CN1016967B - 纯化具有人生理活性的多肽的方法 - Google Patents

Abstract

含有生理活性多肽的水溶液，它是用重组DNA技术生产的，对L-M细胞有细胞毒素活性，能引起在BALB/C小鼠中植入的MethA肉瘤出血性坏死，通过用以染料结合的交联琼脂糖凝胶装的柱的柱层析就能被有效地纯化，本发明的纯化人生理活性多肽已被发现引起肿瘤坏死效果卓著而对活体的正常组织无毒害影响。

Description

这个发明与编码新的人生理活性多肽之脱氧核糖核酸（这里和以后都称为DNA）有关。这个发明也与下列各点有关：含有DNA的可复制的重组DNA;用可复制的重组DNA转化微生物或细胞，通过DNA的表达得到新的有人生理活性的多肽，实质上是纯的有人生理活性并具有本发明所说的氨基酸顺序的多肽;有人生理活性的多肽的生产过程和通过重组DNA技术所生产的有人生理活性的多肽的纯化方法。更特别的是，本发明涉及到编码人肿瘤坏死因子（以后缩写成TNF）的DNA;人TNF具有的氨基酸顺序是从DNA的碱基顺序推引出来的，从利用重组DNA技术得来的DNA产生人TNF的过程和通过重组DNA技术所生产的人TNF纯化方法都与这个发明有关。

在本发明说明书中，用理论化学和应用化学国际协会-生物化学国际协会所审定的生化命名，如下面的缩写，是代表氨基酸和肽。顺便要说明的是，就氨基酸等具有的异构体而言，那些由下面缩写所代表的，除非另有说明，都是L-构型。

Gln：谷氨酰胺残基

Asp：天门冬氨酸残基

Pro：脯氨酸残基

Tyr：酪氨酸残基

Val：缬氨酸残基

Lys：赖氨酸残基

Glu：谷氨酸残基

Ala：丙氨酸残基

Asn：天门冬酰胺残基

Leu：亮氨酸残基

Phe：苯丙氨酸残基

Gly：甘氨酸残基

His：组氨酸残基

Ser：丝氨酸残基

Thr：苏氨酸残基

Ile：异亮氨酸残基

Trp：色氨酸残基

Arg：精氨酸残基

Met：甲硫氨酸残基

Cys：半胱氨酸残基

多聚脱氧核苷酸和寡聚脱氧核苷酸用脱氧核苷酸残基顺序来代表，脱氧核苷酸残基缩写如下：

A：2′-脱氧腺苷酸残基

C：2′-脱氧胞苷酸残基

G：2′-脱氧鸟苷酸残基

T：胸苷酸残基

除非有特殊说明，脱氧核苷酸顺序的左端是5′端。

具有刺激网状内皮系统的各种已知物质，例如具有抗肿瘤活性的有生理活性物质，它是由各种革兰氏阳性细菌和内毒素所诱导生成。确切地说，Carswell等发现从用卡介菌（BCG）感染的CD-1瑞士小鼠的血清和二星期后又用静脉注射内毒素的小鼠血清具有对培养的L细胞有细胞毒素活性;他也还发现一个现象，即在（BALB/CXC57BL/6）杂交子代小鼠（F₁）中它引起植入Meth A肉瘤的出血性坏死，他们给在血清中的这种活性物质名称为肿瘤坏死因子（TNF）〔参阅Proc.Nat.Acad.Sci.USA.Vol.72（No.9），PP.3666-3670（1975）〕。此后，Ruff等报告了按照由Carswell等所建议的上述方法制备的兔的肿瘤坏死因子（TNF）。并提纯得到约高于血清2000倍活性的TNF〔J.Immunol.，Vol.125（No.4），PP.1671-1677（1980）〕。以后，Metlhews等报告了兔子的TNF提纯得到约高于血清1000倍〔Br.J.Cancer，Vol.42，PP.416-422（1980）〕。然而，在Ruff等和Matthews等的报告中，提纯的TNF的肿瘤坏死效应并未在动物试验中确定。

日本专利申请书的公开说明书No.57-140725（1982）宣布分离和纯化有抗肿瘤活力的蛋白质类生理活性物质的过程。这种活性物质具有抗肿瘤活性，通过注射到哺乳类，例如小鼠、兔子、或豚鼠中，引起至少有一种物质具有刺激网状内皮系统的能力;然后再注射来自格兰氏阴性细菌的内毒素，或者把来自格兰氏阴性细菌的内毒素加入到含有哺乳类活化的巨噬细胞的组织培养物中。在这个日本专利申请书的公开说明书中，也公开了该纯化的蛋白质性的生理活性物质的分子量和等电点（分子量：39，000±5，000是用凝胶过滤或十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳进行测定;等电点为pH3.9±0.3是用等电聚焦法测定），但是没有该物质的任何详细结构。

同时，Matthews报告了他得到一种具有对L细胞有细胞毒素活性的物质，过程如下：用卡介菌注射兔子，在注射二星期后，从兔子各种组织得到单核吞噬细胞，接着又把内毒素加到单核吞噬细胞的细胞培养物中去〔Br.J.Cancer，Vol.44（3），PP.418-424（1981）〕。然而，在他的报告中，所得到物质的详细结构也没有公开，而且也没有证据说明他所得到的物质是与血清中所发现的TNF相同。

以后，有许多印刷的出版物报告了具有与TNF类似生物活性因子或与TNF生物活性相同的因子。例如，Reed等在人的外周血中的巨噬细胞及相似的细胞中（J.Immunology，Vol.115，P，395（1975）〕、Matthews等在来自人外周血单核细胞或来自患有髓样单核细胞白血病的白血细胞中〔Immunology，Vol.44，P.135（1981）〕、D.Barbara在用Epstein-棒状病毒转化的人B细胞中〔Proc.Not.Aoad.Sci.USA，Vol.80，P.5397（1983）〕，以及Bharat在类淋巴母细胞1788细胞系中都发现这类因子。上述这类因子也在日本专利申请书公开说明书编号：58-15921（1982），58-21621（1983），58-107197（1983）和58-225024（1983）和美国专利申请书公开说明书编号2，106，117和2，117，385等中宣布。然而，能有效地生产这样的因子的细胞或细胞系还未被发现。另外，关于这样的因子的结构和属性等许多问题还有待阐明。

Ito（井原）〔日本专利申请书，No.58-251817（1983）〕对兔TNF的结构和特性和产生兔TNF细胞作了研究。他用激活网状内皮系统功能的物质给予兔子，接着再给兔注射来自细菌的内毒素。结果得到能产生L细胞细胞毒物质的细胞，然后用那些细胞得到这样的物质，他也确定了用上述得到的细胞所产生的对L细胞有细胞毒性的物质的分子量与免疫活性是与来自兔子血清中得到的TNF那些物质相符合，同时，随之遗传操作的进展，只要编码蛋白的DNA得到是单离的形式，就有可能确定该蛋白质的结构。这是因为分离到的DNA的结构可以被确定，进而蛋白质的结构就能够从DNA的结构上推导出来，而且从利用微生物培养或细胞培养从编码蛋白的DNA产生蛋白质。井原（Ito）应用上述基因操作技术于能产生具有对L细胞有细胞毒素活性的物质的细胞中，结果，他成功地分离到编码兔TNF的DNA并确定DNA和兔TNF的结构，并用这些DNA生产兔TNF。

从上述的工作中又可以看出，井原在生产兔TNF中已作了很大的推进。然而应该注意的是把TNF注射到非其本源的动物有引起过敏反应休克的危险。这是因为TNF是一个多肽，当TNF注射到非本源动物时，作为抗原功能的TNF将产生抗体。由于这个原因当TNF用于人体注射，则用从人中衍生的TNF是最好不过的，但是，人的TNF结构至今还没有建立起来，因此确定编码人TNF    DNA的结构已是非常需要。

本发明对编码人TNF的DNA的结构已作了广泛的和深入的研究，结果，本发明者已惊人地发现人的多肽基因和兔的TNF基因可以用兔的CDNA作为探针克隆出来，编码人多肽的DNA顺序能被精巧地分离出来，因而它的结构能通过兔TNF基因、人多肽基因和兔C    DNA碱基顺序的同一性比较而确定，纯的编码人多肽DNA的结构能被顺利地确定并得到这一纯的DNA;以及用编码对L-细胞有细胞毒素活性的人的多肽DNA生产出人的多肽。

本发明是根据这些新的发现作成的。

因此，本发明一个目的是提供有人生理活性的多肽。

本发明另一个目的是提供编码人TNF的DNA。

本发明再另一个目的是提供包含编码人TNF的可复制的重组DNA和一个复制表达的运载体。

本发明还有一个目的是提供用上述一类重组DNA转化的微生物或细胞。

本发明再一个目的是提供生产象上述一类有人生理活性多肽的方法。

本发明还有一个目的是提供由重组DNA技术所产生的有人生理活性多肽的纯化方法。

在前述目的和另一些目的中，本发明的特点和优点从下面详细的叙述和其中有关的插图的了解将会使更清楚。

图1、其上插有一个含有编码有兔生理活性多肽的DNA的质粒内切酶谱的说明，

图2、制备编码通常有兔生理活性多肽的重组DNA（P    TNF-lac-1）方法流程的说明。

图3、制备编码通常有兔生理活性多肽的DNA另一个重组DNA（P    TNA-lac    UV5-1）方法流程的说明。

图4、含有本发明的有人生理活性的多肽基因之质粒的一部分内切酶谱的说明。

图5、含有一般有兔生理活性多肽基因的质粒的一部分内切酶谱的说明。

图6、制备编码本发明的有人生理活性多肽的重组DNA（P    HTNF-1ac    UV5-1）方法流程的说明。

图7、制备编码本发明的有人生理活性多肽的另一个重组DNA（P    HTNF-lac    UV5-2）方法流程的说明。

根据本发明基本上可以提供有下列结构式（Ⅰ）所代表的氨基酸顺序的具人生理活性的多肽。（见表A）

表A

Ser  Ser  Ser  Arg  Thr  Pro  Ser  Asp  Lys  Pro  Val  Ala  His  Vai  Vai

Ala  Asn  Pro  Gln  Ala  Glu  Gly  Gln  Leu  Gln  Trp  Leu  Asn  Arg  Arg

Ala  Asn  Ala  Leu  Leu  Ala  Asn  Gly  Val  Glu  Leu  Arg  Asp  Asn  GLn

Leu  Val  Val  Pro  Ser  Glu  Gly  Leu  Tyr  Leu  Ile  Tyr  Ser  Gln  Val

Leu  Phe  Lys  Gly  Gln  Gly  Cys  Pro  Ser  Thr  His  Val  Leu  Lue  Thr

His  Thx  Ile  Ser  Arg  Ile  Ala  Val  Ser  Tyr  Gln  Thr  lys  Val  Asn

Leu  Leu  Ser  Ala  Ile  Lys  Ser  Pro  Cys  Gln  Arg  Glu  Thr  Pro  Glu

Gly  Ale  Glu  Ala  Lys  Pro  Trp  Tyr  Glu  Pro  Ile  Tyr  Leu  Gly  GLy

Val  Phe  Gln  Leu  Glu  Lys  Gly  Asp  Arg  Leu  Ser  Ala  Glu  Ile  Asn

Arg  Pro  Asp  Tyr  Leu  Asp  Phe  Ala  Glu  Ser  Gly  Gln  Val  Tyr  Phe

Gly    Ile    Ile    Ala    Leu

其中Gln代表谷氨酰胺残基，Asp为门冬氨酸残基，Pro为脯氨酸残基，Tyr为酪氨酸残基，

Val为颉氨酸残基，Lys为赖氨酸残基，

Glu为谷氨酸残基，Ala为丙氨酸残基，

Asn为门冬酰胺残基，Leu为亮氨酸残基，

Phe为苯丙氨酸残基，Gly为苷氨酸残基，

His为组氨酸残基，Ser为丝氨酸残基，

Thr为苏氨酸残基，Ile为异亮氨酸残基，

Trp为色氨酸残基，Arg为精氨酸残基，

Met为甲硫氨酸残基和Cys半胱氨酸残基。

本发明的具人生理活性多肽也包括那种具有甲硫氨酸紧接上述氨基酸顺序N端的多肽和间有一部分或整部分人TNF的信号肽紧接在上述氨基酸顺序N端的多肽。通过自然的或人工的突变有可能使变换编码多肽的DNA部分结构而不使多肽活性起重要变化。本发明的有人生理活性的多肽包括那种具有结构与有上述氨基酸顺序的多肽相当的同源变株。所有这样有人生理活性的多肽这里都称为“人TNF”（人肿瘤坏死因子）。

本发明的另一方面所提供的脱氧核糖核酸包含 编码有人生理活性多肽的碱基顺序。

所说的有人生理活性的多肽具有下列结构式（Ⅰ）所代表的氨基酸顺序。（见表A）

其中Gln代表谷氨酰胺残基，Asp为门冬氨酸残基，Pro为脯氨酸残基，Tyr为酪氨酸残基，

Val为颉氨酸残基，Lys为赖氨酸残基，

Glu为谷氨酸残基，Ala为丙氨酸残基，

Asn为门冬酰胺残基，Leu为亮氨酸残基，

Phe为苯丙氨酸残基，Gly为苷氨酸残基，

His为组氨酸残基，Ser为丝氨酸残基，

Thr为苏氨酸残基，Ile为异亮氨酸残基，

Trp为色氨酸残基，Arg为精氨酸残基，

Met为甲硫氨酸残基，和Cys为半胱氨酸残基。

本发明另一方面是提供脱氧核糖核酸，它是从由下列结构式Ⅱ和与之互补的碱基顺序组成的一组碱基序列中选出的至少一种碱基序列。（见表B）

本发明的DNA包括具有紧接在上述碱基序列5′端的ATG（A、T、和G如上述）的碱基序列，依靠微生物或细胞培养物以产生成熟的人TNF。本发明的DNA也包括有5′侧DNA-编码人TNF信号肽整个顺序或部分顺序的DNA。

DNA的结构和由此推引出的多肽的结构，可以通过自然的或本人工的突变而使产生部分变换但多肽的主要活性不使变化。因此，本发明的DNA可以选择地使编码多肽的碱基顺序具有相当于前面提到的多肽的一些同源变异体的结构。

根据遗传密码的简并有可能使基因的碱基顺序的至少一个碱基用另一类碱基取代，而不使由基因产生的多肽的氨基酸顺序发生变化。因此本发明的DNA也可以按照遗传密码的简并用取代的方法使任何碱基序列发生变化。在这个例子中，通过上述取代的方法得到的碱基顺序上推导出来的氨基酸顺序是与前面所确定的结构（Ⅰ）的氨基酸顺序相同。

本发明的另一个方面，是提供可复制的重组DNA，它包含根据本发明的上述脱氧核糖核酸和复制表达的运载体。重组DNA是能在转化的微生物或细胞培养物中表达包含人TNF氨基酸顺序的多肽。关于合适的运载体也许已被提到，例如PHINF-lacUV5-1和PHTNF-lacUV5-2表达运载体。

另外，本发明指出重组DNA转化微生物或细胞培养物表达包含人TNF氨基酸顺序的多肽。这样的微生物或细胞培养物的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌、酵母和高等动物细胞。

本发明再有一个方面，要提供生产本发明的有人生理活性的多肽的方法，它包括：

（a）把上述规定的结构式（Ⅱ）的脱氧核糖核酸与可复制的表达运载体相连接以得到含所说的脱氧核糖核酸的可复制的重组DNA和所说的复制表达的运载体。

（b）用所说的可复制的重组DNA转化微生物或细胞培养物的细胞以形成转化体。

（c）从微生物或细胞培养物的亲代细胞中筛选所说的转化体。

（d）培育所说的转化体，使该转化体表达所说脱氧核糖核酸以生产有人生理活性的多肽。

（e）从培养的转化体中分离所说的有人生理活性的多肽。

按照本发明的方法，上述本发明的多聚脱氧核糖核酸与可复制的表达运载体相连接而作成运载体以得到含有上述多聚脱氧核酸的可复制的重组DNA。用这样得到的可复制的重组DNA转化微生物或细胞培养物以得到含有重组DNA的转化过的微生物或细胞培养物。这样得到的转化体从亲代微生物或亲代细胞培养物通过由DNA给予表型性状而分离到。这样得到的转化过的微生物或细胞培养物使之生长并使编码在上述核酸中的遗传信息得到表达， 从而产生按照本发明的有生理活性的多肽。

此外，本发明所指的人TNF，是成熟型TNF，是从寄主细胞作为直接表达产物分泌出来。也许已提到关于得到这样成熟型的人TNF的方法，例如包含构造DNA顺序的方法，以使来自微生物或高等动物由15个到40个氨基酸组成的，通称为信号肽的氨基酸顺序与成熟型的TNF的氨基酸顺序的头端结合起来。

按照下述步序可得到人TNF。

1.用由下Maniatis教授（美国麻州（02138）剑桥神字街7号，哈佛大学生物化学与分子生物学系）所制备的噬菌体λ/兔基因库和噬菌体λ/人基因库。

这些材料可按下述步骤制备〔参看Cell15，P687（1978）〕。

（1）、取兔或人的组织，例如兔或人的胰组织，作成冰冻粉，并对RNA物质和蛋白质物质进行降解处理，通过沉淀提供出高分子量的兔或人的DNA。

（2）、把高分子量DNA进行部分酶解。就基因位点而言系随机切断。

（3）、得到的DNA片段进行大小分级，给出15到20千碱基对（Kh）片段。

（4）、把第3步得到的片段用入Charon4A噬菌体运载体进行克隆。

（5）、克隆好的运载体进行离体包装使成含有γDNA的能感染的噬菌体颗粒，以得到上述兔或人的基因库。

2、参照例3所得到的cDNA用P.W.J.Rigby等的缺口转移方法标记³²P〔参阅J.Mol Biol 113，p237（1977）〕。

3、每个噬菌体λ/兔染色体基因库和噬菌体λ/人染色体基因库倒成平板，使它在细菌层上形成融合的噬菌斑;并用³²P标记的兔TNFcDNA进行分子杂交筛选。

4、从合适的克隆中，分离到相当的DNA，作限制性内切酶谱，并用Southern杂交法分析〔参阅E.M.Southern，J.Mol.Biol.98，P.503（1975）〕

把含有兔或人TNF基因的内切酶切的片段进行次级克隆到质粒运载体上然后进行顺序分析。

5、把兔TNFcDNA的碱基顺序与兔TNF基因的碱基顺序相比较，以确定兔TNF基因的外显子（编码兔TNF氨基酸顺序的一段碱基顺序）和内含子（不编码兔TNF氨基酸顺序的一段碱基顺序）。

6、其后，把人TNF基因的碱基顺序与兔TNF基因的碱基顺序相比较以确定人TNF基因的外显子和内含子。

7、从碱基序列推导的兔TNF氨基酸顺序可用删去兔TNF基因内含子，单把外显子并连起来的方法得到，从而可以确认它是与由兔TNFcDNA碱基顺序推导出来的相符合。

8、由编码人TNF的DNA碱基顺序推引来的人TNF氨基酸顺序可通过删除人TNF基因内含子而连接其外显子而得到。人TNF的氨基酸顺序可以确认它与兔TNF一部分相符合。

9、以后，编码人TNF的DNA在体外裁剪并把它插入到适合的表达运载体上以形成含有编码DNA的重组DNA。用重组DNA转化合适的寄主细胞，并又使寄主细胞长成培养物并表达所期望的人TNF。

10、这样产生的人TNF，它的成熟型中含有以丝氨酸开始的155个氨基酸残基。当信号肽在它的前体序列中时，信号肽是有很高的流水性的。

前面公开了得到TNF基因的方法、得到编码人TNF的DNA碱基顺序的方法以及用这种DNA产生人TNF的过程。然而应该明确，前面的方法公开，不是想限制本发明。那些技术熟练者在不改变本发明的基本特点与基本概念同时，是可以对以上过程作明显的改动的。

由于相当于每个氨基酸的密码子（遗传密码）使用频率的不同以及另外原因，编码人的TNFDNA碱基顺序的整个部分或一部分可用有机化学合成的人工DNA取代而不使得到的多肽的氨基酸顺序在其处改变。

据推测人TNF在细胞内产生的也许是不成熟型的前肽或前肽原;在加工阶段它通过中间型进行加工成为成熟的TNF。人TNF的不成熟型也许可从人TNF基因的碱基序列推引出。含有不成熟型TNF的DNA编码或中间型TNF的DNA编码的DNA也可以与自然的或人工合成的DNA相连接。

这个技术的一个途径可通过在5′-端插入甲硫氨酸密码子（ATG），在成熟型的、中间型的或不成熟型的TNF之DNA的3′端，从TAA、TAG、TGA中选择插入至少一个终止密码子。由 于甲硫氨酸密码子的存在，成熟型的或中间型的，或不成熟型的TNF，可能通过适合的启动子合成的mRNA而生产出来。然而紧靠在TNF    N端的甲硫氨酸碱基，随所用寄主细胞的种类可以被切除或不被切除。插入终止密码的目的是使由TNF    DNA转录来的mRNA在合适的位置（结构式Ⅰ多肽的C端）上停止转译。

这个技术另一个途径也许可通过加入一段编码高度疏水性的碱基顺序称作为“信号顺序”的DNA。应用这个方法，能使实现TNF分泌到寄主细胞外面或在格兰氏阴性细菌中分泌到称作“外周质”的空间中。

当应用已掺有起始码的运载体时，也将会产生由人TNF与运载体编码的蛋白所组成的融合肽。这时，融合肽可用化学法或酶法使之裂开。另外，融合肽如果对人TNF的主要活性没有什么影响，则它就可以被应用。

人TNF    DNA在其5′端上游可以与基因启动子顺序相连接，从而得到TNF    DNA-启动子顺序，它不会妨碍其复制，也不会使合成的RNA的翻译蒙受不利影响。因此得到的TNF-DNA启动顺序可以与细菌中或高等生物细胞中可复制的运载体相连接以得到重组的基因。如此得到的重组基因可以去转化用作寄主的细菌或高等生物细胞。这样得到的转化体可以培养促使TNF基因表达以生产人TNF。

当大肠杆菌（Escherichia    coli）用作如上述的寄主时，则E.coli    K-12的各种突变株，如HB101（ATCC33694）、C600K（ATCC33955）、D1210、RRI（ATCC31343）、MC1061、LE392（ATCC33572）、JM101（ATCC33876）、JM83和X1776（ATCC31244）、可以说都是合适的寄主。

当大肠杆菌寄主被应用时，则质粒例如PBR322，PBR325、PBR327、PUC8、PUC9、PMB9（ATCC37019）、PJB8（ATCC37074）和PKC7（ATCC37084）λ噬菌体例如λgt，λB和Charon4A，以及M13噬菌体可以说都是合适的运载体。使TNF在大肠杆菌细胞中产生;则从大肠杆菌基因和噬菌体基因的启动子中选择来的启动子是可以应用的。合适的启动子的先例有乳糖水解酶基因（LAC）的，由此而来的UV5突变体基因的，青霉素酶（BLA）和色氨酸合成酶（TRP）基因的;λ噬菌体PL启动子和由色氨酸合成酶启动子与乳糖降解酶启动子相融合的TAC启动子。

当枯草杆菌被用作寄主时，则BD170菌株（ATCC33608）BR151菌株（ATCC33677）和MI112菌株（ATCC33712）等可以说是合适的寄主。当枯草杆菌（Bacilluo    Rubtilis）寄主被应用时，则质粒pc194（ATCC37034）、PuB110（ATCC37015）、psA2100（ATCC37014）和pE194可以说是合适的运载体。另外，枯草杆菌寄主被应用时，氯微素乙酰化酶（CAT）基因、青微素酶基因和抗红霉素基因的启动子可以说是合适的启动子。

当酵母菌用作寄主时，啤酒酵母（Sacchavomyces    cerevisiae）菌株如RH218（ATCC44076）、SHY1（ATCC44769）、SHY3（ATCC44771）、D131A，483和830，可以说都是合适的寄主。当应用酵母作寄主时，则其质粒如YEp13（ATCC37115）、YEp6，YRp7和YIp5可以说都能作为合适的运载体。另外，当应用酵母寄主时，酸性磷酸单酯酶基因、醇脱氢酶（ADHI）基因，色氨酸合成酶（TRP）基因、磷酸甘油酸激酶（PGK）基因、细胞色素B基因（COB）和肌动蛋白基因的启动子可以说都可作为合适的启动子。

当把高等生物细胞培养物用作寄主时，猴肾细胞培养物、COS和小鼠C127（ATCC1616）、可以说都能作合适的寄主。应用高等生物细胞培养物作寄主时，SV40病毒可以说是合适的运载体。

当人TNF如果按下面所述的方法进行分析时，则人TNF对L-M细胞表现细胞毒素活性并在BALB/c小鼠中引起植入的MethA肉瘤出血性坏死。

本发明还有另外一个方面是提供纯化人生理活性多肽的方法，它包括把含有人生理活性多肽粗提物的水溶液放在用结合染料的、交联的琼脂糖凝胶装填的柱进行柱层析。

所说结合染料的、交联的琼脂糖凝胶，含有交联的琼脂糖凝胶作为载体，而染料作为配位体并与之共价结合。

所说有生理活性的多肽，它是用含有编码有生理活性的多肽之DNA的重组DNA，通过重组DNA技术所产生的一种肽，它对L-M细胞有细胞毒素活性并能引起BALB/C小鼠中植入的MethA肉瘤出血性坏死。

如前所说，人TNF具有前面所说结构式（Ⅰ）的氨基酸顺序，可以通过常用的重组DNA技术进行生产，所用的重组DNA，它含有编码有生理活 性多肽的DNA，其包含的至少有一碱基顺序是从前述结构式（Ⅱ）所代表的碱基顺序和与结构式（Ⅱ）碱基顺序互补的碱基顺序所组成的群体中选得的。直观地说，前面所提到的DNA是插在可复制的表达运载体上以形成重组DNA。用这样得到的重组DNA转化微生物以得到转化体。

这样得到的转化体进行大规模培养，按通常的方法以生产所期望的人TNF。当能分泌的转化体被应用时，则收集转化体培养的上清液就是含有未纯化人TNF的水溶液。在另一方面，不能分泌人TNF，但能积累人TNF的转化体被应用时，那末收集转化体的培养细胞并使之溶解，从而得到溶解细胞的抽提物便是含有未纯化的人TNF的水溶液。

这样得到的水溶液，含有未纯化的人TNF，使它直接上色层分析柱，该柱是按本发明用染料结合的，交联的琼脂糖凝胶装填的。另外根据本发明在上层析柱前可把含未纯化的人TNF水溶液单用或联合用下面叙述的常用的生化技术进行部分纯化以得到含有部分纯化的人TNF水溶液。关于部分纯化人TNF的合适生化技术，可以提到的，例如监析技术，其中可应用硫酸铵、离子交换层析以除去蛋白质性的杂质，其中可应用阳离子交换树脂，像DEAE-琼脂糖（发玛西亚，优级化学试剂AB.瑞典），用Polymine    P水溶液处理以除去核酸，用热处理以除去蛋白质性杂质，以及凝胶过滤技术，电泳技术等等。

如上所说明的，按照本发明的方法，含有生理活性多肽粗品的水溶液，可用染料-结合的交联的琼脂糖凝胶装填的柱进行柱层析。含有生理活性多肽粗品的水溶液（在这里及以后都称为“粗制有生理活性多肽水溶液”），按照本发明的方法纯化，它包括上述含有未纯化人TNF水溶液和部分纯化人TNF水溶液二者。

本发明中所用的染料-结合的交联的琼脂糖凝胶按照三氮杂苯偶合法（根据Boehme等，J.Chromatogr.69，pp.209-214（1972），把染料作为配位体共价结合到作为载体的琼脂糖凝胶上进行制备。关于交联的琼脂糖凝胶，任何交联的琼脂糖凝胶商品，例如Sepharose（由瑞典发玛西亚优级化学试剂AB制造与经销）就可以应用。至于在本发明中所用的染料，可以提到的，例如汽巴克郎兰P3GA（染料索引名：反应兰2），普施安红HE3B（染料索引名：反应红120）绿色A（美国Amicon公司生产，绿色A-结合的琼脂糖凝胶，商品名为“Matrex”凝胶绿色A）等等。汽巴克郎兰F3GA和普施安红HE3D的化学结构分别在下面结构式（1）和（2）中图示。在图中他们分别地以汽巴克郎兰F3GA-结合到交联的琼脂糖凝胶（Matrex凝胶兰色A）和普施安红HE3B-结合到交联琼脂糖凝胶（Matrex凝胶红色A）（每一个都由美国Amicon公司制造和经销）的形式表示。

染料结合交联的琼脂糖凝胶是商品生产的。关于汽巴克郎兰F3GA结合到交联琼脂糖的凝胶，可以方便地应用，例如，兰色琼脂糖CL-6B（瑞典发玛西亚优级化学试剂AB公司制造与经销），兰色视和凝胶（美国生物-放射实验室制造与经销），兰色Matrex凝胶A（美国Amicon公司制造与经销），以及其他等等。关于普施安红HE3B-结合的交联琼脂糖的凝胶也可以方便地应用;例如红色Matrex凝胶，（美国Amicon公司制造与出售）等，有关绿色 A结合的交联琼脂糖的凝胶也可以方便地应用、绿色A    Matrel凝胶（美国Amicon有限公司制造和经销）和其他等等。

把上面所提到的染料-结合的交联琼脂糖的凝胶装柱并用于柱层析。按照本发明，柱层析可以按下述方法进行。

用染料-结合的交联琼脂糖凝胶装柱，并用含0.1摩尔/升NaCl的缓冲液（pH5.5-6.5）充分平衡。关于缓冲液可以被应用的，例如磷酸缓冲液等。有生理活性多肽粗制品水溶液可以加到经过如此平衡过的柱上。加前最好把有生理活性的粗制品水溶液的pH调到5.5到6.5。然后用与上述相同缓冲液充分洗柱。其后，用比用于平衡柱的缓冲液有更高氯化钠浓度的缓冲液作洗脱液进行洗脱。例如，洗脱液含0.5M或更多的NaCl，另外，也可用pH值为8.0或更高的缓冲液作洗脱液进行洗脱。如此得到含有人TNF的部分实质上是纯的。

根据本发明的方法，实质上能得到纯的人TNF和高产量的回收。另外，与一般特异抗体-结合的交联琼脂糖凝胶不同，染料-结合的交联琼脂糖凝胶在相对严格的条件下有优越的重复性和稳定的应用性能。所以，按照本发明，人的TNF能大规模低成本进行稳定地纯化。另外，要注意的是在柱层析中应用的吸附剂的处理，已知是用碱性水溶液进行，这样在吸附剂上含有的在药物上不期望的杂质-热源物质就可被除去;也知道在柱层析中应用的吸附剂通过蒸汽灭菌器可以消毒。但是，抗体-结合的，于一般亲和层析技术的交联琼脂糖凝胶，不仅不能应用碱性水溶液处理，而且连蒸汽灭菌器进行消毒都不能应用，因为它们不能抵抗热与碱性条件。相反，在本发明中所用的染料-结合的交联琼脂糖凝胶，是能抵抗碱性条件和热的;所以能经受碱性水溶液处理，从而使在药物应用上不期望有的杂质-热源物质在染料-结合的琼脂糖凝胶上容易地被除去。而且染料-结合的琼脂糖凝胶也能用蒸汽灭菌器进行消毒。

本发明的这样纯化过的人生理活性多肽（人TNF）有抗肿瘤活性而且对正常细胞无毒性影响。例如，在一个活体分析中（它将在后面提到），应用植入MethA肉瘤的小鼠，当用按本发明已经得到纯化的人TNF300单位注射小鼠时，活性被评定为（+）。而且在注射人TNF后，与已经植入结肠瘤Colon26的小鼠并用生理盐水注射的对照小鼠相比较，可以观察到癌的明显的生长抑制或退化。还有，各种纯化的人TNF对各种癌细胞的细胞毒素活性的评定，除了KB细胞（腺癌）PC-8细胞（肺癌）和作为对照的正常细胞（胎儿人肾细胞和胎儿上皮细胞）等代替L-M细胞和细胞在37℃培养72小时以代替37℃培养48小时以外，基本上与后面所述的离体分析方法相同。

如上所述，本发明的有人生理活性的多肽具有优越的抗肿瘤活性，而具是从人中产生的。因此本发明的有人生理活性的多肽，当把活性多肽作为抗肿瘤药物在临床应用是特别有用的。

本发明的活性多肽，按照已知方法可以处方以配制抑制细胞增殖例如抑制恶性肿瘤细胞的增殖有用的药物成分。活性多肽也可以与药物上可接受的载药运载体组合成掺合剂。本发明活性多肽的有效量可以与合适的载体量相混合以制备在药物上可接受的组成药以适合接受者的有效服用。

本发明的有生理活性多肽可以投给需做抗肿瘤或抗病毒处理的患者;作注射药，滴眼药，滴鼻药，吸入剂，内服制剂，口服用药，直肠栓或阴道片。本发明的多肽，每成人的日用剂量，大概在50到100，000，000单位的范围，局部用药时最好在50到500，000单位的范围，一般注射例如静脉注射或肌肉注射大概在1000到1，000，000单位，口服用药剂量在10，000到100，000，000单位。日剂量根据用药的指导和接受者的病症可以增加或减少。

上面所用术语“1单位”意指杀死50%的1×10⁵细胞/毫升的L-M细胞（美国标准培养物收集站CCL1.2）所需要的本发明有生理活性多肽量。上面所述的量是根据以后要讲到的离体分析方法测定的。

本发明的有生理活性的多肽也可以作肠胃外用药。在肠胃外制剂中，可以是合并的，作为添加物、起稳定剂者有白蛋白，明胶，球蛋白，鱼精蛋白、鱼精蛋白的盐或其他等等，起加浓剂的如蔗糖，甘油，甲基纤维素，羧甲基纤维素或其他等等，和/或pH调节剂如各种无机盐。多肽也是适合的片剂形式投予的。在片剂中可以并合，作添加剂，药物载体如淀粉、乳糖或其他等等降上述稳定剂以外的物质。

关于动物试验的结果，已经发现小鼠肿瘤在多 数情况中，只通过1次或2次注射就被完全治愈。特别是人工的赘生物细胞（Meth-A细胞）一个试样植入到每个小鼠的皮肤中。当肿瘤长大到直径6到7毫米时注射本发明的多肽量0.6微克。一个星期以后出现结痂。二个星期以后，毛开始生长这就说明肿瘤完全被治愈。以后观察到小鼠妊娠并成功地生育。

其次，应用于评定本发明的有人生理活性多肽的抗肿瘤活性的分析方法详细说明如下。

（1）活体分析法（用MethA肉瘤植入的小鼠）

关于活体方法，例如（Wrswell等（Proc.Nat.Acad    Sci    USA    72，（1975）3666）的方法。

本发明者所应用的是通过改进上述的方法并已经作了发展方法。根据此法，把MethA肉瘤细胞（2×10⁵细胞）植入到每个BALB/C小鼠皮内。7天以后，小鼠已长有7-8毫米直径的肿瘤，并选择无出血性坏死和血管化好的作为评定之用。取人TNF样品（0.5毫升）用生理盐溶液稀释并把它从每只小鼠尾静脉注入。过24小时以后，按照下列的标准评定样品的活性。

（-）：无变化

（+）：稍有出血性坏死

（++）：中度出血性坏死（中心坏死并扩展几乎达植入肿瘤表面的50%）

（+++）：显著地出血性坏死（在植入肿瘤的中心大块地坏死，在沿肿瘤的周边留有小的活性边缘）。

（2）离体分析法（用L-M细胞分析法）

关于人TNF活性分析的离体方法能够提到的有，例如Ruff的方法〔淋巴因子，由E.PicK编，卷2，科学出版社N.Y.（1980）235〕和〔J.Immunol.126（1981）1279〕的方法。

本发明者所用的是通过改进上面提到的方法所发展的方法。本发明者的方法是测定人TNF对L-M细胞（美国标准培养物收集站CCL1.2）的细胞毒活性，操作如下：取人TNF样品（0.1毫升）用培养液进行系列稀释，并将L-M细胞悬浮（0.1毫升），1×10⁵细胞/毫升）液加到有96个孔的微滴定板（Flow Laboratory.Ibc.U.S.A）的每一个孔中。培养基用内含10%（体积比）的胎牛血清（其成分已有叙述，例如，在“组织培养”中，由Junnosuka Naki et al.Asaku ra Shoten，（1967）编）的Eagle最少基本培养基。把微滴定板在含有5%二氧化碳和37℃条件中培养48小时。培养期结束时，加入20%戊二醛水溶液20微升以固定细胞。固定以后、清洗微滴定板并让其干燥，然后取0.1毫升0.05%甲烯兰加入以使活细胞染色。微滴定板经过充分的清洗除去甲烯兰并让其干燥。然后加3%盐酸于每个小孔中从染色细胞中萃取甲烯兰。最后用Titertek Mulhiska（美国，Flow Laboratorg，Ine）在665毫微米测定每一个孔的吸光率。吸光率与活细胞数成比例。使试样的吸光率与未加入TNF样本的对照组的吸光率的50%相等时的人TNF的稀释度可通过图和计算得到。稀释度被定义为1单位/毫升。

（3）蛋白质测定

用Lowry等〔J.Biol.Chem，193，P265（1951）〕的方法测定蛋白质量。

现在本发明将参考下列参照例，工作实例和比较实例作详细的说明。

在本发明的实例中，重组DNA的构建和把重组DNA送进微生物中，除非另有说明，都是按照下列实验报告〔Literatures（1）到（4）所述〕的方法与操作进行

（1）Yasutaka    Takagi，基因工程手册，Kodan-Sha

（2）Yasutaka    Takagi，基因工程实验方法，Kodan-Sha

（3）T、Maniatis，E.F.Fritsch，J.Sambrook，分子克隆化，美国冷泉港实验室

（4）Ray    Wu    et    al.，酶学方法，101卷，美国科学出版社。

另外，下面的实例和比较的实例的回收都是通过下列方程式计算确定的。

通过纯化各步得到的分级中

回收（%）＝ (人TNF的总量（单位）)/(粗提液中人TNF的总量（单位）) ×100

其次，纯化的程度是通过下列公式计算确定的。

通过纯化各步所得到的分级中

纯化程度＝ (人TNF的比活（单位/毫克）)/(培养物抽提液的)

（倍数）

比活（单位/毫克）

用于参照例和实例的缩写

MoPs：吗啡啉丙磺酸

LB介质：Luria-Bertani培养基

Dmso：二甲基亚砜

PFU：噬斑形成单位

EDTA：乙二胺四乙酸

SDS：十二烷基硫（磺）酸钠

BRL：比斯达研究实验室责任有限公司

Lac：乳糖

DMT：二甲氧基三苯甲基

Tris：三（羟甲基）氨基甲烷

XAR-5：X-腺胶片由美国伊斯脱曼柯达公司制造和经销

1×SSC：0.15摩尔/升NaCl+0.015摩尔/升柠檬酸钠，pH7。

2×SSC：0.30摩尔/升NaCl+0.030摩尔/升柠檬酸钠，pH7。

3×SSC：0.45摩尔/升NaCl+0.045摩尔/升柠檬酸钠，pH7。

5×SSC：0.75摩尔/升NaCl+0.075摩尔/升柠檬酸钠，pH7。

6×SSC：0.90摩尔/升NaCl+0.090摩尔/升柠檬酸钠，pH7。

FDSS：50%去离子甲酰胺+5×Denhardt液+5×SSPE+0.1%SDS+100微克/毫升变性小牛胸腺DNA

SSPE：0.15摩尔/升NaCl+10毫摩尔/升NaH₂Po₄+1毫摩尔/升EDTA，pH7.4。

SM：贮存噬菌体的培养基每升含有5.8克NaCl，2克MgSO₄·7H₂O，50毫升1摩尔/升Tris·Cl（pH7.5）和5毫升2%明胶

ME-液

体培养基：含有10克NE胺，5克NaCl和2克MgSO₄·7H₂O的培养基（NE胺是由美国Hum KO Sheffield有限公司Kraft化学部制造和经销的A型酪蛋白水介物

IPTG：异丙基硫代半乳糖苷

X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷

TAE：0.04摩尔/升三氨基甲烷-醋酸盐（pH8.0）-0.002摩尔/升乙二胺四乙酸

5×Denhardts溶液：每升含有多聚蔗糖1000毫克，多聚乙烯吡咯烷1000毫克和牛血清蛋白1000毫克

bp：碱基对

参照实例1

（对L-细胞细胞毒素活性的评定）

在下述参照例2到例3和实例1到2所制备的有生理活性的物质对L-细胞细胞毒活性的评定是按照Ruff等〔参阅淋巴因子，2卷，由E、Pick编，科学出版社，N·Y·P235（1980）〕的方法和在免疫学月刊第126卷1279页（1981）上所叙述的方法通过对L929细胞（美国标准培养物收集站CCLI）测定其毒性影响而达到。在下述参照例2到例3和实例1到2中所制备有生理活性物质的细胞毒活性评定的方法在下面说明。

应用96-孔的微滴定板（由Flow Laboratory公司美国）作为培养的器皿，而L929细胞是培养在含有1%（体积比）胎牛血清和5微克/毫升（最后浓度）放腺菌素D的Eagle最少基本培养基（这个培养基的成分已有记载，例如在“组织培养”由Juno Suka Nakai等，Asakura Shoten编著，日本，（1967）〕。取样本0.1毫升用培养基进行系列稀释后和L929细胞悬液（0.1毫升，1×10⁵细胞）在板上每个孔中混合并把微滴定板在含5%二氧化碳的空气中，37℃培养21小时。在培养末期，加入20微升20%戊二醛水溶液以固定细胞。固定以后，用蒸馏水洗板并任其干燥，加入0.05%甲烯兰（0.1毫升）以对活细胞染色。用蒸馏水充分清洗滴定板以除去过多的染料并使其干燥。在每个孔中加入0.36当量的盐酸以抽提染色细胞中的染料。用Titertek Multiskan（多点测定仪）（美国，Flow Laboratory，Inc）在665毫微米测定每个孔的吸光度。吸光度与活细胞数成比例。有生理活性的物质的细胞毒活性，单位/毫升被定义为导致50%细胞毒性生理活性物质的稀释度倒数，通过图上稀释度对吸光度的作图就能得到。在作参照的实例中应用的“1个单位”是指10⁵细胞/毫升L929细胞被杀死50%所需要的兔TNF量。

在另一方面，蛋白质总量是按照Bradford等〔参阅Anal·Biochem·vol72，PP248-254（1976）〕的传授用康马氏亮兰G250结合蛋白质的方法确定的。

在另一方面，在参照例4、实例3到4和比较例1中，对L-细胞细胞毒素活性的评定是按照上述离体分析方法完成的。

参照例2

步骤1

（从兔血清中制备TNF）

雌兔重2.5到3公斤，通过耳静脉注射以50毫克福尔马林杀死的疮疱丙酸杆菌（小棒杆菌，英国Wellcome研究实验室）。八天后，把100微克内毒素（来自大肠杆菌026：B6的脂多糖，美国Difco实验室生产）再通过耳静脉注射，二小时后，从心脏收集兔的全部血液。在收集的血中，每100毫升加入100单位量的肝素钠。然后把血在冷条件中5000转离心30分钟以除去血细胞和不溶固体物。结果从40只兔中得到有3×10⁴单位/毫升的TNF细胞毒素活性血清的血浆2.4升。

步骤2

（兔血清中TNF的部分纯化）

在步骤1得到的2.4升血浆中加入24克醋酸纤维素。搅拌混合液1小时，然后过滤。用1.2升0.04摩尔/升Tris-HCl缓冲液（pH7.8）与滤液相混合，然后把它上到DEAE-琼脂糖CL-6B（瑞典，发玛西亚优级化学试剂公司制造和经销）柱中，用内含0.1摩尔/升NaCl的0.04摩尔/升Tris-HCl缓冲液（pH7.8）充分平衡。柱再用0.04摩尔/升Tris-HCl缓冲液清洗，吸附的TNF用含有0.18摩尔/升NaCl的0.04摩尔/升Tris-HCl缓冲液（pH7.2）洗脱。用L-细胞显现细胞毒素活性的部分通过超过滤浓缩。如此得到浓缩液再上Sepharyl S-200（瑞典，发玛西亚优质化学试剂公司制造和经销）柱，用5毫摩尔/升磷酸缓冲液充分平衡，并用同样的缓冲液进行凝胶过滤。有活性部分通过超过滤浓缩，借此得到纯的TNF它具有3.5×10⁶单位的活性和18×10⁶单位/毫克的比活。

步骤3

（抗-TNF抗体）

在步骤2中部分纯化的兔血清TNF与完全的弗罗因德氏佐剂（Freund）按1∶1混合;然后在12周令的BALB/C雄性小鼠的背上进行皮下注射。在开始注射后2和4周内重复这一注射。在最后一次注射的第二周，采集全部血清。从采集的血中得到血清。

把如此得到的血清加到评定TNF对L-细胞细胞毒素活性用的培养基中，其加量为使其最后浓度相当于稀释500倍。兔血清TNF对L-细胞的细胞毒素活性的评定是和在参照例1中所叙述的相同情况下进行的。发现兔血清TNF对L-细胞表现无细胞毒素性。从上述的结果就能得出结论，在这步中所得到的小鼠血清含有对兔血清TNF的抗体（此处和以后称作为“抗-TNF抗体）。

参照例3

步骤1

（TNF-产生细胞的制备）

取母兔用福尔马林杀死的疮疱丙酸菌细胞（小棒状杆菌，英Wellcome研究实验室）进行静脉注射。7天以后，将兔杀头处死，用生理盐溶液洗肺，从而得到上浮的细胞。这样得到的细胞用生理盐溶液洗之。用含有10%（体积比）胎牛血清的RPMI1640（美国Flow    Laboratory    Inc）作为培养用的培养基，在含有5%二氧化碳的空气中37℃进行细胞培养。细胞培养物分为二组;一组加入来自大肠杆菌的内毒素（来自026：B6大肠杆菌的脂多糖，由美国Difco实验室所生产）其浓度为10微克/毫升。另一组加入同样量的消毒水。加入内毒素的细胞培养物的上清液，对L-细胞表现细胞毒素活性，在7小时内活性达到最高值。这样的活性可被抗-TNF抗体消除，但不能被正常小鼠血清消除。

另一方面，没有加入内毒素的细胞培养物的上清液对L-细胞不表现细胞毒素性。

步骤2

（TNF的分子量）

在步骤1加入内毒素所制备的细胞培养物中，再加入（1毫居里/毫升）的放射性L-（35S）甲硫氨酸（比强1300居里/毫摩尔，由英国Amersham Industries ple.生产）。按照Laemmli的方法〔参阅Laemmli，U·K·（1970），Natwre（London）Vol.227，PP680-685〕用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对上清液进行分析。凝胶浓度调到12.5%（重量）。电泳以后，凝胶用ENHANCE

（增强剂）（美国新英格兰核公司的产品商标）处理，干燥以后，用X-腺胶片（FuJiRx，日本Fuji光片公司生产和经销）曝光。有内毒素的细胞培养物上清液中，可以看到有分子量约为17500的物质形成。

另外，在步骤1所制备的每个细胞培养物上清液，像上面叙述一样情况都进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。其后，凝胶在2.5%NP40（表面活性剂，美国Calbiochem出售）振动1小时，然后在水中二小时。振动完后，每条泳道彼此切离，再切成2毫米宽并与移动方向垂直的带。每个带与L-细胞一块培养，并评定其对L-细胞的细胞毒素活性。在含有内毒素细胞培养物的上清液所扩展的条上，相当于分子量17500的位置上看到对L-细胞的细胞毒素活性。在另外位置没有看到细胞毒素活性。

步骤3

（mRNA的抽提）

象在步骤1中制备的细胞培养物加入内毒素后再培养2小时，接着就离心收集细胞。从收集的细胞中提取细胞质RNA，然后从细胞质RNA中提取mRNA，方法按照Chirgwin等〔参照Chirgwin，J·M·等，Biochemistry vol.18，P·5294，（1979）〕把4毫升4摩尔/升硫氰胍溶液加到3×10⁸细胞中，通过匀浆器（AM-7型，日本Nihon Seiki Seisakusho，公司制造和经销）把细胞混合液粉碎。用离心除去残留物，并在其中加2.4克氯化铯溶解。把此混合液小心地倒入Polyallomer管中，此管预先已装有2.5毫升5.7摩尔/升氯化铯和0.1摩尔/升EDTA溶液（pH7.5）;然后用贝克曼SW41转头（美国贝克曼公司制造和出售）在20℃，30000转超离心12小时。除去上清液后，把沉淀块在1毫升含5毫摩尔EDTA和1w/v%SDS的10毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液中溶解。所得的溶液用4∶1体积比的氯仿和1-J醇混合液萃取。取水相并在其中加入0.05体积的2摩尔/升醋酸钠和2.5体积的乙醇;让其在-20℃静止2小时或更多一些时间使在其处沉淀RNA。通过离心收集沉淀，使干燥然后在500微升消毒水中溶解，结果得到细胞质的RNA溶液。

把上述得到的RNA溶液在68℃加热2分钟，其后很快便冷却。取500微升2倍浓度的10毫摩尔/升Tris-EDTA缓冲液（pH7.4）内含1毫摩尔EPTA，0.1w/v%SDS和0.5摩尔氯化锂）加到RNA溶液中，然后把混合液上到200毫克寡聚dT-纤维素（美国Bethesda    Reseavch    Laboratory    Inc制造和出售）柱，并用上述同样缓冲液（一倍浓度）10毫升淋洗。在柱上吸附的物质用2毫升含10毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液pH7.4，1毫摩尔/升EDTA和0.1w/v%SDS的洗脱缓冲液洗脱。在洗脱液中加入0.05体积的醋酸钠溶液和2.5体积的乙醇，混合液在-20℃冷却使之沉淀。通过离心收集沉淀并再把它上寡聚dT-纤维素柱，收集在寡聚dT-纤维素上吸附的部分。回收到的85微克的mRNA通过紫外光谱分析确定。

步骤4

（mRNA的大小分级）

用在步骤3中所叙述的同样方法制备得的880微克mRNA溶解在250微升水中，所得的溶液铺在10毫升5-25%直腺蔗糖密度梯度上。蔗糖密度梯度是通过ISCO570梯度仪（美国ISCO公司制造和出售）用分别含有5%蔗糖和25%蔗糖的Tris-HCl缓冲液〔内含有25毫摩尔/升Tris-HCl（pH7.2），2毫摩尔/升EDTA和1%w/vSDS〕制备的。

应用Backman    SW41转头，在4℃40000转超离心12小时，通过分部回收器（美国Backman公司制造和出售）回收每个400微升的级分部分，然后用酒精沉淀。离心收集沉淀部分并把它溶解在消毒水中。

步骤5

（mRNA转译的实验）

按照实验报告（例如，Hivoshi    Teraoka，Mikio    Itsuki和Kentaro    Tanaka，“蛋白质、核酸、酶”，基因工程，增册，1981，p602）所叙述的操作用非洲爪蟾（Hamamatsu生物教育材料）卵母细胞进行mRNA的翻译。非洲爪蟾是从Hamamatsu气物教学材料中采集的。把在步骤4得到的分过级的mRNA溶于消毒水中使其浓度为1微克/1微升;然后把此溶液以每细胞50毫微升的微量注射到卵母细胞。然后把细胞放在含1毫克/毫升牛血清蛋白的Barth′s溶液（内含有7.5毫摩尔/升Tris-HCl（pH7.6），88毫摩尔/升NaCl1毫摩尔/升氯化钾，0.33毫摩尔/升硝酸钙，0.41毫摩尔/升氯化钙，0.82毫摩尔/升硫酸镁，2.4毫摩尔/升重碳酸钠，18单位/毫升青霉素G和18微克/毫升链霉素）培养24小时。通过用玻璃棒在培养液中把卵母细胞压破。然后把培养液离心，取上清液评定其对L-细胞的毒素活性。被翻译后给出有最大活性的多肽的mRNA为16S大小的沉淀物。这个活性可被在参照例2步骤3中所得到的抗-TNP抗体所消除，但不能被正常的小鼠血清所消除。

步骤6

（转化体的制备）

应用在步骤4中得到分级过的mRNA5微克，按照文献（1）96页上所述的操作合成双链DNA。应用的反转录酶是美国生命科学公司的产品。制备成的双链DNA在3.5%聚丙烯酰胺凝胶上进行大小级分，得到约为1000到2000碱基对部分330毫微克。按照文献（1）所述的方法，这个部分的7毫微克可用末端脱氧核苷酸转移酶（美国Bethesda    Reseavch    Laboratories，Inc。制造和出售），使脱氧胞嘧啶核苷酸残基在其端延伸，并同56毫微克已经用Pstl酶解并以脱氧鸟嘌呤核苷酸残基在末端延伸的质粒PB R322退火。如此退火的混合物放入大肠杆菌K-12株（HB101，ATCC33694）中以转化此菌株。结果获得12000个转化体。

步骤7

（兔TNF的部分氨基酸顺序）

在参照例2中部分纯化的兔TNF（活性：5×10⁷单位）如在步骤2在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上纯化。一部分凝胶用考马氏亮兰染色。相当于分子量17000位置的带从凝胶中切下，并用1%重碳酸铵抽提。大约180微克的TNF作为蛋白质被回收。

把回收的TNF150微克溶解于75微升1%重碳酸铵中，接着就加入3微克TpcK蛋白胰酶（美国Worthington生化试剂公司制造和出售）。混合液在37℃保温4小时。然后混合液通过以Losmosil    5C8（日本Nakarai化学公司制造和出售）作为装柱材料的高性能液相层析柱分级，从而得到胰蛋白酶酶解的片段。

高度纯化的TNF和胰蛋白酶酶解的片段然后通过多葡萄糖G-25柱去盐，然后冷冻干燥。根据R·M·Hewick等（参阅J·Biol    Chem·Vol256PP7990-7997，1981）的方法，纯化的TNF和胰蛋白酶降解的片段，每一个都从N端受Edman降解。每一步释放出的苯基硫代乙内酰脲脲氨基酸用Solpacks    ODS（美国E·I·Du    Pont制造和出售）为柱的高性能色谱仪SP    8100型（美国Spectra    Physics公司制造和出售）进行通常方法分析。结果发现，TNF具有下列N端氨基酸顺序：Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln-

一个胰蛋白酶降解的片段具有下列N端氨基酸顺序。

Glu    Thr    Pro    Glu    Glu    Ala    Glu    Pro    Met    Ala

步骤8

（寡聚脱氧核苷酸探针的合成）

mRNA的碱基顺序是从参照例3步骤7得到的兔TNF的氨基酸顺序推引出来的，而互补于mRNA碱基顺序的寡聚脱氧核苷酸是按照本发明者已报告的〔H·Ito    et    al·Nncleic    Acid    Res.10，1755-1769（1982）〕改进的磷酸三脂法合成的。在寡聚脱氧核苷酸的合成中，由兔TNF氨基酸顺序估计来的128个碱基长的寡聚脱氧核苷酸划分成五个片段，即16、16、32、32和32诸片段组，而合成的是各个片段组混合（连合）的寡聚脱氧核苷酸。得到的各个寡聚脱氧核苷酸片段按照一般方法脱保护，并用葡聚糖G-50（瑞典，发玛西亚优级化学试剂公司制造和出售）层析柱纯化，在含7摩尔尿素的重量比20%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳并再用DE52（美国Whatman公司制造和出售）进行柱层析。如是得到的各个寡聚脱氧核苷酸片段再对0.1毫摩尔Tris-EDTA缓冲液透析。

纯化过的各个片段组的每个寡聚脱氧核苷酸用T₄多核苷酸激酶（Bethesda Research Laboratories Inc.制造和出售，美国）和r-32P腺三磷按照常规方法标记;然后用DE52（美国Whatman）公司制造和出售）为柱通过柱层析纯化。参入到各个片段组的每个寡聚脱氧核苷酸的放射性量约为3×10⁸CPm/微克。每个以各个片段混合形式得到的寡聚脱氧核苷酸探针，标志如表1所示。

兔TNF氨基酸部分顺序，由兔TNF氨基酸顺序估计来的mRNA的碱基顺序以及各个片段组合成的寡聚脱氧核苷酸的碱基顺序都在表1中列出。（见表1）

注：X代表核糖核酸A、C、G或U残基

Y代表核糖核酸A或G残基

M代表脱氧核糖核酸T或C残基

N代表脱氧核糖核酸A或G残基

Z代表脱氧核糖核酸A、C、G或T残基。

按照参照例3步骤3得到的细胞所产生TNF的mRNA用含有1摩尔乙二醛，10毫摩尔Na₂PO₄和按体积50%的二甲亚砜的溶液在50℃处理60分钟;然后用在按重量1.1%琼脂糖凝胶电泳进行分级。把分级的mRNA按照制作者的手册转移到电泳型转移印溃器（美国生物放射公司制造和出售）的滤膜上。然后把印溃器滤膜上的mRNA与含有5×SSC溶液和150微克/毫升鲑鱼精子的变性DNA的5×Denhardt′s溶液在65℃处理2小时，然后用内含有1×10⁷cpm/毫升的标记寡聚脱氧核糖核酸和5×SSC溶液的5×Denhardt′s溶液在50℃再处理2小时。经过上述处理得到的滤膜用6×SSC溶液在室温40℃，50℃和60℃连续清洗四次。把XAR-5X-腺胶片（美国Eastman Kodak公司制造和出售）对滤膜上的放射性曝光。结果发现由探针MJ标志的寡聚脱氧核糖核酸与mRNA杂交最强，说明在标志探针MJ的寡聚脱氧核糖核酸中存在着完全与mRNA互补的酯基序列。

步骤9

（兔TNF基因的克隆）

根据文献（1）第162页所述的操作，把在参照例3第6步得到的转化体转移到纤维素滤膜上;然后把此转化体的DNA与在参照例3第8步的选得的标记的寡聚脱氧核糖核酸（探针MJ）与参照例3步骤8（菌落杂交）相同的条件进行分子杂交。在刚才所述的操作中，与标记的寡聚脱氧核糖核酸（探针MJ）选到有强杂交的49个菌落，然后再把它固定在另一张硝酸纤维素滤膜上。以后，利用49个菌落再进行杂交选得9个菌落，它们与标记的寡聚脱氧核酸（探针MJ）杂交更强。

按照文献（1）第6页所述快速分离质粒的方法，从9个菌落中的每一个得到约5微克的质粒（DNA）。得到的每一个质粒用限制性内切酶PstI    TagI，RsaI和PvuII（每一个制造和出售都是美国Bethesda    Reseavch    Laboratories，Inc.）按照作者手册中所述的方法进行酶切;接着就在按重量为1%琼脂糖凝胶上电泳。以后，各个限制性内切酶酶解得到的片段就其长度进行比较。

结果说明，相当于9个菌落的9个菌株都有PvuⅡ和RsaⅠ酶解的和约50个碱基对组成的片段的碱基顺序;9个菌株的大多数含有RsaⅠ酶解得到的和约200碱基对组成的片段的碱基顺序。换句话说，结果说明9个菌株有部分共同的碱基顺序。用限制性内切酶分析的结果在图1中表示。

在下面表2含有标记质粒的7个菌株分别在含有10微克/毫升四环素的2毫升LB培养基中培养，直至培养液的光密度达到下面表2中所列的数值，跟着通过离心得到各菌株的细胞。把每一个得到的菌株细胞加到2毫升生理盐水中并用超声波破碎细胞。这样得到的菌株细胞再加到2毫升生理盐水中并再用超声波破碎。这样得到的溶液进行离心，得到的上清液对L细胞进行细胞毒素活性测定。结果列在下面表2中。关于空白试验，是用含质粒PBR322的菌株以与上述相同的操作进行重复的。其结果也在下面表2中表示。（见表2）

对L-细胞的细胞毒素活性可被抗-TNF抗体消除但不能被正常小鼠血清消除。这就说明所有上述的9个菌落都存在含有编码TNF的寡聚脱氧核酸的质粒。

1×SSC-0.1%SDS    50℃

浸泡30分钟    ×2

10）曝光

XAR-5（Eartman    Kodak    Company，U·S·A·）-80℃，双增感屏，17.5小时

11）洗脱：

0.5M    NaOH-1.5M    NaCl（浸泡：1分钟）

0.5M    Tris-1.5M    NaCl（浸泡：1分钟）

3×SSC    （浸泡：1分钟）

12）曝光

除了曝光时间为19小时外，步骤与上面10）相同

13）第二次预杂交：

与上面7）的步骤相同

14）第二次杂交：

pB2-7插入物（在上面步骤3中制得）

42℃，16.5小时

15）清洗：

同上面9）的步骤

16）曝光

除了曝光时间为19.5小时外，步骤与10）相同

17）洗脱：

与上11）的步骤相同

步骤10

（编码兔TNF的DNA碱基顺序的确定）

把含有质粒PB2-7和PR18的大肠杆菌菌株在按文献（3）第440页所述的含有10微克/毫升四环素的1升Mq培养基中培养。然后，按文献（3）第90页所述的方法分离每个质粒使量有约150微克。

插入到每个质粒上的碱基顺序按照Maram等所述的Maxam-Gilbert化学法（见酶学方法·55，490页，（1980），科学出版社）进行测定。如此测定碱基顺序发现是与参照例3步骤7中所确定的部分氨基酸顺序相符合。这样，可以考虑建立兔TNF全部顺序。

步骤11

在这步中，用重组体PR12构建质粒以得到用lac为启动子在大肠杆菌中进行TNF的直接表达。构建过程已在图2中说明。首先，把10微克质粒PR12用10单位ApaⅠ（美国B·R·L·公司制造和出售）在37℃酶解2小时，然后在按重量4%聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离630碱基对的片段。用电泳洗脱法从凝胶中分离得约1微克的片段。与参照例3步骤8相同的情况，图2中所示的二个寡聚脱氧核糖核酸，即5′-GATCCATGTCAGCTTCTCGGGCC-3′和5-CGAGAAGCTGACATG-3′二 个片段被合成了。然后，每个寡聚脱氧核酸（大约100微微摩尔）5′端用T₄多核苷酸激酶按照文献（3）122页上所述的方法进行磷酸化。反应完成后，用酚然后用氯仿萃取反应混合液。然后把得到的合成的寡聚体与0.5微克ApaⅠ630碱基对片段相混合并用酒精沉淀。按照文献（1）37页上所述的方法，把片段与合成的寡聚体用10单位T₄DNA连接酶在4℃连接过夜。连接反应完成后，反应混合液用酒精沉淀并用20单位BamHI在37℃酶解3小时;接着在按重量4%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，通过电泳洗脱回收670碱基对片段。取1微克市售的质粒Ruc-8（商品号4916，美国P-L生化试剂公司制备与出售）用BamHI酶解，并用酚，然后用氯仿抽提，接着用酒精沉淀以得到运载体。用这样得到的0.5微克运载体与上述得到其二端有BamHI位点和约有670对碱基编码TNF的片段在T₄DNA连接酶作用下进行连接。按照文献（4）第20页所述的方法，用上述的运载体转化大肠杆菌，并在含1毫摩尔IPTG和0.004%（W/v）X-gal的琼脂培养基上培养而得到大约200个白色菌落。从100个这些转化体中制备质粒DNA并用BamHI酶解。结果发现，15个质粒含有预期的BamHI片段（约670碱基对）。为要检查插入的方向，上面15个质粒用在其PuC-8上只有一个识别位点的EcoRI和在其约670碱基对片段部分只有一个识别位点的PvuⅡ双酶解，并在按重量6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。结果确定7个质粒有约140个碱基对组成的指定片段，它在puc-8上lac启动子转录的方向是与编码TNF的寡聚脱氧核糖核酸一致的。

DNA顺序分析表明，这7个质粒有相同的顺序，在Lac启动子、合成的DNA和cDNA间的关节上有期望的核苷酸顺序。

用重组体质粒pR17再构建另一个质粒以得到利用lacUV5作为启动子在大肠杆菌中直接表达TNF。其过程在图3中已说明。首先，取10微克质粒pR17用10单位ApaⅠ（美国BRL公司制备和出售）在37℃酶解2小时，并在按重量4%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离约由630碱基对组成的片段。通过电泳洗脱从凝胶上分离到约1微克的这种片段。与在步骤8中一样，在图3所示的二个寡聚脱氧核酸，即5′AATTCATGTCAGCTTCTCGGGCC-3′和5′-CGAGAAGCTGACATG-3′是被合成了。以后，这二个寡聚脱氧核酸（约100微微摩尔）用T₄多核苷酸激酶按照文献（3）第122页上所述方法进行磷酸化。磷酸化反应完成后，反应混合液就用酚以后用氯仿萃取。然后把合成的寡聚体与0.5微克前从质粒pR17制备的ApaⅠ片段（约630碱基对）混合并酒精沉淀。按照文献（1）37页所述的方法，把片段与合成的寡聚体用10单位T₄连接酶在4℃连接过夜。连接反应完后，反应混合物用酒精沉淀并用20单位EcoRI在37℃酶解3小时，接着在按重量4%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，通过电泳洗脱回收片段（约670碱基对）。

按照F、Fuller在“Gene”19PP42-54（1982），所述的方法，制备了质粒PoP95-15。

取1微克Pop95-15用EcoRI酶解，并用酚然后用氯仿萃取，接着用酒精沉淀以得到运载体。用T₄DNA连接酶把得到的0.5微克运载体与由合成的寡聚体与编码TNF的寡聚脱氧核酸连接的片段（约670碱基对）相连接。按照文献（4）第20页所述的方法，用上面得到运载体转化大肠杆菌JM101（ATCC33876），并在含1毫摩尔/升IPTG和0.004%（w/v）X-gal的培养基上培养，得到约150个白色菌落。从100个这些菌落中制备质粒DNA并用EcoRI酶解。结果发现有12个质粒含有指定的EcoRI片段（约670碱基对）。为要检查插入片段的方向，把上面12个质粒用PvuⅡ和PstⅠ酶解，并在按重量1.5%琼脂糖凝胶上电泳。结果确定了4个质粒具有所期望的片段（约1280碱基对和约2600碱基对），其LacUV5启动子上转录的方向与编码TNF寡聚脱氧核糖核酸相一致。

碱基顺序分析表明，这四个质粒有相同的顺序，其上LacUV5启动子，合成的寡聚脱氧核酸和cDNA彼此连接是合适的。得到的这些质粒被标名为PTNF-lacUV5-1。

步骤12

（大肠杆菌产生的TNF的纯化）

在步骤11中得到的含有质粒的大肠杆菌菌株，在50毫升含有氨苄青霉素的LB培养基中在37℃培养过夜。然后把菌株转接到含100微克/毫升氨苄青霉素的5升LB培养基中在37℃再培养3小时。把异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷（美国Sigma化学公司制备和出售），加入之使其最后浓度为1毫摩尔/升。进一步培养6小时，接着冷却。然后通过离心收集菌株细胞。如在步骤11中所述一样，把菌株加入到5升0.04摩尔/升Tris-HCl缓冲液（pH7.8）中并用超声破碎以 得到菌株蛋白溶液。得到的溶液对L-细胞的细胞毒性有5×10⁷单位/升。

得到的溶液如参照例2步骤2一样进行纯化得到1.2×10⁶单位的TNF。TNF的比活为6.8×10⁷单位/毫升。

步骤13

（用小鼠中植入MethA肉瘤法评定）

把2×10⁵MethA肉瘤细胞在BALB/C小鼠腹区表皮内植入，7天以后，选择带有7到8毫米直径的肿瘤以及其中心无自发坏死的小鼠作评定用。把在参照例3步骤12中所得到的TNF样本（0.2毫升）用生理盐水稀释并从尾静脉注入。样本的活性是：24小时后按照下列标准进行评定。

（-）：无变化

（+）：轻度出血坏死

（++）：中度出血坏死（中心坏死并扩展到几乎达肿瘤表面50%）。

（+++）：重度出血坏死（大块地坏死，在沿肿瘤的周边留有小的活性边缘）

注射样品20天后，观察肿瘤的退化并按下式确定恢复率。

恢复率＝ (肿瘤完全治愈的小鼠数)/(用于测定的小鼠数)

结果列在表3中。（见表3）

实例1

步骤1（用PR18、PB2-7和PB2-2质粒转化大肠杆菌K12菌株Mc1061）

大肠杆菌K-12株MC1061的菌落是用质粒PR18、PB2-7和PB2-2中的每一个转化形成的，他们是按照通常的方法，在参照例3中得到的。特别的是，大肠杆菌K-12株MC1061的菌落是培养在LB培养基中直到其培养液光密度在550毫微米变为0.3。收集50毫升生长的大肠杆菌培养物，用25毫升含有10毫摩尔/升MOPS（pH7.0）和10毫摩尔/升RbCl的混合液清洗，并在含有0.1摩尔/升MOPS（pH6.5）、50毫摩尔/升CaCl₂和10毫摩尔/升RbCl的25毫升混合液中悬浮。所得的悬浮液在冰上冷却30分钟，离心并再悬浮在2毫升含有0.1摩尔/升MOPS（pH6.5），50毫摩尔/升CaCl₂，10毫摩尔/升RbCl和30微升DMSO的上述混合液中。在所得悬浮液的200微升各试样中，分别加入10微升每个质粒的DNA液。把一批做好的混合液放于冰上冷却30分钟，接着就在44℃热休克60秒。其后立即把5毫升在37℃预温的LB培养基加到每个热休克过的混合液中，接着就在37℃培养1小时。得到的培养液每一个都离心使之形成细胞块。弃去上清液，加入LB培养液并振动使每个细胞块悬浮。把每个所得的悬浮液在含有30微克/毫升四环素的平板上涂接，接着就在37℃培养过夜。结果转化成抗四环素的转化体，得到了带有PR18、PB2-7和PB2-2质粒每个转化体。

步骤2（PB2-7和PR18质粒DNA的制备）

把用质粒PB2-7和PR18分别转化的，在步骤1中所得到的每个转化体，按照“分子克隆化”（由美国T·Maniatis·E·P·Fritsch和J·Sambrook编，冷泉港实验室出版）在88-96页中所述的方法，进行（1）培养转化体和质粒的扩增（2）收集和溶解转化体（3）纯化质粒DNA。今作例证性的说明。把每个转化体接种到含30微克/毫升四环素的LB培养液中并在37℃剧烈振摇培养。重复这一步骤使转化体获得生长，质粒得到扩增。通过4000克4℃10分钟离心收集转化体培养物。弃去上清液。所得的菌块在100毫升冰-冷STE（0.1摩尔/升NaCl，10毫摩尔/升Tris·Cl（pH7.8）和1毫摩尔/升EDTA）清洗，并用在20毫克/毫升溶菌酶-10毫摩尔/升Tris·Cl，pH8.0溶液中煮沸使之溶解。把粘滞产物转移到超离心管中在25000转，4℃离心30分钟以得到DNA溶液。测定DNA溶液的体积。每一毫升准确加1克固体氯化铯并轻轻混合直至盐溶解为止。每10毫升氯化铯溶液加入0.8毫升溴化乙锭（10毫克/毫升水中）最后溶液的密度为1.55克/毫升，溴化乙锭的浓度接近600微克/毫升。把氯化铯溶液转移到用于离心的合适离心管中，管的空余部分用轻的石蜡油充填。离心在20℃，45000转进行36小时以得到DNA区带，由此靠上面的区带是由腺状的细菌DNA和有缺口的环状质粒DNA组成;由此稍下的带是由闭环质粒DNA组成。下面的带（闭环质粒DNA）的收集通过插入离心管边的皮下注射针头进入玻璃管中。除去溴化乙锭，其水相对TAE进行透析。质粒DNA溶液用核糖核酸处理，并用等体积的饱和酚抽提。把水相层置在TAE（pH8.0）和0.1%SDS中平衡的Bio-gelA-150柱上。淋洗柱上的DNA，带有0.1%SDS的TE容器用于收集各分级部分。用酒精沉淀分级部分以得到纯的质粒DNA。

通过上述的操作，得到了250微克纯的PB2-7质粒DNA和134微克纯的PR18质粒DNA。

步骤3

（纯的PB2-7和PR18质粒DNA的缺口转移）

从在步骤2中得到的纯的PB2-7质粒DNA中取40微克，用pstⅠ酶解并在4%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳以后，使DNA染色并切出所期望的带以分离pstⅠ插入片段。

取500毫微克分离到的pstⅠ插入片段，在与Maniatis，T·等〔在proc·Natl·Acad·Sci·U·S·A    72，1184（1975）〕所述条件下进行缺口转移。应用美国BRL公司为缺口转移制备和出售的缺口转移盒;在25微升反应系统中应用80微微摩尔的放射性dCTP（400居里/毫摩尔）。混合液成分为：

2.5微升溶液A（dNTP的溶液）

2.5微升溶液B（500毫微克测试DNA样本即pstⅠ插入片段）

5微升热dCTP（3200居里/毫摩尔）

1.3微升冷dCTP（65微微摩尔/升、50微微摩尔/微克dCTP）

11.2微升溶液E（H₂O）

22.5微升（总体积）

在混合液中加入2.5微升溶液C（脱氧核糖核酸酶Ⅰ，DNA多聚酶Ⅰ），反应在15℃进行60分钟。然后把溶液D（终止缓冲液）加入所得的混合液中以终止反应。以后，加入载体tRNA，并用酒精沉淀二次，再溶于500微升水中。每微克DNA的比活性为9.3×10⁷cpm。

在步骤2中得到的纯的PR18质粒DNA，也按上述的方法进行缺口转移。每微克DNA的比活性是7×10⁷cpm。

步骤4

（PR18质粒DNA的RsaⅠ插入片段的制备）

PR18质粒DNA80微克用RsaⅠ限制性内切酶酶解，并在4%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。切出下列期望的插入物电泳带并通过BND柱纯化：

约640碱基对    3.77微克（回收率52%）

约175碱基对    1.77微克（回收率50%）

上面约640碱基对插入物标记为PR18的3′-片段（意指PR18的3′-未转译区），上述约175碱基对插入物标记为PR18-cfr（意指PR18编码区）。

另外，用PstⅠ和MstⅡ限制性内切酶代替RsaⅠ限制性内切酶重复上面操作得到下列电泳带：

约450碱基对    3.65微克（回收率60%）

上面的插入物标记作PR18的5′-片段。

步骤5

（人染色体TNF基因的分离）

在实例1步骤3得到的³²P标记的PB2-7质粒的插入物用作杂交探针去筛选10⁶Chwron4A噬菌体的噬斑/人染色体基因库，该基因库是通过人DNA部分酶解并进行大小分级过的〔参阅Maniatis et al，“cell”15，687（1781）〕片段插入到Charon4EcoRI连接位点〔参阅Blattner et al，“Science”196，161（1977）〕上构建而成的。应用Benton和Davis〔参阅Benton and Davis，“Science”196，180，（1977）〕噬斑杂交的方法。因为起始培养物中不是所有噬菌体都含有制备人TNF需要的遗传物质，所以应用有与兔TNF基因互补的碱基顺序的探针。含有期望遗传物质的噬斑噬菌体的DNA与放射性的探针结合，通过他们的放射性就可鉴定。从基因库中分离到9个杂交噬斑。

应用的操作与条件如下：

1）噬斑数：

～1×10⁶噬斑（～4×10⁴噬斑/直径150毫米平皿25个）

2）转移到硝酸纤维滤带：

〔参阅Benton和Davis，science，196，186，（1977）〕

3）杂交：

加入PB2-7插入物1.25×10⁵cpm/毫升

实例1步骤3中制备的探针，42℃，19.5小时

4）清洗：

2倍SSC-0.1%SDS在室温

浸没10分钟，4次

↓

1倍SSC-0.1%SDS在50℃

浸没30分钟，2次

5）曝光

XAR-5（伊斯塔曼柯达公司，美国）

-80℃，双增感屏，39小时

在上面的筛选中，得到12个候补株系。如上述同样，进行第二次筛选，得到9株含有指定片段。利用这些株系，还如上述同样进行第三次筛选，得到含有指定的片段还是9株。利用这些得到的株系进行第四次筛选以确定这9个株系确含有指定的片段。含有指定片段这9个噬菌体分别标记为HG-1～HG-9。

步骤6

（兔染色体TNF基因的分离）

除了10⁶Charon4A噬菌体噬斑/兔染色体基因库是酶解兔DNA〔参阅Maniatis et al，Cell，15，687，（1978）〕以代替酶解人DNA而构建的以外，实质上是实例1步骤5所述相同操作的重复。用6.7×10⁵Charon 4A噬菌体噬斑/兔染色体基因库代替10⁶Charon4噬菌体的噬斑/人染色体基因库。如是得到了2个噬菌体株（RG-1和RG-2）它含有兔染色体TNF基因。

步骤7

（人克隆的Southern浸渍分析）

应用在实例1步骤5中得到的HG-3、HG-6、和HG-7噬菌体，按照下述的操作得到每一种噬菌体的DNA。

把6×10¹⁰大肠杆菌LE392细胞（寄主细胞）悬浮在18毫升SM中，加入噬菌体HG-3、3×10⁹PFU，这样使大肠杆菌在37℃被感染20分钟。然后把得到的混合液加到3升NZ-培养液中，使在37℃振动培养23小时。把60毫升氯仿加到上述混合液中再使振动培养液30分钟。又把NaCl加到此混合液中使其最后浓度为1摩尔/升，然后让混合液静止15分钟，接着离心得到上清液。然后把聚乙二醇（分子量，约6000）加到混合液中使聚乙二醇浓度成为10%（W/V）并让其在4℃静止22小时。通过离心收集噬菌体。得到的噬菌体在28毫升SM中悬浮并加入等体积的氯仿。通过振动仪搅动30秒以后，把混合液进行离心得到水相。把SM加到水相使总体积成为30毫升。取26.4克氯仿铯加到得到的混合液中轻轻地使之溶解，接着就超离心（45，000转，20小时），得到噬菌体带。把得到含有噬菌体的混合液对10毫摩尔/升NaCl-50毫摩尔/升Tris（pH8.0）-10毫摩尔/升MgCl₂透析。然后加入EDTA，蛋白酶K和SDS到混合液中，使他们的浓度分别为20毫摩尔/升，50微克/毫升和0.5%（W/V）。然后把混合液在65℃处理1小时，接着用酚抽提，用酚与氯仿混合液（按体积1∶1）抽提，然后用氯仿抽提。得到的水相对10毫摩尔/升Tris（pH8）-1毫摩尔/升EDTA透析。得到的水相之紫外吸收值的测定表明纯的噬菌体DNAHG-3已被得到。

得到HG-6和HG-7噬菌体DNA实质上是就HG-3噬菌体制备所述的同样操作的重复。

这样，得到2920微克HG-3，1100微克HG-6，和819微克HG-7。

按照Southern的方法〔参阅E·M·Southern，J·Mol·Biol·，98，503（1975）〕，完成了得到的DNA的Southerm印渍分析。操作和条件如下。

1）DNA：

HG-3    825毫微克    每个处理

HG-6    935毫微克    每个处理

HG-7    685毫微克    每个处理

2）用各种限制性内切酶酶解

10单位BamHI，10单位EcoRI

10单位BamHI，+10单位EcoRI

10单位HindⅢ

10单位HindⅢ+10单位EcoRI

10单位PvaⅡ

37℃，3小时

3）电泳：

0.8%琼脂糖凝胶

TAE

28伏，15.5小时

4）转移到硝酸纤维滤膜上：

〔参阅E·M·Southern，J·Mol·Biol·98，503，（1975）〕

5）予杂交

30毫升FDSS

42℃    6小时

6）杂交

PR18的5′-片段（1×10⁵cpm/毫升）

（在实例1步骤4中制备）

7）清洗

2倍SSC-0.1%SDS在室温

浸没10分钟，4次

↓

1倍SSC-0.1%SDS在50℃

浸没30分钟，2次

8）曝光

XAR-5（E·柯达公司，美国）

-80℃，双增感屏，14小时

杂交的结果列在表4中。

步骤8

（兔克隆的Southern印渍分析）

除了噬菌体RG-1和RG-2的一个去代替噬菌体HG-3，HG-6和HG-7的一个以外，实质上是实例1步骤7中相同方法的重复。这样，完成了Southern印渍分析。结果发现，PR18    5′片段与通过用BamHI，EcoRⅠ，BglⅡ，HindⅢ，和BamHⅠ+EcoRⅠ中每个酶酶解RG-1和RG2所得到片段的单个条带 片段相杂交。

步骤9

（含有人染色体TNF基因之细菌克隆的构建）

应用Landy等〔Biochemistry，Vol13，134（1974）〕方法，如在上述步骤5得到那样，取得HG-3DNA。把33微克得到HG-3DNA用80单位EcoRI在37℃酶解3小时。酶解物在1%低熔点琼脂糖凝胶上电泳（条件：1×TAE，20伏，14.5小时）按T·Maniatis所述方法〔“分子克隆”，冷泉港实验室，P377，（1982）〕从琼脂糖凝胶分离2.9千碱基对的电泳带。具体地说，2.9千碱基带部分切出的凝胶在65℃加热15分钟。有2.9Kb长度的EcoRI酶切HG-3片段（此处及后面常标记作“HG-3/EcoRI2.9Kb片段”）从熔解的凝胶中回收并又用酚抽提3次，然后又用其他抽提液3次，接着就用含醋酸铵的酒精沉淀。这样得到637毫微克（产量：约30%）HG-3/EcoRI2.9Kb片段。

把上述得到的片段255毫微克，与56.5毫微克EcoRI酶切的PUC13〔J·Messing，酶学方法，Vol.101，20（1983）〕用2.5单位T₄连接酶在4℃连接，反应20小时。

用上述得到的连接产物转化大肠杆菌K-12菌株JM83。具体地说，把大肠杆菌K-12菌株JM83在LB培养基中培养直到培养液的光密度在550nm为0.3。收集50毫升中生长的大肠杆菌K12株JM83培养物，用25毫升10毫摩尔/升MOPS（PH7.0）-10毫摩尔/升RbCl洗之;并悬浮在25毫升0.1摩尔/升MOPS（PH6.5）-50毫摩尔/升CaCl₂-10毫摩尔/升RbCl中悬浮。把悬浮液在冰上冷却30分钟，离心并再悬浮于2毫升0.1摩尔/升MOPS（pH6.5）-50毫摩尔/升CaCl₂-10毫摩尔/升RbCl和30微升DMSO的混合液中。在203微升悬浮液中加入10微升含有10毫微克连接产物的连接产物水溶液。混合液在冰上冷却30分钟，然后在40℃加热60秒。其后立即把5毫升在39℃予热的LB培养液加到热过的混合液中，接着就在37℃培养1小时，所得的培养液进行离心除去上清液。把LB培养基加到得到的细胞块中，然后在含有30微克/毫升氨苄青霉素和40微克/毫升X-galLB平皿中接种。含有插入物质粒的菌落转化的大肠杆菌K12菌株JM83是白色，而那些只被质粒转化的大肠杆菌K12菌株JM83则是兰色的。为了进一步确定，把得到的白色菌落再在含有30微克/毫升氨苄青霉素和40微克/毫升X-gal的LB平皿上接种一次。

从上述得到的白色菌落中，选出十个菌落，再应用微量制备技术进行筛选。

具体的说，每个菌落在含有30微克/毫升的LB培养基中培养过夜。收集生长的细胞并悬浮在含有2毫克/毫升溶菌酶-50毫摩尔/升葡萄糖-10毫摩尔/升EDTA-25毫摩尔/升Tris·HCl（pH8.0）的溶液中悬浮。让悬浮液在室温静置5分钟，接着加入200微升0.2当量/升NaOH-1%SDS。慢慢搅动以后，让悬浮液在室温静止2分钟。此后加入150微升3摩尔醋酸钠，并让其在-20℃静置10分钟，接着离心15分钟，回收所得上清液。在上清液中加入900微升冷酒精，接着离心5分钟得到所要的沉淀。用70%酒精清洗所要的沉淀，使干燥得到质粒DNA。

每个质粒DNA溶解在10毫摩尔/升Tris-0.1毫摩尔/升EDTA（pH8.0）中，用EcoRI酶解，并进行内切酶分析而电泳。酶切和电泳的条件如下：

酶解：质粒DNA溶液，上述制备量的1/15，EcoRI，3单位，37℃1.5小时。

电泳：1%琼脂糖凝胶;1×TAE，120伏2小时。

上述限制性内切酶分析表明，10个菌落中8个阳性。那就是说8个克隆有2.9Kb片段。从8个阳性克隆中选得1个并标记为E·coliK12菌株JM83（PHGE）（ATCC    39656）。

除了用大肠杆菌K-12菌株JM83（PHGE）去代替PB2-7和PR18寄居的大肠杆菌外，制备1.89毫克PHGEDNA实质上是上述步骤2中相同操作的重复。

步骤10

（EcoRⅠ-酶切RG-1的亚克隆）

上面步骤6制得的30微克RG-1用EcoRⅠ酶解。得到片段混合液（片段长度为3.5Kb），其回收基本上按照上面步骤9的方法，除了用上面制备的片段混合液和0.8%低融点的琼脂糖凝胶外。获得1.0微克EcoRⅠ-酶切的RG-1片段（约3.5Kb）。把得到的EcoRⅠ-酶切RG-1片段（3.5Kb）连接到经EcoRⅠ-酶解的Puc13上，其连接步骤基本上按照上面步骤9，除了用得到的EcoRⅠ-酶切片段（3.5Kb）代替EcoRⅠ-酶切的HG-3片段（2.9Kb）外。

E·coliK12菌株JM83的转化，细菌克隆的筛选克隆的酶介和电泳，除了应用上面得到的连接的产物外，基本上按照上面步骤9的方法进行。得到的克隆标记为E·coliK12菌系JM83（PRGE）（ATCC39655）。

除了用E·coliK12菌系JM83（PRGE）代替PB2-7和 PR-18外，基本上重复上面步骤2的方法制备1.70毫克的pRGE    DNA。

步骤11

（PHGE质粒DNA的限制性内切酶分析）

上面步骤9中得到的PHGE    DNA的限制性内切酶分析按照Maniatis〔分子克隆化，Cold    Sprimg    Harbor    Laboratory，98（1982）〕。所述的方法进行。

步骤和采用的条件如下：

1）用EcoRI酶解pHGE    DNA：

18.6微克pHGE    DNA

64单位EcoRI酶

37℃，2小时

2）乙醇沉淀：沉淀

3）沉淀中增入蒸馏水：

制得1微克/微升EcoRI-酶切pHGE溶液

4）用各种限制性内切酶酶解：

1微克pHGE/EcoRI

限制性内切酶：5单位PvuⅡ，5单位PvuⅡ

+10单位RsaⅠ，10单位RsaⅠ，4单位MstⅡ

3单位AvaⅠ，9单位PstⅠ

37℃，2小时

5）电泳：

2%琼脂糖凝胶，1×TAE

28伏，14.5小时

6）转移到硝化纤维素滤纸上：

〔参阅E·M·Southern，J·Mol·Biol·98，503（1975）〕

7）第一次预杂交：

30毫升FDSS

42℃，6小时

8）第一次杂交：

PR18 5′端片端（5×10⁴cpm/毫升）

（在上面步骤4中制得）

9）清洗：

2×SSC-0.1%SDS室温

浸泡10分钟    ×4

↓

1×SSC-0.1%SDS    50℃

浸泡30分钟    ×2

10）曝光

XAR-5（Eartman    Kodak    Company，U·S·A·）

-80℃，双增感屏，17.5小时

11）洗脱：

0.5M    NaOH-1.5M    NaCl（浸泡：1分钟）

0.5M    Tris-1.5M    NaCl（浸泡：1分钟）

↓

3×SSC    （浸泡：1分钟）

12）曝光

除了曝光时间为19小时外，步骤与上面10）相同

13）第二次预杂交：

与上面7）的步骤相同

14）第二次杂交：

PB2-7插入物（在上面步骤3中制得）

42℃，16.5小时

15）清洗：

同上面9）的步骤

16）曝光

除了曝光时间为19.5小时外，步骤与10）相同

17）洗脱：

与上11）的步骤相同

18）曝光

除了曝光时间为20小时外，步骤与10）相同

19）第三次预杂交：

与上7）的步骤相同

20）第三次杂交：

PR18片段的3′端（4.5×10⁵cpm/毫升）

（在上面步骤4中制得）

42℃，15小时

21）清洗：

同上9）的步骤

22）曝光

同上10）的步骤

限制性内切酶分析的结果见图4。

步骤12

（pRGE质粒DNA的限制性内切酶分析）

步骤10制得的pRGE质粒DNA用于限制性内切酶分析，除了用pRGE质粒DNA代替pHGE质粒DNA外，基本上与上面步骤11相同的方法进行。得到的pRGE    DNA插入物的限制性内切酶图谱如图5所示。

步骤13

（兔TNF基因和人TNF基因的碱基序列测定）

除了用步骤9获得的E·coliK12菌系JM83（pHGE）和步骤10获得的E·coliK12菌系JM83（pRGE）代替含有PB2-7的E·coliK12菌系Mc1061和含有PR18的E·coliK12菌系Mc1061外，基本上重复上面的步骤2。这样，分别获得150微克pRGE质粒DNA 和pHGE质粒DNA。

pRGE和pHGE碱基序列的测定按照Maxam-Gilbert方法进行〔Maxam    et    al，酶学方法55卷，490页（1980）科学出版社发行〕。

参考实例3测定的pR-18碱基序列与上面测定的pRGE碱基序列相比较建立了包括外显子和内含子的兔TNF基因的结构。

pRGE    DNA插入物的结构如图5所示。继而，对pRGE的碱基序列与pHGE碱基序列进行比较以研究其同源性和在内含子和外显子间周围的相同序列。这样，包括外显子和内含子的人TNF基因的结构就建立起来。人TNF基因的结构如图4所示。

上面得到的编码兔TNF和人TNF的碱基序列如下所示。在碱基序列中，上行表示编码兔TNF的碱基序列（R），下行表示编码人的TNF的碱基序列（H）。（见表C）

步骤14

（寡聚脱氧核苷酸的合成）

在500微升的不锈钢反应管（两端带有不锈钢滤器）中加入20毫克通过琥珀酰基与核苷（2.0微摩尔）连接的聚苯乙烯树脂。树脂用二氯甲烷和异丙醇（85∶15）中的溴化锌（1摩尔）处理，以除去二甲氧三苯甲基（DMT）保护基，然后用二甲基甲酰胺，吡啶和乙腈清洗，并用氮气流干燥。干燥的树脂中加入溶于200微升吡啶中的DMT-核苷酸（20微摩尔）和1，3，5-三甲基苯磺基硝基三唑（60微摩尔）。在45℃进行偶联反应20分钟。为连续连接核苷酸，脱保护和偶联反应的循环重复进行直至树脂上所需的寡聚脱氧核苷酸已连接成。然后处理树脂使寡聚脱氧核苷酸脱落，按照Ito，Ike，Ikuta，和Itakura（核酸研究，10卷·1755页（1982）描述的方法纯化寡聚脱氧核苷酸。

如此，得到如下的寡聚脱氧核苷酸：（见表D）

步骤15

（含有人TNF微基因的M12mp9-HGE的构建）

把质粒pHGE（10微克）用EcoRI（20单位）酶解。在1%低熔点琼脂糖凝胶上电泳以后，洗脱得到2.9Kb片段。然后把此片段插入M13mp9噬菌体复制型的EcoRI片段上。选择M13mp9噬菌体是因为它特别适合于接受DNA片段。把有2.9Kb片段的M13mp9产物转染E·coliJM103〔BRI公司，美国Usermanual/M13mp7    Clouing/Dideoxy′Segnen    cnig（应用者手册/M13mp7克隆化/双脱氧顺序测定，1980〕。产物标记为M13mp-9-HGE。

步骤16

（利用M13mp9-HGE单链DNA和缺失体E3-4删除内含子3）

M13mp9-HGE单链DNA按照BRL    User    Manual/M13mp7    Cloniug/Dideoxy    sequencing，1980的方法制得。步骤14制得的寡聚脱氧核苷酸4）3′-ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5′用作内含子3的缺失体。内含子3的缺失体标记为“E3-4”。

缺失体E3-4具有一个碱基序列，它与待被删去内含子3前（外显子3）后（外显子4）碱基的一些碱基序列互补。按照Wallace    et    al，Science209卷1396页（1980）的学说内含子3的删去按照下列步骤进行。

应用T₄激酶和ATP（3毫摩尔/升）使E3-4（164毫微克，15微微摩尔）磷酸化，并加到M13mp9-HGE模板（1.65毫克0.5微微摩尔）上。反应混合液在65℃加温，冷却到室温放5分钟，最后在冰水中冷却。相继加入dATP，dcTP，dGTP，dTTP和ATP（0.4毫摩尔/升）Klenow酶（5单位）在H的缓冲液中的T₄连接酶（10单位〔Wallace et al，核酸研究，9卷、3647页（1981）〕（10毫摩尔/升Tris HCl（pH7.2），2毫摩尔/升MgCl₂和1毫摩尔/升β-硫基乙醇）中。反应混合液（最后体积50微升）在4℃保持30分钟，然后，室温培养30分钟。按照BRL User Manual/M13mp7 Cloning/′Dideoxy′sequencing 1980年的步骤，从有引物的寡聚核苷酸反应得到的DNA用来转染E·coliJM103。这种方法得到的噬菌斑挑到YT平板上〔J·H·Miller，433页分子遗传学实验Cold Sprig Harbor Laboratory（1972）〕。得到的菌落在55℃下与³²P标记的E3-4杂交2小时。在这一步缺失体作为一种探针来鉴定在内含子已被删去后具有相当于互补碱基序列的DNA序列。从那些与缺失体杂交后的菌落中分离得到噬菌体。

得到的噬菌体倒平板，挑噬菌斑到YT平板上。克隆在55℃与³²P标记的E3-4杂交2小时。获得阳性克隆，测定噬菌体DNA的序列，选择那些完全缺失内含子3的噬菌体。这样的一个噬菌体标记为mp9-HGE△3-1。

步骤17

（构建pHTNF-lacUV5-2）

mp9-HGE△3-1的复制型用EcoRI酶解。分离EcoRI片段并克隆到EcoRI-酶切pBR327，得到质粒pHGE△3-1。

利用质粒pHGE△3-1进一步构建质粒以便获得能用lacUV5作为启动子在E·Coli中直接表达TNF的质粒△3-1。步骤如图7所示。首先，10微克质粒PHGE△3-1用10单位的AvaⅠ和EcoRⅠ（由Bethesda Research Laborator-ies，Inc·，U·S·A·生产和销售）在37℃酶解2小时，在4%（重量）聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离片段。大约1微克片段从凝胶中通过电泳洗脱得到。用步骤14相同的方法，合成图7所示的5′-AATTCATGTCATCTTCTCGAACC-3′和5′-TCGGGGTTCGAGAAGATGACATG-3′两个寡聚脱氧核苷酸。然后，两个寡聚脱氧核苷酸（约100微微（10^-9）摩尔）的每个5′端用T₄多核苷酸激酶按照文献（3），122页描述的方法磷酸化。反应完成后，反应混合液用酚然后氯仿抽提。如此获得的合成寡聚物同0.5微克先前从质粒pHGE△3-1和乙醇沉淀获得的AvaⅠ-EcoRⅠ片段混合。这些片段在4℃下用10单位连接酶连接反应过夜，步骤按文献（1）37页描述的进行。反应完成后，混合液用乙醇沉淀，接着在4%（重量）聚丙烯酰胺凝胶上电泳，借助电泳洗脱回收片段。

按照F·Fuller《基因》19卷42-54页（1982）描述的步骤制备质粒pOP95-15。

1微克POP95-15用EcoRⅠ酶解，用酚，氯仿依次抽提，接着用乙醇沉淀，获得载体。0.5微克得到的载体经T₄DNA连接酶作用与上面得到的片段相连接。按照文献（4）第20页描述的过程，用上面得到的载体转化E·coliJM101（ATCC33876）并培养在含有1毫摩尔/升IPTG和0.004%（重量/体积）X-gal的琼脂培养基上，获得大约100个白色菌落。

从这些转化体中制备质粒DNA，并用EcoRⅠ酶解鉴定那些含有指定的EcoRⅠ片段的质粒。为了检查插入方向，那些质粒用PvuⅡ和PstⅠ降解，在1.5%（重量）琼脂凝胶上电泳，选择产生表明1acUV5启动子转录方向与编码TNF寡聚脱氧核苷酸转录方向一致的约1280碱基对和2600碱基对片段的质粒。

碱基序列的测定表明这两个质粒有相同的序列，1acUV5启动子，合成的寡聚脱氧核苷酸和DNA彼此联合是合适的。得到的质粒命名为PHTNF-1acUV5-2。

含有pHTNF-lacUV5-2的E·coli培养在普通培养基上。产物的TNF活力生物测定表明在lac启动子的调控下用含有兔TNF基因的质粒PTNF-lacUV5-1能获得相同的活力。

实例2：

应用按照实例1的步骤1到14描述的方法获得质粒PHGE和寡脱氧核苷酸1）至4），按照图6所示的步骤制备PHTNF-lacUV5-1。

这将可理解，即：作为本发明一部分的新型微生物和细胞培养物因为能产生人类TNF因而是重要的和新颖的。除按照上面讨论转化的微生物和制备的细胞培养物外，本发明还包括在产生TNF中表现重要活力的突变和异变体。

微生物和新质粒保藏在美国菌种保藏中心（ATCC）在Rockville，Maryland，U·S·A·在1984年4月6日保藏了含有质粒的微生物标本。微生物E·coliK-12菌系JM83（pRGE）的ATCC系列号为39655。微生物E·coliK-12菌系JM83（pHGE）的ATCC系列号为39656。

参考实例4

步骤1

（抗原的纯化）

实例2制备的含有质粒pHTNF-lacUV5-1的E·coli用普通方法培养。为了产生所需的人类TNF，在生成的培养物中加入1毫摩尔/升IPTG产生诱导作用，培养物进一步培养，获得含有人类TNF    E·coli的细胞。细胞经离心收集，接着在1升0.04M/升Tris-HCl缓冲液（pH7.8）中超声波破碎，获得含有所说的人TNF细胞提取液。

细胞抽提液具有4.5×10⁵单位/毫升，比活力为3.0×10⁴单位/毫升。

细胞提取液加在事先用0.04M（摩尔）Tris-HCl缓冲液（pH8.0）充分平衡的DEAE-Sepharose CL-6B（由Pharmacia Fine Chemicah AB，Sweden生产和销售）柱上，用0.04摩尔/升Tris-HCl缓冲液（PH8.0）洗，然后用含有0.1摩尔/升NaCl的0.04摩尔/升Tris-HCl缓冲液（pH8.0）作为洗脱液进行洗脱。具有抗L细胞的细胞毒素活力部分经离心浓缩到比活力为4.0×10⁵单位/毫克的粗溶液。

粗溶液加在事先用含有0.15摩尔/升NaCl的5毫摩尔/升磷酸缓冲液（pH7.4）平衡的Sephacryl    S- 200柱上（由Pharmacia Fine Chemical AB，Sweden生产和销售）。柱中加入相同的缓冲液进行凝胶过滤。具有抗L细胞的细胞毒素活力的部分经离心浓缩获得抗L细胞的细胞毒素活力为2.0×10⁵单位/毫升和含有比活力为7.5×10⁵单位/毫克的人TNF的纯化溶液。

步骤2

（小鼠的免疫）

上面步骤1获得的纯化后溶液同等体积的Freund完全作剂混合乳化得到乳剂。乳剂皮下注射于BALB/C雄性小鼠，一次间隔二周共三次，使小鼠免疫。注射的乳剂用量是0.2毫升/每次注射/小鼠。第3次注射4星期后，在腹膜内注射0.5毫升步骤1获得的纯化后溶液引起小鼠最终免疫。

步骤3

（细胞融合）

在最终免疫的3天后，杀死小鼠取出脾脏。脾脏切成碎片，接着用不锈钢滤器在加压下进行过滤得脾脏细胞。然后，细胞悬浮在Eagle基本培养基（下文称为“MEM”）上，得到MEM的脾脏细胞悬浮液。脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞（P₃/X63-Ag8μl）分别用MEM洗3次以4∶1的比例混合，接着在800rpm离心15分钟得到沉淀。在离心管的沉淀中逐步加入2毫升44%（体积/体积）溶解在MEM中的聚乙烯乙二醇2000溶液得到混合液。含有混合液的离心管在37℃的水浴中缓慢转动1分钟进行细胞融合。然后，在混合液中加入1毫升MEM，含有混合液的离心管缓慢转动。在混合液中再继续以2毫升/分钟的速度加入MEM，使最后体积达10毫升。然后，混合液在600rpm离心5分钟得到沉淀。沉淀悬浮在含有10%牛犊血清（下文称为“FCS”）的Rosewel Park Memorial Institute 1640培养基上（下文称为“RPMI”），得到含有浓度为7×10⁵骨髓瘤细胞/毫升的悬浮液。悬浮液培养在由Flow Laboratories，Inc·（U·S·A）生产的96-孔微滴定度平板的每个孔中，用量为0.1毫升/孔。

1天后，每孔中加入0.1毫升含有HAT（1×10^-4摩尔/升次黄嘌呤，4×10^-7摩尔/升氨基蝶呤和1.6×10^-5摩尔/升胸苷）的RPMI1640-10%FCS培养基（下文称为“HAT培养基”）。以后每隔3或4天后，每孔中一半的培养基用新鲜的HAT培养基替换。在加入含有HAT的RPMI1640-10%Fcs培养基的7天后，某些孔可观察到杂交瘤细胞的生长，2或3周后，几乎所有孔都可观察到杂交瘤细胞的生长。

步骤4

（产生抗体和克隆的细胞筛选）

上面已观察到杂交融合细胞生长的小孔培养的0.1毫升悬浮液，加入到96-孔微滴定度平板的每一个已连接有人类TNF的小孔中，微滴定度平板在室温放置1小时。每孔中的细胞用含有0.1%牛血清清蛋白的生理盐水洗。在洗后的细胞中加入10000倍稀释的用0.1毫升/孔过氧化物酶标记的抗-小鼠IgG（Cappel    Laboratories，Inc·，U·S·A·）液，室温下放置1小时。然后，细胞用含有0.1%牛血清清蛋白的生理盐水洗。在洗后的细胞中加入底物溶液（30毫克邻苯二胺，7微升30%过氧化氢水溶液，10毫升0.1摩尔/升柠檬酸和10毫升0.2摩尔/升磷酸氢二钠）每孔用量为0.15毫升，30分钟后测定每孔在492毫微米处的吸收量以确定含有产生抗体细胞的孔。

利用玻璃毛细管将每个表现高抗体活性的孔中的细胞取出，进行克隆以获得克隆株。用在上述的相同步骤中克隆的抗体活力作为筛选的标准，得到表现高度抗体活力的2个克隆，即是杂交细胞系HⅡ7C和杂交细胞系HⅢ2F。

每个上面获得的克隆培养在含有10%FCS的RPMI1640培养基上增加克隆细胞。然后，收集克隆细胞悬浮在含有15%FCS和10%二甲基亚砜的RPMI1640培养基中。这样得到的悬浮液保藏在液氮中。

步骤5

（含有杂交融合细胞腹水的制备）

上面步骤4获得的杂交融合细胞，每1×10⁷个细胞接种到BALB/C小鼠腹腔中，其每个小鼠事先腹腔注射0.2毫升的降植烷（2，4，10，14-四甲基+五烷）制备腹水。10天后，从小鼠中得到3至5毫升腹水。

步骤6

（单克隆抗体的纯化）

步骤5得到的10毫升腹水中加入2.66克硫酸铵（35%饱和度），得到的混合液在4℃搅拌过夜，然后形成沉淀。离心取出沉淀上事先用0.01摩尔/升磷酸缓冲液（PH8.0）平衡过的DEAE-Sepharose    CL 6B柱（Phannacia    Fine    Chemicals    AB，Sweden）。柱用相同的缓冲液洗，然后，用含有0.2摩尔/升氯化钠的0.01摩尔/升磷酸缓冲液（pH8.0）作为洗脱液进行洗脱。从柱底收集的部分进行聚乙烯酰胺凝胶电泳测定含有单克隆抗体的部分。获得97毫克由杂交细胞系HII7C产生的单克隆抗体（下文称为“HII7C单克隆抗体”），和199毫克由杂交细胞系HIII2F产生的单克隆抗体（下文称为“HIII2F单克隆抗体”）。

步骤7

（确定单克隆抗体的亚类）

按照Ouchterlony免疫方法〔已发表，见由Blackwell科学出版社（1976）发行的“实践免疫学”107-115页，Hudson et al，的描述〕应用抗-小鼠IgG1，IgG2a和IgG2b（由美国Miler公司生产和销售）进行亚类的鉴定。发现HII7C单克隆抗体和HIII2F单克隆抗体2个同属于IgG₁类。

步骤8

（借助单克隆抗体的活动来消除生理活性物质的活力）

步骤1制得的人类TNF纯化后溶液用含有10%FCS的MEM培养基进行稀释，获得浓度为20单位/毫升和200单位/毫升的溶液。上面得到的2个单克隆抗体用同样的培养基稀释得到2种浓度的溶液。两种溶液混合倒入96-孔微滴定度平板的每个孔内，用量为0.05毫升/孔。在37℃培养1小时后，每孔中加入0.1毫升含有10⁵L-M细胞/毫升的相同培养基的悬浮液。然后，基本上重复试管测定方法所述的相同步骤测定抗L细胞的细胞毒素活力。同时也进行检验（A）既不加入TNF也不加单克隆抗体，和检验（B）不加单克隆抗体但加入TNF。

结果如表5所示，其活力消除率（%）从公式计算得到：（见表5）

(（样品吸收）-（检验（B）得到的吸收）)/(（在检验（A）中的吸收）-（检验（B）中得到的吸收）) ×100

2个单克隆抗体在高浓度下完全消除从人TNF得到的活力。在低浓度下，HIII2F单克隆抗体表现比HII7C单克隆抗体更高的消除率。

步骤9

（测定单克隆抗体的等电点）

一种薄层等电点聚焦仪（由Pharmacia    Fine    Chemical    AB，Sweden生产和销售）用来测定这2个单克隆抗体的等电点。应用Pharmalite    pH3-10（由Pharmacia    Fine    Chemical    AB，Sweden生产和销售）作为两性电解度载体，按照Awdeh    et    al的方法（Natue219卷66页（1980））进行。

发现HII7C单克隆抗体和HIII2F单克隆抗体的等电点分别为6.7至7.0和6.2至6.5。

步骤10

（单克隆抗体结合树脂的制备）

50毫升步骤6制得的含有150毫克HII7C单克隆抗体的水溶液相对于含有0.5摩尔/升氯化钠和0.1摩尔/升碳酸钠的水溶液透析。透析后的抗体溶液加到50毫升经溴化氰活化过的膨胀树脂Sepharose    CL-4B（由Pharmacia    Fine    Chemical    AB，Sweden生产和销售）中。混合液在4℃温和搅拌过夜进行反应。反应结束后，树脂用含有0.5摩尔/升氯化钠和0.1摩尔/升碳酸钠的水溶液充分洗。然后，树脂用50毫升1摩尔/升乙醇胺水溶液混合，接着在室温搅拌2小时，保护未反应的活性基团。随后树脂用8摩尔/升尿素水溶液和生理盐水充分洗涤得到能在亲和层析中作为吸附剂之用的HII7C单克隆抗体结合树脂。

基本上重复上述相同的步骤制备HIII2F单克隆抗体结合树脂。

连接了HII7C单克隆抗体的树脂装柱（2.5×8厘米）。

实例3

实例2制备的含有质粒PHTNF-lacUV5-1的E·coli用普通方法培养，然后收集细胞。细胞在2升0.02摩尔/升Tris-盐酸缓冲液（pH7.8）中溶菌，获得含有人TNF的细胞提取液。细胞提取液活力为5.2×10⁵单位/毫升，含有比活力为4.2×10⁴单位/毫克的人TNF。

在提取液中加入链霉素使其最终浓度为0.7%（重量/体积）产生核酸沉淀。离心去除沉淀后，上清液加在事先用0.02摩尔/升Tris-盐酸缓冲液（pH8.0）平衡过的DEAE-Sepharose CL-B柱上（由Pharmacia Fine Chemicals AB，Sweden生产和销售）。柱用相同的缓冲液洗，然后用含有0.1摩尔/升氯化钠的10毫摩尔/升的磷酸缓冲液（pH7.5）作为洗脱液进行洗脱，获得具有比活力为3.90×10⁵单位/毫克的粗提液（A）。

在用盐酸调节pH达6后，粗提液（A）加在 事先用含有0.1摩尔/升氯化钠的10毫摩尔/升磷酸缓冲液（pH6.0）平衡过的Blue    Sepharose    CL-6B柱上（由Pharmacia    Fine    Chemical    AB    Sweden生产和销售）。柱充分洗，然后，用含有0.5摩尔/升氯化钠的10毫摩尔/升磷酸缓冲液（pH8.0）作为洗脱液进行洗脱，得到含有纯化的人TNF的部分。关于提取液，去除了核酸后的上清液，粗提液（A）和按照本发明经柱层析后得到的部分，这些溶液的比活力、回收和纯化度是按照以前描述过的方法测定。结果如表6所示。

比较实例1

实例3得到的粗液（A）用单克隆抗体柱纯化。

这里使用的单克隆抗体柱是由单克隆抗体结合树脂装成，树脂按参考实例4的步骤制得。柱用含有0.15摩尔/升氯化钠的50毫摩尔/升磷酸缓冲液（pH7.5）平衡，然后，粗提液（A）上柱。在充分洗后，用0.1摩尔/升苷氨酸-氯化钠（pH10.0）作为洗脱液进行洗脱，获得含有纯化的人TNF的部分。

这样获得的部分，按照前述的方法测定其比活力，回收和纯化度。

结果如表7所示，表7同时表示实例3得到的结果。

实例4

除了分别使用MatriX    Gel    Red    A和Matrix    Gel    Red    B（由美国Amicon公司生产和销售）代替Blue    Sepharose    CL-6B外，基本上重复实例3的步骤，获得含有纯化后人TNF的部分。

这样得到的部分，按照前述的方法测定其比活力，回收和纯化度。结果如表8所示，表8同时表示实例3得到的结果。（见表6、7、8）

这里阐述的发明，显然是可以许多方式加以变化的。这些变化不能认为是同本发明的精神和范围相歧，所有这些对于精通本行者是明显的改换，都被认为包括在如下权利要求的范围中。

表1

氨基酸顺序    羧基端    Ala    Met    Pro    Glu    Ala    Glu    Glu…氨基端

mRNA    3′……XCG    GTA    XCC    YAG    XCG    YAG    YAG……5′

探针MH    5′    GC    CAT    MGG    MTC    GGC    MTC    MTC    3′

探针MI    5′    GC    CAT    NGG    MTC    GGC    MTC    MTC    3′

探针MJ    5′    GC    CAT    ZGG    MTC    AGC    MTC    MTC    3′

探针MK    5′    GC    CAT    ZGG    MTC    CGC    MTC    MTC    3′

探针ML    5′    GC    CAT    ZGG    MTC    TGC    MTC    MTC    3′

表2

退火的碱 OD₆₀₀对L-细胞的细

质粒    基对数    胞毒素活性

（单位/毫升）

pB2-2    1400    1.369    35

pB2-3    800    1.605    ＜10

pB2-7    1060    1.364    ＜10

pR9    1550    1.618    ＜10

pR12    1400    1.458    15

pR18    1850    1.438    ＜10

pR25    1350    1.514    ＜10

pBR322    0    1.677    ＜10

表3

大肠杆菌所产生

的兔TNF的注入    用于测定    样本活性的评定    恢复率

量    单位/小鼠    的小鼠数    （1天以后）    （20天以后）

-    +    ++    +++

2×10⁵5 0014 5/5

参照    5    5000    0/5

用生理盐水

表4

酶    克隆    与探针（PR18）杂交片段的大小

（噬菌体）    5′端    3′端

HG-3    6.7千碱基对（Kb）    ←

BamHI    -6    11.2千碱基对（Kb）    ←

-7    9.2千碱基对（Kb）    ←

BamHI    HG-3    2.9千碱基对（Kb）    ←

+    -6    ″    ←

EcoRI    -7    ″    ←

HG-3    ″    ←

EcoRI    -6    ″    ←

-7    ″    ←

HindIII    HG-3    ″    ←

+    -6    ″    ←

EcoRI    -7    ″    ←

HG-3    9.7千碱基对（Kb）    ←

HindIII    -6    4.1千碱基对（Kb）    ←

-7    9.7千碱基对（Kb）    ←

HG-3    2.2千碱基对（Kb）    0.9千碱基

PvuII    -6    1.9千碱基对（Kb）    0.9千碱基

-7    2.2千碱基对（Kb）    0.9千碱基

注：符号“←”指同一片段杂交

表C

表D

1）5′-AATTCATGTCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAA-3′

2）3′-GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCTCACTGTTCGG-5′

3）5′-GCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGC-3′

4）3′-ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5′

表5

单克隆抗    生理活性物质的浓度    单克隆抗体的浓    活力消除率

体的类型    （单位/毫升）    度（微克/毫升）    （%）

50    100

20    3.2    46

0.2    6

HII7C

500    100

200    32    70

2.0    9

50    100

20    3.2    100

0.2    40

HIII2F

500    100

200    32    100

2.0    93

表6

比活力    回收率    纯化度

步骤    （单位/毫克）    （%）    （倍数）

粗提取液 4.2×10⁴100 1.0

去除核酸后 4.8×10⁴76 1.1

经DEAE-葡聚糖

柱后（粗液（A）） 3.9×10⁵65 9.3

经兰色葡聚糖

CL-6B柱后 1.5×10⁶63 35.7

表7

比活力    回收率    纯化度

步骤    （单位/毫克）    （%）    （倍数）

粗提液（A） 3.9×10⁵100 1.0

经兰色葡聚糖 1.5×10⁶90 3.8

CL-6B柱后

经单克隆抗体柱后 1.4×10⁶55 3.6

表8

比活力    回收率    纯化度

步骤    （单位/毫克）    （%）    （倍数）

粗液（A） 3.9×10⁵100 1.0

经Blue葡聚糖 1.5×10⁶90 3.8

CL-6B柱后

经Matrex红色A 1.4×10⁶85 3.6

凝胶后

经Matrex绿色A 1.4×10⁶80 3.6

凝胶后

勘误表

文件名称    页    行    补正前    补正后

说明书    1    倒2    颉氨酸    缬氨酸

7    倒3    ″    ″

全    文    格兰氏    革兰氏

3    倒2    聚丙酰胺    聚丙烯酰胺

4    倒9    Bharat    B·Bharat

倒7    1982    1983

倒5    美国    英国

5    3    产生L细胞细胞毒    产生对L细胞具有细胞

物质    毒素物质

10    蛋白的DNA产生    蛋白质的DNA就有可能

产生

全    文    CDNA，PHTNF-Lac，    cDNA，pHTNF-Lac，

PTNF-Lac    pTNF-Lac

6    倒3    PTNA-Lac    pTNA-Lac

倒4    多肽的DNA    多肽的

12    倒12    头端    末端

倒10    由下    由T·

13    2    （Kh）    （Kb）

7    得到的cDNA    得到的兔TNF    cDNA

14    11    流水性    疏水性

倒1    编码的DNA    编码的TNF    DNA

勘误表

文件名称    页    行    补正前    补正后

说明书    15    倒4    动顺序    动子顺序

11    DNA。    DNA来获得。

倒10    蛋白    肽

16    倒4    Bacilluo    Bacillus

Rubtilis    Subtilis

倒1    氯微素    氯霉素

17    1    青微素    青霉素

18    12    分泌的    分泌TNF的

倒3    监析    盐析

19    倒9    p3GA    F3GA

21    7    红色Matrex    红色A    Matrex

22    倒1    而具    而且

23    倒1    降上述    加到上述

24    10    Wrswell    Carswell

全    文    毒活性    毒素活性

25    12    Junnoska    Naki    Junnoske    Nakai

倒8    除去甲烯兰    除去过量的甲烯兰

倒6    Multiska    Multiskan

Laboratorg    Laboratories

Ine    Inc.

26    4    送进    插进

勘误表

文件名称    页    行    补正前    补正后

说明书    28    4    ME-液    NZ-液

5、6    NE胺    NZ胺

8    水介物    水解物

29    1    CCLI    CCL1

7-8    Junosuka    Junnosuke

31    4    Sepharyl    Sephacryl

倒2    （TNF-产生细胞    （产生TNF细胞的制

的制备）    备）

32 倒9 35S³⁵S

倒8    ple.    plc.

倒7    Natwre    Nature

倒3    X-腺胶片    X-光胶片

33 3 NP40 NP40

34    倒5    直腺    直线

35    2、3    Backman    Beckman

8    HiVoshi    Hiroshi

12    气物    生物

15    牛血清蛋白    牛血清白蛋白

倒2    TNP    TNF

36    倒4    蛋白胰酶    胰蛋白酶

倒2    Losmosil    Cosmosil

勘误表

文件名称    页    行    补正前    补正后

说明书    37    1    多葡萄糖    交联葡聚糖

倒1    葡聚糖    交联葡聚糖

倒6    磷酸三脂    磷酸三酯

38    13    核苷酸的    核苷酸探针的

39 7 Na₂PO₄NaH₂PO₄

10    印溃器    印渍器

全    文    寡聚脱氧核糖核酸    寡聚脱氧核糖核苷酸

寡聚脱氧核酸    寡聚脱氧核苷酸

倒4    酯基序列。    碱基序列。

倒1    文献（1）    文献（2）

43    6    Ruc-8    puc-8

48    6    悬浮液在含有    悬浮液接种到含有

11    的平板上涂接，    的LB琼脂平板上，

49    4    得到DNA    得到两条DNA

8    核糖核酸    核糖核酸酶

51    8    Chwron    Charon

11    4E    4A

52    末行    4噬菌体    4A噬菌体

54    10    Southerm    Southern

56    全页    碱基对    碱基

57    倒8    ″    ″

勘误表

文件名称    页    行    补正前    补正后

说明书    58    倒3    十个菌落，    十个菌落细菌克隆，

倒1    毫升的    毫升氨苄青霉素的

倒11    39℃    37℃

59    8    DNA。    DNA，用上述方法，

得到10质粒DNA。

60    9    酶介    酶切

11    （PRGE）    （pRGE）

66    倒8    M12    M13

倒2    Clouing    Cloning

倒1    Segnen    cnig    Sequencing

67    6    Cloniug    Cloning

10    3前    3

11    （外显子3）    （外显子4）

（外显子4）碱基    （外显子3）前的碱基

倒7    酶    （删去）

倒6    H的    Hin的

68 9 32P³²p

70    3    培养基上。    营养培养基上。

71    5    毫升    毫克

12、18    离心    超滤

倒2    作    佐

勘误表

文件名称    页    行    补正前    补正后

说明书    74    4、5    融合    瘤

7    （2，4，10，    （2，6，10，

14    phannacia    pharmacia

倒1    免疫方法    免疫扩散方法

75    3    Miler    Miles

77    倒9    连接了HII7C单    将HII7C单克隆抗体

克隆抗体的树脂    结合树脂

79    表6    粗提取液    培养物提取液

79    表6    葡聚糖    琼脂糖

｜

80    表7    ″    ″

表8    ″    ″

权利要求书    3    7    Anricon    Amicon

4    8    Cgs    Cys

6    4    TVP    Trp

勘误表

文件名称    页    行    补正前    补正后

说明书    3    倒6

15    12    格兰氏    革兰氏

25    7

28    倒4    毒活性    毒素活性

29    2

9    倒7

45    倒3    毒性    素性活性

56    45，

6，7，

倒2，

倒3，    碱基对    碱基

倒4，

倒5，

倒6，

倒7，

44    倒4    寡聚体    寡聚脱氧核糖核苷酸

40    2，4

42    倒6

43    倒5    寡聚脱氧核糖核酸    寡聚脱氧核糖核苷酸

45    7

勘误表

文件名称    页    行    补正前    补正后

说明书    40    6

41    倒1

42    倒3

44    5

8    寡聚脱氧核酸    寡聚脱氧核糖核苷酸

倒4

45    9

7    4

11    9    PHTNF-lac    pHTNF-lac

45    10    UV5-1    UV5-1

7    6    PHTNF-lac    pHTNF-lac

11    10    UV5-2    UV5-2

6    倒6    PTNF-lac-1    pTNF-lac-1

6    1    CDNA    cDNA

Claims (2)

1、纯化有生理活性的多肽的方法，该方法包括将含有生理活性的多肽粗制品进行柱层析，所述有生理活性的多肽是一种用含有编码具有以下式(Ⅰ)为代表的氨基酸顺序的多肽的DNA的重组DNA通过重组DNA技术产生的多肽：(见表A)

表A

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val

Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln

Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val

Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr Nis Val Leu Leu Thr

His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn

Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu

Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly

Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn

Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe

Gly Ile Ile Ala Leu

其特征在于所述柱层析是用染料结合的交联琼脂糖凝胶装成的柱进行的，所述染料结合的交联琼脂糖凝胶包括作为载体的交联琼脂糖凝胶与作为配体的染料共价结合，所述染料选自汽巴克郎(Cibacron)兰F3GA(染料索引名称：反应兰2)，普施安红HE3B(染料索引名称：反应红120)和绿A(从美国Amicon公司可以买到，己作成绿A-结合的交联琼脂糖凝胶，商品名为“Matrex”凝胶绿A”)，得到的该多肽的比活力至少为1.4×10⁶μ/mg，回收率至少为63%。

2、按照权利要求1的方法，其特征在于所述编码有生理活性的多肽的DNA含有至少由下式（Ⅱ）所代表的碱基顺序和与该碱基顺序互补的碱基顺序组成的一段碱基顺序：（见表B）

表B

TCA  TCT  TCT  CGA  ACC  CCG  AGT  GAC  AAG  CCT  GTA  GCC  CAT  GTT  GTA

GCA  AAC  CCT  CAA  GCT  GAG  GGG  CAG  CTC  CAG  TGG  CTG  AAC  CGC  CGG

GCC  AAT  GCC  CTC  CTG  GCC  AAT  GGC  GTG  GAG  CTG  AGA  GAT  AAC  CAG

CTG  GTG  GTG  CCA  TCA  GAG  GGC  CTG  TAC  CTC  ATC  TAC  TCC  CAG  GTC

CTC  TTC  AAG  GGC  CAA  GGC  TGC  CCC  TCC  ACC  CAT  GTG  CTC  CTC  ACC

CAC  ACC  ATC  AGC  CGC  ATC  GCC  GTC  TCC  TAC  CAG  ACC  AAG  GTC  AAC

CTC  CTC  TCT  GCC  ATC  AAG  AGC  CCC  TGC  CAG  AGG  GAG  ACC  CCA  GAG

GGG  GCT  GAG  GCC  AAG  CCC  TGG  TAT  GAG  CCC  ATC  TAT  CTG  GGA  GGG

GTC  TTC  CAG  CTG  GAG  AAG  GGT  GAC  CGA  CTC  AGC  GCT  GAG  ATC  AAT

CGG  CCC  GAC  TAT  CTC  GAC  TTT  GCC  GAG  TCT  GGG  CAG  GTC  TAC  TTT

GGG  ATC  ATT  GCC  CTG

其中A代表脱氧腺苷酸残基，G为脱氧鸟嘌呤核苷酸残基，C为脱氧胞苷酸残基，和T为胸苷酸残基，而其中结构式Ⅱ左端和右端分别代表5′羟基和3′羟基。

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