas en las superficies de las células T. De
éstas, se prefiere tomar como objetivo CD14 debido a la prevalencia
relativa de infiltración de monocito/macrófago de tumores sólidos en
oposición a los otros tipos de células de leucocitos.
En una realización de inducción a título de
ejemplo, un animal que tiene un tumor sólido se inyecta con
anticuerpo biespecífico (Fab'-Fab')
anti-CD14/antitumor (tal como el anticuerpo
anti-CEA, 9.2.27 contra antígenos de melanoma Mr
alto OV-TL3 o anticuerpos MOv18 contra antígenos
asociados con los ovarios). El anticuerpo se localiza en el tumor,
en virtud de su actividad de enlace con el tumor, y luego activa
monocitos y macrófagos en el tumor reticulando sus antígenos CD14
(Schutt y colaboradores, 1988; Chen y colaboradores, 1990). Los
monocitos/macrófagos activados tienen actividad tumoricida
(Palleroni y colaboradores, 1991) y liberan IL-1 y
TNF que rápidamente induce antígenos E-selectina
sobre las células endoteliales vasculares del tumor (Bevilacqua y
colaboradores, 1987; Pober y colaboradores, 1991).
El segundo grupo preferente de marcadores
inducibles destinado a su uso en la presente invención son los
antígenos MHC Clase II (Collins y colaboradores, 1984), que incluyen
HLA-DR, HLA-DP y
HLA-DQ. Los antígenos Clase II se expresan sobre las
células endoteliales vasculares en la mayoría de los tejidos
normales en varias especies, incluyendo al hombre. Estudios in
vitro (Collins y colaboradores, 1984; Daar y colaboradores,
1984; O'Connell y colaboradores, 1990) e in vivo (Groenewegen
y colaboradores, 1985) han mostrado que la expresión de los
antígenos de Clase II por células endoteliales vasculares requieren
la presencia continua de IFN-\gamma, la cual es
elaborada por células T_{H1} y, en menor grado, por células NK y
células CD8^{+}T.
Los antígenos MHC de Clase II no son exclusivos a
las células endoteliales vasculares, y también se expresan
constitutivamente en células B, células T activadas, células de
linaje monocito/macrófago y en ciertas células epiteliales, tanto en
ratones (Hammerling, 1976) como en el hombre (Daar y colaboradores,
1984). Debido a la expresión de antígenos MHC Clase II sobre
endotelio ``normal'', su objetivo no es tan directo como la
E-selectina. Sin embargo, la inducción y dirección
de los antígenos MHC Clase II se hacen posible usándolos junto con
un inmunosupresor, tal como la ciclosporina A (CsA), que tiene la
capacidad de inhibir efectivamente la expresión de las moléculas de
Clase II en tejidos normales (Groenewegen y colaboradores, 1985). La
ciclosporina A actúa evitando la activación de células T y células
NK (Groenewegen y colaboradores, 1985; DeFranco, 1991), reduciendo
mediante esto los niveles basales de IFN-\gamma
por debajo de los necesarios para mantener la expresión de Clase II
en el endotelio.
Hay varias otras ciclosporinas relacionadas con
la ciclosporina A, incluyendo ciclosporinas A, B, C, D, G, y
similares, que también tienen acción inmunosupresora y probablemente
demuestran una capacidad para suprimir la expresión de la Clase II.
Otras sustancias que pueden ser similarmente útiles incluyen FK506 y
rapamicina.
De este modo, la práctica de la inducción de MHC
Clase II y la realización de ataque requiere un pretratamiento del
animal que tiene tumor con una dosis de ciclosporina A u otra
sustancia inmunosupresora de la Clase II que sea efectiva para
suprimir la expresión de la Clase II. En caso de la ciclosporina A,
esto típicamente es del orden de aproximadamente 10 hasta
aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal. En cuanto se suprime en
tejidos normales, los antígenos de Clase II también se pueden
inducir selectivamente en el endotelio del tumor, de nuevo a través
del uso de un anticuerpo biespecífico.
En este caso, el anticuerpo biespecífico que
induce el antígeno tendrá especificidad para un marcador de células
tumorales y para un antígeno de activación encontrado en la
superficie de una célula efectora que es capaz de inducir la
producción de IFN-\gamma. Estas células efectoras
generalmente serán células T ayudantes (T_{H}) o células
eliminadores naturales (NK). En estas realizaciones, es necesario
que las células T, o las células NK si se usa CD16, estén presentes
en el tumor para producir la citoquina intermedia en la cual la
expresión de antígeno de Clase II se logra usando
IFN-\gamma, pero no se logra con otras citoquinas.
De este modo, para la práctica de este aspecto de la invención, se
deseará seleccionar CD2, CD3, CD28, o más preferiblemente CD28, como
el antígeno activador de citoquina para objetivo por el anticuerpo
biespecífico que induce antígeno.
Las células T que deberán activarse en el tumor
son aquellas adyacentes a la vasculatura, ya que ésta es la región
más accesible a las células y también es donde el anticuerpo
biespecífico estará más concentrado. Las células T activadas deberán
secretar IFN-\gamma lo cual induce antígenos de
Clase II sobre la vasculatura del tumor adyacente.
El uso de un anticuerpo biespecífico
(Fab'-Fab') que tiene una rama dirigida contra un
antígeno del tumor y la otra rama dirigida contra CD28 se prefiere
actualmente. Este anticuerpo reticulará antígeno CD28 sobre células
T en el tumor las cuales, cuando se combinan con una segunda señal
(proporcionada, por ejemplo, por IL-1 que es
comúnmente secretada por las células del tumor (Burrows y
colaboradores, 1991; Ruco y colaboradores, 1990), ha mostrado que
activa las células T a través de una trayectoria independiente de
CA^{2+} inhibible CsA (Hess y colaboradores, 1991; June y
colaboradores, 1987; Bjorndahl y colaboradores, 1989).
La preparación de anticuerpos contra varias
moléculas de activación de citoquina también se conoce bien en la
técnica. Por ejemplo, la preparación y uso de anticuerpos
monoclonales anti-CD14 y anti-CD28
que tienen la capacidad de inducir la producción de citoquina por
leucocitos se ha descrito ahora por varios laboratorios (revisado en
Schutt y colaboradores, 1988; Chen y colaboradores 1990, y June y
colaboradores, 1990, respectivamente). Más aún, también se conoce la
preparación de anticuerpos monoclonales que estimulan la liberación
de leucocito de citoquinas a través de otros mecanismos y otros
antígenos activantes (Clark y colaboradores, 1986; Geppert y
colaboradores, 1990).
En todavía otras realizaciones, los inventores
tienen en cuenta un enfoque alternativo para suprimir la expresión
de las moléculas de clase II, y obtener selectivamente expresión de
molécula de Clase II en el lugar del tumor. Este enfoque, que evita
el uso de tanto ciclosporina A como de un anticuerpo de activación
biespecífico, aprovecha el hecho de que la expresión de las
moléculas de Clase II se puede inhibir efectivamente suprimiendo la
producción de IFN-\gamma por las células T, por
ejemplo, a través del uso de un anticuerpo anti-CD4
(Street y colaboradores, 1989). Usando esta realización, la
producción de IFN-\gamma se inhibe administrando
anti-CD4, dando como resultado la supresión general
de la expresión de Clase II. La Clase II se induce entonces
solamente en el sitio de localización del tumor, por ejemplo, usando
células T específicas del tumor que sólo son activables dentro del
tumor.
En este modo de tratamiento, generalmente se
pretratará un animal o paciente humano con dosis de
anti-CD4 que es efectiva para suprimir la producción
de IFN-\gamma y mediante esto suprimir la
expresión de moléculas de Clase II. Se tiene en cuenta que las dosis
efectivas sean, por ejemplo, del orden de aproximadamente 4 hasta
aproximadamente
\hbox{10 mg/kg} de peso corporal. Después
de que se suprime la expresión de Clase II, se preparará e
introducirá en la corriente sanguínea unos clones de célula T que
produce IFN-\gamma (por ejemplo, T_{h}l o
linfocito T citotóxico, CTL) específico para un antígeno expresado
en la superficie de las células tumorales. Estas células T se
localizan en la masa del tumor, debido a su capacidad de
reconocimiento de antígeno y, después de este reconocimiento,
liberan entonces IFN-\gamma. De esta manera, se
restringe de nuevo la liberación de citoquina al tumor, limitando de
este modo la expresión de las moléculas de Clase II a la vasculatura
del tumor.
Los clones de célula T que produce
IFN-\gamma se pueden obtener a partir de la sangre
periférica (Mazzocchi y colaboradores 1990), sin embargo, una fuente
preferente es de dentro de la masa del tumor (Fox y colaboradores,
1990). El elemento actualmente preferente para preparar este clon de
célula T es para eliminar una parte de la masa tumoral de un
paciente; aislar células, usando digestión de colagenasa, cuando sea
necesario; enriquecer los leucocitos que se infiltran en el tumor
usando centrifugación de gradiente de densidad, seguido por
supresión de otros subconjuntos de leucocitos mediante, por ejemplo,
tratamiento con anticuerpos específicos y complemento; y luego
expandir los leucocitos de infiltración del tumor in vitro
para proporcionar el clon que produce IFN-\gamma.
Este clon necesariamente será inmunológicamente compatible con el
paciente, y por lo tanto será bien tolerado por el mismo.
Se propone que se lograrán beneficios
particulares seleccionando además un clon de célula T que produce
IFN-\gamma alta a partir de los leucocitos
expandidos determinando el patrón de secreción de citoquina de cada
clon individual cada 14 días. Con este fin, los clones restantes
serán mitogénicamente o antigénicamente estimulados durante
aproximadamente 24 horas y los sobrenadantes de su cultivo se
probarán, por ejemplo, usando una técnica en ``sandwich'' específico
de ensayo inmunoabsorbente de enzima enlazada (Cherwinski y
colaboradores, 1989), para determinar la presencia de
IL-2, IFN-\gamma,
IL-4, IL-5 e IL-10.
Se seleccionarán los clones que secretan altos niveles de
IL-2 e IFN-\gamma, el patrón de
secreción de citoquina característico de los clones T_{H1}. Se
confirmará la especificidad del tumor usando ensayos de
proliferación.
Además, se preferirá emplear como el anticuerpo
anti-CD4 un Fab anti-CD4, debido a
que será eliminado del cuerpo dentro de 24 horas después de la
inyección y así no causará supresión de clones de células T de
reconocimiento del tumor que se administren posteriormente. La
preparación de clones de células T que tengan especificidad del
tumor se conoce generalmente en la técnica, como se ejemplifica por
la producción y caracterización de clones de células T a partir de
la infiltración de tumores de melanoma sólidos (Maeda y
colaboradores, 1991).
Usando cualquiera de los métodos de supresión
inducción de MHC Clase II, probablemente resultarán beneficios
adicionales del hecho de que los anticuerpos
anti-Clase II inyectados intravenosamente no parecen
alcanzar las células epiteliales o los monocitos/macrófagos en
órganos normales distintos del hígado y bazo. Presumiblemente esto
se debe a que el endotelio vascular en la mayoría de los órganos
normales es estrecho, no está abierto como lo está en el hígado y el
bazo, y de este modo los anticuerpos se deben difundir a través de
las membranas de basamento para alcanzar las células positivas de
Clase II. También, cualquier eliminación de células B que pueda
resultar, por ejemplo, después de la reticulación, es improbable que
plantee un problema significativo, ya que estas células se vuelven a
llenar a partir de progenitores negativos de Clase II (Lowe y
colaboradores, 1986). Aún la eliminación de células B, como se
presenta en pacientes con linfoma B, no causa daño obvio (Vitetta y
colaboradores, 1991).
En resumen, aunque las composiciones y
anticuerpos coagulantes del tumor de la presente invención son
excelentemente simples, y no requieren la inducción de antígenos
para su operabilidad, también se tiene en cuenta el uso combinado de
un anticuerpo biespecífico que induce antígeno con esta invención.
Estos anticuerpos generalmente se administrarán antes de los
ligandos de coagulación biespecíficos de esta invención.
En general, los tumores más ``inmunogénicos''
serían los tumores más convenientes para el enfoque de MHC Clase II
involucrando, por ejemplo, la reticulación de células T en el tumor
a través del anticuerpo biespecífico
anti-CD28/antitumor, debido a que es más probable
que estos tumores sean infiltrados por las células T, un
prerrequisito para que este método sea efectivo. Ejemplos de tumores
sólidos inmunogénicos incluyen carcinomas renales, melanomas, una
minoría de cánceres del seno y del colon, así como posiblemente
cánceres con tumor pancreático, gástrico, del hígado, del pulmón y
glial. Estos tumores se conocen como ``inmunogénicos'' debido a que
hay evidencia de que obtienen respuestas inmunes en el huésped y se
ha encontrado que son dóciles a la inmunoterapia celular (Yamaue y
colaboradores, 1990). En el caso de melanomas y cánceres del
intestino grueso, los anticuerpos más preferentes para su uso en
estos casos serían B72.3
(anti-TAG-72) y PRSC5/PR4C2
(antígeno anti-Lewis) o 9.2.27 (antígeno
anti-melanoma Mr alto).
Para la mayoría de los tumores sólidos de
cualquier origen, un enfoque anti-CD14 que emplea un
intermediario macrófago/monocito sería más conveniente. Esto es
debido a que la mayoría de los tumores son ricos en macrófagos.
Ejemplos de tumores ricos en macrófagos incluyen la mayoría de los
carcinomas de seno, colon y pulmón. Ejemplos de anticuerpos
preferentes antitumor para su uso en estos casos serían
anti-HER-2, B72.3,
SM-3, HMFG-2, y SWA11 (Smith y
colaboradores, 1989).
Los coagulantes, tales como la trombina, Factor
IX/IXa, Factor X/Xa, plasmina y metaloproteinasas, tales como las
colagenasas intersticiales, estromelisinas y gelatinasas, también
actúan para inducir ciertos marcadores. En particular,
E-selectina, P-selectina, PDGF e
ICAM-1 se inducen mediante trombina (Sugama y
colaboradores, 1992; Shankar y colaboradores, 1994).
Por lo tanto, para esta inducción se utilizará un
anticuerpo biespecífico anticoagulante/antitumor. El anticuerpo se
localizará en el tumor a través de su actividad de enlace con el
tumor. El biespecífico concentrará entonces el coagulante, por
ejemplo, trombina, en el tumor, dando como resultado la inducción de
E-selectina y P-selectina en las
células endoteliales vasculares del tumor (Sugama y colaboradores,
1991; Shankar y colaboradores, 1994).
Alternativamente, el direccionamiento de Factor
de Tejido truncado a células tumorales o endotelio inducirá depósito
de trombina dentro del tumor. Conforme se deposita la trombina, se
pueden inducir E-selectina y
P-selectina sobre las células endoteliales
vasculares del tumor.
Un medio directo para reconocer un objetivo de
vasculatura asociado a enfermedad, ya sea inducida en el ambiente
natural o mediante medios artificiales, es a través del uso de un
anticuerpo que tenga afinidad de enlace para el receptor de
superficie celular particular, molécula o antígeno. Éstos incluyen a
los anticuerpos dirigidos contra todos los componentes de la
superficie celular que se conoce que están presentes sobre, por
ejemplo, células endoteliales vasculares del tumor, las que son
inducidas o sobreexpresadas como respuesta a factores derivados del
tumor, y a las que se inducen por la posterior manipulación de la
mano del hombre.
Anti-vWF reconoce al antígeno
VIII R Ag y tiñe 100% de los tipos de tumores presentados y tiñe
100% de los vasos en el tumor y presenta un patrón de tinción fuerte
en vasos normales. FB5 reconoce el antígeno endosialina y tiñe el
50% de los tipos de tumor presentados y tiñe del 10 al 30% de los
vasos en el tumor y presenta un patrón de tinción en vasos normales
en los órganos linfoides. TP3 reconoce el antígeno 80 kDa
osteosarcoma relacionado con proteína de antígeno y tiñe el 50% de
los tipos de tumor presentados y tiñe del 10 al 30% de los vasos en
el tumor y presenta un patrón de tinción fuerte en vasos normales
sobre los vasos sanguíneos pequeños. BC-1 reconoce
el antígeno isoformas de fibronectina y tiñe el 60% de los tipos de
tumor presentados y tiñe del 10 al 30% de los vasos en el tumor y no
presenta patrón de tinción en vasos normales. TV-1
reconoce el antígeno fibronectina y tiñe el 100% de los tipos de
tumor presentados y tiñe 100% de los vasos en el tumor y presenta un
patrón de tinción fuerte en todos los vasos normales. LM 609
reconoce el receptor de vitronectina \alpha_{v} \beta_{e} y tiñe
el 85% de los tipos de tumor presentados y tiñe del 70 al 80% de
los vasos en el tumor y presenta un patrón de tinción medio en vasos
normales. TEC-11 reconoce endoglina y tiñe el 100%
de los tipos de tumor presentados y tiñe el 100% de los vasos en el
tumor y presenta un patrón de tinción débil en la mayoría de los
vasos normales. TEC110 reconoce antígenos VEGF y tiñe el 100% de
tipos de tumor presentados y tiñe 100% de los vasos en el tumor y
presenta un patrón de tinción débil en la mayoría de los vasos
normales.
En un estudio comparativo de anticuerpos
monoclonales ``(MAbs)'' anti-EC en tumores humanos
se encontró que TEC 110, TV-1 y TEC11 fueron
positivos en tumores gastrointestinales, de parótida, seno, ovario
uterinos, de pulmón y tumores tipo Hodgkin. Mientras
FB-5 tuvo una tinción ligera en tumores
gastrointestinales y de pulmón y fue negativo en otros tumores
mencionados. TP-3 fue positivo en tumores
gastrointestinales y menos en tipos de tumor de parótida, ovarios y
tumores tipo Hodgkins. BC-1 fue positivo para
tumores gastrointestinales, así como para tumores reproductivos y
respiratorios. IM 609 fue positivo en tumores gastrointestinales, de
ovarios, uterinos, en pulmones y tumores tipo Hodgkin así como
tumores del aparato reproductor y respiratorio.
Otros dos anticuerpos que se pueden usar en esta
invención son los descritos por Rettig y colaboradores, (1992) y
Wang y colaboradores (1993) que se dirigen contra antígenos no
relacionados de función desconocida expresada en la vasculatura de
tumores humanos, pero no en la mayoría de los tejidos normales.
El anticuerpo descrito por Kim y colaboradores
(1993) también se puede usar en esta invención, particularmente ya
que este anticuerpo inhibió angiogénesis y suprimió el crecimiento
del tumor in vivo.
Los anticuerpos que no se han mostrado
anteriormente que sean específicos para tumores humanos también se
pueden usar. Por ejemplo, Venkateswaran y colaboradores (1992)
describió la producción de anticuerpos monoclonales
anti-FGF. Xu y colaboradores (1992) desarrollaron y
caracterizaron un panel de 16 anticuerpos monoclonales y
policlonales de dominio específico e isoformos contra isoformas de
receptor FGF (flg). Massoglia y colaboradores (1987) también dio a
conocer anticuerpos monoclonales contra el receptor FGF.
Además de utilizar un anticuerpo conocido, tal
como el descrito anteriormente y otros conocidos y publicados en la
literatura científica, también se puede generar un anticuerpo
novedoso usando procedimientos de inmunización estándares, como se
describe en mayor detalle más adelante en la presente descripción.
Para generar un anticuerpo contra un antígeno marcador vascular
conocido, asociado con una enfermedad, se inmunizaría un animal con
una composición inmunogénica que comprenda al antígeno. Esto puede
ser una preparación de membrana que incluye o se enriquece para el
antígeno; una forma relativamente purificada del antígeno, un
aislado de células o membranas; una forma altamente purificada del
antígeno, como se obtiene mediante una variedad de etapas de
purificación usando, por ejemplo, un extracto de antígeno original o
una forma recombinante del antígeno obtenida a partir de una célula
huésped recombinante.
La presente invención también da a conocer además
otros métodos para generar un anticuerpo contra un antígeno presente
en células endoteliales de vasculatura asociadas con enfermedad,
estos métodos son convenientes para su uso aún cuando la identidad
bioquímica del antígeno permanezca desconocida. Estos métodos se
ejemplifican a través de la generación de un anticuerpo contra las
células endoteliales de la vasculatura del tumor. Un primer elemento
para lograr la generación de anticuerpo de esta manera usa una
preparación de células endoteliales vasculares obtenidas del sitio
de localización del tumor de un animal o paciente humano.
Simplemente se inmuniza un animal experimental con una preparación
de estas células y se recolectan los anticuerpos así producidos. La
forma más útil de este método es cuando se seleccionan
posteriormente anticuerpos específicos, como se puede lograr usando
tecnología de hibridoma convencional y seleccionando contra células
endoteliales vasculares del tumor.
Un descubrimiento del método anterior es que
imita el fenómeno de vasculatura del tumor in vitro, y donde
la purificación de la célula no es necesaria. Usando este método,
las células endoteliales se someten a productos derivados del tumor,
lo que se podría obtener de medio condicional o del tumor, en
cultivo celular en vez de en animal. Este método generalmente
involucra estimular células endoteliales con medio condicionado del
tumor y emplear las células endoteliales estimuladas como
inmunógenos para preparar una colección de anticuerpos. De nuevo,
deberán seleccionarse anticuerpos específicos, por ejemplo, usando
tecnología anticuerpo monoclonal convencional, u otras técnicas
tales como bibliotecas fagémidas de inmunoglobulina combinatoriales
preparadas a partir de ARN aislado del bazo del animal inmunizado.
Se seleccionaría un anticuerpo específico que preferencialmente
reconozca el endotelio vascular estimulado del tumor y reaccione más
fuertemente con células endoteliales asociadas con el tumor que con
tejidos humanos adultos normales.
Uno de los inventores ha preparado y aislado
anticuerpos que tienen especificidad relativa para endotelio
vascular del tumor. El anticuerpo monoclonal llamado anticuerpo de
célula endotelial del tumor 4 y el anticuerpo de célula endotelial
del tumor 11 (TEC4 y TEC11) se obtuvieron usando el anterior método
(solicitud de Patente U.S.A. con número de serie 08/457.229 y
08/457.031, cada una incorporada en la presente descripción como
referencia). El antígeno reconocido por TEC4 y TEC11 se determinó
finalmente que era la molécula de endoglina. Los epítopes sobre
endoglina reconocidos por TEC4 y TEC11 están presentes sobre la
superficie celular de células HUVE estimuladas, y sólo mínimamente
presentes (o inmunológicamente accesibles) en la superficie de
células no estimuladas. Los anticuerpos monoclonales se han
cultivado previamente contra endoglina. Sin embargo, analizando la
reactividad con HUVEC o determinantes de superficie de célula HUVEC
activado por TCM mediante FACS o inmunofluorescencia indirecta
muestra que los epítopes reconocidos por TEC-4 y
TEC11 son distintos de los de un anticuerpo previo llamado 44G4
(Gougos y Letarte, 1988).
También se pueden emplear como componente
objetivo los ligandos biológicos que se sabe que enlazan o
interactúan con moléculas de la superficie de las células
endoteliales, tales como receptores de factor de crecimiento.
Los factores de crecimiento o ligandos que se
tienen en cuenta, útiles como objetivos en este sentido incluyen
VEGF/VPF, FGF, TGF\beta, ligandos que se enlazan a un TIE,
isoformas de fibronectina asociada con tumor, factor de dispersión,
factor de crecimiento hepatocito (HGF), factor de plaqueta 4 (PF4),
PDGF y TIMP.
Objetivos particularmente preferentes son
VEGF/VPF, la familia FGF de proteínas y TGF\beta. Abraham y
colaboradores (1986) clonaron FGF, el cual por lo tanto está
disponible como una proteína recombinante. Como se da a conocer por
Ferrara y colaboradores (1991), han sido clonadas cuatro especies de
VEGF que tienen 121, 165, 189, y 206 aminoácidos.
Los anticuerpos o ligandos de objetivo específico
también se pueden dirigir a cualquier componente que se enlace a la
superficie de células endoteliales vasculares en un sitio de
enfermedad, tal como un tumor. Estos componentes se ejemplifican por
ligandos y antígenos derivados del tumor, tales como factores de
crecimiento, que se enlazan a receptores de la superficie celular
específica ya presentes en las células endoteliales, o a receptores
que han sido inducidos, o sobreexpresados, sobre estas células como
respuesta al ambiente del tumor. Los objetivos asociados con la
vasculatura del tumor también se pueden llamar factores de enlace de
células endoteliales derivadas del tumor.
Se alcanzará parcialmente un nivel de
especificidad requerido para dirigir con éxito a un objetivo de
enfermedad debido a que las células endoteliales locales se
inducirán a expresar, o revelar, receptores que no están presentes,
o están subexpresados o enmascarados, en células endoteliales
normales. Con los tumores, resultará mayor especificidad debido al
hecho de que las células endoteliales en el tumor capturarán los
factores derivados del tumor, y los enlazarán a la superficie
celular, reduciendo la cantidad de ligando disponible para otros
tejidos. Cuando se combina con la dilución adicional del factor o
ligando mediante la distribución en la sangre y en cultivo de fluido
de tejido, las células endoteliales en tejidos normales se esperará
que enlacen relativamente pocos de estos factores. De este modo,
operacionalmente, los ligandos o factores de enlace en la superficie
celular serán capaces de usarse como marcadores de células
endoteliales del tumor.
Además de la fabricación por las mismas células
tumorales, los factores de enlace de células endoteliales del tumor
también se pueden originar de otros tipos de células, tales como
macrófagos y células cebadas, que han infiltrado tumores, o pueden
ser elaborados por plaquetas que se activan dentro del tumor.
Otros factores de crecimiento o ligandos tenidos
en cuenta por ser útiles como sustancias objetivo asociados con
vasculatura tumoral incluyen EGF, FGF, VEGF, TGF\beta, HGF
(NaKamura, 1991), angiotropina, TGF-\alpha,
TNF-\alpha, PD-ECGF y ligandos de
enlace TIE (Bicknell y Harris, 1992). Las sustancias objetivo
actualmente preferentes son VEGF/VPF, y la familia FGF de proteínas,
transformando el factor de crecimiento \beta
(TGF-\beta); TGF-\alpha; factor
de necrosis de tumor-\alpha
(TNF-\alpha); angiotropina; factor de crecimiento
de célula endotelial derivada de plaqueta (PD-ECGF);
ligandos de enlace TIE; pleiotropina. Además, componentes de
objetivo no anticuerpo, tales como anexinas y péptidos que
comprenden la secuencia tripéptido
R-G-D, los cuales específicamente se
dirigen a la vasculatura del tumor (Pasqualini y colaboradores,
1997), también están destinados a su uso en ciertos aspectos de la
invención.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de anticuerpos objetivos, o regiones de enlace de los mismos, que
son específicos para epítopes presentes solamente en complejos
ligando-receptor, estos epítopes están ausentes
tanto del ligando individual (libre) como del receptor en su forma
no ligada. Estos anticuerpos reconocen y se unen a la conformación
única que resulta cuando un ligando, tal como un factor de
crecimiento, se enlaza a su receptor, tal como un receptor de factor
de crecimiento, para formar un complejo específicamente enlazado.
Estos epítopes no están presentes en las formas no complejadas de
los ligandos o receptores.
Los inventores tienen en cuenta que los complejos
ligando-receptor a los cuales estos anticuerpos se
enlazan están presentes en un número significativamente más alto en
células endoteliales asociadas con tumores que en células
endoteliales no asociadas con tumores. Estos anticuerpos por lo
tanto serán útiles como sustancias objetivo y servirán para aumentar
adicionalmente la especificidad de los coagulantes biespecíficos de
la invención.
También se tienen en cuenta dominios de enlace
soluble de receptores de superficie de células endotelio para su uso
como ligandos objetivo en la presente invención. Este concepto se
basa generalmente en el fenómeno de enlace en ``sandwich'' bien
conocido que se ha explotado en una variedad de protocolos de enlace
in vitro e in vivo. Básicamente, como las células
endoteliales expresan receptores específicos, las células se enlazan
y adsorben los ligandos correspondientes, los ligandos están
entonces disponibles para enlazarse con otras construcciones
receptoras si se tienen que introducir en el sistema.
Un rango de receptores de células endoteliales
útiles se ha identificado en las secciones anteriores, siendo
objetivos particularmente preferentes VEGF/VPF, FGF, TGF\beta,
TIE-1 y TIE-2. Cada uno de estos
receptores podría manipularse para formar un dominio de enlace
soluble para su uso como ligando objetivo.
La utilidad de los marcadores de membrana de
basamento en la patología tumoral fue descrita por Birembaut y
colaboradores (1985). Estos estudios mostraron que la distribución
de los marcadores de membrana de basamento (BM), colágeno tipo IV,
laminina (LM), heparan sulfato proteoglicano (HSP) y fibronectina
(FN) se interrumpieron en la patología tumoral. Burtin y
colaboradores (1983) también describieron alteraciones de la
membrana de basamento y antígenos del tejido conectivo en nódulos
linfáticos metastáticos humanos.
Un objetivo preferente para su uso con la
invención es RIBS. Ugarova y colaboradores (1993) dieron a conocer
que tienen lugar cambios de conformación en el fibrinógeno y se
producen mediante su interacción con la glicoproteína de la membrana
de plaqueta GPIIb-IIIa. El enlace de fibrinógeno a
la membrana de glicoproteína GPIIb-IIIa en plaquetas
activadas conduce a la agregación de plaquetas. Esta interacción da
como resultado cambios de conformación en fibrinógeno como se
evidencia por la expresión de los sitios de enlace inducidos por
receptor, RIBS, epítopes que se expresan mediante el enlace pero no
por el ligando libre.
Se han localizado dos epítopes RIBS por Ugarova y
colaboradores (1993). Una secuencia reside en
\gamma112-119 y es reconocida por MAb 9F9; el
segundo es la secuencia RGDF en A\alpha 95-98 y es
reconocida por mAb 155B16. Estos epítopes también se exponen por
adsorción de fibrinógeno sobre superficie plástica y la digestión de
la molécula por plasmina. La exposición proteolítica de los epítopes
coincide con la disociación de aspectos terminales carboxilo de las
cadenas A\alpha para formar el fragmento X_{2}. La
inaccesibilidad de la secuencia RGDF de la secuencia A\alpha
95-98 en fibrinógeno sugiere que esta secuencia no
participa en el enlace inicial de la molécula a
GPIIb-IIIa.
El enlace de fibrinógeno a su receptor altera la
conformación de los aspectos de terminal carboxilo de las cadenas
A\alpha, exponiendo las secuencias que residen en los segmentos
conectores de espiral entre los dominios D y E de la molécula,
generando epítopes RIBS. En términos prácticos, se proponen las
secuencias RIBS como epítopes para su uso en dirigirlos con un
coaguligando. Los anticuerpos monoclonales 9F9 y 155B16 se pueden
usar de esta manera ventajosamente, así como los anticuerpos
descritos por Zamarron y colaboradores (1991).
Las combinaciones para el uso de la presente
invención tienen la ventaja adicional de que se pueden usar para
dirigir coagulantes a la vasculatura asociada con la enfermedad
dirigiéndolos a tipos de células encontrados dentro de la región de
la enfermedad.
Las plaquetas participan en hemostasis y en
trombosis adhiriéndose a las paredes de los vasos sanguíneos
lesionados y acumulándose en el sitio de la lesión. Aunque el
depósito de las plaquetas en sitios de lesión de vaso sanguíneo es
responsable de la detención primaria del sangrado bajo condiciones
fisiológicas, puede conducir a la oclusión vascular con daño al
tejido isquémico resultante y embolización de trombo bajo
condiciones patológicas.
Las interacciones de las plaquetas con su
ambiente y entre sí representan procesos complejos que se inician en
la superficie celular. Por lo tanto, la membrana superficial
proporciona una interfase reactiva entre el medio externo, que
incluye componentes de la pared de los vasos sanguíneos, y el plasma
y el interior de la plaqueta.
p-155, una proteína de plaqueta
multimérica que se expresa en plaquetas activadas (Hayward y
colaboradores 1991), se puede atacar usando la invención. Las
plaquetas responden a un número grande de estímulos sufriendo
complejos cambios bioquímicos y morfológicos. Estos cambios se
involucran en los procesos fisiológicos que incluyen adhesión,
agregación, y coagulación. La activación de las plaquetas produce
alteraciones de las membranas que se pueden reconocer mediante los
anticuerpos monoclonales. El anticuerpo monoclonal
JS-1 (Hayward y colaboradores, 1991) es uno de estos
anticuerpos destinados a su uso como parte de un coaguligando.
Los sitios de enlace inducidos por ligando (LIBS)
son sitios expresados en los receptores de la superficie celular
solamente después de que el enlace del ligando cause que el receptor
cambie de forma, mediante los eventos biológicos posteriores. Éstos
se pueden ver como contraparte a los RIBS y también son objetivos
preferentes para su uso en la presente invención.
Frelinger y colaboradores (1990; 1991),
desarrollaron 13 anticuerpos anti-LIBS, cualquiera
de los cuales se puede usar para administrar un coagulante a un
sitio de enfermedad o tumor de acuerdo con la presente descripción.
Los anticuerpos antiplaqueta monoclonal murinos
MA-TSPI-1 (dirigidos contra la
trombospondina humana) y MA-PMI-2,
MA-PMI-1, y
MA-LIBS-1 (dirigidos contra LIBS en
la glicoproteína de plaqueta humana IIb/IIIa) de Dewerchin y
colaboradores (1991) también se pueden usar, así como RUU 2.41 y
LIBS-1 de Heynen y colaboradores (1994);
OP-G2 de Tomiyama y colaboradores (1992); y
Ab-15.
Muchos otros objetivos, tales como antígenos o
células de músculo liso, pericitos, fibroblastos, macrófagos y
linfocitos de infiltración y leucocitos también se pueden usar.
Para ciertas aplicaciones, se considera que las
segundas sustancias terapéuticas serán sustancias farmacológicas
unidas a anticuerpos o a factores de crecimiento, particularmente
sustancias citotóxicas o de otro modo anticelulares que tienen la
capacidad de matar o suprimir el crecimiento de la división celular
de células endoteliales. En general, los aspectos secundarios de la
invención tienen en cuenta el uso de cualquier sustancia
farmacológica que se pueda conjugar a una sustancia objetivo,
preferiblemente un anticuerpo, y administrar en forma activa al
endotelio o estroma objetivo. Las sustancias anticelulares a título
de ejemplo incluyen sustancias quimioterapéuticas, radioisótopos así
como citotoxinas. En el caso de sustancias quimioterapéuticas, los
inventores proponen que las sustancias tales como una hormona, tal
como un esteroide; un antimetabolito tal como arabinosida citosina,
fluorouracil, metotrexato o aminopterina; una antraciclina,
mitomicina C; un alcaloide vinca; demecolcina; etoposida;
mitramicina; o una sustancia alquilante antitumor tal como
clorambucil o melfalán, se preferirán particularmente. Otras
realizaciones pueden incluir sustancias tales como citoquina, factor
de crecimiento, endotoxina bacteriana o la fracción A lípida de la
endotoxina bacteriana. En cualquier caso, se propone que las
sustancias como éstas, si se desea, puedan conjugarse con éxito a
una sustancia objetivo, preferiblemente un anticuerpo, de una manera
que permita su direccionamiento, internalización, liberación o
presentación a los componentes de la sangre en el sitio de las
células endoteliales objetivo como se requiera, usando tecnología de
conjugación conocida (véase, por ejemplo, Ghose y colaboradores,
1983 y Ghose y colaboradores 1987).
En ciertas realizaciones preferentes, las
inmunotoxinas generalmente incluirán una toxina derivada de planta,
hongo o bacteria, tal como las toxinas de cadena A, una proteína de
inactivación de ribosoma, \alpha-sarcina,
aspergilina, restrictocina, una ribonucleasa, toxina de difteria o
exotoxina pseudomonas, para mencionar solamente algunos
ejemplos. El uso de construcciones de anticuerpo de toxinas es muy
conocido en la técnica de las inmunotoxinas, como lo es su unión a
anticuerpos. De éstas, una toxina particularmente preferente para
unirse con anticuerpos será una cadena A de ricina desglicosilada.
La cadena de ricina A desglicosilada se prefiere debido a su extrema
potencia, vida media más larga, y debido a que es económicamente
factible para fabricarla en grado clínico y a escala.
Mientras que la preparación de inmunotoxinas es,
en general, muy conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Patentes
U.S.A. números 4.340.535, y la Patente Europea número 44167, ambas
incorporadas en la presente descripción mediante referencia), los
inventores son conscientes de que se pueden lograr ciertas ventajas
a través de la aplicación de cierta tecnología preferente, tanto en
la preparación de las inmunotoxinas como en su purificación para
administración clínica posterior. Por ejemplo, aunque las
inmunotoxinas basadas en IgG típicamente mostrarán mejor capacidad
de enlace y eliminación más lenta en la sangre que sus contrapartes
Fab', las inmunotoxinas basadas en fragmentos de Fab' generalmente
exhibirán mejor capacidad de penetración en el tejido en comparación
con las inmunotoxinas basadas en IgG.
Adicionalmente, aunque se conocen numerosos tipos
de enlazadores que contienen enlace disulfuro, los cuales se pueden
emplear con éxito para conjugar la fracción de toxina con la
sustancia objetivo, ciertos ligandos generalmente se preferirán
sobre otros ligandos, basándose en diferentes características y
capacidades farmacológicas. Por ejemplo, los ligandos que contienen
un enlace disulfuro que está ``impedido'' estéricamente se
preferirán, debido a su mayor estabilidad in vivo, evitando
así la liberación de la fracción de toxina antes del enlace en el
sitio de acción. Además, aunque ciertas ventajas de acuerdo con la
invención se realizarán a través del uso de cualquiera de entre
varias fracciones de toxina, los inventores han encontrado que el
uso de la cadena de ricina A, y aún más preferiblemente la cadena A
desglicosilada, proporcionará beneficios particulares.
Se conoce una amplia variedad de sustancias
citotóxicas que pueden conjugarse con anticuerpos anticélula
endotelial. Los ejemplos incluyen numerosas toxinas derivadas de
planta, hongo, o hasta bacteria, las cuales, a manera de ejemplo,
incluyen varias toxinas de cadena A, particularmente cadena A
ricina, proteínas de inactivación del ribosoma tales como saporina o
gelonina, \alpha-sarcina, aspergilina,
restrictocina, ribonucleasas tales como ribonucleasa placental,
angiogénica, toxina de difteria, y exotoxina de pseudomonas,
por nombrar solo algunas. La fracción toxina más preferente para su
uso en relación con la invención es la cadena A toxina que ha sido
tratada para modificar o eliminar residuos de carbohidrato, la
llamada cadena A desglicosilada. Los inventores han tenido el mejor
éxito a través del uso de cadena A de ricina desglicosilada (dgA) la
cual está ahora comercialmente disponible de Inland Laboratories,
Austin, TX.
Sin embargo puede ser deseable desde un punto de
vista farmacológico emplear la molécula más pequeña posible que sin
embargo proporcione una respuesta biológica adecuada. Se puede
desear entonces emplear péptidos de la cadena A más pequeños los
cuales proporcionarán una respuesta anticelular adecuada. Con este
fin, se ha descubierto por otros que la cadena A de ricina se puede
``truncar'' mediante la eliminación de 30 aminoácidos de terminal N
por nagarasa (Sigma), y todavía retener una actividad de toxina
adecuada. Se propone que cuando se desea, esta cadena A truncada se
puede emplear en conjugados de acuerdo con la invención.
De manera alternativa, se puede encontrar que la
aplicación de tecnología de ADN recombinante a la fracción de cadena
A de toxina proporcionará beneficios significativos adicionales de
acuerdo con la invención. Ya que la clonación y expresión de la
cadena A de ricina biológicamente activa se ha habilitado a través
de la publicación de otros (O'Hare y colaboradores, 1987; Lamb y
colaboradores, 1985; Halling y colaboradores, 1985), ahora es
posible identificar y preparar péptidos más pequeños o de otro modo
variantes que sin embargo exhiben una actividad de toxina adecuada.
Más aún, el hecho de que la cadena A de ricina ahora se ha clonado
permite la aplicación de mutagénesis dirigida al sitio, a través de
la cual se puede preparar fácilmente y seleccionar para péptidos
derivados de cadena A y obtener fracciones útiles adicionales para
su uso en relación con la presente invención.
La reticulación de la región de cadena A de
toxina del conjugado con la región de la sustancia objetivo es un
aspecto importante de la invención. En ciertos casos, se requiere
que un reticulador que presente función disulfuro se utilice por el
conjugado para tener actividad biológica. La razón de esto no está
clara, pero probablemente se deba a una necesidad para que ciertas
fracciones de toxina sean fácilmente liberables de la sustancia
objetivo una vez que la sustancia ha ``administrado'' la toxina a
las células objetivo. Cada tipo de regulador, así como la manera en
que se realiza la reticulación, tenderá a variar la farmacodinámica
del conjugado resultante. Finalmente, en los casos en que se tiene
en cuenta una toxina liberable, se desea tener un conjugado que
permanezca intacto bajo condiciones encontradas en todos lados en el
cuerpo excepto en el sitio pretendido de acción, en este punto es
deseable que el conjugado tenga buenas características de
``liberación''. Por lo tanto, el esquema de reticulación particular,
incluyendo en particular el reactivo de reticulación particular
usado y las estructuras que se reticulan, tendrá alguna
importancia.
Dependiendo del compuesto de toxina específico
usado como parte de la proteína de fusión, puede ser necesario
proporcionar un separador péptido operativamente unido a la
sustancia objetivo y el compuesto de toxina que sea capaz de
doblarse en una estructura de horquilla enlazada por disulfuro. La
disociación proteolítica dentro de la horquilla producirá entonces
un polipéptido heterodimérico en donde la sustancia objetivo y el
compuesto de toxina están enlazados mediante únicamente un solo
enlace disulfuro. (Véase por ejemplo, Lord y colaboradores, 1992).
Un ejemplo de esta toxina es la toxina de cadena A ricina.
Cuando se utilizan otros compuestos de toxina, se
puede proporcionar un separador de péptido no disociable para unir
operativamente la sustancia objetivo y el compuesto de toxina de la
proteína de fusión. Las toxinas que se pueden usar junto con los
espaciadores péptidos no disociables son aquéllas que pueden, por sí
mismas, convertirse mediante disociación proteolítica en forma
enlazada por disulfuro citotóxica (véase por ejemplo, Ogata y
colaboradores, 1990). Un ejemplo de un compuesto de toxina es un
compuesto de exotoxina de Pseudonomas.
Se pueden utilizar ácidos nucleicos en la
presente descripción que comprenden secuencias de ácidos nucleicos
que codifican una sustancia objetivo de interés y secuencias de
ácido nucleico que codifican una sustancia toxina de interés. Estas
secuencias de ácidos nucleicos que codifican sustancia objetivo y
que codifican sustancia toxina se unen de una manera tal que la
traducción del ácido nucleico produce los compuestos de sustancia
objetivo/toxina de la invención.
Se tiene en cuenta que la mayoría de las
aplicaciones terapéuticas de los aspectos de inmunotoxinas
adicionales de la presente invención involucrarán la dirección de
una fracción de toxina al endotelio del tumor o estroma. Esto se
debe a la capacidad más grande de la mayoría de las toxinas de
administrar un efecto eliminador de células en comparación con otras
sustancias potenciales. Sin embargo, puede haber circunstancias,
tales como cuando el antígeno objetivo no se internaliza mediante
una ruta consistente con la intoxicación eficiente mediante
compuestos de sustancia objetivo/toxina, tales como las
inmunotoxinas, en donde se deseará dirigir sustancias
quimioterapéuticas tales como fármacos antitumor, otras citoquinas,
antimetabolitos, sustancias alquilantes, hormonas, y similares. Las
ventajas de estas sustancias sobre sus contrapartes conjugadas de
sustancias no objetivos es la selectividad añadida que tiene la
sustancia objetivo, tal como un anticuerpo. Se podrían mencionar a
título de ejemplo sustancias tales como esteroides, citosina
arabinosida, metotrexato, aminopterina, antraciclinas, mitomicina C,
alcaloides vinca, demecolcina, etoposida, mitramicina, y similares.
La lista, desde luego, es únicamente a título de ejemplo porque la
tecnología para unir sustancias farmacéuticas a sustancias objetivo,
tales como anticuerpos, para la administración específica a tejidos
está bien establecida (véase, por ejemplo, Ghose y Blair, 1987).
Una variedad de sustancias quimioterapéuticas y
otras sustancias farmacológicas se han conjugado ahora con éxito a
anticuerpos y se muestra que funcionan farmacológicamente (véase,
por ejemplo, Vaickus y colaboradores 1991). Las sustancias
antineoplásicas a título de ejemplo que se han investigado incluyen
dexorrubicina, daunomicina, metotrexato, vinblastina, y varias otras
(Dillman y colaboradores, 1988; Pietersz y colaboradores, 1988). Más
aún, se ha descrito la unión de otras sustancias tales como
neocarzinostatina (Kimura y colaboradores, 1983), macromicina
(Manabe y colaboradores, 1984), trenimón (Ghose, 1982) y
\alpha-amanitina (Davis y Preston, 1981).
La segunda sustancia objetivo para uso opcional
con la invención también puede comprender un componente objetivo que
sea capaz de promover la coagulación. Estas ``sustancias que
promueven la coagulación objetivo'' o ``coaguligandos'' incluyen
cualquiera de las sustancias objetivo anteriores que estén
operativamente asociadas con uno o más factores de coagulación. La
sustancia objetivo puede estar enlazada directamente a un factor que
directa o indirectamente estimule la coagulación, o la sustancia
objetivo puede estar enlazada a una segunda región de enlace que sea
capaz de unir y liberar un factor de coagulación que directa o
indirectamente estimule la coagulación.
Los factores de coagulación a título de ejemplo
son los tipos de moléculas de Factor de Tejido truncado, dimérico,
multimérico y mutante de la presente invención, como se describe en
la presente descripción en detalle.
Se puede usar una variedad de otros factores de
coagulación en relación con la presente invención, como se
ejemplifica por las sustancias indicadas más adelante. Cuando un
factor de coagulación se enlaza covalentemente a una primera
sustancia de enlace o de objetivo, se usa un sitio distinto de su
sitio de coagulación funcional para unir las moléculas. Las regiones
de unión adecuadas distintas de los sitios activos, o regiones
funcionales, de los factores de coagulación también se describen en
cada una de las siguientes secciones.
En la presente invención también se pueden usar
trombina, Factor V/Va y derivados, Factor VIII/VIIIa y derivados,
Factor IX/IXa y derivados, Factor X/Xa y derivados, Factor XI/XIa y
derivados, Factor XII/XIIa y derivados, Factor XIII/XIIIa y
derivados, activador del Factor X y activador del Factor V.
Williams y Esnouf, en 1962, demostraron que el
veneno de víbora de Russell contiene una proteína coagulante. Kisiel
(1979) aisló una glicoproteína de veneno que activa el Factor V; y
Di Scipio y colaboradores (1977) mostraron que una proteasa de
veneno activa el Factor X humano. El activador del Factor X es el
componente destinado a su uso en esta invención.
Los anticuerpos monoclonales específicos para el
activador del Factor X presente en el veneno de víbora de Russell
también se han producido (por ejemplo, MP1 de Pukrittayakamee y
colaboradores, 1983), y podría usarse para administrar la sustancia
en un sitio objetivo específico dentro del cuerpo.
El tromboxano A_{2} se forma de endoperóxidos
mediante las acciones secuenciales de las enzimas ciclooxigenasa y
tromboxano sintetasa en microsomas de plaqueta. El tromboxano
A_{2} es generado fácilmente por las plaquetas y es un potente
vasoconstrictor, en virtud de su capacidad para producir agregación
de plaquetas (Whittle y colaboradores, 1981).
Tanto el tromboxano A_{2} como los análogos
activos del mismo están destinados a su uso en la presente
invención. Un protocolo sintético para generar tromboxano A_{2} se
describe por Bhagwat y colaboradores (1985). Los análogos de
tromboxano A_{2} descritos por Ohuchida y colaboradores (1981)
(especialmente el compuesto 2) están destinados particularmente a su
uso con la presente descripción.
Es posible que la tromboxano sintasa, y otras
enzimas que sintetizan prostaglandinas que activan las plaquetas,
también se pueden usar como ``coagulantes'' en el presente contexto.
Shen y Tai (1986) describen anticuerpos monoclonales, y la
purificación por inmunoafinidad de tromboxano sintasa; y Wang y
colaboradores (1991) da a conocer el ADNc para la tromboxano sintasa
humana.
La \alpha2-antiplasmina, o
inhibidor de \alpha2-plasmina, es un inhibidor de
proteinasa naturalmente presente en el plasma humano que funciona
para inhibir eficientemente la lisis de los coágulos de fibrina
inducidos por el activador plasminógeno (Moroi y Aoki, 1976). La
\alpha2-antiplasmina es un inhibidor
particularmente potente, y está destinada a su uso en la presente
invención.
La \alpha2-antiplasmina se
puede purificar como se describió primero por Moroi y Aoki (1976).
También están disponibles otros esquemas de purificación, tales como
usar cromatografía de afinidad en
plasminógeno-sefarosa, cromatografía de intercambio
iónico sobre DEAE-sefadex y cromatografía sobre
concanavalina-A-sefarosa; o usando
cromatografía de afinidad sobre una columna de sefarosa que tiene
una formulación de plasminógeno digerido por elastasa que contiene
tres estructuras de ciclo triple de terminal N en la cadena A
de plasmina (LBSI), seguido por filtración en gel (Wiman y Collen,
1977; Wiman, 1980, respectivamente).
Como la secuencia de ADNc de la
\alpha2-antiplasmina está disponible (Tone y
colaboradores, 1977), un método preferente para la producción de
\alpha2-antiplasmina será a través de la expresión
recombinante.
También están disponibles anticuerpos
monoclonales contra \alpha2-antiplasmina que se
pueden usar en las realizaciones de ligando de enlace biespecífico
de la invención. Por ejemplo, Hattey y colaboradores (1987) describe
dos anticuerpos monoclonales contra
\alpha2-antiplasmina, MPW2AP y MPW3AP. Ya que cada
uno de estos anticuerpos monoclonales se dio a conocer que
reaccionan igualmente bien con la
\alpha2-antiplasmina original, ambos podrían
usarse para administrar \alpha2-antiplasmina
exógena a un sitio objetivo o acumular
\alpha2-antiplasmina endógena y concentrarla
dentro de la región objetivo. También se podrían usar otros
anticuerpos tales como JTPI-2, descritos por Mimuro
y colaboradores.
Otro grupo de ligandos de coagulación objetivos
para su uso con los Factores de Tejido de esta invención son
aquellos en los cuales la región objetivo no está directamente
enlazada a un factor de coagulación, sino que está enlazada a una
segunda región de enlace que se une a un factor de coagulación.
Cuando se usa una segunda región de enlace para
ligar y administrar un factor de coagulación, la región de enlace se
elige de manera que reconozca un sitio en el factor de coagulación
que no incapacite de manera significativa su capacidad para inducir
coagulación. Las regiones de los factores de coagulación
convenientes para enlazar de esta manera generalmente serán los
mismos que las regiones que son convenientes para el enlace
covalente a la región objetivo, como se describe en las secciones
anteriores.
Sin embargo, ya que los ligandos biespecíficos de
esta clase se puede esperar que liberen el factor de coagulación
después de administrarlo al sitio o región del tumor, hay más
flexibilidad permitida en las regiones del factor de coagulación
convenientes para enlazarse a una segunda sustancia o anticuerpo de
enlace.
Las segundas regiones de enlace convenientes para
su uso de esta manera, generalmente serán sitios de combinación de
antígeno de anticuerpos que tengan especificidad de enlace para el
factor de coagulación, incluyendo las partes funcionales de los
anticuerpos, tales como los fragmentos scFv, Fv, Fab', Fab y
F(ab')_{2}.
Los ligandos de enlace biespecíficos que
contienen anticuerpos, o fragmentos de los mismos, dirigidos contra
Factor de Tejido, trombina, precaliqueína, Factor V/Va, Factor
VIII/VIIIa, Factor IX/IXa, Factor X/Xa, Factor XI/XIa, Factor
XII/XIIa, Factor XIII/XIIIa, veneno de víbora de Russell, el
tromboxano A_{2} o \alpha2-antiplasmina son
realizaciones a título de ejemplo de este aspecto de la
invención.
Los ejemplos de profármacos de Factor de Tejido
truncado tienen las siguientes estructuras:
tTF_{1-219} (X)_{n1}
\hbox{(Y) _{n2} } Z ligando, en donde
tTF_{1-219} representa el Factor de Tejido menos
los dominios citosólico y de transmembrana; X representa un dominio
de transmembrana hidrofóbica con n1 aminoácidos (AA) de tamaño
(n=1-20 AA); Y representa una secuencia de
reconocimiento de proteasa hidrofílica de n2 aminoácidos de tamaño
(suficientes aminoácidos para asegurar el reconocimiento adecuado de
proteasa); Z representa un tioéster de disulfuro u otro grupo de
enlace tal como (Cys)_{1-2}; Ligando
representa un anticuerpo u otra fracción objetivo de reconocimiento
de células tumorales, tumor EC, tejido conectivo (estroma) o
marcadores de lámina basal.
El profármaco de Factor de Tejido truncado se
tiene en cuenta para inyección intravenosamente, permitiéndole
localizar el tejido enfermo (por ejemplo, tumor). En cuanto se
localiza en el tejido enfermo, las proteasas endógenas (por ejemplo,
metaloproteinasas, trombina, Factor Xa, Factor VIIa, Factor IXa,
plasmina) disociarán la secuencia de reconocimiento de proteasa
hidrofílica del profármaco el cual permitirá que la secuencia de
transmembrana hidrofóbica se inserte en una membrana celular local.
Una vez que la cola se ha insertado en la membrana, el Factor de
Tejido truncado recuperará sus propiedades de inducción de
coagulación, dando como resultado la formación de coágulo en la
vasculatura del tejido deseado.
En general, la preparación de anticuerpos
biespecíficos también es muy conocida en la técnica, como lo
ejemplifican Glennie y colaboradores (1987). Los anticuerpos
biespecíficos se han empleado clínicamente, por ejemplo, para tratar
pacientes con cáncer (Bauer y colaboradores, 1991). Un método para
la preparación de anticuerpos biespecíficos involucra la preparación
separada de anticuerpos que tienen especificidad para el antígeno de
célula tumoral objetivo, por un lado, y la sustancia coagulante (u
otro objetivo deseado, tal como un antígeno activante) por el
otro.
Los anticuerpos biespecíficos también se han
desarrollado particularmente para su uso como sustancias
inmunoterapéuticas. Como se mencionó anteriormente en conjunción con
la inducción de antígeno, ciertos de estos anticuerpos se
desarrollaron para reticular linfocitos y antígenos del tumor
(Nelson, 1991; Segal y colaboradores, 1992). Los ejemplos incluyen
moléculas quiméricas que enlazan células T, por ejemplo, en CD3, y
antígenos del tumor, y disparan la activación de linfocitos mediante
la reticulación física del complejo TCR/CD3 en estrecha proximidad
con la célula objetivo (Staerz y colaboradores, 1985; Perez y
colaboradores, 1985; 1986a; 1986b; Ting y colaboradores, 1988).
Sin duda, las células tumorales de carcinomas,
linfomas, leucemias y melanomas se ha dado a conocer que son
susceptibles a eliminación mediada por anticuerpo biespecífico
mediante células T (Nelson, 1991; Segal y colaboradores, 1992,
deLeij y colaboradores, 1991). Estos tipos de anticuerpos
biespecíficos también se han usado en varios ensayos clínicos de
fase I contra diversos objetivos tumores. Los anticuerpos de
reticulación biespecífica se pueden administrar como se describe en
referencias tales como deLeij y colaboradores (1991); Clark y
colaboradores (1991); Rivoltini y colaboradores (1992); Bolhuis y
colaboradores (1992); y Nitta y colaboradores (1990).
Aunque se conocen numerosos métodos en la técnica
para la preparación de anticuerpos biespecíficos, el método de
Glennie y colaboradores (1987) involucra la preparación de
fragmentos de F(ab'\gamma)_{2} pépticos de los dos
anticuerpos elegidos, seguidos por la reducción de cada uno para
proporcionar fragmentos de Fab'\gamma_{SH} por separado. Los
grupos SH en uno de los dos compañeros para acoplarse se alquilan
con un reactivo de reticulación tal como
o-fenilenodimaleimida para proporcionar grupos
maleimida libres en un compañero. Este compañero se puede conjugar
con el otro por medio de un enlace de tioéter, para dar el
heteroconjugado F(ab'\gamma)_{2} deseado.
Debido a la facilidad de preparación, alto
rendimiento y reproducibilidad, el método de Glennie y colaboradores
(1987) frecuentemente se prefiere para la preparación de anticuerpos
biespecíficos, sin embargo, hay numerosos enfoques distintos que se
pueden emplear y que están considerados por los inventores. Por
ejemplo, se conocen otras técnicas en donde se lleva a cabo la
reticulación con SPDP o proteína A, o se prepara una construcción
triespecífica (Titus y colaboradores 1987; Tutt y colaboradores,
1991).
Otro método para producir anticuerpos
biespecíficos es mediante la fusión de dos hibridomas para formar un
cuadroma (Flavell y colaboradores, 1991, 1992; Pimm y colaboradores,
1992; French y colaboradores, 1991; Embleton y colaboradores, 1991).
Como se usa en la presente descripción, el término ``cuadroma'' se
usa para describir la fusión productiva de dos hibridomas de células
B. Usando ahora técnicas estándar, se fusionan dos hibridomas que
producen anticuerpo para producir células hijas, y se seleccionan
esas células que han mantenido la expresión de ambos conjuntos de
genes de inmunoglobulina clonotipo.
Un método preferente para generar un cuadroma
involucra la selección de un mutante deficiente de enzima de como
mínimo uno de los hibridomas padres. Esta primera línea celular de
hibridoma mutante se fusiona entonces con células de un segundo
hibridoma que ha sido expuesto letalmente, por ejemplo, a
yodoacetamida, impidiendo su supervivencia continuada. La fusión
celular permite el rescate del primer hibridoma adquiriendo el gen
para su deficiencia de enzima a partir del hibridoma tratado
letalmente, y el rescate del segundo hibridoma a través de la fusión
con el primer hibridoma. Se prefiere, pero no se requiere, la fusión
de inmunoglobulinas del mismo isotipo, pero de una subclase
diferente. Un anticuerpo de subclase mezclado permite el uso si hay
un ensayo alternativo para el aislamiento de un cuadroma
preferente.
En mayor detalle, un método de desarrollo de
cuadroma y de selección involucra obtener una línea de hibridoma que
secreta el primer anticuerpo monoclonal elegido y lo hace deficiente
para la enzima metabólica esencial,
hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa
(HGPRT). Para obtener mutantes deficientes del hibridoma, se
cultivan células en presencia de concentraciones crecientes de
8-azaguanina (1x10^{-7} M a 1 x 10^{-5} M). Los
mutantes se subclonan limitando la dilución y probando su
sensibilidad a la hipoxantina/ aminopterina/ timidina (HAT). El
medio de cultivo puede consistir en, por ejemplo, DMEM complementado
con 10% de suero de becerro fetal (FCS), 2 mM de L glutamina y 1mM
de penicilina-estreptomicina.
Una línea de célula de hibridoma complementaria
que produce el segundo anticuerpo monoclonal deseado se usa para
generar los cuadromas mediante técnicas de fusión de célula
estándares (Galfre y colaboradores, 1981), o usando el protocolo
descrito por Clark y colaboradores (1988). En resumen, se mezclan
4,5 x 10^{7} primeras células sensibles a hipoxantina/
aminopterina/ timidina con 2,8 x 10^{7} segundas células
resistentes a hipoxantina/ aminopterina/ timidina que han sido
tratadas previamente con una dosis letal del inhibidor bioquímico
irreversible yodoacetamida (5 mM en solución salina regulada de
fosfato) durante 30 minutos en hielo antes de la fusión. La fusión
celular se induce usando polietilenglicol (PEG) y las células se
plaquean en placas de microcultivo de 96 pocillos. Los cuadromas se
seleccionan usando medio que contiene hipoxantina/ aminopterina/
timidina. Se identifican cultivos que contienen anticuerpo
biespecífico usando, por ejemplo, un ELISA específico de isotipo de
fase sólida y teñido de inmunofluorescencia específico para
isotipo.
En una realización de identificación para
identificar el anticuerpo biespecífico, los pocillos de placas de
microtitulación (Falcon, Becton Dickinson Labware) se recubren con
un reactivo que interactúa específicamente con uno de los
anticuerpos de hibridoma padre y que carece de reactividad cruzada
con ambos anticuerpos. Las placas se lavan, se bloquean, y los
sobrenadantes (SNs) que se van a probar se añaden a cada pocillo.
Las placas se incuban a temperatura ambiente durante dos horas, los
sobrenadantes se descartan, las placas se lavan, y se diluye
conjugado de fosfatasa
alcalina-anti-anticuerpo añadido
durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan y se
añade un sustrato de fosfatasa, por ejemplo,
P-Nitrofenilfosfato (Sigma, St. Louis) a cada
pocillo. Las placas se incuban, se añade NaOH 3N a cada pocillo para
detener la reacción, y se determinan los valores OD_{410} usando
un lector de ensayo inmunosorbente de enzima enlazada (ELISA).
En otra realización de identificación, se usan
placas de microtitulación pretratadas con
poli-L-lisina para unir una de las
células objetivo a cada pocillo, entonces las células se fijan, por
ejemplo usando 1% de glutaraldehído y se prueban los anticuerpos
biespecíficos para determinar su capacidad para enlazar la célula
intacta. Además, se puede usar FACS, tinción por
inmunofluorescencia, anticuerpos específicos de idiotipo, ensayos de
competición de enlace de antígeno, y otros métodos comunes en la
técnica de la caracterización de anticuerpos, junto con la presente
invención para identificar los cuadromas preferentes.
Después del aislamiento del cuadroma, se
purifican los anticuerpos biespecíficos lejos de otros productos
celulares. Esto se puede llevar a cabo mediante una variedad de
procedimientos de aislamiento de proteína, conocidos para los
expertos en la técnica de la purificación de inmunoglobulina. Los
medios para preparar y caracterizar anticuerpos son muy conocidos en
la técnica (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboraty Manual,
1988).
Por ejemplo, los sobrenadantes de cuadromas
seleccionados se pasan sobre columnas de sefarosa proteína A o
proteína G para enlazar IgG (dependiendo del isotipo). Entonces los
anticuerpos se eluyen con, por ejemplo un regulador citrato con pH
5,0. Las fracciones eluidas que contienen los anticuerpos
biespecíficos se dializan contra un regulador isotónico.
Alternativamente, el eluido también se pasa sobre una columna de
sefarosa anti-inmunoglobulina. Los anticuerpos
biespecíficos se eluyen con cloruro de magnesio 3,5 M. Los
anticuerpos biespecíficos purificados de esta manera se prueban para
determinar su actividad de enlace mediante, por ejemplo, un ensayo
inmunosorbente de enzima enlazada específico de isotipo y un ensayo
de tinción de inmunofluorescencia de las células objetivo, como se
ha descrito anteriormente.
Los anticuerpos biespecíficos purificados y los
anticuerpos padres también se pueden caracterizar y aislar mediante
electroforesis SDS-PAGE, seguido por tinción con
plata o Coomassie. Esto es posible cuando uno de los anticuerpos
padres tiene un peso molecular mayor que el otro, en donde la banda
de los anticuerpos biespecíficos migra a medio camino entre el de
los dos anticuerpos padres. La reducción de las muestras verifica la
presencia de cadenas pesadas con dos diferentes pesos moleculares
aparentes.
Además, ahora está disponible tecnología
recombinante para la preparación de anticuerpos en general,
permitiendo la preparación de genes de anticuerpo recombinante que
codifican un anticuerpo que tiene la especificidad dual deseada (Van
Duk y colaboradores, 1989). De este modo, después de seleccionar los
anticuerpos monoclonales que tienen las características de enlace
más preferentes, se pueden aislar los respectivos genes para estos
anticuerpos, por ejemplo, mediante selección inmunológica de una
biblioteca de expresión de fago (Oi y Morrison, 1986; Winter y
Milstein, 1991). Luego, a través de la redisposición de los dominios
de codificación de Fab, fácilmente se puede obtener la construcción
quimérica adecuada.
Las composiciones de Factor de Tejido en
combinación ya sea con inmunotoxinas o coaguligandos están
destinadas a su uso en el tratamiento clínico de varios cánceres
humanos y aún otros desórdenes, tales como hiperplasia prostática
benigna y artritis reumatoide, en las cuales la detención a plazo
medio o más largo del flujo sanguíneo sería ventajoso.
La combinación de las composiciones de factor de
tejido descritas en la presente solicitud con inmunotoxinas y
coaguligandos se considera que son herramientas particularmente
útiles en la terapia antitumor. A partir de los datos presentados en
la presente descripción, incluyendo los estudios de animales, y el
conocimiento en la técnica con respecto al tratamiento del linfoma
(Glennie y colaboradores, 1988), se pueden desarrollar directamente
dosis apropiadas y regímenes de tratamiento teniendo como objetivo
las células T (Nolan y Kennedy, 1990) y teniendo como objetivo
fármacos (Paulus, 1985).
Actualmente se propone que las dosis efectivas de
inmunotoxinas y coaguligandos para su uso con las construcciones de
factor de tejido descritas anteriormente en el tratamiento del
cáncer estarán entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 2
mg/kg, y preferiblemente, de entre aproximadamente 0,8 mg/kg y
aproximadamente 1,2 mg/kg, cuando se administran a través de la ruta
IV a una frecuencia de aproximadamente una vez por semana. Ocurrirá
necesariamente alguna variación en dosificación dependiendo del
estado del sujeto que se esta tratando. La persona responsable para
la administración, en cualquier caso, determinará la dosis adecuada
para el sujeto individual. Esta optimización y ajuste se lleva a
cabo de manera rutinaria en la técnica y de ninguna manera refleja
una cantidad indebida de experimentación.
Naturalmente, antes de que su uso se extienda
ampliamente, se llevaran a cabo estudios en animales y ensayos
clínicos adicionales. Los distintos elementos para conducir un
ensayo clínico, incluyendo el tratamiento al paciente y la
supervisión, serán conocidos para los expertos en la técnica a la
luz de la presente descripción. La siguiente información se está
presentando como una pauta general para su uso en el establecimiento
de estos ensayos.
Se tiene en cuenta que los pacientes elegidos
para estudios combinados habrían fallado a responder a como mínimo
un curso de terapia convencional y debían de tener enfermedad
objetivamente medible como se determina por examen físico, técnicas
de laboratorio, o procedimientos radiográficos. Cuando se emplean
partes de anticuerpo monoclonal murino en las inmunotoxinas o
coaguligandos, los pacientes deberán no haber tenido historia de
alergia a inmunoglobulina de ratón. Cualquier quimioterapia deberá
detenerse como mínimo dos semanas antes de entrar en el estudio.
Con respecto a la administración de las
construcciones de factor de tejido, ya sea con inmunotoxinas o
coaguligandos, se considera que ciertas ventajas se encontrarán en
el uso de un catéter venoso central residente con una puerta de
lumen triple. Las mezclas terapéuticas deberán filtrarse, por
ejemplo, usando un filtro de 0,22 \mu, y diluirse adecuadamente,
tal como con solución salina, hasta un volumen final de 100 ml.
Antes del uso, la muestra de la prueba también deberá filtrarse de
una manera similar, y su concentración valorarse antes y después de
la filtración determinando el A_{280}. La recuperación esperada
deberá ser dentro del rango de 87 a 99%, y se considerarán ajustes
para la pérdida de proteína.
Estas combinaciones de factor de tejido y de
inmunotoxina o coaguligando se pueden administrar durante un período
de aproximadamente 4-24 horas, recibiendo cada
paciente de 2 a 4 infusiones en intervalos de 2 a 7 días. La
administración también se puede llevar a cabo mediante un régimen
estable de infusión durante un período de 7 días. La infusión dada a
cualquier nivel de dosis deberá depender de cualquier toxicidad
observada. Por lo tanto, si se alcanza la toxicidad de grado II
después de cualquier infusión simple, o en un período de tiempo
particular para una infusión de régimen estable, deberán retenerse
otras dosis o detenerse la infusión a régimen estable hasta que la
toxicidad mejore. Las dosis crecientes de factor de tejido ya sea
con inmunotoxinas o coaguligandos deberán administrarse a grupos de
pacientes hasta que aproximadamente el 60% de los pacientes muestren
toxicidad inaceptable de grado III o IV en cualquier categoría. Las
dosis que son 2/3 de este valor deberán definirse como la dosis
segura.
El examen físico, mediciones del tumor, y pruebas
de laboratorio, desde luego deberán realizarse antes del tratamiento
y en intervalos de hasta un mes después. Las pruebas de laboratorio
deberán incluir conteos completos de sangre, creatinina de suero,
quinasa creatina, electrólitos, urea, nitrógeno, SGOT, bilirrubina,
albúmina, y proteína en suero total. Las muestras de suero tomadas
hasta 60 días después del tratamiento deberán evaluarse mediante
radioinmunoensayo para determinar la presencia del factor de tejido
intacto, inmunotoxina y/o coaguligando o componentes de los mismos y
anticuerpos contra cualquier parte de los mismos. Análisis
inmunológico de suero, usando cualquier ensayo estándar tal como,
por ejemplo, un ensayo inmunosorbente de enzima enlazada o
radioinmunoensayo, permitirán que se evalúe la
fármaco-cinética y la eliminación de la sustancia
terapéutica.
Para evaluar las respuestas antitumor, se tiene
en cuenta que los pacientes deberán ser examinados a las 48 horas a
una semana y de nuevo 30 días después de la ultima infusión. Cuando
está presente una enfermedad palpable, deberán medirse diariamente
dos diámetros perpendiculares de todas las masas durante el
tratamiento, dentro de una semana después de completar la terapia, y
a los 30 días. Para medir la enfermedad no palpable, se realizarán
rastreos CT en serie a intervalos de un centímetro en todo el pecho,
abdomen, y pelvis a las 48 horas hasta una semana y de nuevo a los
30 días. Las muestras de tejido deberán también evaluarse
histológicamente, y/o mediante citometría de flujo, usando biopsias
de los sitios de enfermedad o incluso muestras de sangre o fluidos
si es adecuado.
Las respuestas clínicas se pueden definir por
medición aceptable. Por ejemplo, una respuesta completa se puede
definir mediante la desaparición de todo tumor medible un mes
después del tratamiento. Mientras que una respuesta parcial se puede
definir mediante una reducción del 50% o mayor de la suma de los
productos de los diámetros perpendiculares de todos los módulos
tumorales evaluables un mes después del tratamiento, sin sitios de
localización del tumor que muestren agrandamiento. De manera
similar, se puede definir una respuesta mixta por una reducción del
producto de diámetros perpendiculares de todas la lesiones medibles
por 50% o más un mes después del tratamiento, con avance en uno o
más sitios.
Se demuestra en la presente descripción que la
actividad antitumor del factor de tejido truncado se aumenta
conjugando el factor de tejido truncado con moléculas portadoras,
tales como inmunoglobulinas, que retrasan la eliminación del factor
de tejido truncado del cuerpo. Por ejemplo, enlazando el factor de
tejido truncado a inmunoglobulina se aumenta la actividad antitumor
prolongando la vida media en vivo del factor de tejido truncado de
manera que el factor de tejido truncado persiste durante más tiempo
y tiene más tiempo para inducir eventos trombóticos en los vasos
tumorales. La prolongación en la vida media es resultado ya sea del
aumento en tamaño del factor de tejido truncado por encima del
umbral para la filtración glomerular; o de la readsorción activa del
conjugado dentro del riñón, una propiedad de la pieza Fc de
inmunoglobulina (Spiegelberg y Weigle, 1965). También es posible que
el componente de inmunoglobulina cambie la conformación del factor
de tejido truncado para volverlo más activo o estable. Se tienen en
cuenta otras moléculas portadoras además de inmunoglobulina para
producir efectos similares y se incluyen entonces dentro de la
presente invención.
Dado que una primera interpretación de la vida
media prolongada observada después del enlace del factor de tejido
truncado a la inmunoglobulina es simplemente que el aumento
resultante en tamaño conduce a vida media prolongada del plasma, los
inventores tienen en cuenta que otras modificaciones que aumentan el
tamaño de las construcciones del factor de tejido se pueden usar de
manera ventajosa en relación con la presente invención, en tanto la
modificación de alargamiento no restaure sustancialmente la
funcionalidad de enlace de membrana con la construcción de factor de
tejido modificada. En ausencia de una posibilidad así, que
fácilmente se puede probar, virtualmente cualquier molécula
generalmente inerte biológicamente aceptable se puede conjugar con
una construcción de Factor de Tejido con el fin de preparar un
Factor de Tejido modificado con vida media aumentada en vivo.
La modificación también se puede hacer a la
estructura del Factor de Tejido mismo para volverlo más estable, o
tal vez para reducir el régimen de catabolismo en el cuerpo. Un
mecanismo para estas modificaciones es el uso de
d-aminoácidos en lugar de
l-aminoácidos en la molécula de Factor de Tejido.
Los técnicos con experiencia ordinaria en el campo entenderán que la
introducción de estas modificaciones necesita ser seguida por
pruebas rigurosas de la molécula resultante para asegurar que
todavía retiene las propiedades biológicas deseadas. Otras
modificaciones estabilizantes incluyen el uso de la adición de
fracciones estabilizantes ya sea al N-terminal o al
C-terminal o a ambos, lo cual generalmente se usa
para prolongar la vida media de las moléculas biológicas. A manera
de ejemplo solamente, se puede desear modificar los términos de las
construcciones de Factor de Tejido mediante acilación o aminación.
La variedad de estas modificaciones también se pueden emplear
juntas, y también se pueden reemplazar partes de la molécula de
Factor de Tejido por estructuras químicas peptidomiméticas que den
como resultado el mantenimiento de la función biológica y todavía
mejoren la estabilidad de la molécula.
Las técnicas útiles en relación con las proteínas
de conjugación de interés para proteínas portadoras se usan
ampliamente en la comunidad científica. Generalmente se entenderá
que en la preparación de estos conjugados de Factor de Tejido para
el uso en la presente invención, la proteína elegida como una
molécula portadora deberá tener ciertas propiedades definidas. Por
ejemplo, desde luego debe ser biológicamente compatible y no dar
como resultado ningún efecto contrario significativo después de la
administración a un paciente. Además, generalmente se requiere que
la proteína portadora sea relativamente inerte, y no inmunogénica,
ambas propiedades darán como resultado el mantenimiento de la
función del Factor de Tejido y permitirán que la construcción
resultante evite la excreción a través del riñón. Las proteínas a
título de ejemplo son albúminas y globulinas.
En común con los conjugados de proteínas
descritos anteriormente, las moléculas de Factor de Tejido de la
presente invención también pueden estar conjugadas a elementos que
no son proteínas con el fin de mejorar su vida media in vivo.
De nuevo, la elección de moléculas no proteínas para su uso en estos
conjugados fácilmente será aparente para los expertos en la técnica.
Por ejemplo, se pueden usar uno o más de una variedad de polímeros
naturales o sintéticos, incluyendo polisacáridos y
polietilenglicol.
En el contexto de preparar conjugados, ya sean
proteínicos o no proteínicos, se debe tener cuidado en que el
conjugado introducido no reasocie sustancialmente la molécula de
Factor de Tejido modificada con la membrana del plasma de manera que
aumente su capacidad de coagulación y dé como resultado una molécula
que ejerza efectos colaterales dañinos después de su administración.
Como regla general, se cree que las adiciones hidrofóbicas o
conjugados en gran medida se deben evitar en relación con estas
realizaciones.
Cuando se usan anticuerpos para conjugar a las
composiciones de Factor de Tejido truncado de la presente invención,
la elección del anticuerpo generalmente dependerá del uso destinado
del conjugado de Factor de Tejido-anticuerpo. Por
ejemplo, cuando se destinan inmunoconjugados de Factor de Tejido a
su uso en adición a las moléculas de Factor de Tejido solas, el tipo
de tumor deberá considerarse, por ejemplo, si es preferible
dirigirse a las células del tumor, o más preferiblemente, a la
vasculatura tumoral o al estroma tumoral. Como los inmunoconjugados
del Factor de Tejido son ellos mismos las sustancias terapéuticas
primarias, los inmunoconjugados de ninguna manera serán un
``inmunoconjugado objetivo''. En estos aspectos, la conjugación de
la molécula del Factor de Tejido a un anticuerpo o parte del mismo
simplemente se lleva a cabo con el fin de generar una construcción
que tenga vida media mejorada y/o biodisponibilidad en comparación
con la molécula de Factor de Tejido original. En cualquier caso, se
pueden lograr ciertas ventajas a través de la aplicación de tipos
particulares de anticuerpos. Por ejemplo, aunque se espera que los
anticuerpos basados en IgG exhiban mejores capacidades de enlace y
eliminación en la sangre más lenta que sus contrapartes Fab', las
composiciones basadas en fragmentos de Fab' generalmente exhiben
mejor capacidad de penetración en el tejido.
Los elementos para preparar y caracterizar
anticuerpos son muy conocidos en la técnica (Véase, por ejemplo,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
1988).
Los métodos para generar anticuerpo monoclonales
(MAbs) generalmente comienzan a lo largo de las mismas líneas que
los de preparar anticuerpos policlonales. En resumen, un anticuerpo
policlonal se prepara inmunizando a un animal con una composición
inmunogénica de acuerdo con la presente invención, ya sea con o sin
inmunotolerancia anterior, dependiendo de la composición de antígeno
y del protocolo que se está empleando (por ejemplo, tolerar a una
población de células normales y luego inmunizarlas con una población
de células tumorales), y recolectar el antisuero a partir del animal
inmunizado. Se puede usar un rango amplio de especies animales para
la producción de antisuero. Típicamente el animal usado para la
producción de antisuero es un conejo, un ratón, una rata, un
hámster, un conejillo de indias o una cabra. Debido al volumen
relativamente grande de sangre de los conejos, un conejo es una
elección preferente para la producción de anticuerpos
policlonales.
Como se sabe bien en la técnica, una composición
dada puede variar en su inmunogeneicidad. Frecuentemente es
necesario por lo tanto elevar el sistema inmune del huésped, como se
puede lograr acoplando un péptido o inmunógeno polipéptido a un
portador. Los portadores preferentes y a título de ejemplo son la
hemocianina de lapa en forma de cerradura (KLH) y albúmina de suero
bovino (ASB). También se pueden usar como portadores otras albúminas
tales como albúmina de huevo, albúmina de suero de ratón o albúmina
de suero de conejo. Los elementos para conjugar un polipéptido a una
proteína portadora son muy conocidos en la técnica e incluyen
glutaraldehído, éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida,
carbodiimida y bencidina bis-biazotizada.
Como se sabe bien en la técnica, la
inmunogeneicidad de una composición inmunógena particular se puede
aumentar mediante el uso de estimuladores no específicos de la
respuesta inmune, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes a título
de ejemplo y preferentes incluyen adyuvante de Freund (un
estimulador no específico de la respuesta inmune que contiene
Mycobacterium tuberculosis muertos), adyuvantes incompletos
de Freund y adyuvante de hidróxido de aluminio.
La cantidad de composición de inmunógeno usada en
la producción de anticuerpos policlonales varía según la naturaleza
del inmunógeno así como del animal usado para la inmunización. Se
puede usar una variedad de rutas para administrar el inmunógeno
(subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e
intraperitoneal). La producción de anticuerpos policlonales se puede
supervisar muestreando sangre del animal inmunizado en varios puntos
después de la inmunización. Se puede dar también una segunda
inyección de refuerzo. El proceso de reforzar y titular se repite
hasta que se logra una titulación conveniente. Cuando se obtiene un
nivel de titulación deseado, el animal inmunizado se puede sangrar y
el suero se aísla y almacena, y/o el animal se puede usar para
generar anticuerpos monoclonales.
Se pueden preparar fácilmente anticuerpos
monoclonales mediante el uso de técnicas muy conocidas, tales como
las ejemplificadas en la Patente U.S.A. número 4.196.265.
Típicamente, esta técnica involucra inmunización de un animal
conveniente con una composición de inmunógeno seleccionada, por
ejemplo, una célula tumoral purificada o parcialmente purificada, o
proteína de célula endotelial vascular, polipéptido, péptido, o
composición celular intacta. La composición inmunizante se
administra de una manera efectiva para estimular a las células que
producen anticuerpos. Los roedores tales como los ratones y las
ratas son los animales preferentes, sin embargo, también es posible
el uso de células de conejo, borrego, rana. El uso de ratas puede
proporcionar ciertas ventajas (Goding, 1986, páginas
60-61), pero se prefieren los ratones, siendo los
ratones más preferentes los BALB/c, ya que éste se usa más
rutinariamente y generalmente da un porcentaje más alto de fusiones
estables.
Después de la inmunización, se seleccionan
células somáticas con el potencial para producir anticuerpos,
específicamente linfocitos B (células B), para su uso en el
protocolo de generación de anticuerpos monoclonales. Estas células
se pueden obtener a partir de bazos, amígdalas o nodos linfáticos de
biopsias, o a partir de una muestra de sangre periférica. Se
prefieren las células de bazo y las células de sangre periférica,
las primeras debido a que son una fuente rica de células que
producen anticuerpos que están en la etapa de división de
plasmablasto, y las últimas debido a que la sangre periférica es
fácilmente accesible. Frecuentemente, se habrá inmunizado un
conjunto de animales y el bazo del animal con la titulación de
anticuerpos más alta será eliminado y se obtendrán los linfocitos
del bazo homogeneizando el bazo con una jeringa. Típicamente, el
bazo de un ratón inmunizado contiene aproximadamente de 5 X 10^{7}
hasta 2 X 10^{8} linfocitos.
Los linfocitos B que producen anticuerpos a
partir del animal inmunizado se funden entonces con células de una
célula de mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie que
el animal que se inmunizó. Las líneas de células de mieloma
convenientes para su uso en procedimientos de fusión que produce
hibridoma preferiblemente son no productores de anticuerpos, que
tienen eficiencia de fusión alta, y deficiencias de enzimas que los
vuelven incapaces de crecer en cierto medio selectivo que soporta el
crecimiento de solamente las células fusionadas deseadas
(hibridomas).
Se puede usar cualquiera de varias células de
mieloma, como lo saben los expertos en la técnica (Goding, páginas
65-66, 1986; Campbell, páginas
75-83, 1984). Por ejemplo, cuando el animal
inmunizado es un ratón, se puede usar P3-X63/Ag8,
X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1,
Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11,
MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul;
para ratas se puede usar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3,
IR983F, 4B210 o alguna de las líneas celulares de ratón mencionadas
anteriormente; y U-266, GM1500-GRG2,
LICR-LON-HMy2 y
UC729-6, son útiles en relación con las fusiones
celulares humanas.
Los métodos para generar híbridos de bazo
productor de anticuerpo o células de nodo linfático y células de
mieloma usualmente comprenden mezclar células somáticas con células
de mieloma en una proporción de 4:1, aunque la proporción puede
variar desde aproximadamente 20:1 hasta aproximadamente 1:1,
respectivamente, en la presencia de una sustancia o sustancias
(químicas o eléctricas) que promueven la fusión de las membranas
celulares. Los métodos de fusión que usan virus Sendai han sido
descritos por Kohler y Milstein (1975; 1976), y las que usan
polietilenglicol (PEG), tales como 37% (volumen/volumen) de
polietilenglicol, por Gefter y colaboradores, (1977). El uso de
métodos de fusión inducida eléctricamente también es adecuado
(Goding páginas 71-74, 1986).
Los procedimientos de fusión usualmente producen
híbridos viables a frecuencias bajas, aproximadamente 1 X 10^{-6}
hasta 1 X 10^{-8}. Sin embargo, esto no plantea un problema, ya
que los híbridos fusionados, viables, se diferencian de las células
no fundidas, padres, (particularmente las células de mieloma no
fundidas que normalmente continuarían dividiéndose indefinidamente)
cultivándolas en un medio selectivo. El medio selectivo generalmente
es uno que contiene una sustancia que bloquea la síntesis de
novo de nucleótidos en el medio de cultivo de tejido. Las
sustancias a título de ejemplo y preferentes son aminopterina,
metotrexato, y azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean
la síntesis de novo} tanto de las purinas como de las pirimidinas,
mientras que la azaserina bloquea solamente la síntesis de purina.
Cuando se usa aminopterina o metotrexato, el medio se suplementa con
hipoxantina y timidina como una fuente de nucleótidos (medio HAT
(``hipoxantina/ aminopterina/ timidina'')). Cuando se usa azaserina,
el medio se suplementa con hipoxantina.
El medio de selección preferente es hipoxantina/
aminopterina/ timidina. Solamente las células capaces de operar
estas rutas de restauración de nucleótidos son capaces de sobrevivir
en el medio hipoxantina/ aminopterina/ timidina. Las células de
mieloma son defectuosas en enzimas clave de la ruta de restauración,
por ejemplo, hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), y no
pueden sobrevivir. Las células B pueden operar esta ruta, pero
tienen una extensión de vida limitada en cultivo y generalmente
mueren dentro de aproximadamente dos semanas. Por lo tanto, las
únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo son los
híbridos formados de mieloma y células B.
Este cultivo proporciona una población de
hibridomas de los cuales se seleccionan hibridomas específicos.
Típicamente, la selección de hibridomas se lleva a cabo cultivando
las células mediante una dilución de un solo clon en placas de
microtitulación, seguidas por pruebas de los sobrenadantes clonales
individuales (después de aproximadamente dos a tres semanas) para
determinar la reactividad deseada. El ensayo podría ser sensible,
simple y rápido, tal como radioinmunoensayos, inmunoensayos de
enzima, ensayos de citotoxicidad, ensayos de placa, ensayos de
inmunoenlace puntual, y similares.
Los hibridomas seleccionados se diluirían
serialmente y clonarían en líneas celulares que producen anticuerpos
individuales, cuyos clones pueden entonces propagarse
indefinidamente para proporcionar anticuerpos monoclonales. Las
líneas celulares se pueden explotar para la producción de
anticuerpos monoclonales en dos maneras básicas. Una muestra de
hibridoma se puede inyectar (frecuentemente en la cavidad
peritoneal) en un animal histocompatible del tipo que se usó para
proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión
original. El animal inyectado desarrolla tumores que secretan el
anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido de la
célula fusionada. Los fluidos corporales del animal, tales como
suero o fluido de ascitis, se puede drenar para proporcionar
anticuerpos monoclonales en alta concentración. Las líneas celulares
individuales también podrían cultivarse in vitro, en donde
los anticuerpos monoclonales se secretan naturalmente en el medio de
cultivo a partir del cual se pueden obtener fácilmente en altas
concentraciones. Los anticuerpos monoclonales producidos por
cualquiera de los medios se pueden purificar adicionalmente, si se
desea, usando filtración, centrifugación y varios métodos
cromatográficos tales como HPLC (``cromatografía líquida de alta
presión'') o cromatografía por afinidad.
Los inventores también tienen en cuenta el uso de
un enfoque de clonación molecular para generar monoclonales. Para
esto, se preparan bibliotecas de fagémidos de inmunoglobulina
combinatorias de ARN aislado del bazo de un animal inmunizado, y se
seleccionan los fagémidos que expresan los anticuerpos adecuados
mediante lavado con batea usando células que expresan el antígeno y
células de control por ejemplo, células normales contra tumor. Las
ventajas de este enfoque sobre las técnicas de hibridoma
convencionales son que aproximadamente se pueden producir y
seleccionar 10^{4} veces más anticuerpos en una sola ronda, y que
se generan nuevas especificidades mediante la combinación de cadena
H y L que además aumenta la oportunidad de encontrar anticuerpos
adecuados.
Cuando se emplean anticuerpos monoclonales en la
presente invención, pueden ser de origen humano, murino, de mono, de
rata, de hámster, de pollo o incluso de conejo. La invención prevé
el uso de anticuerpos humanos, anticuerpos ``humanizados'' o
quiméricos de ratón, rata o de otras especies, que tienen regiones
de dominio constante y/o variable humana, y otros anticuerpos
recombinantes y fragmentos de los mismos. Desde luego, debido a la
facilidad de preparación y disponibilidad inmediata de los
reactivos, se prefieren típicamente los anticuerpos monoclonales
murinos.
Se pueden obtener fragmentos de anticuerpos
funcionales mediante la proteólisis de la inmunoglobulina completa
mediante la tiolproteasa no específica, papaína. La papaína primero
debe activarse reduciendo el grupo sulfidrilo en el sitio activo con
cisteína, 2-mercaptoetanol o ditiotreitol. Se deben
eliminar los metales pesados en el material enzimático mediante
quelación con EDTA (2 mM) para asegurar la actividad enzimática
máxima. La enzima y el sustrato normalmente se mezclan entre sí a
una proporción de 1:100 en peso. Después de la incubación, la
reacción se puede detener mediante alquilación irreversible del
grupo tiol con yodoacetamida o simplemente mediante diálisis. Deberá
supervisarse la terminación de la digestión mediante
SDS-PAGE y las distintas fracciones separarse
mediante la proteína A-sefarosa o cromatografía de
intercambio iónico.
El procedimiento usual para la preparación de
fragmentos F(ab')_{2} de inmunoglobulina G de conejo y de
origen humano es la proteólisis limitada por la enzima pepsina
(Protocolo 7.3.2.). Las condiciones, 100x exceso de anticuerpo
peso/peso en regulador de acetato a pH 4,5, a 37ºC, sugieren que el
anticuerpo se disocia en el lado terminal C del enlace disulfuro de
inter-cadena pesada. Las velocidades de digestión de
inmunoglobulina G de ratón pueden variar con las subclases y puede
ser difícil obtener altos rendimientos de fragmentos
F(ab')_{2} activo sin alguna inmunoglobulina G no digerida
o completamente degradada. En particular, la IgG_{2b} es muy
susceptible a la degradación completa. Las otras subclases requieren
diferentes condiciones de incubación para producir resultados
óptimos.
La digestión de IgG de rata mediante pepsina
requiere condiciones que incluyen la diálisis en 0,1 M de regulador
acetato, pH 4,5, y luego incubación durante 4 horas con 1% de
peso/peso de pepsina; la digestión de IgG_{1} y IgG_{2a} mejora
si primero se dializa respecto al regulador formato 0,1 M, pH 2,8, a
4ºC, durante 16 horas seguido por regulador acetato. IgG_{2b} da
resultados más consistentes con incubación en proteasa V8 de
estafilococo (3% peso/peso) en 0,1 M regulador de fosfato de sodio,
pH 7,8, durante 4 horas a 37ºC.
Los inventores tienen en cuenta que la parte Fc
de la inmunoglobulina en la construcción de Factor de Tejido
truncado-inmunoglobulina empleada en los estudios
ventajosos descritos en la presente descripción realmente puede ser
la parte relevante de la molécula de anticuerpo, dando como
resultado una vida media en vivo aumentada. Es razonable presumir
que la conjugación de la región Fc dé como resultado una readsorción
activa de un conjugado de TF-Fc dentro del riñón,
restableciendo el conjugado a la circulación sistémica. Como tal, se
puede conjugar cualquiera de las construcciones de Factor de Tejido
de coagulación deficiente o variantes de la invención a una región
Fc con el fin de aumentar la vida media in vivo del conjugado
resultante.
Están disponibles varios métodos para producir
regiones Fc de pureza suficiente para permitir su conjugación a las
construcciones de Factor de Tejido. A manera de ejemplo solamente,
la disociación química de anticuerpos para proporcionar los dominios
definidos o partes se conoce bien y se practica fácilmente, y
también se puede emplear tecnología recombinante para preparar
cantidades sustanciales de regiones Fc o, sin duda, preparar el
conjugado de TF-Fc entero después de la generación
de un vector recombinante que expresa la proteína de fusión
deseada.
Otras manipulaciones de la estructura de
inmunoglobulina general también se pueden llevar a cabo con el
objeto de proporcionar la segunda generación de construcciones de
Factor de Tejido con vida media aumentada. A manera de ejemplo
solamente, se puede considerar reemplazar el dominio C_{H}3 de una
molécula de IgG con un Factor de Tejido truncado o un variante del
mismo. En general, el mecanismo más efectivo para producir esta
molécula híbrida será usar técnicas de clonación molecular y
expresión recombinante. Todas estas técnicas generalmente son
conocidas por los expertos en la técnica, y se describen en detalle
en la presente descripción.
Las composiciones anteriores se pueden enlazar a
las composiciones de Factor de Tejido de cualquier manera operativa
que permita que cada región realice su función pretendida sin
deterioro significativo de las funciones del Factor de Tejido. De
este modo, los componentes de enlace serán capaces de prolongar la
vida media de la construcción, y el Factor de Tejido es capaz de
promover la coagulación de la sangre.
La unión de cualquiera de los componentes
anteriores, a una composición de Factor de Tejido generalmente
empleará la misma tecnología que la desarrollada para la preparación
de inmunotoxinas. Se considera como una pauta general que cualquier
reticulador bioquímico que sea adecuado para su uso en una
inmunotoxina también será útil en el presente contexto, y también se
pueden considerar enlazadores adicionales.
Los reactivos de reticulación se usan para formar
puentes moleculares que atan entre sí grupos funcionales de dos
diferentes moléculas, por ejemplo, una sustancia estabilizante y
coagulante. Para enlazar dos proteínas diferentes de una manera
escalonada, se pueden usar reticuladores
hetero-bifuncionales que eliminen la formación de
homopolímeros indeseados.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|c|}\hline
Enlazador \+ Reactivo Hacia \+ Ventajas y Aplicaciones \+
Distancia del \\ \+ \+ \+ brazo separador \\ \+ \+ \+
después \\ \+ \+ \+ reticulación \\\hline SMPT \+ Aminas
primarias \+ x Mayor estabilidad \+ 11,2 A \\ \+ sulfidrilos \+
\+ \\\hline SPDP \+ Aminas primarias \+ x Tiolación \+ 6,8 A \\
\+ sulfidrilos \+ x Reticulación \+ \\ \+ \+ disociable \+
\\\hline LC-SPDP \+ Aminas primarias \+ x
Separación extendida \+ 15,6 A \\ \+ sulfidrilos \+ \+ \\\hline
Sulfo-LC- \+ Aminas primarias \+ x Separación
extendida \+ 15,6 A \\ SPDP \+ sulfidrilos \+ x Soluble en agua
\+ \\\hline SMCC \+ Aminas primarias \+ x Grupo reactivo \+ 11,6
A \\ \+ sulfidrilos \+ maleimida estable \+ \\ \+ \+ x
Conjugación enzima- \+ \\ \+ \+ Anticuerpo \+ \\ \+ \+ x
Conjugación de Hapten- \+ \\ \+ \+ proteína portadora \+ \\\hline
Sulfo-SMCC \+ Aminas primarias \+ x Grupo
reactivo \+ 11,6 A \\ \+ sulfidrilos \+ maleimida estable \+ \\
\+ \+ x Soluble en agua \+ \\ \+ \+ x Conjugación enzima- \+ \\
\+ \+ Anticuerpo \+ \\\hline MBS \+ Aminas primarias \+ x
Conjugación enzima- \+ 9,9 A \\ \+ sulfidrilos \+ Anticuerpo \+
\\ \+ \+ x Conjugación Hapten- \+ \\ \+ \+ proteína portadora
\+ \\\hline Sulfo-MBS \+ Aminas primarias \+ x
Soluble en agua \+ 9,9 A \\ \+ sulfidrilos \+ \+ \\\hline SIAB
\+ Aminas primarias \+ x Conjugación enzima- \+ 10,6 A \\ \+
sulfidrilos \+ anticuerpo \+ \\\hline Sulfo-SIAB
\+ Aminas primarias \+ x Soluble en agua \+ 10,6 A \\ \+
sulfidrilos \+ \+ \\\hline SMPB \+ Aminas primarias \+ x
Separación extendida \+ 14,5 A \\ \+ sulfidrilos \+ x
Conjugación enzima- \+ \\ \+ \+ anticuerpo \+ \\\hline
Sulfo-SMPB \+ Aminas primarias \+ x Separación
extendida \+ 14,5 A \\ \+ sulfidrilos \+ x Soluble en agua \+
\\\hline EDC/Sulfo- \+ Aminas primarias \+ x Conjugación Hapten-
\+ 0 \\ NHS \+ Grupos carboxilo \+ portadora \+ \\\hline ABH \+
Carbohidratos no \+ x Reacciona con grupos \+ 11,9 A \\ \+
selectivos \+ azúcar \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Un ejemplo de reticulador
hetero-bifuncional contiene dos grupos reactivos:
uno que reacciona con el grupo amina primario (por ejemplo
N-hidroxisuccinimida) y el otro que reacciona con un
grupo tiol (por ejemplo, disulfuro de piridilo, maleimidas,
halógenos, etc.). A través del grupo reactivo de amina primaria, el
reticulador puede reaccionar con los residuos lisina de una proteína
(por ejemplo, el anticuerpo o fragmento seleccionado) y a través del
grupo reactivo tiol, el reticulador, ya unido a la primera proteína,
reacciona con el residuo cisteína (grupo sulfidrilo libre) de la
otra proteína (por ejemplo, el coagulante).
Por lo tanto se puede ver que la composición
preferente de Factor de Tejido generalmente tendrá, o se derivará a
tener, un grupo funcional disponible para fines de reticulación.
Este requisito no se considera que sea limitante, ya que una amplia
variedad de grupos se puede usar de esta manera. Por ejemplo, grupos
amina primaria o secundaria, grupos hidrazida o hidrazina, alcohol
carboxílico, fosfato, o grupos alquilantes se pueden usar para
enlace o reticulación. Para una vista general de la tecnología de
enlace, se puede desear hacer referencia a Ghose y Blair (1987).
El brazo separador entre los dos grupos reactivos
de un reticulador puede tener distintos tamaños y composiciones
químicas. Un brazo separador más largo permite una mejor
flexibilidad de los componentes del conjugado mientras que algunos
componentes particulares en el puente (por ejemplo, grupo benceno)
pueden prestar estabilidad extra al grupo reactivo o una resistencia
aumentada del enlace químico a la acción de varios aspectos (por
ejemplo, enlace disulfuro resistente a las sustancias reductoras).
También se tiene en cuenta el uso de separadores péptidos, tales
como
L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala.
Es preferible emplear un reticulador que tenga
estabilidad razonable en la sangre. Se conocen numerosos tipos de
uniones disulfuro que contienen enlazadores que pueden emplearse de
manera exitosa para conjugar sustancias objetivo y coagulantes. Los
enlazadores que contienen un enlace disulfuro que esté impedido
estéricamente pueden probar dar mayor estabilidad en vivo, evitando
la liberación del Factor de Tejido antes de unirse al sitio de
acción. Estos enlazadores son entonces un grupo preferente de
sustancias de enlace.
Uno de los reactivos de reticulación más
preferentes para su uso en inmunotoxinas es SMPT, el cual es un
reticulador bifuncional que contiene un enlace disulfuro que está
``impedido estéricamente'' mediante un anillo benceno adyacente y
grupos metilo. Se cree que el impedimento estérico del enlace
disulfuro sirve una función de protección de enlace del ataque de
aniones tiolato tales como glutationa, los cuales pueden estar
presentes en tejidos y sangre, y mediante los cuales se ayuda a
evitar el desacoplamiento del conjugado antes de la administración
de la sustancia unida al sitio de localización del tumor. Se tiene
en cuenta que la sustancia SMPT también se puede usar en relación
con los ligandos coagulantes biespecíficos de esta invención.
El reactivo de reticulación SMPT, junto con otros
muchos reactivos de reticulación conocidos, presta la capacidad de
reticular grupos funcionales tales como el SH de la cisteína o
aminas primarias (por ejemplo, el grupo épsilon amino de la lisina).
Otro tipo posible de reticulador incluye las fenilazidas
fotorreactivas hetero-bifuncionales que contienen un
enlace disulfuro disociable tal como
sulfosuccinimidil-2-(p-azido
salicilamido)
etilo-1,3'-ditiopropionato. El grupo
N-hidroxi-succinimidilo reacciona
con los grupos amino primarios y la fenilazida (después de la
fotólisis) reacciona no selectivamente con cualquier residuo de
aminoácido.
Además de los reticuladores impedidos, también se
pueden emplear enlazadores no impedidos de acuerdo con la presente
descripción. Otros reticuladores útiles, no considerados para
contener o generar un disulfuro protegido, incluyen SATA, SPDP y
2-iminotiolano (Wawrzynczak y Thorpe, 1987). El uso
de estos reticuladores es muy bien entendido en la técnica.
En cuanto está conjugado, el Factor de Tejido
truncado generalmente se purifica para separar el conjugado de
sustancias objetivos no conjugadas o coagulantes o de otros
contaminantes. Un gran número de técnicas de purificación están
disponibles para su uso para proporcionar conjugados de un grado
suficiente de pureza para volverlos clínicamente útiles. Los métodos
de purificación basados en la separación por tamaño, tales como la
filtración en gel, la permeación en gel o la cromatografía líquida
de alto rendimiento, generalmente serán de mucho uso. También se
pueden usar otras técnicas cromatográficas, tales como la separación
por Azul-Sefarosa.
Las composiciones de Factor de Tejido truncado de
la invención también pueden ser proteínas de fusión preparadas por
técnicas de biología molecular. El uso de técnicas de ADN
recombinante para lograr estos fines ahora es una práctica común
para los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen, por
ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas
sintéticas y recombinación en vivo/recombinación genética.
Adicionalmente, se pueden realizar síntesis de ADN y ARN usando un
sintetizador automático (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas
en Sambrook y colaboradores, 1989; y Ausubel y colaboradores,
1989).
La preparación de esta proteína de fusión
generalmente conlleva la preparación de una primera y una segunda
regiones de codificación de ADN y la ligadura funcional o la unión
de dichas regiones, en cuadro, para preparar una sola región de
codificación que codifica la proteína de fusión deseada. En el
presente contexto, el Factor de Tejido truncado o la secuencia de
ADN mutante de Factor de Tejido generalmente estará unida en cuadro
con la secuencia de ADN que codifica un portador de proteína inerte,
inmunoglobulina, región Fc, o algo similar. Generalmente no se cree
que sea particularmente relevante si la parte de Factor de Tejido de
la proteína de fusión o la parte inerte se prepara como la región
N-terminal o como la región
C-terminal. En relación con la segunda generación de
moléculas de inmunoglobulina de Factor de Tejido, la secuencias de
codificación del Factor de Tejido pueden además estar insertadas
dentro de las regiones de codificación de inmunoglobulina, de manera
que las secuencias de Factor de Tejido funcionalmente interrumpen a
las secuencias de inmunoglobulina y la proteína codificada se puede
considerar un ``tribrido''.
En cuanto se ha producido la codificación de la
región deseada, se crea un vector de expresión. Los vectores de
expresión contienen uno o más promotores corriente arriba de las
regiones de ADN insertado que actúan para promover la transcripción
del ADN y de este modo promueven la expresión de la proteína
recombinante codificada. Éste es el significado de ``expresión
recombinante'' y se ha discutido en algún otro lado en la
especificación.
Como con otros aspectos de la presente invención,
en cuanto una construcción de Factor de Tejido candidata se ha
generado con la intención de proporcionar una construcción con vida
media en vivo aumentada, la construcción generalmente deberá
probarse para asegurar que las propiedades deseadas han sido
impartidas al compuesto resultante. Los distintos ensayos para su
uso para determinar estos cambios en función son de rutina y los
expertos en la técnica los ponen en práctica fácilmente.
En los conjugados de Factor de Tejido diseñados
simplemente con el fin de aumentar su tamaño, la confirmación de su
tamaño aumentado es completamente rutina. Por ejemplo, simplemente
se separará la composición candidata usando cualquier metodología
que se diseña para separar componentes biológicos con base en el
tamaño y se analizarán los productos separados con el fin de
determinar que se ha generado una construcción de Factor de Tejido
de tamaño aumentado. A manera de ejemplo solamente, se pueden
mencionar gel de separación y columnas de separación, tales como las
columnas de filtración en gel. El uso de columnas de filtración en
gel en la separación de mezclas de componentes conjugados y no
conjugados también puede ser útil en otros aspectos de la presente
invención, tales como en la generación de niveles relativamente
altos de conjugados, inmunotoxinas o coaguligandos.
Como el objetivo de la presente clase de
conjugados es proporcionar una molécula de Factor de Tejido de
coagulación deficiente que tenga una vida media en vivo aumentada,
las variantes modificadas del Factor de Tejido candidatas o los
conjugados generalmente deberán probarse con el fin de confirmar que
está presente esta propiedad. De nuevo, estos ensayos son rutina en
la técnica. Un primer ensayo sería determinar la vida media del
Factor de Tejido modificado o conjugado candidato en un ensayo in
vitro. Estos ensayos generalmente comprenden mezclar la molécula
candidata en suero y determinar si la molécula persiste o no en una
forma relativamente intacta durante un período de tiempo más largo,
en comparación con la muestra inicial de Factor de Tejido de
coagulación deficiente. De nuevo se muestrearán alícuotas de muestra
de la mezcla y se determinará su tamaño y, preferiblemente, su
función biológica.
Los ensayos en vivo de la vida media biológica o
``eliminación'' fácilmente se pueden llevar a cabo. En estos
sistemas, generalmente se prefiere etiquetar las construcciones de
Factor de Tejido candidatas de prueba con un marcador detectable y
seguir la presencia del marcador después de la administración al
animal, preferiblemente a través de la ruta pretendida en la
estrategia de tratamiento terapéutico final. Como parte de este
proceso, se tomarían muestras de fluidos corporales, particularmente
suero y/o muestras de orina, y se analizarían las muestras para
determinar la presencia del marcador asociado con la construcción
del Factor de Tejido, lo cual indicaría la longevidad de la
construcción en el ambiente natural en el cuerpo.
Una o más de una combinación de moléculas del
Factor de Tejido con vida media aumentada se puede usar de este modo
junto con los métodos terapéuticos descritos en la presente
descripción. Las dosis propuestas para la administración
generalmente estarán entre aproximadamente 0,2 miligramos y
aproximadamente 200 miligramos por paciente, como con las
construcciones de Factor de Tejido originales descritas
anteriormente. Sin embargo, ya que estas moléculas de Factor de
Tejido se han modificado, es posible que las dosis efectivas puedan
ser todavía menores, tales como del orden de aproximadamente 0,1
miligramos. Es más probable que los regímenes de tratamiento
terapéutico se alteren cuando se usan Factores de Tejido de vida
media aumentada en el número de veces que los fármacos se
administran, en vez de una alteración de la dosis dada. Por ejemplo,
cuando se propone una construcción de Factor de Tejido original para
su uso en los días 1, 3 y 7 dentro del período de tratamiento, el
Factor de Tejido mejorado de contraparte con vida media más larga se
administraría solamente en el día 1 y en el día 7. En cualquier
caso, todas estas optimizaciones en términos de dosis y tiempos de
administración serán fácilmente determinadas por los técnicos con
experiencia en el campo.
Los inventores han demostrado además que la
actividad que induce la coagulación del Factor de Tejido truncado
unido a células A20 aumentó marcadamente en la presencia del Factor
VIIa. En común con estudios anteriores, estos resultados in
vitro también se trasladan al ambiente en vivo. Los estudios se
presentan en la presente descripción para demostrar que la actividad
antitumor de varias construcciones de Factor de Tejido de
coagulación deficiente aumenta después de la
co-administración con Factor VIIa. Aún usando un
modelo animal experimental del tumor HT29, que es notablemente
difícil de coagular, la co-administración de las
construcciones de Factor de Tejido de coagulación deficiente y el
Factor VIIa exógeno dio como resultado una necrosis considerable del
tejido del tumor.
Estos datos se pueden explicar ya que el Factor
de Tejido truncado se une al Factor VII pero no media eficientemente
su activación al Factor VIIa mediante el Xa y las moléculas de
Factor VIIa adyacentes. Proporcionando una fuente de Factor VIIa
preformado (exógeno) se supera este bloqueo, permitiendo una
coagulación más eficiente. El éxito del tratamiento combinado de
Factor de Tejido de coagulación deficiente y Factor VIIa
generalmente se basa en la sorprendente localización de la
construcción del Factor de Tejido dentro de la vasculatura tumoral.
A falta de esta localización sorprendente y de efectos funcionales
específicos, la coadministración de Factor VIIa no tendría
significado en el contexto del tratamiento del tumor, y puede aún
ser dañino ya que promueve trombosis no deseada en varios tejidos
sanos. El uso combinado del Factor de Tejido truncado y el Factor
VIIa de una manera no dirigida se ha propuesto anteriormente en
relación con el tratamiento de hemofílicos y pacientes con otros
desórdenes sanguíneos, en los cuales hay un deterioro fundamental de
la cascada de coagulación. En la presente invención, la cascada de
coagulación generalmente está completamente operativa, y la
invención terapéutica concentra esta actividad dentro de una región
definida del cuerpo.
Por lo tanto otro objeto es aumentar los efectos
antitumor de cualquiera de las construcciones de Factor de Tejido de
la invención combinando el uso del Factor de Tejido con la
administración adicional del Factor VIIa. Ya que el Factor de Tejido
truncado se une al endotelio vascular del tumor, es posible inyectar
Factor de Tejido truncado en animales que tengan tumor, esperar un
período de tiempo para que se elimine el exceso de Factor de Tejido
truncado, y luego inyectar Factor VIIa para magnificar la acción
trombótica del Factor de Tejido truncado dentro de los vasos del
tumor. De esta manera, el Factor de Tejido truncado u otra
construcción de Factor de Tejido de coagulación deficiente se puede
ver que forme una reserva dentro del tumor, que permite la
administración posterior del Factor VIIa para aumentar y perpetuar
el efecto antitumor.
Otra observación de la presente invención es que
la actividad trombótica de los mutantes de activación del Factor VII
del Factor de Tejido truncado (G164A) y Factor de Tejido truncado
(W158R) fue restaurada en gran medida por el Factor VIIa. Estas
mutaciones están dentro de una región del Factor de Tejido truncado
que es importante para la conversión del Factor VII en Factor VIIa.
Como con el mismo Factor de Tejido truncado, los estudios en la
presente descripción muestran que la adición del Factor VIIa
preformado a menudo supera este bloqueo en la formación de complejo
de coagulación. La presente descripción explota esto y las
observaciones antes mencionadas con el objetivo de dar a conocer
terapia in vivo del cáncer.
Sin duda, los estudios presentados en la presente
descripción confirman que la coadministración de una variante de
mutante de activación del Factor VII del Factor de Tejido con Factor
VIIa preformado da como resultado un daño necrótico considerable a
los tumores, aún en modelos de tumores pequeños que no son los más
dóciles para el tratamiento con la presente invención. Este aspecto
de la invención es particularmente sorprendente, ya que no se creyó
previamente que estos mutantes tendrían ninguna utilidad terapéutica
en ninguna realización distinta que, tal vez, en la inhibición
competitiva del Factor de Tejido como se puede usar para inhibir o
reducir la coagulación. Aparte de esta hipótesis, la generación de
estos mutantes ha sido motivada por interés científico y podrían tal
vez usarse como controles en ciertos estudios in vitro. Sólo
los estudios de los presentes inventores vuelven a estos mutantes
clínicamente útiles, ya sea en el contexto de la administración
dirigida (WO 96/01653), o en los todavía más sorprendentes usos
combinados de la presente invención.
En realizaciones particulares, esta aplicación,
por lo tanto, involucra primero inyectar tTF(G164A),
tTF(W158R) o un equivalente de los mismos en animales que
tengan tumores. Entonces se deja que el mutante de Factor de Tejido
truncado se localice en los vasos tumorales y se elimina el residuo.
Luego, esto es seguido por la inyección del Factor VIIa, lo cual
permite que los mutantes del Factor de Tejido truncado localizados
expresen actividad trombótica. Esta estrategia ofrece la ventaja de
que es muy segura. Los mutantes de Factor de Tejido truncado
prácticamente no son tóxicos, así como el Factor VIIa. De este modo,
la administración del mutante de Factor de Tejido truncado seguido
del Factor VIIa será inocuo al huésped, aunque eficientemente induce
trombosis en los vasos del tumor.
El Factor VII se puede preparar como lo describe
Fair (1983), y como se muestra en las Patentes U.S.A. números
5.374.617, 5.504.064 y 5.504.067. La parte de codificación de la
secuencia de ADNc del Factor VII humano fue dada a conocer por Hagen
y colaboradores, (1986). La secuencia de aminoácido del 1 al 60
corresponde a la secuencia pre-pro/delantera que es
eliminada por la célula antes de la secreción. La cadena madura de
polipéptidos del Factor VII consiste en los aminoácidos 61 a 466. El
Factor VII se convierte en su forma activa, Factor VIIa, mediante la
disociación de un solo enlace péptido entre
arginina-212 e isoleucina-213.
El Factor VII se puede convertir in vitro
en Factor VIIa mediante la incubación de la proteína purificada con
el Factor Xa inmovilizado en cuentas de
Affi-Gel^{MR} 15 (Bio-Rad). La
conversión se puede supervisar mediante electroforesis en gel
SDS-poliacrilamida de muestras reducidas. El Factor
Xa libre en la preparación del Factor VIIa se puede detectar con el
sustrato cromogénico acetato de
metoxicarbonil-D-ciclohexilglicil-glicil-arginina-p-nitroanilida
(Spectrozima^{MR} Factor Xa, American Diagnostica, Greenwich, CT)
a una concentración final de 0,2 mM en la presencia de 50 mM
EDTA.
El Factor VIIa recombinante también se puede
comprar en Novo Biolabs (Danbury, CT).
El uso del Factor VIIa en relación con la
presente invención no se confina a su capacidad para mejorar
significativamente la utilidad de los mutantes de activación del
Factor VII descritos en la presente descripción. Igualmente se tiene
en cuenta que el Factor VIIa se usará junto con las moléculas de
Factor de Tejido de coagulación deficiente de actividad equivalente
al Factor de Tejido truncado empleado primero. En estas
realizaciones de tratamiento, la dosis de la construcción de Factor
de Tejido generalmente estará entre aproximadamente 0,2 miligramos y
aproximadamente 200 miligramos por paciente. Las dosis adecuadas
para el Factor VIIa se pueden determinar mejor a la luz de esta
información.
Por ejemplo, se puede desear crear una proporción
1:1 de la construcción de Factor de Tejido y Factor VIIa en un
precomplejo y administrar la composición preacomplejada al animal.
Si esto se desea, generalmente se mezcla una cantidad de Factor de
Tejido y una cantidad de Factor VIIa suficiente para permitir la
formación de un complejo equimolar. Para lograr esto, debe ser
preferible usar un exceso molar de 2-3 de Factor
VIIa con el fin de asegurar que cada una de las moléculas de Factor
de Tejido se acompleje adecuadamente. Luego simplemente se separaría
el Factor de Tejido no acomplejado y el Factor VIIa de la mezcla
acomplejada usando cualquier técnica conveniente, tal como
filtración en gel. Después de la formación del complejo TF:VIIa,
simplemente se puede administrar el complejo a un paciente que
necesite tratamiento en una dosis de aproximadamente 0,2 miligramos
y aproximadamente 200 miligramos por paciente.
Como se ha indicado anteriormente, generalmente
se puede preferir administrar con anticipación una construcción de
Factor de Tejido de coagulación deficiente a un paciente, dejando el
tiempo suficiente al factor de tejido para localizarse
específicamente dentro del tumor. Después de esta preadministración,
luego se diseñaría una dosis adecuada de Factor VIIa suficiente para
coordinar y acomplejarse con el Factor de Tejido localizado dentro
de la vasculatura del tumor. De nuevo, se podría diseñar la dosis de
Factor VIIa con el fin de permitir que una proporción molar de 1:1
de Factor de Tejido y Factor VIIa se forme en el ambiente del tumor.
Dadas las diferencias en el peso molecular de estas dos moléculas,
se verá que sería recomendable añadir aproximadamente el doble de
cantidad en miligramos del Factor VIIa en comparación con los
miligramos del Factor de Tejido.
Sin embargo, el análisis anterior es únicamente a
título de ejemplo, y cualquier dosis del Factor VIIa que dé como
resultado generalmente un mejoramiento en la coagulación
evidentemente sería de importancia clínica. Con respecto a esto, es
notable que los estudios presentados en la presente descripción de
hecho usan un excedente 16:1 de Factor de Tejido en comparación con
el Factor VIIa, el cual es generalmente aproximadamente un excedente
molar de 32 veces de la construcción de Factor de Tejido. Sin
embargo, se observó específicamente coagulación y necrosis notables
en el tumor. Por lo tanto, será evidente que las dosis efectivas del
Factor VIIa son bastante amplias. A manera de ejemplo únicamente, se
puede considerar administrar a un paciente una dosis de Factor VIIa
entre aproximadamente 0,01 miligramos y aproximadamente 500
miligramos por paciente.
Cada uno de los análisis anteriores se puede
aplicar igualmente al uso de construcciones de Factor de Tejido que
han sido mutadas para deteriorar su capacidad para activar el Factor
VII. Dado que los cálculos anteriores se basan en una proporción de
enlace, no se cree necesario usar niveles particularmente aumentados
de Factor VIIa en combinación con los mutantes de activación
descritos. Sin embargo, dado que la administración del Factor VIIa
no se cree que sea particularmente dañina en sí misma, el potencial
para usar dosis aumentadas del Factor VIIa ciertamente es
evidente.
Aunque la guía detallada dada a conocer
anteriormente se cree que es suficiente para permitir que una
persona con experiencia ordinaria en la técnica sepa cómo poner en
práctica estos aspectos de la invención, también se puede hacer
referencia a otros análisis cuantitativos para ayudar en la
optimización de las dosis del Factor de Tejido y Factor VIIa para su
administración. A manera de ejemplo solamente, las Patentes U.S.A.
números 5.374.617; 5.504.064; y 5.504.067 describen un rango de
dosis activas terapéuticamente y niveles de plasma del Factor
VIIa.
Morrissey y Comp han dado a conocer que, en el
contexto de los desórdenes de sangrado, el Factor de Tejido de
coagulación deficiente se puede administrar en una dosis efectiva
para producir en el plasma un nivel efectivo de entre 100
nanogramos/mililitro y 50 microgramos/mililitro, o un nivel
preferente de entre 1 microgramo/mililitro y 10
microgramos/mililitro o de 60 a 600 microgramos/kilogramo de peso
corporal, cuando se administra sistémicamente; o un nivel efectivo
de entre 10 microgramos/mililitro y 50 microgramos/mililitro o un
nivel preferente de entre 10 microgramos/mililitro y 50
microgramos/mililitro, cuando se administra tópicamente (Patente
U.S.A. número 5.504.064).
El Factor VIIa se administra en una dosis
efectiva para producir en el plasma un nivel efectivo de entre 20
nanogramos/mililitro y 10 microgramos/mililitro, (1,2 a 600
microgramos/kilogramo), o un nivel preferente de entre 40
nanogramos/mililitro y 700 microgramos/mililitro (2,4 a 240
microgramos/kilogramo) o un nivel de entre 1 microgramo de Factor
VIIa/mililitro y 10 microgramos de Factor VIIa/mililitro cuando se
administra tópicamente.
En general, se administraría Factor de Tejido de
coagulación deficiente y activador de Factor VII para producir
niveles de hasta 10 microgramos de Factor de Tejido de coagulación
deficiente/mililitro de plasma y entre 40 nanogramos y 700
microgramos de Factor VIIa/mililitro de plasma. Aunque estos
estudios se realizaron en el contexto de desórdenes de sangrado,
también tienen relevancia en el contexto de la presente invención,
ya que los niveles deben ser efectivos pero supervisados
adecuadamente para evitar la toxicidad sistémica debido a los
niveles elevados de Factor de Tejido de coagulación deficiente y
Factor VIIa activado. Por lo tanto, el activador de Factor VII se
administra en una dosis efectiva para producir en el plasma un nivel
efectivo de Factor VIIa, como se define anteriormente.
Como se describe en la Patente U.S.A. número
5.504.064, los activadores del Factor VII endógeno también se pueden
administrar en lugar del mismo Factor VIIa. Como se describe en la
Patente anterior, el Factor VIIa también se puede formar en vivo,
poco tiempo antes, en el momento de, o preferiblemente poco después
de la administración de los Factores de Tejido de coagulación
deficiente. En estas realizaciones, el Factor VII endógeno se
convierte en Factor VIIa mediante la infusión de un activador del
Factor VIIa, tal como el Factor Xa (FXa) en combinación con
fosfolípidos (PCPS ``fosfatidil colina/fosfatidilserina'').
Los activadores del Factor VII en vivo incluyen
el Factor Xa/PCPS, Factor IXa/PCPS, trombina, Factor XIIa y el
activador del Factor VII para el veneno de Oxyuranus scutellatus} en
combinación con fosfatidilcolina/fosfatidilserina. Éstas han
mostrado activar el Factor VII en Factor VIIa in vitro. La
activación del Factor VII a Factor VIIa para Xa/PCPS en vivo también
se ha medido directamente. En general, el activador del Factor VII
se administra en una dosis entre 1 y 10 microgramos/mililitro de
portador (Patente U.S.A. número 5.504.064).
El fosfolípido se puede proporcionar en varias
formas tales como vesículas de fosfatidilcolina/fosfatidilserina
(PCPS). Las preparaciones de vesículas de fosfatidilcolina/
fosfatidilserina y el método de administración de Xa/PCPS se
describe en Giles y colaboradores, (1988), cuyas ideas se incorporan
específicamente en la presente descripción. Otras preparaciones de
fosfolípidos se pueden sustituir por PCPS, en tanto aceleren la
activación del Factor VII por el Factor Xa. La efectividad, y por lo
tanto la determinación de la composición y dosis óptimas, se puede
supervisar como se describe más adelante.
Una dosis muy efectiva de Xa/PCPS, que eleva los
niveles del Factor VIIa en vivo en el chimpancé, se ha dado a
conocer que es de 26 pmoles FXa + 40 pmoles de fosfatidilcolina/
fosfatidil serina por kilogramo de peso corporal. Esa dosis produjo
un incremento de 18 veces en los niveles endógenos del Factor VIIa
(hasta 146 nanogramos/mililitro). Se observó un efecto marginalmente
detectable usando una dosis más pequeña en perros, en donde la
infusión de 12 pmoles de Factor Xa + 19 pmoles de
fosfatidilcolina/fosfatidilserina por kilogramo de peso corporal
produjo un incremento de tres veces en los niveles del Factor VIIa
endógeno. De conformidad con lo anterior, las dosis de Factor Xa que
son de como mínimo 12 pmoles de Factor Xa por kilogramo de peso
corporal, y preferiblemente 26 pmoles de Factor Xa por kilogramo de
peso corporal, deberán ser útiles. Las dosis de fosfatidilcolina/
fosfatidilserina que son como mínimo 19 pmoles de fosfatidil colina/
fosfatidilserina por kilogramo de peso corporal, y preferiblemente
40 pmoles de fosfatidilcolina/ fosfatidilserina por kilogramo de
peso corporal, son igualmente útiles (Patente U.S.A. número
5.504.064).
Se puede supervisar la efectividad de cualquier
activador del Factor VII en infusión después de la administración
intravenosa, extrayendo muestras de sangre citrada en tiempos
variables (a los 2, 5, 10, 20, 30, 60, 90 y 120 minutos) después de
una infusión de bolo del activador, y preparar plasma con pocas
plaquetas para las muestras sanguíneas. La cantidad de Factor VIIa
endógeno se puede medir entonces en las muestras de plasma citrado
realizando un ensayo de coagulación de Factor VIIa basado en Factor
de Tejido de coagulación deficiente. Los niveles deseados de Factor
VIIa endógeno serían los mismos que los niveles objetivo de Factor
VIIa en plasma indicados para coinfusión del Factor VII purificado y
el Factor de Tejido de coagulación deficiente. Por lo tanto, podrían
probarse otros activadores del Factor VII en vivo para la generación
del Factor VIIa con la debida experimentación y ajustarse la dosis
para generar los niveles deseados de Factor VIIa usando el ensayo de
Factor de Tejido de coagulación deficiente-basado en
Factor VIIa de las muestras de plasma. La dosis adecuada del
activador del Factor VII (que produce el nivel deseado del Factor
VIIa endógeno) se puede usar entonces en combinación con las
cantidades recomendadas de Factor de Tejido de coagulación
deficiente.
Las dosis se pueden cronometrar para proporcionar
elevación prolongada en los niveles de Factor VIIa. Las dosis
preferiblemente se administrarían hasta que se logre el efecto
antitumor deseado, y luego se repetirían conforme fuera necesario
para controlar el sangrado. La vida media del Factor VIIa en vivo se
ha dado a conocer que es de aproximadamente dos horas, aunque esto
podría variar con diferentes realizaciones terapéuticas y pacientes
individuales. Por lo tanto, la vida media del Factor VIIa en el
plasma en una realización de tratamiento dada deberá determinarse
con el ensayo de coagulación basado en Factor de Tejido de
coagulación deficiente.
Los siguientes ejemplos se incluyen para
demostrar las realizaciones preferentes de la invención. Deberá ser
apreciado por los expertos en la técnica que las técnicas descritas
en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el
inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y así se
puede considerar que constituyen modos preferentes para su
práctica.
El Factor de Tejido truncado en la presente
descripción se designa como el dominio extracelular de la proteína
madura del Factor de Tejido (aminoácidos 1-219 de la
proteína madura; SEQ ID NO:1). La Secuencia de identificación No. 1
se codifica mediante, por ejemplo, la Secuencia de identificación
No. 10.
H_{6} Ala Met Ala [tTF]. El ADN complementario
del Factor de Tejido truncado (ADNc) se preparó como sigue: ARN de
células J-82 (del carcinoma de vejiga humano) se usó
para la clonación del Factor de Tejido truncado. El ARN total se
aisló usando el reactivo de microaislamiento de ARN GlassMax^{MR}
(Gibco BRL). El ARN se transcribió inverso en ADNc usando el equipo
de PCR (``reacción de cadena de polimerasa'') de ARN GeneAmp (Perkin
Elmer). El ADNc del Factor de Tejido truncado se amplificó usando el
mismo equipo con los siguientes dos cebadores:
5' cebador: 5' GTC ATG CCA TGG CCT CAG GCA CTA
CAA (SEQ ID NO:15)
3' cebador: 5' TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC
CCT TTC T (SEQ ID NO:16)
Las secuencias subrayadas codifican el término N
del Factor de Tejido truncado. El resto de la secuencia en el
cebador 5' es el sitio de restricción para NcoI permitiendo
la clonación de Factor de Tejido truncado en el vector de expresión.
La secuencia en el cebador 3' es el sitio HindIII para la
clonación del Factor de Tejido truncado en el vector de expresión.
Se realizó amplificación por reacción de cadena de polimerasa como
se sugiere por el fabricante. En resumen, se usaron 75 \muM dNTP;
0,6 \muM cebador, 1,5 mM MgCl_{2} y se realizaron 30 ciclos de
30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC y 30 segundos a 72ºC.
El Factor de Tejido truncado se expresó como una
proteína de fusión en un estado no natural en cuerpos de inclusión
de E. coli usando el vector de expresión H_{6}
pQE-60 (Qiagen). El vector de expresión de E.
coli H_{6} pQE-60 se usó para la expresión del
Factor de Tejido truncado (Lee y colaboradores, 1994). El ADNc del
Factor de Tejido truncado amplificado por reacción de cadena de
polimerasa se insertó entre el sitio NcoI y HindIII.
El H_{6} pQE-60 tiene una secuencia de
codificación integrada (His)_{6} de manera que la proteína
expresada tiene la secuencia de
\hbox{(His) _{6} }
en el término N, la cual se puede purificar en una columna
Ni-NTA. Además, la proteína de fusión tiene un sitio
de disociación de trombina y los residuos 1-219 del
Factor de Tejido.
Para purificar el Factor de Tejido truncado, se
transformó el Factor de Tejido truncado que contenía ADN de H_{6}
pQE-60 en células TG-1 de E.
Coli. Las células se cultivaron a OD_{600} = 0,5 y se añadió
IPTG a 30 \muM para inducir la producción de Factor de Tejido
truncado. Las células se cosecharon después de agitación durante 18
horas a 30ºC. El sedimento celular se desnaturalizó en 6 M de
Gu-HCl y el lisado se cargó sobre una columna
Ni-NTA (Qiagen). El Factor de Tejido truncado
enlazado se lavó con 6 M de urea y el Factor de Tejido truncado se
redobló con un gradiente de 6 M - 1 M de urea a temperatura ambiente
durante 16 horas. La columna se lavó con regulador de lavado (0,05
Na H_{2} PO_{4}, 0,3 M NaCl, 10% glicerol) y se eluyó el Factor
de Tejido truncado con 0,2 M de Imidozol en regulador de lavado. Se
concentró el Factor de Tejido truncado eluido y se cargó en una
columna G-75. Se recolectaron los monómeros de
Factor de Tejido truncado.
Gly [tTF]. El ADN complementario de GlytTF (ADNc)
se preparó de la misma manera que como se describió en la sección
anterior excepto que el cebador 5' se reemplazó por el siguiente
cebador en la reacción de cadena de polimerasa.
5' cebador: 5' GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC
GTG CTT CTG GCA CTA CAA ATA CT (SEQ ID NO:17)
La secuencia subrayada codifica el término N del
Factor de Tejido truncado. La secuencia restante codifica un sitio
de restricción para NcoI y un sitio de disociación para
trombina.
El vector de expresión H_{6} pQE60 y el
procedimiento para la purificación de proteína es idéntico al
descrito anteriormente excepto que el producto de proteína final se
trató con trombina para eliminar el péptido H_{6}. Esto se hizo
añadiendo una parte de trombina (Sigma) a 500 partes de Factor de
Tejido truncado (peso/peso), y se llevó a cabo la disociación a
temperatura ambiente durante 18 horas. La trombina se eliminó del
Factor de Tejido truncado mediante el paso de la mezcla a través de
una columna de afinidad de trombina Benzamidina Sefarosa 6B
(Pharmacia). El Factor de Tejido truncado resultante, designado
tTF_{219}, consistió en los residuos 1-219 del
Factor de Tejido más una glicina adicional en el término N. Ésta
migró como una sola banda de peso molecular 26 kDa cuando se analizó
mediante SDS-PAGE, y se confirmó la secuencia de
N-terminal mediante degradación de Edman. Tuvo la
secuencia de Secuencia de identificación No. 1.
(His)_{6}-N'-cys'tTF_{219}-tTF,
abreviado de aquí en adelante como
H_{6}-N'-cys-tTF_{219},
se preparó mutando tTF_{219} mediante reacción de cadena de
polimerasa con un cebador 5' que codifica una Cys enfrente del
término N' de Factor de Tejido truncado maduro. Se preparó
igualmente
H_{6}-tTF_{219}-cys-C'
usando un cebador 3' que codifica una Cys después del aminoácido 219
del Factor de Tejido truncado. La expresión y purificación fueron
como para tTF_{219}, excepto que el reactivo de Ellman (ácido
5'5'-ditio-bis-2-nitrobenzoico)
se aplicó después de redoblarlo para convertir la Cys N' o C'
terminal en un grupo disulfuro activado estable. Los productos
tenían las secuencias mostradas en Secuencia de identificación No. 2
y Secuencia de identificación No. 3. La disociación de trombina
eliminó la etiqueta (His)_{6} y convirtió las proteínas en
N'-cys-tTF_{219} y
tTF_{219}-cys-C' teniendo las
secuencias mostradas en Secuencia de identificación No. 4 y
Secuencia de identificación No. 5. Los productos fueron > 95%
puros juzgados por electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida.
H_{6}-tTF_{220}-cys-C'
y
H_{6}-tTF_{221}-cys-C'
se prepararon mutando tTF_{219} mediante reacción de cadena de
polimerasa con cebadores 3' codificando Ile-Cys e
Ile-Phe-Cys después del aminoácido
219 del Factor de Tejido truncado. La expresión, redoble y
purificación fueron como para
H_{6}-tTF_{219}-cys-C'.
Las proteínas tienen las secuencias mostradas en Secuencia de
identificación No. 6 y Secuencia de identificación No. 7
Los inventores razonaron que los dímeros de
Factor de Tejido pueden ser más potentes que los monómeros al
iniciar la coagulación. Es posible que el Factor de Tejido natural
en la superficie de las células de carcinoma de vejiga J82 pueda
existir como un dímero (Fair y colaboradores, 1987). El enlace de
una molécula de Factor VII o Factor VIIa a una molécula de Factor de
Tejido también puede facilitar el enlace de otro Factor VII u otro
Factor VIIa a otro Factor de Tejido (Fair y colaboradores, 1987;
Bach y colaboradores, 1986). Además, el Factor de Tejido muestra
homología estructural a los miembros de la familia receptora de
citoquina (Edgington y colaboradores, 1991) algunos de los cuales se
dimerizan para formar receptores activos (Davies y Wlodawer, 1995).
Los inventores por lo tanto sintetizaron dímeros de Factor de
Tejido, como sigue. Aunque la síntesis de los dímeros más adelante
en la presente descripción se describen en términos de conjugación
química, también tuvieron en cuenta los inventores los recombinantes
y otros medios para producir los dímeros de la presente
invención.
Se hizo el Gly [tTF] Enlazador [tTF] con la
estructura Gly [tTF] (Gly)_{4} Ser (Gly)_{4} Ser
(Gly)_{4} Ser [tTF]. Dos pedazos de ADN se amplificaron
con reacción de cadena de polimerasa por separado y se ligaron y se
insertaron en el vector como sigue:
Reacción de cadena de polimerasa 1: Preparación
de Factor de Tejido truncado y la mitad 5' del ADN enlazador. Las
secuencias cebadoras en la reacción de cadena de polimerasa fueron
como sigue:
5' cebador: 5' GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC
GTG GTT CTT GCG GCA CTA CAA ATA CT (SEQ ID NO:18)
3' cebador: 5' CGC GGA TCC ACC GCC ACC AGA TCC
ACC GCC TCC TTC TCT GAA TTC CCC TTT CT (SEQ ID NO:19)
Se usó el ADN Gly [tTF] como el patrón de ADN.
Otras condiciones de la reacción de cadena de polimerasa fueron como
las descritas en la sección del Factor de Tejido truncado.
Reacción de cadena de polimerasa 2: La
preparación de la mitad 3' del ADN enlazador y del ADN del Factor de
Tejido truncado. Las secuencias cebadoras en la reacción de cadena
de polimerasa fueron como sigue:
5' cebador: 5' CGC GGA TCC GGC GGT GGA GGC TCT
TCA GGC ACT ACA AAT ACT GT (SEQ ID NO:20)
3' cebador: 5' TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC
CCT TTC T (SEQ ID NO:21)
Se usó el ADN del Factor de Tejido truncado como
el patrón en la reacción de cadena de polimerasa. El producto de la
reacción de cadena de polimerasa 1 fue digerido con NcoI y
BamH. El producto de reacción de cadena de polimerasa 2 fue
digerido con HindIII y BamH1. El ADN de la reacción de
cadena de polimerasa 1 y la reacción de cadena de polimerasa 2
digerido fue enlazado con ADN H_{6} pQE 60 digerido por
NcoI y HindIII.
Para las construcciones de vector y la
purificación de proteína, los procedimientos fueron los mismos que
se describen en la sección Gly [tTF].
También se construyó el Cys [tTF] Enlazador [tTF]
con la estructura Ser Gly Cys [tTF 2-219]
(Gly)_{4} Ser (Gly)_{4} Ser (Gly)_{4}
Ser [tTF]. Se hizo ADN mediante reacción de cadena de polimerasa
usando los siguientes cebadores:
5' cebador: 5'GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG
GTT CTT GCG GCA CTA CAA ATA CT (SEQ ID NO:22)
3' cebador: 5' TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC
CCT TTC T (SEQ ID NO: 23)
Se usó ADN [tTF] enlazador [tTF] como el patrón.
Las condiciones de reacción de cadena de polimerasa restantes fueron
las mismas que se describen en la sección de Factor de Tejido
truncado. Todas las construcciones de vector y la purificación de
proteínas se describieron en la purificación de H_{6} C [tTF].
También se hizo el dímero [tTF] enlazador [tTF]
cys con la estructura de proteína [tTF](Gly)_{4}
Ser(Gly)_{4} Ser(Gly)_{4} Ser [tTF]
Cys. Se hizo ADN mediante reacción de cadena de polimerasa usando
los siguientes cebadores:
5' cebador: 5'GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG
GTT GCA CTA CAA ATA CT (SEQ ID NO: 24)
3' cebador: 5' TGA CAA GCT TAG CAT TCT CTG AAT
TCC CCT TTC T (SEQ ID NO: 25)
Se usó el ADN de [tTF] enlazador [tTF] como el
patrón. Las condiciones restantes de la reacción de cadena de
polimerasa fueron las mismas que se describen en la sección de
Factor de Tejido truncado. Las construcciones de vector y la
purificación de proteína se realizaron de nuevo como se describe en
la purificación de la sección de [tTF] cys.
Se redujo el monómero [tTF] Cys, que había sido
tratado con reactivo de Ellman para convertir el Cys libre en grupo
disulfuro activado, con la mitad de un equivalente molar de
ditiotreitol. Esto generó residuos de Cys libre en la mitad de las
moléculas. Los monómeros se conjugaron químicamente para formar
dímeros [tTF] Cys-Cys [tTF]. Esto se hizo añadiendo
una cantidad molar igual al DTT para el [tTF] Cys protegido a
temperatura ambiente durante una hora para desproteger y exponer la
cisteína en el término C del [tTF] Cys. Una cantidad molar igual de
[tTF] Cys protegido se añadió a la mezcla de DTT/[tTF] Cys y la
incubación continuó durante 18 horas a temperatura ambiente. Los
dímeros se purificaron sobre una columna de filtración de gel
G-75. Se prepararon igualmente dímeros de
H_{6}-tTF_{220}-cys-C',
H_{6}-tTF_{221}-cys-C'
y
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}.
El monómero Cys [tTF] se conjugó químicamente para formar dímeros
usando el mismo método.
Se describen tres mutantes de Factor de Tejido
truncado que carecen de la capacidad para convertir el Factor VII
ligado con Factor de Tejido truncado en Factor VIIa. Hay 300 veces
menos Factor VIIa en el plasma en comparación con el Factor VII
(Morrissey y colaboradores, 1993). Por lo tanto, el Factor de Tejido
truncado mutante circulante debería ser menos capaz de iniciar la
coagulación y por lo tanto exhibir muy poca toxicidad. Sin embargo,
en cuanto el Factor de Tejido truncado mutante se ha localizado en
el sitio de localización del tumor, como sorprendentemente se
demuestra en la presente descripción, el Factor VIIa se puede
inyectar para intercambiarse con el Factor VII enlazado con Factor
de Tejido truncado. Las proteínas mutadas tienen las secuencias
mostradas en Secuencia de identificación No. 8 y Secuencia de
identificación No. 9 y son activas en la presencia del Factor
VIIa.
El ``[tTF]G164A'' tiene la estructura de
proteína mutante con el aminoácido 164 (Gly) de tTF_{219}
reemplazado por Ala. El equipo de mutagénesis dirigido al sitio de
cadena doble Chameleon (Stratagene) se usó para generar al mutante.
El patrón de ADN es ADN Gly[tTF] y la secuencia del cebador
mutagenizante es:
5' CAA GTT CAG CCA AGA AAAC (SEQ ID NO:26)
El mutante G164A se representa mediante Secuencia
de Identificación No. 9. Las construcciones de vector y los
procedimientos de purificación de proteína descritos anteriormente
se usaron en la purificación de Gly [tTF].
El triptofano en el aminoácido 158 de tTF_{219}
se mutó en arginina mediante reacción de cadena de polimerasa^{MR}
con un cebador codificando este cambio. La expresión, redoble y
purificación fue como para tTF_{219}. La proteína mutada tiene las
secuencias mostradas en Secuencia de Identificación No. 8
El [tTF]W158R S162A es un mutante doble en
el cual el aminoácido 158 (Trp) de tTF_{219} se reemplaza por Arg
y el aminoácido 162 (Ser) se reemplaza por Ala. Se usa el mismo
método de mutagenización que el descrito para [tTF] G164A y
[tTF]W158R. El cebador de mutagenización es:
5' ACA CTT TAT TAT CGG AAA TCT TCA GCT TCA GGA
AAG (SEQ ID NO:27)
\newpage
Las anteriores construcciones de vector y la
purificación de proteína son las mismas que las usadas para
purificar Gly[tTF].
Se construyeron anticuerpos biespecíficos que
tenían un brazo Fab' del anticuerpo 10H10 que es específico para un
epítope no inhibitorio de Factor de Tejido truncado enlazado con un
brazo de Fab' de anticuerpos (OX7, Mac51, CAMPATH-2)
de especificidad irrelevante. Cuando se mezcla con Factor de Tejido
truncado, el anticuerpo biespecífico enlaza al Factor de Tejido
truncado a través del brazo 10H10, formando un aducto no covalente.
Los anticuerpos biespecíficos se sintetizaron de acuerdo con el
método de Brennan y colaboradores (1985; incorporado en la presente
descripción mediante referencia) con pequeñas modificaciones.
En resumen, se obtuvieron fragmentos de
F(ab')_{2} a partir de anticuerpos de IgG mediante la
digestión con pepsina (tipo A; EC 3.4.23.1) y se purificaron hasta
su homogeneidad mediante cromatografía en Sephadex G100. Se
redujeron fragmentos de F(ab')_{2} durante 16 horas a 20ºC
con 5 mM de 2-mercaptoetanol en 0,1 M de regulador
de fosfato de sodio, pH 6,8, conteniendo 1 mM de EDTA (regulador
PBSE) y 9 mM NaAsO_{2}. Se añadió el reactivo de Ellman (ER) para
dar una concentración final de 25 mM y, después de 3 horas a 20ºC,
se separaron los fragmentos de Fab' derivados de Ellman
(Fab'-ER) de reactivos de Ellman sobre columnas de
Sephadex G25 en PBSE.
Para formar el anticuerpo biespecífico,
Fab'-ER derivado de un anticuerpo se concentró en
aproximadamente 2,5 mg/ml en una celda de ultrafiltración Amicon y
se redujo con 10 mM de 2-mercaptoetanol durante una
hora a 20ºC. El Fab'-SH resultante se filtró a
través de una columna de Sephadex G25 en PBSE y se mezcló con un
exceso molar de 1:1 de Fab'-ER preparado del segundo
anticuerpo. Las mezclas se concentraron mediante ultrafiltración a
aproximadamente 3 mg/ml y se agitaron durante 16 horas a 20ºC. Los
productos de la reacción se fraccionaron en columnas de Sephadex
G100 en solución salina regulada de fosfato. Las fracciones que
contenían el anticuerpo biespecífico (110 kDa) se concentraron a 1
mg/ml, y se almacenaron a 4ºC en azida de sodio 0,02%.
Para formar los aductos de anticuerpos
biespecíficos de tTF, el anticuerpo biespecífico se mezcló con un
equivalente molar de tTF o derivados del mismo durante 1 hora a 4ºC.
El aducto eluido con un peso molecular de aproximadamente 130 kDa en
columnas de filtración de gel, correspondiente a una molécula de
anticuerpo biespecífico se enlazó con una molécula de tTF.
A 26 mg de inmunoglobulina G a una concentración
de 10 mg/ml en solución salina de fosfato lavada con N_{2} se
añadieron 250 microgramos de SMPT (Pharmacia) en 0,1 ml de DMF seco.
Después de agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente, se
aplicó la solución a una columna (1,6 cm de diámetro X 30 cm) de
Sephadex G25(F) equilibrada en el mismo regulador. La
inmunoglobulina G derivada se recolectó en un volumen de 10 a 12 ml
y se concentró hasta aproximadamente 3,5 ml mediante ultrafiltración
(Amicon, membrana YM2). El
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
o
H_{6}-tTF_{219}-cys-C'
(15 mg) se redujo mediante incubación a temperatura ambiente en la
presencia de 0,2 mM DTT hasta que se liberó la sustancia de Ellman
(es decir OD a 412 nm alcanzó un máximo). Entonces se aplicó a la
columna Sephadex G25(F) (1,6 cm de diámetro x 30 cm)
equilibrada con un regulador lavado con N_{2}.
Se añadió el Cys-tTF (\sim15
ml) directamente a la solución de IgG derivada. La mezcla se
concentró a aproximadamente 5 ml mediante ultrafiltración y se
incubó a temperatura ambiente durante 18 horas antes de la
resolución mediante cromatografía por filtración en gel en Sephacryl
S200. El pico que contenía el material que tenía un peso molecular
de 175.000-200.000 se recolectó. Este componente
consistía en una molécula de IgG enlazada con una o dos moléculas de
tTF. Los conjugados tienen la estructura:
Se produjeron fragmentos de Fab' mediante la
reducción de fragmentos de F(ab')_{2} de IgG con 10 mM de
mercaptoetilamina. Los fragmentos de Fab' resultantes se separaron
de la sustancia reductora mediante filtración en gel sobre Sephadex
G25. El fragmento Fab' recientemente reducido y el
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
modificado de Ellman se mezclaron en cantidades equimolares a una
concentración de 20 \muM. El progreso de la reacción de
acoplamiento fue seguido por el aumento en absorbencia a 412 nm
debido al anión
3-carboxilato-4-nitrotiofenolato
liberado como resultado de la conjugación. El conjugado tenía la
estructura:
Fab'-SS-tTF
Los conjugados del anticuerpo de tTF se
sintetizaron mediante el enlace del anticuerpo derivado químicamente
al Factor de Tejido truncado derivado químicamente a través de un
enlace disulfuro.
El anticuerpo se hizo reaccionar con un exceso
molar de 5 veces de succinimidil
oxicarbonil-\alpha-metil-\alpha-(2
-piridilditio)tolueno (SMPT) durante una hora a temperatura
ambiente para producir un anticuerpo derivado con un promedio de 2
grupos piridildisulfuro por molécula de anticuerpo. El anticuerpo
derivado se purificó mediante cromatografía de permeación en
gel.
Se hizo reaccionar un exceso molar de 2,5 veces
de Factor de Tejido truncado sobre un anticuerpo con un exceso molar
de 45 veces de 2-iminotiolano (2IT) durante una hora
a temperatura ambiente para producir Factor de Tejido truncado con
un promedio de 1,5 grupos sulfidrilo por molécula de Factor de
Tejido truncado. El Factor de Tejido truncado derivado también se
purificó mediante cromatografía de permeación en gel e
inmediatamente se mezcló con el anticuerpo derivado.
La mezcla se dejó reaccionar durante 72 horas a
temperatura ambiente y luego se aplicó una columna Sefacril
S-300 para separar el conjugado del
anticuerpo-Factor de Tejido truncado del Factor de
Tejido truncado libre y se liberó
piridina-2-tiona. El conjugado se
separó del anticuerpo libre mediante cromatografía de afinidad sobre
una columna de anti-Factor de Tejido truncado. La
especie molecular predominante del producto conjugado final fue el
conjugado de únicamente sustituido anticuerpo-Factor
de Tejido truncado (Mr aproximadamente 176.000) con menores
cantidades de conjugados sustituidos múltiplemente (Mr \geq
aproximadamente 202.000) valorado mediante
SDS-PAGE.
Los conjugados de
anticuerpo-C[tTF] y [tTF]C se
sintetizaron mediante acoplamiento directo de Factor de Tejido
truncado modificado con cisteína a anticuerpo químicamente derivado
a través de un enlace disulfuro.
El anticuerpo se hizo reaccionar con un exceso
molar de 12 veces de 2IT durante una hora a temperatura ambiente
para producir anticuerpo derivado con un promedio de 1.5 grupos
sulfidrilo por molécula de anticuerpo. El anticuerpo derivado se
purificó mediante cromatografía de permeación en gel e
inmediatamente se mezcló con un exceso molar de 2 veces Factor de
Tejido truncado modificado con cisteína. La mezcla se dejó
reaccionar durante 24 horas a temperatura ambiente y luego se
purificó el conjugado mediante permeación en gel y cromatografía por
afinidad como se describe anteriormente.
La especie molecular predominante del conjugado
final fue el conjugado únicamente sustituido (Mr aproximadamente
176.000) con menores cantidades de conjugados sustituidos múltiples
(Mr \geq aproximadamente 202.000) valorado mediante
SDS-PAGE.
Se prepararon los conjugados de anticuerpo
Fab'-C[tTF] y [tTF]C. Estos conjugados
pueden ser más potentes en vivo debido a que deberán permanecer en
la superficie celular durante más tiempo que los conjugados
bivalentes debido a su capacidad limitada de internalización. Los
fragmentos Fab' se mezclan con un exceso molar de 2 veces de Factor
de Tejido truncado modificado con cisteína durante 24 horas y
después el conjugado se purifica mediante permeación en gel y
cromatografía por afinidad como se ha descrito anteriormente.
Este ensayo se usó para verificar que el Factor
de Tejido truncado, varios derivados y mutantes del mismo, y
conjugados de inmunoglobulina-tTF adquieren
actividad que induce a la coagulación en cuanto se localiza en una
superficie celular. Se incubaron células de linfoma A20
(I-A^{d} positivo) (2 X 10^{6} células/ml, 50
\mul) durante una hora a temperatura ambiente con un anticuerpo
biespecífico (50 microgramos/ml, 25 microlitros) consistiendo en un
brazo de Fab' del anticuerpo B21-2 dirigido contra
I-A^{d} enlazado con un brazo de Fab' del
anticuerpo 10H10 dirigido contra un epítope no inhibitorio en Factor
de Tejido truncado. Las células se lavaron a temperatura ambiente y
se añadieron concentraciones variantes de Factor de Tejido truncado,
derivados o mutantes del mismo, o conjugados de
inmunoglobulina-Factor de Tejido truncado durante
una hora a temperatura ambiente. El anticuerpo biespecífico captura
al Factor de Tejido truncado o el Factor de Tejido truncado enlazado
con inmunoglobulina, poniéndolo en estrecha aproximación con la
superficie celular, en donde puede proceder la coagulación.
Las células se lavaron de nuevo a temperatura
ambiente, se volvieron a suspender en 75 microlitros de solución
salina regulada de fosfato y se calentaron a 37ºC. Se añadieron
calcio (12,5 mM) y plasma citrado de ratón o humano (30
microlitros). Se registró el tiempo para que se formaran las
primeras hebras de fibrina. Se graficó el tiempo de coagulación
respecto a la concentración de Factor de Tejido truncado y se
compararon las curvas con curvas estándar preparadas usando
preparaciones de tTF_{219} estándar.
En algunos estudios, se añadieron concentraciones
variantes de Factor VIIa humano recombinante junto con tTF_{219} y
mutantes del mismo, para determinar si la capacidad de coagulación
se aumentó por la presencia del Factor VIIa.
Este ensayo es útil además de o como alternativa
al ensayo de coagulación in vitro para demostrar que el
Factor de Tejido truncado y los conjugados de
inmunoglobulina-tTF adquieren actividad que induce a
la coagulación en cuanto se localizan en una superficie celular. El
ensayo mide la tasa de conversión del Factor X en Factor Xa mediante
un sustrato que genera cromóforo (S-2765) para el
Factor Xa.
Se suspendieron células A20 (2 X 10^{7}
células) en 10 mililitros de medio que contenía 0,2 por ciento de
peso/volumen de azida de sodio. A 2,5 ml de suspensión de células se
añadieron 6,8 microgramos del anticuerpo biespecífico de ``captura''
B21-2/10H10 durante 50 minutos a temperatura
ambiente. Las células se lavaron y volvieron a suspender en 2,5 ml
de medio que contenía 0,2 por ciento de peso/volumen de azida de
sodio. El Factor de Tejido truncado y los conjugados de
inmunoglobulina-tTF disueltos en el mismo medio se
distribuyeron en volúmenes de 100 microlitros a un rango de
concentraciones en placas de microtitulación de 96 pocillos. A los
pocillos se añadieron entonces 100 microlitros de la suspensión de
célula/anticuerpo biespecífico. Las placas se incubaron durante 50
minutos a temperatura ambiente.
Las placas se centrifugaron, se descartaron los
sobrenadantes y se volvieron a suspender los sedimentos celulares en
250 microlitros de regulador de lavado (150 mM NaCl; 50 mM
Tris-HCl, pH 8; 0,2 por ciento peso/volumen de
albúmina de suero bovino). Las células se lavaron de nuevo y las
células se volvieron a suspender en 100 microlitros de una dilución
de 12,5 veces de Proplex T (Baxter, Inc.) que contenía factores II,
VII, IX y X en regulador de dilución (Regulador de lavado
suplementado con 12,5 mM de cloruro de calcio). Las placas se
incubaron a 37ºC durante 30 minutos. A cada pocillo se añadió
solución de detención (12,5 mM de ácido
etilenodiamino-tetracético (EDTA) de sodio) en
regulador de lavado. Las placas se centrifugaron. Cien microlitros
de sobrenadante de cada pocillo se añadieron a 11 microlitros de
S-2765 (Dihidrocloruro de
N-\alpha-benciloxicarbonil-D-Arg-L-Gly-L-Arg-p-nitroanilida,
Chromogenix AB, Suecia). La densidad óptica de cada solución se
midió a 409 nm. Los resultados se compararon con curvas estándares
generadas a partir de tTF_{219} estándar.
Este modelo se usó para demostrar que el Factor
de Tejido truncado y los conjugados de
inmunoglobulina-tTF indujeron trombosis de los vasos
sanguíneos del tumor y causaron el infarto del tumor en vivo.
Los sistemas de prueba de tumor fueron de cuatro
tipos: (i) carcinoma de pulmón de ratón 3LL creciendo
subcutáneamente en ratones C57BL/6; (ii) neuroblastoma de ratón
C1300 creciendo subcutáneamente en ratones BALB/c nu/nu; (iii)
carcinoma colorrectal humano HT29 creciendo subcutáneamente en
ratones BALB/c nu/nu; y (iv) neuroblastoma de ratón C1300 Mu\gamma
creciendo subcutáneamente en ratones BALB/c nu/nu. El tumor C1300
Mu\gamma es un transfectante que segrega
interferón-\gamma derivado del tumor C1300
(Watanabe y colaboradores, 1989).
Además, el modelo de tumor C1300 (Mu\gamma) de
(Burrows y colaboradores, 1992; incorporado en la presente
descripción mediante referencia) se empleó y modificó como sigue:
(i) se usó el anticuerpo B21-2 para dirigirse a
I-A^{d}; (ii) se usaron células tumorales C1300
(Mu\gamma), una sublínea de las células tumorales C1300
(Mu\gamma) 12, que crecen continuamente en ratones BALB/c nu/nu; y
(iii) se omitió tetraciclina del agua de beber de los ratones para
evitar que las bacterias de los intestinos indujeran
I-A^{d} en el epitelio gastrointestinal. A
diferencia de las inmunotoxinas, los coaguligandos y las
construcciones de Factor de Tejido no dañan al epitelio intestinal
que expresa I-A^{d}.
Para establecer tumores, se inyectaron
subcutáneamente 10^{6} hasta 1,5 x 10^{7} células tumorales en
el flanco anterior derecho de los ratones. Cuando crecieron los
tumores a distintos tamaños, se asignaron los ratones aleatoriamente
a diferentes grupos de estudio. Entonces los ratones recibieron una
inyección intravenosa de 0,5 mg/kg de Factor de Tejido truncado solo
o enlazado con IgG, Fab', o anticuerpo biespecífico. Otros ratones
recibieron cantidades equivalentes de IgG, Fab' o solamente
anticuerpo biespecífico. Las inyecciones se realizaron lentamente en
las venas de la cola durante aproximadamente 45 segundos, usualmente
seguidas por 200 microlitros de solución salina.
En algunos estudios, se investigó el efecto de
administrar fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer sobre la
acción trombótica del Factor de Tejido truncado en vasos sanguíneos
del tumor. A ratones que tenían tumores subcutáneos colorrectales
humanos HT29 de 1,0 cm de diámetro se les aplicaron inyecciones
intraperitoneales de doxorrubicina (1 mg/kg/día), camptotecina (1
mg/kg/día), etoposida (20 mg/kg/día) o interferón gamma (2 x
10^{5} unidades/kg/día) durante dos días antes de la inyección de
Factor de Tejido truncado y de nuevo en el día de la inyección de
Factor de Tejido truncado.
Veinticuatro horas después de haber sido
inyectados con Factor de Tejido truncado o conjugados de
inmunoglobulina-Factor de Tejido truncado, los
ratones se anestesiaron con metofano y se desangraron por perfusión
con solución salina heparinizada. Se cortaron tumores y tejidos
normales e inmediatamente se fijaron en 3 por ciento
(volumen/volumen) formalina. Se cortaron secciones de parafina y se
tiñeron con hematoxilina y eosina. Se contaron los vasos sanguíneos
que tenían lúmenes abiertos que contenían eritrocitos y los vasos
sanguíneos que contenían trombos. Las secciones de parafina se
cortaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina o con azul escarlata
de Martius (MSB) tricromo para la detección de fibrina.
Se usaron modelos animales aceptados para
determinar si la administración de Factor de Tejido truncado de
conjugados de inmunoglobulina-Factor de Tejido
truncado suprimían el crecimiento de tumores sólidos en ratones. Los
sistemas de prueba de tumor fueron: (i) tumores de enfermedad de
Hodgkin humanos L540 creciendo en ratones SCID; (ii) neuroblastoma
C1300 Mu\gamma (que secreta interferón) creciendo en ratones
nu/nu; (iii) carcinoma de pulmón de célula no pequeña humana H460
creciendo en ratones nu/nu. Para establecer tumores sólidos, se
inyectaron subcutáneamente 1,5 x 10^{7} células tumorales en el
flanco anterior derecho de ratones SCID o BALB/c nu/nu (Charles
River Labs., Wilmingham, MA). Cuando los tumores crecieron a
diferentes diámetros, los ratones se asignaron a diferentes grupos
experimentales, conteniendo cada uno de 4 a 9 ratones.
Los ratones recibieron entonces una inyección
intravenosa de 0,5 mg/kg de Factor de Tejido truncado solo o
enlazado con anticuerpo biespecífico. Otros ratones recibieron
cantidades equivalentes de anticuerpo biespecífico solamente. Las
inyecciones se llevaron a cabo durante aproximadamente 45 segundos
en una de las venas de la cola, seguidas por 200 microlitros de
solución salina. Las infusiones se repitieron seis días después. Se
midieron los diámetros perpendiculares de los tumores a intervalos
regulares y se calcularon los volúmenes de los tumores.
Para dirigir el Factor de Tejido truncado a
I-A^{d} en endotelio vascular del tumor, los
inventores prepararon un anticuerpo biespecífico con brazo Fab' del
anticuerpo B21-2, específico para
I-A^{d}, enlazado con el brazo Fab' del anticuerpo
10H10, específico para un epítope no inhibitorio en el módulo C del
Factor de Tejido truncado. Este anticuerpo biespecífico,
B21-2/10H10, medió el enlace de Factor de Tejido
truncado de una manera específica para antígeno a
I-A^{d} en células de linfoma B de ratones A20
in vitro. Cuando se añadió plasma de ratón a las células A20
a las cuales el Factor de Tejido truncado había sido enlazado
mediante B21-2/10H10, se coaguló rápidamente. Las
hebras de fibrina fueron visibles 36 segundos después de la adición
de plasma a las células tratadas con anticuerpo, en comparación con
164 segundos cuando el plasma se añadió a células no tratadas
(figura 4A). Sólo cuando el Factor de Tejido truncado se enlazó a
las células esto aumentó la coagulación observada: no se vio efecto
sobre el tiempo de coagulación cuando las células se incubaron con
Factor de Tejido truncado solamente, con F(ab')_{2},
homodimérico, con fragmentos de Fab', o con Factor de Tejido
truncado más anticuerpos biespecíficos que solamente tenían una o
dos especificidades necesarias para enlazar el Factor de Tejido
truncado a células A20.
El tTF_{219} preparado como en el Ejemplo I
tuvo capacidad idéntica a una preparación de tTF_{219}
``estándar'' obtenida del Dr. Thomas Edgington (The Scripps Research
Institute, La Jolla, CA) para inducir la coagulación de plasma de
ratón o humano después de su enlace a través de anticuerpo
biespecífico B21-2/10H10 a células de linfoma A20
(figura 5). El plasma de ratón se coaguló en 50 segundos cuando
tanto la preparación de tTF_{219} del Ejemplo I como el Factor de
Tejido truncado estándar se aplicaron a las células a 3 X 10^{-9}
M. De este modo, el tTF_{219} preparado como se describe en la
presente descripción parece estar correctamente redoblado y
completamente activo.
Hubo una relación lineal entre el logaritmo del
número de moléculas de Factor de Tejido truncado enlazadas a las
células y la velocidad de coagulación de plasma por las células
(figura 4B). En presencia de las células solas, el plasma se coaguló
en 190 segundos, mientras que a 300.000 moléculas de Factor de
Tejido truncado por célula el tiempo de coagulación fue de 40
segundos. Aún con sólo 20.000 moléculas por célula, la coagulación
fue más rápida (140 segundos) que con células no tratadas. Estos
estudios in vitro mostraron que la potencia trombogénica de
Factor de Tejido truncado aumenta por la proximidad de la superficie
celular mediada a través de enlace dirigido por anticuerpo a los
antígenos de Clase II sobre la superficie celular.
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
y
H_{6}-tTF_{219}-cys-C'
fueron tan activos como el Factor de Tejido truncado en inducir la
coagulación de plasma en cuanto se enlazaron a través del anticuerpo
biespecífico a células A20. El plasma se coaguló en 50 segundos
cuando se aplicaron
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
y
H_{6}-tTF_{219}-cys-C'
a 3 x 10^{-9} M, la misma concentración que para el Factor de
Tejido truncado (figura 5). De este modo, la mutación del Factor de
Tejido truncado para introducir una secuencia (His)_{6} y
un residuo Cys en el término N' o C' no reduce su actividad
inductora de coagulación.
H_{6}-tTF_{220}-cys-C',
tTF_{220}-cys-C',
H_{6}-tTF_{221}-cys-C'
y tTF_{221}-cys-C' fueron tan
activos como tTF_{219} para inducir la coagulación del plasma en
cuanto se localizaron en la superficie de células A20 a través del
anticuerpo biespecífico, B21-2/10H10. Con todas las
muestras a 5 x 10^{-10} M, el plasma se coaguló en 50 segundos
(figura 6 y figura 7).
El dímero
H_{6}-N'cys-tTF_{219} fue tan
activo como el mismo tTF_{219} en inducir coagulación de plasma en
cuanto se localizó en la superficie de células A20 mediante el
anticuerpo biespecífico, B21-2/10H10. A una
concentración de 1-2 x 10^{-10} M, ambas muestras
indujeron la coagulación en 50 segundos (figura 8). En cambio, el
dímero
H_{6}-tTF_{221}-cys-C'
fue 4 veces menos activo que el monómero
H_{6}-tTF_{221}-cys-C'
o tTF_{219} mismo. A una concentración de 4 x 10^{-9} M, el
dímero
H_{6}-tTF_{221}-cys-C'
indujo la coagulación del plasma en 50 segundos, mientras que el
monómero correspondiente necesitó ser aplicado a 1 x 10^{-9} M
para el mismo efecto en la coagulación.
Se realizó un estudio histológico para determinar
si la administración intravenosa del coaguligando
B21-2/10H10-tTF inducía trombosis
selectiva de la vasculatura del tumor en ratones que tenían
neuroblastomas subcutáneos C1300 (Mu\gamma) de 0,8 a 1,0 cm de
diámetro (figura 9). Dentro de 30 minutos, todos los vasos en todo
el tumor se trombosaron, conteniendo agregados de plaquetas
oclusivas, eritrocitos empaquetados, y fibrina. En este momento, las
células del tumor eran indistinguibles histológicamente de las
células tumorales de ratones no tratados.
Después de cuatro horas, sin embargo, hubo
señales de daño de célula del tumor. La mayoría de las células del
tumor se separaron entre sí y tuvieron núcleos picnóticos, y el
intersticio tumoral comúnmente contenía eritrocitos. Alrededor de
las 24 horas, el tumor mostraba necrosis avanzada, y a las 72 horas,
la región central entera del tumor se había condensado en un residuo
amorfo. Estos estudios indicaron que el efecto predominantemente
oclusivo del coaguligando de
B21-2/10H10-tTF en los vasos del
tumor es mediado a través del enlace de los antígenos de Clase II
sobre endotelio vascular del tumor.
Sorprendentemente se observó que hubo una acción
trombótica no específica del Factor de Tejido truncado discernible
en los vasos del tumor en tiempos posteriores: en tumores de ratones
que habían sido inyectados 24 horas anteriormente con Factor de
Tejido truncado solamente o Factor de Tejido truncado mezclado con
el anticuerpo biespecífico de control, OX7/10H10, los tumores
asumieron una apariencia ennegrecida, magullada comenzando en los 30
minutos y siendo progresivamente más marcada hasta las 24 horas. Un
estudio histológico reveló que 24 horas después de la inyección de
tTF_{219} prácticamente todos los vasos en todas las regiones del
tumor estaban trombosados (figura 9). Los vasos contenían agregados
de plaquetas, células rojas empaquetadas y fibrina. La mayoría de
las células del tumor se habían separado entre sí y habían
desarrollado núcleos picnóticos y muchas regiones de los tumores
estaban necróticas. Esto fue más pronunciado en el núcleo del tumor.
Se observaron comúnmente eritrocitos en el intersticio del
tumor.
Es posible que la actividad trombogénica
residente de la vasculatura del tumor (Zacharski, y colaboradores,
1993) vuelva estos vasos más susceptibles a trombosis aún mediante
Factor de Tejido truncado no dirigido. Alternativamente, cambios
procoagulantes aumentados podrían haber sido inducidos por el
interferón-\gamma derivado del tumor.
Se obtuvieron resultados similares cuando el
tTF_{219} se administró a ratones que tenían tumores C1300 grandes
(mayores de 1000 mm^{3}). De nuevo, virtualmente todos los vasos
se trombosaron 24 horas después de la inyección (figura 10). De este
modo, los efectos observados en los tumores C1300 Mu\gamma no se
relacionaron con la secreción de interferón \gamma por las células
tumorales.
Otros estudios se realizaron en ratones C57BL/6
que tenían tumores 3LL grandes (mayores de 800 mm^{3}). De nuevo,
se observó trombosis de los vasos del tumor, aunque algo menos
pronunciada que con el tumor C1300 y el tumor C1300 Mu\gamma. En
promedio 62 por ciento de los vasos del tumor 3LL se trombosaron
(figura 11).
Los vasos en tumores C1300 y C1300 Mu\gamma
pequeños (menores de 500 mm^{3}) en gran medida no fueron
afectados por la administración de tTF_{219}. De este modo,
conforme crecen los tumores, su susceptibilidad para la trombosis
por tTF_{219} aumenta. Esto es posiblemente debido a que las
citoquinas liberadas por las células tumorales o por las células
huésped que infiltran al tumor activan el endotelio vascular del
tumor, induciendo cambios procoagulantes en los vasos.
El tratamiento de coaguligando fue bien tolerado,
los ratones no perdieron peso y retuvieron la apariencia normal y
los niveles de actividad normales. A la dosis de tratamiento de 0,6
mg/kg de B21-2/10H10 más 0,5 mg/kg de Factor de
Tejido truncado, se observó toxicidad en solamente dos de cuarenta
ratones (trombosis de la vena de la cola). Es importante notar que
ni los trombos, ni anormalidades histológicas o morfológicas fueron
visibles en secciones parafínicas de hígado, riñón, pulmón,
intestino, corazón, cerebro, adrenales, páncreas, o bazo de los
ratones que tenían tumores 30 minutos o 24 horas después de la
administración de coaguligando o Factor de Tejido truncado libre.
Además, no se observaron signos de toxicidad (cambios de
comportamiento, signos físicos, cambios de peso) en los animales
tratados.
Los inventores enseguida investigaron si la
administración intravenosa del coaguligando
B21-2/10H10-tTF podría inhibir el
crecimiento de tumores grandes (0,8 a 1,0 cm de diámetro) en
ratones. Los resultados combinados de tres estudios separados
indican que los ratones que recibieron coaguligando
B21-2/10H10-tTF tuvieron regresiones
completas de tumor que duraron cuatro meses o más. Estos efectos
antitumor fueron significativamente mayores que para otros grupos de
tratamiento (figura 12A).
De manera sorprendente, los inventores
encontraron que el efecto antitumor del coaguligando
B21-2/10H10-tTF fue atribuible, en
parte, a un efecto no dirigido del Factor de Tejido truncado. Los
tumores en los ratones que recibieron Factor de Tejido truncado solo
o mezclado con anticuerpos biespecíficos de control (CAMPATH
II/10H10 o B21-2/OX7) crecieron significativamente
más lentamente que los tumores en ratones que recibieron anticuerpos
o solamente solución salina (figura 12A; figura 12B).
Los ratones que tenían tumores C1300 Mu\gamma
pequeños (300 mm^{3}) se inyectaron intravenosamente con
16-20 microgramos de tTF_{219}. El tratamiento se
repitió una semana después. El primer tratamiento con tTF_{219}
tuvo un ligero efecto inhibitorio en el crecimiento del tumor,
consistente con la falta de trombosis marcada observada con los
tumores pequeños anteriores (figura 12B). El segundo tratamiento
tuvo un efecto sobre el crecimiento tumoral sustancialmente mayor,
estadísticamente significativo (P menor de 0,01), probablemente
debido a que los tumores tenían tamaño aumentado. Una semana después
del segundo tratamiento con tTF_{219}, los tumores tenían el 60
por ciento del tamaño de los tumores en los ratones que recibieron
solamente diluyente. La efectividad mayor de la segunda inyección
probablemente se deriva de la mayor acción trombótica de tTF_{219}
sobre los vasos en tumores grandes, observada anteriormente.
Se observaron efectos antitumor similares en los
ratones que tenían carcinomas de pulmón humano H460 (figura 13). El
primer tratamiento con tTF_{219} se dio cuando los tumores eran
pequeños (250 mm^{3}) y tuvieron poco efecto en la tasa de
crecimiento. El segundo tratamiento con tTF_{219} se dio cuando
los tumores eran mayores (900 mm^{3}) y causó que los tumores
regresaran a 550 mm^{3} antes de volver a crecer.
Los efectos antitumor también se observaron en
ratones que tenían carcinomas colorrectales humanos HT29 (figura
14). Ratones Nu/nu que tenían tumores grandes (1200 mm^{3}) en sus
flancos se inyectaron intravenosamente con tTF_{219} o solución
salina regulada de fosfato (control), y se supervisó el crecimiento
de los tumores cada día durante diez días. Los tumores en los
ratones tratados con tTF_{219} discontinuaron el crecimiento
durante aproximadamente 7 días después del tratamiento, mientras que
los tumores en ratones tratados con solución regulada de fosfato
continuaron creciendo sin obstáculos.
En animales que no mostraron completa regresión
del tumor después del tratamiento de coaguligandos
B21-2/10H10-tTF, los tumores
crecieron de nuevo desde un anillo microscópico sobreviviente de
células en la periferia del tumor. El examen inmunohistoquímico de
estos tumores reveló que el endotelio vascular en el borde invasor
de los tumores carecía de antígenos Clase II detectables consistente
con una falta de trombosis de estos vasos permitiendo el
coaguligando la supervivencia celular del tumor local. De este modo,
la coadministración de un fármaco que actúa sobre las mismas células
tumorales probablemente mejoraría la eficacia, como se ha observado
con otra terapia antivascular (Burrows y Thorpe, 1992; Burrows y
Thorpe 1993; Burrows y Thorpe 1994; Solicitud de Patente U.S.A.
números 07/846.349; 08/205.330; 08/295.868; y 08/350.212).
Los inventores anteriormente demostraron que una
inmunotoxina de cadena A de ricina citotóxica poderosa dirigida
contra las mismas células tumorales virtualmente carecía de
actividad antitumor cuando se administraba a ratones con tumores
grandes C1300 (Mu\gamma) (Burrows y Thorpe, 1993; Solicitudes de
Patente U.S.A. números 07/846.349; 08/205.330; 08/295.868; y
08/350.212). La falta de actividad se debió a la incapacidad de la
inmunotoxina de tener un acceso a las células tumorales en masas
tumorales grandes, sirviendo como testigos a la efectividad
comparativa de la terapia de coaguligando.
Los estudios usando coaguligandos confirmaron la
terapéutica potencial de la iniciación selectiva de la cascada de
coagulación de sangre en la vasculatura tumoral (Solicitudes de
Patente U.S.A. números 08/273.567; 08/482.369; 08/485.482;
08/487.427; 08/479.733; 08/472.631; 08/479.727; y 08/481.904). La
inducción de infarto tumoral dirigiendo un trombógeno a los
marcadores de células endoteliales del tumor es, por lo tanto, una
estrategia anticáncer efectiva y puede dar como resultado aún la
erradicación de tumores sólidos primarios y metástasis
vascularizada.
El uso exitoso de Factor de Tejido truncado solo
o inmunoconjugados de Factor de Tejido truncado con un anticuerpo de
especificidad irrelevante inicialmente fue un resultado sorprendente
de los estudios dirigidos. Aunque los ratones que recibieron
solamente Factor de Tejido truncado no tuvieron regresiones del
tumor completas, es claro que la actividad antitumor sorprendente
del Factor de Tejido truncado vuelve a éste y a sus derivados de
Factor de Tejido funcionalmente relacionados útiles en el
tratamiento de tumores sólidos. Los beneficios de estas
composiciones como se detalla en la presente descripción son de más
alcance e incluyen la falta de efectos secundarios del uso de estos
Factores de Tejido. Además, está bien dentro de la experiencia de
los técnicos en el campo producir el tipo de composiciones de
Factores de Tejido truncadas presentadas en la presente invención.
Estas composiciones se pueden emplear entonces en el tratamiento de
tumores sólidos solos o en combinación con otras sustancias sólidas
anti-cáncer.
El conjugado
IgG-H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
fue activo para inducir la coagulación de plasma de ratón cuando se
localizó en la superficie de células A20 por medio del anticuerpo
biespecífico, B21-2/10H10. Indujo la coagulación en
50 segundos cuando se aplicó a concentraciones de Factor de Tejido
truncado de 5 x 10^{-9} M en comparación con 1 x 10^{-9} M para
tTF_{219} y
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
no conjugados (figura 15). La actividad que induce la coagulación
del conjugado
IgG-H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
por lo tanto se redujo 5 veces en relación con el
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
o el tTF_{219} mismo no conjugados.
La ligera reducción de la conjugación de
inmunoglobulina G (IgG) podría ser debido a que la fracción de
inmunoglobulina G de
IgG-H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
impide el acceso del anticuerpo biespecífico
B21-2/10H10 a la fracción de Factor de Tejido
truncado (es decir, una reducción aberrante relacionada con el
método de ensayo). Probablemente no es debido a que la fracción de
inmunoglobulina G de
IgG-H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
interfiera con la formación de los complejos de iniciación de
coagulación debido a que, en trabajos anteriores, los inventores han
encontrado que la fracción de Factor de Tejido truncado en una
construcción análoga, B21-2
IgG-H_{6}-N'-cys-tTF_{219},
es activa conforme el Factor de Tejido truncado se enlaza a través
de B21-2/10H10 a antígenos I-A^{d}
en células A20 (figura 16). De manera similar, B21-2
IgG-H_{6}-tTF_{219}-cys-C'
fue tan activo para inducir la coagulación como la conjugación de
N'-enlazada (figura 16).
Se probó la capacidad de
IgG-H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
y Fab'-H_{6}-N'
-cys-tTF_{219} para convertir el Factor X en Xa en
presencia de los Factores II, VII y IX, una vez localizados en la
superficie de células de linfoma A20 por medio del anticuerpo
biespecífico B21-2/10H10. La construcción
Fab'-tTF fue tan activa como el mismo
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
para inducir la formación de Xa. La construcción
IgG-tTF fue ligeramente (2 veces) menos activa que
la misma
H_{6}-N'-cys-tTF_{219}
(figura 17).
Ratones con tumores pequeños (300 mm^{3})
subcutáneos C1300 Mu\gamma fueron tratados con tTF_{219} o con
un complejo de tTF_{219} y un anticuerpo biespecífico, OX7
Fab'/10H10 Fab', no dirigido a un componente del ambiente del tumor.
El tratamiento se repitió seis días después (figura 18). El
anticuerpo biespecífico se diseñó simplemente para aumentar la masa
del tTF_{219} de 25 kDa a 135 kDa, y prolongar así su vida media
circulatoria, y no fue intencional para impartir una función
objetivo al Factor de Tejido truncado.
Los tumores en los ratones tratados con conjugado
de inmunoglobulina-tTF crecieron más lentamente que
aquellos ratones que recibieron solamente tTF_{219}. Catorce días
después de la primera inyección, los tumores tenían el 55 por ciento
del tamaño de aquéllos en los controles que recibieron solamente
diluyente. En ratones que recibieron tTF_{219} solo, los tumores
fueron 75 por ciento del tamaño en controles que recibieron
solamente diluyente (figura 18).
Se trataron ratones que tenían tumores de la
enfermedad de Hodgkin humana L540 con un complejo de tTF_{219} y
un anticuerpo biespecífico junto con el fármaco anticáncer
convencional, etoposida. La etoposida aumentó en gran medida la
acción del conjugado de inmunoglobulina-tTF. En este
modelo de tumor solo, ratones que recibieron el complejo de
anticuerpo-tTF solo mostraron poca reducción en
crecimiento de tumor en relación con los tumores en ratones que
recibieron solamente diluyente (figura 19).
En cambio, los tumores en ratones que recibieron
tanto la etoposida como el conjugado de
inmunoglobulina-tTF disminuyeron de tamaño y no
recomenzaron su crecimiento durante diecisiete días. Al final del
estudio (día 20), los tumores en los ratones que recibieron
etoposida más inmunoglobulina-tTF tenían un promedio
de 900 mm^{3} de volumen en comparación con 2300 mm^{3} en los
ratones tratados con diluyente y 2000 mm^{3} en ratones tratados
con solamente inmunoglobulina-tTF. En ratones que
recibieron solamente etoposida, los tumores promediaron 1400
mm^{3} en el día 14 (figura 19). Estos resultados indican que la
etoposida puede predisponer los vasos tumorales a trombosis mediante
tTF o conjugados de inmunoglobulina-tTF.
Independientemente del mecanismo, los resultados claramente muestran
que la combinación ventajosa de Factor de Tejido, o un conjugado de
Factor de Tejido con una sustancia quimioterapéutica clásica.
La capacidad del tTF_{219} asociado a la célula
para inducir la coagulación de plasma de ratón o humano aumentó
mucho con la presencia del factor libre VIIa (figura 20). En
ausencia del Factor VIIa, las células A20 tratadas con anticuerpo
biespecífico B21-2/10H10 y 10^{-10} M del
tTF_{219} coaguló el plasma en 60 segundos, mientras que en
presencia de 13,5 nM de Factor VIIa, coaguló el plasma en 20
segundos (figura 20). Esto representa aproximadamente un aumento de
100 veces en la potencia de inducción de coagulación del tTF en
presencia del Factor VIIa. Aún en presencia de 0,1 nM de Factor
VIIa, se observó un aumento de 2-5 veces de potencia
de inducción de coagulación del Factor de Tejido truncado.
Este hallazgo conduce a los aspectos de la
descripción que se refieren a la coadministración de Factor VIIa
junto con Factor de Tejido truncado o derivados del mismo, o con
conjugados de inmunoglobulina-Factor de Tejido
truncado, con el fin de aumentar la trombosis de los vasos del tumor
en vivo.
Se han dado a conocer mutaciones en W158 y G164
del tTF_{219} para reducir marcadamente la capacidad del Factor de
Tejido para inducir la coagulación de plasma recalcificado (Ruf y
colaboradores, 1992; Martin y colaboradores, 1995). Los residuos de
157-167 del Factor de Tejido parecen ser importantes
para acelerar la activación del Factor VII en Factor VIIa, pero no
la unión del Factor VII al Factor de Tejido. Los inventores mutaron
W158 a R y G164 a A y determinaron si los mutantes adquirieron la
capacidad para coagular plasma en cuanto se localizaron por medio de
un anticuerpo biespecífico, B21/2-10H10, en la
superficie de células A20. Se encontró que los mutantes fueron de 30
a 50 veces menos efectivos que lo que fue tTF_{219} en inducir la
coagulación de plasma (figura 21).
El mutante tTF_{219} (G164A) es un mutante muy
débilmente coagulante del tTF_{219} (Ruf, y colaboradores, 1992).
La mutación está presente en una región del Factor de Tejido
(aminoácidos 157-167) pensado que es importante para
la conversión del Factor VII en Factor VIIa. De este modo, la
adición del Factor VIIa a las células recubiertas con anticuerpo
biespecífico y tTF_{219} (G164A) se razonaría que induce la
coagulación de plasma. En apoyo de esto, células A20 recubiertas con
B21-2/10H10 seguidas por tTF_{219} (G164A)
tuvieron capacidad aumentada para inducir la coagulación de plasma
en presencia del Factor VIIa (figura 22). La adición del Factor VIIa
a 1 nM o más produjo solamente tiempos de coagulación marginalmente
más lentos que la observada con tTF_{219} y el Factor VIIa en las
mismas concentraciones.
El mutante tTF_{219} (W158R) dio resultados
similares al tTF_{219} (G164A). De nuevo, en adición del Factor
VIIa a 1 nM o más a células A20 recubiertas con
B21-2/10H10 seguido por tTF_{219 }solamente dio
tiempos de coagulación marginalmente más lentos que el tTF_{219} y
el Factor VIIa a las mismas concentraciones.
Estos resultados soportan los aspectos de la
descripción que dan a conocer que tTF_{219} (G164A) o tTF_{219}
(W158R), cuando se coadministran con el Factor VIIa a animales que
tienen tumor, inducirán la trombosis de los vasos tumorales. Este
enfoque se considera que es ventajoso debido a que tTF (G164A), tTF
(W158R) o el Factor VIIa dado separadamente son prácticamente no
tóxicos para los ratones, y lo mismo se espera razonablemente en
humanos. La coadministración del tTF mutante y el Factor VIIa se
espera que no cause toxicidad, y que cause trombosis eficiente de
los vasos del tumor. La administración de Factor de Tejido truncado
mutante junto con Factor VIIa se tiene en cuenta así que da como
resultado un índice terapéutico mejorado en relación con el
tTF_{219} más Factor VIIa.
Para estos estudios, los inventores eligieron el
modelo de tumor de xenoinjerto HT29 (carcinoma colorrectal humano).
Las células HT29 (10^{7} células/ratón) se inyectaron
subcutáneamente en ratones BALB/c nu/nu. Se midió el tamaño del
tumor y los animales se trataron cuando el tamaño del tumor fue de
0,5 y 1,0 cm^{3}. Se les dio a los animales una inyección
intravenosa de uno de los siguientes tTF_{219} (16 \mug),
tTF_{219} (16 \mug) + Factor VIIa (1 \mug), tTF_{219}
(G164A) (64 \mug), tTF_{219} (G164A) (64 \mug) + Factor VIIa
(1 \mug), Factor VIIa solo (1 \mug), o solución salina.
Los animales fueron sacrificados 24 horas después
del tratamiento, se inundaron con solución salina y heparina y se
desangraron. Los tumores y los órganos se recolectaron, se fijaron
con formalina y se prepararon secciones histológicas. Se cuantificó
el área promedio de necrosis en secciones del tumor y se calculó
como un porcentaje del área total del tumor en la sección.
En estos pequeños tumores HT29, el análisis de
las secciones de tumores de animales tratados con solución salina,
Factor VIIa, tTF_{219} o tTF_{219} (G164A) mostraron alguna
necrosis (figura 23). La necrosis del tumor inducida por tTF fue la
más desarrollada, aunque esto no fue sorprendente, en esta ocasión,
como los resultados de estudios anteriores usando diferentes modelos
de tumor y/o tumores más grandes. Un análisis de las secciones de
tumores de los animales tratados con tTF_{219} + Factor VIIa o
tTF_{219} (G164A) + Factor VIIa revelaron necrosis considerable
(12,5 por ciento y 17,7 por ciento respectivamente; figura 23) y una
correlación mayor entre los vasos sanguíneos recientemente
trombosados y áreas de necrosis. El uso combinado del Factor VIIa
con Factor de Tejido, incluso una construcción de Factor de Tejido
con actividad coagulante in vitro particularmente deficiente,
es por lo tanto un aspecto particularmente ventajoso de la presente
invención. Ya que el modelo de tumor HT29 es difícil de trombosar en
general y estos tumores tenían tamaño pequeño, estos resultados
probablemente se trasladan a resultados más impactantes en otros
sistemas y en humanos.
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<400> 6
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 236
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 219
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 219
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 657
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 13865
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 263
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 1440
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> mammalian
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 466
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> mammalian
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SYNTHETIC PRIMER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 15
gtcatgccat ggcctcaggc
actacaa
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SYNTHETIC PRIMER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 16
tgacaagctt attctctgaa ttcccctttc
t
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SYNTHETIC PRIMER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 17
gtcatgccat ggccctggtg cctccgtgctt ctgggcactac
aaatact
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SYNTHETIC PRIMER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 18
gtcatgccat ggccctggtg cctcgtggtt cttgcggcac
tacaaatact
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SYNTHETIC PRIMER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 19
cgcggatcca ccgccaccag atccaccgcc tccttctctg
aattcccctt tct
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SYNTHETIC PRIMER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 20
cgcggatccg gcggtggagg ctcttcaggc actacaaata
ctgt
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SYNTHETIC PRIMER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 21
tgacaagctt attctctgaa ttcccctttc
t
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SYNTHETIC PRIMER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 22
gtcatgccat ggccctggtg cctcgtggtt cttgcggcac
taccaaatact
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SYNTHETIC PRIMER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 23
tgacaagctt attcctctgaa ttcccctttc
t
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SYNTHETIC PRIMER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 24
gtcatgccat ggccctggtg cctcgtggtt gcacctacaaa
tact
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SYNTHETIC PRIMER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 25
tgacaagctt agcattctct gaattcccct
ttct
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SYNTHETIC PRIMER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 26
caagttcagc caagaaaac
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SYNTHETIC PRIMER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 27
acactttatt atcggaaatc ttcagcttca
ggaaag
\hfill36
Claims (47)
1. Composición que comprende una cantidad
biológicamente efectiva de un compuesto de Factor de Tejido de
coagulación deficiente que es como mínimo 100 veces menos activo en
coagulación que el Factor de Tejido original, de tamaño completo, y
que ha sido modificado para aumentar su vida media biológica; en la
que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación deficiente no
está unido a una parte objetivo.
2. Composición, según la reivindicación 1, para
su uso para promover la coagulación en la vasculatura tumoral de un
animal.
3. Uso de una composición, según la
reivindicación 1 ó 2, en la fabricación de un medicamento para su
uso en el tratamiento de tumores vascularizados promoviendo la
coagulación en la vasculatura tumoral de un animal.
4. Uso de una composición que comprende una
cantidad biológicamente efectiva de un compuesto de Factor de Tejido
de coagulación deficiente en la fabricación de un medicamento para
su uso en el tratamiento de tumores vascularizados promoviendo la
coagulación en la vasculatura tumoral de un animal; en el que el
compuesto de Factor de Tejido de coagulación deficiente es como
mínimo 100 veces menos activo en coagulación que el Factor de Tejido
original, de tamaño completo, y no está unido a una parte
objetivo.
5. Uso, según la reivindicación 4, en el que el
compuesto de Factor de Tejido de coagulación deficiente ha sido
modificado para aumentar su vida media biológica.
6. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3, 4 ó 5, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente ha sido modificado para aumentar su vida media biológica
mediante su unión a una proteína portadora inerte o a una molécula
portadora no proteínica.
7. Uso, según la reivindicación 6, en el que el
compuesto de Factor de Tejido de coagulación deficiente se une a una
molécula portadora de albúmina o de globulina.
8. Uso, según la reivindicación 6, en el que el
compuesto de Factor de Tejido de coagulación deficiente se une a un
anticuerpo portador inerte, o parte del mismo.
9. Uso, según la reivindicación 6, en el que el
compuesto de Factor de Tejido de coagulación deficiente se une a un
anticuerpo de IgG portador inerte, una parte Fc de un anticuerpo o
se inserta en una molécula IgG portadora inerte en lugar del dominio
C_{H}3.
10. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 9, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es entre 100 veces y 1.000.000 de veces menos activo en
coagulación que el Factor de Tejido original, de tamaño
completo.
11. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 10, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es como mínimo 1.000 veces menos activo en coagulación
que el Factor de Tejido original, de tamaño completo.
12. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 11, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es como mínimo 10.000 veces menos activo en coagulación
que el Factor de Tejido original, de tamaño completo.
13. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 12, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es como mínimo 100.000 veces menos activo en coagulación
que el Factor de Tejido original, de tamaño completo.
14. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 13, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es como mínimo 500.000 veces menos activo en coagulación
que el Factor de Tejido original, de tamaño completo.
15. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 14, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es como mínimo 1.000.000 veces menos activo en
coagulación que el Factor de Tejido original, de tamaño
completo.
16. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 15, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es un compuesto de Factor de Tejido mutante deficiente en
su capacidad para activar al Factor VII.
17. Uso, según la reivindicación 16, en el que el
compuesto de Factor de Tejido de coagulación deficiente es un
compuesto de Factor de Tejido mutante que incluye como mínimo una
primera mutación en la región de aminoácido entre la posición 157 y
la posición 167 de la SEQ ID No:1.
18. Uso, según la reivindicación 17, en el que el
compuesto de Factor de Tejido de coagulación deficiente es un
compuesto de Factor de Tejido mutante en el cual el Trp en la
posición 158 se cambia por Arg; Ser en la posición 162 se cambia por
Ala; Gly en la posición 164 se cambia por Ala; o en la cual Trp en
la posición 158 se cambia por Arg y Ser en la posición 162 se cambia
por Ala.
19. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 18, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es un compuesto de Factor de Tejido deficiente para
enlazar a una superficie de fosfolípido.
20. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 19, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es un compuesto de Factor de Tejido truncado.
21. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 20, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es un compuesto de Factor de Tejido truncado de 219
aminoácidos de tamaño.
22. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 21, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es un compuesto de Factor de Tejido homodimérico,
heterodimérico o polimérico.
23. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 22, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es:
- (a)
- un compuesto de Factor de Tejido mutante que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No:8 ó SEQ ID No:9; ó
- (b)
- un compuesto de Factor de Tejido truncado que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No:1.
24. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 23, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es un compuesto de Factor de Tejido humano.
25. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 24, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente es un compuesto de Factor de Tejido preparado mediante
expresión recombinante.
26. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 25, en el que la composición comprende un segundo compuesto de
Factor de Tejido de coagulación deficiente.
27. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 26, en combinación con una cantidad biológicamente efectiva de
como mínimo un Factor VIIa o un activador del Factor VII.
28. Uso, según la reivindicación 27, en
combinación con el Factor VIIa.
29. Uso, según la reivindicación 28, en el que el
Factor VIIa consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos
desde el aminoácido 61 hasta el aminoácido 212 de la secuencia de
polipéptidos del Factor VII de la SEQ ID No:14.
30. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
27 a 29, en el que el compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente se combina con Factor VIIa en un complejo preformado de
Factor de Tejido-Factor VIIa.
31. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 30, en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de
un agente anticáncer.
32. Uso, según la reivindicación 31, en el que el
agente anticáncer es un agente quimioterapéutico.
33. Uso, según la reivindicación 32, en el que el
agente anticáncer es uno entre: agentes alquilantes,
antimetabolitos, productos naturales, hormonas y antagonistas,
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|}\hline
Mostazas de Nitrógeno \\\hline Etilenimenas y \\ Metilmelaminas
\\\hline Sulfonato de alquilo \\\hline Nitrosoureas \\ Triazinas
\\\hline Análogos de Ácido Fólico \\\hline Análogos de Pirimidina
\\\hline
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
(continuación)
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|}\hline
Análogos de Purina e \\ Inhibidores Relacionados \\\hline
Alcaloides vinca \\\hline Epipodofilotoxinas \\\hline Antibióticos
\\\hline \\\hline Enzimas \\\hline Modificadores de Respuestas \\
Biológicas \\\hline Complejos de Coordinación \\ Platino \\\hline
Antracenediona \\\hline Urea Sustituida \\\hline Derivado Metil
hidrazina \\ Adrenocortical \\\hline Supresor \\\hline
Adrenocorticoesteroides \\\hline Progestina \\\hline Estrógeno
\\\hline Antiestrógeno \\\hline Andrógenos \\\hline Antiandrógeno
Análogo de \\ hormona que libera \\ Gonadotropina \\\hline
Mecloretamina (HN _{2} ) \\\hline Ciclofosfamida \\ Ifosfamida
\\\hline Melfalán (L-sarcolisina) \\\hline
Clorambucil \\\hline Hexametilmelamina \\\hline Tiotepa \\\hline
Busulfán \\\hline Carmustina (BCNU) \\\hline Lomustina (CCNU)
\\\hline Semustina \\ (metil-CCNU) \\\hline
Estreptozocina \\ (estreptozotocina) \\ Decarbacina (DTIC; \\
dimetiltriacenoimida \\ zolecarboxamida) \\\hline Metotrexato \\
(ametopterina) \\\hline Fluouracilo \\
(5-fluorouracilo; 5-FU) \\
Floxuridina (fluorode- \\ oxiuridina; FUdR)
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
(continuación)
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|}\hline
Citarabina (citosina \\ arabinosida) \\\hline Mercaptopurina \\
(6-mercaptopurina; 6-MP) \\\hline
Tioguanina \\ (6-tioguanina; TG) \\\hline
Pentostatina \\ (2-deoxicoformicina) \\\hline
Vinblastina (VLB) \\\hline Vincristina \\\hline Etopósido \\
Tertipósido \\\hline Dactinomicina \\ (actinomicina D) \\\hline
Daunorrubicina \\ (daunomicina; \\ rubidomicina) \\\hline
Doxorrubicina \\ Bleomicina \\\hline Plicamicina (mitramicina)
\\\hline Mitomicina (mitomicina C) \\\hline
L-Asparraginasa \\\hline Interferón alfa \\\hline
Cisplatín ( cis -DDP) \\ Carboplatín \\\hline Mitoxantrona
\\\hline Hidroxiurea \\\hline Procarbacina \\
(N-metilhidracina, MIH) \\ Mitotane
( o,p '-DDD) \\\hline Aminoglutetimida
\\\hline Prednisona (se dispone de \\ otros varios preparados \\
equivalentes) \\\hline Hidroxiprogesterona \\ caproato \\
Medroxiprogesterona \\ acetato \\ Megestrol acetato \\\hline
Dietilestilbestrol \\ Etinil estradiol (se \\ dispone de otros \\
preparados) \\\hline Tamoxifén \\\hline Testosterona propionato \\
Fluoximesterona (se \\ dispone de otros \\ preparados) \\\hline
Flutamida \\ Leuprólido
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
34. Uso, según la reivindicación 33, en el que el
agente anticáncer es etoposida.
35. Uso, según la reivindicación 31, en el que el
agente anticáncer es una construcción de anticuerpo que comprende
una región de enlace de anticuerpo o antígeno que específicamente se
enlaza a un componente de una célula tumoral, vasculatura tumoral o
estroma tumoral, el anticuerpo está operativamente unido a un agente
citotóxico o a un factor de coagulación.
36. Uso, según la reivindicación 35, en el que el
agente anticáncer es una construcción de anticuerpo que se enlaza
específicamente a un componente de vasculatura tumoral o estroma
tumoral.
37. Uso, según la reivindicación 35, en el que el
agente anticáncer es una construcción de anticuerpo que comprende un
agente citotóxico.
38. Uso, según la reivindicación 35, en el que el
agente anticáncer es una construcción de anticuerpo que comprende un
factor de coagulación.
39. Uso, según la reivindicación 38, en el que el
agente anticáncer es una construcción de anticuerpo que comprende
Factor de Tejido o un derivado de Factor de Tejido.
40. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 39, en el que el medicamento es para su uso en la promoción de
coagulación en la vasculatura tumoral asociada con un tumor maligno
de tamaño mediano o grande vascularizado de un animal.
41. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 40, en el que el medicamento se formula para la administración
sistémica al animal.
42. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 41, en el que el medicamento se formula para inyección
intravenosa al animal.
43. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones
3 a 42, en el que el medicamento está destinado a administración a
un sujeto humano.
44. Estuche terapéutico que comprende, en un
elemento contenedor conveniente:
- (a)
- una combinación biológicamente efectiva de una composición, según la reivindicación 1 ó 2, y como mínimo uno entre el Factor VIIa, un activador del Factor VII o un agente anticáncer; o
- (b)
- una combinación biológicamente efectiva de un agente anticáncer y un compuesto de Factor de Tejido de coagulación deficiente que es como mínimo 100 veces menos activo en coagulación que el Factor de Tejido original, de tamaño completo, y no está unido a una parte objetivo.
45. El estuche, según la reivindicación 44, que
comprende una combinación biológicamente efectiva de una
composición, según la reivindicación 1 ó 2, y como mínimo uno entre
el Factor VIIa, un activador del Factor VII o un agente
anticáncer.
46. El estuche, según la reivindicación 44, que
comprende una combinación biológicamente efectiva de un agente
anticáncer y un compuesto de Factor de Tejido de coagulación
deficiente que es como mínimo aproximadamente 100 veces menos activo
en coagulación que el Factor de Tejido original, de tamaño completo,
y no se une a una parte objetivo.
47. El estuche, según la reivindicación 44, que
comprende una combinación biológicamente efectiva de (a) un
compuesto de Factor de Tejido de coagulación deficiente que es como
mínimo 100 veces menos activo en coagulación que el Factor de Tejido
original, de tamaño completo, y no está unido a una parte objetivo;
(b) como mínimo uno entre el Factor VIIa o un activador de Factor
VII; y (c) un agente anticáncer.
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