CN1320689A - 利用自体裂解融合蛋白质的表达系统及新的还原多肽 - Google Patents

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Abstract

利用自体溶解融合蛋白质的表达系系统和新的还原性多肽。本发明提供了用于外源性多肽的表达系统,其中多肽被表达成与三叶草黄色叶脉病毒核包涵体a(NIa)构成的融合蛋白质,该NIa成份在表达之后负责自体溶解该融合蛋白质。此系统可被用于表达一种新的多肽,它被命名为KM31－7蛋白质,并且能够还原二氯靛酚和氧化态谷胱甘肽。此多肽可用于治疗由氧化应激引起的疾病。

Description

利用自体裂解融合蛋白质的表达 系统及新的还原多肽
本发明涉及一种需要裂解前体产物的多肽表达系统，和用于该系统的蛋白酶。本发明还涉及一种能够还原二氯靛酚和氧化态谷胱甘肽的新的多肽，编码这种新的多肽的DNA，含有该DNA的载体，用该载体转化的宿主，和含有该多肽的药物组合物。另外，本发明还涉及抗这种多肽的单克隆抗体，和用该抗体分离和纯化所说多肽的方法。
马铃薯Y病毒是一组其中每种都有一种大约10,000碱基的单股RNA基因组，并且能够感染植物如茄科植物的病毒。马铃薯Y病毒基因组的特征是具有一特别长的开放阅读框架，或ORF[Dougherty,W.G.and Hiebert,E.(1980),Virology 101:466-474.；Allison,R.et al.(1986),Virology 154:9-20]。为了表达在ORF中编码的单个蛋白质，用两种类型的蛋白酶消化翻译的多聚蛋白质，这两种类型的蛋白酶也是在ORF内编码的[Dougherty,W.G.and Carrington,J.C.(1988),Ann.Rev.Phytopath.26:23-143]。
烟草蚀刻病毒(TEV)是马铃薯Y病毒家族的一个成员，而且这种病毒能在被感染细胞中产生可被锥虫蓝染色的核内包涵体。核内包涵体明显是由两种蛋白组成的。其中一种已被证明是一种病毒蛋白酶，并被命名为核内包涵体a，或NIa[J.Virol.,61:2540-2548(1987)]。
核包涵体是马铃薯Y病毒的一种蛋白酶，它能识别和切割包括Gln-Gly,Gln-Ser和Gln-Ala之一的肽序列，据信该序列是六聚体，并且出现在多聚蛋白质内相关NIa的C末端。裂解位点是在构成上述二聚体的两个残基之间。
TEV和烟草叶脉斑纹病毒(TVMV)-马铃薯Y病毒家族的又一成员-的完整基因组序列已被测出，且同源性检索表明这些病毒的NIa可以定位在它们的相关基因组中[Virology,154:9-20(1986)；Nuclear Acid Res.,14:5417-5430(1986)]。
三叶草黄叶脉病毒，或简称CYVV，也是一种马铃薯Y病毒。到目前为止，只测出了CYVV基因组3′端的基因和它所编码的衣壳蛋白质的序列[Uyeda,I.et al.(1991),Intervirol.32:234-245]。以往未曾推断出基因组NIa区的结构，也未分离出相应的NIa。
利用本领域中公知的技术，可以容易地做到由表达系统产生外源性蛋白质。但是，还有许多多肽尚不能在外源系统中很容易地被表达。问题可能是多肽不能够被大量地表达，而且这种情况通常也不能只在基因上游置入一个调节基因而得以纠正。或者可能是没有发生为获得成熟型蛋白质所需的转录后加工过程，或错误地发生了这一过程。
例如，许多真核多肽是以N末端蛋氨酸开始翻译的，然后再去掉该氨基酸而得到成熟型多肽。这一过程不能在原核细胞中发生，因此必须寻找获得表达的其他手段。这种技术之一包括，将所需的外源蛋白质与麦芽糖结合蛋白质或谷胱甘肽转移酶融合，例如，纯化表达的融合蛋白，然后用蛋白酶，如Xa因子，肠激酶，或凝血酶进行切割。这种笨拙方法的主要缺点是它需要两个纯化步骤，导致大量的终产物丢失。
美国专利NO.5,162,601公开了利用TEV蛋白酶生产在所要表达的每种蛋白之间具有接头序列，如人tPA的多蛋白质。尽管如此，该专利只是公开了将编码这种多聚蛋白质的多基因克隆到宿主中，而没有公开蛋白水解裂解终产物的表达或纯化。
用于代谢能量所需的氧在细胞环境中一般是以氧化剂形式提供的。
其中氧能被利用的活化形式一般是自由基、如超氧化物(O2 -)，过氧化物(H2O2)、或羟基(OH-)，所有这些都在利用后被还原形成水(H2O)。氧化本身是具有高度氧化作用的，但是，本文所用的术语“活化氧”是指比气体氧有更大氧化能力的氧和含氧分子。最强形式的活化氧是自由基，它是一种具有一个或多个未配对电子的分子或原子。
自由基一般是不稳定的，并且，如果不适当控制，其可使脂类、蛋白质和核酸变性。因此说，尽管活化氧是生命所必需的，但它又是一种潜在的健康不利因素，必须严加控制。即使是非常微小的量，活化氧也会因为其高度反应活性而引起疾病。结果是，如果不装备抵御活化氧的机制，生命机体就不能存活。
在细胞环境中，必须使活化氧产生的部位、数量和时间与细胞中和相关危险的能力达到平衡。这种能力一般是由利用其自身的抗氧化剂或抗氧化酶的防御机制提供的。在本发明说明书中，“抗氧化剂”是指天然产生的能够防止或抑制脂质自动氧化的一类物质的统称。术语“抗氧化酶”一般用于指能够催化消除活化氧的反应的酶，术语“抗氧化作用”也由此得到解释。
在一些异常情况下会产生过量的活化氧，如当人体处于紧张状态，服用药物，吸烟，手术后，器官移值，或在大脑或心肌栓塞过程中出现局部缺血时。如此大量的活化氧超过了机体控制系统消除它们的能力，致使过量的活化氧进一步对身体造成损害，进而严重地损伤正常细胞。因此说，所谓的氧化应激是许多疾病的致病因素。
以动脉硬化为例，被活化氧氧化的低密度脂蛋白的出现被认为是这种疾病的病因之一[Steinberg,D.(1983),Arteriosclerosis 3,283-301]。氧化应激也被认为与糖尿病的发生、代谢异常和血管并发症相关之机制的诱因与影响密切相关[Kondo,M.ed.,“Approaches from Modern Medicine(4)Free Radicals”,Medical View Pub.,PP.138-146]。
活化氧也与其他的病理状态和状况有关，例如局部缺血性疾病(再灌注性疾病、缺血性心脏病、脑缺血、缺血性肠炎等)，水肿、血管通透性增加、炎症、胃粘膜疾病、急性胰腺炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肝病、帕拉夸特氏病、肺气肿、化学性癌症、癌转移、成人呼吸窘迫综合症、弥漫性血管内凝血、白内障、早熟性视网膜病、自身免疫性疾病、叶啉血症、溶血性疾病、地中海贫血、帕金森氏症、阿尔茨海墨氏病、癫痫、紫外线照射性疾病、放射性疾病、冻伤、和烧伤。
在细胞内和细胞外都存在有仅以消除生理状态下产生的活化氧为目的的几种防御机制。
在细胞内，已知如下所述的一些抗氧化剂和抗氧化酶可以处理和消除活化氧。例如，存在于过氧化物体中的过氧化氢酶，这种酶可以还原和清除地氧化氢。谷胱甘肽过氧化物酶出现于细胞质和线粒体中，并且这种酶在还原态谷胱甘肽存在下可以还原和解毒过氧化氢及脂质过氧化物。转铁蛋白、铁蛋白和乳铁传送蛋白，例如可以通过稳定铁离子而抑制活化氧的产生；同样，血浆铜蓝蛋白也起到类似的与铜离子相关的作用。另外，存在于细胞质和线粒体中的超氧化物歧化酶能催化超氧化物还原以形成过氧化氢，然后过氧化氢则被过氧化氢酶消除。再者，维生素E和C能还原谷胱甘肽，而且其他的低分子量化合物也能够还原和清除活化氧。
另一方面，象细胞外超氧化物歧化酶、细胞外谷胱甘肽过氧化物酶和还原态谷胱甘肽这类物质存在于细胞外的环境中，它们与上述的细胞内相应物质具有类似的作用。尽管如此，但是与细胞内的情况相比，细胞外抗氧化剂和抗氧化酶的种类较少，并且只有少数能够表现出细胞外抗氧化作用。
谷胱甘肽对于保持细胞内和细胞外的还原状态具有重要的作用，它可由下式表示。谷胱甘肽最初是由de-Rey-Pailhade于1888年在酵母中发现的，Hopkins于1921年将其作为化合物分离出来之后，命名为谷胱甘肽。
谷胱甘肽由三个氨基酸组成：谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。两个谷胱甘肽分子的巯基可以在活化氧的存在下被氧化形成二硫键。
谷胱甘肽主要产生于肝脏，通过血浆在体内循环。在正常机体中，谷胱甘肽几乎全部以还原形式存在。当氧化形式的谷胱甘肽含量增加时，在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)存在下可通过谷胱甘肽还原酶的作用再产生还原形式的谷胱甘肽。因此，还原态谷胱甘肽可以保护细胞膜免于遭受因还原活化氧和自由基所导致的氧化疾病和影响。由于具有这种抗氧化特性，还原态谷胱甘肽还可以抵抗放射性的影响，并且可用作白内障的治疗药物。最近还报道艾滋病病人体内还原态谷胱甘肽的全身水平下降，这似乎表明了还原态谷胱甘肽在体内的作是极为重要的。尽管如此，在异常状况下，活化氧的量太大以致于使几乎所有的谷胱甘肽处于被氧化状态，从而使活化氧不可能尽快地被清除。
人硫氧还蛋白是又一个代表性的物质，它可以在细胞内和细胞外通过其还原活性发挥多种生理学作用。人硫氧还蛋白(也被称为成人T细胞白血病衍生因子，ADF)作为一种能够在成人T细胞白血病细胞系中诱导细胞介素2受体(IL-2R)的因子被克隆。它是一种在其活化位点带有两个半胱氨酸残基的巯基依赖性还原酶，并能够还原活化氧和自由基。
除了能诱导IL-2受体之外，人硫氧还蛋白还可以：促进被Epstein-Barr病毒(EBV)感染的B细胞株3B6中的细胞生长；抵抗衍生于单细胞源细胞系U937的肿瘤坏死因子；抵抗由中性白细胞引起的血管内皮细胞损伤。而且，在细胞内环境中，人硫氧还蛋白通过其还原活性作用于转录因子NFKB,JUN和FOS，从而促进DNA结合活性，使之发挥作用以增加转录活性。人硫氧还蛋白目前正被开发成一种放射性疾病的预防剂，以及用作再灌注性疾病、类风湿性关节炎和炎症的治疗药物，由于它能通过其还原能力防止细胞损伤，所有上述这些痰病也因此得以预防。
如上所述，通过清除活化氧和自由基来保持细胞内和细胞外环境处于还原状态在生理学上是极为重要的。尽管目前尚不清楚，但相信有许多抗氧化剂和抗氧化酶存在于细胞内和细胞外，在消除活化氧和自由基中发挥作用。因此，发现一种能够再生，例如，还原态谷胱甘肽的还原物质是非常有用的。这类物质对于异常的身体状况，如上述那些疾病可能有所帮助。
本发明的第一个目的是提供一种新的蛋白酶，编码此蛋白酶的核苷酸序列，含有编码这种蛋白酶之DNA序列的载体，和用所说载体转化的宿主细胞。
本发明的第二个目的是提供编码有意义蛋白质且还编码所说蛋白质上游之新蛋白酶的DNA，位于所说两序列之间并进一步编码可由所说蛋白酶切割之肽的序列。所有的所说序列是在相同的开发放阅读框架中。本发明的另一个目的是提供一种由所说DNA编码的蛋白质，以及含有所说DNA的载体，和含有所说载体的表达系统，所说载体能够在一合适的宿主细胞，例如包含自动复制所必需之核苷酸序列的宿主细胞中自动复制。
从另一个角度说，本发明的首要目的是提供编码具有体内还原活性的新多肽的核苷酸序列。再一个目的是提供编码能够还原二氯靛酚和氧化态谷胱甘肽之多肽的DNA。
本发明的另一个目的是提供含有上述DNA的重组载体，所说载体能够在合适的宿主细胞中，例如带有一个能进行自动复制之基本序列的宿主细胞中自动复制。
另外，本发明还有一个目的是提供用上述重组载体转化的宿主细胞微生物。本发明的另一个目的是提供一种作为转化宿主细胞表达产物的上述肽，并提供抗这种肽的单克隆抗体。
我们现已鉴定并克隆了新的CYVV蛋白酶(NIa)，并且令人惊奇地发现能够用CYVV NIa作为融合蛋白质的一部分，在大肠杆菌(E.coli)这样的宿主中表达，并允许大量产生能通过自身裂解得到所需要外源性蛋白质的融合蛋白质。这种CYVV NIa基因能稳定地保留并在大肠杆菌中表达，所表达的NIa具有特异性蛋白酶的活性，即使该蛋白质形成融合蛋白质的一部分时也具有此种活性。
我们还发现了编码新多肽的DNA，所说的多肽能够还原二氯靛酚{也称为二氯靛酚，2,6-二氯靛酚，或2,6-二氯-4-[(4-羟苯基)亚氨基]-2,5-环己二烯-1-酮}和氧化态谷胱甘肽，可利用合适的基因工程技术大量地获得所说的多肽。这种多肽特别适用于治疗由氧化应激引起的或与之相关的痰病，或由活化氧引起的任何疾病，如动脉硬化，糖尿病和缺血性疾病(包括再灌注疾病、缺血性心脏病、脑供血不足和缺血性肠炎)。
因此，在本发明第一个具体体现的第一方面中，提供了一种多核苷酸序列，其中所说的序列沿5′至3′的方向在同一开放阅读框架中包括：
a)编码三叶草黄色叶脉病毒核包涵体a蛋白，或者是它的与三叶草黄色叶脉病毒核包涵体a蛋白具有相似的蛋白水解特异性之突变体或变异体的序列；
b)编码可被所说三叶草黄色叶脉病毒核包涵体a蛋白或其所说突变体或变异体识别和裂解之肽的序列；和
c)至少一个编码多肽的序列。
本发明还提供了一种编码三叶草黄色叶脉病毒核包涵体a蛋白，或其与三叶草黄色叶脉病毒核包涵体a蛋白具有相似蛋白水解特异性之突变体或变异体的编码序列。
本发明还提供含有如上限定之序列的载体，尤其是表达载体。
本发明还进一步提供用上文限定的载体转化的宿主，以及包括所说宿主和所说表达载体的表达系统，以及由该表达系统产生的多肽。
在本发明的另一个具体体现中，第一个方面提供了多核苷酸序列，它能编码一种多肽，该多肽是有序列ID No.12中的1至526个氨基酸的氨基酸序列，或者编码所说多肽的突变体或变异体，条件是由该多核苷酸序列编码的多肽能够还原二氯靛酚和氧化态谷胱甘肽。
还提供了一种含有如上所限定之序列的载体，特别是表达载体。
本发明还提供了由如上限定之载体转化的宿主，以及包括所说宿主和所说表达载体的表达系统，并且还提供了由这种表达系统所产生的多肽。
本发明还提供了上述多肽的医疗用途，以及这种多肽在治疗和预防由氧化应激引起或与之相关的疾病或由活化氧引起的任何疾病中的应用，以及含有这种多肽的药物组合物。
还提供了抗这种多肽的抗体，尤其是单克隆抗体，和它的等同物；本发明另外还提供了产生这种抗体的方法以及用这种抗体纯化多肽的方法。
本发明将借助附图得以进一步地举例说明，其中：
图1是从CYVV-cDNA中分离的NIa区之cDNA的限制性酶切图谱；
图2是含有NIa5′区域之质粒pKNI5′的构建图；
图3是含有部分IL-11基因和NIa5′区域之质粒PKNI5IL的构建图；
图4显示用于制备5′IL DNA片段CIN3 DNA片段的引物，其中NIa基因的3′端和IL-11基因的5′端是融合的；
图5显示通过PCR使CIN3 DNA片段与IL5′DNA片段融合；
图6显示质粒pKSUN9的构建图；
图7是pUCKM31-7的限制性酶切图谱；
图8是pUCKM31-7和pcD-31之3′端核苷酸序列的比较图；
图9是pSRα31-7的构建图；
图10是将一组氨酸六聚体编码序列导入到pUCKM31-7中的图解说明；
图11是pMAL31-7的构建图；
图12是对二氯靛酚还原活性的分析示图；
图13是对氧化态谷胱甘肽还原活性的确定。
首先通过本发明的第一实施方案举例说明本发明，但是下述讨论也适合于本发明的第二实施方案，除非该讨论明显地不适于第二实施方案。
本发明的多核苷酸序列一般较好为DNA形式的，鉴于这一的原因，本文所引用的序列一般是指DNA。尽管如此，只要合适这些指称也包括RNA。由于RNA的应用在实际当中受到限制，所以RNA不是优选的。例如，mRNA可以在非洲蟾蜍卵母细胞或麦胚溶解产物系统中表达，但是从经济角度讲两者在实际生产中均不适于大量生产融合蛋白。
术语“肽”在本文中是指包含通过肽键连接之2个或多个氨基酸的任何分子。因此，该术语包括寡肽、多肽和蛋白质。术语“融合蛋白质”是指通过将两个或多个其他肽序列结合而获得的任何单一多肽。
理想的是本发明的序列较好是双股形式的，并且本发明也包括与本发明序列相应的反义序列。本发明的双股序列可以具有一个或两个“粘性”末端，这种情况下反意和有意义链不一定准确对应。
当本发明的序列在适当表达系统中被表达时，由上述a)中鉴定的序列编码的蛋白质倾向裂解由上述b)的序列编码的肽，以释放出由上述c)的序列编码的多肽。
在上述a)和b)的序列被翻译之后的任何时间均可以发生融合蛋白的裂解。因此，由上述c)编码的多肽不必要在裂解之前全部被翻译。尽管如此，实践中我们发现至少某些融合蛋白质(如果不是大多数)，在裂解之前已全部被翻译。
如果上述的c)序列编码的不只是一种多肽，而且不是希望，例如，获得一种未被切割的融合的复数多肽，那么就不必要在每个被编码的多肽之间再进一步编码裂解序列。
如果上述c)的序列编码超过一种多肽，则该序列在转录环境中便易于衰减。在衰减过程中，在整个mRNA被阅读之前本发明mRNA序列的转录即停止，以致于靠近该序列3′端编码的多肽产生数量将少于靠近5′端编码的多肽。除非编码了几种多肽和/或该多肽非常长，衰减一般不是问题。
除非是希望制备一起使用的多种肽或这些肽是融合的，一般优选上述的c)序列只编码一种多肽。否则，必须在裂解之后分离单个的多肽，而这是一种笨拙的方法，并且浪费纯化过程中的终产物。
然而，当上述c)中的序列编码一个以上的多肽，并且在每个编码的多肽之间有一个裂解序列时，该裂解序列不一定要被CYVV-NIa所识别。必须要求的是在a)的序列和b)的序列5′端之间的裂解序列要能够被由a)序列编码的蛋白酶所识别。如果希望或能够允许融合蛋白自身消化来制备多个多肽，那么任何进一步的裂解序列便可被由a)序列所编码的蛋白酶识别。尽管如此，对这些进一步的序列应当进行选择以使它们能被其他工具所切割，从而使融合蛋白质在转录之后被它的NIa部分所切割，以产生NIa和多聚蛋白质。然后可以去掉NIa，并通过例如因子Xa或胰蛋白酶切割该多聚蛋白质。
由上述b)序列所编码的裂解肽(这里也称为“裂解序列”和“裂解肽”)可以是一种全部或部分包含于由a)和c)序列所编码的任一序列(分别是“NIa”或“蛋白酶”，和“多肽”)之中的序列。因此，裂解肽的N末端也可以是包括于蛋白酶C末端序列之中，而裂解肽的C末端部分可以包括于多肽的N末端部分中。在这种情况下，裂解肽或称切割肽没有独立存在，而且蛋白酶识别位点是由蛋白酶的C末端和多肽的N末端组成的。
裂解肽也可以是只被包含于部分蛋白酶或多肽之中。在这种情况下，裂解肽的N末端一般是包含于蛋白酶的C末端部分中，而多肽的N末端部分可以直接连接到裂解序列上或在多肽和接头之间有一个或多个氨基酸残基上。
如果裂解序列和蛋白酶和/或在裂解序列和多肽之间有一个或多个氨基酸残基，那么这些残基的数量和性质不应当妨碍蛋白酶的功能。在多肽N末端存在有过量的氨基酸残基一般是不利的，这些残基必须去除以获得成熟形式的多肽。如果可能并且在没有禁忌的情况下，一般优选对裂解肽进行加工处理以致于融合蛋白质裂解时获得成熟形式的所希望的蛋白质。但是也完全有可能获得在N末端上带有Gly,Ser或Ala的蛋白质，并且如果需要的话，可通过合适的氨基肽酶的作用将其去掉。
在某些情况下，希望在多肽的N末端和裂解序列之间编码一个脯氨酸。这样可以允许例如通过氨基肽酶P(3,4,11,9)的作用切割残基达到脯氨酸残基处，但不超过它。然后，再通过脯氨酸亚氨基肽酶的作用去掉脯氨酸残基以产生成熟蛋白质。这便形成了本发明的一个优选方案。
a)序列编码一种能够切割由本发明序列编码之融合蛋白质的蛋白酶。在本发明中，这种蛋白酶是三叶草黄色叶脉病毒核包涵体a蛋白酶，或与三叶草黄色叶脉病毒核包涵体a蛋白酶具有类似蛋白水解特异性的突变体或变异体。
三叶草黄色叶脉病毒NIa蛋白酶是由序列表内序列ID No.1序列中的第10至1311位核苷酸编码的，而NIa的一级序列是由序列表中序列ID No.2序列的第4到437位氨基酸所给出的。这些序列以及其突变体和变异体都是新的，构成本发明的一部分。
核包涵体a具有能够特异性水解底物肽中Gln-Ala,Gln-Gly或Gln-Ser之间肽键的蛋白水解活性。另外，我们还发现NIa能够切割Gln-Val。因此，与马铃薯Y病毒家族的其他蛋白酶相反，我们已发现CYVV NIa(本文所指的NIa除另有说明者外，-应当理解为CYVV NIa)能够切割序列Asn Cys Ser Phe GlnX，其中X是任何氨基酸残基，但是尤其指Gly.Ala.Val Ser，并且特别指Gly,Ala或Ser。
另外还希望含有序列Asn Cys Ser Phe GlnX的肽能够被NIa所切割，尤其是在这个序列立体结构上曝露于NIa的作用之处。因此，本发明还提供了一种用于制备多肽的系统，其中含有序列Asn CysSer Phe Gln X的多肽的前体形式被NIa裂解。这个系统也可以含有其他的加工步骤，只要合适，可以是在NIa裂解之前、之后或同时发生这些加工。
尽管我们一般优先使用编码天然产生之NIa的序列(根据序列ID2)，但是本发明同样也包括使用NIa的突变体或变异体。
如上所述，蛋白酶应当具有与天然NIa相同或相似的特异性。在这方面，蛋白酶一般应当与序列ID NO.2中的氨基酸残基4至437分享重要的序列同源性，而在没有改变识别序列或使活性降低到应用水平以下的情况下可能发生实质性变异，对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
一般来说，任何给定的蛋白质的活性均取决于分子的某些保守区域，而其他区域与它们的特定序列几乎没有重要关联，并且它可能几乎完全是多余的。因此，如上所述，本发明包括了仍然能表现出与天然产生的NIa有类似特异性的该序列的任何突变体和变异体。这种突变体和变异体包括，例如缺失、加入、插入、倒位重复和类型替代(例如，用一个亲水残基替代另一个，但是原则上是不强的亲水残基替代强的疏水残基)。小的变化一般不影响活性，除非它们是发生在分子的基本部位，而且这种改变可以是基因操作的付产物，例如，如果需要，发生在产生额外限制性位点时。
一般来说，除了对本领域的熟练技术人员来说是显而易见的情况之外，通常没有任何特殊的理由要改变NIa的结构。的确，绝大部分氨基酸或编码序列的突变或变异是在原始野生型病毒上分离新的变异的结果。然而，只要蛋白酶具有必要的特异性和足够的蛋白水解活性，本发明并不排除精细设计的，甚至是偶然的修饰。
本文所用术语“不利影响”是指能够影响蛋白酶的特异性或活性使之显著低于上述天然NIa之效果的任何作用，影响的程度是其活性降低到有用水平以下。
许多取代、加入等都可能发生，唯一的限制是其活性不能受到不利的影响。一般来说，只有在NIa的三维结构受到严重的影响时才可能对活性有不利作用。
本文所用术语“突变体”是指对活性不产生不利影响的序列中氨基酸的缺失、加入、插入、倒位和取代。本发明还包括“变异体”，该术语用于指与序列ID2密切相关的天然产生的CYVNIa，但是在大的种群内它以预期方式由之发生变化。这一定义内包含了等位基因变异和来源于其他培育品种的表现出类似活性与相关序列的那些多肽。
应当指出的是，本发明第二方案的NIa和蛋白质都不必分别与序列ID2和12中所描述的序列完全一致。唯一的要求是尽管多肽只是完整天然序列的一部分或该部分的突变体或变异体，但它们都必须有所需的活性。
真核生物的基因，如干扰素基因，一般被认为表现有多态性[参见Nishi,T.et al.(1985),J.Biochem.97,153-159]。这种多态性导致出现了在多肽中有一个或多个氨基酸取代的情况，以及除了核甘酸序列取代之外没有氨基酸序列变化的其他情形。
因此，只要对蛋白酶活性没有不利影响，多核苷酸编码序列可以以任何所需方式被修饰。点突变和其他的变化可以有效地加入或缺失限制性位点，例如，以有助于基因操作/表达，或增强或方便地修饰NIa分子。
术语“突变体”和“变异体”还用于指多核苷酸序列，并且这种特指应当以合适的方式，mutatis mutandis加以解。应当清楚的是，虽然肽序列的突变体或变异体总是在编码核苷酸序列中反映出来，但反过来则不一定是真实的。因此，有可能核苷酸序列发生很大变化(参见下文关于基因编码简并性的讨论)，而不以任何方式影响肽序列。这种核苷酸序列的突变和变异是在本发明之内的。
例如，已经实现了用一个丝氨酸密码子取代白介素2(IL-2)基因中的半胱氨酸密码子所获得的蛋白质仍然能够表达IL-2的活性[Wang,A.et al.(1984),Science 224:1431-1433]。因此，只要某序列编码具有合适NIa活性的天然或合成蛋白质，那么它就包括在本发明范围之内。
本领域中的熟练技术人员可以容易地由序列ID2经反向工程制得本发明编码NIa的基因。
应当指出的是，由于基因密码的简并性，任何给定的反向工程操作的序列都不一定与来自相同肽的任何反向工程操作的互补序列完好或充分杂交。这是本领域中熟练技术人员预计之中的共同因素。并且任何给定序列的简并性经常是很宽的，以致于很难合成一个甚至很短的互补寡核苷酸序列作为天然产生之寡核苷酸序列的探针。
密码子的简并性是这样的，例如，对于大多数经常出现的氨基酸会有4个或更多个可能的密码子。因此，对于任何特定肽的可能的编码序列的数量可随着残基的数量呈指数增加。鉴于此，本发明NIa的可能的编码序列数会有6位或超过6位数。尽管如此，还是要根据相关表达系统来平衡G+C的含量。而且还应考虑到一些其他因素如用于相关表达系统的密码子频率。
如上所述，杂交可能不是表示序列同源性可靠指征，然而，与序列ID1表现有50％以上，较好70％，最好80％的同源性一般是优选的。在每种情况下，都应是编码所定义的蛋白酶。
本发明还包括了前导序列编码的蛋白酶上游的可能应用。这样可使得融合蛋白质进入宿主外环境，并在培养上清中收集之。然后使收集到的外在化融合蛋白质自身消化，并收集多肽。作为这种信号序列，可以使用任何合适的序列，尤其是已为特定表达系统特殊制备的序列。
本发明还包括了含有本发明序列的载体。
用于本发明的载体的一般性质对于本发明来说并不十分重要。一般来说，合适的载体和表达载体以及其构建对于本领域中熟练技术人员来说是显而易见的，并且可以准确地根据操作者要使用该序列达到的目的，如克隆或表达，来选择适当载体。
合适的表达载体可以是基于噬菌体或质粒的载体，尽管可以对它们进行工程化改造以使适应于其它宿主，但二者一般都是宿主特异性的。其它合适的载体包括粘性质粒(Cosmids)和反转录病毒以及任何其他的载体，它们对于特定系统可以有，也可以没有特异性。合适的控制序列，如识别序列、启动子、操纵基因、诱导基因、终止子和调节表达中基本的或有用的其它序列，对于本领域中的熟练技术人员来说是显而易见的，它们可以是与CYVV或所用载体相关的那些序列，或者是其它合适来源的序列。可以以任何合适的方式对载体进行修饰或基因工程化改造。
序列ID2代表了编码完整NIa的足够序列。可以加入所需要的终止子，启动子和其他的这类控制序列，例如，以有利于与合适载体的连接，或表达，或二者兼有之。
可以容易地将编码本发明NIa的DNA片段，与编码裂解序列的任何片段及编码多肽的片段一起插入到任何合适的载体中。理想的是，接受载体含有利于插入的合适的限制性位点，但是也可以利用例如钝端连接，但是这可以导致在开放阅读框架上及插入方向上的不确定性。在这种情况下，当然要对转柒载体转化的宿主进行检测，以选择具有插到正确方向和正确ORF中之必要片段的载体。为了确保该片段位于正确的ORF中，理想的是创制一个序列a)，b)和c)的构建体，然后将其直接插入到载体中，从而减少了获得所需表达载体的不确定性。本领域中的熟练技术人员根据所需的表达系统可以选择到合适的载体。
经用例如所获得的质粒转化大肠杆菌(E.coli)，用氨苄青霉素抗性或其他合适的工具选择转化体，加入色氨酸或其他合适的启动子诱导物(如吲哚基丙烯酸)，可以表达所需要的融合蛋白质。可经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)来分析表达程度[Laemmli et al.,Nature,(1970),227,PP,680-685]。
还需指出的是，如果使用另一种载体时，则使用任何合适的选择标记物，或其他的选择方法，和/或使用任何所需的或方便的合适启动子都是同样可被接受的。
培养之后，如果要从宿主细胞中收集融合蛋白质，则要适当地收集转化体细胞、破碎细胞(如用超声波)并沉淀细胞碎片。破碎也可以是利用酶消化技术，如使用纤维素酶，或者使用某种试剂如玻璃珠振荡，但一般优选超声处理破碎方法(因该方法不需要其他的试剂)。对所得到的上清分析其多肽活性，并通过SDS-PAGE确定裂解产物。
常规蛋白质纯化方法适合于获得表达产物。
通过从三叶草黄色叶脉病毒中分离RNA基因组来制备本发明的DNA[Uyeda,I.et al.(1975)Ann.Phytopath.Soc.Japan41:92-203]。合适的CYVV来源是ATCC NO.PV123。在任何情况下，三叶草黄色叶脉病毒可以限定为能够引起蚕豆坏死的病毒。
从被感染植物中纯化的CYVV颗粒中获得基因组RNA，然后进行反转录并用已知方法制备双股cDNA。
为了确定病毒是否为CYVV相同毒侏的突变体或变异体，序列同源性是一种好的标志。许多类型的马铃薯Y病毒是已知的，它们在致病性方面各不相同。一种已知病毒是否构成该家族的分离的成员，是基于病毒衣壳蛋白的血清学关联及氨基酸序列的同源性。因此，具有分享90％同源性之一级氨基酸序列的病毒被认为是相同毒株，而具有分享低于70％同源性之一级氨基酸序列的病毒则被认为是不同的家族成员[Shukla,D.D.and Ward,C.W.(1989),Arch.Virol.106:171-200]。根据本发明中所用CYVV之衣壳蛋白质的各种特性[Uyeda,I.et al.(1991),Intervirol.32:234-245]，此CYVV被鉴别为马铃薯Y病毒家族的一个独立成员。因此，任何具有90％或更多的衣壳蛋白质一级氨基酸序列同源性的病毒，或任何用抗CYVV抗血清(如ATCC NO.PVAS-123：三叶草黄色叶脉病毒抗血清)经ELISA检测呈阳性的病毒，均被限定为是三叶草黄色叶脉病毒的毒株。
CYVV能够在其上面生长的各种植物品种包括：普通云扁豆，蚕豆和Pisum Sativum，但是优选蚕豆，尤其是蚕豆培育品种Wase-Soramame。
纯化病毒颗粒的优选方法包括在适合的缓冲液中将被感染之植物的叶子制成匀浆并挤压，然后用有机溶剂如氯仿提取，反复差速离心，然后再进行蔗糖密度梯度离心。
确定如此获得的病毒颗粒是否为CYVV的一种方法是在电子显微镜下检查该病毒颗粒。另一种方法是将病毒颗粒与蚕豆一起培育以观察是否有症状出现。
从病毒颗粒中提取基因组RNA的合适方法包括硫氰酸鈲/苯酚法，硫氰酸鈲/三氟铯法和苯酚/SDS方法。但是，我们优选使用碱性蔗糖密度梯度离心法[Dougherty,W.G.and Hiebert,E.(1980)Virology 101:466-474]。
然后可在一无细胞翻译体系中检验按上述方法获得的RNA，以确定它的确能编码蛋白酶。经监测溶解产物中收获之产物的分子量的改变，即可确定当RNA不只编码总翻译产物中的蛋白酶时，产物的自溶(自身消化)现象。例如可借助抗衣壳蛋白质抗体来进行这一监测。
如果需要，可以利用抗衣壳蛋白质抗体，例如，将被翻译的基因组RNA注射到爪蟾卵母细胞中[Gurdon,J.B.(1972),Nature 233:177-182]，或利用兔网织红细胞或麦胚溶解产物系统[Schleif,R.F.and Wensink,P.C.(1981),“Practical Methods in Molecular Biology”Spring-Verlag,N.Y.]以在不同时间监测翻译产物的产生。
可利用如此获得的基因组RNA作为模板，用反转录酶合成单股DNA，再通过下述的标准方法由单股cDNA合成双股cDNA(ds-cDNA)。合适的方法包括S1核酸酶法[Efstratidiatis,A.et al.(1976).Cell 7:279-288；Okayama,H.and Berg,P.(1982),Mol.Cell.Biol.2:161-170和其他文献]、Land法[Land,H.et al.(1981)Nucleic Acids Res.9,2251-2266]和O.Joon Yoo法[Yoo.O.J.et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79,1049-1053]。在各种选择中，我们优选Gubler-Hoffman法[Gubler,U.and Hoffman,B.J.(1983),Gene 25:263-269]。
可将如此获得的ds-cDNA结合到克隆载体，如质粒或λ噬菌体中，然后将所得到的重组载转化到微生物如大肠杆菌，尤其是E.coli DH5α菌株中。按本领域中公知的技术，利用其对抗菌素，如四环素或氨苄青霉素的抗性来选择转化株。
可以利用Hanahan方法[Hanahan,D.(1983),J.Mol.Biol.166:557-580]实现转化，其中将重组DNA载体导入到已经用氯化钙、氯化镁或氯化铷处理而处于感受态的细胞中。
选择具有NIa DNA之转化株的合适方法如下所述。
(1)用探针筛选
如果希望从野生型CYVV开始，那么分离合适RNA的一种方法是利用cDNA探针，条件是NIa的氨基酸序列已经被阐明(所使用的序列部分可以来自NIa的任何区域)。为此，合成与相关氨基酸序列相对应的寡核苷酸。一般来说，所选择的氨基酸序应包括尽可能少的简并性，否则必须利用几种可能的密码子生产几种探针。在这种情况下，考虑到密码子利用频率因素可能会有所帮助。或者，可考虑多个核苷酸序列，并可以用次黄嘌呤核苷替代变化的核苷酸。用放射性同位素如32P,35S或生物素标记探针。用放射标记的探针将变性的质粒DNA固定到硝化纤维素滤膜上以检测转化体毒株，可通过放射自显影检测出阳性克隆。
(2)使用PCR探针
在此方法中，合成来源于与部分已知氨基酸序列相对应的有意义链和反义链的寡核苷酸，并进行聚合酶链反应[Saiki,R.K.et al.(1988),Science 239,487-491]。可以将它们联合使用用于扩增编码NIa的DNA片段。通过反转录已知编码NIa的病毒基因组RNA获得的cDNA是合适的模板DNA。用32P,35S或生物素标记如此制备的DNA片段，用该探钟进行菌落杂交或噬斑杂交以选择有用克隆。
(3)根据在动物细胞中的外源性产生进行筛选
该方法包括培养转化体毒株以扩增基因，然后将该基团转染到动物细胞中(一般使用处于复制感受态和含有转录启动子区的质粒，或使用可被整合到适当染色体中的质粒)，以表达由该基因编码的蛋白质。可通过测定相关活性来选择转化株。
(4)使用抗NIa抗体进行选择
从用CYVV感染的植物中制备抗核包涵体(NIa和NIb)的抗体，或在合适的系统中制备抗由该表达载体产生之蛋白质的抗体。这种抗体，或其抗抗体能够检测出所需的NIa或有意义的转化株。
(5)选择性杂交翻译系统
如上所述，使转化体cDNA与来源于表达NIa之细胞的mRNA杂交，解离结合到cDNA上的mRNA并回收之。在翻译系统中将收集的mRNA翻译成蛋白质，例如，将其注射到爪蟾卵母细胞中，或注射到兔网织细胞溶解产物或麦胚溶解产物这样的无细胞体系中。通过检查NIa活性或利用抗NIa抗体检测NIa，来选择有意义的转化株。
可用已知方法[参见Maniatis,T.et al.(1982),“Molecular Cloning A Laboratory Manual”Cold SpringHarbor Laboratory,N.Y.]从有意义的转化株中获得编码CYVV NIa的DNA。例如，从细胞中分离出与载体DNA相对应的一部分，并从所说的质粒DNA上切下编码所说蛋白质的DNA区域。
可以利用，例如，Maxam-Gilbert化学修饰方法[Maxam,A.M.and Gilbert,W.(1980),“Methods in Enzymology”65:499-276]，或借助例如使用M13噬菌体的双脱氧核苷酸链终止法[Messing,J.and Vieira,J.(1982),Gene 19:269-276]来完成对所获得之DNA的序列测定。
近年来，荧光技术倾向于替代较为危险的放射性同位素测定DNA序列。另外，当前一般可通过机机器人在计算机控制下完成双脱氧核苷酸链终止法。用于电泳后阅读碱基序列的系统越来越丰富，这方面的例子包括“CATALYST 800”测序机器人和373A DNA测序仪(Perkin-Elmer Japan Applied Biosystems)。这些系统使得DNA碱基序列测定方法即快捷又安全。
一般所选择的本发明的载体能够在原核或真核“标准细胞”中表达。另外，通过将一合适的启动子和用于表型表达的序列导入到载体中，可以使该基因在相配的宿主细胞中得以表达。
合适的原核宿主包括大肠杆菌和枯草杆菌。为了进行相关基因的表型表达，载体可以适当地含有来源于与宿主相容的种的复制子。在大肠杆菌中，质粒可以含有复制原点和启动子序列，如Lac或UV5。能够将基于表型特征(表现型)的选择性赋予被转化细胞的载体是优选的。
经常使用大肠杆菌作为宿主，并且优选衍生于大肠杆菌菌株K12的JM 109菌株。目前用于大肠杆菌的载体一般选自pBR322或pUC质粒系列，但是也可以按照需要使用其他的菌株和载体。适合于大肠杆菌的启动子包括乳糖启动子(Lac)、色氨酸启动子(trp)、色氨酸—乳糖启动子(tac)，脂蛋白(lpp)启动子、lambda(λ)PL启动子(来自λ噬菌体)和多肽链延长因子Tu(tufB)启动子，但是本发明并不限于这些启动子。
枯草杆菌的合适菌株包括207-25菌株。合适的载体包括pTUB228[Ohmura,K.et al.(1984),J.Biochem.95:87-93]和其他载体。合适的启动子是枯草杆菌α淀粉酶基因的调节序列。这是一个能够将信号肽序列(来源于α淀粉酶)用于细胞外分泌的适当例子。
如果希望在真核细胞中表达融合蛋白质，则可以使用脊椎动物、昆虫、酵母、植物等的细胞。优选性脊椎动物细胞是COS细胞，尤其是COS-1细胞[例如参见Gluzman,Y.(1981),Cell 23:175-182],或二氢叶酸还原酶缺陷性中国仓鼠卵细胞系(CHO)[Urlaub,G.and Chasin,L.A.(1980),Proc.Natl.Acad.Sci.USA77,4216-4220]，但本发明并不局限于这些宿主细胞。如上所述，COS细胞适合于用作脊椎动物宿主细胞，而且这些细胞可以作为实施例。含有SV40复制子的表达载体能够在COS细胞中自动复制，并且这些载体还具有转录启动子、转录终止序列及一个或多个切接位点。可以借助几种方法，如DEAE-葡聚糖法[Luthman,H.and Magnusson,G.(1983),Nucleic AcidsRes.11,1295-1308]、磷酸钙—DNA共沉淀法[Graham,F.L.and van der Eb.A.J.(1973),Virology 52,456-457]和电穿孔法[Neumann,E.etal.(1982),EMBO J.1,841-845]，用含有所需DNA序列的表达载体转化COS细胞。
如果用CHO细胞作为宿主细胞，则应当使用能够表达可提供G418抗性之neo基因的载体。携带这种标记物的合适载体包括pRSVneo[Sambrook,J.et al.(1989)；“MoleculorCloning-A Laboratory Manual”,Cold Spring HarborLaboratory,NY]和pSV2-neo[Southern,P.J.and Berg,P.(1982),J.Mol.Appl.Genet.1,327-341]。然后可根据它们对G418的抗性来选择转化体。
可用常规方法培养选择的转化体，并且在本发明的第二个方案的情况下，在细胞内和细胞外都产生多肽。可以根据所使用的宿主细胞，从常用培养基中选择合适的培养基。例如，对于COS细胞来说，必须向培养基中加入含有血液成份，如胎牛血清的培养基，如RPMI-1640培养基或Dulbecco氏修改的Eagle氏培养基(DMEM)。
如果研究者选用昆虫细胞，那么可以使用来源于Spodopterafrugiperda的细胞[Smith,G.E.et al.(1983),Mol.Cell.Biol.3:2156-2165]。
合适的酵母包括贝克氏酵母(Saccharomyces Cerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe)。
合适的植物细胞包括来源于烟草(Nicotiana tabacum)和Oryza sativa的植物细胞。
应当指出的是，上面列举的宿主是本领域中已知的标准宿主，本领域中熟练技术人员能够在这些和其他宿主中适当地选择所需要者。
适用于脊椎动物细胞的表达载体包括在待表达之基因上游有一启动子的那些载体，而且所说载体中还带有RNA切接位点与聚腺苷酸化位点，以及转录终止序列，如果需要还带有复制原点。这种表达载体的合适例子是pSV2dhfr，它带有SV40早期启动子[Subramani,S.et al.(1981),Mol.Cell.Bio.,1:854-864]。
适用于昆虫细胞的表达系统包括Spodoptera frugiperda的培养细胞。合适的表达载体在所要表达基因的上游带有杆状病毒多角体启动子，并且还带有聚腺苷酸化位点和同源重组所需要的部分AcMNPV(Acutographa Californica核多角体病病毒)基因组。其中一个例子是p BacPAK8[Matuura,Y.et al.(1987),J.Gen.Virol.68:1233-1250]。
对于真核表达，一般使用酵母，如贝克氏酵母(S.cerevisiae))。适用于酵母的表达载体包括醇脱氢酶启动子[Bennetzen,J.L.andHall,B.D.(1982),J.Biol.chem.257:3018-3025]、酸性磷酸酶启动子[Miyahara,A.et al.(1983),Proc.Natl.Acad.Sci.USA80,1-5]，或羧基肽酶Y启动子[Ichikawa,K.et al.(1993),Biosci.Biotech.Biochem.57:1686-1690]。在这种情况下，也可以使用来源于羧基肽酶Y的信号肽序列，以使表达产物分泌到细胞外空间。
适用于植物的表达载体，例如包括pBI121，它具有一个35S启动子[衍生于花椰菜花叶病毒的早期启动子)、来源于Agrobacteriumtumefaciens的蓝曙红(nopaline)合成基因的多聚腺苷酸化序列及Agrobacterium tumefaciens基因转移序列[Jefferson,R.A.et al.(1987),EMBO J.6:3901-3907]。可用Agrobacteriumtumefaciens感染和电穿孔等方法将这些载体导入到植物细胞中。
质pKK 388-1(由Clonetech.Co.生产)具有trc启动子并适用于大肠杆菌。该表达载体能够在衍生于大肠杆菌菌株K12的菌株，如JM109菌株中自动复制。可通过如上所述的已知方法很容易地将此载体导入到大肠杆菌中。将如此获得的菌株接种到培养基上，如已知的LB培养基中，并培养一段时间。
然后经加入，例如异丙基-β-吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导启动子，以激活trc启动子。进一步培养之后，破碎细胞(如超声波破碎)并从细胞中提取所表达的蛋白质。如果希望产生的蛋白质在N末端带有脯氨酸(PrO)，则一般适于使用大肠杆菌作为宿主。
基于上述的描述，并在必要时考虑附带的实施例，可根据多肽的物理和化学特性，用已知的方法从适当被转化细胞的培养物中分离和纯化含有所需多肽的部分。这些适当的方法包括用蛋白沉淀剂处理、超滤、各种层析法[如分子筛层析(凝胶过滤)，吸附层析、离子交换层析、亲和层析和高效液相层析(HPLC)]、透析以及上述方法的联合使用。
为了确定所表达的NIa蛋白质是否具有所必需的蛋白酶活性，可使纯化的NIa蛋白质与含有该蛋白酶裂解序列的底物蛋白质，例如编码融合之基因的表达产物反应，该融合蛋白质包括了病毒衣壳蛋白(NIa的天然底物)和核包涵体b(NIb)[Dougherty,W.G.et al.(1988),EMBO J.7:1281-1287]。可以将这种融合蛋白质从病毒基因组cDNA中分离出来，并插入到表达载体中。然后将所得到的表达载体导入到合适的宿主细胞中以产生融合蛋白质。按已知方法，如用蛋白质沉淀剂或层析法处理所获得的融合蛋白质，即可分离并纯化之。
使如此分离和纯化的底物蛋白质与所说蛋白酶在合适的缓冲溶液中，于合适温度下反应，并回收反应产物。对回收的反应产物进行电泳分析，并用抗衣壳蛋白抗体进行Western印迹分析，根据谱带迁移的差别检测蛋白酶活性。在此方法中，也可以使用含有合适裂解序列的合成寡肽。
不需纯化便可测出本发明蛋白酶的蛋白水解活性。因此通过连接蛋白酶基因的序列和相同的开放阅读框架、启动子如trc启动子的下游，以及蛋白酶裂解序列的上游即可测出其活性。如果表达产物中的蛋白酶有活性，就可通过Western印迹法观察到比融合蛋白迁移率高的带。
通过从凝胶中回收已被观察到裂解的带，并通过常规的方法学分析其氨基末端序列就可确定蛋白质是否在所需肽键处裂解。
可以产生预期产生的该蛋白质，例如可以作为融合蛋白质，如与谷胱甘肽S-转移酶蛋白质，一起形成的融合蛋白质，和然后可用本发明的NIa在体外裂解接头序列。作为一种选择，所需的蛋白质可以在宿主细胞中直接表达如作为与所说的蛋白酶形成的融合蛋白质，所需的蛋白质则可经自身裂解而制得。
如有必要，可传用上述方法容易地以高产率和高纯度产生NIa，并可将如此得到的本发明的重组NIa用作蛋白酶。
如果必要可以化学合成本发明的DNA，然后可用常规方法学，如亚磷酸三酯法[Hunkapiller,M.et al.(1984)；Nature 310:105-111]或用核苷酸的化学合成法[Grantham,R.et al.(1981),Nucleic Acids Res.9:r43-r74]制备之。如有必需，可用常规方法对这些核苷酸序列进行部分修饰，如用位点特异性诱变法，使用含有编码所需修饰的合成的寡核苷酸作为引物[Mark,D.F.et al.(1984),Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81:5662-5666]。
如上面可提到的，例如可使用由[α-32P]dCTP标记的探针，以随机引物法[Feinberg,A.P.and Vogelstein,B,(1983)Anal.Biochem.132:6-13]，或缺口翻译方法[Maniatis,T.et al.(1982),in″Molecular Cloning A Laboratory Mannual″Cold SpringHarbor Labora-tory.N.Y.]确认杂交。用常规方法使DNA固定到固相上，例如吸收到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后加热或用紫外线照射。再将固相常规浸没在预杂交液中，其中含有6×SSC,5％Denhardt溶液和0.1％SDS，并在55℃下保温4小时或更长时间。然后向预杂交溶液中加入预先制备的探针至最终比活性为1×106cpm/ml，并将混合物在60℃下保温过夜。然后在室温下用6×SSC将固相反复洗5次每次5分钟，再在57℃下洗20分钟，并经放射自显影来确定DNA是否已杂交。需认识到这只是一个特定实例，使用其他方法同样是可能的。
可用细胞内直接切割法或细胞外切割法来制备所需的蛋白质。细胞内直接切割法
通过一裂解序列，较好是Gln-Gly,Gln-Ser或Gln-Ala将编码NIa的DNA与编码所需蛋白质的DNA相连接，所得的DNA编码一融合蛋白，并被插入到含有启动子和终止子的载体中，然后在适当的宿主细胞中得以表达。被表达的融合蛋白质通过蛋白酶活性自身裂解，从而得到一个，其中Gly,Ser或Ala被一肽键连接与有用蛋白质之N-末端上的肽。特别优选的表达蛋白质是IL-11。
可以按上述方法，根据需要从所得蛋白质，的N-末端上裂解，任何残基，例如使用氨肽酶P来裂解N-末端的Pro残基是合乎需要的。
一些表达系统已经有氨肽酶P存在。然而，如果不存在氨肽酶P，就需要在原位裂解N-末端氨基酸残基，然后可将氨肽酶P的表达载体导入宿主细胞。氨肽酶P是已知蛋白质，此酶基因序列是本领域技术人员容易得知的。
当需要得到N-末端以Pro开始的蛋白质时，通常延长培养期限以使细胞的氨肽酶P起作用是有利的。
如上所述，可借助脯氨酸亚氨肽酶(3,4,11,5)的催化作用除去N-末端的Pro残基，它可经内源表达或由外源表达载体表达(此酶是已知蛋白质，而且此酶的基因序列是本技术领域人员容易利用的)。另外，可在从表达系统中回收后，例如融合蛋白质从细胞中分泌出来后，再裂解脯氨酸残基。
因此可以看出，本发明允许生产具有任何预期N末端残基的蛋白质。
本发明的序列可产生含有Ala N-末端的多肽，然后可通过丙氨酸氨肽酶(3,4,11,14)的催化作用除去该丙氨酸残基；丙氨酸氨肽酶是已知的酶，且其中基因序列是本领域技术人员容易利用的。此技术还允许生产具有自由选择之N末端残基的多肽。
可用已知方法分离和纯化所需蛋白质。细胞外切割法
可将适当的DNA与载体结合，然后将此载体包括于适当的表达系统中来产生NIa。可使用离子交换柱、凝胶过滤柱或反相柱等纯化由被转化细胞表达的NIa。另外，NIa亦可被表达为与另一多肽，如谷胱甘肽-S-转移酶或麦芽糖结合蛋白质相融合的蛋白质，然后可分别用谷胱甘肽柱或麦芽糖柱分离并纯化之。用肠激酶或Xa因子切割纯化的产物后，NIa即可被纯化并使用。
同时，制备含有NIa识别序列(裂解序列)的蛋白质前体。它可存在于指定的位置，或者该蛋白质可通过适当接头(裂解序列)，连接如谷胱甘肽-S-转移酶或麦芽糖结合蛋白质连接，而成为融合蛋白质的一部分。可在适当缓冲溶液中使前体与NIa反应，在体外裂解前体。如有必要，可按上述方法除去N末端的氨基酸残基。
同前所述，可用已知方法分离和纯化所得到的蛋白质。
有关本发明的第二个具体体现，我们相信自然发生的还原肽具有序列ID12所示的序列，它由526个氨基酸组成，带有N-末端缬氨酸残基。
据信自然存在的编码此肽的DNA具有序列ID11中70至1647位的核苷酸序列。
本发明的肽可以还原氧化的谷胱甘肽和二氯靛酚。这是对此肽准确的描述，但在某种程度上有些累赘，以致本发明的肽在本文中也称为KM31-7肽或蛋白质。
KM31-7蛋白质来源于体内，也可是它的突变体或变异体，因而与其毒性和/或抗原性有关的问题很少。
在本发明的第二个具体体现中，据信具有序列ID12中序列-23至526的多肽是KM31-7蛋白质的前体。因而本发明也包括此前体及其突变体和变异体，以及编码它们中的任一个的多核苷酸序列。
下面有关本发明第二个具体体现的讨论是必要的。应理解上述与CYVV NIa有关的许多前体对于分离、克隆和表达编码本发明肽的DNA也是适用的。差别基本上是从这样的事实中产生的，即CYVV NIa是植物病毒蛋白质，而本发明的肽是哺乳动物蛋白质。现在将描述用基因重组技术从哺乳动物细胞中得到已表达的特定多肽的一般步骤。
用已知方法可得到编码KM31-7肽的mRNA并将其反转录成ds-DNA。任何适当的哺乳动物细胞、细胞系或组织都可用作起始的mRNA的来源，但我们优选使用从人骨髓基质细胞分离的KM-102细胞系[Harigaya,K.and Handa.H.(1985),Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82,3447-3480]。
可使用不同的方法，如硫氰酸胍热酚法或者硫氰酸胍盐酸胍法从哺乳动物细胞中提取mRNA，但一般优选的是硫氰酸胍氯化铯法。
既然真核细胞细胞质中存在的mRNA中的大多数都已知具有3′末端的polyA序列，因而可利用此特性通过Oligo(d)纤维素柱吸附来影响哺乳动物mRNA的纯化。洗脱出的mRNA可进一步通过如蔗糖密度梯度离心的方法来分级分离。
可在适当系统如Xenopus laevis卵母细胞系统、兔网织细胞系统或麦胚系统(文献同上)中翻译mRNA，来进一步证实得到的mRNA确实是编码所需肽的。
按下述方法完成表达产物之还原活性的测定。ⅰ)二氯靛酚还原活性的测定
此测定方法由Beinert.H.在″Methods in Enzymology″(1962),5,546中作过描述。
50μm二氯靛酚(Sigma)制剂是用20mM磷酸盐缓冲液和0.5MNaCl(pH7.8)配制的。将1ml此制剂放入小杯中(SARSTEDT,10×4×45mm)，再加入检测样品。将15μl溶于同样缓冲液的1mM NADPH(Boeringer-Mannheim)在室温下加入小杯以开始反应。
经监测氧化态二氯靛酚在600nm处，吸收的降低或者经监测NADPH在340mm处吸收的降低测出还原酶活性。(ⅱ)氧化态谷胱甘肽还原活性的测定
该检测法的方法学由Nakajima,T.等人在″New BasicExperimental Methods in Biochemistry(6)-Assay MethodsUsing Biological Activity″,3-34中作过描述。
10mM氧化态谷胱甘肽制剂(Boeringer-Mannheim)是用20mM磷酸盐缓冲液和0.5M NaCl配制并用调pH至7.8。在小杯(10×4×4mm)中先放入试样。再放入15μl此制剂然后将15μl用相同缓冲液配制的1mM NADPH在室温下加入小杯中以开始反应，可经监测340nm处吸收的降低来测定谷胱甘肽还原酶活性。
可用如上所述的不同的方法从mRNA制得ds-DNA。它们包括S1核酸酶方法、Land方法和O.Joon Yoo方法(文献同上)，但在此例中我们优先使用Okayama-Berg方法[Okayama H.and Berg.P.(1982).Mol.Cell.Biol.,2,161-170]。
然后可将如此得到的ds-cDNA掺入克隆载体中，并将所得的重组质粒被导入上述大肠杆菌中。
可用不同方法筛选到含有编码本发明肽之所需DNA的菌株，例如使用上述与筛选含NIa DNA转化体有关并作了适当的修改的方法。例如，如果用PCR来制备探针，则合适的模板DNA可以是上述的CDNA或者是基因组DNA。
在本发明第二个具体体现中，可以经初步筛选来减少所要检测之菌株的数目。初步筛选是可能的，因为本发明的肽与细胞有关，以致它的mRNA细胞因子的mRNA共同享有AUUUA特征部分[Shaw,G.and Kamen,R.(1986),Cell 46,659-667]，因此在初步筛选中可以使用与AUUUA特征部分互补的合成的寡核苷酸探针，然后通过测定哺乳动物细胞中外源蛋白质的产量来进行筛选。
然后可从载体上切掉编码该肽的DNA，并用上述与NIa DNA有关的相似方法来测定序列。另外，按上述方法将DNA片段引入适当的载体中，用以转化原核或真核宿主。
KM31-7蛋白质可以单独使用，也可与一种或多种其他治疗药物联合使用，用于预防和治疗由氧化的压力导致或与之相关的病理状态，或者由激活的氧导致的任何疾病。这些状态包括但不只限于动脉硬化、糖尿病、局部缺血(如再灌注障碍、缺血性心脏病、离缺血和缺血性肠炎)、浮肿、血管渗透性过高、炎症、胃粘膜病变、急性胰腺炎、Crohn′氏病、溃疡性结肠炎、肝病、Paraquat氏病、肺气肿、化学致癌、致癌性转移、成人呼吸困难综合症、弥漫性血管内凝血(DIC)、白内障、早熟性视网膜病、自身免疫疾病、卟啉病、溶血症、地中海贫血症，Parkinson氏症、Alzheimer氏病、癫痫、紫外线照射病、放射病、冻伤和烧伤。
本发明第二个具体体现的药用组合物含有药学上活性量的KM31-7肽及其药学上可接受的载体。
本发明的组合物可以不同的方式给药，如以片剂、胶囊、粒剂、粉末和糖浆剂的形式口服给药，或者以注射液、输注液和栓剂的形式经肠道外途径给药。其它适当的给药方式对本技术熟练人员来说是显而易见的。
当本发明的肽以注射或输注的方式给药时，可将此肽的无热原制剂制成适当的药学上可接受的水溶液以供肠道外给药。符合pH、等渗性和稳定性要求的多肽溶液的制备是本领域技术人员熟知的。
对本领域技术人员容易确定给药的剂量和形式，所考虑的标准包括病人状态、体重、性别、年龄、饮食、其他感染的严重程度、给药时间以及其他临床上重要的因素。通常正常成年人口服剂量为每天约0.01mg至1000mg范围。此量在24小时之内可以以一次剂量给药或者分几次亚剂量给药。当此肽经肠道外途径给药时，可通过皮下、肌内或静脉内注射，每次给药约0.01mmg至约100mg。
为了完全鉴定KM31-7蛋白质，得到此蛋白质特异性的抗体是重要的，这种抗体对于检测KMα31-7蛋白质的功能、定量、纯化以及组织分配都有用处。
因此，经给实验动物接种由被PMAL31-7转化的大肠杆菌所产生的多肽，再将抗体生成细胞与骨髓瘤细胞一起制备杂交瘤，再筛选并克隆杂交瘤即可得到产生抗-KM31-7抗体的杂交瘤。由所得到的杂交瘤产生的抗体可识别从被PSRα31-7转化的COS-1细胞的无血清培养物上清液中得到的多肽。
因此本发明进一步提供了抗体，较好是单克隆抗体或其等同物，它可特异性地识别KM31-7蛋白质，或KM31-7蛋白质的突变体或变异体。
本发明的抗体是针对KM31-7蛋白质或其突变体或变异体的。应认识到此抗体可为多克隆或单克隆，但更好是单克隆形式的。这是因为存在通常与多克隆抗体有关的非确定性。为保持结果的一致性，不论是用于治疗还是用于纯化KM31-7蛋白质，都优选使用单克隆抗体。
可由任何适当的动物制备本发明的抗体。然而，当抗体是非人抗体的，就会产生抗原性问题。在这方面，有可能建造出与人抗体更接近相似的抗体。可用本领域中已知的方法，经化学或遗传修饰可以达到这一目的。
本发明也设想了抗同种异型抗体，即那些识别位点可识别上述抗体之识别位点的抗体。这种抗体可通过给适当的动物使用最初的抗体来制备这类抗同种异型抗体。值得注意的是，此过程与相应于最初的或抗同种异型抗体的各代都可趋于无穷尽地传递下去。然而如果每一代不能筛选出可正确识别的抗体，那么特异性实际上就会消失。抗同种异型抗体是有用的，例如用于检测游离的抗KM31-7抗体。
本发明也设想了能够识别KM31-7蛋白质的本发明抗体的片段，以及携带有这种抗体之识别位点的分子。这种片段和分子在本文中被称作本发明抗体的″等同物″。
用质粒pMAL 31-7转化E.coli，纯化表达产物并用于免疫实验室动物。将被免疫的动物的脾细胞同骨髓瘤细胞融合以制备杂交瘤，即可得到产生高浓度和有良好稳定性之抗KM31-7单克隆抗体的克隆(此克隆被命名为MKM150-2并被保藏于FermentationResearch Institute of the Agency of Industrial Scienceand Technology,Japan，保藏号为FERM BP-5086)。此克隆的培养物在其上清液中产生抗-KM31-7的单克隆抗体。
将得到的抗-KM31-7单克隆抗体与通过在E.coli中引入和表达PMAL31-7得到的融合蛋白质一起发生免疫化学反应。此抗体也与从用编码KM31-7的cDNA转化的哺乳动物细胞培养物上清中得到的KM31-7蛋白质发生免疫化学反应。
为了产生单克隆抗体，一般还需接着完成下列步骤，它们包括：(a)纯化将被用作抗原的生物高聚物；(b)经注射抗原来免疫小鼠，在适当的时候通过取样和检查血液从脾脏制备抗体生成细胞；(c)制备骨髓瘤细胞；(d)将脾细胞与骨髓瘤细胞融合；(e)筛选可产生所需抗体的杂交瘤细胞群；(f)制备单个的克隆(克隆化)；(g)培养可大量产生单克隆抗体的杂交瘤，或如条件允许饲养被杂交瘤感染的小鼠；并(h)将所得单克隆抗体作为一标记的试剂来检测其生理活性或特性。
可参考上面所列的步骤来描述抗KM31-7单克隆抗体的生产。值得注意的是，没有必要再作详细精确地描述，而且有可能使用任何适当的步骤。例如，可以使用脾以外的抗体生成细胞和骨髓瘤，以及其他哺乳动物的抗体生成细胞和骨髓瘤。下述步骤代表了目前优选得到抗KM31-7单克隆抗体的方法。(a)抗原纯化
经在E.coli中表达pMAL31-7并纯化表达产物所得到的融合蛋白质是有效的抗原材料。被pMAL31-7转化的E.coliTB-1培养物需经异丙基-3-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导。然后使用直链淀粉树脂柱(New England Biolabs)以亲合层析法纯化被表达的融合蛋白质。从被pSRα31-7转化的COS-1细胞之无血清培养物上清液中纯化得到的KM31-7也是有效的抗原。(b)抗体生成细胞的制备
将从(a)中得到的纯化的融合蛋白质，与弗氏完全或不完全佐剂，或明矾等佐剂相混合，然后用得到的疫苗免疫实验室动物。实验动物优选BALB/C小鼠，因为大多数从小鼠中得到的有用的骨髓瘤都是从BALB/C小鼠中得到的。而且，这些小鼠的特性已经被研究的很详细。再者，如果抗体生成细胞和骨髓瘤都来自BALB/C小鼠，则所得到的杂交瘤即可在BALB/C小鼠的腹腔中生长。因此使用BALB/C小鼠可提供许多便利，使得单克隆抗体可从腹水中轻易获得而无需使用复杂的操作步骤。然而，本发明并不局限于使用BALB/C小鼠。
抗原可以任何适当的形式给药，如皮下注射、机腹膜内注射、静脉内注射、皮内注射或肌肉内注射，优选皮下注射或腹膜内注射。
免疫可经一次或有适当间隔期的多次给药而实现。优选的方案是免疫后再进行一次或多次间隔1至5周的加强免疫。如果定期测定免疫动物血清中抗所说抗原的抗体效价则可改善后来步骤的结果。具有很高抗体效价的动物被用来提供可产生抗体的细胞。较好在最后一次免疫后3至5天从动物体内分离得到用于继后融合的抗体生成细胞。
检测抗体效价的方法包括，例如可使用放射性同位素免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、荧光抗体技术和被动血细胞凝集法等多种不同的已知技术，但因其敏感性、速度、准确性和自动化潜力而优选RIA和ELISA。
ELISA的适当形式如下所述。将抗原吸附于固相上，再将固相表面暴露于与抗原不相关的蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)中以封闭没有吸收抗原的表面任何区域然后洗固相，再将它暴露于最初抗体(如小鼠血清)的系列稀释样品。样品中任何抗-KM31-7的抗体都与抗原结合。洗涤后加入酶联的抗小鼠第二抗体，以允许结合已被结合的小鼠抗体，洗涤后加入酶底物，通过检测参数，如由底物分解引起的颜色改变来计算抗体效价。(溶液)(c)骨髓瘤细胞的制备
所建立的小鼠细胞系被优选用作骨髓瘤细胞的来源。此细胞系的合适例子包括骨髓瘤细胞系P3-X63 Ag8-U1(P3-U1)，它来自源于BALB/C的8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠[Current Topics in Micro-biology and Immunology,81,1-7(1978)]、以及P3-NSI/1-Ag4,1(NS-1)[Europear J.Immunology,6,511-519(1976)],SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269-270(1978)]、P3-X63-Ag8.653(653)[J.Immunology,123,1548-1550(1979)]和P3-X63-Ag8(X63)[Naturc256,495-497(1975)]。这些细胞系可以在适当培养基中作次级传代培养，如使用8-氮杂鸟嘌呤培养基(RPMI-1640培养基，含有8-氮杂鸟嘌呤、1.5mM谷氨酰胺、5×10-5M2-巯基乙醇、10μg/ml庆大霉素和10％小牛血清)、Iscovc氏改良的Dul bccco氏培养基(IMDM)或Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)。在细胞融合前3至4天，通过在正常培养基中，也即完全GIT[5.5ml MEM非必需氨基酸溶液(NEAA,Gibco)、27.5ml NCTC109(Gibco)、6ml青霉素一链霉素溶液(Sigma)和11ml谷氨酰胺在500mlGIT培养基(Wako PureChemicalIndustry)中的200mM溶液(Sigma)中进行传代培养，使细胞计数在融合当天增加到至少2×107个。(d)细胞融合
抗体生成细胞是血浆细胞和它们的前体淋巴细胞。它们可取自动物个体的任何适宜部位，如脾脏、淋巴结、外周血液或这些部位任何适宜的联合。然而最常用的是脾细胞。未次免疫后3至5天，从至少具有规定的抗体效价的小鼠中收获抗体生成细胞。将所得的抗体生成细胞与上述(C)中得到的骨髓瘤细胞融合。目前最常用的方法是使用聚乙二醇融合脾细胞和骨髓瘤细胞，这应归功于该化合物的相对低水平的细胞毒性以及容易处理。此方法按下述步骤进行。
将脾细胞和骨髓瘤细胞用培养基或磷酸盐缓冲盐水(PBS)充分洗涤并混合，以使脾细胞对骨髓瘤细胞的比率大约为5至10∶1，然后经受离心分离之。弃去上清并充分打破细胞团，然后在搅拌下加入聚乙二醇的混合溶液(PEG，分子量：1000至4000)。几分钟后，离心分离细胞。再弃去上清，在含有5至10ng/ml小鼠IL-6的适当量的完全GIT中悬浮沉淀的细胞，然后将其转移到培养板的小孔中。一旦证实各孔中有细胞生长，即将培养基换成HAT培养基(含有5至10ng/ml小鼠IL-6,10-6至10-3M次黄嘌呤，10-8至10-7M氨基蝶呤和10-6至10-4M胸苷的完全GTT)。(e)杂交瘤组群的选择
将培养板置于35至40℃的CO2恒温箱中温育10至14天在这段时间里，每隔1至3天加入培养基量一半的新鲜HAT培养基。
骨髓瘤细胞来自8-氮杂鸟嘌呤抗性细胞系，骨髓瘤细胞和仅含骨髓瘤的杂交瘤在HAT培养基中不能存活。然而，含有抗体生成细胞部分的杂交瘤，包括抗体生成细胞与骨髓瘤细胞的杂交瘤则可以存活。仅含有抗体生成细胞的杂交瘤将死亡，从而通过在HAT培养基中培养即可选择出由骨髓瘤细胞和抗体生成细胞组成的杂交瘤。
在那些可观察到杂交瘤克隆生长的小孔中，以HT培养基(其中氨基喋呤已从HAT培养基中除去)替代HAT培养基。除去一部分培养物上清液，并例如用ELISA检测抗KM31-7抗体的效价。
上述方法是就8-氮杂鸟嘌呤抗性细胞而言的，但也可以使用允许选择杂交瘤的其他细胞系。在这种情况下，通常所使用的培养基成分也应改变。(f)克隆
将来自(e)，已确定可产生抗KM31-7特异性抗体的杂交瘤转移到不同的平板上进行克隆。可使用不同的克隆方法，如接种法(其中杂交瘤经有限稀释分析，以使每孔只含一个杂交瘤)、软琼脂法(其中接种的克隆被软琼脂培养基接收)、接种法(其中用显微操作器移去单个细胞)和分拣器克隆法(其中通过细胞分拣器可分离个别细胞)。有限稀释分析因其简单易行而成为最常用的方法。
对于那些可不断观察到抗体的小孔，需例如通过有限稀释分析重复2至4次克隆。选择不断显示有抗KM31-7抗体产生的克隆作为要选择的杂交瘤。(g)通过杂交瘤培养制备单克隆抗体
将从(f)选出的杂交瘤培养于普通培养基中。通过使用大培养瓶或转瓶旋转培养得到大体积培养物。对细胞上清液进行凝胶过滤，再收集和纯化IgG部分即可得到抗KM31-7单克隆抗体。另外，杂交瘤也可在同系小鼠的腹腔内生长(例上面提到的BALB/C小鼠)或例如Nu/Nu小鼠。进行此步骤的简单方法是使用单克隆抗体制备试剂盒(例Pharmacia的MAbTrap GII)。(h)单克隆抗体的鉴定
可按下述方法鉴定从(g)得到之单克隆抗体的同种异型和亚类。可以使用的鉴定技术的例子包括Ouchterlony方法，ELISA和RIA。尽管Ouchterlony方法简单，但缺点是在单克隆抗体的浓度十分低时，必须进行浓缩。
如果使用ELISA或RIA，可将培养物上清液直接暴露于已吸附了抗原的固相。然后用IgG亚类的各型特异性的第二抗体鉴定亚类的类型。另外，可使用同种异型分型试剂盒(例如，Amersham的小鼠单克隆抗体同种异型分型试剂盒)。通过Folin-Lowry法或通过测量280nm处的吸收值可进行蛋白质定量[1.4(OD280)=1mg/ml免疫球蛋白]。
在相伴的实施例中，从被称为MKM150-2的杂交瘤得到的单克隆抗体被鉴定为IgG类同种异型，并被认定属于IgGl亚类。
按照本发明得到的单克隆抗体对KM31-7蛋白质有高度特异性。而且因为通过培养上面提到的杂交瘤可始终如一地得到高质量的单克隆抗体，所以它可被用来分离和纯化KM31-7蛋白质，并且利用抗原-抗体反应，以免疫沉淀法用所说的单克隆抗体分离和纯化所说的KM31-7蛋白质，也构成了本发明的一部分。
现参考所附的非限制性的实施例来举例说明本发明。所有溶液都是含水的和由去离子水制备的，所有百分数，除非另外说明者外都是指W/V。如果方法不是特别的，则都可在′Molecular Cloning-A Laboratory Manual″[第二版，Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),Cold Spring HarborLaroratoryPress]中找到。溶液和其它培养基的制备方法在下文标题为″培养基″的部分给出，而不在实施例中给出。在没有技术的实施例中提到的方法应在前面实施例的上下文中加以解释。A)CYVV的来源材料
将冷冻保存的三叶草黄叶脉病毒(clover yellow vein virus)[CYVV分离物No.30:Uyeda,I.et al.(1975),Am.phytopath.Soc.Japan 41:192-203]感染的叶加10倍体积的接种缓冲液磨碎。
使用已长出第二片成叶的Vicia faba,Cultivar Wase-Soramamefaba繁殖CYVV。在成叶上喷洒金刚砂(400目)，再用玻璃抹刀接种上面得到的液体。接种后约8至10天，被接种的叶已成了网眼状的花叶病状态，除去这片叶子以用作CYVV的来源。B)病毒的纯化
用含有3倍体积提取缓冲液的切碎机切碎上述(A)步骤中分离的叶。切碎后，在研钵用杵进一步磨碎叶。用装备有发动机的不锈钢搅动刀电机在室温下将所得制品缓慢搅拌1小时。然后通过双层纱布挤出液体制剂。
随后的所有步骤都在4℃下进行。
将粗提液与一半体积的氯仿混合，在Waring混合器中被混匀，随后将制剂在6000×g下离心15分钟。离心后收集水层，在这部分中加入聚乙二醇(PEG#6,000)至终浓度为4％V/V。
将得到的混合物在冰上搅拌1小时，再将其在冰上放置1小时。将由此得到的液体以6,000×g离心15分钟，作为含有病毒的部分回收沉淀物。将此沉淀物悬浮于含有0.5M尿素的50ml 10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，再与等体积的四氯化碳相混合，将所得制品剧烈搅拌5分钟，然后将制剂以3,000×g离心10分钟。再用Hitachi RP-30转子在4℃以30,000rpm将水相超速离心90分钟。所得片状沉淀物作为含有病毒的那部分被回收。
将片状沉淀物悬浮于含有1％Triton×100(PH7.4)的10mM磷酸盐缓冲液中，再将此悬液在4℃以8,000×g离心1分钟。使所得上清在10至40％蔗糖密度梯度柱管中被分层(40％:10ml,30％:10ml,20％:10ml,10％:10ml；已在4℃下的放置过夜；此柱已预先用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4))制备得到。一旦上清液在管内分层，即用HitachiPRS 25转予在4℃下以23,000rpm将其超速离心120分钟。
离心后，可使用装配有OD260nm检测器的分级分离器(ModelUA-2:由ISCO CO.制造)来分级分离庶糖密度梯度柱管。具有约20至30％蔗糖密度，在OD260nm处有吸收的部分即为含有病毒的部分。
用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)两倍稀释所回收的病毒部分，使用Hitachi RP-65转子在4℃以下40,000rpm将其离心90分钟。将所得沉淀物重新悬浮于10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中以产生纯化的病毒溶液。c)病毒RNA的分离
CYVV的基因组RNA含有约10,000个碱基，并且其3′末端是聚腺苷酸化的。无论是使用常规的酚/十二烷基磺酸钠法或是硫氰酸鈲法，因其长度和聚腺苷酸化的两方面问题，都使得在无损失情况下提取到全长度RNA变得很困难。相应地，通过碱性蔗糖密度梯度离心法则可制得病毒基因组RNA。
将500μl病毒溶液(根据1mg/ml病毒的OD260nmO2.5算得含有2mg病毒)加入到500μl降解溶液中并将混合液在室温下放置20分钟。然后使混合物在已用1×SSC制备的0％至33.4％蔗糖密度梯度柱管(33.4％:1.4ml,30.4％:7.6ml,27％:7.0ml,23％:6.3ml,18.7％:5ml,12％:3.2ml,0％:2.7ml；均在4℃下放置过夜)上分层。所用的缓冲液仍为1×SSC，用Hitachi RPS-27转子将已分层的管在15℃,24,000rpm下超速离心9小时。然后刺穿管的底部以分级分离蔗糖密度梯度。检测每个部分在260nm处的吸收值即可鉴定出病毒的基因组RNA部分。病毒基因组RNA在蔗糖浓度约为20至30％时发生沉积。所得基因组RNA的产量约为25μg。D)病毒cDNA的合成
使用上述C)中制备的基因组RNA作为模板来合成cDNA。 cDNA的合成是使用CDNA合成系统(cDNA Synthesis System Plus)(由Amersham制造)进行的。所得CDNA在Sephadex G50柱(注册商标，由Pharmacia制造)上纯化，用dCTP和末端脱氧核苷酸转移酶(由Bethesda Research Laboratories制造)将polyc链加到纯化的cDNA的5′末端上。用限制性酶pstⅠ消化质粒，再在两端都加上3′poly G链即可制得质粒pBR322(由Bethesda ResearchLaboratories制造)的制剂。在此制剂中加入cDNA，在65℃下将混合物温育5分钟，然后在57℃下温育2小时。逐渐冷却所得混合物以使cDNA的poly C链与质粒的poly G链退火。E)转化
按氯化钙法将上述D)中制备的新质粒转化进E.coli菌株HB101中。E.coli菌株HB101的种子培养物是在液体LB培养基中振荡过夜而制得的。用0.5ml此种子培养物接种50ml新鲜液体LB培养基，将接种物在37℃下振荡培养直至OD550mm为0.5。在4℃下以5.000×g离心5分钟以回收细菌细胞，将所得片状沉淀物轻轻悬浮在25mlTris-钙缓冲液中，并在冰上放置5分钟。将所得悬浮液以4,000×g再离心4分钟，并将片状沉淀物悬浮于5ml Tris-钙缓冲液中，在冰上放置2小时即得到感受态细胞。
将上述D)中得到的100μl新质粒加到200μl如上制得的感受态细胞中，将混合物在冰上放置30分钟。然后在42℃下温育2分钟，再加入1ml液体LB培养基，并在37℃下将所得混合物振荡培养1小时。将所得混合物涂布在含有12.5μg/ml盐酸四环素和1.5％W/W琼脂的固体LB培养基上。在37℃下过夜培养细胞以得到CDNA克隆文库。F)质粒pNS51的制备与选择
用碱-SDS法分析cDNA重组质粒文库。此方法详述如下。
将得自上述E)的固体LB培养物中抗四环素但对青霉素敏感的细菌菌落接种于2ml液体LB培养基中，将所得悬液在37℃下振荡培养过夜。以10,000xg离心以回收细胞并将其悬浮于70μl另外含有16μl溶菌酶溶液(10mg/ml)的裂解缓冲液中。搅拌5秒以形成悬浮液后于室温下放置5分钟。然后在悬浮液中加入160μl碱-SDS溶液，将试管倒数几次以第一次混合所得混合物，并再在冰上放置5分钟。在混合物中加入120μl的5M醋酸钾，再在冰上放置5分钟，然后在4℃下以10,000xg将混合物离心5分钟。
离心后，将上清液转移到干净试管中，再在试管中加入250μl异丙醇并将所得混合物在冰上放置30分钟。然后，以10,000xg再将混合物离心5分钟，将所得状沉淀物溶于100μlTE缓冲液[10mMTris,1mM EDTA(pH8.0)]中，再在所得混合物中加入等量苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)并剧烈混均之，在4℃下以10,000xg将混合物离心5分钟(下文中此步骤指的是苯酚提取)。
将离心得到的100μl水层与10μl3M醋酸钠(pH5.2)和250μl乙醇相混合，将所得混合物在干冰上放置10分钟，然后以10,000xg离心5分钟以得到核酸部分(下文中，将使用同样相对量上清液、乙醇和醋酸钠溶液的步骤称为乙醇沉淀)。
将所得片状沉淀物悬浮于50μl RNase A(10μg/ml，溶于TE缓冲液)溶液中，再在37℃下保温1小时。然后向保温的悬浮液中加入30μl聚乙二醇溶液(2.5M氯化钠，20％聚乙二醇#8,000)，并将混合物在冰上放置1小时。然后在4℃下以10,000xg将混合物离心5分钟以得到作为片状沉淀物的DNA部分，乙醇沉淀两次以上以得到纯化的质粒DNA。
将纯化的质粒DNA用限制性酶PstⅠ裂解，再用TBE溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳。电泳后，使凝胶经受Southern印迹杂交[Southern,E.M.(1975),J.Mol.Biol.89:503-517]。更具体地说，凝胶先在变性溶液中振荡40分钟，再转移到中和缓冲溶液振荡2小时。
振荡后，将凝胶转移到含有20×SSC的聚氨酯海绵上以将DNA转移到一片Hybond-N膜(注册商标；由Amersham制造)上。DNA转移到Hybond-N膜上后，将膜在1×SSC中振荡10分钟，再在80℃下干燥1小时以固定DNA。然后将膜置于预杂交溶液[5ml甲酰胺，1ml 50×Denhardt氏溶液，2.5ml 20×SSC,100μl酵母tRNA(50mg/ml),100μl 10％SDS和1.3ml重蒸馏水]中并在50℃下温育3小时。
用已被Mg2+裂解的病毒基因组RNA作为探针。更具体地说，在上述c)中得到的含有1μg病毒RNA的16μl溶液中加入4μl 5x变性缓冲液。将混合物在37℃下温育3小时，经乙醇沉淀，再在70℃下加热5分钟然后置冰上骤冷，得到含有100ng RNA(根据1mg/ml RNA的OD260为20来计算)的5μl变性的RNA溶液。
向变性的RNA溶液中加入4μl 5x标记缓冲液、1μl 3.3mM[γ-32P]ATP(0.37MBq)以及10μl重蒸馏水然后将20uT4多核苷酸激酶[由Takara Shuzo制造]加入混合物中，并在37℃下温育30分钟。重复五次乙醇沉淀步骤以除去未掺入的[γ-32P]ATP。
将所得经标记的探针加入杂交溶液[5ml甲酰胺2ml 50％硫酸葡聚糖、200μl 50×Denhardt氏溶液、2.5ml 20×SCC、50μl酵母tRNA(50mg/ml)、100μl 10％SDS 1.3ml重蒸水]中以达终浓度为5×105cpm/ml，并将上面得到的Hybond-N膜移入此溶液中，经在50℃下保温过夜进行杂交、然后于60℃下用含有0.1％十二烷基磺酸钠(SDS)的2×SSC振荡洗涤。此步骤重复三次，再在室温下用含有0.1％SDS的0.1×SSC将Hybond-N膜振荡洗涤1小时，然后干燥。
放射自显影结果显明，被称为pNs51的质粒具有一插入片段，它含有已与病毒基因组RNA杂交的约6,500个碱基对(bp)。G)pNS51插入片段的序列测定
为了绘制在pNS51中克隆之cDNA的限制性图谱，用下列每种限制性酶消化质粒：BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、NcoⅠ、PstⅠ、SalⅠ、SphⅠ、SacⅠ、SmaⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ及它们的配对。所得的图谱如图1所示。
随后，将用限制性酶SalⅠ和PstⅠ消化得到的每一个片段插入到M13mp19 RFDNA中。为此，用限制性酶PstⅠ和SalⅠ消化pNS51，并在使用1×TBE的5％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离裂解产物。电泳后，用1μg/ml溴化乙锭使凝胶染色以在紫外灯下分辨出带。用剃刀切割含有每一DNA带的凝胶条，再用装有Centricon-30(由Amicon制造)的电洗脱仪(由Amicon制造)进行洗脱。
使用DNA连接试剂盒(由Takara ShuzO制造)将每一片段插入到预先仅用SalⅠ或用PstⅠ和SalⅠ两者消化，再用碱性磷酸酶处理的M13mpl9中。
使用氯化铷法将所得重组M13mpl9RF-DNA(其中已使用T4DNA连接酶将片段插入)引入E.coli菌株JM109中。将已在M9基本琼脂培养基上培养出的菌株JM109的单菌落接种于液体SOB培养基中并振荡培养过夜。将0.6ml过夜培养物接种于50ml新鲜的SOB液体培养基中，在37℃下振荡培养直至OD600nm达到0.5。4℃下5,000xg离心10分钟以回收细胞；将片状沉淀物轻轻悬浮在25ml TFB1缓冲液中并在冰上放置20分钟。
将悬浮液以3,000xg再离心5分钟，将片状沉淀物悬浮于2mlTFB2缓冲液中，然后在上放置20分钟以提供感受态细胞。
连接后，使用1至10μl如上所得的重组M13mp19 RF-DNA与100μl感受态细胞相混合，并在冰上放置1小时。然后将此混合物在42℃下保温1.5分钟，然后向混合物中加入500μl SOC液体培养基，在37℃下振荡培养1小时。
在所得振荡培养物中加入含有0.8％琼脂、30μl 100mMIPTG、10μl 10％的5-溴-4-氯-3-吲哚基-1-半乳糖苷(X-gal)和100μl指示剂细菌(菌株JM109在37℃下，2×YT培养基中振荡培养的过夜培养物)的2×YT培养基，将混合物散布于含有1.2％琼脂的2×YT固体培养基上。混合物固化后，在37℃下过夜培养。随后重组噬菌体表现为白色的噬菌斑。
将所得各白色噬菌斑以1/100的量接种于含有指示剂细菌的2×YT液体培养基中。在37℃下振荡培养过夜。以10,000xg离心1分钟后，将上清液冷冻或在4℃下贮藏以作为噬菌体溶液，细胞片状沉淀物按制备质粒的标准方法处理，以回收RF双链DNA(下文中简称为RF-DNA)，它是噬菌体的复制中间体。经用限制性酶消化证实插入片段的存在。
由此，得到51SS/M13mp19(例如，含有SalⅠ/SalⅠ片段的M13mp19，该片段本身又是含有来自CYVV基因组5′区域之PstⅠ-SalⅠ片段的51PS5′/M13mp19基因组的一部分)。按照标准方法，通过碱-SDS和氯化铯密度梯度离心从这些噬菌体克隆中纯化RF-DNA′S。
将5μg所得纯化的DNA先用BamHⅠ裂解以得到5′粘性末端，再进一步用KpnⅠ裂解以得到3′粘性末端，下一步则根据伴随有除去一个碱基的系统(由Promega制造)的方案，加入核酸外切酶以从每一个cDNA线性化质粒的5′粘性末端分步缺失碱基。用核酸外切酶的持续处理10分钟，在1至10分钟的不同时间取出样品。因为载体有3′粘性末端，它不会受核酸外切酶的攻击。用S1核酸酶处理得自1至10分钟期间的不同样品以将其切成平头，再用T4 DNA连接酶将其连接成环状形式。
用上述氯化铷法将所得环状重组M13 mp19 RF-DNA引入E.coli菌株JM109中。相应地，具有不同长度cDNA插入的重组噬菌斑作为白色噬菌斑被得到。
用常规方法从以上得到的重组噬菌体亚克隆中提取RF-DNA，以筛选具有不同长度插入段的克隆。经接种于含有E.coli指示剂菌株的液体2×YT培养基中，并在37℃下振荡培养过夜，以分别培养筛选出的克隆。然后在4℃下以10,000xg将1.5ml每种培养物离心5分钟取1ml上清液被转移并新鲜试管中，并在试管中混合下加入250μl20％聚乙二醇水溶液(20％聚乙二醇#8000,2.5M氯化钠)，然后在冰上放置30分钟。将混合物在4℃下10,000xg离心5分钟，并将所得片状沉淀物悬浮于100μlTE缓冲液中。按前述方法进行苯酚提取和乙醇沉淀，从每份制剂中回收单链DNA(下文简称为SSDNA)噬菌体基因组。
使用ssDNA作模板，以双脱氧链终止法测定进行上面所得每一个亚克隆的核苷酸序列。具体地说，使用7-脱氮杂-测序酶2.0变体dCTP试剂盒(由USB制造)，用[α-32P]dCTP(220TB q/mmol，由Amersham制造)标记噬菌体ssDNA。将所得反应产物在含有8M脲素、使用1×TBE为缓冲液的5％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，干燥凝胶，并经放射自显影确定核苷酸序列。
通过分析pNS51的5′-PstⅠ-SalⅠ片段和M-SalⅠ-SalⅠ片段的核苷酸序列，我们可确定总共3,839个碱基。
作为寻找以上所得序列中开放阅读框架(下文简称为ORF)的结果，在病毒基因组的正意义链上测知了多肽的单个ORF。然后确定在ORF中编码的多肽序列，使用GeneBank将此多肽序列与已知序列相比较的同源性研究表明它与TEV-HAT同源。
已知如TEV、梅痘病毒(plum pox virus)或脊髓灰质炎病毒(动物病毒)的病毒的成熟需通过蛋白酶的作用，蛋白酶通常裂解含有Gln-Ala、Gln-Ser或者Gln-Gly键的肽键[Willink J.和VanKammen,A.(1988),Arch.Virol.98:1-26]。对CYVV-No.30的外壳蛋白裂解位点的分析结果是：我们可以在推断出的多肽序列中发现三个裂解序列[Uyeda,I.et al.(1991)Intervirology 32:234-245]。从这些裂解位点的一个开始，自氨基酸序列位置4的Gly至位置437的Gln这段多肽被鉴定为来自CYVV的核包合体a。H)CYVV-NIa/IL-Ⅱ融合蛋白质的制备
通过编码Gln-Ala的连接序列将上述G)中鉴定为编码CYVV NIa的DNA，在它的3′末端在码内串联连接到编码人白细胞介素Ⅱ(IL-Ⅱ)的DNA上。
需检查下列情况：首先，上述G)中鉴定的DNA是否能编码其有蛋白质水解活性的NIa；第二，此蛋白酶是否能切割所需的氨基酸序列；第三，当NIa是与所需异源蛋白质一起构成的融合蛋白质的一部分时，NIa的蛋白酶活性是否仍以类似于在被病毒感染的细胞中存在的方式存在；以及第四，裂解该融合蛋白所得的任何异源蛋白质是否能维持其完整性、结构和功能。
由于NIa本身是从病毒前体多肽上切割而产生的，所以NIa顺反子没有起始密码子。因此，有必要在NIa基因的5′末端加上起始密码子ATG。 NIa基因的3′端也必需在相同的ORF中与IL-Ⅱ基因的5′端相连接。为了解决这些问题，可利用在NIa基因中间存在的XhoⅠ酶的位点，以聚合酶链反应(PCR)技术来修饰NIa。
为了在NIa的5′末端(NIa5′)加上起始密码子ATG和适于克隆的限制性酶NcoⅠ的识别位点，需制备PCR引物。所制备的序列是5′GTCCATGGGGAAAAGTAAGAGAACA 3′(称为NSATG；序列ID:3)和5′ACTCTGAGACCGTGCTCGAG 3′(称为NS×1；序列ID NO:4)。
将0.8μl dNTP溶液(dATP、dTTP、dCTP和dGTP各25mM)。10×Taq缓冲液(由Promega制造)和各1μg所得引物加到1μg质粒pNS51DNA中，混合物用重蒸馏水补足到100μl。加入5单位在10×Taq缓冲液中制得的DNA聚合酶以进行PCR。PCR程序为每次循环92℃,1分钟； 37℃,1分钟；72℃,2分钟，重复20次，接着是92℃,1分钟；37℃,1分钟；72℃,30分钟的单一循环。
将所得经扩增的DNA用苯酚提取并用乙醇沉淀，再在5％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，通过溴化乙锭染色检出含有DNA的一条带，从凝胶上切下此带并用装有Centricon-30(由Amicon制造)的电洗脱仪(由Amicon制造)进行电洗脱。洗脱后，用Centricon(Amicon)在4℃下以7,500xg离心45分钟，以浓缩和回收洗脱的DNA部分。经用苯酚提取和用乙醇沉淀进一步纯化所得DNA浓缩物。
将1μg其中SacⅠ识别位点已被xhoⅠ识别位点取代的质粒pkk388-1(由Clonetech制造)分别用限制性酶NcoⅠ和XhoⅠ切割并用小牛肠碱性磷酸酶(下文简称为CLAP；由Takara Shuzo制造)处理使之脱磷酸化。用连接试剂盒(由Takara Shuzo制造)将所得DNA与100ng已被NcoⅠ和XhoⅠ裂解并按上述方法脱磷酸化的pkk388-1连接，并将如此得到的重组DNA克隆到E.Coli TM 109中，从而得到质粒pKNI 5′，它以正常方向插入pkk388-1之trc启动予的下游(图2)。
质粒pCD 20-2[Kawashima,1.et al.(1991),FEBS L.283:199-202]含有编码IL-11前体(pre-IL-11)并具有分泌信号序列的cDNA。用限制性酶BanHⅠ和ApaⅠ切割该质粒，切下既含有IL-11前体(pre-IL-11)又含有SV40启动子的区域。将此片段连接在pBluescript ⅡSK+的BamHⅠ和ApaⅠ位点之间，再用限制性酶XhoⅠ和kpnⅠ切割，即可产生编码缺少成熟IL-11(Mat-IL-11)N末端之蛋白质的基因。
用T4连接酶将所得Mat-IL-11片段(缺少其N末端)整合到已预先用限制性酶xhoⅠ和kpnⅠ裂解并已用CIAP处理过的pKNI5中。我们将所得构建体定名为pKNI 5IL(图3)。为了通过Ala在NIa的C末端将此特定序列与Mat-IL-11相连接，同时保持相同的阅读框架，需合成四种PCR引物：
5′AGGAAAAGAGTTCCTCGAGC 3′(称为NS×2；序列ID NO:5),
5′AATTGTTCATTCCAAGCACCTGGGCCACCACCTGGC 3′(称为NSJ 001P；序列ID NO:6),
5′GCCAGGTGGTGGCCCAGGTGCTTGGAATGAACAATT 3′(称为NSJ002N；序列ID NO:7),
5′TTGTCAGCACACCTGGGAGCTGTAGAGCTC 3′(称为ILSAC；序列IDNO:8)。
所进行的第一个PCR反应使用了NS×2和NDJ002N引物对，用PNS51 DNA作模板以扩增编码NIa之C末端的插入区域(被称为CNI3区域)。另一个PCR反应则是使用NSJ001P和ILSAC引物对，用pNS 51DNA作模板以扩增编码IL-11肽之N末端的插入区域(被称为5′IL区域)。PCR程序是将92℃,1分钟；37℃,1分钟和72℃,2分钟的循环重复20次，然后是92℃,1分钟；37℃,1分钟和72℃,30分钟的单一循环。从每个PCR步骤中得到的产物用苯酚抽提再用乙醇沉淀，然后经受5％聚丙烯酰胺凝胶电泳。切割下含有经扩增之DNA带的凝胶带，并使用上述电洗脱法从凝胶条中电洗脱回收DNA。结果如图4中所示。
所得两个经扩增的DNA片段是引物NSJ 001P和NDJ002N的区域，即CIN 3 DNA片段的3′末端部分和5′IL DNA片段的5′末端部分，它们在核苷酸序列上有部分同源性。因此，如果使用引物NS×2和ILSAC再进行PCR，同源的部分就会杂交以致于可以得到含有两基因部分的融合的DNA，同源部分是作为连接部分来起作用的(图5)。相应地，将所得CIN3 DNA片段和5′IL DNA片段混合，仅使用NS×2和ILSAC作为引物再进行PCR。此PCR程序包括10次循环：92℃,1分钟；37℃,1分钟和72℃,2分钟；然后是20次循环：92℃,1分钟；45℃,1分钟和72℃,2分钟，最后是一个单循环：92℃,1分钟；55℃,1分钟和72℃30分钟。经苯酚处理和乙醇沉淀后，进行5％聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳以获得CNI3IL DNA片段，其中融合了CNI3和5′IL。方法示于图5中。
用限制性酶XhoⅠ裂解CNI3 IL DNA片段，并使用T4DNA连接酶将所得片段插入已预先被限制性酶XhoⅠ裂解，并经CIAP脱磷酸化的pKNI 5′中。将所得质粒克隆到E.Coli菌株JM109中。为了选择出其中CNI 3IL片段已在正确方向插入的克隆，从所得克隆中提取质粒并用引物NSX2和ILSAC连行PCR。使用此系统，只有从其中以正确方向插入了该片段的克隆中才可检测到DNA带。从而得到质粒pKSUN 9,其中通过裂解序列Gln-Ala将NIa和Mat-IL-11连接在同一阅读框架中(图6)。I)在细菌细胞中表达Ala-IL-11
将携带有质粒pKSUN 9的E.Coli(下文简称为菌株KSUN9)在5ml含有42μg/ml青霉素的LB培养基中，37℃下振荡培养过夜。将2.5ml所得KSUN9培养物加到250ml新鲜LB培养基中(含有相同量的青霉素)，并在37℃下振荡培养直至OD600nm达到1.0。一旦OD600nm已达到1.0，即加入IPTG直至终浓度为0.1mM，同时将混合物在28℃下继续振荡培养12小时。
确切按照相同步骤生产第二份培养物，不同的是最终培养是在28℃下进行36小时或更长时间(所加IPTG的浓度为1mM)，以获得成熟的IL-11(它有N末端Pro)。J)western印迹法
进行western印迹分析是为了确定pKSUN9在E.Coli中是否有功能以及所构建的重组基因是否被表达。
经IPTG诱导的12和36小时培养物均进一步按下述步骤处理。在4℃下，3,000xg离心5分钟，从2ml培养物中回收细胞，将片状沉淀物悬浮于100μl 20mM硼酸钠缓冲液(用0.1N NaOH将pH调至9.0)中。将所得悬浮液用超声波发生器处理(手提式超声波发生器UR-20P，由Tomy Seiko Co制造)，其中置于8处处理2分钟以使细胞破碎，并在4℃下，10,000xg离心10分钟。回收含有可溶蛋白质部分的上清液。按照Laemmli方法[Laemmli,U.K.(1970),Nature 227:680-685]取5μl上清液在12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。
电泳后，将凝胶在转移缓冲液(25mM Tris,192mM甘氨酸，20％甲醇)中振荡5分钟，并吸印在一片PVDF膜(跨过印迹转移介质，由Bio-Rad实验室制造)上。此吸印步骤是使用Trans-Blot-SD Semi-DryTransfer Cell(由Bio-Rad实验室制造)，在15V下处理1小时完成的。将被吸印的PVDF膜用PBS-Tw培养基洗10分钟，洗过的PVDF膜被转移到含有5％脱脂牛奶(由Snow Brand Milk Pmoducts制造)的PBS-Tw中，在37℃下封闭1小时。
封闭后，将PVDF膜在PBS-Tw中进一步洗涤，10分钟一次，5分钟两次，然后将其转移到在PBS-Tw中被稀释10,000倍的抗IL-11兔血清中，在37℃下保温20分钟。再用PBS-Tw洗PVDF膜，一次洗10分钟，再两次各洗5分钟。
将PVDF膜再转移到用辣根过氧化物酶(由Amersham制造)标记的，并用PBs-Tw稀释了5,000倍的抗兔IgG羊抗体中，在37℃下保温20分钟。然后再用PBS-Tw洗PVDF膜，一次洗10分钟，再四次各5分钟。
进一步洗涤后，将PVDF膜用提示的化学发光(ECL)检测剂(由Amersham制造)处理，将PVDF膜与x-射线胶片接触30秒至5分钟，显示出与抗IL-11抗体反应的带。
作为上述Western吸印试验的结果，从12小时和36小时培养物中都发现了相应于分子量约50KDa和约23KDa的信号带。23KDa的带显示出基本上与作为对照的成熟IL-11有相同的迁移率。因此，23KDa信号带似乎就是Gln-Ala连接序列处被NIa的蛋白质水解活性从NIa/IL-11融合蛋白质中裂解下来的IL-11。可以推断较重的带(50KDa)即为未裂解的融合蛋白质。
下文中，从12小时培养物中得到的23KDa蛋白质被称为23KDa-ON，从36小时培养物中得到的23KDa蛋白质被称为23KDa-36hr。K)23KDa-ON和23KDa-36hr蛋白质的纯化
23KDa-ON和23KDa-36hr蛋白质需经纯化以测定它们N末端的氨基酸序列。按照上文Ⅰ)中所述的相同步骤得到各250ml 12小时和36小时培养物。然后培养物再进一步按下述方法处理。将培养物在4℃下5,000xg离心15分钟，将片状沉淀物悬浮于10ml 20mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)中，再用French挤压器或超声波发生器破细胞。在4℃下15,000xg离心30分钟后，回收作为上清液的可溶性蛋白质部分。
使用Pharmaria制造的FPLC，利用下述条件对所得可溶性蛋白质部分进行弱离子交换柱层析：柱：CM Toyopearl Pack 650M(2.2×20cm，由Toso制造)洗脱缓冲液：
A=10mM硼酸-氢氧化钠(pH9.0),13mM氯化钾
B=10mM硼酸-氢氧化钠(pH9.0),13mM氯化钾，400mM氯化钠流速：2.5ml/分钟镏分体积：5ml/管所用的浓度梯度是在120分钟期间从洗脱液A至洗脱液B的线性梯度。
随后对被洗脱下的每一部分进行酶联免疫吸附分析(ELlSA)，以找出含IL-11的部分。
ELISA按下述步骤进行。96孔免疫板(Maxisoap；由Nunc制造)的每一孔都装有含1μg/ml抗IL-11小鼠单克隆抗体的100μl 50mM碳酸钠缓冲液，将此板置37℃下保温1小时，然后用PBS-T介质(含有0.1％吐温20的PBS)将各孔洗四次。
将按上述方法制得的FPLC部分分别用PBS-T稀释100倍，并以100μl/孔的等分样品装进孔中。将板置37℃保温1小时，再用PBS-T洗涤各孔，然后在各孔内装入100μl用PBS-T稀释直至终浓度为1μg/ml的抗IL-11兔IgG。
将此板置37℃下继续保温1小时，并用PBS-T洗涤，然后在各孔中装入100μl已被PBS-T稀释3,000倍的碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体(由Gibco Bethesda Research Laboratories制造)。将此板再置37℃下保温1小时，然后用PBS-T洗。再在各孔中装入100μl碱性磷酸酶底物溶液。将此板置室温下继续保温30分钟至1小时，然后检测各孔的颜色变化(405nm的吸光度)以鉴定感兴趣的部分。
合并从FPLC步骤中得到的、用上述ELLSA方法鉴定为含有可与兔抗IL-11抗体反应之物质的部分(第19-25管)，用Centprep-10(由Amicon制造)浓缩100倍，然后按Laemmli方法(文献同上)在12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将凝胶电吸印到一片PVDF膜上，所用方法与上述Western印迹方法中所用的相似，只是使用Problot膜(由Applied Biosystems制造)作为PVDF膜。
吸印后，用重蒸馏水彻底洗膜，用考马氏亮蓝R-250染色，用50％甲醇脱色，然后切下含有在Western印迹中可与抗IL-11抗体反应的蛋白质带。
用蛋白质测序仪(由Applied Biosystems制造)分析此蛋白质N末端的氨基酸序列，来自可与抗-LL-11抗体反应的23KDa-ON带的N末端序列被测定为：
Ala-Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-(序列ID NO:9)
此序列符合成熟IL-11蛋白质氨基酸序列的氨基酸序列-1至+6，根据这一发现，可推断从12小时培养物得到的，并与抗-LL-11抗体反应的23KDa蛋白质是Ala-IL-11。相应地，可明显看出此蛋白质是通过NIa的蛋白质水解活性在特异裂解序列的Gln-Ala位点上裂解NIa/IL-11融合蛋白质而产生的。
可与抗-IL-11抗体反应的23KDa-36hr带的N末端序列被测定为：
Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro(序列ID NO:10)
此序列符合成熟IL-11的氨基酸序列+1至+7。因此，可得出下列结论。
经用IPTG诱导后，NIa/IL-11融合蛋白质可在E.Coli.中得以表达。
经诱导后培养12小时，所表达的NIa/IL-11融合蛋白质由NIa的蛋白酶活性在其特异裂解序列的Gln-Ala肽键处被裂解。
用NIa裂解肽键后，成熟的但在其N末端有一额外Ala的IL-11可在E.Coli中得以表达。
Ala-IL-11的表达被确立后，继续培养24小时，Ala-IL-11成熟为IL-11，其中存在于Ala-IL-11之N末端上的Ala残基被删除了。
根据上述发现，可以推断出培养36小时后得到的23KDa蛋白质是N末端为Pro的成熟型的IL-11。
因此，可以确定IL-11可与NIa一起表达为融合蛋白质，而NIa的活性可以裂解含有Gln-Ala的特异性接头序列以产生Ala-IL-11。连续培养可以产生成熟的IL-11，其中通过E.Coli中存在的因子删除了丙氨酸残基而暴露出脯氨酸N末端。
为了确保所表达的IL-11和Ala-IL-11具有生物学活性，以脂肪生成抑制因子(AGIF)活性被作为检测指标。IL-11具有脂肪生成抑制活性这一事实先前已被证明[Kawashima,I.et al(1991),FEBS L.283:199-202]。L)检测对从3T3-L1细胞变成脂肪细胞之形态学变化的抑制作用
本发明所用的检测AGIF活性的方法如下。使用从ATCC购买的小鼠胚胎成纤维细胞细胞系3T3-L1[Green,H.and Kehinde,O.(1974),Cell 1:113-116]。在所有情况下，此细胞都被置于10％CO2-90％空气混合的潮湿气体中，在37℃下培养并用培养基A进行次级培养。按照下述由Rubin等人描述的方法[Rubin,C.S.et al.(1978),J.Biol.Chem.253:7570-7578]进行脂肪生成分化的诱导。
将3T3-L1细胞悬浮于培养基A中至密度为1.0×104细胞/ml，并接种于48孔的多组盘(由Coaster制造，0.5ml/孔)中，然后培养。培养3天后，细胞达到汇合状态。用新鲜培养基A替换原培养基，再培养2天后，用脂肪生成的诱导培养基，培养基B替换原培养基，同时一起加入0.5ml样品。每隔两天用新鲜培养基B和新鲜样品替换原培养基。
用脂肪细胞维持培养基即培养基C而不是培养基B取代孔中已耗尽营养的培养基。在第一次加入试样后4天至7天间对于不同的孔在不同的时间开始上述替换。
在培养基C中培养2天后，用5％甲醛固定细胞，分别用油红0和苏木精着染在细胞和细胞核中积累的任何脂肪颗粒。进行显微摄影并计数积累有被染色之脂肪颗粒的细胞数目。按公式计算脂肪生成率(AR)：
AR(％)=100×积累脂肪颗粒的细胞数目/总的细胞数目
根据Yoshio Mitomo和Shojiro Takayama在由IshiyakuShuppan出版的″Lectures on Clinical Testing″Vol.12,″Pathology″(1982)中描述的方法进行细胞固定和用油红0及苏木精染色。M)脂蛋白脂酶抑制活性的测定方法
按照Beutler等人所描述的方法[Beutler,B.A.et al.,(1985),J.Immonol.135:3972-3977]进行此项测定。按上文L)中所述方法，制备脂肪生成分化的3T3-L1细胞，不同的是当诱导化分成脂肪细胞时不加入试样。另外亦可将试样和新鲜的培养基C一起加入，并将细胞培养18小时。
然后，弃去培养基，细胞用PBS(-)(磷酸盐缓冲盐水，由NissuiSeiyaku配制)洗涤两次，再往每孔内加入300μl培养基D继续培养1小时。从每份培养物上清液中取出100ml的等份样品用于检测脂蛋白脂酶(LPL)活性，每份样品测三次得到一平均数。
LPL活性按Nilsson-Ehle和Schotz[Nilsson-Ehle,P.andSchotz,M.C.(1976),J.Lipid Res.17:536-541]所述的方法测定。将上面所得的每份上清液等份样品与等体积的LPL底物溶液混合，37℃反应120分钟。加入1.05ml 0.1M碳酸钾缓冲液(用0.1M硼酸钾调至pH10.5)和3.25ml的甲醇∶氯仿∶庚烷[141∶125∶100(V/V)]混合液，剧烈搅拌使反应停止。然后将混合物在室温下3,000xg离心15分钟。用液体闪烁计数器测定水一甲醇相中的3H含量。
1单位LPL活性定义为每分钟产生lμmol脂肪酸所需的活性。在底物溶液中的13mM的甘油三[9,10(n)-3H]油酸酯通过稀释甘油三[9,10(n)-3H]油酸酯，(37.0GBq/mol)制得，后者是由Amersham用三油酸甘油酯(Sigma生产)制造，然后用硅胶柱层析法纯化的。
下列实施例涉及体现本发明的谷胱甘肽还原蛋白质。
                  实施例1从KM-102细胞中抽提poly(A)=RNA
将KM-102细胞置于36个直径为15cm塑料培养皿中添加含10％小牛血清的Iscove氏改良的基本培养基(Boeringer-Mannheim)中进行培养。
当细胞长到汇合时，加入佛波醇十四烷基乙酸酯(PMA)和钙离子载体A23187(Sigma)，使其终浓度分别为10ng/ml和0.2μM，并在37℃下继续培养。在3、6和14小时后，分别收集12个培养皿中的细胞，每个培养皿的细胞分别溶于硫氰酸胍溶液中，并收集液相。
poly(A)+RNA的分离基本上按″Molecular Cloning-A Laboratory Manual″[Maniatis,T,et al.(1982).196-198]中所述方法进行。现对这一方法详细描述如下。
对每份回收的液相样品分另作如下处理。液体用一装有21G注射针头的10ml注射器反复吸入和推出。在与RPS 40-T离心机(Hitachi koki)转子采样桶大小相称的Polyaromar离心管中预先加入3ml 5.7M CsCl-0.1M EDTA(p7.5)溶液，然后将细胞样品加到溶液上直到将管装满。
20℃下以30,000rpm离心18小时后，将所得沉淀饼悬浮于400μl蒸馏水中，再用乙醇沉淀。将所得沉淀团块溶解于400μl蒸馏水中。边搅拌边加入等体积的氧仿/1-丁醇混合物(4∶1,V/V)，并离心分离收集水层。再次用乙醇沉淀，将所得沉淀物溶于600μl蒸馏水中以得到总RNA。分别汇集用pMA/A23187刺激3、6和14小时后的样品，得到大约4.5mg的总RNA。
合并用这种方法得到的三种类型总RNA各600μg，并经Oligo(dT)纤维素柱层析纯化poly(A)+RNA。
将总RNA溶于吸附缓冲液中，65℃加热5分钟。将所得溶液加到装有吸附缓冲液的Oligo(dT)纤维素柱(Pharmacia,7型)上，并用洗脱液洗脱以回收100μg poly(A)+RNA。
                      实施例2制备cDNA文库
用Okayama-Berg方法制备cDNA文库。
使5μg Poly(A)+RNA和24单位逆转录酶(Seikagaku Corp.)在20μl逆转录酶反应溶液中42℃反应1小时。
加入2μl 0.25M EDTA和1μl 10％SDS以终止反应，然后用20μl苯酚/氯仿混合液(1:1,V/V)使溶液去蛋白。离心除去蛋白质部分后，向上清液中加入20μl 4M乙酸铵和80μl乙醇，然后于-70℃下冷却15分钟。离心分离收集沉淀物，用75％乙醇洗，并减压干燥。
将干燥的沉淀物溶于15μl末端转移酶反应溶液中，37℃加温3分钟。然后向反应溶液中加入18单位的末端脱氧核苷酰转移酶(Pharmacia)，反应5分钟。加入1μl 0.25M EDTA和0.5μl 10％SDS终止反应，溶液用苯酚-氯仿(如上所述)脱蛋白。离心去除蛋白部分，收集上清液与15μl 4M乙酸铵和60μl乙醇彻底混合，将混合物于-70℃下冷却15分钟，并离心收集沉淀物。
将所得沉淀团块溶解于10μl限制性酶缓冲液中，加入2.5单位的限制性酶HindⅢ,37℃消化1小时。
反应溶液再用苯酚-氯仿去蛋白，随后用乙醇沉淀并将上清液于-70℃下冷却15分钟。离心收集所得沉淀物并溶解于10μl TE缓冲液[10mM Tris-HCl(pH7.5)和1mM EDTA]中。用1μl所得的溶液制成10μl的反应溶液，其中含10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、100mM NaCl和10ng Oligo(dG)-尾部接头DNA[3′-Ologo(dG)-接尾的PL-1 HindⅢ接头，Pharmacia]，于65℃加热5分钟，然后于42℃加温30分钟。反应混合物用冰水冷却。然后向其中加入10μl 10×连接酶缓冲液、78μl蒸馏水和8单位T4 DNA连接酶。反应溶液于12℃下保存过夜。
第二天，将反应混合物与10μl含1M KCl、1单位核糖核酸酶H、33单位DNA聚合酶I、4单位T4DNA连接酶、0.5μl dNTP溶液(20mMdATP,20mM dCTP,20mM dGTP和20mM dTTP)及0.1μl 50μg/ml牛血清白蛋白(BSA)的溶液混合，所得混合物先在12℃温育1小时，然后在25℃加温1小时。之后，反应溶液用蒸馏水稀释5倍，再用Hanahan方法[hanahan D.(1983)J.Mol.Biol.166,557-580]直接以其转化E.Coli DH 5α，由此制备KM-102细胞的cDNA文库。
                    实施例3制备寡核苷酸探针
根据细胞素mRNA之3′非翻译区的AUUUA序列，用化学方法合成命名为ATT-3的15个碱基的寡核苷酸5′-TAAATAAATAAATAA-3′(序列ID NO(3)。合成使用380B型自动DNA合成仪(Perkin-Elmer Japan AppliedBiosystems)，按其所附手册提供的说明进行操作。所用的方法是Caruthers等人[Matteucci,M.D.and Caruthers,M.H.(1981)J.A.Chem.Soc.103,3185-3191]所描述的磷酰胺方法。当合成15-mer后，将所得的寡核苷酸从支持物上分离下来并去掉保护基团。所得的寡核苷酸溶液冻干形成粉末，然后溶于蒸馏水，贮存于-20℃下备用。
                      实施例4筛选cDNA文库
按照Grunstein和Hogness[Grunstein,M.and Hogness,D.S.(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72,3961-3965]所述的方法，将由上面实施例2制备的cDNA文库产生的6,500个集落固定到硝酸纤维滤膜上。将实施例3中制备的ATT-3探针按标准程序(见″MolecularCloning-A Laboratory Manual″)用32P作5′标记，并用标记的探针进行集落杂交。
预杂交在下述溶液中37℃进行3小时：6×SSC、1×Denhardt溶液、0.25％SDS、0.05％焦磷酸钠和100μg/ml变性鱼精DNA。然后，在下述溶液中，31℃下杂交过夜：6×SSC、1×Denhardt溶液、17μg/ml酵母tRNA和0.05％含32P-标记之探针ATTT-3的焦磷酸钠溶液。
第二天用含0.05％焦磷酸钠的6×SSC溶液室温将硝酸纤维系滤膜洗2小时。随后的放射自显影发现33个阳性克隆。
按下述标准程序从阳性克隆中提取质粒DNA。随机挑选几个克隆用双脱氧链终止法测定其部分cDNA核苷酸序列。然后，通过个人计算机比较这些部分序列与记录在EMBL或GenBank数据库的核苷酸序列的同源性，发现由ATT-3检测到的克隆之部分序列中的某些与Alu重复序列的一些部分有同源性[Schmid,C.W.and Jelinek,W.R.(1982).Science 216,1065-1070]。
按标准方法从人基因组DNA制备含有Alu重复序列的DNA片段并用32P标记之。用该标记的DNA作为使用如上鉴定的33个克隆进行的集落杂交中的探针，进一步发现12个克隆具有Alu重复序列。确定剩下的21个克隆的cDNA插入序列的长度，证实该长度变化范围为50至3，600个碱基。
对剩下的21个克隆的cDNA插入序列进行限制性酶切图谱分析，并按上述方法测定部分核苷酸序列。然后，按上文所述方法通过个人计算机检测这些部分序列与登记在EMBL或GenBank数据库中的核苷酸序列的同源性，并选择出那些具有新序列的克隆。
                      实施例5第31号克隆的Northern杂交
其中的一个克隆，第31号克隆(命名为pcD-31)具有一个大约560bp的cDNA插入序列。从pcD-31的cDNA插入片段得到一个PstⅠ-AatⅠ片段(292bp)并用32P标记，将其用作Northern印迹程序中的探针，这一程序使用从KM-102细胞制备的poly(A)+并与实施例1的程序相似。这一杂交用于测定与pcD-31插入序列相对应的天然形成之mRNA的长度。
Northern杂交的程序如下：从KM-102细胞中制备5.5μg poly(A)+RNA并在1M乙二醛、50％二甲亚砜(DMSO)和0.0M磷酸氢二钠(pH7.0)的混合液中50℃温育1小时。向保温的混合物中加入4μl的电泳颜料，然后在1×TAE中用1％琼脂糖凝胶电。
电泳后，使用毛细管转移法(见″molecular Cloning-aLaboratory Manual″)以20×SSC将琼脂糖凝胶上的RNA过夜转移到尼龙滤膜(Bio Rad,Zeta-Probe)上。转移后，用2×SSC轻轻洗滤膜，空气干燥，再在80℃下继续干燥2小时以固定mRNA。
使用Multiprime DNA标记系统(Amersham)，用32P标记pcD-31的PstⅠ-AatⅠ片段。
预杂交在含有5×SSCP,2.5×Denhardt溶液，50％甲酰胺，10mM磷酸氢二钠(pH7.0),0.5％SDS和100μg/ml变性鱼精DNA的溶液中，于37℃下在滤膜上进行3小时。
在含32P-标记的探针、5×SSCP、1×Denhardt溶液、50％甲酰胺、10mM磷酸氢二钠(pH7.0)、0.1％SDS和100μg/ml变性鱼精DNA的溶液中，于42℃下在滤膜上杂交过夜。第2天，滤膜先用含50％甲酰胺、5×SSC和0.1％SDS的溶液37℃洗滤膜1小时，然后再在含有40％甲酰胺、5×SSC和0.1％SDS的溶液中，于相同温度下洗2小时。最后，在2×SSC溶液中室温下洗15分钟。继后的放射自显影表明，克隆pcD-31的cDNA插入片段并不是全长度，而且相应mRNA全长为3.9kb(根据分子量标记物的校准曲线测知)。
                        实施例6制备用于筛选克隆pcD-31cDNA的新文库
使用cDNA合成系统正型和cDNA克隆系统(λgt10，连接物方法，由Amersham提供)制备新cDNA文库。
从KM-102细胞提取5μg poly(A)+RNA(按与实施例1相似的程序)，加入100单位逆转录酶，并在50μl逆转录酶反应溶液中于42℃下反应40分钟。然后向反应溶液中加入20μCi[α-32P]dCTP,93.5μl第二链缓冲液，4单位核糖核酸酶H和115单位DNA聚合酶Ⅰ均随试剂盒提供)，先于12℃温育1小时，然后于22℃温育1小时，最后于70℃加热10分钟。加热处理后，加10单位T4DNA聚合酶(随试剂盒提供)到反应溶液中，于37℃反应10分钟。
然后，反应混合物用苯酚-氯仿去蛋白质。将反应液离心收集上清液，并与250μl4M乙酸铵和1ml乙醇充分混合。混合物冷却到-20℃过夜并离心收集沉淀物。将所得沉淀物溶于30μl无菌水中。取出10μl所得的溶液，加到由2μl连接酶/激酶缓冲液、250pmoleEcoRⅠ连接物和5单位T4 DNA连接酶(均随试剂盒提供)组成的混合物中，于15℃培养过夜。然后将全部反应溶液加到随试剂盒提供的筛析层析柱上层析除去EcoRⅠ连接物。反应液收集成120μl的等份样品，每等份与200μl 0.25×TE缓冲液混合。将第10到第17等份合并，并用丁醇浓缩到总体积为120μl。
然后将全部浓缩制品与55μl无菌水、20μl连接酶/激酶缓冲液和40单位T4多核苷酸激酶(均随试剂盒提供)混合，并将所得混合液于37℃温育30分钟。然后将反应混合物以苯酚-氯仿提取法脱蛋白三次，再用乙醇沉淀，-20℃冷冻过夜。离心收集所得沉淀物并溶解于10μl无菌水中，作为备用cDNA样品。
每2μl cDNA样品中加入1μg λgt10的EcoRⅠ臂、1μl连接酶/激酶缓冲液和2.5单位T4 DNA连接酶(均随试剂盒提供)，然后于15℃培养过夜。以同样方法制备含4μl cDNA样品的样品。每份样品进一步按下述方法处理。首先将所得的全部反应溶液加到10μl抽提物A(随试剂盒提供)中，然后将所得混合物加到15μl提取物B(随试剂盒提供)中，并将所得混合液于20℃温育20分钟，以便发生体外包装反应。
然后，向反应溶液中加入470μl SM缓冲液并贮存于4℃下。用贮存的溶液感染经10mM MgSO4处理过的E.Coli菌株NM514，以产生KM-102 cDNA的λgt10文库。
                     实施例7cDNA文库的筛选
将从实施例6中制备的合并的cDNA文库中产生的2×105个噬菌斑，按下述方法固定在尼龙滤膜(Hyband N,Amersham)上。
将实施例6中制备的感染的E.Coli培养在10个含固态LB培养基的9cm培养皿中，以使每个培养皿形成1至2×104个噬菌斑。通过轻压培养皿上的尼龙滤膜将噬菌斑转移到培养皿上。然后用18G注射器针头穿刺滤膜并在凝胶上标记3个位置用于参考。将滤膜于4℃下放置5到10分钟后，揭去滤膜并浸入碱性溶液(0.1N NaOH,1.5MNaCl)中20秒钟。然后将滤膜转移到中性溶液[0.2M Tris-HCl(pH7.5),2×SSCP]中20秒至1分钟，再在室温下空气干燥2小时。最后，将滤膜置于80℃下干燥2小时。
                       实施例8探针的制备和杂交
使用Multiprime DNA标记系统标记pcD-31(实施例4)的PstⅠ-AatⅠ片段和EcoT 221-AatⅠ片段(223bp)，制得来自pcD-31的32P-标记的探针。使用上述探针与实施例7所得的滤膜进行噬菌斑杂交。
将滤膜放在50％甲酰胺、5×SSCP、2.5×Denhardt溶液、0.01M磷酸氢二钠(pH7.0)、0.5％SDS和100μg/ml变性鱼精DNA的混合溶液中37℃温育2小时以进行预杂交。
然后将滤膜放在含上面制备的32P标记之探针和50％甲酰胺、5×SSCP、1×Denhardt溶液、0.01M磷酸氢二钠(pH7.0)、0.1％SDS和100μg/ml变性鱼精DNA的反应溶液中37℃温育过夜，以完成杂交步骤。
第二天，先用含50％甲酰胺、5×SSC和0.1％SDS的溶液室温洗滤膜3小时，然后再用2×SSC室温洗5分钟。放射自显影显示出初筛得到80个阳性克隆。
用每次被鉴定为阳性的克隆，再重复实施例7和8的程序三次(四次筛选)，最终得到共17个阳性克隆。从17个克隆中分别分离其cDNA，用EcoRⅠ切下插入片段。通过琼脂糖凝胶电泳测定每个cDNA插入片段的长度，并分离出具有3.9kbp之cDNA插片段、相当于原始mRNA的全长的31-7号克隆。
                      实施例9第31-7号克隆的限制性图谱
用EcoRⅠ消化第31-7号克隆以分离并纯化含cDNA插入段的3.9kb片段。再用T4DNA连接酶将此片段插入PUC18中。用这一新质粒转化E.coli DH 5α。根据抗氨苄青霉素抗性束选择转化的细胞。用EcoRⅠ消化DNA并对裂解的DNA作琼脂糖凝胶电泳分析以鉴定有3.9kbpcNDA插入段的pUCKM3-7克隆。
分别用限制性酶HindⅢ、SacⅠ、XbaⅠ、SmaⅠ、Bg 1Ⅱ、EcoT22Ⅰ和AatⅠ裂解或用其中两个酶同时裂解pUCKM31-7。对所得的片段作琼脂糖凝胶电泳分离，用λHindⅢ/ΦX174 HaeⅢ标记物作指示剂测出各片段的长度。所得的限制性图谱如图7所示。
                      实施例10第31-7号克隆的序列测定
使用M13噬菌体通过双脱氧链终止法测定pUCKM31-7cDNA插入段的全部核苷酸序列。另外，用373A DNA序列仪(Perkin-ElmerJapan Applied Biosystems)分析该一部分序列。所得的核苷酸序列为列于序列表中的ID No.11。
PUCKM31-7cDNA插入段为3815个碱基长，清楚地具有一个由549个氨基酸组成，起始氨基酸为蛋氨酸的阅读框架。显然没有poly(A)尾部。比较pcD-31插入段3′端的碱基顺序与克隆pUCK31-7的顺序表明，pUCKM31-7插入段仅丢失了poly(A)尾部(图8)，而无其它缺失。
为了比较碱基和氨基酸顺序，分别检查了EMBL和GenBank核苷酸数据库2NBRF和SWISS-PROT数据库。发现最相近的匹配是该肽序列与人谷胱甘肽还原酶有35.3％的同源性。由此推论pUCKM31-7cDNA插入段的ORF清楚地编码一个新的多肽。该新的多肽即为所附序列表中的序列ID No.12。
                        实施例11新多肽的表达和纯化高表达载体的构建及在COS-1细胞中的表达
按标准程序用HindⅢ消化pUCKM31-7并分离和纯化含cDNA插入片段的3003bp片段。用DNA修平端试剂盒(Takara Shuzo)使所得片段的末端变为平端。
同时，高表达载体pCDL-SRα296[Takabe.Y.et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8,466-472]用PstⅠ和KpnⅠ消化并用DNA修平端试剂盒使其末端变为平头。用T4DNA连接酶将修成平头的插入序列连接到修成平头的质粒中。用氯化钙法以所得的DNA转化E.coli。挑选所得的AmpR转化细菌，分析保留在细菌内的质粒DNA。
经用HindⅢ和BglⅡ消化质粒，然后琼脂糖凝胶电泳定位800bp片段，选择出一个cDNA转录方向与SRα启动子方向一致的菌株，并将选出的质粒命名为pSRα31-7(图9)。SRα启动子含有SV40早期启动子和HTLV-1长末端重复(LTR)的R-U5序列，并具有比单独的SV40早期启动子强10到100倍的启动活性。
然后，用所得的质粒pSRα31-7转染COS-1细胞。用GTE-1基因导入装置(Shimadzu)经电穿孔转染COS-1细胞。
COS-1细胞在七个150cm3培养瓶的底部生长到半汇合。每个瓶里有25ml DMEM(含10％小牛血清)培养基。收集培养基并各用3mlTrypsin-EDTA溶液(10x溶液可从Sigma得到)处理，室温放置直至细胞分离。加入1ml灭活的小牛血清和9ml新鲜trypsin-EDTA溶液，离心收集细胞。然后将收集的细胞用PBS(-)缓冲液洗涤二次并以6×107细胞/ml的密度重新悬浮于PBS(-)缓冲液中。
同时，用氯化铯法制备质粒DNA并在PBS(-)缓冲液中配成200μg/ml。
将上面提到的PBS(-)细胞和质粒样品各20μl混合，将所得的混合物放入含有以2mm间隔分开之电极的小室中。对混合物以1秒钟间隔施加2个600V的脉冲，每个持续时间为30微秒。
电极小室于4℃冷却5分钟，然后，将里面的细胞DNA混合物与含10％小牛血清的10ml DMEM混合。将该混合物转移到Petri培养皿中，在5％CO2气体中37℃培养过夜。第二天，弃去培养物上清液，细胞用无血清DMEM洗涤并重悬于10ml DMEM中，37℃培养3天。然后，收获细胞上清液。
同样收集阴性对照培养物的上清液。阴性对照使用不含cDNA插入段的pCDL-SRα296质粒，但用与试验培养物同样的方式制备。
1ml阴性对照和试验培养物的培养上清液分别按以下程序处理。上清液先用三氯乙酸(TCA)处理以沉淀蛋白质，离心收集沉淀物。将所得沉淀物用冰冻丙酮洗涤后空气干燥。然后溶于含2-巯基乙醇的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)样品缓冲液中。SDS-PAGE于还原条件下在12.5％凝胶上进行。
对电泳带的银染色使用银染色试剂″Daiichi″(DaiichiChemical Detection)进行。试验样品培养物上清液的几个特定带(分子量约60,000)被着染。
由于pSRα31-7中序列编码的多肽分子量约为60,000，而且从氨基酸序列推断其翻译后修饰增加糖侧链是不可能的，因此这几个特定的带是与pSRα31-7cDNA编码的多肽相对应的。
                 实施例12用于COS-1细胞的高表达质粒的制备
下一步证实实施例11中鉴定的几个特定的60KDa带与pSRα31-7的插入序列编码的多肽是一样的。还可望确定该多肽N末端氨基酸顺序。为此，制备了一个克隆，其中由PSRα31-7插入序列编码的多肽之C末端有额外的6个His残基，紧接在终止密码子之前。组氨酸残基对Ni2+有高亲合力，目的是为了表达具有组氨酸6聚体(6×His)的多肽，它可用装有Ni2+的亲合树脂柱纯化。
首先，使用自动DNA合成仪394(Perkin-Elmer JapanAppliedBiosystems)合成66个碱基的寡核苷酸5′-CTAGCGCTCTGGGGCAAGCATCCTCCAGGCTGGCTGCCACCACCACCACCACCACTGATCTAGACT-3′(序列ID No.14)及其互补的66碱基链并纯化之。混合寡核苷酸样品，于70℃下温育3分钟，然后再于37℃温育30分钟以使之退火。接着，用T4多核苷酸激酶使末端磷酸化。
用T4DNA连接酶将所得的双链(ds)片段连接到预先经Eco47Ⅲ消化过的pUCKM31-7中。构建体如图10所示。用该DNA以氯化钙法转化E.coli DH5α，选择并筛选所得的转化菌株，得到pUCKM31-7His。通过分析该pUCKM31-7His的相关碱基顺序的一部分，证实在pUCKM31-His中插入了该片段的这个部分没有异常。
然后将pUCKM31-7His的插入段亚克隆到pCDL-SRα296中，制备COS-1细胞的高表达质粒。
用Xbal和HindⅢ消化pUCKM31-7His，纯化所得片段，在有2mMdATP,2mM dCTP,2mM dGTP,2mM dTTP,50mM TRIS-HCl(pH7.2)，10mM MgSO4,0.1mM二硫苏糖醇和50μg/ml BSA存在的条件下，用1单位klenow片段将片段修成平头。
同时，高表达载体pcDL-SRα296用PstⅠ和KpnⅠ消化并用DNA修平端试剂盒修成平头，然后用T4DNA连接酶连接平头片段和平头质粒。用所得质粒转化E.Coli DH5α。然后选择和筛选转化体。选出cDNA转录方向与SRα启动子方向一致的菌株，这一菌株的质粒命名为pSRα31-7His。用所得质粒pSRα31-7His转染COS-1细胞，并用如实施例11所述者相似的方法得到无血清上清液。
                      实施例13纯化及N末端氨基酸顺序分析
使实施例12中制得的600ml上清液在17倍体积的透析缓冲液中4℃透析15小时。用另外17倍体积的透析缓冲液替代上述缓冲液4℃继续透析4小时。
透析过的制剂在下述条件下用FPLC(快速蛋白质多核苷酸液相层析仪-Pharmacia)做亲和层析。
柱：20ml ProBondTM树脂(InVitrogen)装入XK16/20(Φ2.0×20cm,Pharmacia)柱中
洗脱缓冲液：
A)含200mM味唑、0.5M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.8)
B)含300mM味唑、0.5M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.8)
流速：1ml/分钟
洗脱溶液分配：5ml/管
洗脱条件：用洗脱缓冲液A)回收4管后，用洗脱缓冲液B)回收16管，各管按1至20次序编号。
从所得的各部分样品中各取300μl分别用TCA进行沉淀处理，所得的沉淀按前述方法用12.5％凝胶在还原条件下进行SDS-PAGE。用银染色法鉴定带，并在围绕编号为10的部分(管)检测到三条带。这三条带的存在表明pSRα31-7His插入段编码一条具有不同N末端顺序的3种不同长度的多肽。
剩余的第7至14管样品用TCA沉淀法浓缩，对沉淀物用10％凝胶在还原条件下进行SDS-PAGE。使用凝胶膜转移装置(Marisol,KS-8441)将蛋白带从聚丙烯酰胺凝胶上转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(ProBlotTM,Applied Biosystems)上。转移以9V在转移缓冲液[0.02％SDS、20％甲醇、25mM Tris-硼酸、(pH9.5)]中4℃进行2.5小时。
然后，膜用0.2％萘酚蓝黑(Sigma)染色。从膜上切下与前面鉴定者相对应的三条带，用气相蛋白质测序仪(Shimadzu,PPSQ-10)测定每条带从N末端到第6个氨基酸的序列。带有第二大表观分子量(分子量约60.000)的带N端顺序是：
Val-Val-Phe-Val-Lys-Gln(序列ID No.12的第1至6位氨基酸)。
这6个氨基酸相当于克隆31-7之ORF的前6个氨基酸，也相当于由pSR 31-7His和PSRα31-7cDNA插入段编码之前体多肽N末端从第24位氨基酸(Val)开始的6个氨基酸的序列。因此，以这种前体多肽N末端切去1至23号氨基酸将导致分泌以Val残基起始的成熟形式的蛋白质。
                         实施例14还原活性的测定ⅰ)表达载体的构建
前面实施例中纯化的多肽当它从COS-1细胞中表达时只能以极小的产量得到。故不可能将此多肽用于其他用途，如活性试验。因此必须找到能在可代用的宿主中表达pSRα31-7cDNA的插入段所编码的多肽，且能得到足够用于纯化和检测实验之适当数量产物的办法。为达到这一目的，进行下述处理。
用HindⅢ消化pUCKM31-7，分离和纯化含cDNA插入段的3003bp的片段，用DNA修平端试剂盒使之变成平头末端。该片段再进一步用XbaⅠ消化。
表达载体pMAL-c[Guan,C.et al.(1987)Gene 67,21-30]用XbaⅠ和StuⅠ消化，然后用T4连接酶将上述XbaⅠ修饰的HindⅡ片段连接到这一裂解的质粒中。所得构建体示于图11中。用该构建体转化E.coli TB-1并选择和筛选AmpR转化株。挑选cDNA转录方向与启动子方向一致的菌株，所得到的质粒被命名为pMAL31-7。ⅱ)融合蛋白质的表达和纯化
在3ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃振荡培养过夜，制备含有pMAL31-7的E.coli种子培养物。第二天，将1ml种子培养物加入100ml含50μg/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃振荡培养至OD600nm值达到0.5。在这一阶段，培养物中加入IPTG至终浓度为0.1mM，并将培养物于37℃继续振荡培养过夜。
第二天，经以6500rpm于4℃下离心20分钟，从过夜的培养物中回收细菌细胞。将沉淀物悬浮于10ml柱缓冲液中，用超声破碎仪处理以破碎所得悬浮液中的细胞。于0℃下8800rpm离心30分钟除去全部细胞及细胞碎片，回收上清液中的可溶性蛋白质部分。取1ml该可溶性部分在直链淀粉树脂柱(New England Biolabs)上进行层析。
往10ml柱缓冲液中加入麦芽糖至终浓度为10mM，以制备用于层析的洗脱缓冲液。
阴性对照样品也进行层析。阴性对照样品的制备用相似程序，不同的是，pMAL-C载体中没有任何cDNA插入段。然后测定层析样品中蛋白质的还原活性。ⅲ)测定还原活性
用二氯酚-酚(DCIP)和氧化态谷胱甘肽在样品杯(SARSTEDT,10×4×45mm)中测还原活性。
a)使用DCIP测定还原活性
将各90.4μg(用蛋白试验试剂盒(Bio-Rad)测定的)上述ⅱ)步骤中所得的层析样品分别与1ml 50μM DCIP(Sigma)混合。然后向各样品中加入15μl 1mM NADPH(Boehringer Mannheim)，并定时监测OD600nm和OD340nm的吸光度。所得的两个波长处吸光度的降低如图12所示，可见仅有pMAL31-7样品含有减少DCIP的因子。b)用氧化态谷胱甘肽测定还原活性
在预先装入不同小杯中的上面ⅱ)步骤中得到的各90.4μg层析样品中加入15ml 10mM氧化态谷胱甘肽(Boeringer-Mannheim)。每个小杯中再加入15μl 1mM NADPH，并定时监测OD340nm处的吸光度。结果如图13所示，可见只有得自pMAL31-7样品中的蛋白质能还原氧化态谷胱肽。还观察到，当无氧化态谷胱甘肽存在时则不消耗NADPH，所以可以认为在NADP存在下，只有pMAL31-7样品中的蛋白质才能还原氧化态的谷胱甘肽。
                      实施例15N末端氨基酸序列的纯化和分析
从实施例13可推断，用pSRα31-7 His转柒的COS-1细胞表达具有三种类型的N末端的多肽。
在一个单独实验中，用从pMAL31-7转化的E.coli中回收的融合蛋白质免疫兔，得到抗KM31-7蛋白的多克隆抗体制品。使用该多克隆抗体做Western印迹分析，在从pSRα31-7转染的COS-1细胞中得到的无血清培养物上清液中也清楚地检测到三种类型的带。这一结果与实施例13中所得的结果相似。
因此，用pSRα31-7转染COS-1细胞，以期收集到大体积的无血清培养物上清液，得以纯化和分析KM31-7蛋白质的N端序列。
用pSRα31-7转染COS0-1细胞，在装有30ml DMEM的150mm培养皿中培养3天。然后收集上清液，再向各培养皿中加入30ml新鲜培养基并继续培养3天。再次收集培养物上清液。有关转染和培养的其它方面同实施例11所述，但使用199培养基培养。
合并收获到的上清液，离心后收集10升无血清培养上清液并将其在10mM Tris-HCl(pH9.0)中透析过夜。对透析的制品用FPLC(Pharmacia)在下述条件下进行离子交换层析8次：
柱：20ml DEAE Sepharose Fast Flow(Pharmacia)，填入XK16/20(Φ2.0×20cm,Pharmacia)
洗脱缓冲液：
A)．10mM Tris-HCl(pH9.0)
B)．10mM Tris-HCl(H9.0)-0.5M NaCl
流速：1ml/分钟
洗脱溶液分配：3ml/管
洗脱条件：在60分钟以线型浓度梯度由洗脱溶液A变成洗脱溶液B。
收集在0.1M-0.4M间各NaCl浓度下洗脱的各部分并合并之，在含0.1M Tris-HCl,5mM EDTA(pH7.6)和1mM 2-巯基乙醇的透析缓冲液中透析过夜。经透析的制品再使用2′,5′-ADP Sepharose 4B(Pharmacia)于下述条件下进行亲合层析：
柱：20ml 2′,5′-ADP Sepharose 4B填入xK16/20(Φ2.0×20cm,Pharmacia)
洗脱缓冲液：
A)0.1M Tris-HCl,5mM EDTA(pH7.6),1mM2-巯基乙醇
B)O.1M Tris-HCl,5mM EDTA(pH7.6),1mM2-巯基乙醇，10mMNADPH
流速：0.5ml/分钟
洗脱溶液分配：2ml/管
洗脱条件：在120分钟内以线型浓度梯度从洗脱液A变为洗脱液B
从每个所得的部分中取100μl等份试样用TCA沉淀，对沉淀物在还原条件下使用12.5％凝胶做SDS-PAGE。
电泳后，对凝胶作银染色以确定蛋白带。从第11管起得到三条带。
第11至第14管的全部剩余液经用TCA沉淀而浓缩，沉淀物在还原条件下用12.5％凝胶进行SDS-PAGE。电泳后将蛋白质从凝胶上转移到ProBlot PVDF膜(Applied Biosystems)上。蛋白质转移到膜上后，将膜用0.2％萘酚蓝黑染色并切下三条蛋白带。用气相蛋白质序列仪进行N端序列分析。
测知三种类型中分子量最小的带N端为Lys-Leu-Leu-Lys-Met。这5个氨基酸相当于由pSRα31-7cDNA之插入段编码的多肽之N端从第49号氨基酸开始的5个氨基酸。因此可推断，在第48位氨基酸残基处裂解该肽产生一个N端以Lys开始的成熟型蛋白质。
                        实施例16制备抗KM31-7蛋白质的单克隆抗体a.)抗原蛋白质的制备：
在3ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃下振荡培养一接种环的细胞，以制备含pMAL31-7的E.coli种子培养物。取1ml所得的种子培养物接种到100ml含50μg/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃振荡培养直至OD600nm达到0.5。此阶段向培养液中加入IPTG至终浓度为0.1mM，然后于37℃继续振荡培养过夜。
所得的过夜培养物于4℃下以6500r.p.m.离心20分钟回收细胞，将片状沉淀物重悬于10ml柱缓冲液中。所得悬液中的细胞用超声破碎仪破碎，0℃下8,000r.p.m离心30分钟。所得的上清液即含有可溶性的蛋白质部分。
将该可溶性的蛋白质部分加在1ml直链淀粉树脂柱上进行层析。用10ml含10mM麦芽糖的柱缓冲液洗脱。将从层析中得到的融合蛋白质贮存作为抗原备用。(b)免疫的小鼠脾细胞的制备
往上面(a)步骤中纯化的2ml(相当于200μg)抗原中加入2ml弗氏完全佐剂以形成乳剂。将该乳剂抽入装有玻璃活塞的5ml注射器筒内，通过皮下注射免疫年龄为8周的雄性BALB/C小鼠。
进行第二次免疫时，佐剂使用弗氏不完全佐剂，但与第一次免疫的程序相同。以大约每2周免疫一次的速度共做四次免疫。
开始第二次免疫时，免疫前直接从眼基底静脉丛取血，用固相酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中抗KM31-7抗体的效价。固相抗KM31-7 ELISA
在96孔ELISA板(Costar)的各孔中加入用作抗原的150-200μl(约相当于200ng的融合蛋白质)从pSRα31-7转染的COS-1细胞中得到的无血清培养物上清液。平板于4℃下过夜，使溶液包被板孔的底部表面。第二天，平板用0.1％Tween-20/磷酸盐缓冲盐水(0.1％Tween 20/PBS)洗3次，然后每孔加入100μl以PBS配成10μg/ml浓度的BSA溶液，室温放置1小时。
然后，再用0.1％Tween 20/PBS将平板洗3次，并向各孔内加入30-100μl系列稀释之样品形式的第一抗体(例如小鼠血清、杂交瘤培养物上清液或单克隆抗体)，并将平板于室温下放置1小时。
然后，将平板再用0.1％Tween 20/pBS洗三次，每孔加入100μl的第二抗体。第二抗体由羊抗小鼠IgG过氧化物酶复合物(Amersham)的3000倍稀释液或羊抗小鼠IgG-碱性磷酸酶复合物(BIO-RAD)的3000倍稀释液制成。平板于室温下放置1至2小时。
然后，平板再用0.1％Tween 20/pBS洗三次，各孔内加入100μl过氧化物酶底物溶液(BIO-RAD，过氧化物酶底物试剂盒ABTS)或含0.001％磷酸对硝基苯酯的10％乙醇胺溶液。将平板在室温下放置15至30分钟，然后可使用微板阅读议(BIO-RAD)测415nm或405nm处吸光率以计算出抗体滴度(效价)。(c)小鼠骨髓瘤细胞的制备
在正常培养基(完全GIT)中培养8-氮鸟嘌呤抗性小鼠骨髓瘤细胞P3-X63-Ag8.653(653)(ATCC no.CRL-1580)，最少得到2×107个细胞。(d)杂交瘤的制备
按上文(b)中所述方法进行免疫后得到1.4×108个被免疫小鼠的脾细胞，并用DMEM(Nissui Pharmaceutical)彻底洗细胞。洗过的细胞与上述步骤c)中制备的1.5×107个小鼠骨髓瘤细胞P3-X63-Ag 8.653(653)混合，并将所得混合物以800r.p.m离心6分钟。
收集由脾细胞和P3-X63-Ag.653(653)细胞的混合物组成的细胞团并分散开所形成的沉淀饼。预先将聚乙二醇4000(聚乙二醇#4000)用DMEM配成50％溶液。将该溶液在1分钟时间内以2ml/分的速度边搅拌边滴入分散开的细胞中。然后DMEM以同样的方式在1分钟内以2ml/分钟的速度加入细胞样品中。按上述方法再一次加入聚乙二醇和DMEM溶液。最后，在3分钟内逐渐加入16ml DMEM。所得的细胞制品以800r.p.m离心6分钟。弃去上清液，将细胞悬浮于35ml含5至10ng/ml小鼠IL-6的完全GIT中。(e)杂交瘤的筛选
100μl上述步骤d)中制备的悬液加入96孔板的各孔中(Sumitomo Bakelite)并在7.5％CO2培养箱中于37℃下培养。培养7天后，每孔中加入50μl HAT培养基，再培养4天后，每孔再加入50μl HAT培养基。平板再培养3天。此后，在可观察到融合细胞之菌落生长的孔中取部分培养上清液样品，按上面步骤b)中所述的固相ELISA法测定抗KM31-7抗体的滴度。立即用HT培养基代替取样的培养基。(f)克隆：
用有限稀释分析法将从用作阳性的试验孔中得到的细胞重复克隆三次。选择那些观察到具有恒定抗体效价的克隆用作产生抗KM31-7单克隆抗体的杂交瘤细胞系。尤其是在这一阶段，不仅按上述步骤b)所述方法进行ELISA，而且还使用得自pCDL-pSRα296转染之COS-1细胞的无血清培养物上清液制备固相，进行对照ELISA。从而，选择那些与前者反应但不与对照ELISA反应的细胞系进行克隆。(g)单克隆抗体的纯化
从产生抗KM31-7单克隆抗体的杂交瘤细胞系中收集培养物上清液，用0.22μm滤器(Millipore)过滤除菌，然后用MAb Trap GⅡ(Pharmacia)纯化抗体。(h)检测单克隆抗体1)单克隆抗体的抗原特异性
用从pSRα31-7转染的COS-1细胞得到的无血清培养物上清液做免疫沉淀试验，以证实单克隆抗体是对KM31-7蛋白质特异的。2)单克隆抗体的分类
使用小鼠单克隆抗体分型试剂盒(Amersham)进行本试验，鉴定该抗体为属于IgG1亚类的抗体。
                  实施例17用抗原-抗体反应分离和纯化KM31-7蛋白质
按上面实施例16h)1)中所述方法进行。还用抗体和从pcDL-pSRα296转染的COS-1细胞得到的无血清上清液重复同一试验。
各1.7ml无血清上清液中加入1.4μg单克隆抗体，室温反应1小时，同时在2.2ml小离心管中以20r.p.m离心。用不加单克隆抗体的pSRα31-7转染的COS-1细胞无血清上清液作为对照。
各管中加入30μl预先用0.1％Tween 20/PBS洗过的Protein GSepharose 4 Fast Flow(Pharmacia)以吸附抗体，并在室温下以20r.p.m的速率继续离心30分钟。
每份混合物在小离心管中以10000r.p.m离心几秒钟后，小心弃去上清液，以免丢失沉淀物。将沉淀物分别用0.1％Tween 20/PBS洗涤并离心，再以同样的方法洗5次。
将所得沉淀悬浮于含10μl2-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液中。每份悬液于90℃加热2分钟，然后使用12.5％凝胶在还原条件下进行SDS-PAGE。电泳后，将产物从聚丙烯酰胺凝胶上转移到硝酸纤维素膜(Bio-RAD)上。用实施例1(a)部分中所述的抗KM31-7多克隆抗体和确定从COS-1/pSRα31-7无血清培养物上清液中特异地沉淀KM31-7蛋白质的抗KM31-7单克隆抗体进行Western吸印分析。
                  实施例18Cyvv-NIa/KM31-7融合蛋白质的制备
为了用CYVV-NIa蛋白酶技术表达KM31-7蛋白，必须将NIa基因3′端连接到与KM31-7蛋白DNA相同的阅读框架中。因此，完成下述二步骤程序：ⅰ)将KM31-7cDNA的3′侧链(SmaⅠ-XbaⅠ,1006bp)引入pKSUN9中
为了得到含有KM31-7cDNA 3′端的SmaⅠ-XbaⅠ片段(1,006bp)，用限制性内切酶SmaⅠ和XbaⅠ消化7μg的pSRα31-7质粒DNA，并使用0.8％琼脂糖凝胶，以GENE CLEANⅡ(Funakoshi Japan)收集和纯化所得的片段。
同时，用SmaⅠ和XbaⅠ同样地消化5μg pKSUN9质粒DNA，用牛碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,E.coliC75,Takara Shuzo,Japan)使裂解片段去磷酸化。将所得去磷酸的线性化的DNA用连接试剂盒(Takara Shuzo)与SmaⅠ-XbaⅠKM-31片段连接，用所得构建体转化E.coli菌株JMl09。选择并筛选转化体得到含SmaⅠ-XbaⅠ片段的pNⅠa31-7SX克隆。ⅱ)NIa蛋白酶和KM31-7的连接
为了将NIa的C端序列与在同一阅读框架中有Val N末端残基之KM31-7亚型的N端序列相连接，使用一Perkin-Elmer JapanApplied Biosystems392型DNA合成仪构建4个类型的聚合酶链反应(PCR)引物。引物如下：5′GGT CAG CAC AAA TIT CCA3′         SEQ.ID No.15(1)5′AAA CAC AAC TTG GAA TGA ACA ATT 3′SEQ.ID No.16(2)5′TCA TTC CAA GTT GTG TTT GTG AAA 3′SEQ.ID No.17(3)5′CAT AGG ATG CTC CAA CAA 3′    SEQ.ID No.18(4)
第一轮PCR用1μg pKSUN9质粒DNA作模板完成。将引物(1)和(2)各100pmol和1/10体积10倍浓度的Taq聚合酶反应缓冲溶液及最后5单位Taq聚合酶(Takara Shuzo)按此顺序加入反应溶液中。PCR反应先在72℃下进行3分钟，随后进行30个循环：94℃,1分钟；55℃,2分钟和72℃,3分钟，以72℃处理10分钟结束。PCR反应后，对扩增的DNA产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳。用溴化乙锭染色鉴定含DNA的凝胶条并切下之。向各压碎的凝胶条中加入300μl洗脱缓冲液(0.5乙酸铵，1mM EDTA,pH8.0)37℃下保温过夜。离心得到含有经纯化和扩增之DNA的上清液。
用同样的方式再进行一次PCR，但使用1μg的pUCKM31-7质粒DNA作模板并用引物(3)和(4)，所得DNA纯化方法同上所述。
第一次PCR扩增的片段含有编码KM31-7蛋白质N末端残基的序列，从Val-Val-Phe开始，一直到NIa XhoⅠ位点上游的31bp处。第二次pCR扩增的片段含有编码Asn-Cys-Ser-Phe-Gln，从NIa之C末端到KM31-7cDNA之SmaⅠ位点下游32bp的序列。
因此，当用从两次PCR得到的DNA片段及引物(1)和(4)进行PCR时，产生一条由9bp的NIa之3′端与15bp的编码KM31-7所需N-端的序列组成的杂交链。这样，可能产生一条以这一部分作为连接子的融合DNA序列。
根据这一逻辑，有充分理由地用这种方式进行第二轮PCR，并从凝胶中收集扩增的片段。ⅲ)将NIa/KM31-7DNA引入pNIa31-7SX中
从ⅰ)中得到的5μg pNIa31-7SX质粒DNA用XhoⅠ和SmaⅠ消化后，用牛碱性磷酸酶处理所得DNA使之脱磷酸化。在ⅱ)中制备的PCR产物也用XhoⅠ和SmaⅠ消化，将所得片段用连接试剂盒与经消化并脱磷酸化的pNIa31-7SX连接。用所得的构建体转化E.coli菌株JM109。
然后选择并筛选出AmpR转化菌。筛选是通过用XhoⅠ消化及随后做凝胶电泳进行的。选择仅含有8.0Kbp带的克隆。然后用HindⅢ消化所选出之克隆的质粒并再做凝胶电泳。所选择的质粒有一条330bp带，相当于NIa之cDNA插入段的一部分。该质粒被命名为pNⅠa31-7V，其含有XhoⅠ和SmaⅠPCR产物。
测定克隆pNIa31-7V的碱基序列，且证实了编码NIa和KM31-7的序列被连接在同一阅读框架中，带有位于NIa和KM31-7蛋白质之间的必要的Gln-Val裂解序列。ⅳ)KM31-7蛋白质的生产
Western印迹证实pNⅠa31-7V在E.coli中发挥功能，并且KM31-7蛋白质是由构建的重组基因表达的。
含有pNⅠa31-7V的E.coli种子培养物在3ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振荡培养过夜。取1ml种子培养物加入100ml含50μg/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃振荡培养至OD600nm值达到1.0。此时，往培养液中加入IPTG至终浓度为1mM，然后将培养物在28℃下继续振荡培养两夜。
此后，将1ml培养物转移到一个小离心管中，以15000rpm离心5分钟。弃去上清液，片状沉淀物与300μl无菌水和300μl含2-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液混合以分散沉积的细胞体。所得的悬液于95℃加热2分钟，然后取10μl这种悬液在还原条件下用8％凝胶做SDS-PAGE。
电泳后，将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上。这一过程通过将凝胶与膜接触，并在转录缓冲液(25mM Tris-HCl,1.4％甘氨酸和20％甲醇)中于4℃保温2.5小时，并使用凝胶膜转录装置(Marisol,Japan)在19V下完成。
然后，用20mlPBS-T培养基洗硝酸纤维素膜，再在20ml含5％脱脂乳(Snow Brand Co.Ltd)的PBS-T中封闭1小时。然后，膜用2份20ml的PBS-T漂洗，再在含1μl在无菌水中作100倍稀释的抗KM31-7兔MAb血清(第一抗体)的20ml PBS-T中反应90分钟。然后将硝酸纤维素膜漂洗一次15分钟，再洗二次各5分钟，每次均使用20ml PBS-T
将洗过的膜浸入在PBS-T中3,000倍稀释的过氧化物酶标记的抗兔IgG羊抗体(BIO-RAD)(用作上述第二抗体)溶液中，并放置1小时。然后用20ml PBS-T洗膜并转移到ECL检测试剂(Amersham)溶液中，经过放射自显影检测出与抗KM31-7抗体反应的带。
进行Western印迹分析并检测到一条分子量约为60,000的带。该带表现出与用作对照的用pSRα31-7转染COS-1细胞得到的无血清培养物上清液中检测到的三种KM31-7蛋白质中分子量次大的蛋白质具有相同的迁移率。
                    培养基xM磷酸盐缓冲液
一种Na2HPO4的xM溶液，用xM NaH2PO4溶液调到所需的pH值。接种缓冲液
0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7.0,0.05MEDTA,1％2-巯基乙醇。提取缓冲液
0.1M Tris-HCl缓冲液，0.05MEDTA,1％2-巯基乙醇，pH7.0。降解溶液
200mM碳酸铵，2％SDS,2mMEDTA,400μg/ml皂土和20μg/ml蛋白酶K(pH9.0)。1×SSC
0.15M NaCl,0.015M柠檬酸三钠，pH7.0。液态LB培养基
10g Bacto Tryptone(Difco),5g Bacto酵母提取物(Difco)和5g氯化钠，用蒸馏水定容到1升。Tris-钙缓冲液
10mM Tris,50mM氯化钙，用盐酸调到pH7.4。溶胞缓冲液
0.17g蔗糖，250μl 1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，200μl 0.5MEDTA(pH8.0)，用重蒸水定容到20ml。碱-SDS溶液
0.2M氢氧化钠，1％SDS。TBE溶液
100mM Tris，100mM硼酸，1mMEDTA。变性溶液
1.5M氯化钠，0.5M氢氧化钠。中和缓冲液
0.5M Tris,3M氯化钠(p7.4)。50×Denhardt′s溶液
1％聚乙烯吡咯烷酮，1％牛血清白蛋白，1％Ficoll 400。溶液用双蒸水稀释，根据需要调到合适的浓度。5×变性缓冲液
125μl 1M甘氨酸(pH9.0),25μl 1M氯化镁，850μl重蒸水。5×标记缓冲液
25μl 1M Tris-HCl缓冲液(pH7.9),5μl 1M氯化镁，2.5μl1M二硫苏糖醇，9.2μl重蒸水。10×M9盐溶液
0.145M磷酸氢二钠，0.172M磷酸二氢钾，0.187M氯化铵，0.137M氯化钠，pH7.0。M9基本琼脂培养基
10ml 10×M9盐溶液，100μl 1M硫酸镁，1ml 20％葡萄糖，50μl 1％盐酸硫胺素盐，1ml 0.01M氯化钙和13ml重蒸水，混合后过滤灭菌，在往平皿中加入50ml 3％细菌琼脂后立即注入该混合液。液态SOB培养基
10g细菌蛋白胨，2.5g细菌酵母提取物，100μl 5M氯化钠和125μl 1M氯化钾混合，加蒸馏水定容到500ml。高压灭菌后，加入5ml 1M氯化镁和5ml 1M硫酸镁。TFB1缓冲液
5ml 1M 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES-以lNHcl 调节至pH6.2),6.045g氯化铷，0.735g二水合氯化钙和4.94g四水合氯化锰混合，用冰乙酸调到pH5.8，用重蒸水定容到500ml并过滤灭菌。TFB2缓冲液
1ml 1M2-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS),1.102g二水合氯化钙，0.12g氯化铷和15ml甘油混合，用冰乙酸调pH6.5，用重蒸水定容到100ml并过滤灭菌。液态SOC培养基
5ml液体SOC介质，90μ120％葡萄糖。2×YT培养基
16g细菌蛋白胨，5g细菌酵母提取物和5g氯化钠混合，用重蒸水定容到1升。PBS-Tw培养基
80mM磷酸氢二钠，20mM磷酸二氢钠，100nM氯化钠，0.1％Tween-20。PBS-T培养基
4g氯化钠，0.1g磷酸二氢钾，1.45g十二水合磷酸氢二钠，0.1g氯化钾和0.1g叠氮钠，用重蒸水调到1升，pH7.4。碱性磷酸酶底物溶液
0.01％磷酸对硝基苯酯溶于用盐酸调到pH9.8的10％二乙醇胺水溶液中。培养基A
DMEM(Dulbecco氏修饰的Eagle培养基，含4.5g/l葡萄糖)，10％灭活的小牛血清(Hyclone生产)和10mMHEPES(pH7.2)。培养基B
DMEM(含4.5g/l葡萄糖)，10mM HEPES(pH7.2)，3％灭活的小牛血清，5μg/ml牛胰岛素(Sigma生产)，8μg/ml d-生物素(Sigma生产)，4μg/ml泛酸(Sigma生产)，1.0μM地塞米松(Sigma生产)和0.5mM异丁基甲基黄嘌呤(Aldrich生产)。培养基C
DMEM(含4.5g/l葡萄糖)含5％灭活的小牛血清，10mM HEPES(pH7.2)和100ng/ml牛胰岛素。培养基D
DMEM(含4.5g/l葡萄糖)，5％灭活小牛血清，10mM HEPES(pH7.2)，100ng/ml牛胰岛素和10U/ml肝素钠(Novo Industry Co.生产)。LPL底物溶液
13mM甘油三[9,10(n)-3H]油酸酯(51.8KBq/μmol,Amersharm生产)，1.3mg/ml L-α-磷酸酰胆碱二硬脂酰(Sigma Co.生产)，20mg/l牛血清白蛋白(Sigma Co.生产)，135mM Tris-盐酸[Tris-HCl(pH8.1),Sigma Co.生产]，16.5％(V/V)甘油和16.5％(V/V)灭活的小牛血清。硫氰酸胍溶液
4M硫氰酸胍，1％Sarkosyl,20mM乙二胺四乙酸(EDTA),25nM柠檬酸钠(pH7.0),100mM42-巯基乙醇和0.1％消泡剂A(Sigma)。吸附缓冲液
0.5M NaCl,20mM Tris-HCl(pH7.5),1mM EDTA和0.1％SDS。洗脱溶液
10mM Tris-HCl(pH7.5),1mM EDTA和0.05％SDS。实施例2的逆转录酶反应溶液
50ml Tris-HCl(pH8.3),8mM MgCl2,30mM KCl,0.3nM二硫苏糖醇，2mM dATP,2mM dGTP,2mM dTTP,10μCi[α-32P]dCTP和1.4μg引物DNA载体(3′-Oligo(dT)结尾的PCDV-1,Pharmacia)。末端转移酶反应溶液
140mM二甲胂酸钾,30mM Tris-HCl(pH6.8),1mM CoCl2,0.5mM二硫苏糖醇，0.2μg poly A和100mM dCTP。限制性酶缓冲液
50mM NaCl,10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2和1mM二硫苏糖醇。10体积连接酶缓冲液
10mM ATP,660mM Tris-HCl(pH7.5),66mM MgCl2和100mM二硫苏糖醇。电泳染料
50％甘油，0.01M磷酸氢二钠(pH7.0)和0.4％溴酚蓝。1×TAE
0.04 Tris-乙酸，0.001M EDTA。1×SSCP
120mM NaCl,15mM柠檬酸钠，13mM磷酸二氢钾，和1mM EDTA。实施例6的逆转录酶反应溶液
1×第一条链合成缓冲液，5％焦磷酸钠，100单位核糖核酸酶抑制剂，1mM dATP,1mM dGTP,1mM dTTP,0.5mM dCTP和3.75μg oligo(dT)引物，均随cDNA克隆系统(Amersham)提供。SM缓冲液
100mM NaCl,8mM MgSO4·7H2O,50mM Tris-HCl(pH7.5)和0.01％明胶。透析缓冲液
20mM磷酸盐缓冲液(pH7.8)和0.5M NaCl。柱缓冲液
10mM Tris-HCl(pH7.4),200mM NaCl和1mM EDTA。Taq聚合酶反应缓冲溶液
Taq含500mM Tris-HCl(pH8.3),500mM KCl,15mM MgCl2,100mM dATP,100mM dCTP,100mM dGTP,100mMdTTP和2mg/ml明胶。
序列表序列ID号：1序列长度：1320序列类型：核酸链型：双链拓扑学：线型分子类型：mRNA的cDNA反意：无原始来源：生物：三叶草黄脉病毒特征：1-1320 E CDS
  10-1311 E mat多肽序列描述：AAG TTC CAA GGG AAA AGT AAG AGA ACA AGA CAA AAG TTG AAG TTC AGA    48Lys Phe Gln Gly Lys Ser Lys Arg Thr Arg Gln Lys Leu Lys Phe Arg1               5                  10                 15GCG GCA AGA GAC ATG AAG GAT CGT TAT GAA GTG CAT GCC GAT GAG GGG    96Ala Ala Arg Asp Met Lys Asp Arg Tyr Glu Val His Ala Asp Glu Gly
         20                  25                  30ACT TTA GTG GAA AAT TTT GGA ACT CGT TAT TCA AAG AAA GGC AAG ACA   144Thr Leu Val Glu Asn Phe Gly Thr Arg Tyr Ser Lys Lys Gly Lys Thr
     35                  40                  45AAA GGT ACT GTT GTG GGT TTG GGT GCA AAA ACA AGA CGG TTC ACT AAC   192Lys Gly Thr Val Val Gly Leu Gly Ala Lys Thr Arg Arg Phe Thr Asn
 50                  55                  60ATG TAT GGT TTT GAC CCC ACG GAG TAT TCA TTT GCT AGG TAT CTT GAT  240Met Tyr Gly Phe Asp Pro Thr Glu Tyr Ser Phe Ala Arg Tyr Leu Asp65                  70                  75                  80CCA ATC ACG GGT GCA ACA TTG GAT GAA ACC CCA ATT CAC AAT GTA AAT  288Pro Ile Thr Gly Ala Thr Leu Asp Glu Thr Pro Ile His Asn Val Asn
             85                  90                  95TTG GTT GCT GAG CAT TTT GGC GAC ATA AGG CTT GAT ATG GTT GAC AAG  336Leu Val Ala Glu His Phe Gly Asp Ile Arg Leu Asp Met Val Asp Lys
        100                 105                 110GAG TTA CTT GAC AAA CAG CAC TTA TAC CTC AAG AGA CCA ATA GAA TGT  384Glu Leu Leu Asp Lys Gln His Leu Tyr Leu Lys Arg Pro Ile Glu Cys
     115                 120                125TAC TTT GTA AAG GAT GCT GGT CAG AAG GTG ATG AGG ATT GAT CTA ACA  432Tyr Phe Val Lys Asp Ala Gly Gln Lys Val Met Arg Ile Asp Leu Tnr
    130             135                 140CCC CAC AAC CCA TTG TTG GCA AGC GAT GTT AGC ACA ACC ATA ATG GGT  480Pro His Asn Pro Leu Leu Ala Ser Asp Val Ser Thr Thr Ile Met Gly145                150                  155                 160TAT CCT GAG AGA GAA GGT GAA CTC CGT CAA ACT GGA AAG GCA AGG TTA  528Tyr Pro Glu Arg Glu Gly Glu Leu Arg Gln Thr Gly Lys Ala Arg Leu
            165                 170                 175GTC GAC CCA TCA GAG TTG CCC GCG CGG AAT GAG GAT ATT GAT GCA GAG  576Val Asp Pro Ser Glu Leu Pro Ala Arg Asn Glu Asp Ile Asp Ala Glu
        180                 185                 190TTT GAG AGT CTA AAT CGC ATA AGT GGT TTG CGC GAC TAT AAT CCC ATT  624Phe Glu Ser Leu Asn Arg Ile Ser Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro Ile
    195                 200                 205TCA CAA AAT GTT TGC TTG CTA ACA AAT GAG TCA GAA GGC CAT AGA GAG  672Ser Gln Asn Val Cys Leu Leu Thr Asn Glu Ser Glu Gly His Arg Glu
210                 215                 220AAG ATG TTT GGA ATT GGA TAT GGT TCA GTG ATC ATT ACA AAT CAA CAT  720Lys Met Phe Gly Ile Gly Tyr Gly Ser Val Ile Ile Thr Asn Gln His225                 230                 235                 240CTG TTC AGA AGG AAT AAT GGG GAG TTA TCA ATT CAA TCC AAG CAT GGC  768Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly Glu Leu Ser Ile Gln Ser Lys His G1y
            245                 250                 255TAC TTC AGA TGC CGC AAC ACC ACA AGC TTG AAG ATG CTG CCT TTG GAG  816Tyr Phe Arg Cys Arg Asn Thr Thr Ser Leu Lys Met Leu Pro Leu Glu
        260                 265                 270GGA CAT GAC ATT TTG TTG ATT CAG TTA CCA AGG GAC TTT CCA GTG TTT  864Gly His Asp Ile Leu Leu Ile Gln Leu Pro Arg Asp Pha Pro Val Phe
    275                 280                 285CCA CAA AAG ATT CGC TTT AGG GAG CCA AGA GTG GAT GAC AAA ATT GTT  912Pro Gln Lys Ile Arg Phe Arg Glu Pro Arg Val Asp Asp Lys Ile Val
290                 295                 300TTG GTC AGC ACA AAT TTC CAG GAA AAG AGT TCC TCG AGC ACG GTC TCA  960Leu Val Ser Thr Asn Phe Gln Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Val Ser305                 310                 315                 320GAG TCC AGT AAC ATT TCA AGA GTG CAG TCA GCC AAT TTC TAC AAG CAT 1008Glu Ser Ser Asn Ile Ser Arg Val Gln Ser Ala Aan Phe Tyr Lys His
            325                 330                 335TGG ATC TCA ACA GTA GCA GGA CAC TGT GGA AAC CCT ATG GTT TCG ACT 1056Trp Ile Sar Thr Val Ala Gly His Cys Gly Asn Pro Met Val Ser Thr
        340                 345                 350AAA GAT GGA TTT ATT GTA GGT ATC CAC AGT CTT GCT TCA TTG ACA GGC 1104Lys Asp Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Leu Ala Ser Leu Thr Gly
    355                 360                 365GAC GTT AAC ATC TTC ACA AGC TTT CCG CCG CAG TTT GAG AAC AAA TAT 1152Asp Val Asn Ile Phe Thr Ser Phe Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Tyr
370                 375                 380CTA CAG AAG CTC AGT GAA CAC ACA TGG TGT AGT GGA TGG AAA CTA AAT 1200Leu Gln Lys Leu Ser Glu His Thr Trp Cys Ser Gly Trp Lys Leu Asn385                 390                 395                 400CTT GGA AAG ATT AGT TGG GGT GGA ATC AAC ATT GTG GAG GAT GCA CCT 1248Leu Gly Lys Ile Ser Trp Gly Gly Ile Asn Ile Val Glu Asp Ala Pro
            405                 410                 415GAA GAG CCC TTT ATA ACA TCC AAG ATG GCA AGC CTT CTT AGT GAT TTG 1296Glu Glu Pro Phe Ile Thr Ser Lys Met Ala Ser Leu Leu Ser Asp Leu
        420                 425                 430AAT TGT TCA TTC CAA GCA AGT GCG                                 1320Asn Cys Ser Phe Gln Ala Ser Ala
    435                 440序列ID号：2序列长度：440序列类型：氨基酸拓朴学：线型分子类型：蛋白质反意：无来源：生物：三叶草黄脉病毒特征：4-437 E mat-肽序列描述：Lys Phe Gln Gly Lys Ser Lys Arg Thr Arg Gln Lys Leu Lys Phe Arg1               5                  10                  15Ala Ala Arg Asp Met Lys Asp Arg Tyr Glu Val His Ala Asp Glu Gly
         20                  25                  30Thr Leu Val Glu Asn Phe Gly Thr Arg Tyr Ser Lys Lys Gly Lys Thr
     35                  40                  45Lys Gly Thr Val Val Gly Leu Gly Ala Lys Thr Arg Arg Phe Thr Asn
 50                  55                  60Met Tyr Gly Phe Asp Pro Thr Glu Tyr Ser Phe Ala Arg Tyr Leu Asp65                  70                  75                  80Pro Ile Thr Gly Ala Thr Leu Asp Glu Thr Pro Ile Hie Asn Val Asn
             85                  90                  95Leu Val Ala Glu His Phe Gly Asp Ile Arg Leu Asp Met Val Asp Lys
        100                 105                 110Glu Leu Leu Asp Lys Gln His Leu Tyr Leu Lys Arg Pro Ile Glu Cys
    115                 120                 125Tyr Phe Val Lys Asp Ala Gly Gln Lys Val Met Arg Ile Asp Leu Thr
130                 135                 140Pro His Asn Pro Leu Leu Ala Ser Asp Val Ser Thr Thr Ile Met Gly145                 150                 155                 160Tyr Pro Glu Arg Glu Gly Glu Leu Arg Gln Thr Gly Lys Ala Arg Leu
            165                 170                 175Val Asp Pro Ser Glu Leu Pro Ala Arg Asn Glu Asp Ile Asp Ala Glu
        180                 185                 190Phe Glu Ser Leu Asn Arg Ile Ser Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro Ile
    195                 200                 205Ser Gln Asn Val Cys Leu Leu Thr Asn Glu Ser Glu Gly His Arg Glu
210                 215                 220Lys Met Phe Gly Ile Gly Tyr Gly Ser Val Ile Ile Thr Asn Gln His225                 230                 235                 240Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly Glu Leu Ser Ile Gln Ser Lys His Gly
            245                 250                 255Tyr Phe Arg Cys Arg Asn Thr Thr Ser Leu Lys Met Leu Pro Leu Glu
        250                 265                 270Gly His Asp Ile Leu Leu Ile Gln Leu Pro Arg Asp Phe Pro Val Phe
    275                 280                 285Pro Gln Lys Ile Arg Phe Arg Glu Pro Arg Val Asp Asp Lys Ile Val
290                 295                 300Leu Val Ser Thr Asn Phe Gln Glu Lys Ser Ser Sar Ser Thr Val Ser305                 310                 315                 320Glu Ser Ser Asn Ile Ser Arg Val Gln Ser Ala Asn Phe Tyr Lys His
            325                 330                 335Trp Ile Ser Thr Val Ala Gly His Cys Gly Asn Pro Mec Val Ser Thr
        340                 345                 350Lys Asp Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Leu Ala Ser Leu Thr Gly
    355                 360                 365Asp Val Asn Ile Phe Thr Ser Phe Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Tyr
370                 375                 380Leu Gln Lys Leu Ser Glu His Thr Trp Cys Ser Gly Trp Lys Leu Asn385                 390                 395                 400Leu Gly Lys Ile Ser Trp Gly Gly Ile Asn Ile Val Glu Asp Ala Pro
            405                410                415Glu Glu Pro Phe Ile Thr Ser Lys Met Ala Ser Leu Leu Ser Asp Leu
        420                 425                 430Asn Cys Ser Phe Gln Ala Sar Ala
    435                 440序列ID号：3序列长度：25序列类型：核酸拓朴学：线型分子类型：其它核酸合成DNA序列描述：GTCCATGGGG AAAAGTAAGA GAACA 25序列ID号：4序列长度：20序列类型：核酸拓朴学：线型分子类型：其它核酸，合成的DNA序列描述：ACTCTGAGAC CGTGCTCAGAG 20序列ID号：5序列长度：20序列类型：核酸拓朴学：线型分子类型：其他核酸，合成的DNA序列描述：AGGAAAGAG TTCCTCGAGC序列ID号：6序列长度：36序列类型：核酸拓朴学：线型分子类型：其它核酸，合成的DNA序列描述：AATTTGTTCAT TCCAAGCACC TGGGCCACCA CCTGGC 36序列ID号：7序列长度：36序列类型：核酸拓朴：线型分子类型：其它核酸，合成的DNA序列描述：GCCAGGTGGT GGCCCAGGTG CITGGAATGA ACAATT 36序列ID号：8序列长度：30序列类型：核酸拓朴：线型分子类型：其它核酸，合成的DNA序列描述：TTGTCAGCAC ACCTGGGAGC TGTAGAGCTC 25序列ID号：9序列长度：7序列类型：氨基酸拓朴学：线型分子类型：蛋白质序列描述：Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly 7
             5序列ID号：10序列长度：7序列类型：氨基酸拓朴学：线型分子类型：蛋白质序列描述：Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro 7
             5序列ID号：11序列长度：1650序列类型：核酸链型：双链拓朴学：线型分子类型：mRNA的cDNA来源生物：Homo sapiens特征：表达特征的符号：CDS存在位置：1..1647检测特征的方法：E表达特征的符号：mat-肽存在位置：70..1647检测特征的方法：E表示特征的符号：sig肽存在位置：1..69检测特征的方法：E序列：ATG TCA TGT GAG GAC GGT CGG GCC CTG GAA GGA ACG CTC TCG GAA TTG   48Met Ser Cys Glu Asp Gly Arg Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ser Glu Leu-23         -20                 -15                 -10GCC GCG GAA ACC GAT CTG CCC GTT GTG TTT GTG AAA CAG AGA AAG ATA   96Ala Ala Glu Thr Asp Leu Pro Val Val Phe Val Lys Gln Arg Lys Ile
    -5                    1               5GGC GGC CAT GGT CCA ACC TTG AGG GCT TAT CAG GAG GGC AGA CTT CAA  144Gly Gly His Gly Pro Thr Leu Lys Ala Tyr Gln Glu Gly Arg Leu Gln10                  15                  20                  25AAG CTA CTA AAA ATG AAC GGC CCT GAA GAT CTT CCC AAG TCC TAT GAC  192Lys Leu Leu Lys Met Asn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lys Ser Tyr Asp
             30                  35                  40TAT GAC CTT ATC ATC ATT GGA GGT GGC TCA GGA GGT CTG GCA GCT GCT  240Tyr Asp Leu Ile Ile Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala
         45                  50                  55AAG GAG GCA GCC CAA TAT GGC AAG AAG GTG ATG GTC CTG GAC TTT GTC  288Lys Glu Ala Ala Gln Tyr Gly Lys Lys Val Met Val Leu Asp Phe Val
     60                  65                  70ACT CCC ACC CCT CTT GGA ACT AGA TGG GGT CTT GGA GGA ACA TGT GTG  336Thr Pro Thr Pro Leu Gly Thr Arg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys Val
 75                  80                  85AAT GTG GGT TGC ATA CCT AAA AAA CTG ATG CAT CAA GCA GCT TTG TTA  384Asn Val Gly Cys Ile Pro Lys Lys Leu Met His Gln Ala Ala Leu Leu90                  95                 100                 105GGA CAA GCC CTG CAA GAC TCT CGA AAT TAT GGA TGG AAA GTC GAG GAG  432Gly Gln Ala Leu Gln Asp Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu
            110                 115                 120ACA GTT AAG CAT GAT TGG GAC AGA ATG ATA GAA GCT GTA CAG AAT CAC  480Thr Val Lys His Asp Trp Asp Arg Met Ile Glu Ala Val Gln Asn His
        125                 130                 135ATT GGC TCT TTG AAT TGG GGC TAC CGA GTA GCT CTG CGG GAG AAA AAA  528Ile Gly Ser Leu Asn Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lys Lys
    140                 145                 150GTC GTC TAT GAG AAT GCT TAT GGG CAA TTT ATT GGT CCT CAC AGG ATT  576Val Val Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Phe Ile Gly Pro His Arg Ile
155                 160                 165AAG GCA ACA AAT AAT AAA GGC AAA GAA AAA ATT TAT TCA GCA GAG AGA  624Lys Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Arg170                 175                 l80                 185TTT CTC ATT GCC ACT GGT GAA AGA CCA CGT TAC TTG GGC ATC CCT GGT  672Phe Leu Ile Ala Thr Gly Glu Arg Pro Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Gly
            190                 195                 200GAC AAA GAA TAC TGC ATC AGC AGT GAT GAT CTT TTC TCC TTG CCT TAC  720Asp Lys Glu Tyr Cys Ile Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu Pro Tyr
        205                 210                 215TGC CCG GGT AAG ACC CTG GTT GTT GGA GCA TCC TAT GTC GCT TTG GAG  768Cys Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Tyr Val Ala Leu Glu
    220                 225                 230TGC GCT GGA TTT CTT GCT GGT ATT GGT TTA GAC GTC ACT GTT ATG GTT  816Cys Ala Gly Phe Leu Ala Gly Ile Gly Leu Asp Val Thr Val Met Val
235                 240                 245AGG TCC ATT CTT CTT AGA GGA TTT GAC CAG GAC ATG GCC AAC AAA ATT  864Arg Ser Ile Leu Leu Arg Gly Phe Asp Gln Asp Met Ala Asn Lys Ile250                 255                 260                 265GGT GAA CAC ATG GAA GAA CAT GGC ATC AAG TTT ATA AGA CAG TTC GTA  912Gly Glu His Met Glu Glu His Gly Ile Lys Phe Ile Arg Gln Phe Val
            270                 275                 280CCA ATT AAA GTT GAA CAA ATT GAA GCA GGG ACA CCA GGC CGA CTC AGA  960Pro Ile Lys Val Glu Gln Ile Glu Ala Gly Thr Pro Gly Arg Leu Arg
        285                 290                 295GTA GTA GCT CAG TCC ACC AAT AGT GAG GAA ATC ATT GAA GGA GAA TAT 1008Val Val Ala Gln Ser Thr Asn Ser Glu Glu Ile Ile Glu Gly Glu Tyr
    300                 305                 310AAT ACG GTG ATG CTG GCA ATA GGA AGA GAT GCT TGC ACA AGA AAA ATT 1056Asn Thr Val Met Leu Ala Ile Gly Arg Asp Ala Cys Thr Arg Lys Ile
315                 320                 325GGC TTA GAA ACC GTA GGG GTG AAG ATA AAT GAA AAG ACT GGA AAA ATA 1104Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys Ile Asn Glu Lys Thr Gly Lys Ile350                 335                 340                 345CCT GTC ACA GAT GAA GAA CAG ACC AAT GTG CCT TAC ATC TAT GCC ATT 1152Pro Val Thr Asp Glu Glu Gln Thr Asn Val Pro Tyr Ile Tyr Ala Ile
            350                 355                 360GGC GAT ATA TTG GAG GAT AAG GTG GAG CTC ACC CCA GTT GCA ATC CAG 1200Gly Asp Ile Leu Glu Asp Lys Val Glu Leu Thr Pro Val Ala Ile Gln
        365                 370                 375GCA GGA AGA TTG CTG GCT CAG AGG CTC TAT GCA GGT TCC ACT GTC AAG 1248Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gln Arg Leu Tyr Ala Gly Ser Thr Val Lys
    380                 385                 390TGT GAC TAT GAA AAT GTT CCA ACC ACT GTA TTT ACT CCT TTG GAA TAT 1296Cys Asp Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr
395                 400                 405GGT GCT TGT GGC CTT TCT GAG GAG AAA GCT GTG GAG AAG TTT GGG GAA 1344Gly Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Val Glu Lys Phe Gly Glu410                 415                 420                 425GAA AAT ATT GAG GTT TAC CAT AGT TAC TTT TGG CCA TTG GAA TGG ACG 1392Glu Asn Ile Glu Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp Pro Leu Glu Trp Thr
            430                 435                 440ATT CCG TCA AGA GAT AAC AAC AAA TGT TAT GCA AAA ATA ATC TGT AAT 1440Ile Pro Ser Arg Asp Asn Asn Lys Cys Tyr Ala Lys Ile Ile Cys Asn
        445                 450                 455ACT AAA GAC AAT GAA CGT GTT GTG GGC TTT CAC GTA CTG GGT CCA AAT 1488Thr Lys Asp Asn Glu Arg Val Val Gly Phe His Val Leu Gly Pro Asn
    460                 465                 470GCT GGA GAA GTT ACA CAA GGC TTT GCA GCT GCG CTC AAA TGT GGA CTG 1536Ala Gly Glu Val Thr Gln Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Cys Gly Leu
475                 480                 485ACC AAA AAG CAG CTG GAC AGC ACA ATT GGA ATC CAC CCT GTC TGT GCA 1584Thr Lys Lys Gln Leu Asp Ser Thr Ile Gly Ile His Pro Val Cys Ala490                 495                 500                 505GAG GTA TTC ACA ACA TTG TCT GTG ACC AAG CGC TCT GGG GCA AGC ATC 1632Glu Val Phe Thr Thr Leu Ser Val Thr Lys Arg Ser Gly Ala Ser Ile
            510                 515                 520CTC CAG GCT GGC TGC TGA                                         1650Leu Gln Ala Gly Cys
        525序列ID号：12序列长度：526序列类型：氧基酸链型：单链拓朴学：线型分子类型：肽序列：Met Ser Cys Glu Asp Gly Arg Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ser Glu Leu-23         -20                 -15                 -10Ala Ala Glu Thr Asp Leu Pro Val Val Phe Val Lyg Gln Arg Lys Ile
    -5                    1               5Gly Gly His Gly Pro Thr Leu Lys Ala Tyr Gln Glu Gly Arg Leu Gln10                  15                  20                  25Lys Leu Leu Lys Met Asn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lys Ser Tyr Asp
             30                  35                  40Tyr Asp Leu Ile Ile Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala
         45                  50                  55Lys Glu Ala Ala Gln Tyr Gly Lys Lys Val Mat Val Leu Asp Phe Val
     60                  65                  70Thr Pro Thr Pro Leu Gly Thr Arg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys Val
75                  80                  85Asn Val Gly Cys Ile Pro Lys Lys Leu Met His Gln Ala Ala Leu Leu90                  95                 100                 105Gly Gln Ala Leu Gln Asp Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu
            110                 115                 120Thr Val Lys His Asp Trp Asp Arg Met Ile Glu Ala Val Gln Asn His
        125                 130                 135Ile Gly Ser Leu Asn Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lys Lys
    140                 145                 150Val Val Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Phe Ile Gly Pro Hie Arg Ile
155                 160                 165Lys Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Arg170                 175                 180                 185Phe Leu Ile Ala Thr Gly Glu Arg Pro Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Gly
            190                 195                 200Asp Lys Glu Tyr Cys Ile Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu Pro Tyr
        205                 210                 215Cys Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Tyr Val Ala Leu Glu
    220                 225                 230Cys Ala Gly Phe Leu Ala Gly Ile Gly Leu Asp Val Thr Val Met Val
235                 240                 245Arg Ser Ile Leu Leu Arg Gly Phg Asp Gln Asp Met Ala Asn Lye Ile250                 255                 260                 265Gly Glu His Met Glu Glu His Gly Ile Lys Phe Ile Arg Gln Phe Val
            270                 275                 280Pro Ile Lys Val Glu Gln Ile Glu Ala Gly Thr Pro Gly Arg Leu Arg
        285                 290                 295Val Val Ala Gln Ser Thr Asn Ser Glu Glu Ile Ile Glu Gly Glu Tyr
    300                 305                 310Asn Thr Val Met Leu Ala Ile Gly Arg Asp Ala Cye Thr Arg Lys Ile
315                 320                 325Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys Ile Asn Glu Lys Thr Gly Lys Ile330                 335                 340                 345Pro Val Thr Asp Glu Glu Gln Thr Asn Val Pro Tyr Ile Tyr Ala Ils
            350                 365                 360Gly Asp Ile Leu Glu Asp Lys Val Glu Leu Thr Pro Val Ala Ile Gln
        365                 370                 375Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gln Arg Leu Tyr Ala Gly Ser Thr Val Lys
    380                 385                 390Cys Asp Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr
395                 400                 405Gly Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Val Glu Lys Phe Gly Glu410                 415                 420                 425Glu Asn Ile Glu Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp Pro Leu Glu Trp Thr
            430                 435                 440Ile Pro Ser Arg Asp Asn Asn Lys Cys Tyr Ala Lys Ile Ile Cys Asn
        445                 450                 455Thr Lys Asp Asn Glu Arg Val Val Gly Phe His Val Leu Gly pro Asn
    460                 465                 470Ala Gly Glu Val Thr Gln Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lye Cys Gly Leu
475                 480                 485Thr Lys Lys Gln Leu Asp Ser Thr Ile GIy Ile His Pro Val Cys Ala490                 495                 500                 505Glu Val Phe Thr Thr Leu Ser Val Thr Lys Arg Ser Gly Ala Ser Ile
            510                 515                 520Leu Gln Ala Gly Cys
        525序列ID号：13序列长度：15序列类型：核酸链型：双链拓朴学：线型分子类型：其它核酸，合成的DNA序列：TAAATAAATA AATAA序列ID号：14序列长度：66序列类型：核酸链型：双链拓朴：线型分子类型：其它核酸，合成的DNA序列：CTAGCGCTCT GGGGCAAGCA TCCTCCAGGC TGGCTGCCAC CACCACCACC ACCACTGATC 60TAGACT                                                            66序列ID号：15序列长度：18序列类型：核酸拓朴学：线型分子类型：其它核酸，合成的DNA序列描述：GGTCAGCACA AATTTCCA                18序列ID号：16序列长度：24序列类型：核酸拓朴学：线型分子类型：其它核酸，合成的DNA序列描述：AAACACAACT TGGAATGAAC AATT         24序列ID号：17序列长度：24序列类型：核酸拓朴学：线型分子类型：其它核酸，合成的DNA序列描述：TCATTCCAAG TTGTGTTTGT GAAA         24序列ID号：18序列长度：18序列类型：核酸拓朴学：线型分子类型：其它核酸，合成的DNA序列描述：CATAGGATGC TCCAACAA    18

Claims (26)

1．一种多核苷酸序列，它编码含有序列ID No.12的第1至526号氨基酸之氨基酸序列的多肽，或编码所说多肽的突变体或变异体，条件是由该多核苷酸序列编码的多肽能够还原二氯靛酚或氧化态谷胱甘肽。
2．根据权利要求1的多核苷酸序列，它与序列ID No.12的1至526号氨基酸分享55％或更多的序列同源性。
3．根据权利要求1的多核苷酸序列，它与序列ID No.12的1至526号氨基酸分享70％以上的序列同源性。
4．根据权利要求1的多核苷酸序列，它与序列ID No.12的1至526号氨基酸分享80％以上序列同源性。
5．根据权利要求1的多核苷酸序列，其中编码序列含有序列IDNo.11中所示的第70至1647位核苷酸序列。
6．根据权利要求1的多核苷酸序列，它编码具有序列ID 12中序列-23至526的多肽或其突变体或变异体。
7．与权利要求1的多核苷酸序列杂交的DNA，其中相应的有意义链编码具有还源活性的多肽。
8．根据权利要求7的DNA，其中杂交条件是在60℃至70℃使用6X SSC。
9．由权利要求1的多核苷酸序列编码的多肽。
10．权利要求9的多肽在制备用于治疗或预防下述疾病的药物中的应用：氧化应激、动脉硬化、糖尿病、局部缺血性疾病、水肿、血管通透性增加、炎症、胃粘膜疾病、急性胰腺炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肝病、帕拉夸特氏病、肺气肿、化学性癌症、癌转移、成人呼吸窘迫综合症、弥散性血管内凝血、白内障、早熟性视网膜病、自身免疫性疾病、叶啉血症、溶血性疾病、地中海贫血、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、癫痫、紫外线照射性疾病、放射性疾病、冻伤、烧伤或任何由活化氧引起的疾病。
11．一种药物组合物，该组合物含有药学上活性量的权利要求9的肽连同药学上可接受的载体。
12．一种载体，该载体含有权利要求1的多核苷酸序列。
13．根据权利要求12的载体，它是一种表达载体。
14．用权利要求12的载体转化的宿主。
15．一种表达系统，该表达系统包括用权利要求13的载体转化的宿主。
16．根据权利要求15的表达系统，其中宿主是大肠杆菌(E.coli)。
17．由权利要求15的表达系统生产的多肽。
18．一种抗体或其等同物，它特异性地识别KM31-7蛋白质、或特异性地识别KM31-7蛋白质的突变体或变异体。
19．根据权利要求18的抗体，它是一种单克隆抗体。
20．根据权利要求18的抗体，其中所说的抗体在抗原性上类似于人抗体。
21．一种识别权利要求18的抗体的识另位点的抗同种异型抗体。
22．由命名为MKM150-2的杂交瘤产生的抗体，或由命名为MKM150-2的杂交瘤获得之杂交瘤衍生的抗体，杂交瘤MKM150-2已保藏于日本工业科学技术处发酵研究所，保藏号是FERM BP-5086。
23．根据权利要求18的抗体，该抗体用于分离和纯化KM31-7蛋白质。
24．一种纯化KM31-7蛋白质的方法，该方法包括用权利要求18的抗体结合所说蛋白质。
25．能够在培养基中表达权利要求18的抗体的杂交瘤。
26．一种杂交瘤，该杂交瘤命名为MKM150-2，保藏于日本工业科学技术处发酵研究所，保藏号是FERM BP-5086。
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