CZ293745B6 - Polynukleotidová sekvence, DNA, polypeptid, farmaceutický prostředek, vektor, hostitel, expresivní systém, protilátka, způsob čištění proteinu a hybridom - Google Patents

Abstract

Polynukleotidová sekvence kódující polypeptid, který obsahuje sekvenci aminokyselin od čísla 1 do čísla 526 sekvence č. ID: 12 nebo která kóduje mutaci či variantu řečeného polypeptidu s předpokladem, že polypeptid, kódovaný touto polynukleotidovou sekvencí je schopen redukovat dichloroindofenol a oxidovaný glutathion. Řešení se rovněž týká DNA s obsahem uvedené polynukleotidové sekvence, polypeptidu, který je touto sekvencí kódován, příslušných vektorů, hostitelů, expresivních systémů a protilátek a farmaceutického prostředku, který uvedený polypeptid obsahuje spolu s farmaceutickým nosičem. Mimo to se řešení týká také způsobu čištění účinných polypeptidů a hybridomu, který exprimuje příslušné protilátky.ŕ

Description

Polynukleotidová sekvence, DNA, polypeptid, farmaceutický prostředek, vektor, hostitel, expresivní systém, protilátka, způsob čištění proteinu a bybridom

Oblast techniky

Tento vynález se vztahuje na nový polypeptid mající schopnost redukovat dichloroindofenol a oxidovaný glutathion, na DNA kódující tento nový polypeptid, na vektory obsahující takovou DNA, na hostitele transformované takové vektory a na farmaceutické prostředky obsahující tento polypeptid. Tento vynález dále pojednává o monoklonálních protilátkách proti tomuto polypeptidu a způsobu izolace a čištění tohoto polypeptidu s použitím těchto protilátek.

Dosavadní stav techniky

Tvorba exogenních proteinů expresívními systémy může být s použitím technik známých pracovníkům v tomto oboru jednoduchou záležitostí. Nicméně existuje mnoho polypeptidů, které v exogenních systémech nelze snadno exprimovat. Problém může být v tom, že takový polypeptid nemůže být exprimován ve velkém množství, což nelze upravit pouhým umístěním regulačního genu ve směru proti směru exprese. Dále to může být způsobeno možností, že posttranskripční úpravy potřebné pro získání zralé formy se neuskutečňují nebo se uskutečňují nesprávně.

Například u mnoha eukaryotických polypeptidů se translace zpočátku uskuteční s methioninem na N-konci, který je následně deletován a vzniká tak zralá forma polypeptidu. Toto zpracování se nemůže u prokaryot odehrát, proto se musí hledat alternativní prostředky pro získání potřebné exprese. Jedna z takových technik zahrnuje sloučení požadovaného exogenního proteinu s proteinem vážícím maltózu nebo s glutathion-S-transferázo například pročištěním exprimovaného fúzního proteinu a následným štěpením proteázou, jako je faktor Xa, enterokinázou nebo thrombinem. Hlavní nevýhodou této nepohodlné metody je skutečnost, že vyžaduje dva čisticí kroky, které vedou k výrazným ztrátám konečného produktu.

Kyslík pro metabolickou energii je v buněčném prostředí obecně poskytován ve formě využíván, je většinou volný radikál, jako je superoxid (O^_ ₂), peroxid (H₂O₂) nebo hydroxylové radikály (OH~), které jsou všechny redukovány, aby po reakci vytvořily vodu (H₂O). Plynný kyslík sám je silně oxidační, ale termín „aktivovaný kyslík“ je zde používán ve vztahu ke kyslíku a molekulám obsahujícím kyslík, které mají vyšší oxidační potenciál než atmosférický kyslík. Nejsilnější formou aktivovaného kyslíku je jeho volný radikál, což je molekula nebo atom mající jeden nebo více nepárových elektronů.

Volné radikály jsou nestabilní, a pokud nejsou pod řádnou kontrolou, mohou denaturovat lipidy, proteiny a nukleové kyseliny. Z toho vyplývá, že ačkoli je aktivovaný kyslík, životně důležitým prvkem, je zároveň potenciálně zdraví škodlivý a musí být pod přísnou kontrolou. Dokonce i malá množství aktivovaného kyslíku mohou vyvolat vzhledem ke své vysoké reaktivitě poruchy. Z toho důvodu nejsou organismy schopny přežít, pokud nejsou vybaveny obrannými mechanismy zamířenými proti aktivovanému kyslíku.

V buněčném prostředí musí být umístění, množství a čas tvorby aktivovaného kyslíku přísně vyváženo schopností buněk neutralizovat nebezpečí představované aktivovaným kyslíkem. Tuto schopnost typicky zabezpečují obranné mechanismy, které využívají vlastní antioxidanty nebo antioxidační enzymy. V kontextu tohoto vynálezu je termín „antioxidant“ obecně používán pro přirozeně se vyskytující látky, které mají schopnost zabránit nebo potlačit autooxidaci například lipidů. Termín „antioxidační enzym“ je obecně používán pro enzym katalyzující reakci, která eliminuje aktivovaný kyslík. Termín „antioxidační působení“ je sestaven na základě těchto termínů.

-1 I

V řadě abnormálních situací dochází ke tvorbě nadbytečného množství aktivovaného kyslíku. Takovými případy jsou pro člověka například stresové situace, používání drog, kouření, chirurgické zákroky, transplantace orgánů, ischemické choroby z důvodu mozkové mrtvice nebo infarktu myokardu. Tato vysoká množství aktivovaného kyslíku jsou větší, než jaká mohou dané kontrolní systémy zpracovat, takže přebytečný aktivovaný kyslík může způsobit další poškození organismu vážným narušením normálních buněk. Výsledný tzv. oxidační stres je odpovědný za velké množství dalších zdravotních potíží.

Jako příklad lze uvést arteriosklerózu. Za jednu z příčin tohoto onemocnění je považován výskyt lipoproteinů s nízkou hustotou, které byly oxidovány aktivovaným kyslíkem [Steinbeerg, D. (1983), Arteriosclerosis 3,283-301]. Rovněž se předpokládá, že oxidační stres se přímo podílí na příčinách a důsledcích mechanismů spojených s výskytem metabolických poruch a vaskulámích komplikací při diabetů [Rondo, M. vyd., „Aproaches from Modem Medicine (4) Free Radicals“, Medical view Pub., str. 138-146].

Aktivovaný kyslík se rovněž účastní vzniku dalších patologických stavů a okolností, jako jsou ischemické poruchy (poruchy provázející reperfúzi, ischemická srdeční onemocnění, cerebroischemie, ischemická enteritida, apod.), edémy, vaskulámí hyperpermeabilita, záněty, poruchy žaludeční sliznice, akutní pankreatitida, Crohnova nemoc, vředová kolitida, poruchy jater, Paraquatova nemoc, rozedma plic, chemokarcinogeneze, karcinogenní metastázy, syndrom nedostatečnosti dýchacího ústrojí u dospělých, disseminovaná intravaskulámí koagulace (DIC), šedý zákal, předčasná retinopatie, autoimunitní onemocnění, porfyrémie, hemolytická onemocnění, středomořská anemie, Parkinsonova nemoc, Alzheimerova nemoc, epilepsie, poruchy z ultrafialového záření, poruchy z ozáření, omrzliny a popáleniny.

Jak na povrchu, tak uvnitř buňky existuje několik obranných mechanismů sloužících výhradně účelům zneškodnění aktivovaného kyslíku vytvořeného fyziologickými cestami.

Níže uvedené antioxidanty a antioxidační enzymy z vnitřního prostředí buňky jsou známy pro své schopnosti zpracovat a eliminovat aktivovaný kyslík. Například v peroxisomech se vyskytuje katalýza, která redukuje a odstraňuje peroxid vodíku. Tlutathionperoxidáza se vyskytuje v cytoplazmě mitochondrií. Tento enzym redukuje a detoxikuje peroxid vodíku a peroxidy lipidů v přítomnosti redukovaného glutathionu. Například transferin, feritin a laktoferin potlačují tvorbu aktivovaného kyslíku tím, že stabilizují ionty železa, zatímco cerolplazmin působí podobně při použití iontů mědi. Superoxiddismutáza, která je rovněž přítomna v cytoplazmě mitochondrií, katalyzuje redukci superoxidů za vzniku peroxidu vodíku, který je dále eliminován například katalázou. Dále vitamíny C a E, redukovaný glutathion a některé další látky s nízko molekulovou hmotností mají rovněž schopnost redukovat a eliminovat aktivovaný kyslík.

Na druhé straně takové látky, jako je extracelulámí superoxiddismutáza, extracelulámí glutathionperoxidáza a redukovaný glutathion existují v extracelulámím prostředí a mají podobné mechanismy působení jako jejich protějšky vyskytující se uvnitř buněk. Avšak ve srovnání se situací uvnitř buňky je počet antioxidantů a antioxidačních enzymů vně buňky podstatně nižší a pouze několik z nich vykazuje antioxidační účinky v extracelulámím prostředí.

Redukovaný glutathion má významnou funkci při udržování redukovaného stavu jak vně, tak uvnitř buňky. Jeho vzorec je uveden níže. Glutathion byl poprvé objeven jako látka vyskytující se v kvasinkách v roce 1888 de-Ray-Pailhadem a byl po izolaci v roce 1921 pojmenován Hopkinsem jako glutathion.

Vzorec glutathionu:

Η OΗ O

I III ιι

HOOC-C-CH₂-CH₂-C-NH-C-C-NH-CH₂-COOH

II nh₂ch

I SH

Glutathion se skládá ze tří aminokyselin: kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu. Thiolové skupiny dvou molekul glutathionu mohou být oxidovány za vzniku disulfidové vazby v přítomnosti aktivovaného kyslíku, čímž tento aktivovaný kyslík redukují.

Glutathion vzniká především v játrech a v těle cirkuluje prostřednictvím plazmy. V normálním organismu se glutathion vyskytuje téměř výhradně v redukované formě. Pakliže se zvýší hladina jeho oxidované formy, znovu se vytvoří redukovaná forma působením glutathionreduktázy v přítomnosti NADPH (nikotinadenindinukleotidfosfát). Tak ochraňuje redukovaný glutathion buněčné membrány, před oxidačními poruchami prostřednictvím své redukční funkce, která redukuje aktivovaný kyslík na volné radikály. Další výsledkem této antioxidační vlastnosti redukovaného glutathionu je obrana proti účinkům radioaktivity a jeho využitelnost jako léčebného přípravku při šedém zákalu. V posledních letech bylo rovněž publikováno, že u pacientů s AIDS jsou značně sníženy systémové hladiny redukovaného glutathionu, čímž se dokazuje, že redukovaný glutathion má pro organismus zásadní důležitost. Při nenormálních podmínkách může být však množství aktivovaného kyslíku tak vysoké, že doslova veškerý glutathion je voxodovaném stavu, takže aktivovaný kyslík není odstraňován tím nejrychlejším možným způsobem.

Dalším příkladem je lidský thioredoxim. Je to látka, která využívá svou redukční účinnost k několika fyziologickým procesům, které zprostředkovává jak na povrchu, tak uvnitř buňky. Lidský thioredoxin (rovněž známý jako Adult T Cell Leukemie Derived Factor, ADF) byl klonován jako faktor, který má schopnost indukovat receptory interleukinu 2 (IL-2R) u dospělých T buněk leukemických buněčných linií. Je to reduktáza závislá na thiolu, obsahující ve svých aktivních místech dva cysteinové zbytky a mající schopnost redukovat aktivovaný kyslík a volné radikály.

Kromě indukce receptorů IL-2 může lidský thioredoxin rovněž: podporovat buněčný růst u B buněk kmene 3B6, které byly infikovány Epstein-Barr virem (EBV), chránit před faktorem nádorové nekrózy (TNF) odvozeného od monocytů linie U937 a chránit proti poškození vaskulámích endotheliálních buněk neutrofily. Dále působí lidský thioredoxin v intracelulámím prostředím na transkripční faktor NFkB, JUN a FOS prostřednictvím své redukční účinnosti, čímž podporuje vazebnou aktivitu DNA a umožňuje tak zvýšení transkripční činnosti. V současné době se vyvíjí lidský thiredoxin jako léčebný přípravek pro poruchy z ozáření a při poruchách provázejících reperfuzi, revmatické artritidě a zánětech. Všem těmto poruchám lze zabránit schopnosti jeho redukční účinnosti vedoucí k ochraně buněk před poškozením.

Jak bylo již dříve zmíněno, z fyziologického hlediska je nesmírně důležité udržovat nitrobuněčné i mimobuněčné prostředí v redukovaném stavu eliminací aktivovaného kyslíku a volných radikálů. Předpokládá se, že existuje mnoho dosud nepopsaných antioxidantů a antioxidačních enzymů jak uvnitř, tak vně buňky, které hrají důležitou roli při odstraňování aktivovaného kyslíku a volných radikálů. Bylo by tedy nadmíru užitečné nalézt redukující látky, které by měly schopnost opětovně vytvářet například redukovaný glutathion. Takový látka by mohla pomoci při takových abnormálních stavech, jaké byly popsány výše v tomto textu.

-3 CZ 293745 B6

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří polynukleotidová sekvence kódující polypeptid, který obsahuje sekvenci aminokyselin od čísla 1 do číslo 526 sekvence č. ID: 12 nebo která kóduje mutaci či variantu řečeného polypeptidu s předpokladem, že polypeptid, kódovaný touto polynukleotidovou sekvencí je schopen redukovat dichloroindofenol a oxidovaný glutathion.

Součást podstaty vynálezu tvoří zejména sekvence, která má 55% nebo vyšší sekvenční homologií se sekvencí aminokyselin č. 1 až 526 sekvence č. ID: 12, sekvence, která sdílí více než 70% sekvenční homologií se sekvencí aminokyselin č. 1 až 526 sekvence č. ID. 12 a zvláště sekvence, která sdílí více než 80% sekvenční homologií se sekvencí aminokyselin č. až 526 sekvence č. 12.

Výhodným provedením je sekvence, jejíž kódující sekvence obsahuje nukleotidovou sekvenci 70 až 1647 vyznačenou v sekvenci č. ID: 11 a sekvence, která kóduje polypeptid mající sekvenci 23 až 526 ze sekvence č. ID: 12 nebo její mutaci či variantu.

Podstatu vynálezu tvoří také DNA, která hybridizuje s uvedenou polynukleotidovou sekvencí a ve které řetězec s odpovídajícím smyslem kóduje polypeptid mající redukující účinek, zejména DNA, při jejímž hybridizačních podmínkách se používá 6x SSC při 60 až 70 °C.

Součást řešení tvoří také polypeptid, který je kódován uvedenou polynukleotidovou sekvencí a který je určen pro využití v profylaxi nebo léčbě stavů způsobených nebo souvisejících s oxidativním stresem nebo s kterýmkoliv onemocněním způsobeným aktivovaným kyslíkem, zvláště pro využití v profylaxi nebo léčbě arteriosklerózy, diabetů nebo ischemických poruch. Polypeptid je specificky určen pro využití v profylaxi nebo léčbě arteriosklerózy, diabetů, ischemických poruch, edemů, vaskulámí hypermeability, zánětů, poruch žaludeční sliznice, akutní pankreatitidy, Crohnovy nemoci, vředové kolitidy, poruch jater, Paraquatovy nemoci, rozedmy plic, chemokarcinogeneze, karcinogenních metastáz, syndromu nedostatečnosti dýchacího ústrojí u dospělých, disseminové intravaskulámí koagulace (DIC), šedého zákalu, předčasné retinopatie, autoimunitních onemocnění, porfyrémie, hemolytického onemocnění, středomořské anemie, Parkinsonovy nemoci, Alzheimerovy nemoci, epilepsie, poruch z ultrafialového záření, poruch z ozáření, omrzlin a popálenin.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž použití tohoto polypeptidu pro výrobu farmaceutického prostředku a farmaceutický prostředek pro léčbu a profylaxi stavů způsobených nebo majících souvislost s oxidačním stresem nebo jakoukoli nemocí způsobenou aktivovaným kyslíkem, a zároveň léčebné přípravky obsahující takový polynukleotid.

Vynález se dále týká vektorů, obsahujících svrchu uvedenou polynukleotidovou sekvenci.

Podstatu vynálezu tvoří také protilátky, obzvláště monoklonální protilátky, a jejich ekvivalenty proti polypeptidu. Tento vynález dále popisuje způsob výroby takových protilátek, hybridomy pro jejich produkci a způsoby čištění takového polypeptidu s využitím těchto protilátek.

Přehled obrázků na výkresech

Tento vynález bude ilustrován následujícími obrázky, ve kterých:

Obr. 1 je konstrukční diagram plazmidu pSRa31-7.

Obr. 2 je diagram začlenění sekvence kódující histidinový hexamer do pUCKM31-7.

Obr. 3 je konstrukční diagram pMAL31-7.

Obr. 4 je graf hodnocení redukční účinnosti dichlorfenol-indofenolu.

Obr. 5 uvádí stanovení redukční účinnosti oxidovaného glutathionu.

-4CZ 293745 B6

Přirozeně se vyskytující redukující polypeptid má sekvenci uvedenou pod číslem ID: 12 a skládá se z 526 aminokyselin s valinem na svém N-konci.

Přirozeně se vyskytující DNA kódující tento polypeptid má sekvenci nukleotidů 70 až 1647 vyznačenou jako sekvence ID: 11.

Polypeptid podle vynálezu má schopnost redukovat oxidovaný glutathion a dichloroindofenol. Takovýto popis tohoto peptidu je sice přísný, avšak poněkud těžkopádný, takže polypeptid podle vynálezu bude označován jako polypeptid nebo protein KM31-7.

Protein KM31-7 má původ v organismu nebo je mutací či variantou takového proteinu, takže přináší minimální problémy s jeho toxicitou a/nebo antigenitou.

V druhém provedení tohoto vynálezu je za prekurzor proteinu TM31-7 pokládán polypeptid o sekvenci -23 až 526 se sekvenčním číslem ID: 12. Jako takový zahrnuje tento vynález rovněž tento prekurzor a jeho mutace či varianty zároveň se sekvencí polynukleotidů kódující takový prekurzor.

Dále budou uvedeny základní postupy pro získání exprimovaného specifického polypeptidu z živočišných buněk technikami genetických rekombinaci.

mRNA kódující peptid KM31-7 může být tvořen známými metodami a reverzní transkripcí převedena na ds-DNA. Jak zdroj původní mRNA mohou být použity jakékoli vhodné živočišné buňky, buněčné linie nebo tkáně, dává se však přednost buňkám buněčné linie KM-102 odvozeným od lidských buněk kostní dřeně [Haryguaya, K. a Handa, H. (1985), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3447-3480],

Pro extrakci mRNA za savčích buněk mohou být použity různé metody. Ve většině případů se používají metody používající guanidinthiokyanát a horký fenol nebo metoda guanidinthiokyanátkyseliny chlorovodíkové, ale obecně je nejvíce používána metoda používající guanidinthiokyanát a chlorid česný.

Vzhledem k tomu, že většina mRNA přítomné v cytoplazmě eukaryotických buněk má 3'-konci sekvenci polyA, může být purifikace savčí mRNA provedena adsorpcí na kolonu celulózy obsahující oligo(dt), čímž se využije tato vlastnost mRNA. Eluovaná mRNA může být dále frakcionována takovými metodami, jako je centrifugace v sacharosovém hustotním gradientu.

Kontrola, zda taková mRNA skutečně kóduje požadovaný peptid, může být provedena translací této mRNA ve vhodném systému, jakým je například oocyt Xenopus laevis, králičí retikulocyty nebo pšeničné klíčky.

Měření redukující aktivitu exprimovaného produktu může být provedeno následujícím způsobem.

i) Stanovení účinnosti redukující dichlorindofenol

Metodika tohoto stanovení byla popsána Beinertem, H. v „Methods in Enzymology“ (1962), 5, 546.

Přípravek 50 μΜ dichlorindofenolu (Sigma) je naředěn 20mM fosfátovým pufrem a 0,5 M NaCl (pH 7,8). Do kyvety (SARSTEDT, 10 x 4 x 45 mm) se napipetuje 1 ml tohoto roztoku a přidá se vzorek na měření. Do kyvety se při teplotě místnosti přidá 15 μΐ 1 mM NADPH (BoeringerMannheim) ředěný stejným pufrem pro započetí reakce. Účinnost reduktázy pak může být stanovena absorpcí oxidovaného dichloroindofenolu při 600 nm nebo stanovením poklesu absorpce NADPH při 340 nm.

-5CZ 293745 B6 ii) Stanovení účinnosti redukující oxidovaný glutathion

Metodika tohoto stanovení byla popsána Nakajimou, T. a kol. v „New Basic Experimental Methods in Bichemistry (6) - Assay Methods Using Biological Activity“, 3-34.

mM oxidovaný glutathion (Boehringer-Manngeim) se připraví s 20 mM fosfátovým pufrem a 0,5 M NaCl do pH 7,8. Vzorek reduktázy se napipetuje do kyvety (10x4x4 mm), kam se dále převede 15 μΐ tohoto roztoku. Pro spuštění reakce se do kyvety dále při teplotě místnosti přidá 15 μΐ 1 mM NADPH připraveného ve stejném pufru. Redukční účinnost reduktázy pak může být stanoveny následným poklesem absorpce při 340 nm.

Pro odvození ds-DNA od mRNA mohou být použity různé výše uvedené metody. Mezi tyto metody patří metoda používající nukleázu SI, Landova metoda a metoda O. Joon Yooa, dává se však v tomto případě přednost metodě Okayama-Berga [Okayama, H. a Berg. P. (1982), Mol Cell. Bio. 2,161-170],

Takto získaná ds-cDNA pak může být zavedena do klonovacího vektoru a výsledný rekombinantní plazmid pak může být vnesen do Escherichia coli.

Kmen obsahující požadovanou DNA kódující daný peptid podle vynálezu může být selektován různými způsoby. Například, je-li pro přípravu nukleotidové sondy použita PCR, pak vhodnou templátovou DNA je cDNA, nebo genomová DNA.

Je možné použít primární screening, aby se snížil počet transformovaných kmenů, které se budou muset testovat. Primární screening, je možný z toho důvodu, že peptid podle vynálezu je příbuzný s cytokiny, takže jeho mRNA obsahuje AUUUA motiv společný pro mRNA cytokinů [Shaw, G. a Kamen, R. (1986), Cell 46: 659-667]. Proto může být pro primární screening použita syntetická oligonukleotidová sonda, která je komplementární k motivu AUUUA. Potom může být proveden test na produkci exogenního proteinu v savčích buňkách.

DNA kódující daný peptid může být potom z vektoru vyštěpena a sekvenována. Fragment DNA může být pak opět zaveden do vhodného vektoru a použit pro transformaci prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk podle potřeby.

Protein KM31-7 může být použit buď samostatně, nebo v kombinaci s jedním nebo více léčebnými přípravky jako prevence léčby stavů způsobených nebo majících souvislosti soxidativním stresem či jakoukoliv další nemocí způsobenou aktivovaným kyslíkem. Takové stavy zahrnují, avšak nejsou omezeny pouze na arteriosklerózu, diabetes ischemické poruchy (jako poruchy při reperfuzi, ischemická choroba srdeční, cerebroischemie a ischemická enteritis), edémy, vaskulámí hyperpermeabililty, záněty, poruchy žaludeční mukózy, akutní pankreatitidu, Crohnova nemoc, vředovou kolitidu, poruchy jater, Paraquatovu nemoc, rozdmu plic, chemokarcinogenezi, karcinogenní metastázy, DIC, šedý zákal, předčasnou retinopatii autoimunitní onemocnění, porfyremii, hemolytická onemocnění, středozemní anemii, Parkinsonovu nemoc, Alzheimerovu nemoc, epilepsii, poruchy způsobené ultrafialovým zářením, poruchy způsobené radioaktivitou, omrzliny a popáleniny.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu obsahuje farmakologicky aktivní množství peptidu KM31-7 a jeho přijatelný nosič.

Prostředek může být aplikován v různé formě. Orální aplikace může být provedena ve formě tablet, kapslí, granulí, prášku nebo sirupu. Parenterální aplikace zahrnuje injekce, infuze a čípky. Odborníkům budou jistě známy další vhodné způsoby aplikace.

-6CZ 293745 B6

V případě, že polypeptid podle vynálezu má být aplikován injekcí nebo infuzí, pak je potřeba připravit apyrogenní přípravek polypeptidu v lékařsky přijatelném vodném roztoku polypeptidu tak, aby vyhovoval požadavkům na pH, izotonicitu a stabilitu, bude předmětem technické expertizy odborníků v tomto oboru.

Dávkování a forma aplikace může být odborníky snadno stanovena s přihlédnutím na stav pacienta, tělesnou hmotnost, pohlaví, věk, dietu, závažnost dalších infekcí, čas podání a další klinicky důležitých faktorů. Normální orální dávka pro dospělé se bude pohybovat v rozmezí od 0,001 mg do 1000 mg denně. Toto množství může být podáno v jediné dávce nebo jako několik dávek v rozmezí 24 hodin. Při parenterálním podání tohoto polypeptidu může být podáno v jedné podkožní, nitrosvalové nebo nitrožilní injekci 0,01 mg až 100 mg.

Pro celkovou charakterizaci proteinu KM31-7 bylo důležité získat specifické protilátky proti tomuto proteinu. Takové protilátky jsou užitečné při stanovení funkcí proteinu KM31-7, jeho množství, čistoty a distribuce v tkáních.

Proto byly získány hybridomy produkující protilátky proti KM31-7 technikou očkování laboratorních zvířat polypeptidem vyprodukovaným E. coli transformovanými pMAL31-7, přípravou hybridomů produkujících protilátky společně s myelomovými buňkami, screeningem a klonováním takových hybridomů. Protilátky produkované výslednými hybridomy měly schopnost rozpoznat polypeptid získaný z bezsérového supernatantu kultury COS-1 buněk transformovaných pSRa31-7.

Tak tento vynález rovněž popisuje protilátky, především monoklonální, nebo jejich ekvivalenty, které specificky rozpoznávají protein KM31-7 nebo jeho mutaci či variantu.

Protilátky popsané v tomto vynálezu jsou zaměřeny proti proteinu KM31-7, jeho mutaci nebo variantě. Je vhodné, aby tyto protilátky byly polyklonální nebo monoklonální, přičemž výhodnější jsou monoklonální protilátky, protože polyklonální protilátky jsou většinou spojeny s nespecifičností. Pro jednotnost výsledků ať jit při terapii, nebo při čištění proteinu K.M31-7 jsou vhodnější monoklonální protilátky.

Protilátky pro účely tohoto vynálezu mohou být připraveny z kteréhokoli živočicha. U protilátek vytvořených u jiných organismů než lidských však mohou nastat problémy s antigenitou. Proto je lépe vytvořit protilátky, které co nejvíce připomínají lidské protilátky, čehož může být dosaženo buď chemickými, nebo genetickými úpravami odborníkům dostatečně známými.

Tento vynález rovněž předpokládá anti-idiotypové protilátky, tj. protilátky jejichž rozpoznávací místo rozpoznává vazebná místa výše uvedených protilátek. Takovéto protilátky lze získat aplikací působením protilátek vhodným zvířatům. Je pochopitelné, že tento proces může účinně pokračovat nepřetržitě, přičemž každá odpovídající generace protilátek bude buď původní, nebo anti-idiotypová. Avšak pokud s nebude provádět selekce protilátek na správné rozpoznávací místo po každé generaci, může se specifičnost takových protilátek postupně vytratit. Antiadiotypové protilátky mohou být užitečné na příklad při testu volných protilátek proti KM31-7.

Tento vynález zároveň předpokládá tvorbu fragmentů protilátek podle vynálezu, které mají schopnost rozpoznávat protein KM31-7, a molekul nesoucích vazebná místa pro takové protilátky. Takové fragmenty a molekuly jsou v tomto textu označovány jako „ekvivalenty“ protilátek podle vynálezu.

Pro transformaci E. coli byl použit plazmid pMAL31-7. Produkt exprese byl čištěn a použit k imunizaci laboratorních zvířat. Slezinné buňky očkovaných zvířat byly použity pro přípravu hybridomů fúzí s myelomovými buňkami, byly získány klony produkující anti-KM31-7 monoklonální protilátky ve vysokém množství a o dobré stabilitě (tento klon byl pojmenován MK.M150-2 a uložen v Fermentation Research Instituce of the Agency of Industrial Science and

-7CZ 293745 B6

Technology, Japonsko, pod registračním číslem FERM BP-5086). Kultura tohoto klonu poskytuje ze svého supematantu monoklonální protilátky proti KM31-7.

Výsledné monoklonální protilátky proti KM31-7 reagují imunochemicky sfúzním proteinem získaným zavedením expresívního vektoru pMAL31-7 do E. coli. Tyto protilátky zároveň imunochemicky reagují s proteinem KM31-7 získaným ze supematantu kultury savčích buněk transformovanzch cDNA kódující KM31-7.

Při přípravě monoklonálních protilátek je nutné dodržovat dále uvedené postupy, které se skládají z:

(a) čištění biopolymeru, který má být použit jako antigen, (b) imunizace myši injekcemi antigenů a ve vhodné chvíli přípravy buněk produkujících protilátky ze sleziny pomocí krevních vzorků a jejich testů, (c) přípravy myelomových buněk, (d) fúze slezinných a myelomových buněk, (e) selekce skupin hybridomů produkujících požadované protilátky, (f) přípravy jednotlivých klonů, (g) velkoobjemové kultivace hybridomů pro přípravu monoklonálních protilátek nebo podle potřeby pěstování myší infikovaných hybridomy, (h) testování fyziologické aktivity nebo vlastností výsledné monoklonální protilátky označením reaktantu.

Dále bude popsána přípravy monoklonálních protilátek anti-KM31-7 s odkazem na výše uvedené metody. Je zřejmé, že není nutné přesně dodržovat následují popisy a že je možné použít jakoukoli vhodnou metodu. Pro přípravu protilátek je například možné použít jiné buňky než slezinné a myelomové stejně tak, jako je možné použít slezinné nebo myelomové buňky jiných živočichů. Následující postup představuje v současné době nejpoužívanější metodu přípravy monoklonálních protilátek proti KM31-7.

(a) Purifikace antigenů

Fúzní protein získaný expresí pMAL31-7 vE. coli a jeho purifikací je účinným antigenem. Kultura E. coli TB-1 transformovaná pMAL31-7 byla indukována izopropyl-[3-d-thiogalaktopyronosidem (IPTG). Exprimovaný fúzní protein byl čištěn afinitní chromatografií s použitím kolony samylosou (New England BioLabs). Protein KM31-7 čištěný zbezsérového supernatantu kultuiy COS-1 buněk transformovaných pSRa31-7 je rovněž účinným antigenem.

(b) Příprava buněk produkujících protilátky

Čištěný fúzní protein získaný podle bodu (a) se smísí s kompletním nebo nekompletním Freudovým adjuvans nebo s látkou jakou je potaš a výslednou vakcínou jsou imunizována laboratorní zvířata. Nejpoužívanějšími laboratorními zvířaty jsou myši BALB/c, protože většina použitelných myolomů získaných z myší byla odvozena právě od kmene BALB/c a navíc byl tento kmen myší dopodrobna prostudován. Další výhodou případu, kdy jsou myelomy i buňky produkující protilátky získány z BALB/c myší, je, že takto získané hybridomy mohou být pěstovány v břišní dutině myší BALB/c. Tím poskytuje použití myší kmene BALB/c výhody představované snadným získáním monoklonálních protilátek zascitu bez nutnosti využívat složité postupy. Tento vynález se nicméně neomezuje pouze na použití myší BABL/c.

Antigen může být aplikován v jakékoli vhodné formě jakou je třeba podkožní injekce, intraperitoneální injekce, nitrožilní, nitrosvalové injekce nebo nitrokožní injekce. Přednost se dává podkožním nebo intraperitoneálním injekcím.

-8CZ 293745 B6

Imunizace může být provedena jednou nebo při více příležitostech ve vhodných intervalech. Nejvhodnějším režimem je očkování a následné přeočkování jednou nebo víckrát v intervalech od 1 do 5 týdnů. Účinnost tohoto postupu může být zvýšena, je-li pravidelně testován titr použitého antigenu v séru imunizovaných zvířat a zvířata s dostatečně vysokým titrem protilátek jsou pak použita pro získání buněk produkující protilátky. Buňky produkující protilátky pro následnou fúzi jsou ze zvířat izolovány převážně 3 až 5 dnů po očkování.

Způsoby testování titru protilátek zahrnují například různé známé techniky, jako je RIA (radioizotopová imunologická zkouška), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), techniky fluorescenčních protilátek a pasivní hemaglutinace, ale nejvýhodnějšími technikami pro svoji citlivost, rychlost, přesnost a možnost automatizace jsou RIA a ELISA.

Dále bude uveden popis vhodného ELISA testu. Antigen se adsorbuje na pevnou fázi. Povrch pevné fáze je pak vysycen proteinem nepříbuzným s daným antigenem, jako je například hovězí sérumalbumin (BSA), aby se blokovaly veškeré povrchové oblasti, na kterých není adsorbován antigen. Pevná fáze je pak omyta a vystavena postupně ředěnému vzorku primární protilátky (např. myšímu séru). Veškeré protilátky proti KM31-7 ve vzorku se vážou s antigenem. Po omytí jsou přidány anti-myší protilátky ve vazbě s enzymem, aby se mohly navázat na vázané myší protilátky. Po omytí je přidán substrát enzymu a titr protilátek pak může být spočítán měřením takových parametrů, jako je změna barvy způsobená rozkladem substrátu.

(c) Příprava myelomových buněk

Jako zdroj myelomových buněk jsou především používány zavedené linie myších buněk. Vhodnými příklady takovýchto linií jsou třeba myelomové buněčné linie P3-X63 Ag8-Ul (P3— Ul) odvozené původně od myší BABL/c rezistentních proti 8-azaguaninu [Current Topics in Microbiology and Immunoiogy, 81, 1-7 (1978)], P3-NSI/l-Ag4.1 (NS-1) [European J. Immunology, 6: 511-519 (1976)], SP2/0-Agl4 (SP-2) [Nátuře, 276: 269-279 (1978)], PS-X63AG8.653 (653) [J. Immunology, 123: 1548-1550 (1979)] a PS-X63-AG8 (X63) [Nátuře 256, 495-497 (1975)]. Tyto buněčné linie mohou být kultivovány ve vhodném médiu, jakým je například 8-azeguaninové médium (médium RPMI-1640 obsahující 8-azeguanin, 1,5 mM glutamin, 5x10’⁵ M 2-merkaptoethanol, 10 μg/ml gentamycin a 10% fetální telecí sérum), médium IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) nebo médiu DMEM (Dulbecco's Modifíed Engle's Medium. Počet buněk se ke dni fúze zvýší na nejméně 2x10⁷ předkultivací v běžném médiu známém jako kompletní GIT [5,5 ml MEM roztoku neesenciálních aminokyselin (NEAA, Gibco), 27,5 ml NCTC109 (Gibco), 6 ml roztoku penicilin-Streptomycin (Sigma) a 11 ml 200 mM roztoku glutaminu (Sigma) v 500 ml média GIT (Wako Pure Chemical Industry)] 3 až 4 dny před fúzí buněk.

(d) Fúze buněk

Buňky produkující protilátky jsou plazmatické buňky a jejich prekurzory jsou lymfocyty. Mohou být získány z vhodných míst jednotlivých zvířat, jako je slezina, lymfatické uzliny, periferní krev nebo z jakékoli vhodné kombinace těchto orgánů. Nejpoužívanějšími jsou však slezinné buňky.

Buňky produkující protilátky jsou sklizeny 3 až 5 dnů po poslední imunizaci od myší, které mají alespoň zde popsaný titr. Výsledné buňky produkující protilátky jsou pak fúzovány s myelomovými buňkami získanými podle c). V současnosti je nejvíce používán postup fúze slezinných buněk s myelomovými buňkami při použití ethylenglykolu vzhledem k nízké hladině buněčné toxicity a snadné manipulaci s těmito složkami. Tento postup se provádí následujícím způsobem:

Slezinné buňky a myelomové buňky se důkladně promyjí médiem nebo fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (PBS) a smíchají tak, aby se poměr mezi slezinnými buňkami a myelomovými buňkami pohyboval přibližně mezi 5 až 10:1. Pak se tato směs centrifuguje. Odstraní se

-9CZ 293745 B6 supematant a usazenina buněk se rozruší a za stálého míchání se přidá roztok polyethylenglykolu (PEG, molekulová hmotnost od 1000 do 4000). Po několika minutách se buňky opět centrifugují. Supematant se opět odstraní a usazené buňky jsou resuspendovány ve vhodném množství kompletního GIT obsahujícího 5 až 10 ng/ml myšího 1L-6, 10'⁶ až 10‘³ M hypoxantin, 10’⁸ až 10’ ⁷ M aminopterin a 10‘⁶ až 10⁴ M thymidin).

(e) Selekce skupin hybridomů

Kultivační plotna je inkubována v inkubátoru s CO₂ atmosférou při 30 až 40 °C po dobu 10 až 14 dnů. Během této doby se přidává každý 1. až 3. den čerstvé HAT médium v množství odpovídajícím polovině původního objemu.

Myelomové buňky procházejí z buněčné linie rezistentní proti 8-azaguaninu a jako myelomové buňky, tak hybridomy složené pouze z myelomových buněk nemohou přežívat v médiu HAT. Avšak hybridomy obsahující část buněk produkujících protilátky a hybridomy složené z myelomových buněk a buněk produkujících protilátky mohou v tomto médiu přežít. Hybridomy složené pouze z buněk produkujících protilátek nejsou schopny života, takže potřebné hybridomy obsahující buňky produkující protilátky a myelomové buňky mohou být tímto způsobem snadno selektovány.

HAT médium je nahrazeno HT médiem (ve kterém je vynechán aminopterin) v těchto komůrkách, ve kterých byl pozorován růst kolonií. Část supematantu z kultury je odebrána a testována na přítomnost protilátek proti KM31-7 například pomocí ELISA testů.

Výše uvedený postup používá buňky z buněčné linie rezistentní proti 8-azaguaninu, avšak mohou být použity i jiné buněčné linie za předpokladu, že umožňují selekci hybridomů. Složení média se v těchto případech samozřejmě rovněž změní.

(f) Klonování

Hybridomy podle (e), u kterých byla stanovena produkce specifických protilátek proti KM31-7, jsou přeneseny na novou kultivační plotnu. Mohou být použity různé klonovací metody, jako je očkování, (kde jsou hybridomy podrobeny analýze omezeného ředění, tak aby každá komůrka obsahovala pouze jeden hybridom), metoda měkkého agaru, (kde jsou naočkované kolonie přeneseny do měkkého agarového média), očkovací metoda, (kde jsou jednotlivá buňky přemístěny pomocí mikromanipulátoru), a třídicí klonovací metoda, (ve které jsou jednotlivé buňky oddělovány buněčným třídičem). Analýza omezeného ředění se vzhledem ke své jednoduchosti používá nejčastěji.

Klonování pomocí omezeného ředění se opakuje 2x až 4x u těch komůrek, ve kterých je opakovaně pozorován titr protilátek. Klon soustavně vykazují tvorbu protilátek proti KM31-7 je pak vybrán jako hybridom volby.

(g) Příprava monoklonálních protilátek kulturou hybridomů

Hybridom vybraný podle (f) je pak kultivován v běžném médiu. Velkoobjemová kultivace se pak provádí za rotace kultury buď ve velkoobjemových lahvích, nebo v míchačce. Monoklonální protilátky proti KM31-7 se mohou získat ze supematantu z kultury filtrací na gelu a pak odebráním a čištěním frakce IgG. Hybridomy mohou být navíc pěstovány v břišní dutině stejného kmene myší (např. výše uvedené myší BALB/c) nebo například myší Nu/Nu. Jednoduchou metodou přípravy monoklonálních protilátek je použití soupravy na přípravu monoklonálních protilátek (např. MAbTrap GII z Pharmacia).

-10CZ 293745 B6 (h) Identifikace monoklonální protilátky

Identifikace izotypu a podtřídy monoklonální protilátky získané podle (g) může být provedeno následujícím způsobem. Příklady identifikace monoklonálních protilátek zahrnují Ouchterlonyho 5 metodu, ELISA test a RIA test. Ačkoli je Ouchterlonyho metoda velice jednoduchá, má jednu nevýhodu, a tou je nutnost zahuštění monoklonální protilátky v případě její příliš nízké koncentrace.

Ať už je použit test ELISA nebo RIA, může být v oboru případech suspematant přímo vystaven 10 pevné fázi, na kterou byl adsorbován antigen. Při určování typu podtřídy protilátky mohou být použity sekundární protilátky specifické pro každý typ podtřídy IgG. Může se rovněž použít souprava izotypů (například izotypová souprava myších monoklonálních protilátek od firmy Amersham). Množství proteinu může být stanoveno metodou Flin-Lowryho nebo měření absorbance při 280 nm [1,4 (OD_2g0) = 1 mg/ml imunoglobulinu].

V následujících příkladech byla monoklonální protilátka získaná zhybridomů označených MKM150—2 definována jako izotyp třídy IgG jako příslušník podtřídy IgGl.

Monoklonální protilátka získaná podle vynálezu má vysokou specifičnost pro protein KM31-7. 20 Tuto monoklonální protilátku lze navíc získávat dlouhodobě a ve vhodném množství pomocí kultivace výše zmíněných hybridomů. Tato monoklonální protilátka může být použita pro izolaci a čištění proteinu KM31-7 a tato izolace a purifikace proteinu KM31-7 uvedenou monoklonální protilátkou pomocí imunoprecipitace s použitím antigen-protilátka tvoří součást tohoto vynálezu.

Tento vynález bude dále doplněn následujícími příklady. Veškeré roztoky jsou vhodné, připravené z deionizované vody a tam, kde jsou uvedena množství v %, jedná se o objemová procenta, pokud není uvedeno jinak. Pokud nejsou metody určeny jinak, jedná se o metody, které lze nalézt v „Molecular Cloning - A Laboratory Manual“ [druhé vydání, Sambrook, J., Fritsch, E. F., a Maniatis, T. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Metody přípravy roztoků a ostatních médií, které nejsou specifikovány přímo u jednotlivých příkladů, jsou uvedeny v další části tohoto testu pod hlavičkou „Použité chemikálie a roztoky“.

Příklady provedení vynálezu ³⁵

Příklad 1

Extrakce poly(A) +/- RNA z buněk KM-102

Buňky KM-102 byly pěstovány v 36 plastikových kultivačních miskách o průměru 15 cm v upraveném Iscovo minimálním základní médiu (Boeringer Mannheim) obsahujícím 10% fetálního hovězího séra. Po nárůstu buněk do zákalu byl přidán forbolmyristylacetát (PMA) a ionofor vápníku A23187 (Sigma) do konečné koncentrace 10 ng/ml a 0,2 μΜ. Kultivace pokra45 čovala při 37 °C. Po 3, 6 a 14 hodinách bylo sklizeno 12 misek, obsah každé misky byl odděleně rozpuštěn v roztoku guanidinthiokyanátu a byla odebrána kapalná fáze.

Izolace poly(A) ⁺RNA byla provedena v podstatě podle postupu z „Molecular Cloning - A Laboratory Manual“ [Maniatis, T., a kol. (1982): 196-198]. Následuje podrobný popis tohoto 50 postupu.

Každá odebraná kapalná fáze byla zpracována následujícím způsobem. Tekutina byla opakovaně natažena a vypuštěna z 10 ml injekční stříkačky s jehlou 21G. Byly přidány 3 ml roztoku 5,7 M CsCl - 0,1 M EDTA (pH 7,5). Směs byla centrifugována v kyvetách Polyaromar v centrifuze

-11 CZ 293745 B6

RPS 40-T (Hitachi Koki). Přípravek buněk byl poté navrstven na roztok v kyvetách až do jejich úplného naplnění.

Po centrifugaci při 30 000ot/min. po dobu 18 h při teplotě 20 °C byla vzniklá usazenina resuspendována v 400 μΐ destilované vody a vysrážena etanolem. Výsledná peleta byla rozpuštěna ve 400 μΐ destilované vody a za stálého míchání bylo přidáno stejné množství směsi chloroform/l-butanol (4:1 v/v). Vodná vrstva byla oddělena centrifugaci. Poté bylo opět provedeno srážení ethanolem a peleta byla rozpuštěna v 600 μΐ destilované vody, čímž byla získána celá RNA. Z každého vzorku odebraného po 3, 6 a 14 hodinách a stimulovaného PMA/A 23187 bylo získáno kolem 4,5 mg celkové RNA.

Dále bylo odebráno 600 pg od každého ze 3 typů celkové RNA získaných výše uvedených postupem a poly(A) ⁺RNA byla čištěna chromatografií na sloupci oligo(dT) celulózy.

Celková RNA byla rozpuštěna v adsorpčním pufřu a inkubována při 65 °C po dobu 5 minut. Výsledný roztok byl aplikován na sloupec oligo(dT) celulózy (Pharmacia, typ 7) v adsorpčním pufru a eluován elučním roztokem. Tímto postupem bylo získáno 100 pg poly(A) ⁺RNA.

Příklad 2

Příprava cDNA knihovny cDNA knihovna byla připravena metodou Okayama-Berga.

Pro reakci bylo použito 5 pg poly(A)⁺RNA a 24 jednotek reverzní transkriptázy (Seikagaku Corp.). Reakce probíhala při 42 °C po dobu 1 hodiny ve 20 pl reakčních roztoku reverzní transkriptázy.

Reakce byla zastavena přidáním 2 pl 0,25 M EDTA a 1 pl 10% SDS. Roztok byl poté deproteionizován 20 pl směsi fenol/chloroform (1:1 v/v). Proteinová frakce byla odstraněna centrifugaci a k supematantu bylo přidáno 20 pl 4 M octanu amonného a 80 pl ethanolu. Směs byla ponechána v teplotě -70 °C po dobu 15 minut. Po této době byla sraženina oddělena centrifugaci, promyta 70% alkoholem a vysušena za sníženého tlaku.

Vysušená sraženina byla rozpuštěna v 15 pl reakčního roztoku terminální transferázy a zahřívána na 37 °C po dobu 3 minut. Pak bylo k reakční směsi přidáno 18 jednotek terminální deoxynukleotidyltransferázy (Pharmacia). Reakce probíhala 5 minut. Poté byla ukončena přídavkem 1 pl 0,25 EDTA a 0,5 ml 10% SDS a roztok byl deproteinizován fenol/chromoformem (podle postupu uvedeného výše). Proteinová frakce byla odstraněna centrifugaci. Supematant byl odebrán a důkladně promíchán s 15 pl 4 M octanu amonného a 60 pl ethanolu. Směs byla chlazena v -70°C po dobu 15 minut a sraženina byla oddělena centrifugaci.

Výsledná usazenina byla rozpuštěna v 10 pl pufru pro restrikční enzym a k roztoku byly přidány 2,5 jednotek restrikčního enzymu HindlII. Účinného štěpení bylo dosaženo inkubací směsi v 37 °C po dobu 1 hodiny.

Reakční roztok byl poté deproteinizován fenol/chloroformem a srážením ethanolem. Supematant byl ponechán v teplotě -70 °C po dobu 15 minut. Výsledná sraženina byla oddělena centrifugaci a rozpuštěna v 10 pl TE pufru [10 mM Tris-HCl (pH 7,5) a 1 mM EDTA]. 1 pl výsledné směsi byl doplněn do objemu 10 pl reakčním roztokem obsahujícím 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl a 10 ng spojovací DNA zakončenou oligo(dG) [spojovník 3'-oligo(dG) pL-1 HindlII, Pharmacia]. Směs byla inkubována po dobu 5 minut v 65 °C a poté 30 minut ve

- 12CZ 293745 B6 °C. Reakční směs byla zchlazena směsí vody a ledu. Poté bylo přidáno 10 μΐ lOx ligačního pufru, 78 μΐ destilované vody a 8 jednotek T4 DNA ligázy. Reakční roztok byl ponechán přes noc v teplotě 12 °C.

Následující den bylo k reakční směsi přidáno 10 μΐ 1 M KC1, 1 jednotka ribonukleázy H a 33 jednotek DNA polymerázy I, 4 jednotky T4 DNA ligázy, 0,5 μΐ roztoku dNTP (20 mM dATP, 20 mM dCTP, 20 mM dGTP) a 0,1 μΐ 50 μΐ/ml hovězího sérového albuminu (BSA) a výsledná směs byla zahřívána při teplotě 12 °C 1 hodinu a další hodinu při teplotě 25 °C. Po této době byl reakční roztok 5x zředěn destilovanou vodou a okamžitě použit pro transformaci E. coli HD5a s použitím Hanahanovy metody [Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol. 166: 557-580], čímž byla připravena cDNA knihovna buněk KM-102.

Příklad 3

Příprava oligonukleotidové sondy

Na základě sekvence AUUUA na nepřenášené 3' oblasti mRNA cytokinů byl chemicky syntetizován oligonukleotid 5'-TAAATAAATAAATAA-3' (sekvenční č. ID: 13) skládající se z 15 bází a označený ATT-3. Syntéza byla provedena s použitím automatického syntetizátoru 380 B (Perkin-Elmer Japan Applied Biosystem) podle návodu dodavatele. Použitou metodou byla metoda fosfoamiditová podle Carutherse a kol. 103, 3185-3191)]. Po syntéze 15-mer byly nukleotidy odděleny od nosiče a byly odstraněny ochranné skupiny. Výsledný roztok oligonukleotidů byl lyofilizován, byl vytvořen prášek, který byl pak rozpuštěn v destilované vodě a skladován při teplotě -20 °C až do chvíle použití.

Příklad 4

Screening cDNA knihovna

6500 kolonií vytvořených z cDNA knihovny připravené v příkladu 2 bylo fixováno na nitrocelulózový film podle metody popsané Grunsteinem a Hognessem [Grunstein, M. a Hogness, D. S. (1975) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965]. Sonda ATT-3 připravená podle příkladu 3 byl na 5'-konci označena ³²P standardním postupem (viz „Molecular Cloning - A laboratory“), a označená sonda byla použita pro hybridizací kolonií.

Předběžná hybridizace byla provedena při 37 °C po dobu 3 hodin v následujícím prostředí: 6x SSC, lx Denhardtův roztok, 0,25% SDS, 0,5% pyrofosfát sodný a 100 pg/ml denaturované DNA lososího spermatu. Hybridizace probíhala přes noc při 31 °C v následujícím prostředí: 6x SSC, lx Denhardtův roztok, 17 mg/ml tRNA kvasinek a 0,05% pyrofosfát sodným obsahující ATTT-3 sondu značenou ³²P.

Následující den byl nitrocelulózový filtr 2 hodiny omýván roztokem 6x SSC obsahujícím 0,05% pyrofosfát sodný při laboratorní teplotě.

Plazmidová DNA byla extrahována z pozitivních klonů následujícím způsobem. Náhodně bylo vybráno několik klonů a dideoxy metodou byly určeny dílčí sekvence cDNA. Tyto dílčí sekvence byly testovány na homologii nukleotidových sekvencí se sekvencemi registrovanými v EMBL nebo GenBank databázi přes počítač a bylo stanoveno, že některé z těchto dílčích sekvencí klonů detekovaných pomocí ATT-3 mělo homologní části s částmi Alu repetice [Schmid, C. W. a Jelínek, W. R. (1982) Science 216, 1065-1070)].

-13CZ 293745 B6

Fragmenty DNA obsahující sekvenci Slu repetice byly připraveny z lidské genomové DNA a označené ³²P standardním postupem. Tato značená DNA byla použita jako sonda v hybridizaci kolonií s použitím 33 klonů definovaných výše a ukázalo se, že 12 z těchto klonů obsahovalo tuto Alu repetici. Byla stanovena délka inzertu cDNA každého ze zbývajících klonů. Tato délka byla různá a pohybovala se v rozsahu 50 až 3 600 bází.

Na inzertech cDNA ze zbývajících 21 klonů bylo provedeno mapování restrikčními enzymy a byly stanoveny dílčí nukleotidové sekvence stejným způsobem jako bylo uvedeno výše. Tyto dílčí sekvence pak byly testovány ohledně homologních oblastí s nukleotidovými sekvencemi registrovanými vEMBL nebo GenBank databází pomocí počítače a byly vybrány klony obsahující nové sekvence.

Příklad 5

Nothem hybridizace klonu č. 31

Jeden z klonů, klon č. 31 (označený pcD-31) měl cDNA inzert kolem 560 bp. Z tohoto cDNA inzertu z pcD-31 byl získán fragment (292 bp) a byl označen ³²P pro použití v Northem blotu jako sonda s použitím poly(A) ⁺RNA připravené z buněk KM-102 podle postupu jako v příkladu 1. Tato hybridizace byla použita pro stanovení délky přirozeně se vyskytující mRNA, která odpovídá inzertu pCD-31.

Postup při Northem hybridizaci byl následující. Z KM-102 buněk bylo připraveno 5,5 mg poly(A)⁺RNA a inkubováno při 50 °C 1 hodinu ve směsi 1 mg glyoxalu, 50% dimetylsufoxidu (DMAO) a 0,01 M hydrogenfosfátu sodného (pH 7,0). Na konci této doby byly k inkubační směsi přidány 4 μΙ elektroforetického barviva a směs byla pak rozdělena elektroforézou na 1% agarózovém gelu v lx TAE:

Po elektroforéze byla RNA z agarózového gelu přes noc převedena na mylonovou membránu (BiRad, Zeta-Probe) při použití 20x SSC pomocí metody kapilárního přenosu (viz „Molecular Cloning - A Larobratory Manual“). Po přenosu byl filtr opatrně omyt 2x SSC, usušen vzduchem a pak dodatečně sušen při 80 °C 2 hodiny, aby se fixovala mRNA.

Fragment Pstl-AaTI z pcD-31 byl značen ³²P s použitím DNA značícího systému Multiprime (Amersham).

Předběžná hybridizace byla prováděna na filtru po dobu 3 hodin při 37 °C v roztoku obsahujícím 5x SSCP, 2,5x Denhardtův roztok, 50% formamid, 10 mM hydrogenfosfát sodný (pH 7,0), 0,5% SDS a 100 μg/ml denaturované DNA lososího spermatu. Následující den byl filtr nejdříve omýván 1 hodinu při 37 °C roztokem obsahujícím 50% formamid, 5x SSC a 0,1% SDS, a pak 2 hodiny omýván při téže teplotě roztokem obsahujícím 40% formamid, 5x SSC a 0,1 % SDS. Nakonec byl filtr omýván při laboratorní teplotě po dobu 15 minut roztokem 2x SSC. Následná autoradiografie ukázala, že inzert cDNA klonu pcD-31 zde není v celé délce a že kompletní délka odpovídající mRNA je 3,9 kg (stanovena z kalibrační křivky založené na molekulové hmotnosti markérů).

Příklad 6

Příprava čerstvé knihovny pro screening cDNA klonu pcD-31

Čerstvá knihovna byla připravena s použitím systémů cDNA Synthesis Systém Plus a cDNA Cloning Systém (XgtlO, adapterová metoda, dodávané Amershamem).

- 14CZ 293745 B6

Do reakce bylo vloženo 5 pg poly(A)⁺RNA extrahované z buněk KM-102 (podle postupu jako v příkladu 1) a 100 jednotek reverzní transkriptázy. Reakce probíhala při teplotě 42 °C 40 minut v 50 μ! reakčního roztoku reverzní transkriptázy. Po této době bylo k reakčnímu roztoku přidáno 20 pCi [a-32P]dCTP, 93,5 μΐ pufru druhého řetězce, 4 jednotky ribonukleázy H a 115 jednotek DNA polymerázy I (všechny roztoky dodávány v soupravě). Směs pak byla inkubována při 22 °C 1 hodinu a nakonec zahřívána na 70 °C po dobu 10 minut. Po této tepelné reakci bylo k reakční směsi přidáno 10 jednotek T4 DNA polymerázy (dodávané v soupravě) a reakce dále probíhala dalších 10 minut při 37 °C.

Reakční směs pak byla zbavena proteinů fenol-chloroformovou deproteinizací. Reakční roztok byl centrifugován, odebrán supematant a smíchán s 250 μΐ 4 M octanu sodného a 1 ml ethanolu. Směs byla ponechána přes noc v teplotě -20 °C, sraženina byla oddělena centrifugaci. Výsledná usazenina byla rozpuštěna v 30 μΐ sterilní vody. Z výsledného roztoku bylo odebráno 10 μΐ a přidáno ke směsi 2 μ pufru pro ligázu/kinázu, 250 pM EcoRI adaptéru a 5 jednotek T4 DNA ligázy (vše dodáváno v soupravě) a výsledná směs byla inkubována přes noc při 15 °C.

Celý reakční roztok byl pak aplikován na frakcionační kolonu, aby byl odstraněn EcoRI adapter. Reakční roztok byl pak rozdělen na alikvotní objemy po 120 μΐ a každý podíl byl smíchán s 200 μΐ 0,25x TE pufru. Byly shromážděny frakce od č. 10. do 17., koncentrovaný butanolem na celkový objem 120 μΐ.

Celý koncentrovaný přípravek pak byl smíchán s 55 μΐ sterilní vody, 20 μΐ pufru ligáza/kináza a 40 jednotek T4 polynukleotidkinázy (vše dodáváno v soupravě) a výsledná směs byla inkubována 30 minut při 37 °C, Poté byla reakční směs třikrát deproteinizována fenolchlorformovou metodou, sražená ethanolem a ponechána přes noc při teplotě -20 °C. Výsledná sraženina byla oddělena centrifugaci a rozpuštěna v 10 μΐ sterilní vody, čímž vznikl vzorek cDNA.

Ke každému vzorku cDNA o objemu 2 μΙ byl přidán 1 pg EcoRI ramene XgtlO, 1 ml ligáza/kináza pufru a 2,5 jednotek T4 DNA ligázy (vše poskytováno v soupravě) a pak následovala inkubace přes noc při 15 °C. Vzorek obsahující 4 μΐ cDNA byl připraven stejným způsobem. Každý vzorek byl pak dále zpracován následovně. Veškerý vzniklý reakční roztok byl nejdříve přidán k 10 ml extraktu A (poskytovaného v soupravě) a takto vzniklá směs pak byla přidána k 15 μΐ extraktu B (poskytovaného v soupravě). Výsledná směs byla 20 minut inkubována v 20 °C, aby mohla proběhnout reakce balení in vitro.

Po této době bylo k reakčnímu roztoku přidáno 470 μΐ SM pufru a pak byla směs uskladněna při 4°C. Kmen E. coli NM514 byl po reakci s 10 mM MgSO₄ infikován skladovaným roztokem čímž vznikla XgtlO knihovna cDNA KM-102.

Příklad 7

Screening cDNA knihovny

Zkombinovaných cDNA knihoven připravených podle příkladu 6 bylo získáno 2 x 10⁵ plaků, které byly následně fixovány na nylonové filtry (Hybond N, Amersham) následujícím způsobem.

Infikované E. coli připravené podle příkladu 6 byly kultivovány na 9 cm miskách obsahujících pevné LB médium tak, aby se na každé misce vytvořilo mezi 1 a 2 x 10⁴ plaky.

Příklad 8

Příprava nukleotidové sondy a hybridizace

-15CZ 293745 B6

Sondy značené ³²P byly vytvořeny z pcD-31 (získaného podle příkladu 4) označením fragmentů Pstl-Aatl a EcoT221-AatI (223 bp) z pcD-31 pomocí systému Multiprime DNA labeling systém. Byla provedena hybridizace plaků na filtrech získaných podle příkladu 7 při použití uvedených sond.

Prehybridizace byla provedena umístěním těchto filtrů do reakčního roztoku obsahujícího sondy značené ³²P a připravované podle výše uvedeného postupu, 50% formamid, 5x SSCP, lx Danhardtův roztok, 0,01 M hydrogenfosfátu sodného (pH 7,0), 0,1% SDS a 100 pg/ml denaturované DNA z lososího spermatu. Inkubace probíhala přes noc při 37 °C.

Následující den byl filtr nejdříve omýván 3 hodiny při laboratorní teplotě roztokem obsahujícím 50 % formamid, 5x SSC a 0,1% SDS, a pak 5 minut promýván při laboratorní teplotě 2x SSC. Autoradiografie ukázala 80 pozitivních klonů získaných tímto prvním screeningem.

S použitím klonů, které byly opakovaně identifikovány jako pozitivní, byly opakovány postupy příkladu 7 a 8 ještě třikrát (čtverný screening) a na konci bylo určeno celkem 17 pozitivních klonů. Z každého z těchto 17 klonů byla izolována cDNA a pomocí EcoRI byly vyštěpeny inzerty. Délka každého cDNA inzertu byla ověřena elektroforézou na agarosovém gelu a byl izolován klon 31-7, který měl cDNA inzert o délce 3,9 kbp odpovídající celkové délce původní mRNA.

Příklad 9

Restrikční mapování klonu č. 31-7

Klon č. 31-7 byl štěpen EcoRI, aby byl izolován a čištěn fragment o 3,9 kb obsahující cDNA inzert. Tento fragment byl pak vložen do pUC18 pomocí T4 DNA ligázy. E. coli DH5a byly transformovány tímto novým plazmidem. Transformované buňky byly podrobeny selekcí podle rezistence a ampicilin a klon pUCKM31-7 obsahující inzert 3,9 kb cDNA byl určen štěpením DNA EcoRI a následnou elektroforézou v agarózovém gelu.

pUCKM31-7 byl štěpen každým z těchto restrikčních enzymů: HindlII, Sací, Xbal, Smál, BglII, EcoT221 a Aatl nebo jejich dvojice. Výsledné fragmenty byly analyzovány elektroforézou na gelu a délka každého fragmentu byla změřena použitím markéru <|)X174HaeIII jako indikátoru. Výsledná restrikční mapa je uvedena na obr. 7.

Příklad 10

Stanovení sekvence klonu č. 31-7

Celková nukleotidová sekvence inzertu cDNA vpUCKM31-7 byl určena dideoxymetodou využívající fág M13. Část této sekvence byla analyzována sekvenátorem 373A DNA Sequencer (Perkin-Elmer Japan Applied Biosystems). Výsledná sekvence nukleotidů má sekvenční číslo ID: 11 a je uvedena v přiloženém přehledu sekvencí.

Inzert cDNA zpUCKM31-7 je dlouhý 3815 báze a má otevřený čtecí rámec složený z 549 aminokyselin počínaje methioninem. Zjevně chybí poly(A) konec. Srovnání sekvencí bází na 3'-konci inzertu pcD-31 se sekvencí klonu pUCKM31-7 ukazuje, že inzert zpUCKM31-7 postrádá pouze konec poly(A) a nic víc.

Porovnání sekvencí bází a aminokyselin bylo provedeno pomocí databází nukleotidů EMBL, GenBank, NBRF a SWISS-PROT. Nejtěsnější souhlasnost, která byla nalezena, činila 35,3 %

-16CZ 293745 B6 homologii peptidové sekvence s lidskou glutathionreduktázou. Z tohoto bylo vyvozeno, že ORF inzertu cDNA zpUCKM31-7 jasně kóduje nový polypeptid. Tento nový polypeptid je uveden pod sekvenční číslem ID: 12 v přiloženém seznamu sekvencí.

Příklad 11

Exprese a purifíkace nového polypeptidu

Konstrukce vysoce expresívního vektoru a exprese v COS-1 buňkách pUCKM31-7 byl štěpen HindlII a fragment 3003 bp obsahující cDNA inzert byl izolován a čištěn standardními technikami. Konce výsledného fragmentu byly zatupeny s použitím soupravy DNA blunting kit (Takara Shuzo).

Mezitím byl vysoce expresivní vektor pcDL-SRa296 [Takabe, Y. a kol. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 466-472] štěpen Pstl a KpnI a konce byly zatupeny pomocí uvedené soupravy. Zatupený inzert byl pak ligován do zatupeného plazmidu pomocí reakce T4 DNA ligázy. E. coli pak byly pomocí metody chloridu vápenatého transformovány výslednou DNA. Vzniklé transformanty Amp^R byly podrobeny selekci a byl analyzován plazmid DNA zachycený v buňkách.

Štěpením plazmidu enzymu HindlII a GblII, po kterém následovala elektroforéza na agarózovém gelu pro detekci 800bp fragmentu, byl vybrán kmen, ve kterém byl směr transkripce cDNA totožný s SRa promotorem. Vybraný plazmid byl označen pSRa31-7 (obr. 9). SRa promotor obsahuje počáteční promotor SV40 a sekvenci R-U5 LTR z HTLV-1 a aktivita jeho promotoru je desetkrát až stokrát silnější než samotného počátečního promotoru SV40.

Dále byly COS-1 buňky podrobeny transfekci výsledným plazmidem pSRa31-7. Transfekce COS-1 buněk byla provedena elektroporací pomocí zařízení pro zavádění genů GTE-1 (Shimadzu).

COS-1 buňky byly pěstovány v sedmi lahvích o objemu 150 cm³, z nichž každá obsahovala 25 ml DMEM (s 10% fetálním hovězím sérem) až do částečného základu na dně lahví. Kultury pak byly sklizeny, ke každé z nich byly přidány 3 ml roztoku tripsin-EDTA (lOx koncentrovaný roztok dodávaný Sigmou) a byly ponechány při laboratorní teplotě dokud se neoddělily buňky. Pak byl přidán 1 ml inektivovaného fetálního hovězího séra a 9 ml čerstvého roztoku trypsinEDTA. Buňky pak byly odděleny centrifugací. Takto oddělené buňky byly dvakrát promyty PBS(-) pufrem a resuspendovány v pufru PBS(-) do hustoty 6 x 10⁷buněk/ml.

Mezitím byl metodou s chloridem česným připraven plazmid DNA a doplněn do 200 pg/ml pufrem PBS(-).

Z obou výše uvedených PBS(-) přípravků buněk a plazmidu bylo odebráno 20 μΐ a jejich směs byla umístěna do komoiy obsahující elektrody v rozestupu 2 mm. Na směs pak byly aplikovány dva pulsy v intervalu 1 sekundy o síle 600 V a trvání 30 psec.

Elektrodová komora byla chlazena 5 minut na 4 °C a pak byla směs buňky-DNA uvnitř smíchána s 10 ml DMEM obsahujícího 10 % fetálního bovinního séra. Tato směs byla přenesena na Petriho misku a kultivována přes noc při 37 °C v atmosféře 5% CO?. Následující den byl z kultury odebrán supematant, buňky byly omyty bezsérovým DMEM médiem a pak resuspendovány v 10 ml DMEm a kultivovány při 37 °C další 3 dny. Po této době byl odebrán supematant.

- 17CZ 293745 B6

Supematant byl rovněž odebrán z negativní kontroly. Jako negativní kontrola byl použit plazmid pCDL-SRa296 neobsahující žádný inzert cDNA, který však byl jinak připraven podobným způsobem jako testovaná kultura.

Jeden ml supematantu z každé testované kultuiy a z negativní kontroly byl zpracován následujícím způsobem. K supematantu byla pro vysrážení proteinů nejdříve přidána kyselina trichloroctová (TCA) a sraženina byla oddělena centrifugací. Tato sraženina byla promyta eldovým acetonem, vysušena vzduchem a poté rozpuštěna ve vzorkovém pufru pro elektroforézu v SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) obsahujícím 2-merkaptoethanol. Pak byl proveden SDS-PAGE na 12,5% gelu za redukčních podmínek.

Po elektroforéze byly pruhy obarveny stříbrem s použitím stříbrného barviva „Daiichi“ (Daiichi Chemical Detection). Tímto způsobem bylo obarveno několik specifických pruhů z testovaného vzorku (molekulová hmotnost kolem 60 000).

Protože molekulová hmotnost polypeptidu kódovaného v pSRa31-7 je kolem 60 000 a protože bylo vydedukováno, že je nepravděpodobná přítomnost aminosekvence, která by způsobovala posttranslační modifikace přidáváním postranních sacharidových řetězců, bylo stanoveno těchto několik specifických pruhů odpovídá danému polypeptidu kódovanému cDNA z pSRa31-7.

Příklad 12

Příprava vysoce expresívního plazmidu pro buňky COS-1

Dalším krokem bylo ověření, zda těchto několik specifických 60 kDa pruhů určených v příkladu 11 je stejných jako jsou polypeptidy kódované inzertem z pSRa31-7. Dalším záměrem bylo stanovení N-konce sekvence aminokyselin tohoto polypeptidu. Proto byl vytvořen klon s dalšími šesti histidinovými zbytky přímo před terminačním kodonem kódovanými pro C-konec polypeptidu kódovaného inzertem pSRa31-7. Histidinové zbytky mají vysokou afinitu pro Ni²⁺ a cílem bylo exprimovat polypeptid mající histidinový hexamer (6x His), který by mohl být čištěn pomocí afinitní chromatografie na koloně s nábojem NI²⁺.

Nejdříve byl syntetizován oligonukleotid se 66 bázemi: 5'CTAGCGCTCTGGGGCAAGCATCCTCČAGGCTGGCTGGCTGCCACCACCACCACCACC ACTGATCTAGACT-3' (sekvenční č. ID: 14) a komplementární řetězec o 66 bázích a tyto látky byly čištěny s použitím automatického syntetizátoru DNA Automated DNA Synthesizer 394 (Perkin-Elmer Japan Applied Biosystems). Oba přípravky oligonukleotidů byly smíchány a inkubovány 3 minuty v 70 °C a dodatečně zahřívány 30 minut při 37 °C, aby proběhla teplotní hybridizace. Následně byly fosforylovány konce pomocí T4 polynukleotidkinázy.

Výsledný dvouřetězový (ds) fragment byl pomocí T4 DNA ligázy ligován do pUCKM31-7, kteiý byl předem štěpen Eco47III. Tento konstrukt byl uveden na obr. 10. E. coli DH5 byly transformovány DNA metodou využívající chlorid vápenatý a výsledné transformované kmeny byly podrobeny selekci a testovány, aby byl získán pUCKMŠ 1—7His.

Analýzou části relevantní sekvence bází tohoto pUCKM31-7 bylo potvrzeno, že v části pUCKM31-7His nejsou žádné abnormality.

Vysoce expresivní plazmid pro COS-1 buňky byl připraveny subklonováním inzertu z pUCKM31-7 His do pcDL-SRa296.

pUCMK31-7His byl rozštěpen Xbal a HindlII, fragmenty byly čištěny a konce fragmentů byly zatupeny použitím jedné jednotky Klenowova fragmentu za přítomnosti 2 mM dATP, 2 mM

-18CZ 293745 B6 dCTP, 2 mM dGTP, 2mM dTTP, 50 mM Tris-HCI (pH 7,2), 10 mM MgSO₄, 0,1 mM dithiothreitolu a 50 pg/ml BSA.

Mezitím byl vysoce expresívní vektor pcDL-SRa296 rozštěpen Pstl a KpnI a konce byly zatupeny soupravou DNA blunting kit. Zatupený fragment byl pak ligován do zatupeného plazmidu pomocí T4 DNA ligázy. Výsledný plazmid byl pak použit pro transformaci E.coli DH5a. Transformanty byl selektovány a testovány. Kmen, ve kterém byl směr transkripce cDNA totožný se směrem promotoru SRa, byl vybrán a plazmid tohoto kmene byl označen pSRa317His. Buňky COS-1 byly podrobeny transfekci výsledným plazmidem pSRa31-7 a bezsérový supernatant byl získán postupem stejným jako v příkladu 7.

Příklad¹13

Čištění a analýza aminokyselinové sekvence na N-konci

600 ml supematantu získaného podle příkladu 12 bylo dialyzováno proti 17 objemům dialyzačního pufru po dobu 15 hodin při teplotě 4 °C. Pufr byl nahrazen dalšími 17 objemy dialyzačního pufru a dialýza pokračovala při 4 °C další 4 hodiny.

Dialyzovaný přípravek pak byl podroben afinitní chromatografií používající FPLC (Fast Protein Polynukleotide Liquid Chromatography - Pharmacia) v následujících podmínkách.

Kolona: 20 ml ProBond^(tm) Resin (Invitrogen) naplněná XK16/20 (φ2,0 x 20 cm, Pharmacia)

Eluční pufr:

A) 20 mM fosfátového pufru (pH 7,8) obsahující imidazol, 0,5 M NaCl

B) 20 mM fosfátový pufr (pH 7,8) obsahující 300 mM imidazol, 0,5 M NaCl.

Průtok: 1 ml/min

Frakční roztok: 5 mg/zkumavka

Eluční podmínky: po odebrání 4 frakcí elučním pufrem A) bylo odebráno 16 frakcí elučním pufrem B) a frakce byly očíslovány v pořadí od 1 do 20.

300 μΐ každého vzorku z výsledných frakcí byl vysráženo TCA a vzniklá sraženina byla připravena pomocí SDS-PAGE využívající 12,5% gel v redukčních podmínkách jako svrchu. Barvením stříbrem byly detekovány pruhy, z nichž tři byly poblíž frakce č. 10. Přítomnost těchto tří pruhů ukázala, že inzert pSRa31-7His kóduje polypeptid mající tři různé délky s různými sekvencemi na N-konci.

Zbytek frakcí 7 až 14 byl koncentrován TCA srážením a sraženina byla použita v SDS-PAGE s 10% gelem v redukčních podmínkách. Proteinové pruhy pak byly z polyakrylamidového gelu přeneseny na polyvinyldiifluoridový film (PVDF) (proBIot^(tm), Applied Biosystems) pomocí přenosového zařízení a gelové membrány (Merisol, KS-8441) při 9 V a v přítomnosti transferovaného pufru [0,02 % SDS, 20% methanol, 25 mM Tris-kyselina boritá (pH 9,5)] při 4 °C po dobu 2,5 hodiny.

Po této době byla membrána obarvena 0,2% naftolovou modročemí (Sigma) a tři pruhy odpovídající těm, které byly dříve určeny, byly z membrány vystřiženy. Byla stanovena sekvence každého pruhu k šesté aminokyselině od N-konce pomocí plynného sekvenátoru protienů (Shimadzu, PPSQ-10). Sekvence N-konce pruhu s druhou zjevně největší molekulovou hmotností (molekulová hmotnost kolem 60 000) byla následující:

-19CZ 293745 B6

Val-Val-Phe-Val-Lys-Gln (aminokyseliny 1 až 6 sekvence č. ID: 12).

Těchto šest aminokyselin odpovídá prvním šesti aminokyselinám ORF z klonu 31-7 a také odpovídá sekvenci šesti aminokyselin počínaje 24. aminokyselinou (Val) zN-konce prekurzoro5 vého polypeptidu kódovaného inzertem cDNA z pSRa31-7His. Proto by měla delece aminokyselin 1 až 23 z N-konce tohoto prekurzoru polypeptidu vést k sekreci zralé formy proteinu začínající valinovým zbytkem.

io Příklad 14

Stanovení redukční účinnosti

i) Konstrukce expresívního vektoru

Polypeptid čištěný v předchozím příkladu byl získatelný v extrémně malých množstvích, jak byl exprimován z COS-1 buněk. Nebylo tudíž možné použít tento polypeptid k dalším účelům, jako jsou testy účinnosti. Bylo tedy nezbytné najít způsob, jak exprimovat tento polypeptid kódovaný cDNA inzertem v pSRa31-7 v alternativním hostiteli, který by umožňoval produkci množství 20 vhodných pro čištění a testy. Následující postupy byly použity pro dosažení tohoto záměru.

pUCKM31-7 byl rozštěpen HindlII, fragment 3003 bp obsahující cDNA inzert byl izolován a čištěn a konce byly zatupeny pomocí DNA soupravy pro tento účel. Tento fragment byl dále rozštěpen Xbal.

Expresívní vektor pMAL-c [Guan, C. a kol. (1987) Gene 67, 21-30] byl rozštěpen Xbal a Stul. Pomocí Xbal upravený fragment HindlII byl poté ligován do tohoto rozštěpeného plazmidu pomocí T4 DNA ligázy. Výsledný konstrukt je uveden na obr. 11. Tento konstrukt byl pak použit pro transformaci E. coli TB-1 a byli vybrány a testovány transformanty Amp^R. Kmen, ve kterém 30 byl směs transkripce cDNA totožný s transkripcí promotoru byl vybrán a takto získaný plazmid byl označen pMAL31-7.

ii) Exprese a čištění fúzního proteinu

Naočkovaná kultura E. coli nesoucí pMAL31-7 byla připravena kultivací při třepání přes noc při 37 °C v 3 ml LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. Následující den byl přidán 1 ml počáteční kultury do 100 ml čerstvého kultivačního LB média obsahujícího 50 μΐ/ml ampicilinu a kultivace pokračovala za stálého třepání a teplotě 37 °C, dokud nebylo dosaženo zákalu 0,5 při ODfioo nm. V té chvíli bylo ke kultuře přidáno IPTG do konečné koncentrace 0,1 mM a kultivační 40 bujón byl kultivován dále za třepání při 37 °C.

Následující den byly bakteriální buňky odděleny z kultury centrifugací při 6500 ot/min po dobu 20 minut při 4 °C. Usazenina pak byla resuspendována v 10 ml kolonového pufru a buňky byly ve výsledné suspenzi rozrušeny pomocí ultrazvukového desintegrátoru. Celé buňky a buněčné 45 fragmenty pak byly získány centrifugací v 8800 ot/min po dobu 30 min při 0°C a frakce rozpuštěného proteinu byla odebrána v podobě supematantu. Jeden ml této rozpustné frakce pak byl aplikován na chromatografíckou kolonu s amylózou (New England Biolabs).

Eluční pufr pro chromatografíí byl připraven přidáním maltózy k lOml kolonového pufru do 50 konečné koncentrace 10 mM.

Negativní kontrolní vzorky byly rovněž testovány chromatografíí. Negativní kontrola byla připravena podobným způsobem kromě toho, že byl použit vektor pMAL-c bez cDNA inzertu. Pak byla testována redukční účinnost proteinu v chromatografických vzorcích.

-20CZ 293745 B6 iii) Stanovení redukční účinnosti

Stanovení redukční účinností bylo provedeno v kývete (SARSTEDT, 10 x 4 x 45 mm) s použitím dichlorfenolindofenolu (DCIP) a oxidovaného glutathionu.

a) Stanovení redukční účinnosti pomocí DCIP

Z každého chromatografického vzorku získaného v ii) bylo podle návodu v soupravě Protein Assay Kit (Bio-Rad) odebráno 90,4 gg a každý byl odděleně smíchán s 1 ml 50 μΜ DCIP (Sigma). Pak bylo ke každému vzorku přidáno 15 μΐ 1 mM NADPH (Boehringer-Mannheim) a pokaždé byly měřeny hodnoty absorbance při OD_éoo nm a OD₃₄₀ nm. Výsledný pokles absorbance při obou vlnových délkách je uveden na obr. 12. Z obrázku je zřejmé, že pouze vzorek pMAL317 obsahuje faktor, který redukuje DCIP.

b) Stanovení redukční účinnosti pomocí oxidovaného glutathionu

K 90,4 gg každého chromatografícky získaného vzorku podle ii) a naneseného do samostatné kyvety byly přidány 15 ml 10 mM oxidovaného glutathionu. Do každé kyvety bylo přidáno 15 gl 1 mM NADPH a pokaždé byla změřena absorbance při OD₃₄₀ mM. Výsledky jsou uvedeny na obr. 13 aje žních zřejmé, že pouze vzorek pMAL31-7 obsahuje protein, který je schopen redukovat oxidovaný glutathion. Bylo rovněž pozorováno, že nedochází k žádné spotřebě NADPH, pokud není přítomen žádný oxidovaný glutathion, takže z tohoto bylo vyvozeno, že protein ze vzorku pMAL31-7 může redukovat oxidovaný glutathion pouze v přítomnosti NADPH.

Příklad 15

Čištění a analýza sekvence aminokyselin naN-konci.

Z příkladu 13 bylo vyvozeno, že COS-1 buňky po transfekcí pSR 31-7HÍS exprimovaly polypeptid mající tři typy N-konců.

V odděleném experimentu byli imunizovány králíci fúzním proteinem získaným v E. coli transformovaných pMAL31-7. Záměrem tohoto experimentu byla připravena polyklonální protilátky proti proteinu KM31-7. Byl proveden Western blot s použitím této polyklonální protilátky a ukázalo se, že tři typy pruhů jsou rovněž zjistitelné v supematantu bezsérové kultury získaného z COS-1 buněk po transfekcí pSRa31-7. Tento výsledek je podobný výsledku získanému v příkladu 13.

COS-1 buňky byly proto podrobeny transfekcí pSRa31-7 s cílem získat větší množství bezsérového supematantu, které by umožnilo purifikaci a analýzu N-konce sekvence proteinu KM31-7.

COS-1 buňky byly podrobeny transfekcí pSRa31-7 s cílem získat větší množství bezsérového supematantu, které by umožnilo purifikaci a analýzu N-konce sekvence proteinu KM31-7.

COS-1 buňky byly podrobeny transfekcí pSRa31-7 a byly pěstovány 3 dny v Petriho miskách o průměru 15 cm, přičemž každá obsahovala 30 ml DMEM. Supematant této kultury byl po těchto třech dnech odebrán a do každé misky bylo přidáno čerstvé medium v objemu 30 ml. Kultivace pokračovala další tři dny. Opět byl sklizen supematant z kultury. Ostatní aspekty transfekce a kultury byly podle popisu v příkladu 11, avšak bylo pěstováno 199 misek.

-21 CZ 293745 B6

Sklizené supematanty byly slity dohromady. Po centrifugaci bylo získáno 10 litrů bezsérového supematantu, které byly dialyzovány přes noc proti 10 mM Tris-HCl (pH 9,0). Chromatografíe na iontoměniči byla na dialyzovaném přípravku provedena osmkrát v následujících podmínkách a s použitím FPLC (Pharmacia):

Kolona: 20 ml DEAE Sepharosy Fast Flow (Pharmacia) plněné do ΧΚ16/20φ2,0 x 20 cm, Pharmacia)

Eluční pufiy:

A) 10 mM Tris-HCl (pH 9,0)

B) 10 mM Tris-HCl (pH 9,0) - 0,5 M NaCl

Průtok: 1 ml/mi

Frakční roztok: 3 ml/zkumavka

Eluční podmínky: eluční pufr A s přechodem na eluční pufr B v lineárním koncentračním gradientu během 60 minut.

Frakce eluované pro každou koncentraci NaCl od 0,1 M do 0,4 M byly odebrány a shromážděny. Poté byly dialyzovány přes noc proti dialyzačnímu pufru obsahujícímu 0,1 M Tris-HCl, 5 mM EDTA (pH 7,6) a 1 mM 2-Merkaptoethanol. Dialyzovaný přípravek byl pak nanesen na afinitní chromatografickou kolonu plněnou 2', 5-ADP Sepharose 4B (Pharmacia) při následujících podmínkách:

Kolona: 20 ml 2',5-ADP Sepharose 4B plněná do XK16/20 (φ2,0 x 20 cm, Pharmacia)

Eluční pufry:

A) 0,1 M Tris-HCl, 5 mM EDTA (pH 7,6) 1 mM 2-merkaptoethanol

B) 0,1 M Tris-HCl, 5 mM EDTA (pH 7,6) 1 mM 2-merkaptoethanol

Průtok: 0,5/min

Frakční roztok: 2 ml/zkumavka

Eluční podmínky: eluční pufr A postupně změněný n eluční pufr B v lineárním koncentračním gradientu během 120 minut.

100 μΐ podíly z každé výsledné frakce byly vysráženy TCA a sraženiny byly naneseny na SDSPAGE při použití 12,5% gelu při redukčních podmínkách.

Po elektroforéze byl gel barven stříbrem pro detekci proteinových pruhů. Počínaje frakcí č. 11 byly získány tři poruchy.

Všechny zbylé frakce od č. 11 do č. 14 pak byly koncentrovány srážením TCA a sraženina byla analyzována na SDS-PAGE v 12,5% gelu v redukčních podmínkách. Protein byl pak převeden z gelu na PloBlot PVDF membránu (Applied Biosystems) ihned po elektroforéze. Po přenosu proteinu na membránu byla membrána odebrána 0,2% amidočemí a byly vystřiženy tři proteinové pruhy. Analýza N-koncové sekvence byla provedena pomocí sekvenátoru proteinů v plynné fázi.

N-konec daného pruhu mající zjevně nejmenší molekulovou hmotnost ze všech tří typů byl stanoven na Lys-Leu-Leu-Lys-Met. Těchto pět aminokyselin odpovídá pěti aminokyselinám počínaje 49. aminokyselinou na N-konci polypeptidu kódovaného cDNA inzertem pSRa31-7.

-22CZ 293745 B6

Proto bylo vyvozeno, že rozštěpení tohoto peptidu v místě 48. zbytku vede k jedné zralé formě tohoto proteinu začínající lysinem naN-konci.

Příklad 16

Příprava monoklonální protilátky proti proteinu KM31-7 (a) Příprava antigenního proteinu

Naočkovaná kultura E. coli nesoucí pMAL31-7 byla připravena kultivační bakteriologické smyčky buněk třepáním přes noc při 37 °C v 3 ml LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. 1 ml narostlé kultury byl naočkován do 100 ml čerstvého LB média obsahujícího 50pg/ml ampicilinu a tato kultury byla pěstována za stálého třepání při 37 °C do dosažení zákalu 0,5 při 15 OD<soo nm. V tomto stadiu bylo do kultivačního bujónu přidáno IPTG do konečné koncentrace

0,1 mM a kultivace pokračovala při třepání v 37 °C přes noc.

Z takto vypěstované kultury byly buňky získány centrifugaci při 6500 ot/min, 20 minut při 4 °C a usazenina byla resuspendována v 10 ml kolonového pufru. Buňky ve výhodné suspenzi byly 20 rozrušeny ultrazvukovým dezintegrátorem a vzniklá tekutina byla centrifugována při 8000 ot/min při teplotě 0 °C po dobu 30 minut. Výsledný supematant obsahoval frakci rozpuštěného proteinu. Frakce rozpustného proteinu pak byla aplikována na chromatograficko amylózovou kolonu o objemu 1 ml. Eluce byla provedena 10 ml kolonového pufru obsahujícího 10 mM maltózou. Fúzní protein získaný chromatografickou cestou byl uložen a později použit jako antigen.

(b) Příprava slezinných buněk z imunizovaných myší

Ke 2 ml antigenu (odpovídajícím 200 pg) čištěnému podle a) byly přidány 2 ml Freundova kompletního adjuvans, aby vznikla emulze. Tato emulze byla nabrána do 5ml stříkačky se skle30 něnou spojkou a emulze byla použita k imunizaci osmitýdenních savců myší BALB/c podkožními injekcemi.

Počínaje druhým kolem imunizace byla jako adjuvans použito Freundovo nekompletní adjuvans, ostatní postup byl jinak zachován. Imunizace byla provedena dohromady čtyřikrát zhruba každé 35 dva týdny.

Od druhého očkování byly odebírány krevní vzorky z retroorbitální žilní pleteně okamžitě po očkování a v séru byl měřen titr protilátek proti KM31-7 pomocí ELISA testů na pevné fázi.

Elisa anti-KM31-7 na pevné fázi

Do každé komůrky 96komůrkové plotny (Costar) bylo jako antigen naneseno mezi 150 a 200 μΐ (což odpovídá kolem 200 ng fůzního proteinu) bezsérového supematantu získaného z kultury COS-1 buněk po transfekci pSRa31-7. Plotna pak byla ponechána přes noc v 4 °C, aby se 45 protáhly dna komůrek. Následující den byla miska třikrát omyta 0,1 % Tweenem 20/fyziologický roztok s fosfátovým pufrem (0,1% Tween 20/PBS) a pak byly komůrky naplněny 100 μ BSA připravené na 10 pg/ml s PBS a plotna byla ponechána jednu hodinu při laboratorní teplotě.

Po této době byla plotna opět třikrát omyta 0,1% Tweenem 20/PBS. Do každé komůrky bylo 50 naneseno 30-100 μΐ primárních protilátek ve formě sériově ředěných vzorků (na příklad myší sérum, supematant hybridomové kultury nebo monoklonální protilátka) a plotna byla ponechána při laboratorní teplotě 1 hodinu.

-23 CZ 293745 B6

Po této době byla plotna opět třikrát omyta 0,1% Tweenem 20/PBS) a pak byla do každé komůrky přidána sekundární protilátka v množství 100 μΐ. Sekundární protilátka byla připravena 3000násobným ředěním roztoku kozího anti-myšího IgG-peroxidázového komplexu (Amershamú nebo 3000násobným ředěním kozího anti-myšího IgG komplexu alkalické fosfatázy (BIO-RAD). Pak byla plotna ponechána 1 až 2 hodiny při laboratorní teplotě.

Po této době byla plotna opět omyta třikrát 0,1% Tweenem 20/PBS a pak bylo do každé komůrky přidáno 100 μΐ buď roztoku substrátu peroxidázy (BIO-RAD, Peroxidase Substráte Kit ABTS), nebo 10% diethanolaminu obsahujícího 0,001% roztok para-nitrofenylfosfátu. Plotna pak byla ponechána 15 až 30 minut při laboratorní teplotě. Titr protilátek byl počítán měřením absorbance při 415 nm nebo 405 nm pomocí odečítacího zařízení (BIO-RAD).

(c) Příprava myších myelomových buněk

Myší myelomové buňky P3-X63-Ag8.653 (653) (ATCC č. CRL-1580) rezistentní na 8azaguanin byly kultivovány normálním médiu (kompletní GIT) za účelem získat minimální 2 x 10⁷ buněk.

(d) Příprava hybridomů

1,4 x 10⁸ slezinných buněk imunizovaných myší získaných po imunizačním režimu vb) bylo důkladně omyto DMEm (Nissui Pharmaceutical). Omyté buňky pak byly smíchány s 1,5 x 10⁷ myších slezinných buněk P3-X63-Ag8.653 (653) připravených podle c) a výsledná směs byla 6 minut centrifugována při 800 ot/min.

Skupina buněk obsahující směs slezinných buněk P3-X63-Ag8.653 (653) byla odebrána jako usazenina a byla rozrušena. Předem byl připraven 50% roztok polyethylenglykolu 4000 s DMEM a tento roztok byl nakapán rychlostí 2 ml/min na rozrušené buňky v průběhu 1 minuty za míchání. Pak bylo k buněčnému přípravku přidáno DMEM rychlostí 2 ml/min podobným způsobem po dobu 1 minuty. Tento postup byl ještě jednou opakován u obou roztoků, tj. polyethylenglykolu a DMEM. Nakonec bylo přidáno 16 ml DMEm postupně v průběhu 3 minut. Výsledný buněčný přípravek pak byl centrofugován 6 minut při 800 ot/min. Výsledný supernatant byl odebrán, buňky resuspendovány v 35 ml kompletního GIT obsahujícího 5 až 10 ng/ml myšího IL-6.

(e) Screening hybridomů

Do každé komůrky 96komůrkové plotny (Sumitomo Bakelite) bylo naneseno 100 μΐ suspenze připravené podle d). Pak byla plotna inkubována při 37 °C v inkubátoru s 7,5% CO₂. Po 7 dnech inkubace bylo do každé komůrky přidáno 50 μΐ HAT média. Po dalších 4 dnech inkubace bylo do každé komůrky přidáno dalších 50 μΐ HAT média. Poté následovaly další 3 dny inkubace. Po této době byl z každé komůrky, u které byl pozorován růst kolonií fúzovaných buněk, odebrán vzorek supematantu a byl testován titr protilátek proti KM31-7 ELISA testem na pevné fázi popsaném v b). Médium odebrané na vzorky bylo ihned nahrazeno HT médiem.

(f) Klonování

Klonování buněk z komůrek, které byl označeny jako pozitivní bylo opakováno třikrát analýzou omezeného ředění. Tyto klony, u kterých byl pozorován stálý titr protilátek, byly vybrány pro použití jako hybridomové linie buněk produkujících monoklonální protilátky proti KM31-7. V tomto stadiu byl proveden test ELISA nejen, jak bylo popsáno v b), ale rovněž jako kontrolní ELISA, přičemž byl použit bezsérový supematant z kultury získaný z COS-1 buněk po transfekci pcDL-pSRa296 pro přípravu pevné fáze. Proto byly pro klonování vybrány ty buněčné linie, které reagovaly v dřívějším ELISA testu, ale nereagovaly v pozdějším kontrolním ELISA testu.

-24CZ 293745 B6 (g) Čištění monoklonální protilátky

Z kultury hybridomové buněčné linie produkující monoklonální protilátky proti KM31-7 byl 5 odebrán supematant, sterilizován filtrem 0,22 pm (Millipore), a pak byla protilátka čištěna pomocí MAbTrap GI (Pharmacia).

(h) Analýza monoklonální protilátky

1) Antigenní specifičnost monoklonální protilátky

Imunologickým srážecím testem s použitím bezsérového supematantu odebraného z kultury COS-1 buněk po transfekci pSRa31-7 bylo potvrzeno, že monoklonální protilátka je specifická pro KM31-7 protein.

2) Klasifikace monoklonální protilátky

Tento test byl proveden s použitím soupravy izotypů monoklonálních protilátek (Amersham). Bylo stanoveno, že protilátka patří do podtřídy IgGl.

Příklad 17

Izolace a čištění proteinu KM31-7 s použitím reakce antigen-protilátka

Byl použít postup uvedený v příkladu 15 h) 1). Stejný test byl opakován s použitím supematantu s protilátkou a bezsérového supematantu získaného z COS-1 buněk po transfekci pcDLpSRa296.

1,4 μg monoklonální protilátky bylo přidáno k 1,7 ml každého bezsérového supematantu a reakce probíhala při teplotě místnosti 1 hodin při centrifugování v 20 ot/min v mikrozkumavkách 2,2 ml. Kontrola byla provedena s použitím bezsérového supematantu získaného z COS-1 buněk po transfekci pSRa31-7, avšak bez přidání monoklonání protilátky.

Do každé zkumavky bylo pro adsorpci protilátky přidáno 30 μΐ Proteinu G Sepharose 4 Fast Flow (Pharmacia), který byl předem promyt 0,1 Tweenem 20/PBS, a centrifugace pokračovala dalších 30 minut při laboratorní teplotě a rychlosti 20 ot/min.

Po této době byla každá směs centrifugována několik sekund při 10 000 ot/min v mikrocentrifuze 40 a supematant byl opatrně odstraněn, aby nedošlo k žádným ztrátám sedimentu. Usazeniny pak byly jednotlivě promyty 0,1% Tweenem 20/PBS, centrifugovány v mikrocentrifuze a opět promyty, to vše celkem pětkrát.

Výsledný sediment byl resuspendován ve vzorkovém pufru pro SDS-PAGE obsahujícím 10 μΐ 45 2-merkaptoethanolu. Každá suspenze byla 2 minuty ohřívány na 90 °C a pak byla provedena

SDS-PAGE v 12,5% gelu v redukčních podmínkách. Po elektroforéze byl produkt převeden z polyakrylamidového gelu na nitrocelulózový film (BIO-RAD). Western blot byl proveden s použitím polyklonální protilátky proti KM31-7 popsané v příkladu 1 část (a). Bylo stanoveno, že monoklonální protilátka proti KM31-7 specificky sráží protein KM31-7 z bezsérového 50 supematantu z kultury COS-l/pSRa31-7.

-25CZ 293745 B6

Příklad 18

Příprava fúzního proteinu CYVV-NIa/KM31-7

Aby mohl být protein KM31-7 exprimován technikou CYVV-NIa proteázy, je nutné spojit 3'konec genu pro NIa ve stejném ORF jako je DNA pro protein K.M31-7. Proto byly provedeny následující dvoustupňové postupy.

i) Zavedení 3'-postranního řetězce (Smal-Xbal, 1006 bp) KM31-7 cDNA do pKSUN9

Plazmid pSRa31-7 byl rozštěpen restrikčními enzymy Smál a Xbal, aby byl získán Smal-Xbal fragment o 1 006 bp obsahující 3'-konce KM31-7 cDNA. Výsledný fragment byl odebrán a purifikován v 0,8% agarózovém gelu při použití GENECLEANII (Funakoshi Japan).

Mezitím bylo podobným způsobem rozštěpeno Smál a Xbal 5 mg plazmidové DNA pKSUN9 a vzniklé fragmenty byly defosforylovány hovězí alkalickou fosfatázou (Alkaline Phosphatase E. coli C75, Takara Shuzo, Japan). Výsledná defosforylovaná linearizovaná DNA byla ligována s fragmentem Smal-Xbal KM31-7 pomocí ligační soupravy (Takara Shuzo) a takto připravený konstrukt byl použit k transformaci kmene E. coli JM109. Transformanty byly podrobeny selekci a testovány, aby byl nalezen klon pNIa31-7SX obsahující fragment Smal-Xbal.

ii) Spojení proteázy NIa a KM31-7

Aby mohl být C-konec sekvence NIA spojen sN-koncem sekvence KM31-7, subtypy majícího valin na N-konci ve stejném čtecím rámci, byl připraveny čtyři typy primerů pro PCR využívající Perkin-Elmer Japan Applied Biosystems Model 392 DNA Synethesizer. Primery jsou následující: 5' GGT CAG CAC AAA TTT CCA 3' sekv. č. ID: 14 (1) 5' AAA CAC AAC TTG GAA TGA ACA ATT 3' sekv. č. ID: 16 (2) 5' TCA TTC CAA GTT GTG TTT GTG AAA 3' sekv. č. ID 17 (3)

5' CAT AGG ATG CTC CAA CAA 3' sekv. č. ID: 18 (4)

První kolo PCR bylo provedeno s použitím 1 pg plazmidová DNA pKSUN9 jako templátu. Do reakce bylo vloženo 100 pmol každého primeru (1) a (2) a 1/10 objemu desetinásobné koncentrace roztoku reakčního pufru Taq polymerázy a nakonec 5 jednotek Taq polymerázy (Takara Shuzo) v uvedeném pořadí. PCR reakce byla nejdříve provedena 3 minuty při 72 °C. Pak následovalo 30 cyklů: 1 minuta při 94 °C, 2 minuty při 55 °C a 3 minuty 72 °C, zakončeno reakcí 10 minut při 72 °C. Po PCR reakci byl znásobený DNA produkt podroben elektroforéze v 8% polyakrylamidovém gelu. Proužky gelu obsahující DNA byly určeny barvením ethidiumbromidem a byly vystřiženy. K. rozlámaným proužkům bylo přidáno 300 μΐ elučního pufru (0,5 octan amonný, 1 mM EDTA, pH 8,0) a pak následovala inkubace přes noc při 37 °C. Centrifugací se získal supematant, který obsahoval čištěnou a amplifíkovanou DNA.

Opět byla provedena PCR podobným způsobem při použití 1 μg pUCKM31-7 plazmidové DNA jako templátu a primerů (3) a (4). Výsledná DNA byla čištěna jako předtím.

Amplifikovaný fragment z první PCR obsahoval sekvenci kódující zbytky zN-konce protienu KM31-7 počínaje Val-Val-Phe přes 31 bp proti směru exprese od místa Xhol v NIa. Amplifikovaný fragment z druhé PCR obsahoval sekvenci kódující Asn-Cys-Ser-Phe-Gln z Ckonce NIa přes 32 bp po směru exprese od místa Smál v cDNA KM31-7.

Při PCR provedené s použitím obou fragmentů CNA vzniklých z uvedených dvou PCR reakcí spolu s primery (1) a (4) je výsledkem reakce hybridizovaný řetězec sestávající z 9 bp 3'- konce NIA a 15 pg sekvence kódující požadovaný N-konec KM31-7. Tak je možné vytvořit sekvenci fúzované DNA s touto částí jako spojovníkem.

-26CZ 293745 B6

Na základě této logiky bylo provedeno druhé kolo PCR stejným způsobem a znásobený fragment byl pak získán z gelu.

iii) Zavádění NIa/KM31-7 DNA do pNIa31-7SX pg plazmidové DNA z pNIa31-7SX získané podle i) bylo rozštěpeno Xhol a Smál a výsledná DNA byla defosforylvoána reakcí s hovězí alkalickou fosfatázou. Produkt PCR připravený podle ii) byl rovněž rozštěpen Xhol a Smál výsledný fragment byl ligován s rozštěpeným desoforylovaným pNIa31-7SX pomocí ligační soupravy. Výsledný konstrukt byl použit k transformaci e. coli kmene JMI09.

Transformandy amp^R byly selektovány a testovány. Screening byl proveden rozštěpením Xhol a následnou elektroforézou. Byly vybrány klony mající pouze jeden pruh o 8,0 kbp. Plazmidy vybraných klonů byly pak rozštěpeny HindlII a opět elektroforeticky rozděleny. Vybraný plazmid měl pruh 330 bp odpovídající části inzertu NIa cDNA. Tento plazmid byl označen pNIa31-7V a obsahoval Xhol a Smál PCR produkt.

Byla určena sekvence bází klonu pNIa31-7 a bylo potvrzeno, že sekvence kódující NIa a KM317 byly spojeny ve stejném otevřeném čtecím rámci a s nezbytnou štěpnou sekvencí Gln-Val umístěnou mezi NIa proteinem KM31-7.

iv) Produkce proteinu KM31-7

Western blotem bylo potvrzeno, že pNIa31-7V byl v E. coli funkční a že protein KM31-7 byl exprimován zkonstruovaným rekombinantním genem.

Počáteční kultura E. coli nesoucí plazmid pNIa31-7V byla pěstována přes noc za třepání v 3 ml LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. Jeden ml této počáteční kultury byl přidán ke 100 ml čerstvého média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a kultivace pokračovala třepáním při 37 °C až do dosažení zákalu 1,0 při ODňoo nm. V tomto stadiu bylo přidáno ke kultivačnímu bujónu IPTG do konečné koncentrace 1 mM a kultura pak byla inkubována v 28 °C přes další dvě noci za stálého třepání.

Po této době byl 1 ml kultury přenesen do mikrocentrifugační zkumavky a byl centrifugován 5 minut při 15 000ot/min. Supematant byl odstraněn a usazenina byla smíchána s 300 μΐ sterilované vody a 300 μΐ roztoku vzorkového pufru pro SDS-PAGE obsahujícího 2-merkaptoethanol, aby se rozrušily usazené buňky. Vzniklá suspenze byla zahřívána 2 minuty v 95 °C a pak bylo 10 μΐ této suspenze použito pro SDS-PAGE v 8% gelu při redukčních podmínkách.

Po elektroforéze byl protein přenesen zgeluna nitrocelulózovou membránu prostřednictvím kontaktu gelu s touto membránou a inkubací v přítomnosti roztoku transkripčního pufru (25 mM Tris-HCl, 1,4% glycin a 20% methanol) při 4 °C po dobu 2,5 hodin v 19 V a s použitím zařízení na transkripci gel-membrána (Marisol Japan).

Nitrocelulózová membrána pak byla omyta 20 ml PBS-T médiem a blokování bylo prováděno 1 hod v 20 ml PBS-T obsahujícího 5% odstředěné mléko (Snow Brand Co., Ltd.). Po této době byla membrána omyta dvěma dávkami 20 ml PBS-T a pak ponechána po 90 minut v reakci v 20 ml PBS-T obsahujícího 1 μΐ lOOx ředěného králičího séra proti KM31-7 (primární protilátka) sterilní vodou. Nitrocelulózový film pak byl omýván dvakrát 15 minut a opět dvakrát po pěti minutách 20 ml PBS-T.

Omytá membrána pak byla umístěna do lázně s 3000x ředěnou korozí protilátkou anti—králičí IgG značenou peroxidázou (BIO-RAD) v PBS-T (použité jako sekundární protilátka výše) a

-27CZ 293745 B6 ponechána v lázni 1 hodinu. Pak byla membrána omyta 20 ml PBS-T a přenesena do lázně detekční látky ECL (Amersham). Pruhy, které reagovaly s protilátkou proti KM31-7, byly určeny autoradiograficky.

Byl proveden Western blot a byly označeny pruhy mající molekulovou hmotnost přibližně 60 000. Tento pruh vykazoval stejnou mobilitu jako protein mající druhou nejvyšší molekulovou hmotnost ze tří proteinů KM31-7 detekovaných z bezsérového supematantu získaného transfekcí buněk COS-1 pomocí pSRa31-7 použitého jako kontroly.

Použité chemikálie a roztoky x M fosfátový pufr x M roztok Na₂HPO₄ upravený na požadované pH pomocí x M roztoku NaH₂PO₄.

Inokulační pufr

0,1 M Tris-HCl pufr, pH 7,0,0,05 M EDTA, 1% 2-merkaptoethanol

Extrakční pufr

0,1 M Tris-HCl pufr, 0,05 M EDTA, 1% 2-merkaptoethanol, pH 7,0

Degradační roztok

200 mM uhličitan amonný, 2% SDS, 2 mM EDTA,

400 mg/ml bentonit a 20 mg/ml proteáza K. (pH 9,0)

1 x SSC

0,15 M NaCl, 0,015 M citrát sodný, pH 7,0.

Tekuté LB médium g Bacto Tryptonu (Difco), 5 g kvasničného extraktu Bacto yeast (Difco) a 5 g chloridu 30 sodného, vše doplněno do 1 litru destilovanou vodou.

Pufr Tris-Kalcium mM Tris, 50 mM chlorid vápenatý, pH upraveno na 7,4 kyselinou chlorovodíkovou.

Lyzační pufr

0,17 g sacharózy, 250 μΐ 1 M pufru Tris-HCl (pH 8,0), 200 μΐ 0,5 M EDTA (pH 8,0), vše doplněno 20 ml destilovanou vodou

Roztok alkalického SDS

0,2 M hydroxie sodný, TSDS

Roztok TBE

100 mM Tris, 100 mM kyselina boritá, 1 mM EDTA

Denaturační roztok

1,5 M chlorid sodný, 0,5 M hydroxid sodný.

Neutralizační roztok

0,5 M Tris, 3 M chlorid sodný (pH 7,4)

50x Denhardtův roztok

1% polyvinyl pyrrolidon, 1% hovězí sérumalbumin,

1% Ficoll 400. Tento roztok je pak naředěn destilovanou vodou tak, aby se dosáhla požadovaná koncentrace.

-28CZ 293745 B6

5x denaturační pufr

125 μΐ 1 M glycinu (ph 9,0), 25 μ! 1 M chloridu hořečnatého, 850 μΐ redestilované vody.

5x značkovací pufr μΐ 1 M Tris-HCl pufru (pH 7,9), 5 μΐ 1 M chloridu hořečnatého, 2,5 μΐ 1 M dithiotreitolu, 9,2 μΐ redestilované vody.

Solný roztok 10 x M9

0,145 M hydrogenfosfát sodný, 0,172 M dihydrogenfosfát draselný, 0,187 M chlorid amonný, 0,137 M chlorid sodný, pH 7,0.

M9 minimální agarové médium

Μ ΙΟχ M9 solného roztoku, 100 μΐ 1M síranu hořečnatého, 1 Ml 20% glukózy, 50 μΐ 1% thiamin hydrochloridu, 1 ml 0,01 M chloridu vápenatého a 13 ml redestilované vody. Vše smíchané, sterilizováno filtrací a pak nalito na misky ihned po přidání 50 ml 3% baktoagaru.

Tekuté SOB médium g baktotryptonu, 2,5 g kvasničného extraktu (bactoyeast), 100 μΐ 5 M chloridu sodného a 125 μΐ 1M chloridu draselného, vše smícháno dohromady a doplněno do 500 ml destilovanou vodou. Po autoklávování bylo přidáno 5 ml 1M chloridu hořečnatého a 5 ml síranu hořečnatého.

PufřTFBl ml 1 M 2-(N-moroflino)ethansulfonová kyselina (MES - upravená na pH 6,2 pomocí 1 N HCl, 6,045 g chloridu rubidného, 0,735 g bihydrátu chloridu vápenatého smícháno s 4,94 g tetrahydrátu chloridu vápenatého, pH upraveno ledovou kyselinou octovou na 5,8 a doplněno do 500 ml redestilovanou vodou. Sterilováno filtrací.

Pufr TFB2 ml 1 M 2-(N-morfolino)propansulfonové kyseliny (MOPS), 1,102 g bihydrátu chloridu vápenatého, 0,12 g chloridu rubidného a 15 ml glycerolu, smícháno, pH upraveno na 6,5 ledovou kyselinou octovou, do 100 ml doplněno redestilovanou vodou a sterilizovanou filtrací.

Tekuté SOC médium ml tekutého SOB média, 90 μΐ 20% glukózy.

Médium 2x YT g byktotryptonu, 5 g kvasničného extraktu (bactoyest) a 5 g chloridu sodného, smícháno a doplněno do 1 litru redestilovanou vodou.

Médium PBS-Tw mM hydrogenfosfát sodný, 20 mM dihydrogenfosfát sodný, 100 mM chlorid sodný, 0,1% Tween 20.

Médium PBS-T g chloridu sodného, 0,1 g dihydrogenfosfátu draselného 1,45 g dodekahydrátu hydrogenfosfátu sodného, 0,1 g chloridu draselného a 0,1 g azidu sodného, vše smícháno a doplněno do 1 litru redestilovanou vodou, pH 7,4.

Roztok substrátu alkalické fosfatázy

0,01 % p-nitrofenylfosfátu rozpuštěného v 10% vodném roztoku diethanolaminu, který byl upraven na pH 9,8 kyselinou chlorovodíkovou.

-29CZ 293745 B6

Médium A

DMEM (Dulbecccfs modifíed Eagle medium, obsahující 4,5 g/1 glukózy), 10% inaktivované fetální hovězí sérum (Hyclone) a 10 mM HEPES (pH 7,2).

Médium B

DMEM (obsahující 4,5 g/1 glukózy) 10 mM HEPES (pH 7,2), 3% inaktivované hovězí fetální sérum, 5 pg/ml hovězího inzulínu (výroba Sigma), 8 pg/ml d-biotinu (výroba Sigma), 4mg/ml kyseliny panthotenové (výroba Sigma), 1,0 mM dexamethason (Sigma) a 0,5 mM izobutylmethyxantin (Aldrich).

Médium C

DMEM (obsahující 4,5 g/1 glukózy), 5% inaktivovaného hovězího fetálního séra, 10 mM HEPES (pH 7,2), lOOng/ml hovězího inzulínu a lOU/ml heparinu sodného (výroba Novo Industry Co.).

Roztok substrátu LPL mM glycerol tri-[9,10(n)-³H]oleát (51,8 kBq/pmol, výroba Amersham), 1,3 mg/ml La-fosfatidylcholin distearoyl (výroba Sigma Co.), 20 mg/ml hovězího serumalbumin (výroba Sigma, co.), 135 mM Tris hydrochlorid [Tris-HCl(pH 8,1), výroba Sigma Co.], 16,5% (v/v) glycerol a 16,5% (v/v) inaktivované hovězí fetální sérum.

Roztok guanidin thyikyanátu

M guanidin thiokyanát, 1% sarkosyl, 20 mM kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA), 25 mM citrát sodný (pH 7,0), 100 mM 2-merkaptoethanol a 0,1% antifoam A (Sigma).

Adsorpční pufr

0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA a 0,1% SDS.

Eluční roztok mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA a 0,05% SDS.

Reakční roztok reverzní transkriptázy vzorku 2 ml Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl₂, 30 mM KC1, 0,3 mM dithiothreitol, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dTTP, 10 pCi[a-³²P]dCTP a 1,4 pg vektoru primerové-DNA (3'—oligo(dT)— koncový pcDV-1, Pharmacia).

Reakční roztok terminální transferázy

140 mM kakodylát draselný, 30 mM Tris-Cl (pH 6,8), 1 mM CoCl₂, 0,5 mM dithiothreitol, 0,2 pg polyA a 100 mM dCTP.

Pufr pro restrikční enzym mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂ a 1 mM dithiotreitol.

objemů ligačního pufru mM ATP, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 66 mM MgCl₂ a 100 mM dithiotreitol.

Elektroforetický pigment

50% glycerol, 0,01 M hydrogenfosfát sodný (pH 7,0) a bromfenolová modř.

xTAE

0,04 M Tris-acetát, 0,01 M EDTA.

-30CZ 293745 B6 x SSCP

120 mM NaCl, 15 mM citrát sodný, 13 mM dihydrogenfosfát draselný a 1 mM EDTA.

Reakční roztok pro reverzní transkriptázu vzorku 6 lx pufr syntézy prvního vlákna, 5% pyrofosfát sodný, 100 jednotek inhibitoru ribonukleázy, 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dTTP, 0,5 mM dCTP a 3,75 pg příměru oligo (dT), vše poskytováno v cDNA Cloning Systém (Amersham).

SM pufr

100 mM NaCl, 8 mM MgSO4.7H2O, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) a 0,01% želatina.

Dialyzační pufr mM fosfátový pufr (pH 7,8) a 0,5 M NaCl.

Kolonový pufr mM Tris-HCl (pH 7,4), 200 mM NaCl a 1 mM EDTA.

Roztok reakčního pufru pro Taq polymerázu

Taq obsahující 500 mM Tris-HCl (pH 8,3), 500 mM KC1, 15 MM MgCl₂, 100 mM dATP, 100 mM dCTP, 100 mM dGTP, 100 mM dTTp a 2 mg/ml želatiny.

Přehled sekvencí:

Sekvenční č.ID:	11
Délka sekvence:	1650
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Počet řetězců	dvouřetězcová
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	cDNA na mRNA
Původní zdrojový organismus:	Homo sapiens
Vlastnosti:
Charakteristika exprese symbolu:	CDS
Umístění:	1..647
Metoda pro stanovení charakteristiky:	E
Charakteristika exprese symbolu:	mat-peptid
Umístění:	70..1647
Metoda pro stanovení charakteristiky:	E
Charakteristika exprese symbolu:	mat-peptid
Umístění:	70..1647
Metoda pro stanovení charakteristiky:	sig peptid
Umístění:	1..69
Metoda pro stanovení charakteristiky:	E
Sekvence:

-31 CZ 293745 B6

ATG TCA TGT C-AG Met Ser Cys Glu

GAC Asp

GGT CGG GCC CTG GAA GGA ACG

CTC TCG GAA TTG

48

Gly Arg Ala Leu -15

Glu

Gly

Thr

Leu Ser Glu -10

Leu

•23

-20

GCC

GCG

GAA

ACC

GAT

CTG

CCC

GTT

GTG

TTT

GTG

AAA

CAG

AGA

AAG

ATA

9c

Ala

Ala

Glu

Thr

Asd

Leu

Pro

Val

Val

Phe

Val

Lys

Gin

Arg

Lys

Ile

-S

1

5

GGC

GGC

CAT

GGT

CCA

ACC

TTG

AAG

GCT

TAT

CAG

GAG

GGC

AGA

CTT

CAA

144

Gly Gly

HÍS

Gly

Pro

Thr

Leu

Lys

Ala

Tyr

Gin

G1U

Gly

Arg

Leu

Gin

10

15

20

25

-32CZ 293745 B6

AAG Lys

CTA CTA AAA ATG AAC

GGC CCT GAA GAT CTT CCC AAG TCC TAT GAC Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lys Ser Tyr Asp

192

Leu Leu Lys

Met 30

Asn

35

40

TAT

GAC

CTT

ATC

ATC

ATT

GGA

GGT

GGC

TCA

GGA

. GGT

CTG

GCA

. GCT

' GCT

240

Tyr

Asp

Leu

Ile

Ile

Ile

Gly Gly Gly

Ser

Gly Gly

Leu

Ala

Ala

. Ala

45

50

55

AAG

GAG

GCA

GCC

CAA

TAT

GGC

AAG

AAG

GTG

ATG

GTC

CTG

GAC

TTT

GTC

288

Lys

Glu

Ala

Ala

Gin

Tyr Gly

Lys

Lys

Val

Met

Val

Leu

Asp

Phe

Val

60

65

70

ACT

CCC

ACC

CCT

CTT

GGA

ACT

AGA

TGG

GGT

CTT

GGA

GGA

ACA

TGT

GTG

336

Thr

Pro

Thr

Pro

Leu

Gly

Thr

Arg

Trp

Gly

Leu

Gly

Gly

Thr

Cys

Val

75

80

85

AAT

GTG

GGT

TGC

ATA

CCT

AAA

AAA

CTG

ATG

CAT

CAA

GCA

GCT

TTG

TTA

384

Asn

Val

Gly

Cys

Ile

Pro

Lys

Lys

Leu

Met

His

Gin

Ala

Ala

Leu

Leu

90

95

100

105

GGA

CAA

GCC

CTG

CAA

GAC

TCT

CGA

AAT

TAT

GGA

TGG

AAA

GTC

GAG

GAG

432

Gly

Gin

Ala

Leu

Gin

Asp

Ser

Arg

Asn

Tyr Gly

Trp

Lys

Val

Glu

Glu

110

115

120

ACA

GTT

AAG

CAT

GAT

TGG

GAC

AGA

ATG

ATA

GAA

GCT

GTA

CAG

AAT

CAC

480

Thr

Val

Lys

His

Asp

Trp

Asp

Arg

Met

Ile

Glu

Ala

Val

Gin

Asn

His

125

130

135

ATT

GGC

TCT

TTG

AAT

TGG

GGC

TAC

CGA

GTA

GCT

CTG

CGG

GAG

AAA

AAA

528

Ile

Gly Ser

Leu

Asn

Trp

Gly

Tyr

Arg

Val

Ala

Leu

Arg

Glu

Lys

Lys

140

145

150

GTC

GTC

TAT

GAG

AAT

GCT

TAT

GGG

CAA

TTT

ATT

GGT

CCT

CAC

AGG

ATT

576

Val

Val

Tyr

Glu

Asn

Ala

Tyr Gly

Gin

Phe

Ile

Gly

Pro

His

Arg

Ile

155

160

165

AAG

GCA

ACA

AAT

AAT

AAA

GGC

AAA

GAA

AAA

ATT

TAT

TCA

GCA

GAG

AGA

624

Lys

Ala

Thr

Asn

Asn

Lys

Gly Lys

Glu

Lys

Ile

Tyr

Ser

Ala

Glu

Arg

170 175 180 185

-33 CZ 293745 B6

TTT CTC ATT GCC

ACT GGT GAA AGA CCA CGT TAC TTG GGC ATC CCT GGT

672

Phe

Leu

Ile Ala

Thr 190

Gly

Glu

Arg

Pro Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Gly

195

200

GAC

AAA

GAA

TAC

TGC

ATC

AGC

AGT

GAT

GAT

CTT

TTC

TCC

TTG

CCT

TAC

720

Asp

Lys

Glu

Tyr

Cys

Ile

Ser

Ser

Asp

Asp

Leu

Phe

Ser

Leu

Pro

Tyr

205

210

215

TGC

CCG

GGT

AAG

ACC

CTG

GTT

GTT

GGA

GCA

TCC

TAT

GTC

GCT

TTG

GAG

768

Cys

Pro

Gly

Lys

Thr

Leu

val

Val

Gly

Ala

Ser

Tyr

val

Ala

Leu

Glu

220

225

230

TGC

GCT

GGA

TTT

CTT

GCT

GGT

ATT

GGT

TTA

GAC

GTC

ACT

GTT

ATG

GTT

816

Cys

Ala

Gly

Phe

Leu

Ala

Gly

Ile

Gly

Leu

Asp

Val

Thr

Val

Met

Val

235

240

245

AGG

TCC

ATT

CTT

CTT

AGA

GGA

TTT

GAC

CAG

GAC

ATG

GCC

AAC

AAA

ATT

864

Arg

Ser

Ile

Leu

Leu

Arg Gly

Phe

Asp

Gin

Asp

Met

Ala

Asn

Lys

Ile

250

255

260

265

GGT

GAA

CAC

ATG

GAA

GAA

CAT

GGC

ATC

AAG

TTT

ATA

AGA

CAG

TTC

GTA

912

Gly

Glu

His

Met

Glu

Glu

His

Gly

Ile

Lys

Phe

Ile

Arg

Gin

Phe

Val

270

275

280

CCA

ATT

AAA

GTT

GAA

CAA

ATT

GAA

GCA

GGG

ACA

CCA

GGC

CGA

CTC

AGA

960

Pro

Ile

Lys

Val

Glu

Gin

Ile

Glu

Ala

Gly

Thr

Pro

Gly

Arg

Leu

Arg

285

290

295

GTA

GTA

GCT

CAG

TCC

ACC

AAT

AGT

GAG

GAA

ATC

ATT

GAA

GGA

GAA

TAT

1008

Val

Val

Ala

Gin

Ser

Thr

Asn

Ser

Glu

Glu

Ile

Ile

Glu

Gly

G1U

Tyr

300

305

310

AAT

ACG

GTG

ATG

CTG

GCA

ATA

GGA

AGA

GAT

GCT

TGC

ACA

AGA

AAA

ATT.

1056

Asn

Thr

Val

Met

Leu

Ala

Ile

Gly

Arg

Asp

Ala

Cys

Thr

Arg

Lys

Ile

315

320

325

GGC

TTA

GAA

ACC

GTA

GGG

GTG

AAG

ATA

AAT

GAA

AAG

ACT

GGA

AAA

ATA

1104

Gly

Leu

Glu

Thr

Val

Gly

Val

Lys

Ile

Asn

Glu

Lys

Thr

Gly

Lys

Ile

330

335

340

345

-34CZ 293745 B6

CCT GTC ACA .GAT

GAA GAA CAG ACC AAT GTG CCT TAC ATC TAT GCC ATT 1152

Pro

Val

Thr Asp

Glu 350

Glu

Gin

Thr

Asn Val Pro Tyr Ile Tyr Ala Ile

35S

360

GGC

GAT

ATA

TTG

GAG

GAT

AAG

GTG

GAG

CTC

ACC

CCA

GTT

GCA

ATC

CAG

1200

Gly Asp

Ile

Leu

Glu

Asp

Lys

Val

Glu

Leu

Thr

Pro

Val

Ala

Ile

Gin

365

370

375

GCA

GGA

AGA

TTG

CTG

GCT

CAG

AGG

CTC

TAT

GCA

GGT

TCC

ACT

GTC

AAG

1248

Ala

Gly

Arg

Leu

Leu

Ala

Gin

Arg

Leu

Tyr

Ala

Gly

Ser

Thr

Val

Lys

380

385

390

TGT

GAC

TAT

GAA

AAT

GTT

CCA

ACC

ACT

GTA

TTT

ACT

CCT

TTG

GAA

TAT

1296

cys

Asp

Tyr

Glu

Asn

Val

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Thr

Pro

Leu

Glu

Tyr

39S

400

405

GGT

GCT

TGT

GGC

CTT

TCT

GAG

GAG

AAA

GCT

GTG

GAG

AAG

TTT

GGG

GAA

1344

Gly

Ala

Cys

Gly

Leu

Ser

Glu

Glu

Lys

Ala

Val

Glu

Lys

Phe

Gly

Glu

410

415

420

425

GAA

AAT

ATT

GAG

GTT

TAC

CAT

AGT

TAC

TTT

TGG

CCA

TTG

GAA

TGG

ACG

1392

Glu

Asn

Ile

Glu

Val

Tyr

His

Ser

Tyr

Phe

Trp

Pro

Leu

Glu

Trp

Thr

430

435

440

ATT

CCG

TCA

AGA

GAT

AAC

AAC

AAA

TGT

TAT

GCA

AAA

ATA

ATC

TGT

AAT

1440

Ile

Pro

Ser

Arg

Asp

Asn

Asn

Lys

Cys

Tyr

Ala

Lys

Ile

Ile

Cys

Asn

445

450

455

ACT

AAA

GAC

AAT

GAA

CGT

GTT

GTG

GGC

TTT

CAC

GTA

CTG

GGT

CCA

AAT

1488

Thr

Lys

Asp

Asn

Glu

Arg

Val

Val

Gly

Phe

His

Val

Leu

Gly

Pro

Asn

460

465

470

GCT

GGA

GAA

GTT

ACA

CAA

GGC

TTT

GCA

GCT

GCG

CTC

AAA

TGT

GGA

CTG

1536

Ala

Gly

G1U

Val

Thr

Gin

Gly

Phe

Ala

Ala

Ala

Leu

Lys

Cys

Gly

Leu

475

480

485

ACC

AAA

AAG

CAG

CTG

GAC

AGC

ACA

ATT

GGA

ATC

CAC

CCT

GTC

TGT

GCA

1584

Thr

Lys

Lys

Gin

Leu

Asp

Ser

Thr

Ile

Gly

Ile

His

Pro

Val

Cys

Ala

490

495

500

505

-35CZ 293745 B6

GAG Glu

GTA TTC ACA ACA

TTG TCT Leu Ser

GTG ACC AAG CGC TCT GGG GCA AGC ATC 1632

Val

Phe

Thr

Thr 510

Val

Thr

Lys Arg Ser Gly Ala Ser Ile

515

520

CTC

CAG

GCT

GGC

TGC

TGA

1650

Leu

Gin

Ala

Gly

Cys

525

Sekvenční č. ID:	12
5 Délka sekvence:	526
Typ sekvence:	aminokyseliny
Počet řetězců:	jednořetezcové
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	peptid
10 Popis sekvence:

Met

Ser

Cys

Glu

Asp

Gly

Arg

Ala

Leu

Glu

Gly

Thr

Leu

Ser

Glu

Leu

-23

-20

-15

-10

Ala

Ala

Glu

Thr

Asp

Leu

Pro

Val

Val

Phe

Val

Lys

Gin

Arg

Lys

Ile

-5

1

5

Gly

Gly

His

Gly

Pro

Thr

Leu

Lys

Ala

Tyr

Gin

Glu

Gly

Arg

Leu

Gin

10

15

20

Σ5

Lys

Leu

Leu

Lys

Met

Asn

Glý

Pro

Glu

Asp

Leu

Pro

Lys

Ser

Tyr

Asp

30

35

40

Tyr

Asp

Leu

Ile

Ile

Ile

Gly

Gly

Gly

Ser

Gly Gly

Leu

Ala

Ala

Ala

45

50

55

Lys

Glu

Ala

Ala

Gin

Tyr Gly

Lys

Lys

Val

Met

Val

Leu

Asp

Phe

Val

60

65

70

Thr

Pro

Thr

Pro

Leu

Gly

Thr

Arg

Trp

Gly

Leu

Gly

Gly

Thr

Cys

Val

75

80

85

Asn

Val

Gly

Cys

Ile

Pro

Lys

Lys

Leu

Met

His

Gin

Ala

Ala

Leu

Leu

90

95

100

105

Gly

Gin

Ala

Leu

Gin

Asp

Ser

Arg

Asn

Tyr Gly

Trp

Lys

val

Glu

Glu

110

115

120

Thr

Val

Lys

His

Asp

Trp

Asp

Arg

Met

Ile

Glu

Ala

Val

Gin

Asn

His

125

130

135

Ile

Gly

Ser

Leu

Asn

Trp

Gly

Tyr

Arg

Val

Ala

Leu

Arg

Glu

Lys

Lys

140

145

150

Val

Val

Tyr

Glu

Asn

Ala

Tyr Gly

Gin

Phe

Ile

Gly

Pro

His

Arg

Ile

155

160

165

-36CZ 293745 B6

Lys

Ala

Thr

Asn

Asn

Lys

Gly

Lys

Glu

Lys

Ile

Tyr

Ser

Ala

Glu

Arg

170

175

180

185

Phe

Leu

Ile

Ala

Thr

Gly

Glu

Arg

Pro

Arg

Tyr

Leu

Gly

Ile

Pro

Gly

190

195

200

Asp

Lys

Glu

Tyr

Cys

ile

Ser

Ser

Asp

Asp

Leu

Phe

Ser

Leu

Pro

Tyr

205

210

215

Cys

Pro

Gly

Lys

Thr

Leu

Val

Val

Gly

Ala

Ser

Tyr

val

Ala

Leu

Glu

220

225

230

Cys

Ala Gly Phe Leu Ala Gly

Ile Gly Leu Asp Val Thr Val Met Val 245

235

240

Arg

Ser

Ile

Leu

Leu

Arg

Gly

Phe

Asp

Gin

Asp

Met

Ala

Asn

Lys

Ile

250

255

260

265

Gly

Glu

His

Met

Glu

Glu

His

Gly

Ile

Lys

Phe

Ile

Arg

Gin

Phe

Val

270

275

280

Pro

Ile

Lys

Val

Glu

Gin

Ile

Glu

Ala

Gly

Thr

Pro

Gly

Arg

Leu

Arg

285

290

295

Val

Val

Ala

Gin

Ser

Thr

Asn

Ser

Glu

Glu

Ile

Ile

Glu

Gly

Glu

Tyr

300

305

310

Asn

Thr

Val

Met

Leu

Ala

ile

Gly

Arg

Asp

Ala

Cys

Thr

Arg

Lys

Ile

315

320

325

Gly

Leu

Glu

Thr

Val

Gly

Val

Lys

Ile

Asn

Glu

Lys

Thr

Gly

Lys

Ile

330

335

340

345

Pro

val

Thr

Asp

Glu

Glu

Gin

Thr

Asn

Val

Pro

Tyr

Ile

Tyr

Ala

11=

350

355

360

Gly

Asp

Ile

Leu

Glu

Asp

Lys

val

Glu

Leu

Thr

Pro

Val

Ala

Σ ΐ ®

365

370

375

Ala

Gly Arg

Leu

Leu

Ala

Gin

Arg

Leu

Tyr

Ala

Gly

Ser

Thr

Val

Lys

380

385

390

Cys

Asp

Tyr

Glu

Asn

Val

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Thr

Pro

Leu

Glu

Tyr

395

400

405

Gly

Ala

Cys

Gly

Leu

Ser

Glu

Glu

Lys

Ala

Val

Glu

Lys

Phe

Gly

Glu

410

415

420

425

Glu

Asn

Ile

Glu

Val

Tyr

His

Ser

Tyr

Phe

Trp

Pro

Leu

Glu

Trp

Thr

430

435

440

Ile

Pro

Ser

Arg

Asp

Asn

Asn

Lys

Cys

Tyr

Ala

Lys

Ile

Ile

Cys

Asn

445

450

455

Thr

Lys

Asp

Asn

Glu

Arg

Val

val

Gly

Phe

His

val

Leu

Gly

Pro

Asn

460

465

470

Ala

Gly

Glu

Val

Thr

Gin

Gly

Phe

Ala

Ala

Ala

Leu

Lys

Cys

Gly

Leu

475

480

485

-37CZ 293745 B6

Thr

Lys

Lys

Gin.

Leu

Asp

Ser

Thr

Ile

Gly

Ile His Pro Val

Cys

Ala

490

495

500

505

Glu

Val

Phe

Thr

Thr

Leu

Ser

Val

Thr

Lys

Arg Ser Gly Ala

Ser

Ile

510

515

520

Leu

Gin

Ala

Gly

Cys

525

Sekvenční č.ID:

Délka sekvence:

Typ sekvence:

Počet řetězců:

Topologie:

Typ molekuly:

Popis sekvence:

TAAATAAATA AATAA nukleová kyselina dvouřetězcová lineární další typy DNA, syntetická DNA

Sekvenční č. ID:	14
Délka sekvence:	66
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Počet řetězců:	dvouřetězcová
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	další typ DNA, syntetická DNA

Popis sekvence:

CTAGCGCTCT GGGGCAAGCA TCCTCCAGGC

TGGCTGCCAC CACCACCACC ACCACTGATC TAGACT 66

Sekvenční č.ID:

Délka sekvence:

Typ sekvence:

Topologie:

Typ molekuly:

Popis sekvence:

GGTCAGCACA AATTTCCA

Sekvenční č.ID:

Délka sekvence:

Typ sekvence:

Topologie:

Typ molekuly:

Popis sekvence:

AAACACAACT TGGAATGAAC nukleová kyselina lineární další typ DNA, syntetická DNA nukleová kyselina lineární další typ DNA, syntetická DNA

Sekvenční č. ID:

Délka sekvence:

Typ sekvence:

Topologie:

Typ molekuly:

Popis sekvence:

TCATTCCAAG TTGTGTTTGT GAAA nukleová kyselina lineární další typ DNA, syntetická DNA

Sekvenční č.ID:

Délka sekvence:

-38CZ 293745 B6

Typ sekvence:

Topologie:

Typ molekuly:

Popis sekvence:

CATAGGATGC TCCAACAA nukleová kyselina lineární další typ DNA, syntetická DNA

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polynukleotidová sekvence kódující polypeptid, který obsahuje sekvenci aminokyselin od čísla 1 do čísla 526 sekvence č. ID: 12 nebo která kóduje mutaci či variantu řečeného polypeptidu s předpokladem, že polypeptid, kódovaný touto polynukleotidovou sekvencí je schopen redukovat dichloroindofenol a oxidovaný glutathion.
2. 2. Polynukleotidová sekvence podle nároku 1, která má 55% nebo vyšší sekvenční homologii se sekvencí aminokyselin č. 1 až 526 sekvence č. ID: 12.
3. 3. Polynukleotidová sekvence podle nároku 1, která sdílí více než 70% sekvenční homologii se sekvencí aminokyselin č. 1 až 526 sekvence č. ID: 12.
4. 4. Polynukleotidová sekvence podle nároku 1, která sdílí více než 80% sekvenční homologii se sekvencí aminokyselin č. 1 až 526 sekvence č. ID: 12.
5. 5. Polynukleotidová sekvence podle kteréhokoli z nároků od 1 až do 4, jejíž kódující sekvence obsahuje nukleotidovou sekvenci 70 až 1647 vyznačenou v sekvenci č. ID: 11.
6. 6. Polynukleotidová sekvence podle nároku 1, která kóduje polypeptid mající sekvenci -23 až 526 ze sekvence č. ID: 12 nebo její mutaci či variantu.
7. 7. DNA, která hybridizuje s polynukleotidovou sekvencí podle kteréhokoli z nároků 1 až 6 za hybridizačních podmínek s použitím 6x SSC při teplotě 60 až 70 °C a ve které pozitivní kódující řetězec DNA kóduje polypeptid mající redukující účinek.
8. 8. Polypeptid, který je kódován polynukleotidovou sekvencí podle kteréhokoli nároku 1 až 7.
9. 9. Polypeptid podle nároku 8, který je určen pro využití v profylaxi nebo léčbě stavů způsobených nebo souvisejících s oxidativním stresem nebo s kterýmkoliv onemocněním způsobeným aktivovaným kyslíkem.
10. 10. Polypeptid podle nároku 8 určený pro využití v profylaxi nebo léčbě arteriosklerózy, diabetů nebo ischemických poruch.
11. 11. Polypeptid podle nároku 8, který je určen pro využití v profylaxi nebo léčbě arteriosklerózy, diabetů, ischemických poruch, edemů, vaskulámí hypermeability, zánětů, poruch žaludeční sliznice, akutní pankreatitidy, Crohnovy nemoci, vředové kolitidy, poruch jater, Paraquatovy nemoci, rozedmy plic, chemokarcinogeneze, karcinogenních metastáz, syndromu nedostatečnosti dýchacího ústrojí u dospělých, disseminované intravaskulámí koagulace (DIC), šedého zákalu, předčasné retinopatie, autoimunitních onemocnění, porfyrémie, hemolytického onemocnění, středomořské anemie, Parkinsonovy nemoci, Alzheimerovy nemoci, epilepsie, poruch z ultrafialového záření, poruch z ozáření, omrzlin a popálenin.

    -39CZ 293745 B6
12. 12. Použití polypeptidu podle nároku 8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu nebo profylaxi kteréhokoli stavu specifikovaného v některém z nároků 10 až 12.
13. 13. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje farmakologicky účinné množství peptidu podle nároku 8 spolu s farmakologicky přijatelným nosičem tohoto peptidu.
14. 14. Vektor, který obsahuje polynukleotidovou sekvenci podle kteréhokoli z nároků 1 až 7.
15. 15. Vektor podle nároku 14, který je expresivní vektor,
16. 16. Hostitel, transformovaný vektorem podle kteréhokoli z nároku 14 nebo 15 s výjimkou lidských buněk.
17. 17. Expresivní systém v němž je hostitel s výjimkou lidských buněk transformovaný vektorem podle nároku 15.
18. 18. Expresivní systém podle nároku 17 v němž je hostitelem E. coli.
19. 19. Protilátka nebo její ekvivalent specificky rozpoznávající polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí podle nároku 1 nebo specificky rozpoznávající mutaci či variantu tohoto proteinu.
20. 20. Protilátka podle nároku 19, která je monoklonální protilátkou.
21. 21. Protilátka podle nároku 19 nebo 20, která antigenně napodobuje lidskou protilátku.
22. 22. Anti-idiotypová protilátka, která rozpoznává rozpoznávací místo protilátky podle kteréhokoli z nároků 19 až 21.
23. 23. Protilátka, která je produkována hybridomem označeným MKM150-2 a uloženým pod evidenčním číslem FERM BP-5086.
24. 24. Použití protilátky podle kteréhokoli z nároků 19 až 23, pro izolaci a purifikaci proteinu kódovaného polynukleotidovou sekvencí podle nároku 1.
25. 25. Hybridom, který v kultuře exprimuje protilátky podle kteréhokoli z nároků 19 až 22.
26. 26. Hybridom označený MKM 150-2 a uložený pod evidenčním číslem FERM BP-5086.