HUT72922A - Expression system using autolysable fusion protein and new reducing polypeptides - Google Patents
Expression system using autolysable fusion protein and new reducing polypeptides Download PDFInfo
- Publication number
- HUT72922A HUT72922A HU9502114A HU9502114A HUT72922A HU T72922 A HUT72922 A HU T72922A HU 9502114 A HU9502114 A HU 9502114A HU 9502114 A HU9502114 A HU 9502114A HU T72922 A HUT72922 A HU T72922A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- sequence
- polypeptide
- protein
- amino acid
- dna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/12—Antidiuretics, e.g. drugs for diabetes insipidus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5431—IL-11
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
- C12N9/506—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses derived from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
szerekáltaltermett polipeptidek,-a—polipeptidek^lkahnazása gyógyászatikészítmények előállítására és oxid a tív stressz okozta rendellenes*· ségek kezelésére, a polipeptideket felismerő ellenanyagok, az ellenanyagokat termelő hibridómasejtek és eljárások a polipeptidek tisztítására enanyagokalkalmazásával
KIVONAT
A találmány tárgyát exogén polipeptidek expresszálására alkalmas expressziós rendszerek képezik, melyekben az exogén polipeptidet a lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-fehérjéjével (NIa) képezett fúziós proteinként expresszáltatják, és az expressziós rendszerekben az Nlakomponens proteázaktivitásának hatására a keletkezett fúziós protein autolízist szenved.
A találmány szerinti expressziós rendszereket alkalmazni lehet a találmány szerinti KM31-7-jelü fehérje expresszálására, amely fehérje képes diklór-indofenolt és oxidált glutationt redukálni. Ez a találmány szerinti polipeptid alkalmas oxidatív stressz által kiváltott rendellenességek kezelésére.
? ír 0 4 KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY
Képviselő:
DANUBIA SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA Kft.
Autolizáló fúziós proteineket, valamint egy redukáló polipeptidet kódoló polinukleotid-szekvenciák, a szekvenciákat hordozó vektorok és gazdasejtek, ezeket hasznosító expressziós rendszerek, az expressziós rendszerek által termelt polipeptidek, a polipeptidek alkalmazása gyógyászati készítmények előállítására és oxidatív stressz okozta rendellenességek kezelésére, a polipeptideket felismerő ellenanyagok, az ellenanyagokat termelő hibridómasejtek és eljárások a polipeptidek tisztítására az ellenanyagok alkalmazásával
A találmány tárgyát exogén polipeptidek expresszálására alkalmas expressziós rendszerek képezik, melyekben az exogén polipeptidet a lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-fehérjéjével (NIa) képezett fúziós proteinként expresszáltatjuk, és az expressziós rendszerekben az Nlakomponens proteázaktivitásának hatására a keletkezett fúziós protein autolízist szenved. A találmámy tárgyát képezi az alkalmazott NIa-proteáz, valamint a proteázt és a proteázt tartalmazó fúziós proteineket kódoló polinukleotid-szekvenciák is.
A találmány szerinti expressziós rendszereket alkalmazni lehet a találmány tárgyát képező KM31-7-jelű fehérje expresszálására is, amely fehérje képes diklór-indofenolt és oxidált glutationt redukálni.
A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti KM31-7-polipeptidet kódoló polinukleotid-szekvenciák, továbbá az ilyen DNS-t hordozó vektoAktaszámunk: 82233-3096A/PÁ
-2rok, az ilyen vektorokkal transzformált gazdasejtek, valamint a találmány szerinti polipeptid alkalmazása gyógyászati készítmények előállítására és oxidativ stressz okozta rendellenességek kezelésére.
A találmány tárgyát képezik továbbá az említett polipeptid ellen termeltetett monoklonális ellenanyagok, az ellenanyagokat termelő hibridómasejtek, valamint a polipeptid izolálását és tisztítását célzó eljárások az említett ellenanyagok alkalmazásával.
A Poty-vírusok olyan vírusok, melyek egyszálú RNS-genommal rendelkeznek, amely kb. 10.000 bázis hosszúságú, és növényeket fertőznek meg, mint például a Solanaceae-k családját. A Poty-vírusok genomjára jellemző, hogy egy rendkívül hosszú, nyílt leolvasási fázist (open reading fame, ORF) tartalmaznak [Dougherty, W.G. és Hiebert, E.: Virology 101, 466 (1980); Allison, R. és mtsai.: Virology 154, 9 (1986)]. Annak érdekében, hogy a hosszú ORF által kódolt különböző fehérjék kifejeződhessenek, a transzláció lezajlása után a keletkezett poliproteint két különböző típusú proteáz emészti meg, melyeket szintén a hosszú ORF kódol [Dougherty, W.G. és Carrington, J.C.: Ann. Rév. Phytopath 26. 23 (1988)].
A dohánykarcoló vírus (“tobacco etch virus”, TEV) a Poty-vírus családhoz tartozik, és ez a vírus a gazdanövény sejtmagjaiban zárványok képződését idézi elő, melyek a fertőzött sejtekben trypan-kék festéssel láthatóvá tehetők. A sejtmagban található zárványok láthatólag két típusú fehérjéből állnak, melyek egyikéről igazolták, hogy egy virális proteáz, melyet asejtmagzárvány-fehérjének (Nuclear Inclusion a, NIa) neveztek el [J. Virol.: 61, 2540 (1987)].
-3A Poty-vírusok a-sejtmagzárvány-proteázai olyan peptid szekvenciát ismernek fel és hasítanak, amely tartalmaz a Gln-Gly, Gin-Ser és Gln-Ala aminosavpárok közül egyet és feltételezik, hogy a felismerő szekvencia hexamer-típusú és a poliproteinben a megfelelő NIa-fehérje C-terminális végénél található. A hasítás a fent említett aminosavpároknak megfelelő valamelyik két aminosav között történik.
A TEV és a dohány erezetének pettyesedését okozó vírus (“tobacco vein mottling vírus”, TVMV) teljes genomi szekvenciáját meghatározták (a TVMV is a Poty-vírus család tagja), és számítógépes homológiakereséssel azonosították ezen vírusok genomjában az NIa-géneket [Virology, 154. 9 (1986); Nucleic Acid Rés. 14, 5417 (1986)]. A lóhere sárga erezettségét okozó vírus (“clover yellow vein vírus”, CYVV) szintén Poty-vírus. Mindeddig csak a CYVV-genom 3'-végénél található gént valamint az általa kódolt burokfehérjét szekvenálták meg [Uyeda, I. és mtsai.: Intervirol 32, 234 (1991)]. A vírus genomjának NIa-régióját mindeddig nem azonosították és a megfelelő NIa-fehérjét sem izolálták.
Exogén fehérjék termeltetése különböző expressziós rendszerekben, a szakember számára ismert technikák alkalmazásával ma már rutinfeladat. Mindazáltal van sok olyan polipeptid, melyet nem lehet könnyen expresszáltatni exogén rendszerben. A nehézség többek között az lehet, hogy a polipeptidet nem lehet nagy mennyiségben termeltetni és ez a probléma nem oldható meg egyszerűen úgy, hogy a géntől 5'-irányban egy másik regulátorgént helyezünk el. Más esetekben az is előfordulhat, hogy a termeltetett fehérje érett formájának kialakulásához szükséges poszttranszkripciós ι
• · ·
-4események nem történnek meg, vagy nem megfelelő módon történnek meg az adott expressziós rendszerben.
Sok eukarióta polipeptid transzlálódik például oly módon, hogy kezdetben tartalmaz egy N-terminális metionin aminosavat, amely azután lehasad és így alakul ki az érett forma. Ez a processziós esemény nem játszódhat le prokariótákban, éppen ezért szükség volt olyan expressziós rendszerek kifejlesztésére, melyek ennek a problémának a megoldását lehetővé teszik. Az egyik ilyen megoldás azon alapul, hogy a kívánt exogén proteint, például a maltózkötő fehérjével vagy a glutation-S-transzferázzal fúzionáltatjuk, az expresszált fúziós proteint tisztítjuk, majd a tisztított fúziós fehérjét valamely proteázzal elhasítjuk, például a Xa-faktorral, enterokinázzal vagy trombinnal. Ennek a munkaigényes eljárásnak az a fő hátránya, hogy végrehajtása során két tisztítási lépés is szükséges, ami a végtermék mennyiségének jelentős csökkenéséhez vezet.
Az 5,162,601 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás feltáija egy TEV-proteáz alkalmazását egy olyan poliprotein előállítása során, mely az expresszáltatni kívánt proteinek (például humán tPA) között linker szekvenciákat tartalmaz. Mindazáltal ez a szabadalmi leírás kizárólag a poliproteint kódoló multigén gazdasejtbe klónozásáról tartalmaz kitanítást. Nem található a leírásban feltárás a proteolítikusan hasított végtermék expresszálásáról vagy tisztításáról.
A metabolikus folyamatokhoz szükséges oxigén általában a cellurális környezetben található oxidáló ágensektől származik. Az anyagcsere folyamatokban az oxigén aktivált formában kerül felhasználásra, általában szabad gyök formájában, mint szuperoxid (O2), peroxid (H2O2) vagy hidroxigyök t
-5(OH') formájában, melyek mindegyike felhasználás után vízzé (H2O) redukálódik. Maga az oxigéngáz is nagymértékben oxidáló tulajdonságú, de a leírás vonatkozásában az aktivált oxigén kifejezést olyan értelemben használjuk, hogy az olyan oxigénre és oxigéntartalmú molekulákra vonatkozik, melyek oxidáló kapacitása az atmoszférikus oxigéngázénál nagyobb. Az aktivált oxigén leghatásosabb formája a szabad gyök, amely olyan molekula vagy atom, amelyben egy vagy több páratlan elektron található.
A szabad gyökök általában instabilak és ha felhasználásuk nem megfelelően szabályozott denaturálhatják a lipideket, proteineket és nukleinsavakat. Ebből következik, hogy bár az aktivált oxigén esszenciális az élet szempontjából, mégis potenciális egészségkárosító hatású és felhasználásának pontosan szabályozott körülmények között kell végbemenni. Az aktivált oxigén nagy reaktivitásának köszönhetően még elenyészően kis mennyiségekben is rendellenességeket idézhet elő. Mindebből az következik, hogy csak azok a szervezetek életképesek, melyek rendelkeznek az aktivált oxigénnel szemben valamilyen védekezőmechanizmussal.
A cellurális környezetben az aktivált oxigén termelődésének helye, mennyisége és ideje kifinomult egyensúlyi helyzetben kell, hogy legyen a sejt azon képességével, mellyel az aktivált oxigén felhasználásával járó veszélyt semlegesíteni képes. A sejtnek ez a képessége általában valamely védekező mechanizmusból származik, amely saját antioxidánsokat vagy antioxidációs enzimeket használ. A jelen leírás vonatkozásában az antioxidáns kifejezést olyan természetben előforduló anyagokra alkalmazzuk, melyek képesek gátolni az autooxidációs folyamatokat, például a lipidek autooxidációját. Az antioxidációs enzim kifejezés olyan enzimet
-6jelöl, mely valamely aktivált oxigén eliminációjával járó reakciót katalizál. Az antioxidatív reakció kifejezés a fentiek alapján értelmezendő.
Számos abnormális körülmény jár nagy mennyiségű aktivált oxigén termelődésével, például mikor egy személy stresszhelyzetbe kerül, drogokat fogyaszt, dohányzik, sebészeti beavatkozáson megy keresztül, szervátültetésben részesül vagy cerebrális vagy miokardiális infarktus következtében isémiát szenved. Az ilyenkor keletkezett aktivált oxigén mennyisége nagyobb, mint amit a szervezet védekezőrendszere eliminálni képes, így a feleslegben maradó aktivált oxigén a szervezet további károsodását idézi elő, és súlyosan károsítja a normális sejtműködést. Az ily módon kialakuló ún. oxidatív stressz egy egész sor betegséghez vezető rendellenes állapot kialakulásáért felelős.
Példaként megemlíthetjük az arterioszklerózist, melynek esetén az aktivált oxigén által oxidált kis specifikus sűrűségű lipoproteinek megjelenését tartják a betegség kialakulása egyik okának [Steinberg, D. Arteriosclerosis 3, 283 (1983)]. Feltételezik, hogy az oxidatív stressz szintén jelentős szerepet játszik a diabétesz kialakulásával, metabolikus rendellenességeivel és vaszkuláris komplikációival kapcsolatos mechanizmusok okozója és befolyásolójaként [Szerk.: Kondo, M. Approaches from Modem Medicine (4) Free Radicals, Medical View Pub., 138-146. old.].
Az aktivált oxigénnek szerepe van egyéb patológiás állapotok és körülmények kialakulásában is, mint például: isémiás rendellenességek (reperfuziós rendellenességek, isémiás szívbetegség, cerebroisémia, isémiás enteritisz és hasonlók), ödéma, vaszkuláris hiperpermeabilitás, gyulladások, a gyomornyálkahártya rendellenességei, akut pankreatitisz, Chron-kór, fékéf
-7 lyes vastagbélgyulladás, májrendellenességek, Paraquat-kór, pulmonális emfizéma, kemokarciogenézis, karcinogén metasztázisok kialakulása, felnőttkori légzőszervi szorongásos szindróma, elszórt intravaszkuláris koaguláció (“disseminated intravascular coagulation”, DIC), hályogok, fiatalkori retinopátia, autoimmun megbetegedések, porfírémia, hemolítikus betegségek, mediterrán anémia, Parkinson-kór, Alzheimer-kór, epilepszia, ultraibolya sugárzásból fakadó rendellenességek, radioaktív sugárzásból fakadó rendellenességek, fagyászok és égések.
Mind a sejteken belül, mind pedig a sejteken kívül különböző védekező mechanizmusok léteznek, melyeknek kizárólagos célja a fiziológiásán keletkezett aktivált oxigén eliminálása.
Ismeretes, hogy intracellulárisan az alább megadottakhoz hasonló antioxidánsok és antioxidatív enzimek használják fel és elíminálják az aktivált oxigént. A kataláz például jelen van a peroxiszómákban, és ez az enzim redukálja és távolítja el a hidrogén peroxidot. A glutation peroxidáz a citoplazmában és a mitokondriumokban fordul elő és ez az enzim redukálja és detoxifikálja a hidrogén peroxidot és a lipid peroxidokat redukált glutation jelenlétében. A transzferin, a ferritin és a laktoferrin például gátolja az aktivált oxigén keletkezését azáltal, hogy stabilizálják a vasionokat a ceruloplazmin pedig a rézionok vonatkozásában lát el hasonló funkciót. Ezen felül a citoplazmában és mitokondriumokban jelenlévő szuperoxid diszmutáz katalizálja a szuperoxid ionok hidrogén peroxiddá történő redukcióját, melyet azután például a kataláz távolít el. Az elmondottakon túl a C és E vitaminok, a redukált glutation, valamint egyéb kis molekulasúlyú vegyületek szintén képesek az aktivált oxigént redukálni és eltávolítani.
i I *’ *···«»♦·· • · · · · · « • · · · ·« « • · · · « • · ♦ · · ·· «
-8Másrészt, az olyan hatóanyagok, mint például az extracelluláris szuperoxid diszmutáz az extracelluláris glutation peroxidáz és a redukált glutation jelen vannak az extracelluláris környezetben is és ezen ágensek hatásmechanizmusa hasonló a fent felsorolt intracelluláris megfelelőikéhez. Mindazáltal az intracelluláris helyzettel összehasonlítva kevesebb típusú extracelluláris antioxidáns és antioxidatív enzim ismeretes és csak kevés ágens fejt ki extracelluláris antioxidatív hatást.
A I. képletü redukált glutationnak jelentős szerepe van a redukált állapot fenntartásában mind a sejteken belül, mint pedig a sejteken kívül. A glutationt elsőként de-Rey-Pailhade fedezte fel 1888-ban és a vegyület csak később kapta a glutation elnevezést, miután Hopkins 1921-ben önálló vegyületként izolálta (I. képletü vegyület).
A glutation három aminosavból áll: glutaminsav, cisztein és glicin. Két glutation molekula tiolcsoportjai aktivált oxigén jelenlétében diszulfíthíddá oxidálódhatnak, ily módon redukálva az oxidált oxigént.
A glutation főképp a májban keletkezik és a testben való keringését a vérplazma biztosítja. A normális testben a glutation csaknem teljes mértékben redukált formában van jelen. Amennyiben a glutation oxidált formájának szintje emelkedik, a redukált forma regenerálódik a glutation reduktáz enzim hatására, amely nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADPH) jelenlétében fejti ki hatását. Ily módon a redukált glutation megvédi a sejtmembránt az oxidatív rendellenességektől és hatását oly módon fejti ki, hogy redukálja az aktivált oxigént és a szabad gyököket. Az ismertetett antioxidatív sajátsága folytán a redukált glutation védelmet nyújt a rádióaktivitás hatásai ellen is, és alkalmazható hályog elleni terápiás gyógyászati készítmény hatóanya• « · · · · t I
I ι • · · · · · « • · · · ·« « • · · · « ♦ ·· ·<* ·« «
-9gaként is. Legújabban beszámoltak arról, hogy AIDS-páciensek esetén a redukált glutation szisztémás mennyiségei csökkennek, ami arra utal, hogy a redukált glutation szerepe a szervezetben rendkívül jelentős. Abnormális körülmények között az aktivált oxigén mennyisége olyan nagy lehet, hogy lényegében a glutation teljes mennyisége oxidált állapotba kerül és ily módon az aktivált oxigént a szervezet nem tudja a szükséges sebességgel eltávolítani.
Azon hatóanyagok, amelyek mind sejten belül, mind sejten kívül képesek különböző fiziológiás hatásokat kifejteni redukáló aktivitásuk révén, egy másik példájaként megemlíthetjük a humán tioredoxint. A humán tioredoxint (melyet felnőtt T-sejtes leukémia eredetű faktorként, azaz ADFként is ismernek) olyan faktorként klónozták meg, amely képes volt felnőtt T-sejtes leukémia sejtvonalakban 2 típusú interleukin receptorokat (IL-2R) indukálni. A tioredoxin egy tiolfiiggő reduktáz, melynek aktív helyén két cisztein található és képes redukálni aktivált oxigént és szabad gyököket.
Azontúl, hogy a humán tioredoxin indukálja az IL-2-receptorokat a következő fiziológiás hatásokat fejti ki: serkenti a sejtek növekedését a 3B6jelű B-sejt sejtvonalban, amely Epstein-Barr vírussal (EBV) van fertőzve; védelmet nyújt az U937-jelű monocita-eredetű sejtvonalból származó tumor nekrózis faktorral (TNF) szemben; és védelmet nyújt a vaszkuláris endotélsejtek neutrofilek által kiváltott működési rendellenességeivel szemben. A humán tioredoxin, továbbá, az intracelluláris környezetben hatással van különböző transzkripciós faktorokra, mint például az NFkB, a JUN és a FOS, redukáló hatása által, ily módon fokozza az említett faktorok DNSkötő aktivitását és lehetővé teszi, hogy az említett faktorok a transzkripciós ·« ··♦· f f ··»»·» « • · · · · ·4 • · 4 44 • · 4 · · 4 4*
-10aktivitást fokozzák. A humán tioredoxint jelenleg rádióaktivitás okozta rendellenességekkel szemben protektív ágensként kívánják alkalmazni, csakúgy, mint gyógyászati készítmények hatóanyagaként reperíuziós rendellenességekre, reumás ízületi gyulladásra és egyéb gyulladásokra. A humán tioredoxin azért alkalmazható a felsorolt rendellenességek kezelésére, mivel redukáló aktivitása folytán képes védelmet nyújtani a celluláris működési rendellenességek ellen.
Amint azt a fentiekben kifejtettük, fiziológiai szempontból rendkívül fontos mind az intracelluláris, mind az extracelluláris környezet redukált állapotának fenntartása az aktivált oxigén és a szabad gyökök eltávolítása útján. Feltételezhetően létezik még számos jelenleg ismeretlen antioxidáns és antioxidatív enzim mind a sejteken belül, mind a sejteken kívül, melyeknek szintén szerepük van az aktivált oxigén és a szabad gyökök eltávolításában. Az elmondottak értelmében szintén rendkívül hasznos lenne valamely olyan redukáló hatóanyagot találni, mely képes lenne például a redukált glutationt regenerálni. Egy ilyen hatóanyag segítséget nyújthatna a szervezet fent ismertetettekhez hasonló abnormális állapotainak leküzdéséhez.
A találmány tárgyát képezik egy új proteáz, a proteázt kódoló nukleinszekvencia, a proteázt kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazó vektorok, valamint az említett vektorokkal transzformált gazdasejtek.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy kívánt fehérjét kódoló DNSszekvencia, mely DNS-szekvencia szintén kódolja a találmány szerinti új proteázt az említett kívánt fehérjétől 5'-irányban, és az említett DNSszekvencia szintén tartalmaz a két említett fehérjét kódoló szakasz között egy olyan peptidet kódoló szakaszt, mely peptid hasítható az említett ····
If ·· ·· • · » β «· ν · · ·« * • · · · • »· ·4« «
- 11 proteázzal és az említett DNS-szekvencia valamennyi említett szekvenciarészletet azonos leolvasási fázisban tartalmazza. A találmány tárgyát képezi az említett DNS-szekvencia által kódolt protein is, csakúgy, mint az említett DNS-szekvenciát tartalmazó vektorok, valamint az említett vektorokat tartalmazó expressziós rendszerek. Az említett találmány szerinti vektorok képesek a megfelelő gazdasejtekben autonóm módon replikálódni, például azáltal, hogy az autonóm replikációhoz szükséges nukleotidszekvenciákat tartalmaznak.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy in vivő redukáló aktivitással rendelkező új polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia. A találmány tárgyát képezi továbbá egy diklór-indofenol és oxidált glutation redukálására képes peptidet kódoló DNS-szekvencia.
A találmány tárgyát képezik a fent említett DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns vektorok is, mely vektorok képesek a megfelelő gazdasejtekben autonóm módon replikálódni, például azáltal, hogy tartalmaznak valamely autonóm replikációt lehetővé tevő nukleotidszekvencia-részletet.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fent említett rekombináns vektorokkal transzformált mikroorganizmus gazdasejtek is. A transzformált gazdasejtek által termelt fent említett peptid szintén a találmány tárgyát képezi, csakúgy, mint a peptid ellen termeltetett monoklonális ellenanyagok.
Azonosítottunk és megklónoztunk egy új CYVV-proteázt (NIa) és meglepő módon azt találtuk, hogy lehetséges a CYVV-NIa-proteázt olyan fúziós protein részeként alkalmazni, amely E. coliban és hasonló expresszálható és amely fúziós proteint lehetséges nagy mennyiségben termeltetni, és amely fúziós protein képes önmagát elhasítani, ily módon a ki- 12vánt exogén protein termelődését eredményezve. A CYVV-NIa-gén stabilan fenntartható és expresszálható Echerichia coliban és az expresszált NIa fehérje megtartja specifikus proteáz aktivitását, még akkor is, ha a fehérje valamely fúziós protein részét képezi.
Felfedeztünk egy új polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát is, mely polipeptid képes diklór-indofenolt redukálni [amely vegyület ismeretes még: diklórfenol-indofenol, 2,6-diklór-indofenol, és 2,6-diklór-4-[(4-hidroxifenil)imino]-2,5-ciklohexadién-l-on néven is], valamint az oxidált glutationt, amely polipeptid a megfelelő génsebészeti eljárások alkalmazása révén nagy mennyiségben előállítható. Ez a polipeptid rendkívül hasznos oxidatív stressz által okozott vagy ahhoz kapcsolódó rendellenességek kezelésében és egyéb olyan betegségek kezelésében, melyet aktivált oxigén okoz, mint például az arterioszklerózis, diabétesz és az isémiás rendellenességek (többek között: reperíúziós rendellenességek, isémiával járó szívműködészavarok, cerebroisémia és isémiás enteritisz).
Az elmondottak alapján a találmány egy megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezi egy olyan polinukleotid-szekvencia, amely 5-3'irányban, azonos nyílt leolvasási fázisban a következő összetevőket tartalmazza:
i) a lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-fehérjéjét kódoló szekvencia, vagy ennek valamely mutánsa vagy variánsa, amely a lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-fehérjéjéhez hasonló proteolítikus specifítással bír;
• · · • · · · · * · · · • · * * · « ii) egy lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-fehérjéje vagy annak említett mutánsa vagy variánsa által felismerhető és elhasítható peptidet kódoló szekvencia; és iii) egy vagy több szekvencia, amely polipeptidet kódol.
A találmány tárgyát képezi a lóhere sárga erezettségét okozó vírus asejtmagzárvány-fehérjéjét, annak mutánsát vagy variánsát kódoló szekvencia is, ahol az említett mutáns vagy variáns a lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-fehérjéjéhez hasonló proteolítikus specifitással rendelkezik.
A találmány tárgyát képezik a fenti szekvenciát tartalmazó vektorok és expressziós vektorok is. A találmány tárgyát képezik a fenti vektorokkal transzformált gazdasejtek is csakúgy, mint az említett gazdasejtet és az említett vektorokat tartalmazó expressziós rendszerek, valamint az ilyen expressziós rendszerek által termelt polipeptidek is.
A találmány tárgyát képezi továbbá a 12. szekvenciaazonosító számú aminosavszekvencia 1-526. aminosavai által meghatározott polipeptidet kódoló polinukleotid-szekvencia, valamint az olyan polinukleotid-szekvenciák, melyek az említett polipeptid mutánsait vagy variánsait kódolják, feltéve, hogy a polinukleotid-szekvencia által kódolt polipeptid képes diklórindofenolt és oxidált glutationt redukálni.
A találmány tárgyát képezik a fent definiált szekvenciákat kódoló vektorok és expressziós vektorok is. A találmány tárgyát képezik a fent definiált vektorokkal transzformált gazdasejtek is, valamint az olyan expressziós rendszerek, melyek az említett gazdasejtet és az említett
- 14• · · · · • · · · · * · · · · « • · · expressziós vektorokat tartalmazzák, valamint azok a polipeptidek is, melyek az említett expressziós rendszerek termelnek.
A találmány tárgyát képezik az említett polipeptidek terápiás alkalmazásai is, csakúgy, mint a fenti polipeptidek alkalmazása oxidatív stressz által okozott vagy ahhoz kapcsolódó állapotok kezelésére vagy profilaxisára vagy bármely aktivált oxigén által okozott betegség kezelésére. A találmány tárgyát képezik a fenti polipeptidet tartalmazó gyógyászati készítmények is. A találmány tárgyát képezik továbbá az említett polipeptidek ellen termeltetett ellenanyagok, különösen a monoklonális ellenanyagok és azok ekvivalensei. A találmány tárgyát képezi egy eljárás is, ilyen ellenanyagok előállítására, valamint egy eljárás a találmány szerinti polipeptid tisztítására a találmány szerinti ellenanyagok alkalmazásával.
A találmány szerinti megoldást tovább szemléltetik a leíráshoz csatolt ábrák, ahol:
az 1. ábrán a CYVV-cDNS-ből izolált NIa-régió cDNS-ének restrikciós térképét láthatjuk;
a 2. ábrán az NIa-gén 5'-régióját tartalmazó pKNI5'-plazmid előállításának vázlatát láthatjuk;
a 3. ábrán az EL-ll-gén egy részletét, valamint az NIa-gén 5'-régióját tartalmazó pKNI5IL-plazmid előállításának vázlatát láthatjuk;
a 4. ábrán láncindító oligonukleotidokat láthatunk, melyeket az 5'ILDNS-fragmens és a CIN3-DNS-fragmens előállításához használtunk, valamint azt a láncindítót, amelyik az NIa-gén 3'-végének és az IL-ll-gén 5'végének fúzióját tartalmazza;
- 15az 5. ábrán a CIN3-DNS-fragmens és az IL5'-DNS-ffagmens PCR-rel végrehajtott fúziójának vázlatát láthatjuk;
a 6. ábrán a pKSUN9-plazmid előállításának vázlatát láthatjuk;
a 7. ábra a pUCKM31-7-plazmid restrikciós térképe;
a 8. ábrán egy összehasonlító diagrammot láthatunk, mely a pUCKM31-7- és a pcD-31-plazmidok 3'-végeit hasonlítja össze;
a 9. ábrán a pSR-a-31-7-plazmid előállításának vázlatát láthatjuk;
a 10. ábrán egy hisztidin hexamert kódoló szekvencia pUCKM31-7plazmidba történő bejuttatásának vázlatát láthatjuk;
all. ábrán a pMAL31 -7 -plazmid előállításának vázlatát láthatjuk;
a 12. ábrán a diklórfenol-indofenol redukáló aktivitást kimutató vizsgálati eljárás vázlatát láthatjuk;
a 13. ábrán egy oxidált glutation redukáló aktivitást meghatározó kísérletről készült diagrammot láthatunk.
A továbbiakban először a találmány első megvalósítási módját fogjuk részletesen ismertetni, de az ismertetésben feltártak sok tekintetben vonatkoznak a találmány második megvalósítási módjára is, kivéve azt az esetet, amikor nyilvánvaló, hogy ez elmondottak nem vonatkozhatnak a második megvalósítási módra.
A találmány szerinti polinukleotid-szekvencia alatt általában előnyösen DNS-szekvenciát értünk, ezért a találmány szerinti polinukleotidszekvencia kifejezés általában DNS-szekvenciát jelöl. Mindazáltal ez a kifejezés adott esetben RNS-szekvenciát is jelölhet. Az RNS-szekvenciák alkalmazása nem annyira előnyös, mint a DNS-szekvenciáké, mivel az RNS- 16szekvenciák gyakorlati felhasználhatósága korlátozott. Az mRNS expresszáltatható például xenopus oocitákban vagy búzacsíra lizátum rendszerben, de egyik említett rendszer sem alkalmas a találmány szerinti fúziós protein gazdaságos, nagy mennyiségű előállítására.
A leírásban használt értelemben a peptid kifejezés vonatkozik minden olyan molekulára, amely kettő vagy több aminosavat tartalmaz peptidkötéssel összekötve. Az elmondottak értelmében ez a kifejezés vonatkozik oligopeptidekre, polipeptidekre és fehérjékre is. A fúziós fehérje kifejezés alatt minden olyan polipeptidet értünk, melyet kettő vagy több peptidszekvencia kombinálásával állítottunk elő.
A találmány szerinti szekvencia előnyösen kettősszálú formában van, és a találmány szerinti szekvenciáknak megfelelő antiszensz szekvenciák szintén a találmány tárgyát képezik. A találmány szerinti kettősszálú (ds) szekvenciák tartalmazhatnak egy vagy két ragadós véget, amely esetben az antiszensz és a szensz szálak nem feltétlenül tökéletesen felelnek meg egymásnak.
A fenti meghatározás i) pontjában definiált szekvencia által kódolt fehérje képes elhasítani az ii) pontban definiált szekvencia által kódolt peptidet, annak érdekében, hogy az iii) pontban definiált szekvencia által kódolt polipeptid/ek/ felszabadulj on/felszabaduljanak/, amennyiben a találmány szerinti szekvenciát megfelelő expressziós rendszerben expresszáltatjuk.
A találmány szerinti fúziós fehérje elhasadása bármelyik időpillanatban megtörténhet, azután, hogy a fenti i) és ii) pontokban definiált szekvenciák transzlációja megtörtént. Szakember számára világos, hogy a fenti
- 17iii) pontban definiált szekvencia transzlációjának nem kell tökéletesen végbemenni, hogy a hasítás megtörténhessen. Mindazáltal a gyakorlatban azt találtuk, hogy a találmány szerinti fúziós fehérjemolekulák egy része esetén az is lehet, hogy a molekulák nagyobbik része esetén, a transzláció a hasítás megtörténte előtt teljes mértékben végbemegy.
Amennyiben a fenti iii) pontban definiált szekvencia egynél több polipeptidet kódol, szükséges, hogy minden két kódolt polipeptid közé további hasítóhelyeket kódoló szekvenciákat építsünk be, kivéve azt az esetet, amikor az a célunk, hogy hasítatlan fúziós polipeptideket állítsunk elő.
Amennyiben a fenti iii) pontban definiált szekvencia több, mint egy polipeptidet kódol, elképzelhető, hogy a szekvenciáról csökkent mértékű transzkripció fog zajlani. A csökkent mértékű transzkripciót az okozza, hogy a találmány szerinti szekvenciáról átíródó mRNS transzkripciója megszakad, mielőtt a teljes hosszúságú mRNS átíródott volna. Ilyen esetben a 3'-véghez közelebb kódolt polipeptidek kisebb mennyiségben keletkeznek, mint az 5'vég közelében kódoltak. A csökkent mértékű transzkripció általában nem jelent problémát, csak azokban az esetekben, mikor a találmány szerinti szekvencia több és/vagy nagyon hosszú polipeptidet kódol.
A fenti iii) pontban definiált szekvencia általában előnyösen csak egy polipeptidet kódol, kivéve azokat az eseteket, mikor több olyan peptidet kívánunk előállítani, melyeket együttesen lehet alkalmazni, vagy amikor több polipeptidből álló fúziós proteint kívánunk előállítani. Az egyszerre termeltetett különböző polipeptideket ellenkező esetben külön-külön izolálni kellene, ami nagyon munkaigényes eljárás lehet és a tisztítási lépések során a végtermék mennyisége csökken.
- 18Mindazáltal azokban az esetekben, amikor a fenti iii) pontban definiált szekvencia több, mint egy polipeptidet kódol és minden két kódolt polipeptid között hasítószekvencia található, nem szükségszerű, hogy a hasítószekvenciát a CYVV-NIa-proteáz ismerje fel. A találmány szerinti megoldás szempontjából csak az szükséges, hogy a fenti i) pontban definiált szekvencia és a fenti ii) pontban definiált szekvencia 5'-végek között kódolt hasítószekvenciát az i) pontban definiált szekvencia által kódolt proteáz felismerje. Amennyiben kívánatos vagy megengedhető, hogy a találmány szerinti fúziós fehérje saját magát megeméssze, hogy így módon több különálló polipeptidet kapjunk, lehetséges, hogy valamennyi hasítószekvenciát az iii) pontban definiált szekvencia által kódolt proteáz ismerje fel. Mindazáltal a további hasítóhelyeket kódoló szekvenciákat megválaszthatjuk oly módon is, hogy azokat más enzimmel lehessen elhasítani, ilyen esetben a találmány szerinti fúziós fehérje a transzkripció megtörténte után oly módon fog elhasadni, hogy egy NIa-proteáz és egy poliprotein keletkezik. Az NIa-proteázt ezután eltávolíthatjuk és a poliproteint elhasíthatjuk például Xa-faktor vagy tripszin alkalmazásával.
A fenti ii) pontban definiált hasítható peptidet (melyet a leírásban hasítószekvenciának és hasítható pepiidnek is nevezünk) kódoló szekvencia képezheti részét akár részben, akár egészben a fenti i) és iii) pontokban definiált szekvenciáknak (azaz sorrendben az NIa-t vagy a proteázt, valamint a polipeptidet kódoló szekvenciáknak). Az elmondottak értelmében a hasítható peptid N-terminális végét magába foglalhatja a proteáz szekvenciájának C-terminális vége, és a hasítható peptid C-terminális részét magában foglalhatja a polipeptid N-terminális vége. Az ilyen esetekben nem
- 19beszélhetünk önálló hasítópeptidről, hanem a proteáz felismerőhelyét a proteáz C-terminális vége és a polipeptid N-terminális vége együttesen alakítja ki.
Az is lehetséges, hogy a hasítható peptidet csak részben tartalmazza a proteáz vagy a polipeptid. Az ilyen esetekben a hasítható peptid Nterminális végét általában a proteáz C-terminális vége foglalja magában, és a polipeptid N-terminális része vagy közvetlenül csatlakozik a hasítószekvenciához vagy egy vagy több aminosavon keresztül.
Amennyiben a hasítószekvencia és a proteáz és/vagy a hasítószekvencia és a polipeptid között egy vagy több addicionális aminosav található, az ilyen aminosavak száma és természete olyan kell, hogy legyen, hogy a proteáz működése zavartalan maradjon. A kívánt polipeptid Nterminális végén maradó felesleges aminosavak általában nem előnyösek, mivel az ilyen aminosavakat később el kell távolítani, hogy megkapjuk a polipeptid érett formáját. Amennyiben lehetséges és technikailag kivitelezhető, általában előnyös oly módon kialakítani a hasítható peptidet, hogy a fúziós protein elhasadása után a kívánt fehérje érett formáját kapjuk meg. Mindazáltal minden esetben lehetséges olyan kívánt fehérjéket előállítani, melyeket N-terminális végén a hasítás után például addicionális Gly, Ser vagy Alá aminosavak maradnak és ezeket valamely megfelelő aminopeptidáz segítségével kívánt esetben el lehet távolítani a fehérje N-terminális végéről.
Bizonyos esetekben kívánatos, hogy a polipeptid N-terminális vége és a hasítószekvencia közé egy prolint iktassunk be. Ez a megoldás lehetővé teszi, hogy például aminopeptidáz-P (3.4.11.9) alkalmazásával a polipeptid
N-terminális végéről valamennyi aminosavat eltávolítsunk egészen a
-20prolinig, de az aminopeptidáz-P-vel végzett emésztés a prolinon túl nem halad. A prolint azután eltávolíthatjuk prolin iminopeptidáz alkalmazásával és ily módon megkapjuk az érett fehérjét. Ez a megközelítési mód a találmány szerinti megoldás egyik előnyös megvalósítása.
Az i) pont szerinti szekvencia egy olyan proteázt kódol, amely képes elhasítani a találmány szerinti szekvencia által kódolt fúziós fehérjét. A találmány szerinti megoldásban ez a proteáz a lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-proteáza vagy ennek valamely olyan mutánsa vagy variánsa, mely a lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárványproteázához hasonló proteolítikus specifítással rendelkezik.
A lóhere sárga erezettségét okozó vírus NIa-proteázát a szekvencialistában 1. szekvenciaazonosító számon megadott szekvencia 101311 nukleotidja kódolják, míg a NIa-proteáz aminosavsorrendjét a szekvencialistában 2. szekvenciaazonosító számon megadott aminosavszekvencia 4-437 aminosavai között találhatjuk. Ezek a szekvenciák újak és a találmány tárgyát képezik, csakúgy, mint mutánsaik és variánsaik.
Az a-sejtmagzárvány-fehérje olyan proteolítikus aktivitással bír, mely a szubsztrát peptidben specifikusan elhidrolizálja a Gin-Alá, Gln-Gly vagy Gin-Ser aminosavak közötti peptidkötést. Ezenfelül azt találtuk, hogy az NIa-proteáz az említetteken túl a Gin-Val kötést is elhasítja. Azt találtuk, hogy a CYVV-NIa-proteáz (a leírás vonatkozásában az NIa-proteáz minden esetben a CYVV-NIa-proteázt jelenti, hacsak a kifejezést kifejezetten másképpen nem definiáljuk), a Poty-víruscsalád egyéb proteázaival ellentétben képes elhasítani a következő szekvenciát: AsnCysSerPheGlnX, ahol X je-21 lentése bármely aminosav, de különösen Gly, Alá, Val vagy Ser, és elsősorban Gly, Alá vagy Ser.
Az elmondottak alapján világos, hogy azok a peptidek, melyek tartalmazzák az AsnCysSerPheGlnX szekvenciát hasíthatok az NIa-proteázzal, különösen abban az esetben ha az említett szekvencia térben hozzáférhető az NIa-proteáz számára. Az elmondottak értelmében a találmány tárgyát képezi egy olyan polipeptidek előállítására szolgáló expressziós rendszer, amelyben az előállított polipeptid prekurzor formája tartalmazza AsnCysSerPheGlnX szekvenciát és ezt a prekurzort NIa-proteázzal hasítjuk Az ilyen expressziós rendszerben alkalmazhatók további feldolgozási lépések is, amennyiben erre szükség van, akár az NIa-hasítást megelőzően, akár azt követően, akár azzal egyidejűleg.
Bár a találmány szerinti megoldásban általában előnyösen a természetben előforduló NIa-proteázt kódoló szekvenciát alkalmazzuk (a 2. szekvenciaazonosító számon megadott szekvenciának megfelelően), a találmány tárgyát képezi az NIa-proteáz mutánsainak és variánsainak alkalmazása is.
Amint azt már említettük, a találmány szerinti megoldásban alkalmazott proteáz a természetben előforduló NIa-proteázéhoz hasonló specifítással kell, hogy rendelkezzék. Az elmondottak értelmében a találmány szerinti megoldásban alkalmazott proteáz szekvenciájának lényegében homológnak kell lennie a 2. szekvenciaazonosító számon megadott szekvencia 4-437 aminosavai között található szekvenciával, de szakember számára nyilvánvaló, hogy a szekvencián belül lényeges változtatásokat lehet végrehajtani anélkül, hogy megváltoztatnánk a proteáz felismerő szekvenciá-22ját, vagy a proteáz aktivitásának mértékét a gyakorlatban hasznosítható szint alá csökkentenénk.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy általában egy adott fehérje aktivitása elsősorban a molekula bizonyos konzervált régióinak függvénye, míg a molekulában található egyéb régiók pontos szekvenciájának az aktivitás szempontjából csekély a jelentősége és az ilyen szekvenciák lehetnek részben vagy egészen redundánsak. Az elmondottak értelmében a találmány tárgyát képezi valamennyi olyan szekvenciavariáns és -mutáns, amely megtartja a természetben előforduló NIa-proteázhoz hasonló specifítását. Az ilyen variánsokban és mutánsokban előfordulhatnak például deléciók, addíciók, inszerciók, inverziók, ismétlődések és azonos típusú helyettesítések (például helyettesíthetünk egy hidrofil aminosavat egy másik hidrofil aminosawal, de általában nem helyettesíthető valamely erősen hidrofil aminosav valamely erősen hidrofób aminosawal). A szekvenciában végrehajtott kis változtatások általában csekély mértékben befolyásolják az aktivitást, hacsak nem a molekula valamely esszenciális részén hajtottuk azt végre, és az ilyen jelentéktelen változtatások például létrejöhetnek a genetikai manipulációs munka melléktermékeként is, például abban az esetben, ha szükség van valamely új restrikciós hasítóhely kialakítására.
Általánosságban a szakember számára nyilvánvaló eseteket leszámítva nincs szükség arra, hogy az NIa-proteáz természetes szerkezetét megváltoztassuk. A proteáz aminosav vagy kódoló szekvenciájában bekövetkező legtöbb variáció vagy mutáció többnyire az eredeti vad típusú vírushoz képest újabb vírusvariációk izolálásának a következménye. Mindazáltal a szándékos vagy esetleg véletlenszerű módosítások eredményeként keletkező
-23 mutánsok és variánsok is a találmány tárgyát képezik, feltéve, hogy az ily módon létrejött proteáz rendelkezik a szükséges specifítással és proteolítikus aktivitással.
A leírás vonatkozásában a káros hatás kifejezést minden olyan eseménnyel kapcsolatban használjuk, amely a proteáz specifítását vagy aktivitását a természetben előforduló fent definiált NIa-proteázhoz képest olyan mértékben megváltoztatja, hogy a proteáz hasznos aktivitásának mértéke a gyakorlatban alkalmazható alá csökken.
A találmány szerinti proteázban végrehajthatunk különböző szubsztitúciókat, addíciókat és hasonlókat, az egyetlen korlátozást az jelenti, hogy a proteáz aktivitását nem befolyásolhatjuk károsan. Általánosságban elmondhatjuk, hogy a proteáz aktivitásának káros befolyásolása csak abban az esetben valószínű, amennyiben az NIa-proteáz háromdimenziós (tercier) szerkezetét lényegesen megváltoztatjuk.
A leírás vonatkozásában a mutáns kifejezést olyan aminosav deléciók, addíciók, inszerciók, inverziók és cserék vonatkozásában használjuk, melyek nem befolyásolják károsan az aktivitást. A találmány tárgyát képezik továbbá variánsok is, amely kifejezést azokra a természetben előforduló GYVV-NIa-fehérjékre vonatkoztatjuk, melyek szekvenciája lényegében megegyezik a 2. szekvenciaazonosító szám alatt bemutatott szekvenciával, de attól egy nagy populáción belül elvárható mértékben különbözik is. Ez a definíció magába foglalja az allélikus variációkat, valamint az egyéb tenyészetekből izolált olyan polipeptideket, melyek rokonszekvenciájúak és hasonló típusú aktivitással bírnak.
-24Az elmondottak alapján nyilvánvaló, hogy sem az NIa-fehérje sem a találmány másik megvalósítási módja szerinti fehérje szekvenciája nem szükséges, hogy tökéletesen azonos legyen a sorrendben 2. és 12. azonosítószámú szekvenciákkal. A találmány szerinti megoldás szempontjából az az egyetlen lényeges kívánalom, hogy a megfelelő polipeptid szekvencia rendelkezzen a kívánt aktivitással. Az is lehetséges, hogy az alkalmazott polipeptid a természetben található szekvenciának csak egy részlete, sőt az is lehetséges, hogy az alkalmazott polipeptid ennek a részletnek a mutánsa vagy variánsa.
Az eukarióta génekre, mint például az interferon génekre, általában jellemző a polimorfizmus [Nishi,T. és mtsai.: J. Biochem 97, 153 (1985)]. A polimorfizmus abból következik, hogy bizonyos esetekben egy vagy több aminosav felcserélődik a különböző polimorf gének által kódolt polipeptidekben, de más esetekben az is lehetséges, hogy csak a nukleotidszekvenciában következik be helyettesítés, anélkül, hogy az aminosav sorrendben változás történne.
Az elmondottak alapján világos, hogy a polinukleotidot kódoló szekvenciában is végrehajthatunk bármely kívánt változtatást, feltéve, hogy a proteázaktivitást a változtatás nem befolyásolja károsan. Végrehajthatunk például pontmutációkat vagy egyéb változásokat, annak érdekében, hogy restrikciós helyeket beiktassunk vagy kiejtsünk, a genetikai manipulációt vagy expressziót egyéb módon segítsük, vagy az expresszió mértékét fokozzuk vagy az NIa-molekulát kényelmi szempontból egyéb módon módosítsuk.
««
-25A leírás vonatkozásában a mutáns és variáns kifejezéseket a polinukleotid-szekvenciák vonatkozásában is alkalmazzuk, megfelelő módon, mutatis mutandis. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a peptidszekvenciában bekövetkező mutáció vagy variáció minden esetben megnyilvánul a kódoló nukleotidszekvenciában is, az állítás fordítottja azonban nem feltétlenül igaz. Az elmondottak értelmében lehetséges a nukleotidszekvenciát lényegesen megváltoztatni anélkül, hogy a peptidszekvenciát bármilyen mértékben megváltoztatnánk (lásd a genetikai kód degenerációjának alábbi tárgyalását). A találmány szerinti nukleotidszekvenciák említett mutánsai és variánsai szintén a találmány tárgyát képezik.
Példaként megemlítjük, hogy kimutatták, hogy amennyiben az interleukin-2 (IL-2) génben egy tisztein kódont egy szerin kódonnal helyettesítünk, a gén továbbra is alkalmas marad IL-2 aktivitással rendelkező polipeptid expresszálására [Wang, A és mtsai.: Science 224, 1431 (1984)]. Az elmondottak értelmében mindazon szekvenciák, melyek természetben előforduló vagy szintetikus NIa-aktivitással rendelkező fehérjéket kódolnak, a találmány tárgyát képezik.
A 2. azonosítószámú szekvencia alapján szakember könnyen előállíthat a találmány szerinti NIa-fehérjét kódoló gént.
Szakember számára világos, hogy a fentiek szerint származtatott kódoló szekvencia nem fog feltétlenül jól hibridizálódni vagy egyáltalán nem fog hibridizálódni egy másik olyan szekvencia komplementerével, melyet ugyanabból a peptid szekvenciából származtattak, a genetikai kód degeneráltságának következtében. Szakember ezt a tényezőt minden esetben számi-26tásba veszi és egy adott szekvencia degeneráltsága gyakran olyan nagymértékű, hogy az sok esetben rendkívül nehézzé teszi, hogy valamely természetben előforduló oligonukleotidszekvenciához akár csak egy rövid komplementer oligonukleotidot is szintetizáljunk, amely hibridizációs próbaként szolgálhatna.
A genetikai kód degenerációja olyan mértékű, hogy például a leggyakrabban előforduló aminosavaknak négy vagy több kódon is megfelelhet. Az elmondottak alapján nyilvánvaló, hogy bármely adott peptid lehetséges kódoló szekvenciáinak a száma a peptidben található aminosavak számával exponenciálisan növekszik. Az elmondottak alapján világos, hogy a találmány szerinti NIa-fehérje lehetséges kódoló szekvenciáinak a száma lehetséges, hogy csak hat vagy több számjeggyel írható le. Mindazáltal az alkalmazott expressziós rendszer vonatkozásában kívánatos lehet a szekvencia G + C tartalmát optimizálni és a megfelelő kódoló szekvencia megválasztásánál egyéb faktorokat is figyelembe vehetünk, mint például az alkalmazott expressziós rendszer kódonhasználatát, azaz hogy az adott gazdasejt genomjában egy bizonyos kódon milyen gyakorisággal fordul elő.
A fent elmondottakból következően a hibridizációs képesség nem minden esetben megbízható jelzője a szekvencia homológiának, mindazáltal azok a szekvenciák, melyek több, mint 50 %-os, előnyösen több, mint 70 %-os és előnyösebben több, mint 80 %-os homológiát mutatnak az
1. azonosítószámú szekvenciával, általában a találmány szerinti megoldás szempontjából előnyösek. A találmány szerinti nukleotidszekvenciák értelemszerűen valamely fent definiált proteázt kódolnak.
·«
-27A találmány szerinti proteázt kódoló szekvenciától 5'-irányban adott esetben szignálszekvenciát klónozunk. Ez a megoldás lehetővé teszi például, hogy a találmány szerinti fúziós fehérje a gazdasejtből kijusson és a tápfolyadékban szaporodjon fel. Az így keletkezett találmány szerinti fúziós fehérjét ezután önemésztésnek tesszük ki, majd a keletkezett polipeptidet kinyerjük. Szignálszekvenciaként bármilyen alkalmas szekvenciát használhatunk, különösen azokat, melyeket specifikusan bizonyos expressziós rendszerekhez fejlesztettek ki.
A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti szekvenciát hordozó vektorok is. A találmány szerinti megoldás megvalósításában alkalmazható vektorok sajátságai a találmány szerinti megoldás szempontjából nem döntő fontosságúak. Általánosságban elmondhatjuk, hogy szakember számára a megfelelő vektorok expressziós vektorok és vektorkonstrukciók hozzáférhetők és a felhasználó attól függően fogja megválasztani az alkalmas vektort, hogy pontosan mi a szándéka a találmány szerinti szekvenciával, például klónozás vagy expresszió.
Alkalmas expressziós vektorokat előállíthatunk fágokból vagy plazmidokból kiindulva, mely vektorok általában gazdaspecifikusak lesznek, bár sok esetben mód van a vektorok olyan manipulálására, hogy azok egyéb gazdaszervezetekben is szaporodni tudjanak. A találmány szerinti megoldásban alkalmazhatók vektorként kozmidok és retrovírusok is, valamint bármely olyan klónozó eszköz, amely specifikus vagy nem specifikus egy adott expressziós rendszerre. Szakember számára közismertek a megfelelő szabályozó szekvenciák, mint például fölismerő szekvenciák, promóterek, operátorok, indukáló szekvenciák, terminátorok és egyéb olyan szekvencit «···
-28ák, melyek esszenciálisak és/vagy alkalmasak a génexpresszió szabályozása szempontjából. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott szabályozó szekvenciák származhatnak a CYVV-vírusból vagy az alkalmazott vektorból, de származhatnak bármely más alkalmas forrásból is. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott vektorokat bármilyen alkalmas módon és eljárással módosíthatjuk. A 2. azonosító számú szekvencia elegendő hosszúságú ahhoz, hogy a teljes NIa-fehérjét kódolja. A bemutatott szekvenciához terminátorokat, promótereket vagy egyéb alkalmas szabályozó szekvenciákat kapcsolhatunk kívánság szerint, például abból a célból, hogy megkönynyítsük a szekvencia ligálását egy megfelelő vektorba vagy megkönnyítsük az expressziót vagy mindkét célból.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti NIafehérjét kódoló DNS-fragmens a hasító szekvenciát és a polipeptidet (polipeptideket) kódoló szekvenciákkal együtt könnyen beépíthető bármely megfelelő vektorba. Ideális esetben a befogadó vektorban megfelelő hasítóhelyek találhatók a beépítés megkönnyítésére, de például tompavég ligálást is alkalmazhatunk, bár ez a módszer a nyílt leolvasási fázis vonatkozásában és a beépülés irányát tekintve bizonytalanságokhoz vezet. Amenynyiben tompavég ligálást alkalmazunk, ki kell dolgozni valamely megfelelő vizsgálati eljárást, hogy megállapíthassuk, hogy a gazdasejtek közül melyek vannak transzformálva olyan vektorral, amelybe a kívánt fragmens helyes irányban, a megfelelő ORF-be van beépülve. Annak biztosítása érdekében, hogy a kívánt fragmensek a megfelelő ORF-be épüljenek be, kívánatos lehet, hogy először létrehozzunk egy olyan konstrukciót, amely tartalmazza mind a fenti i), ii) és iii) pontokban definiált szekvenciákat, majd ezt a konst« ·
-29rukciók egy lépésben építjük be a vektorba, és ily módon csökkenthetjük a kialakítandó expressziós vektor szerkezetén belüli bizonytalanságokat. A kialakított megfelelő szerkezetű vektorokat az alkalmazott expressziós rendszerre jellemző, szakember számára ismert szelekciós eljárásokkal szelektálhatjuk.
Amennyiben például E. colit transzformálunk a kialakított expressziós vektorra, a transzformánsokat szelektálhatjuk például ampicillinnel vagy más megfelelő eljárással, és a táptalajhoz adhatunk például triptofánt vagy más megfelelő promóter indukáló szert (mint például az indol-akrilsavat) és ily módon expresszálhatjuk a kívánt fúziós fehérjét. Az expresszió mértékét SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis (SDS-PAGE) alkalmazásával vizsgálhatjuk [Laemmli és mtsai.: Natúré 227.680 (1970)].
Szakember számára az is kézenfekvő, hogy amennyiben például valamely más vektort alkalmazunk, bármely megfelelő szelekciós marker vagy markerek alkalmazása elfogadható, vagy alkalmazhatunk valamilyen más szelekciós eljárást is, és/vagy alkalmazhatunk bármely alkalmas promótert, amely valamilyen szempontból kívánatos vagy kényelmes.
A gazdasejtek tenyésztése után amennyiben a fúziós fehérjét a gazdasejtek belsejéből kívánjuk kinyerni a transzformánsokat megfelelő eljárással összegyűjtjük, a sejteket feltárjuk - például ultrahangos kezeléssel -, és a lizátumot lecentrifugáljuk. A sejtek feltárását végezhetjük például olyan technikák segítségével is, mint az enzimes emésztés, például celluláz alkalmazásával, vagy rázathatjuk a sejteket például feltárás céljából üveggyöngyökkel vagy hasonlókkal, de általában az ultrahangos kezelésen alapuló és hasonló módszerek az előnyösek, mert ezekben nincs szükség külön ható·· ·
-30anyag hozzáadására. A sejtek feltárása és a centrifugálás után kapott felülúszót vizsgálhatjuk például polipeptid aktivitás vonatkozásában, és a hasítási termékeket azonosíthatjuk például SDS-PAGE-eljárás alkalmazásával.
Az expressziós termékeket hagyományos fehérjetisztítási eljárásokkal nyerhetjük ki.
A találmány szerinti DNS-szekvenciákat előállíthatjuk például a lóhere sárga erezettségét okozó vírus RNS-genomjának izolálásából kiindulva [Uyeda, I. és mtsai.: Ann. Phytopath. Soc. Japán 41, 92 (1975)]. A CYVV beszerezhető például az American Type Culture Collection törzsgyűjteményből, a PV 123. nyilvántartási számon. A lóhere sárga erezettségét okozó vírust minden esetre azonosíthatjuk azon az alapon, hogy Vicia faba-bw. nekrózist okoz.
A genomi RNS-t fertőzött növényekből izolált CYVV-részecskékből nyerhetjük ki, majd az RNS-t felhasználva reverz transzkripció útján kettősszálú cDNS-t állíthatunk elő, szakember számára ismert eljárások alapján.
Annak eldöntésére, hogy egy vírus a CYVV mutánsa vagy variánsa-e, alkalmas módszer a szekvenciahomológia vizsgálata. A Poty-vírusok sok típusa ismeretes, és ezek patogenitás vonatkozásában egymástól különbözőek. Azt, hogy egy adott vírus a családnak egy különálló tagja-e a vírus burokfehérjéjének szerológiai vizsgálatával, valamint az aminosav-sorrendben megmutatkozó homológja alapján dönthetjük el. Az elmondottak értelmében azokat a vírusokat, melyek egymással aminosav-sorrend vonatkozásában 90 %-ban homológok, azonos törzshöz tartozónak tekintjük, míg azokat a vírusokat, melyek egymással 70 %-nál kisebb mértékben homológok aminosav-sorrendjük vonatkozásában, a család egymástól különböző tagjainak
'« ·
-31 tekintjük [Shukla, D.D. és Ward, C.W.: Arch. Virol. 106, 171 (1989)]. Burokfehérjéjének különböző sajátságait alapul véve a találmány szerinti megoldásban alkalmazott CYVV a Poty-víruscsalád önálló tagjának tekintendő [Uyeda, I. és mtsai.: Intervirol. 32, 234 (1991)]. Az elmondottak értelmében valamennyi olyan vírust, melynek burokfehérjéjének aminosav-sorrendje legalább 90 %-ban homológ a CYVV-burokfehérje aminosav-sorrendjével, valamint minden olyan vírust, amely anti-CYVV-ellenszérum alkalmazásával végzett ELISA-ban pozitívnak mutatkozik (az alkalmazott antiszérum lehet például az American Type Culture Collection PVAS-123 nyilvántartási számú, lóhere sárga erezettségét okozó vírus elleni antiszérum), a lóhere sárga erezettségét okozó vírus valamely törzsének tekintünk.
A CYVV sok különböző növényen fenntartható, mint például: Phaseolus vulgáris, Vicia faba és Pisum sativum, de előnyösen Vicia faba-t, elsősorban pedig a Vicia faba Wase-soranome változatát alkalmazzuk.
A vírusrészecskéket előnyösen úgy izoláljuk, hogy a levelet vagy leveleket homogenizáljuk vagy kipréseljük megfelelő pufferben, majd szerves oldószerrel, mint például kloroformmal extrakciót hajtunk végre, ezután többször ismételve differenciális centrifugálást hajtunk végre, majd szacharóz sűrűséggradiens ultracentrifugálást.
Arról, hogy az izolált vírusrészecskék csakugyan CYVV-részecskéke, úgy győződhetünk meg például, hogy a vírusrészecskéket elektronmikroszkóp alatt megvizsgáljuk. Egy másik lehetséges azonosítási eljárás a Vicia faba fertőzése az izolált vírusrészecskékkel, majd a kapott tünetek azonosítása.
-32A genomi RNS-t a vírusrészecskékből többek között a guanidiumtiocianát/fenol-, a guanidium-tiocianát/trifluor-cézium-, valamint a fenol/SDS-eljárassal nyerhetjük ki. Mindazáltal előnyösen alkalmazhatjuk a lúgos szacharóz sűrűséggradiens ultracentrifugálásos eljárást is [Dougherty,
W.G. és Hiebert, E.: Virology 101, 466 (1980)].
A fenti módon izolált RNS-t sejtmentes transzlációs rendszerben vizsgálhatjuk abban a vonatkozásban, hogy valóban kódolja-e a találmány szerinti proteázt. Az autolízist (önemésztést) abban az esetben tudjuk detektálni, ha az izolált RNS a proteázon kívül még más transzlációs terméket is kódol, oly módon, hogy követjük a kinyert transzlációs termékek molekulatömegében bekövetkező változásokat. A molekulatömeg változásának követését például burokfehérje ellen termeltetett ellenanyag alkalmazásával hajthatjuk végre.
Amennyiben szükséges, a transzlációs termék termelődésének időbeli változását burokfehérje ellen termeltetett ellenanyag alkalmazásával nyomon követhetjük, például oly módon, hogy a genomi RNS-t Xenopus laevis oocitákba történő injektálás útján transzláltatjuk [Gurdon, J.B.: Natúré 233, 177 (1972)], vagy alkalmazhatunk nyúl retikulocita vagy búzacsíra lizátum rendszereket is [Schleif, R.F. és Wensink, P.C.: Practical Methods in Molecular Biology, Springer-Verlag, N.Y.],
Az izolált genomi RNS-t templátként használva reverz transzkriptáz alkalmazásával egyszálú DNS-t szintetizáltathatunk, majd a kapott egyszálú (ss) cDNS-ből kiindulva ismert eljárások alkalmazásával ds-cDNS-t szintetizálhatunk. Alkalmazható eljárások például az Sl-nukleázos eljárás [Efstratidiatis, A. és mtsai.: Cell 7, 279 (1976); Okayama, H. és Berg P.:
-33 Mól. Cél. Bioi. 2, 161 (1982) és mások], a Land-eljárás [Land, H. és mtsai.: Nucleic Acids Rés. 9, 2251 (1981)], valamint az O. Joon Yoo-eljárás [Yoo, 0. J. és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1049 (1983)]. A különböző alkalmas eljárások közül előnyösen kiválaszthatjuk a GublerHoffinan-féle eljárást [Gubler, U. és Hoffinan, B.J.: Gene 25, 263 (1983)].
A fenti módon előállított ds-cDNS-t ezután klónozó vektorba építhetjük, például plazmid vagy λ-fág-eredetű vektorba, majd a kapott rekombináns vektort valamely mikroorganizmusba transzformáljuk, például Escherichia coliba. Az E. coli DN5oc-törzs különösen előnyös. A transzformánsokat például valamilyen baktericid hatóanyaggal szemben mutatott rezisztencia alapján szelektálhatjuk. Például tetraciklin vagy amplicillin rezisztencia alapján, az alkalmazható szelekciós eljárások szakember számára jól ismertek.
A transzformációt végrehajthatjuk például a Hanahan-eljárással [Hanahan, D.: J. Mól. Bioi. 166, 557 (1983)], amely szerint a rekombináns vektort olyan sejtekbe juttatjuk be, melyeket kálcium-klorid, magnéziumklorid vagy rubidium-klorid alkalmazásával kompetenssé tettünk.
Az NIa-DNS-t tartalmazó transzformánsok szelektálására alkalmas eljárásokat az alábbiakban ismertetjük.
(1) Szűrővizsgálat hibridizációs próba alkalmazásával
Amennyiben a megfelelő RNS-t a vad típusú CYVV-ből kiindulva kívánjuk izolálni, akkor egy lehetséges megoldás a cDNS-hibridizációs próba alkalmazása, feltéve, hogy az NIa-fehérje aminosav sorrendje ismert (az NIa-fehérje bármely régiójának szekvenciájából kiindulva előállíthatjuk a hibridizációs próbát). Az elmondottak alapján tehát megszintetizálunk egy
-34releváns aminosav sorrend részletnek megfelel oligonukleotidot. Általában az a célszerű eljárás, hogy olyan aminosav sorrend részletet választunk, amely a lehető legkevesebb lehetséges degeneráltságot tartalmazza, ellenkező esetben több különböző hibridizációs próba előállítására van szükség, melyek a különböző lehetséges kódonokat tartalmazzák. Az ilyen esetekben a CYVV-vírus kódonhasználatának ismerete segítségünkre lehet. Eljárhatunk úgy is, hogy többértelmű nukleotidszekvenciát állítunk elő, ahol a variábilis nukleotid helyekre inozint építünk be. Az előállított hibridizációs próbát például rádióizotópokkal jelöltetjük, mint például a 32P és a 35S, de jelölhetjük a próbát biotinnal is. A transzformáns törzseket ezután úgy azonosíthatjuk, hogy a denaturált plazmid DNS-t nitrocellulóz filterekre fixáljuk, majd például radioaktívan jelölt hibridizációs próbát alkalmazva a pozitív kiónok autoradiográfiával detektálhatok.
(2) PCR-rel előállított hibridizációs próba alkalmazása
A cím szerinti eljárást alkalmazva úgy járunk el, hogy egy ismert aminosav sorrend részletnek megfelelő szensz és antiszensz szállal hibridizálódni képes oligonukleotid láncindító molekulákat szintetizálunk, majd ezen láncindítók alkalmazásával polimeráz láncreakciót hajtunk végre [Saiki, R.K. és mtsai.: Science 239. 487 (1988)]. Az említett láncindítókat kombinációban alkalmazva valamely NIa-részletet kódoló DNS-fragmenst amplifikálunk. A PCR-reakció templátjaként olyan cDNS-t alkalmazhatunk, melyet NIa-fehérjét kódoló virális genomi RNS-ről készítettünk reverz transzkripció útján. Az ily módon előállított DNS-fragmenseket megjelöljük például 32P, 35 S alkalmazásával, és kolóniahibridizációs vagy plakk hibridi-
-35 zációs eljárással, az előállított hibridizációs próbát alkalmazva a kívánt kiónokat kiszelektáljuk.
(3) A transzformánsok azonosítása állati sejtekben végrehajtott expresszió útján
A cím szerinti eljárás alapján úgy járunk el, hogy a gén amplifíkálása céljából a transzformáns törzset tenyésztjük, majd a gént valamely állati sejtbe transzferáljuk (ehhez általában replikáció kompetens plazmidot alkalmazunk, amely transzkripciós promoter régióval is rendelkezik, vagy valamely olyan plazmidot, amelyik képes a megfelelő kromoszómába beintegrálódni) és ily módon expresszáltatjuk a gén által kódolt fehérjét. A transzformánsokat az expresszált fehérje aktivitása alapján szelektáljuk.
(4) Transzformánsok azonosítása Nla-fehérjét felismerő ellenanyag alkalmazásával
Valamely CYVV-vírussal fertőzött növényből izolált sejtmagzárványok (NIa és Nlb) ellen ellenanyagot termeltetünk, vagy az ellenanyagot egy megfelelő expressziós rendszerben kifejezett expressziós vektor által kódolt fehérje ellen termeltetjük. A termeltetett ellenanyagot vagy az ellenanyag ellen termeltetett ellen ellenanyagot alkalmazhatjuk a kívánt NIa-fehérje vagy transzformáns törzs azonosítására.
(5) Szelektív hibridizációs transzlációs rendszer
A transzformáns cDNS-t Nla-fehérjét expresszáló sejtekből kinyert mRNS-izolátummal hibridizáltatjuk, a fent leírtak szerint, majd a cDNS-hez kötődött mRNS-t disszociáltatjuk és visszaizoláljuk. A visszanyert mRNS-t proteinné transzláltatjuk alkalmas transzlációs rendszerben, például oly módon, hogy Xenopus laevis oocitákba injektáljuk, vagy valamely sejtmentes
-36transzlációs rendszerbe juttatjuk, mint például a nyúl retikulocita lizátum vagy a búzacsíra lizátum rendszer. A megfelelő transzformáns törzseket ezután úgy azonosítjuk, hogy detektáljuk az NIa-aktivitást, vagy anti-NIaellenanyag alkalmazásával kimutatjuk az NIa-fehérjék jelenlétét.
A megfelelő transzformáns törzsekből CYVV-NIa-fehérjét kódoló DNS-t izolálhatunk, ismert eljárások alkalmazásával [Maniatis, T. és mtsai.: Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982)]. Például úgy járhatunk el, hogy izoláljuk a sejtekből a vektorDNS-nek megfelelő DNS-írakciót, majd az említett fehérjét kódoló DNSrégiót a plazmid-DNS-ből kivágjuk és izoláljuk.
Az izolált DNS-fragmens szekvenciáját meghatározhatjuk például a Maxam-Gilbert-féle kémiai módosításon alapuló eljárás szerint [Maxam, A.M. és Gilbert, W.: Methods in Enzymology 65, 499 (1980)], vagy például M13-fág alkalmazásán alapuló didezoxinukleotid-láncterminációs eljárás alkalmazásával [Messing, J. és Vieira, J.: Gene 19, 269 (1982)].
Az utóbbi években a DNS-szekvenciák meghatározására szolgáló eljárásokban a veszélyesebb radioizotópok szerepét egyre inkább átveszik a fluorokrómok. Ezen felül elmondhatjuk, hogy a didezoxinukleotidlánctermináción alapuló eljárást ma már általában komputer-vezérelte robotok hajtják végre. Olyan rendszerek is kifejlesztés alatt állnak, melyek az elektroforézist követően képesek automatikusan leolvasni a bázisszekvenciát. Az említett automatikus rendszerek képviselői például a CATALYST 800 szekvenáló robot és a 373A DNS-szekvenátor (Perkin-Elmer, Japan Applied Biosystems). Ezek az automatikus rendszerek lehetővé teszik, hogy
-37a DNS-szekvenciameghatározási eljárásokat hatékonyan és biztonságosan hajthassuk végre.
A találmány szerinti vektorokat megszerkeszthetjük oly módon, hogy azok standard sejtekben expresszálhatók legyenek, akár prokarióta, akár eukarióta sejtekről van szó. Amennyiben a vektorba megfelelő promóterszekvenciákat és fenotípusos expressziót biztosító szekvenciákat is beépítünk, a találmány szerinti gén a kiválasztott gazdasejtekben expresszálható. Alkalmas prokarióta gazdasejtek például az Escherichia coli és a Bacillus subtilis sejtek. Ahhoz, hogy a releváns gén fenotípusos expresszióját biztosítani tudjuk, a vektor előnyösen tartalmaz valamely olyan replikont, amely a gazdasejttel kompatíbilis fajból származik. E. coli alkalmazása esetén például a plazmid olyan replikációs origót és promóter szekvenciát tartalmazhat, mint például a lac vagy az UV5. Előnyös az olyan vektorok alkalmazása, melyek szelektálható fenotípusos sajátságot (fenotípust) idéznek elő.
Az Escherichia coli baktériumot gyakran alkalmazzuk gazdasejtként, és az E. coli K12 törzsből származó JM-109-sejtek előnyös gazdasejtek. Az E. coli gazdasejtekben alkalmazott vektorok lehetnek például a pBR322vagy a pUC-sorozat tagjai, de kívánt esetben alkalmazhatók egyéb törzsek és vektorok is. Az Escherichia coli sejtekben alkalmazható promóterek lehetnek többek között: a laktóz-promóter (lac), a triptofán-promóter (trp), a triptofán-laktóz-promóter (tac), a lipoprotein- (lpp) promóter, a λ-PLpromóter (a lambda fágból származik), valamint a Tu polipeptidláncnövekedési faktor (tuffi) promótere, igényünket azonban nem korlátozzuk az ismertetett promóterekre.
-38A találmány szerinti megoldásban alkalmazható Bacillus subtilis törzs többek között a 207-25-jelű törzs. Alkalmazható vektor többek között a pTUB228 [Ohmura, K. és mtsai.: J. Biochem. 95, 87 (1984)], valamint mások. Alkalmazható promoter többek között a Bacillus subtilis a-amiláz génjének regulációs szekvenciája. Az α-amiláz gén példaként említhető abban az esetben is, ha szignálpeptid szekvencia alkalmazásával extracelluláris szekréciót kívánunk elérni.
Amennyiben a találmány szerinti fúziós proteint eukarióta sejtekben kívánjuk expresszálni, alkalmazhatunk gerinces-, rovar-, élesztő- és növényi eredetű sejteket, valamint hasonlókat. A találmány szerinti megoldásban előnyösen alkalmazható gerinces sejtek a COS-sejtek, különösen a COS-1sejtek [Ohmura, K. és mtsai.: J. Biochem 95, 87 (1984)], valamint az olyan aranyhörcsög-petefészek- (CHO-) sejtvonalak, melyek dihidrofolát reduktáz defíciensek [Urlaub, G. és Chasin, L. A.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)], igényünket azonban nem korlátozzuk az ismertetettekre.
A fentiek értelmében a találmány szerinti megoldásban gerinces gazdasejtként alkalmazhatunk COS-sejteket, és ezen sejtek alkalmazását példaként tekinthetjük. Az SV40-replikonnal rendelkező expressziós vektorok képesek autonóm módon replikálódni COS-sejtekben, és az ilyen vektorokon találhatók még transzkripciós promoter, transzkripciós terminációs szekvencia és egy vagy több splicing hely is. A kívánt DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós vektorral különböző ismert eljárások alkalmazásával transzformálhatunk COS-sejteket, például a DEAE-dextrános eljárás alkalmazásával [Luthman, H. és Magnusson, G.: Nucleic Acids Rés. 11, 1295 (1983)], a kálcium-foszfát-DNS együttes kicsapásos eljárás alkalmazásával
-39[Graham, F. L. és van dér Eb, A. J.: Virology 52, 456 (1982)] valamint az elektroporációs eljárás alkalmazásával [Neumann, E. és mtsai.: EMBO J. 1, 841 (1982)].
CHO-sejtek gazdasejtként történő alkalmazása esetén előnyös olyan vektort használni, amely képes a neo-gént expresszálni, amely kifejeződése esetén G418-rezisztenciát okoz. Az említett rezisztencia gént alkalmazó alkalmas vektorok példáiként megemlíthetjük a pRSVneo- [Sambrook J. és mtsai.: Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory, NY (1989)] és a pSV2-neo-vektorokat [Southem, P. J. és Berg, P., J.: J. Mól. Appl. Génét. 1, 327 (1982)]. Az ilyen vektorokkal létrehozott transzfonnánsokat G418-rezisztencia alapján szelektálhatjuk.
A kiválasztott transzformánsokat szakember számára jól ismert eljárások szerint tenyészthetjük, és a találmány második megvalósítási módja szerint a polipeptid mind intracellulárisan, mind pedig extracellulárisan termelődik. Az alkalmas távközeget az alkalmazott gazdasejt tenyésztésére általánosan alkalmazott táptalajok közül választhatjuk ki. COS-sejtek esetén például az olyan táptalajokat, mint például az RPMI-1640 vagy a Dulbeccoféle módosított Eagle-táptalaj (DMEM), ki kell egészíteni vérből származó összetevőket, például magzati borjúsavót tartalmazó tápközeggel.
Amennyiben a felhasználó rovarsejteket kíván alkalmazni, alkalmazhatók például a Spodoptera frugiperda fajból származó sejtek [Smith, G.E. és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 3, 2156 (1983)].
Alkalmas élesztők például a sütőélesztő (Saccharomyces cerevisiaé) valamint a hasadó élesztő (Schizosaccharomyces pombe).
-40·: ·«· ·*·· ··*:
: ··; .·· · ··· ·· ·· i
Alkalmas növényi sejtek például a Nicotiana tabacumb(A és az Oryza sativdbóX származó sejtek.
Az elmondottak alapján nyilvánvaló, hogy a fent felsorolt sejtek a szakirodalomban található standard gazdasejtek, és szakember a kívánt alkalmazásnak megfelelően választhat alkalmas gazdasejteket a felsoroltak és egyéb gazdasejtek közül.
A gerinces sejtekben alkalmazható alkalmas expressziós vektorok például azok, melyek az expresszálni kívánt géntől 5'-irányban promótert is tartalmaznak, valamint olyan szekvenciákat, mint például az RNS-splicing helyek, a poliadenilációs szignálok, a transzkripciós terminációs szekvenciák, valamint kívánt esetben tartalmaznak replikációs origót is. Egy ilyen alkalmas expressziós vektor például a pSV2dhfr, amely az SV40 korai promóterét tartalmazza [Subramani, S. és mtsai.: Mól. Cell. Bio. 1, 854 (1981)]·
A rovarsejtekre épülő alkalmas expressziós rendszerek egy példája a Spodoptera frugiperda sejttenyészet. Az ebben a rendszerben alkalmazható expressziós vektorok tartalmazhatják például a baculovírus polihedrinpromóterét az expresszálni kívánt géntől 5'-irányban, valamint az AcMNPVvírus (Acutographa califomica nukleáris polihedrózis vírus) poliadenilációs szignálját, valamint a genomjának azon régióját, amelyik a homológ rekombinációhoz szükséges. Az ilyen vektorok egy példája a pBacPAK8 [Matuura, Y. és mtsai.: J. Gén. Virol 68,1233 (1987)].
Eukarióta expressziós rendszerként gyakran alkalmazzák az élesztőalapú expressziós rendszereket, például a sütőélesztőn (S. cerevisiae) alapuló rendszereket. Az élesztőn alapuló rendszerekben alkalmazható
-41 expressziós vektorok tartalmazhatják például az alkohol dehidrogenáz promótert [Bennetzen, J. L. és Hall, B.D.: J. Bioi. Chem. 257, 3018 (1982)], a savas foszfatáz promótert [Miyahara, A. és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1 (1983)], vagy a karboxipeptidáz-Y-promótert [Ichikawa, K. és mtsai.: Biosci, Biotech. Biochem. 57, 1686 (1993)]. Az utóbbi esetben alkalmazhatjuk a karboxipeptidáz-Y szignálpeptid szekvenciáját is, ily módon lehetővé téve az expresszált protein extracelluláris térbe történő szekrécióját.
Növényi sejtekben alkalmazható expressziós vektor például a pBI121, amelyben megtalálható egy 35S-promóter (amely a karfiolmozaik-vírus korai promóteréből származik), az Agrobakterium tumefaciens nopalinszintézis-génjének poliadenilációs szekvenciája, valamint az Agrobakterium tumefaciens géntranszfer szekvenciája [Jefferson, R.A. és mtsai.: EMBO J. 6, 3901 (1987)]. Az ilyen vektorok a növényi sejtekbe bejuttathatok például Agrobakterium tumefaciens végrehajtott fertőzéssel, valamint elektroporációval.
A Clonetech Co. által forgalmazott pKK388-l-plazmidban egy trc-promóter található, és ez a vektor alkalmas Escherichia coliban történő felhasználásra. Ez az expressziós vektor képes autonóm módon replikálódni az Escherichia coli törzséből származó baktériumtörzsekben, mint például a JM-109-ben. Ez a vektor könnyen bejuttatható Escherichia coliba a fent ismertetett közismert eljárások alkalmazásával. Az ily módon előállított transzformáns törzseket folyékony táptalajba olthatjuk, például a jól ismert LB-táptalajba, és ebben alkalmas ideig tenyészthetjük.
-42A vektoron található trc-promótert ezután például izopropil-βgalaktopiranozid (IPTG) hozzáadásával indukálhatjuk. További tenyésztés után az expresszált proteint a sejtek feltárása után a sejtekből kinyerhetjük. A feltárást például szonikátor alkalmazásával végezhetjük. Amennyiben olyan proteint kívánunk előállítani, mely az N-terminális végén prolin aminosavat tartalmaz, általában célszerű Escherichia coli gazdasejteket alkalmazni.
A fenti leírás, valamint szükség esetén a leíráshoz csatolt példákban leírtak figyelembe vételével a kívánt polipeptidet tartalmazó megfelelően transzformált sejtek tenyészetének egy részéből a kívánt polipeptid ismert eljárások alkalmazásával izolálható és tisztítható, az aktuálisan alkalmazott eljárásokat az izolálni kívánt polipeptid kémiai sajátságainak figyelembe vételével kell kiválasztani. Ilyen alkalmas eljárások például: kezelés fehérjekicsapó szerekkel, ultraszűrés, különböző kromatográfiás technikák (például a molekulaszűrésen illetve a gélszűrésen alapuló kromatográfiás eljárások, abszorpciós kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, affinitás kromatográfia, valamint a nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia, azaz HPLC), a dialízis, valamint a felsorolt eljárások kombinációi.
Annak eldöntése céljából, hogy az expresszált NIa-fehérje rendelkezik-e a szükséges proteáz-aktivitással, a tisztított NIa-fehérjét olyan szubsztrát fehérjével reagáltathatjuk, amely tartalmazza a proteáz hasítószekvenciáját, például annak a génnek az expressziós termékével, amely a virális burokfehérjét (az NIa-proteáz természetes szubsztrátja), valamint b-sejtmagzárvány-fehérjét (Nlb) tartalmazó fúziós proteint kódolja [Dougherty, W.G. és mtsai.: EMBO J. 7,1281 (1988)]. Ezt a fúziós proteint
-43 kódoló gént izolálhatjuk például virális genomi cDNS-ből és expressziós vektorba építhetjük. A kialakított expressziós vektort megfelelő gazdasejtbe juttatva a fúziós proteint expresszáltathatjuk. Az ily módon expresszáltatott fúziós proteint ismert módon például fehérjekicsapó szerek és kromatográfiás eljárások alkalmazásával izolálhatjuk és tisztíthatjuk.
Az ily módon izolált és tisztított szubsztrát fehérjét megfelelő puffer oldatban, megfelelő hőmérsékleten reagáltathatjuk az említett proteázzal, és a reakciótermékeket kinyerhetjük. A kinyert reakciótermékeket ezután elektroforetizálhatjuk, majd Westem-blot-eljárásnak vethetjük alá, antiburokfehérje ellenanyag alkalmazásával, és ily módon a proteázaktivitás megjelenését a megfelelő elektroforetikus csík mobilitásában bekövetkezett változásként detektálhatjuk. Az említett eljárásban alkalmazhatunk valamely szintetikus oligopeptidet is, amely tartalmazza a megfelelő hasítószekvenciát.
A találmány szerinti proteáz proteolítikus aktivitása tisztítás nélkül is detektálható. Ilyenkor úgy járunk el, hogy a proteáz génjét valamely alkalmas promótertől, például a trc-promótértől 3'-irányba klónozzuk, és a proteáz géntől 3'-irányban beépítjük a megfelelő hasítószekvenciát kódoló nukleinsav szekvenciarészletet, a proteázgénnel azonos nyílt leolvasási fázisban. Amennyiben a keletkezett expressziós termékben a proteáz aktív, akkor a Westem-blot-eljárás végrehajtása után kapni fogunk egy a fúziós proteinre jellemző csíknál nagyobb mobilitású pozitív csíkot.
Amennyiben a hasítási terméket tartalmazó csíkot a gélből kivágjuk, és a csíkban található polipeptid aminoterminális szekvenciáját meghatároz-44zuk, ismert eljárások alkalmazásával, megállapíthatjuk, hogy az izolált protein a kívánt peptidkötésnél hasadt-e el.
Amennyiben a kívánt fehérjét lehetséges fúziós fehérjeként együtt termeltetni valamely olyan fehérjével, mint például a glutation-S-transzferáz, a találmány szerinti NIa-proteázt alkalmazhatjuk a beépített hasítószekvencia in vitro hasítására. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a kívánt fehérjét a gazdasejtben közvetlenül az említett proteázzal fuzionált fehérjeként expresszáljuk, ily módon a kívánt fehérje önhasadás útján keletkezik.
Kívánt esetben a találmány szerinti NIa-fehérje a fenti eljárások alkalmazásával könnyen előállítható nagy mennyiségben és nagy tisztasággal, és az ily módon előállított találmány szerinti rekombináns NIa-fehérjét proteázként alkalmazhatjuk.
Amennyiben a találmány szerinti DNS-szekvenciákat kívánatos kémiai úton megszintetizálni, a szintéziseket közismert eljárások, mint például a foszfít-triészter eljárás [Hunkapiller, M. és mtsai.: Natúré 310.105 (1984)] alkalmazásával végezhetjük, vagy a nukleinsavak kémiai szintézise útján [Grantham, R. és mtsai.: Nucleic Acids Rés. 9, r43 (1981)]. Kívánt esetben a találmány szerinti DNS-szekvenciák részleges módosítását közismert eljárások alapján megvalósíthatjuk, például helyspecifikus mutagenezissel, olyan szintetikus láncindító oligonukleotid alkalmazásával, amely a kívánt módosítást kódolja [Mark, D.F. és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662 (1984)].
-45A hibridizáción alapuló eljárásokat, ahogy azt már a fentiekben említettük, végrehajthatjuk például a-32PdCTP alkalmazásával radioaktívan jelölt hibridizációs próba felhasználásával. A radioaktív jelölést végrehajthatjuk például a véletlenszerű láncindításos módszer [Feinberg, A.P. és Vogelstein, B. : Anal. Biochem. 132, 6 (1983)], vagy a nick-transzlációs eljárás [Maniatis, T. és mtsai.: Molecular Cloning a Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982)] alkalmazásával. A hagyományos hibridizációs eljárásokat úgy végezzük, hogy a DNS-t ismert eljárással valamely szilárd hordozóhoz rögzítjük, például nitrocellulóz vagy nylonmembránhoz abszorbeáljuk, majd hővel vagy ultraibolya sugárzással rögzítjük. A rögzített DNS-t tartalmazó szilárd hordozót ezután általában prehibridizációs oldatba merítjük, amely 6x SSC-oldatot, 5% Denhardtoldatot és 0,1 % SDS-t tartalmaz, és a beáztatott filtereket négy órán keresztül vagy hosszabb ideig 55 °C-on inkubáljuk. Ezután az előzetesen elkészített hibridizációs próbát a prehibridizációs oldathoz adjuk lxlO6 cpm/ml specifikus aktivitást elérve, majd a reakcióelegyet egy éjszakán át 60 °C-on inkubáljuk. Ezután a szilárd fázist ötször ismételve 6x SSC-pufferrel öt percen keresztül szobahőmérsékleten mossuk, amit 20 percig tartó 57 °C-os mosás követ, majd autoradiográfiát hajtunk végre annak eldöntése érdekében, hogy történt-e hibridizáció vagy nem. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a fent ismertetett eljárás a sok lehetséges alkalmazható eljárásnak csak egy kiragadott példája.
A kívánt fehérjét előállíthatjuk mind intracelluláris direkt hasításos eljárással, mind pedig valamely extracelluláris hasítási eljárással.
-46Intracelluláris direkt hasításos eljárás
A találmány szerinti DNS-fragmensekben az NIa-fehérjét kódoló DNS-szekvenciarészlet a hasítószekvenciát - előnyösen Gln-Gly, Gin-Ser vagy Gln-Ala - keresztül kapcsolódik a kívánt fehérjét kódoló szekvenciához. Az ilyen DNS-fragmensek fúziós proteint kódolnak és promótert valamint terminátort tartalmazó vektorba inszertáljuk őket, majd az így kialakított vektorokkal megfelelő gazdasejteket transzformálunk. Az eredményül kapott expresszált fúziós fehérje proteáz aktivitásának köszönhetően elhasítja saját magát, és ily módon a keletkező kívánt fehérje N-terminális végéhez peptid kötéssel Gly, Ser vagy Alá aminosav fog csatlakozni. Rendkívül előnyös expresszáltatható fehérje az IL-11.
Amennyiben a keletkezett fehérje N-terminális végéről kívánatos bizonyos aminosavakat eltávolítani, akkor ezt a fent leírtak szerint például aminopeptidáz-P-vel végzett emésztéssel valósíthatjuk meg, amelynek eredményeként az N-terminális aminosava prolin marad, amennyiben ez kívánatos.
Ismeretesek olyan expressziós rendszerek is, melyekben az aminopeptidáz-P eleve jelen van. Mindazáltal ha az aminopeptidáz-P nincs jelen az expressziós rendszerben, de kívánatos, hogy bizonyos N-terminális aminosavakat in situ távolítsunk el, a gazdasejtbe bejuttathatunk valamely olyan expressziós vektort, amely képes az aminopeptidáz-P-t expresszáltatni. Az aminopeptidáz-P ismert fehérje, és az enzim génjének szekvenciája szakember számára könnyen hozzáférhető.
Amennyiben az N-terminálison prolin aminosawal kezdődő fehérjét kívánunk előállítani, általában előnyös a gazdasejtek tenyésztésének idejét
-4Ί megnövelni, abból a célból, hogy a celluláris aminopeptidáz-P hatása megnyilvánuljon.
A fent leírtaknak megfelelően az N-terminális prolin aminosav a prolin iminopeptidáz (3.4.11.5) katalitikus aktivitását felhasználva eltávolítható. A prolin iminopeptidáz vagy endogén módon expresszálódik, vagy expresszáltatható egy exogén expressziós vektor bejuttatásával is (az enzim ismert fehérje és génjének szekvenciája szakember számára könnyen hozzáférhető). Eljárhatunk úgy is, hogy az N-terminális prolin aminosavat az expressziós rendszerből történt izolálás után távolítjuk el, például abban az esetben, ha a fúziós protein a sejtből szekretálódik.
Az elmondottak alapján világos, hogy a találmány szerinti megoldás lehetővé teszi bármilyen kívánt N-terminális aminosawal rendelkező fehérje termeltetését.
Amennyiben a találmány szerinti szekvencia expressziójának eredménye olyan polipeptid, melynek N-terminális aminosava Alá, akkor ez az alanin aminosav az alanin aminopeptidáz (3.4.11.14) katalitikus aktivitásának felhasználásával eltávolítható. Az alanin aminopeptidáz szintén ismert enzim, és szekvenciája szakember számára könnyen hozzáférhető. Ez a technika szintén lehetővé teszi, hogy tetszőleges N-terminális végződéssel rendelkező polipeptidet állítsunk elő.
A kívánt fehérje ezután közismert eljárások alkalmazásával izolálható és tisztítható.
Extacelluláris hasítási eljárás
Az NIa-fehérjét előállíthatjuk oly módon, hogy a megfelelő DNSszekvenciát valamely vektorba juttatjuk, amelyet azután valamely
-48expressziós rendszerbe transzformálunk. A transzformált gazdasejtek által expresszált Nla-fehérjét közismert eljárásokkal tisztíthatjuk, mint például ioncserélő oszlop, gélszűrő oszlop és reverz fázisú oszlop alkalmazásával. Eljárhatunk úgy is, hogy az Nla-fehérjét valamely más polipeptiddel, például a glutation-S-transzferázzal vagy a maltózkötö fehérjével együtt fúziós fehérjeként expresszáljuk. Az így előállított fúziós fehérjét glutation oszlop vagy maltóz oszlop alkalmazásával izolálhatjuk és tisztíthatjuk. Miután a tisztított terméket enterokinázzal vagy Xa-faktorral elhasítottuk, a keletkezett Nla-fehérjét tisztíthatjuk és felhasználhatjuk. Előállítjuk ugyanakkor az NIa-felismerő szekvenciát (hasítószekvenciát) tartalmazó prekurzor proteint is. Ez a prekurzor lehet önálló polipeptid, de képezheti a részét valamely fúziós proteinnek is, például glutation-S-transzferázzal vagy maltózkötö fehérjével képezett fúziós fehérje részét, amely fúziós fehérje alkotórészei a megfelelő hasítószekvencián keresztül kapcsolódnak egymáshoz. Amennyiben a prekurzor proteint megfelelő puffer oldatban NIa-proteázzal reagáltatjuk, a prekurzor in vitro elhasad. Kívánt esetben a kapott fehérje N-terminális aminosavát a fent leírtak szerint eltávolíthatjuk.
Ahogy azt a korábbiakban már ismertettük, a kapott fehérjét ismert eljárások alkalmazásával izolálhatjuk és tisztíthatjuk.
A találmány szerinti megoldás második megvalósítási módja szerint a természetben előforduló redukáló peptid szekvenciája ismereteink szerint azonos a 12. azonosító számú szekvenciával, és 526 aminosavból áll, N-terminális aminosava pedig valin.
-49A fenti polipeptidet kódoló természetben előforduló DNS-szekvencia ismereteink szerint megegyezik a 11. azonosítószámú nukleotidszekvenciának 70-1647 nukleotidjaival.
A találmány szerinti polipeptid képes oxidált glutation és diklórindofenolt redukálni. Az előzőekben megadott definíció pontosan jellemzi a találmány szerinti polipeptidet, de meglehetősen nehézkes, ezért a találmány szerinti polipeptidet a leírás vonatkozásában KM31-7-peptidnek vagy -fehérjének is nevezzük. A KM31-7-fehérje a testből származik vagy valamely testből származó fehérje mutánsa vagy variánsa, éppen ezért vele kapcsolatosan minimális toxicitási és/vagy antigenitásí problémákkal kell számolnunk.
A találmány szerinti megoldás második megvalósítási módja szerint a
12. azonosító számú szekvencia -23-526 aminosavaí által meghatározott poíipeptid feltételezésünk szerint a KM31-7-fehérje prekurzora. Ez a prekurzor molekula szintén a találmány tárgyát képezi, csakúgy, mint annak mutánsai és variánsai, valamint az azokat kódoló polinukleotid-szekvenciák.
Az alábbiakban közölt kitanítás alapvetően a találmány második megvalósítási módjára vonatkozik. Szakember számára világos, hogy a CYVV-NIa-fehérje vonatkozásában fent közölt eljárások közül sok szintén alkalmazható a találmány második megvalósítási módja szerinti polipeptidet kódoló DNS-izolálására, klónozására és expresszálására. Az alkalmazandó eljárásokban a kisebb különbségek abból erednek, hogy a CYVV-NIa-fehérje egy növényi vírus fehérjéje, míg a találmány második megvalósítási módja szerinti polipeptid emlős eredetű fehérje. Az emlőssejtekből származó specifikus expresszált polipeptidet genetikai rekombinációs
- 50technikák útján történő előállításának általános lépéseit az alábbiakban nem fogjuk ismertetni.
A KM31-7-polipeptidet kódoló mRNS-t izolálhatjuk és reverz transzkripció útján ds-DNS-sé írhatjuk át, szakember számára jól ismert eljárások alkalmazásával. Az eredeti mRNS-forrásaként bármely alkalmas emlőssejtet, sejtvonalat vagy szövetet felhasználhatunk, előnyösen azonban a KM102-sejtvonalat alkalmazzuk, amely humán csontvelő sztróma-sejtekből származik [Harigaya, K. és Handa, H.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 3447 (1985)].
Az mRNS emlőssejtekből történő izolálására különböző eljárásokat alkalmazhatunk, mint például a guanidium-tiocianát/forró fenol eljárást vagy a guanidium-tiocianát/guanidium-hidroklorid eljárást, de általában előnyösen a guanidium-tiocianát/cézium-klorid eljárást alkalmazzuk.
Mivel az eukarióta sejtek citoplazmájában található mRNS-ek többsége közismerten 3'-végi poli-A-szekvenciával rendelkezik, az emlős mRNS tisztítását elvégezhetjük oly módon, hogy az mRNS-t oligo(dT)-cellulóz oszlopra abszorbeáljuk, kihasználja ily módon az eukarióta mRNS-sek említett sajátságát. Az oszlopról leoldott mRNS-t tovább frakcionálhatjuk olyan eljárások alkalmazásával, mint például a szacharóz sürüséggradiens ultracentrifugálás.
Arról, hogy az izolált mRNS valóban a kívánt polipeptidet kódolja-e, oly módon győződhetünk meg, hogy az mRNS-t valamely alkalmas rendszerben, mint például Xenopus laevis oocitákban vagy nyúl-retikulocitarendszerben vagy búzacsíra-rendszerben (lásd fent) transzlációnak vetjük alá.
-51 Az expressziós termék redukáló aktivitásának meghatározását az alábbiak szerint végezhetjük.
ffi A diklór-indofenol-redukáló aktivitás meghatározása
A meghatározási eljárás leírását megtaláljuk a következő publikációkban: Beinert, H.: Methods in Enzymology 5, 546 (1962).
pmól/l diklór-indofenol (Sigma) oldatot készítünk 0,5 mól/l NaClot tartalmazó 20 mmól/1 foszfátpufferben (pH=7,8). Az oldatból 1 ml-t küvettába töltünk (SARSTEDT, 10x4x45 mm), majd hozzáadjuk a mérendő mintát. A reakciót szobahőmérsékleten 15 μΐ 1 mmól/1 (BoeringerMannheim) oldat - az oldatot a fenti pufferben készítjük - küvettához adásával indítjuk. A reduktáz aktivitást ezután oly módon határozhatjuk meg, hogy követjük az oxidált diklór-indofenol 600 nm-en mérhető abszorpciójának időbeni csökkenését, vagy a NADPH 340 nm-nél mérhető abszorpciójának időbeli csökkenését.
(ii) Az oxidált glutationt redukáló aktivitás meghatározása
A meghatározási eljárás leírását megtalálhatjuk a következő publikációkban: Nakajima, T. és mtsai.: New basic Experimental Methods in Biochemistry (6) - Assay Methods Using Biological Activity, 3-34.
mmól/l-es oxidált glutation (Boeringer-Mannheim) oldatot készítünk 0,5 mól/l NaCl-ot tartalmazó 20 pmól/l-es foszfátpufferben (pH=7,8). Ebből az oldatból 15 μΐ-t mérünk be egy küvettába (10x4x4 mm), azt követően, hogy a vizsgálandó mintát már a küvettába helyeztük. A reakciót szobahőmérsékleten 15 μΐ 1 mmól/l-es NADPH-oldat - az oldatot ugyanabban a pufferben készítjük - küvettához adásával indítjuk. A glutation
-52reduktáz aktivitást ezután a 340 nm-en mérhető abszorpció időbeni csökkenésének követésével határozhatjuk meg.
níRNS-ből a fent leírtak szerint különböző közismert eljárások alkalmazásával állíthatunk elő ds-DNS-t. Ilyen eljárás például az Sl-nukleázos módszer, a Land-féle eljárás és az O. Joon Yoo-féle eljárás (lásd fent), a találmány jelen megvalósítási módja szerint azonban az Okayama-Berg-féle eljárás alkalmazását tartjuk előnyösnek [Okayama H. és Berg, P.: Mól. Cell. Bioi. 2, 161 (1982)].
Az előállított ds-cDNS-t klónozó vektorba építhetjük, és a kapott rekombináns plazmidot a fent leírtak szerint Escherichia coliba juttathatjuk.
A kívánt rekombináns DNS-t tartalmazó törzseket különböző eljárások alkalmazásával szelektálhatjuk, például az előbbiekben az NIa-DNS-t tartalmazó transzformánsok szelektálása vonatkozásában fent leírt eljárások alkalmazásával. Amennyiben például a hibridizációs próbát PCR-eljárással állítjuk elő, alkalmas templát-DNS lehet mind a fent leírt cDNS, mint pedig a genomi DNS.
A találmány szerinti megoldás második megvalósítási módja szerint lehetőség van egy elsődleges szűrő alkalmazására, ami által a vizsgálandó transzformánsok számát csökkenthetjük. Az említett elsődleges szűrő azért valósítható meg, mert a találmány szerinti polipeptid a citokinek közé tartozik, és ezért mRNS-ében megtalálható a citokinekre jellemző közös szekvenciamotívum, az AUUUA-motívum [Shaw, G. és Kamen, R.: Cell 46, 659 (1986)]. Az elmondottak értelmében elsődleges szűrőként olyan szintetikus oligonukleotid hibridizációs próbát alkalmazhatunk, amely az AUUUA-szekvenciamotívummal komplementer. Az elsődleges szűrés után
-53 a megfelelő transzformánsokat úgy választhatjuk ki, hogy emlőssejtekben vizsgáljuk az exogén protein termelődését.
A találmány szerinti polipeptidet kódoló DNS-t kivághatjuk a vektorból és az NIa-DNS vonatkozásában fent leírtak szerint szekvenálhatjuk. Szintén a fent leírtak szerint a kivágott DNS-fragmenst megfelelő vektorba építhetjük, melyet azután a kívánt prokarióta vagy eukarióta gazdasejtek transzformálására használhatunk. A KM31-7-fehérjét alkalmazhatjuk önmagában vagy egy vagy több terápiás hatóanyaggal kombinációban olyan rendellenességek megelőzésére és kezelésére, melyeket oxidatív stressz okoz vagy azzal kapcsolatosak, és bármely olyan betegség kezelésére és megelőzésére, melyet aktivált oxigén okoz. Ilyen rendellenességek többek között - anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk az arterioszklerózis, a diabétesz, az isémiás rendellenességek (mint például reperíüziós rendellenességek, isémiás szívbetegségek, cerebroisémia és isémiás enteritisz), az ödéma, a vaszkuláris hiperpermeabilitás, a gyulladások, a gyomor nyálkahártya rendellenességei, az akut pankreatitisz, a Crohnkór, a fekélyes vastagbélgyulladás, a májrendellenességek, a Paraqat-kór, a tüdő emfizéma, a kemokarciogenézis, a karcinogén metasztázisok, a felnőttkori légzőrendszeri szorongásos szindróma, az elszórt intravaszkuláris koaguláció (DIC), a hályogok, a serdülőkori retinopátia, az autoimmun megbetegedések, a porfirémia, a hemolítikus megbetegedések, a mediterrán anémia, a Parkinson-kór, az Alzheimer-kór, az epilepszia, az ultraibolya sugárzás következtében fellépő rendellenességek, a radioaktív sugárzás következtében fellépő rendellenességek, a fagyási és égési sérülések.
• · · ·· ···· • · · · · · · • ··· ·· · • · · · · • · · · · ·· ·
-54A találmány második megvalósítási módja szerinti gyógyászati készítmények a KM31-7-polipeptid gyógyászatilag hatásos mennyiségét és valamely gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaznak.
A találmány szerinti gyógyászati készítményeket különböző formákban adagolhatjuk, például orálisan, tabletták formájában, kapszulákban, granulátumként, porok és szirupok formájában, vagy parenterálisan, injekciók formájában, infúziók formájában vagy kúpokként. Szakember számára kézenfekvő, hogy a találmány szerinti készítményeket a felsoroltakon kívül más formákban is adagolhatjuk.
Abban az esetben, hogyha a találmány szerinti polipeptidet injekció vagy infúzió formájában kívánjuk adagolni, a polipeptidből pirogénmentes preparátumot kell előállítani, és ezt kell gyógyászatilag elfogadható parenterális adagolásra alkalmas vizes oldatban oldani. A találmány szerinti polipeptidből pH-izotónia és stabilitás szempontjából megfelelő oldat előállítása a szakember köteles tudásához tartozik.
Szakember könnyen meghatározhatja a találmány szerinti gyógyászati készítménynek megfelelő adagolási mennyiségét és formáját, olyan kritériumok figyelembe vételével, mint például a páciens általános egészségi állapota, testsúlya, neme, kora, étrendje, egyéb fertőzések komolysága, az adagolás ideje, valamint egyéb klinikai szempontból jelentős faktorok. Általában a normális felnőtt orális dózis kb. 0-0,1 mg és kb. 1000 mg/nap közötti. Ezt a mennyiséget beadhatjuk egyetlen dózisban, de adagolhatjuk 24 órára elosztva több különböző dózisban is. Amennyiben a találmány szerinti polipeptidet parenterálisan adagoljuk, szubkután, intramuszkuláris vagy int
-55 ravénás injekció formájában kb. 0,01 mg és kb. 100 mg közötti mennyiséget adunk be alkalmanként.
Annak érdekében, hogy a KM31-7-fehérjét teljes mértékben jellemezni tudjuk, fontos volt erre a fehérjére specifikus ellenanyagot előállítani. Az ilyen ellenanyag alkalmazása megkönnyíti a KM31-7-fehérje funkcionális vizsgálatát, mennyiségi meghatározását, tisztítását és szöveti megoszlásának meghatározását.
Az elmondottak értelmében előállítottunk egy anti-KM31-7ellenanyagot termelő hibridóma-sejtvonalat, oly módon, hogy laboratóriumi állatokat beoltottunk pMAL31-7-tel transzformált E. coli által termelt találmány szerinti polipeptiddel, majd előállítottunk egy hibridóma-sejtvonalat ellenanyagtermelő sejtek és mielómasejtek alkalmazásával, majd kiszelektáltuk és megklónoztuk az ellenanyagtermelő hibridóma-sejtvonalat. Az ily módon előállított hibridóma-sejtvonal által termelt ellenanyagok képesek voltak felismerni a psra31-7-tel transzformált COS-1-sejtek szérummentes felülúszójából kinyert találmány szerinti polipeptidet.
Az elmondottak értelmében tehát a találmány tárgyát képezik azok az ellenanyagok, előnyösen monoklonális ellenanyagok, vagy azok ekvivalensei, melyek specifikusan felismerik a KM31-7-fehérjét, vagy a KM31-7fehérje mutánsát vagy variánsát. A találmány szerinti ellenanyagokat a KM31-7-fehérje vagy annak mutánsa vagy variánsa ellen termeltetjük. A találmány szerinti ellenanyagok lehetnek akár poliklonálisak, akár monoklonálisak, de a monoklonális ellenanyagok alkalmazása az előnyösebb. Ez a poliklonális ellenanyagok alkalmazásával általában együtt járó bizonytalanságok következménye. Az eredmények egyöntetűsége céljából • · · · · · • · · · · ··· ’ · ·· «
-56akár terápiás célból, akár a K31-7-fehérje tisztítása céljából előnyösebb monoklonális ellenanyagokat alkalmazni.
A találmány szerinti ellenanyagokat bármely alkalmas állatból kiindulva előállíthatjuk. Mindazáltal antigenitási problémák léphetnek föl amennyiben nem humán ellenanyagot alkalmazunk. Ebben a vonatkozásban megjegyezzük, hogy lehetséges az állati eredetű ellenanyagokat oly módon megváltoztatni, hogy azok jobban hasonlítsanak a humán ellenanyagokra. Az ilyen módosításokat mind kémiai, mind genetikai manipulációs eljárások alkalmazásával végrehajthatjuk, mely eljárások szakember számára jól ismertek.
A találmány tárgyát képezik azok az antiidiotípus ellenanyagok is, melyek felismerőhelye a fentiekben ismertetett ellenanyagok felismerőhelyeit ismeri fel. Ilyen antiidiotípus ellenanyagokat oly módon állíthatunk elő, hogy az eredeti ellenanyagokat megfelelő állatba juttatjuk. Szakember számára kézenfekvő, hogy az említett immunizálási folyamatot valójában végtelenségig folytathatjuk és az immunizálási lánc bármely lépésében keletkező ellenanyagok vagy az eredeti vagy az antiidiotípus ellenanyagok specifításának fognak megfelelni. Mindazáltal amennyiben az egyes immunizálási lépések után nem szelektáljuk ki a megfelelő felismerő sajátságokkal rendelkező ellenanyagokat, a specifitás az immunizálási lépések során elveszhet. Az antiidiotípus ellenanyagok alkalmazása hasznos lehet például a szabad anti-KM31-7-ellenanyagok esetén.
A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti ellenanyagok mindazok fragmensei is, melyek képesek felismerni a K31-7-fehérjét, valamint mindazok a molekulák, melyek tartalmazzák valamely találmány szerinti el»· ♦·♦*
-57lenanyag felismeröhelyeit. Az ilyen fragmenseket és molekulákat a leírás vonatkozásában a találmány szerinti ellenanyagok ekvivalenseinek nevezzük.
E. coli baktériumokat transzformáltunk a pMAL31-7-plazmiddal, és az expressziós terméket tisztítás után laboratóriumi állatok immunizálására használtuk. Az immunizált állatok lépsejtjeit használtuk hibridóma-sejtvonal előállítására, mielómasejtekkel történő fúzió útján, és izoláltunk egy olyan kiónt, amely nagy koncentrációban és jó stabilitással anti-KM31-7 monoklonális ellenanyagokat termelt (ezt a kiónt MKM150-2-nek neveztük el és letétbe helyeztük a Fermentation Research Institut of the Agency of Industrial Science and Technology-nél, Japánban, ahol a FERMBP-5086 deponálási számot kapta). Az említett klón tenyészetének felülúszójából anti-KM31-7 monoklonális ellenanyagokat lehet izolálni.
A kapott anti-KM31-7 monoklonális ellenanyagok immunkémiailag reakcióba lépnek a pMAL-31-7 vektor bejuttatása és expesszáltatása után Escherichia coliból izolált fúziós fehérjével. Ez az ellenanyag szintén immunkémiai reakcióba lép a KM31-7-fehérjét kódoló cDNS-sel transzformált emlőssejtek felülúszójából izolált KM31-7-fehérjével.
Monoklonális ellenanyagok előállításakor általában az alább megadott lépések szerinti eljárást kell követni. A monoklonális ellenanyagok előállítási eljárás főbb lépései:
(a) az antigénként használandó biopolimer tisztítása;
(b) egerek immunizálása az antigén beinjektálása útján, ellenanyagtermelő sejtek izolálása a lépből megfelelő időpontban, a megfelelő időpontot vérvétellel és a vér ellenanyag-szintjének meghatározásával állapítjuk meg;
* · (c) mieloma sejtek előállítása;
(d) a lépsejtek és a mieloma sejtek fuzionáltatása;
(e) a megfelelő ellenanyagokat termelő hibridóma-sejtvonal kiválasztása;
(f) termelőklón izolálása (klónozás);
(g) a hibridóma-sejtvonal tenyésztése a monoklonális ellenanyag nagy mennyiségű ellenanyag előállítása céljából, vagy kívánság szerint a hibridóma-sejtvonallal fertőzött egerek tenyésztése; és (h) a kapott monoklonális ellenanyag fiziológiai aktivitásának vagy jelölő reagensként kutatott sajátságainak vizsgálata.
Az anti-KM31-7 monoklonális ellenanyagok előállítását az ismertetett eljárási lépésekre való hivatkozással fogjuk bemutatni. Szakember számára kézenfekvő, hogy az ellenanyagok előállítása céljából nem szükséges tökéletesen követni az alább bemutatott előállítási eljárás lépéseit, hanem lehetséges egyéb célravezető megoldásokat is alkalmazni. Lehetséges például nem lépből származó ellenanyag termelő és mielómasejteket alkalmazni, és azt is megtehetjük, hogy valamely más állatból származó ellenanyagtermelő és mielómasejteket alkalmazunk. Az alább bemutatott eljárás az anti-KM31-7 monoklonális ellenanyagok jelenleg legelőnyösebbnek tartott előállítási eljárása.
(a) Az antigén tisztítása
A pMAL31-7 E. coliban történő expresszáltatása és az expressziós tennék tisztítása útján nyert fúziós fehérje hatékony antigén. pMAL31-7-tel transzformált E. coli TB-1-sejtek tenyészetét izopropil-B-Dtiogalaktopimoziddal (IPTG) indukáltuk. Az expresszált fúziós proteint affinitás kromatográfiával tisztítottuk amilóz fúnkciós csoportokat tartalmazó
-59gyantával töltött oszlop (New England BioLabs) alkalmazásával. A pSRa31-7-tel transzformált COS-1-sejtek tenyészetének szérummentes felülúszójából tisztított KM31-7-fehérje is hatékonyan antigén.
(b) Ellenanvagtermelő sejtek előállítása
Az (a) lépésben előállított tisztított íuziós proteint Freund-féle komplett vagy inkomplett adjuvánssal elkeverjük, vagy olyan adjuvánssal, mint például a kálium timsó és a kapott oltóanyaggal kísérleti állatokat immunizálunk. Kísérleti állatként előnyösen BALB/c-egereket alkalmazunk, mivel az alkalmas mielómasejtek többsége BALB/c-egerekből származik. Továbbá ezen egerek sajátságait nagy részletességgel tanulmányozták. Továbbá amennyiben mind az ellenanyagtermelö, mind pedig a mielómasejtek BALB/c-egérből származnak, a kapott hibridóma-sejteket lehetséges BALB/c-egerek hasüregében tenyészteni. Ily módon BALB/c-egerek alkalmazásával lehetőség nyílik arra, hogy a monoklonális ellenanyagokat könynyen, aszciteszből izoláljuk, anélkül, hogy szükség lenne bonyolult eljárások alkalmazására. Mindazáltal igényünket nem korlátozzuk a BALB/c-egerek alkalmazására.
Az antigént bejuttathatjuk a kísérleti állatokba bármely alkalmas módon, például szubkután injektálással, intraperitoneális injektálással, intravénás injektálással, intrakután injektálással vagy intramuszkuláris injektálással, és előnyösen szubkután vagy intraperitoneális injektálást alkalmazunk.
Az immunizálást végrehajthatjuk egy alkalommal vagy megfelelő időközönként több alkalommal. Az előnyös eljárás szerint először immunizálunk, majd megerősítő immunizálást végzünk egyszer vagy kétszer, egy-öt hetes intervallumokban.
\ <
-60Αζ eljárás további lépéseinek hatékonyságát fokozhatjuk, ha az immunizált állatok szérumában folyamatosan nyomon követjük az alkalmazott antigénnel reagáló ellenanyagok titerét, és olyan kísérleti állatokat alkalmazunk az ellenanyagtermelő sejtek előállítására, melyek ellenanyagtitere megfelelően magas. A későbbi fúzió céljára az ellenanyagtermelő sejteket előnyösen a végső immunizálást követően 3-5 nappal izoláljuk a kiválasztott kísérleti állatból.
Az ellenanyagtiter meghatározására számos eljárás rendelkezésünkre áll, például a rádióizotópos “immunoassay” (RIA), az enzimmel jelzett immunszorbens alkalmazásán alapuló vizsgálati eljárás (ELISA), a fluoreszcensen jelölt ellenanyagok alkalmazásán alapuló eljárások, valamint a passzív hemagglutináció. A nagy érzékenység, gyorsaság, pontosság és automatizálhatóság szempontjából azonban előnyös a RIA- és ELISAtechnikák alkalmazása.
Az ELISA-eljárás végrehajtásának egy lehetséges módja az alábbi. Az antigént valamely szilárd fázis felszínére abszorbeáljuk, majd a szilárd fázist egy olyan fehérje oldatával érintkeztetjük, melynek szerkezete nem hasonlít az antigén szerkezetéhez, például marhaszérum-albuminnal (BSA), abból a célból, hogy blokkoljuk a szilárd fázis felületének azon részeit, ahová antigén nem abszorbeálódott. A szilárd fázist ezután mossuk, majd az első ellenanyag (például egérszérum) sorozathígításával érintkeztetjük. Ily módon a mintában található anti-KM31-7-ellenanyagok az antigénhez kötődnek. A szilárd fázis mosása után a rendszerhez enzimmel jelölt második (antiegér) ellenanyagot adunk, és lehetővé tesszük, hogy a második ellenanyag a szilárd fázishoz kötött egér ellenanyagokhoz kötődjön. A szilárd « · • ♦· ·* ···· *· * · 9 · « • ··· ·· · • · * · · ··· ·» «« «
-61 fázis ismételt mosása után a rendszerhez hozzáadjuk a jelölő enzim szubsztrátját, az ellenanyag-titert ezután oly módon állapíthatjuk meg, hogy mérjük valamely olyan paraméter változását (például színváltozást), ami az enzimszubsztrát elbomlásának következménye.
(c) A mielómaseitek előállítása
A mielómasejtek fonásaként előnyösen valamely közhasználatú egérsejtvonalat alkalmazunk. Alkalmas mielóma-sejtvonalak példáiként a következő sejtvonalakat említjük meg: P3-X63-Ag8-Ul (P3-U1) - ez a sejtvonal 8-azaguanin-rezisztens BALB/c egerekből származik - [Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1 (1978)), P3-NSI/l-Ag4.1 (NS-1) [European J. Immunology, 6, 511 (1976)], SP2/0-AG14 (SP-2) [Natúré, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8.653 (653) [J. Immunology, 123, 1548 (1979)] és P3-X632-Ag8 (X63) [Natúré, 256, 495 (1975)]. Ezeket a sejtvonalakat alkalmas táptalajban tenyészthetjük, ilyen táptalajon például a 8-azaguanin-táptalaj (RPMI-1640 táptalaj, amely 8-azaguanint tartalmaz, valamint 1,5 mmól/1 glutamint, 5 x 10’5 mól/1 2-merkaptoetanolt, 10 pg/ml gentamicint, valamint 10 % magzati borjúszérumot), az Iscove-féle módosított Dulbecco-táptalaj (IMDM) vagy a Dulbecco-féle módosított Eagletáptalaj (DMEM). A sejtfúzió előtt három-négy napon keresztül a sejteket normál táptalajban tenyésztjük, melyet komplett GIT-táptalajnak is neveznek [5,5 ml “MÉM” nem-esszenciális aminosav-oldat (NEAA, Gibco), 27,5 ml NCTC109 (Gibco), 6 ml penicillin-sztreptomicin-oldat (Sigma) és 11 ml 200 mmól/l-es glutamin-oldat (Sigma) 500 ml GIT-táptalajban felvéve (Wako Pure Chemical Industry)], és a fúzió napjára a sejtszámnak el kell érni a 2 x 107 értéket.
-62 ·“» ·· ν··« • · · · · ··· ·· 9 *··* !
(d) Sejtfúzió
Az ellenanyagtermelő sejtek plazmasejtek, valamint ezek prekurzor limfocitái. Ilyen sejteket a kiválasztott állat bármely megfelelő részéről nyerhetünk, mint például a lépből, a nyirokcsomókból, a perifériális vérből vagy az elmondottak alkalmas kombinációjából. Mindazáltal legáltalánosabban a lépsejteket alkalmazzák. Az ellenanyagtermelő sejteket 3-5 nappal a végső immunizálás után nyerjük ki, azokból az egerekből, melyeknek az ellenanyagtitere egy meghatározott értéknél nagyobb. A kapott ellenanyagtermelő sejteket ezután fuzionáltatjuk a fenti (c) pont szerint előállított mielómasejtekkel. Jelenleg lépsejtek és mielómasejtek fuzionáltatására a legáltalánosabban alkalmazott eljárás a polietilén-glikol alkalmazásán alapuló eljárás, ami azzal magyarázható, hogy ennek a vegyületnek viszonylag könnyű a celluláris toxicitása és könnyen kezelhető. A fúziót az alábbiak szerint hajthatjuk végre.
A lépsejteket és a mielómasejteket alaposan megmossuk táptalajjal vagy foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS), majd összekeverjük a sejteket olyan arányban, hogy kb. 5-10 lépsejtre egy mielómasejt jusson, majd az elegyet centrifugálással szétválasztjuk. A felülúszót elöntjük, majd a sejteket tartalmazó üledéket alaposan összetörjük, majd rázás közben polietilénglikol oldatot (PEG, molekulatömeg: 1000-4000) adunk hozzá. Néhány perc elteltével a sejteket centrifugálással ülepítjük. A felülúszót ismét elöntjük, majd a leülepedett sejteket megfelelő mennyiségű 5-10 ng/ml egér-IL-6-ot tartalmazó komplett GIT-táptalajban felszuszpendáljuk, majd a sejtszuszpenziót egy tenyésztőlemez mélyületeibe juttatjuk. Amikor a sejtnövekedés már valamennyi mélyületben megindult, a táptalajt HAT-63• · · · · · • · · ’· «ν ·*· ·♦ ·· « táptalajra cseréljük (5-10 ng/ml egér-IL-6-ot, 10^-10-3 mól/l hipoxantint, 10'8-10'7 mól/l aminopterint, valamint ÍO^-IO4 mól/l timidint tartalmazó komplett GIT-táptalaj).
(ej A hibridóma-seitcsoportok szelektálása
A tenyésztőlemezt 10-14 napon keresztül 35-40 °C-on CO2inkubátorban inkubáljuk. Az inkubálás ideje alatt mindegy 1-3 napban a táptalaj mennyisége felének megfelelő mennyiségű friss 6 táptalajt adunk a mélyületekbe.
A mielómasejtek egy 8-azaguanin-rezisztens sejtvonalból származnak, és sem a mielómasejtek, sem azok a hibridómák, melyek csak mielómasejtekböl keletkeztek nem képesek életben maradni HATtáptalajban. Azok a hibridómák azonban, melyek két ellenanyagtermelő sejtből keletkeztek, valamint az egy ellenanyagtermelő sejtből és egy mielómasejtből keletkezett hibridómák képesek életben maradni. Azok a hibridómasejtek azonban, melyek csak ellenanyagtermelő-sejtekből keletkeztek, nem halhatatlanok, ezért azokat a hibridómákat, melyek egy mielóma- és ellenanyagtermelő-sejtből keletkeztek oly módon szelektálhatjuk, hogy HAT-táptalajban tenyésztjük a sejtfúzió eredményeként keletkezett sejteket.
Azokban a mélyületekben, melyekben a hibridómasejtek kolóniákat kezdenek alakítani, a HAT-táptalajt HT-táptalajra cseréljük (a HTtáptalajból a HT-táptalajban meglévő aminopterin hiányzik). Ezután a tenyészet felülúszójának egy részét kivesszük, és meghatározzuk benne az antiKM31-7 ellenanyag-titert, például ELISA-eljárás alkalmazásával.
-64A fenti eljárást azzal a feltételezéssel ismertettük, hogy 8-azaguanin rezisztens sejtvonalat alkalmazunk, de alkalmazhatunk egyéb sejtvonalakat is, feltéve, hogy lehetővé teszik a hibridómák szelektálását. Amennyiben más sejtvonalat alkalmazunk, természetesen az alkalmazandó táptalaj is más lesz.
ffi A hibridómasejtek klónozása
Az (e) lépés szerint előállított hibridómákat, melyekről megállapítottuk, hogy anti-KM31-7-jelű specifikus ellenanyagokat termelnek, klónozás céljából új tenyésztőlemezre visszük át. Különböző klónozási eljárásokat alkalmazhatunk, például a seeding-eljárást (eszerint az eljárás szerint a hibridóma-sejtszuszpenziót határhígításnak vetjük alá, oly módon, hogy minden egyes mélyület csak egy hibridóma-sejtet tartalmazzon), a “lágy agar” eljárást (amely szerint a mag kolóniákat lágy agar táptalajban vesszük fel), a mikromanipulátoros seeding-eljárást, (amely szerint az egyes sejteket mikromanipulátorral választjuk külön), valamint a sejtosztályozó berendezéssel végrehajtott klónozási eljárást (amely szerint az egyes sejteket a sejtosztályozó berendezés választja szét). Egyszerűsége miatt a legelterjedtebben a határhígításos eljárást alkalmazzák.
A klónozási eljárást például a határhígításos klónozást 2-4-szer megismételjük mindazon mélyületek esetében, melyekben az ellenanyag aktivitást folyamatosan észleljük. A találmány szerinti megoldás alkalmazásakor olyan hibridóma-sejtvonalat választunk, amely konzisztens módon termel anti-KM31 -7-ellenanyagokat.
(g) Monoklonális ellenanyagok előállítása hibridómaseitek tenyésztésével
Az (f) pont szerint izolált kiválasztott hibridóma-sejteket általánosan használt táptalajban tenyésztjük. A nagyméretű tenyésztést rotációs rázógép alkalmazásával hajtjuk végre, vagy nagy tenyésztőlombikban vagy spinner-ben. Az anti-KM31-7 monoklonális ellenanyagokat oly módon állíthatjuk elő, hogy a tenyészet felülúszóját gélszűrésnek vetjük alá, majd az IgG-frakciót tisztítjuk és kinyerjük. Az elmondottakon túl a hibridómasejteket tenyészthetjük azonos törzsből származó egér hasüregében is (például a fent említett BALB/c-egérben) vagy például Nu/Nu-egérben. A jelen bekezdésben leírt eljárási lépést egyszerűen végrehajthatjuk ellenanyag előállító reagenskészlet alkalmazásával (például: MAbTrap-GII, Pharmacia).
(h) A monoklonális ellenanyagok azonosítása
A (g) pont szerint nyert monoklonális ellenanyagok izotípusának és alosztályának meghatározását az alábbiak szerint végezhetjük. Alkalmazható azonosítási módszerek például az Ouchterlony-eljárás, az ELISA és a RIA. Bár az Ouchterlany-eljárás egyszerű, van egy hátránya, miszerint a nagyon híg monoklonális ellenanyag oldatokat meghatározás előtt be kell töményíteni.
Amennyiben ELISA vagy RIA eljárást alkalmazunk, a tenyészet felülúszóját töményítés nélkül szilárd fázissal érintkeztetjük, melyre előzőleg antigént abszorbeáltunk. Az ellenanyag alosztályát oly módon határozhatjuk meg, hogy a szilárd fázist a különböző IgG-alosztályokra specifikus második ellenanyagokkal érintkeztetjük. Eljárhatunk úgy is, hogy izotípusmeghatározó reagenskészletet alkalmazunk (például az egér monoklonális ellenanyag izotípus-meghatározó Amersham reagenskészletet). Az oldat fe-66hérjekoncentrációjának meghatározására a Folin-Lowry-eljárást alkalmazhatjuk, vagy mérhetjük az oldat abszorbanciáját 280 nm-en [1,4 (OD280) = 1 mg/ml immunoglobilin).
A leíráshoz csatolt példákban bemutatott MKM150-2-jelü hibridómasejtvonalból izolált monoklonális ellenanyag IgG-izotípusúnak bizonyult, és kimutattuk, hogy az IgGl-alosztályba tartozik.
A találmány szerinti megoldás alkalmazásával izolált ellenanyag erősen specifikus a KM31-7-fehérjére. Továbbá mivel az említett hibridóma sejtvonal konzisztensen és nagy mennyiségben termel tenyésztése során monoklonális ellenanyagot, a sejtvonalat felhasználhatjuk KM31-7-fehérje izolálására és tisztítására, az említett monoklonális ellenanyaggal végrehajtott immunkicsapásos eljárás alkalmazásával, és az említett monoklonális ellenanyagokkal végrehajtott KM31-7-fehérje izolálási és tisztítási eljárások, melyeket antigén ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunkicsapásos módszerrel hajtanak végre, a találmány tárgyát képezik.
A találmány szerinti megoldást az alábbiakban a bemutatott példákon keresztül kívánjuk részletesebben szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk. A példákban ismertetett kísérletekben valamennyi alkalmazott oldat vizes oldat, és amennyiben egy oldat koncentrációját százalékosan adjuk meg, ez a százalék vegyesszázalékot jelent, kivéve, ha kifejezetten másként adjuk meg. Amennyiben valamely alkalmazott eljárást nem írunk le részletesen, az eljárás leírása megtalálható a következő kézikönyvben: Molecular Cloning - A Laboratory Manual [második kiadás, szerkesztők: Sambrook, J., Fritsch, E. F. és Maniatis, T. (1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press]. A különféle oldatok és egyéb
-67táptalajok előállítási eljárásait a táptalajok cím alatt adjuk meg, amennyiben azok leírását a példákban nem ismertetjük. Azokat az eljárásokat, melyeket valamely példában nem írunk le részletesen, az előző példákban található leírások alapján kell értelmezni.
A) Kiindulási anyag a CYVV-vírus izolálásához
Fagyasztva tárolt lóhere sárga erezettségét okozó vírussal fertőzött levelet (30 számú CYVV-izolátum: Uyeda, I. és mtsai.: Ann. Phytopath. Soc. Japan 41: 192 (1975)] 10 térfogat beoltó pufferben megőröltünk.
A CYVV-vírus fenntartására olyan Wase-Soramame változathoz tartozó Vicia fabat alkalmaztunk, amely második felnőtt levelet hozott. Egy felnőtt levelet bepermeteztünk karborundummal (400 mesh), majd a levelet üvegspatula alkalmazásával a fentiek szerint előállított folyadékkal beoltottuk. A beoltás után kb. 8-10 nappal a beoltott levél hálózatszerű mozaikos állapotba került. Ezután a levelet eltávolítottuk és CYVV-vírust tartalmazó kiindulási anyagként használtuk.
B) Vírusrészecskék tisztítása
Az A) pont szerint izolált leveleket 3 térfogat extrakciós puffért tartalmazó darálóban felaprítottuk. A darálást követően a leveleket mozsárban mozsártőrővel tovább aprítottuk. A kapott preparátumot szobahőmérsékleten egy órán keresztül lassan kevertettük, a rozsdamentes acél keverőfejjel ellátott motoros homogenizátor alkalmazásával. A kapott folyadékot azután kettős gézrétegen keresztülpréseltük.
Az alábbiakban leírt eljárásokat kivétel nélkül 4 °C-on hajtottuk végre.
-68A nyers folyadékpreparátumot fél térfogat kloroformmal kevertük össze, és a keveréket Waring-ke verő vei elkevertük, majd a preparátumot 15 percig 6000 g-vel centrifugáltuk. A centrifugálást követően a vizes fázist kinyertük, majd 4 térfogat-% végkoncentrációig polietilén glikolt (PEG-6000-t adtunk hozzá).
A kapott reakcióelegyet jég fölött kevertettük egy órán át, majd újabb egy órán keresztül jégen állni hagytuk. A kapott folyadékot 15 percig 6000 g-vel centrifugáltuk, majd az üledéket vírustartalmú frakcióként kinyertük. Az üledéket 0,5 mól/l karbamidot tartalmazó 10 mmól/1 foszfát puffer (pH=7,4) 50 ml-ében felszuszpendáltuk, majd az így kapott preparátumot 5 percen keresztül nagy fordulatszámmal kevertettük, majd ezután a preparátumot 10 percig 3000 g-vel centrifugáltuk. A vizes fázist ezután 4 °C-on, 30.000 ford/perc-cel, 90 percig ultracentrifugáltuk, Hitachi RP-30 rotorban. A kapott üledéket vírustartalmú frakcióként kinyertük. Az üledéket 1 % triton XI00 tartalmú 10 mmól/l-es foszfátpufferben (pH=7,4) felszuszpendáltuk, majd a szuszpenziót 4 °C-on 8000 g-vel egy percig centrifugáltuk. A kapott felülúszót egy 10-40 %-os lépcsős szacharóz sűrűséggradiens tartalmazó oszlop alakú centrifuga csőre rétegeztük (40 %: 10 ml, 30 %: 10 ml, 20 %: 10 ml, 10 %: 10 ml); az oszlop-centrifuga csövet az alkalmazás előtt egy éjszakán át 4 °C-on állni hagytuk, a gradienst 10 mmól/l-es foszfát pufferben (pH=7,4) készítettük. Miután a felülúszót a cső tetejére rétegeztük, azt 120 percig 4 °C-on 23.000 ford/perc-cel ultracentrifugáltuk, Hitachi PRS25-rotorban.
Az ultracentrifugálás befejeztével a szacharóz sűrűséggradienst tartalmazó oszlopcentrifúga csövet egy frakcionáló berendezés (Model UA-2,
-69ISCO Co.) alkalmazásával frakcionáltuk, a frakciónál ó berendezés OD260nmdetektorral volt felszerelve. Azokat a frakciókat tekintettük vírustartalmúaknak, melyek sűrűsége 20-30 % körüli volt és OD260nm-nél abszorpciót mutattak.
A kinyert vírusfrakciót 10 mmól/l-es foszfátpufferrel (pH=7,4) 2szeresére hígítottuk, majd 4 °C-on 90 percig 40.000 ford/perc-cel ultracentrifugáltuk Hitachi RP-65-rotorban. A kapott üledéket 10 mmól/l-es foszfátpufferben (pH=7,4) felszuszpendáltuk, és így tisztított vírusszuszpenziót kaptunk.
C) Virális RNS izolálása
A CYVV genomi RNS-e kb. 10.000 bázisból áll, és 3'-végén poliadenilálva van. A vírus RNS hossza és poliadeniláltsága következtében nehéz a hagyományos fenol/SDS-eljárás vagy a guanidium-tiocianátos eljárás alkalmazásával teljes hosszúságú, ép virális RNS-t izolálni. Az elmondottak miatt a virális RNS-t a lúgos sűrűséggradiens centriíugálásos eljárás alkalmazásával izoláltuk.
500 pl vírusszuszpenzióhoz (amely számításaink szerint 2 mg vírus tartalmazott, a számítást úgy végeztük, hogy az 1 mg/ml-es vírusszuszpenzió elnyelését OD260nm=2,5-nek tekintettük) 500 pl degradációs oldatot adtunk, majd az elegyet 20 percen keresztül szobahőmérsékleten állni hagytuk. Az elegyet ezután egy lx SSC-ben készített 0-33,4 %-os szacharóz sűrűséggradiens oszlop-centrifuga-cső tetejére rétegeztük (33,4 %:1,4 ml,
30,4 %: 7,6 ml, 27 %: 7,0 ml, 23 %: 6,3 ml, 18,7 %: 5 ml, 12%:3,2 ml, 0 %:2,7 ml; az oszlopot felhasználás előtt egy éjszakán át 4 °C-on állni hagytuk). A felülrétegzéshez használt puffer szintén lx SSC volt, majd a
-70felülrétegzett centrifugacsövet Hitachi RPS-27-rotorban 9 órán át 15 °C-on 24.000 ford/perc-cel ultracentrifugáltuk. A centrifugálás befejeztével a centrifugacső alját kilukasztottuk, és ily módon frakcionáltuk az szacharóz sűrűséggradienst. A virális genomi RNS-t tartalmazó frakciót a frakció abszorbanciájának 260 nm-en történő meghatározásával azonosítottuk. A virális genomi RNS a kb. 20-30 % szacharózt tartalmazó frakciókba ülepedett. Kb. 25 pg genomi RNS-t kaptunk.
D) A virális cDNS szintézise
A cDNS-t a C) pont szerint előállított genomi RNS-t templátként alkalmazva szintetizáltuk. A cDNS-szintézist a cDNA Synthesis System Plus reagenskészlet (Amersham) alkalmazásával hajtottuk végre. A kapott cDNS-t Sephadex-G50 (bejegyzett védjegy, Pharmacia) oszlopon tisztítottuk és a tisztított cDNS-láncok 5'-végére terminális dezoxinukleotid transzferáz és dCTP alkalmazásával poli-C-láncot szintetizáltunk (a Bethesda Research Laboratories által forgalmazott enzimet használtunk). Egy pBR322- (Bethesda Research Laboratories) preparátumot állítottunk elő oly módon, hogy a plazmidot Pstl-enzimmel megemésztettük, majd a linearizált plazmid mindkét végére 3'-poli-G-láncot építettünk. Az előállított cDNS-t ezután összekevertük ezzel a preparátummal, majd a keveréket 5 percig 65 °C-on tartottuk, amit két órás 57 °C-os inkubáció követett. A kapott keveréket fokozatosan engedtük lehűlni, hogy lehetővé tegyük, hogy a cDNS poli-C-végződései a plazmid poli-G-végződéseihez hibridizálódjanak.
E) Transzformálás
A D) pont szerint előállított plazmiddal Escherichia coli HB-101sejteket transzformáltunk a kálcium-kloridos eljárás alkalmazásával. Folyé-71 kony LB-táptalajban egy éjszakán át történő rázatással inokulum tenyészetet állítottunk elő E. coli ΗΒ-101-sejtekből. Az inokulum tenyészet 0,5 ml-ével 50 ml friss folyékony LB-táptalajt oltottunk be, és a tenyészetet 37 °C-on rázatással OD5 $0^^0,5 értékig tenyésztettük. A baktériumsejteket ezután 4 °C-on 5 perc alatt 5000 g-vel lecentrifugáltuk, és a kapott üledéket óvatosan felszuszpendáltuk 25 ml Tris-kálcium-pufferben, majd a szuszpenziót 5 percig jégen állni hagytuk. A kapott szuszpenziót 4000 g-vel 4 percig centrifugáltuk, majd az üledéket 5 ml Tris-kálcium-pufferben felszuszpendáltuk, és két órán keresztül jégen állni hagytuk, és ily módon kompetens sejteket kaptunk.
A D) pont szerint előállított plazmid 100 μΙ-ét 200 μΐ fentiek szerint előállított kompetens sejtek 200 μΙ-éhez adtuk, majd az elegyet 30 percig jégen állni hagytuk. Ezután az elegyet 2 percig 42 °C-on tartottuk, majd a sejtekhez 1 ml folyékony LB-táptalajt adtunk, és a kapott elegyet 37 °C-on egy órán át rázatva tenyésztettük. A kapott sejtszuszpenziót 12,5 pg/ml tetraciklin-hidrokloridot és 1,5 tömeg-% agart tartalmazó szilárd LBtáptalajra széleztettük. A táptalajt tartalmazó lemezeket ezután egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk, és így cDNS-klónkönyvtárat kaptunk.
F) Ap pNS5I-plazmid előállítása és szelektálása
A cDNS-tartalmú rekombináns plazmidkönyvtárat a lúgos SDS-es eljárás alkalmazásával vizsgáltuk. Az alábbiakban részletesen ismertetjük az alkalmazott eljárást.
ml folyékony LB-táptalajt beoltottunk tetraciklin rezisztens amplicillin szenzitív kiónokkal, melyeket az E) pont szerint előállított szilárd táptalajt tartalmazó lemezekről nyertünk, és a kapott sejtszuszpenziót egy ·
-72éjszakán át 37 °C-on rázatva tenyésztettük. A sejteket 10.000 g-vel történő centrifugálással ülepítettük ki, majd 16 μΐ lizozim oldatot (10 pg/ml) tartalmazó lízispufferben vettük fel. 5 másodperces erős rázatással szuszpenziót állítottunk elő, majd a szuszpenziót 5 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk. Ezután 160 μΐ lúgos SDS-oldatot adtunk a szuszpenzióhoz, majd a kapott elegyet először oly módon kevertük össze, hogy a centrifugacsövet néhányszor megfordítottuk, majd a csöveket 5 percig jégen állni hagytuk. A keverékhez ezután 120 μΐ 5 m/l-es káliumacetátot adtunk, amit ismételten 5 perces jégen történő inkubálás követett. Az elegyet ezután 5 percig 4 °C-on 10.000 g-vel centrifugáltuk.
A centrifugálás után a felülúszót tiszta csőbe vittük át, majd a csőbe 250 μΐ izopropanolt adtunk, és a kapott elegyet 30 percig jégen állni hagytuk. A keveréket ezután ismét 5 percig centrifugáltuk, 10.000 g-vel, majd a kapott üledéke 100 μΐ TE-pufferben (10 mmól/1 Tris, 1 mmól/1 EDTA, pH=8,0) feloldottuk. Ezután fenolos extrakciót hajtottunk végre oly módon, hogy a csövekhez egyenlő térfogatú fenol/kloroform/isoamil alkohol (25/24/1) elegyet adtunk, majd a kapott reakcióelegyet alaposan összekevertük, és azután 5 percig 4 °C-on 10.000 g-vel centrifugáltuk (a továbbiakban ezt az eljárást egyszerűen fenolos extrakciónak fogjuk nevezni).
A centrifugálás után kapott vizes fázis 100 μΐ-ét összekevertük 10 μΐ 3 m/l-es nátriumacetáttal (pH=5,2), valamint 250 μΐ etanollal, majd a kapott elegyet 10 percig szárazjégen állni hagytuk, majd az elegyet 5 percig 10.000 g-vel centrifugáltuk, majd a kiülepedett nukleinsav frakciót kinyertük (ezt az eljárást a továbbiakban egyszerűen etanolos kicsapásnak fogjuk nevezni és
-73 az ilyen eljárásokban a felülúszókból, az etanolból és a nátriumacetát oldatból azonos arányokat használunk).
A kapott csapadékot 50 μΐ RN-áz-A-oldatban (10 pg/ml, TEpufferben készítve) vettük fel, majd a kapott elegyet 37 °C-on egy óráig inkubáltuk. Ezután az inkubált szuszpenzióhoz 30 μΐ polietilén glikol oldatot (20 % PEG 8000, 2,5 mól/1 nátrium-kloridban oldva) adtunk, és az elegyet egy órán át jégen állni hagytuk. Az elegyet ezután 5 percig 4 °C-on 10.000 g-vel centrifugáltuk, majd a DNS-frakciót csapadék formájában kinyertük, majd kétszer etanolos kicsapást hajtottunk végre, és ily módon tisztított plazmid-DNS-t kaptunk.
A tisztított plazmid-DNS-t Pstl-restrikciós enzimmel hasítottuk, majd TBE-pufferben 1 %-os agaróz gélben elektroforetizáltuk. Az elektroforézist követően a gélt Southem-blot hibridizációnak vetettük alá [Southem, E.M.: J. Mól. Bioi. 89, 503 (1975)]. Részletezve: a gélt 40 percig denaturáló oldatban rázattuk, majd semlegesítő pufferbe vittük át, ahol újabb két órán át rázattuk.
A rázatás után a gélt 20-szor SSC-puffert tartalmazó poliuretán-észter szivacsra vittük át abból a célból, hogy a gélben levő DNS-t a szivacsra helyezett Hybond-N-membrándarabra (bejegyzett védjegy, Amersham) transzferáljuk. Miután a DNS áttranszferálódott a Hybond-Nmembrándarabra, a membránt 10 percig lx SSC-pufferben rázattuk, majd a membránt egy órán át 80 °C-on szárítottuk, a DNS fixálása céljából. A membrándarabot ezután prehibridizációs oldatba [5 ml formamid, 1 ml 50 x Denhardt-oldat, 2,5 ml 20x SSC, 10 μΐ élesztő-tRNS (50 mg/ml), 100 μΐ 10
-74%-os SDS és 1,3 ml kétszer desztillált víz] helyeztük, majd három órán át 50 °C-on inkubáltuk.
Hibridizációs próbaként Mg2+-ionokkal hasított genomi RNS-t alkalmaztunk. Részletezve: a fenti C) pont alapján előállított 16 μΐ oldathoz, amely 1 μΐ virális RNS-t tartalmazott, 4 μΐ 5x denaturáló puffért adtunk, majd az elegyet három órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk. Az etanolos kicsapás után 5 μΐ denaturált RNS-oldatot kaptunk, amely 100 ng RNS-t tartalmazott (a számításhoz azt vettük alapul, hogy 1 ml/ml RNS-oldat OD26o értéke: 20), az etanolos kicsapás után az RNS-t 5 percig 70 °C-on oldottuk, majd az oldatot jégen lehütöttük.
A denaturált RNS-oldathoz ezután 4 μΐ 5x jelölő puffért, 1 μΐ 3,3 ml/1 [y-32P]ATP-t (1,37 MBq), valamint 10 μΐ kétszer desztillált vizet adtunk. Az elegyhez ezután 20 E T4 polinukleotid kináz oldatot adtunk (Takara Shuzo), ezt pedig 30 perces 37 °C-os inkubálás követte. A be nem épült [y-32P]ATPt ötször megismételt etanolos kicsapással távolítottak el.
Az ily módon előállított jelölt próbát ezután 5,5 x 105 cmp/ml végkoncentrációban hibridizációs oldathoz [5 ml formamid, 2 ml 50 %-os dextrán-szulfát, 200 μΐ 50x Denhardt-oldat, 2,5 ml 20x SSC, 50 μΐ élesztőtRNS (50 mg/ml), 100 μΐ 10 % SDS, 1,3 ml kétszer desztillált víz] adtuk, majd a fentiek szerint előállított Hybond-N-membránt ebbe a hibridizációs oldatba helyeztük, majd 50 °C-on egy éjszakán keresztül történő inkubációval hibridizáltuk. A hibridizációt követően a membránt 60 °C-on 0,1 % SDSt tartalmazó 2x SSC-ben történő rázatás útján mostuk. Ezt az eljárást 2-szer megismételtük, majd a Hybond-N-membránt tovább mostuk 0,lx SSC-vel,
-75 ami 0,1 % SDS-t tartalmazott, egy órán keresztül szobahőmérsékleten végzett rázatás útján, majd a membránt megszárítottuk.
A membránról készített autoradiogramon egy plazmidot azonosítottunk, melyet pNS51-nek neveztünk el, és amely tartalmazott egy kb. 6500 bázispár hosszúságú inszertált fragmenst, amely képes volt hibridizálódni virális genomi RNS-sel.
G) A pNS51-plazmid inszertjének szekvenciameghatározása
A pNS51-plazmidba klónozott cDNS-ről az alábbiakban felsorolt restrikciós enzimek mindegyikével végzett emésztés útján restrikciós térképet készítettünk: BamHI, EcoRI, HindlII, KpnI, Ncol, PstI, Sáli, Sphl, SacI, Smal, Xhol, Xbal, valamint a felsoroltak közül kettő-kettő kombinációja. Az eredményül kapott restrikciós térképet az első ábrán mutatjuk be. A restrikciós emésztéseket követően a Sall-gyel és Pstl-gyel végzett emésztés után kapott restrikciós fragmensek mindegyikét M13mpl9-RF-DNS-be klónoztuk. Ezt úgy végeztük, hogy a pNS51-plazmidot PstI és Sáli restrikciós enzimekkel megemésztettük, majd a hasítási termékeket 5 %-os poliakrilamid-elektroforézis gélben megfuttattuk, lx TBE-pufferben. Az elektroforézis után a gélt 1 pg/ml-es etidium-bromid oldattal festettük, ily módon lehetővé téve a DNS-csíkok azonosítását ultraibolya fénnyel történő megvilágítás után. A DNS-csíkokat tartalmazó darabokat ezután borotva alkalmazásával kivágtuk a gélből, majd egy elektroelúciós berendezésben (Amicon) elektroelúciónak vetettük alá a kivágott darabokat, az elektroelúciós berendezésben Centricon-30-csöveket (Amicon) alkalmaztunk.
-76Ezután az izolált fragmenseket DNS-ligációs reagenskészlet (Takara
Shuzo) alkalmazásával M13mpl9-vektorba inszertáltuk, melyet előzőleg megemésztettünk vagy csak Sall-gyel vagy mind Pstl-gyel, mind pedig Sallgyel, és emésztés után a vektort alkalikus foszfatázzal kezeltük.
A kapott rekombináns M13mpl9-RF-DNS-t (melyet úgy alakítottunk ki, hogy a kívánt DNS-fragmenseket T4 DNS ligáz alkalmazásával inszertáltuk be), E. coli JM-109-sejtekbe juttattuk, a rubídium-kloridos eljárás alkalmazásával. Az agar-tartalmú M9-minimáltáptalajon tenyésztett JM109-tenyészetből különálló kiónokat izoláltunk, melyekkel folyékony SOBtáptalajt oltottunk be, és a táptalajt egy éjszakán át rázattuk. Az éjszaka elteltével a tenyészet 0,6 ml-ét 50 ml friss folyékony SOB-táptalaj beoltására használtuk, majd a beoltott táptalajt 37 °C-on rázattuk, ameddig az OD6oonm érték elérte a 0,5-t. A sejteket ezután 4 °C-on 10 percig tartó 5000 g-vel végzett centrifugálás útján nyertük ki, majd a sejteket tartalmazó üledéket óvatosan felszuszpendáltuk 25 ml TFB1-pufferben, majd a szuszpenziót 20 percen keresztül jégen állni hagytuk.
A szuszpenziót ezután 3000 g-vel 5 percig újból centrifugáltuk, majd az üledéket 2 ml TFB2-pufferben felszuszpendáltuk, majd jégen állni hagytuk 20 percig, és így kompetens sejteket kaptunk.
A fentiek szerint előállított M13mpl9-RF-DNS 1-10 μΐ-ét ligálás után 100 μΐ kompetens sejthez adtuk, majd a sejteket egy órán keresztül jégen állni hagytuk. Ezután az elegyet 1,5 percig 42 °C-on tartottuk, majd 500 μΐ folyékony SOC-táptalajt adtunk a reakcióelegyhez, és ezután a transzformált sejteket 37 °C-on történő rázatással további egy órán keresztül tenyésztettük.
-77Ezután a tenyészetekhez rázás közben 0,8 % agart, 30 μΐ 100 ml/1 IPTGT-, 10 μΐ 10 % 5-bróm-4-klór-3-indolil-B-galaktozidot (X-gal), valamint 100 μΐ indikátor baktériumot (JM-109-sejtek egy éjszakás tenyészete, melyet 2x YT-táptalajban, 37 °C-on történő rázatással állítottunk elő) tartalmazó 2x YT-táptalajt adtunk, majd az elegyet szilárd, 1,2 %-agart tartalmazó 2x YT-táptalajra öntöttük. Miután az elegy megszilárdult, egy éjszakán át 37 °C-on tároltuk a tenyésztőlemezeket. A rekombináns fágok ezután fehér plakkokként váltak láthatóvá.
Minden kapott fehér plakkot indikátorbaktériumokat tartalmazó (1/100 mennyiségben) folyékony 2x YT-táptalajba oltottunk, majd a beoltott tenyészeteket egy éjszakán keresztül 37 °C-on rázatva tenyésztettük. A tenyészeteket ezután egy percig 10.000 g-vel centrifugáltuk, és a felülúszót ezután lefagyasztottuk, vagy 4 °C-on tartottuk, és fág-oldatként alkalmaztuk, a sejteket tartalmazó üledéket pedig a szokásos plazmidelőállítási eljárásnak vetettük alá, és ily módon kettősszálú RF-DNS-t (ezután csak RF-DNS-nek nevezzük) állítottunk elő, ami a fág replikációs intermediere. Az inszertált fragmens jelenlétéről restrikciós emésztéssel győződtünk meg.
A fentiek szerint előállítottuk az 51SS/M13mpl9-fágot (azaz egy olyan M13mpl9-fágot, amely tartalmazott egy Sall/Sall-inszertet, és ez az inszert az 51PS5'/M13mpl9-DNS-ből származik, amely tartalmazott egy Pstl/Sall-fragmenst, amely a CYVV-genom 5'-régiójából származott). A kapott fág-klónokból RF-DNS-t tisztítottunk, a lúgos SDS-ses eljárást követően cézium-klorid sűrüséggradiens ultracentrifugálással, szakember számára ismert eljárások alkalmazásával.
·♦·»
-78A kapott tisztított DNS-t először BamH-I-gyel emésztettük, és ily módon ragadós 5'-végeket kaptunk, majd tovább emésztettük a DNS-t Kpnlgyel, és ily módon ragadós 3'-véget alakítottunk ki. Ezután a ragadós 5'végről minden egyes cDNS-t tartalmazó linearizált plazmid esetén egyesével eltávolítottuk a túlnyúló bázisokat, az Erase-a-base reagenskészlet (Promega) alkalmazásával, exonukleáz hozzáadása útján. Az exonukleázos kezelést 10 percen keresztül végeztük, és különböző időpontokban a reakcióelegyekből mintát vettünk, az első és tizedik perc között. Mivel a linearizált vektor 3'-vége ragadós vég, az exonukleáz erről az oldalról nem emészti a vektort. A különböző időkben vett mintákat ezután Sl-nukleáz alkalmazásával tompavégüvé tettük, majd T4 DNS ligáz alkalmazásával cirkuláris formájúvá ligáltuk.
A kapott cirkuláris rekombináns M13mpl9-RF-DNS-t E. coli JM109-sejtekbe juttattuk, a fent ismertetett rubídium-kloridos eljárás alkalmazásával. Az ott elmondottaknak megfelelően a különböző hosszúságú cDNS-inszerteket tartalmazó rekombináns fágok fehér plakkokat képeztek.
Szakember számára ismert eljárások alapján elvégeztük a különböző hosszúságú inszerteket tartalmazó rekombináns fágok szubklónozását, majd a szubklónokból RF-DNS-t izoláltunk. A kiválasztott kiónokat egymástól elkülönítve tenyésztettük, oly módon hogy indikátor E. coli sejteket tartalmazó 2x YT-táptalajt oldottunk le a kiónokkal, majd a tenyésztést 37 °C-on egy éjszakán át rázatva végeztük. Ezután minden tenyészetből 1,5 ml-t 4 Χοή 5 percen keresztül 10.000 g-vel centrifugáltunk. A felülúszó 1 ml-ét ezután új centrifugacsőbe vittük át, és 250 μΐ 20 %-os vizes polietilén glikol oldatot (20 % PEG-8000, 2,5 mól/l nátrium-klorid) adtunk a centrifugacsö·· ·«·
- 79vekhez kevertetés közben, majd a csöveket 30 percig jégen állni hagytuk. A reakcióelegyet ezután 4 °C-on 5 percig 10.000 g-vel centrifugáltuk, majd a kapott üledéket 100 pl TE-pufferben szuszpendáltuk fel. Ezután minden egyes preparátumból egyszálú fág-DNS-t izoláltunk (az egyszálú DNS-t ezentúl SS-DNS-nek fogjuk rövidíteni) fenolos extrakcióval, majd azt követő etanolos kicsapással, ahogy azt korábban már leírtuk.
A szubklónok nukleotidszekvenciájának meghatározását a didezoxiláncterminációs eljárás alkalmazásával határoztuk meg, az izolált SS-DNSeket templátként használva. Részletezve: a radioaktív jelölést [ot-32P]dCTP (220 TBq/mmól Amersham), valamint a 7-daza-sequenase version 2.0 dCTP reagenskészlet (USB) alkalmazásával végeztük. A szekvenáló reakciók termékeit 8 mól/1 karbamidot tartalmazó 5 %-os poliakrilamid elektroforézis gélben futtattuk, füttatópufferként lx TBE-puffert alkalmaztunk. A gélt ezután megszárítottuk, és a nukleotidszekvenciát autoradiográfia után határoztuk meg.
Az 5'-PstI-SalI-fragmens és a pN51 M-Sall-Sall-fragmense nukleotidszekvenciájának analízisével 3839 fázis sorrendjét tudtuk meghatározni.
A fentiek szerint meghatározott szekvenciában nyílt leolvasási fázisokat kerestünk (a nyílt leolvasási fázist ezentúl ORF-nek fogjuk rövidíteni), és a vírusgenom szensz (+) szálán egyetlen nyílt leolvasási fázist találtunk. Ezután meghatároztuk az ORF által kódolt polipeptid aminosavsorrendjét. Ezután homológiakeresést hajtottunk végre a GeneBank adatbázisban, mely alapján azt találtuk, hogy a meghatározott polipeptidszekvencia homológ a TEV-HAT-fehérje aminosavsorrendjével.
·· *··♦
-80Ismeretes, hogy az olyan vírusok, mint például a TEV, a szilvahimlövírus, vagy a poliovírus (ez egy állati vírus) érési folyamata egy proteáz hatására megy végbe, és ezek a vírusproteázok általában Gln-Ala, Gin-Ser vagy Gln-Gly peptidkötéseket hasítanak [Willink J. és Van Kammen, A: Arch. Virol. 98, 1 (1988)]. A meghatározott DNS-szekvenciából kikövetkeztetett aminosavsorrendben találtunk három ilyen hasítóhelyet, a CYVV30-vírus burokfehérje hasítóhelyeinek analízise eredményeként [Uyeda, I. és mtsai.: Intervirology 32, 234 (1991)]. Az egyik ilyen hasítóhelytöl kezdődő polipeptidet, melynek szekvenciája a nyílt leolvasási fázis aminosavsorrendjében a 4. Gly-től a 437. Gln-ig tart, CYVV-asejtmagzárvány fehérjeként azonosítottuk.
H) A CYVV-NIa/IL-11 fúziós fehérje előállítása
A G) pont szerint azonosított CYVV-NIa-fehérjét kódoló DNS-t 3'végénél fogva azonos leolvasási fázisban hozzáépítettük a humán interleukin-11-proteint (IL-11) kódoló DNS-szekvenciához, egy kapcsoló szekvencián keresztül, amely Gln-Ala aminosavakat kódolt.
A kialakított fúziós fehérje vonatkozásában a következő kérdésekre kerestünk választ:
először a G) pont szerint azonosított DNS valóban proteolítikus aktivitással rendelkező NIa-fehérjét kódol-e;
másodszor, a kódolt proteáz a feltételezett peptidkötést hasítja-e; harmadszor megnyilvánul-e az NIa-fehérje proteázaktivitása abban az esetben is, hogyha az NIa-fehérje valamely kívánt heterológ fehérjével alkotott fúziós protein része, ugyanúgy, ahogy az megnyilvánul a vírus által fertőzött sejtekben; és • ·· · · ···* ·♦···» · < ·«· «« 9 • · · · · *·· ·· ·· »
-81 negyedszer, a heterológ fehérje, melyet az ilyen fúziós protein hasításával állítottunk elő, megtartja-e integritását, szerkezetét és működőképességét.
Mivel az NIa-fehérje maga is egy prekurzor polipeptidből történő kihasadás útján keletkezik, az NIa-cisztronnak nincs iniciációs kódonja. Éppen ezért szükséges volt az NIa-gén 5'-végére egy iniciációs kódont (ATG) beépíteni. Azt is meg kellett oldani, hogy az NIa-gén 3'-vége azonos leolvasási fázisban kapcsolódjon az IL-11-gén 5'-végéhez. Annak érdekében, hogy ezeket a problémákat megoldjuk, az NIa-gént polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazásával módosítottuk, kihasználva az NIa-gén középső részén található Xhol-hasítóhelyet.
Abból a célból, hogy a kívánt ATG-kódont, valamint az Ncolrestrikciós enzim felismerőhelyét beépítsük [az Ncol hasítóhely alkalmas az NIa-gén 5'-végének (NIa5') klónozására], PCR-láncindító oligonukleotidokat állítottunk elő. Az előállított oligonukleotidok szekvenciája a következő volt: 5'-GTCCATGGGGAAAAGTAAGAGAACA-3' (ezt a láncindítót NSATG-nek jelöljük, szekvenciaazonosító szám: 3), valamint 5'-ACTCTGAGACCGTGCTCGAG-3' (Jele: NSX1, szekvenciaazonosító szám: 4).
A PCR-reakciót az alábbiak szerint végeztük: 1 pg pNS51-DNS-hez 0,8 pl dNTP-oldatot (az oldat mind dATP-re, mind dTTP-re, mind dCTP-re, mind dGTP-re nézve 25 mmól/l-es volt), lOx Taq-puffert (Promega), valamint mindkét láncindító oligonukleotidból 1 pg-ot adtunk, és az elegyet kétszer desztillált vízzel 100 μΙ-re egészítettük ki. A PCR-reakciót lOx Taqpufferben felvett 5 egység DNS-polimeráz hozzáadásával indítottuk. A PCR-ciklus a következő volt: egy perc 92 °C-on, egy perc 37 °C-on, és két ·
• *
-82perc 72 °C-on, a ciklust 20-szor ismételtük, majd egy ízben a következő ciklust hajtottuk végre: egy perc 92 °C, egy perc 37 °C és harminc perc 72 °C.
A kapott amplifikált DNS-t fenolos extrakciónak és etanolos kicsapásnak vetettük alá, majd 5 %-os poliakrilamid elektroforézis gélen futtattuk. Etidium-bromidos festéssel egy DNS-tartalmú csíkot azonosítottunk, és ezt a csíkot kivágtuk a gélből, majd a kivágott géldarabot elektroelúciónak vetettük alá, Centreluter (Amicon) alkalmazásával, amely Centricon-30membránnal (Amicon) volt felszerelve. Az elúció után a kapott DNSfragmenst Centricon-csőben (Amicon) történő centriíugálással (7500 g, 4 °C, 45 perc) töményítettük be. A kapott koncentrált DNS-oldatot fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítottuk.
Külön kísérletben 1 pg pKK3 88-1-plazmid DNS-t (Clonetech) melyben a SacI felismerőhelyet Xhol felismerő helyre cseréltük - Ncol és Xhol restrikciós enzimekkel hasítottunk, majd borjúbél lúgos foszfatázzal (a továbbiakban CIAP-nak rövidítjük, Takara Shuzo) defoszforiláltuk a hasított DNS-t. A kapott DNS-t ligációs reagenskészlet (Takara Shuzo) alkalmazásával 100 ng szintén Ncol-gyel és Xhol-gyel emésztett, fentiek szerint defoszforilált pKK388-l-DNS-sel ligáltuk, majd az így kialakított rekombináns DNS-t E. coli JM-109-sejtekbe klónoztuk. így alakítottuk ki a pKNI5'-jelű plazmidot, amely a pKK388-l-plazmidban található TRCpromótertől 3'-irányban, normális orientációban egy inszertet tartalmazott (2. ábra).
A pCD20-2 plazmid [Kawashima, I. és mtsai.: FEBS L. 283, 199 (1991)] egy IL-11 prekurzor fehérjét (Pre-IL-11) kódoló cDNS-inszertet ···«
-83 tartalmaz, és az EL-11 prekurzor szekréciós szignálszekvenciát is tartalmaz. Ezt a plazmidot BamHI és Apai restrikciós enzimekkel hasítottuk, és ily módon kivágtunk egy olyan régiót, amely tartalmazta mind az IL-11 prekurzor fehérjegénjét (Pre-IL-11), mind pedig az SV40-promótert. Az izolált fragmenst a pBLUESCRIPT-II-SK+ BamHI és Apai helyére ligáltuk, majd a kialakított konstrukciót Xhol és KpnI enzimekkel hasítottuk, és ily módon egy olyan gént állítottunk elő, amely a proteint az érett IL-11 fehérje (Mat-IL-11) N-terminális része nélkül kódolja.
A kapott Mat-IL-11-fragmenst (mely az N-terminális végződést nem tartalmazta) T4-ligáz alkalmazásával pKNI5'-be integráltuk, melyet előzőleg Xhol és KpnI restrikciós enzimekkel hasítottunk, és CIAP-pal is kezeltünk. A kapott konstrukciót pKNI5IL-nek neveztük (3. ábra). Abból a célból, hogy a NIA-fehérje C-terminális végét kódoló szekvenciát a Mat-IL-ll-et kódoló szekvenciához egy Ala-kódonon keresztül, azonos leolvasási fázisban tudjuk kapcsolni, négy különböző PCR-láncindító oligonukleotidot szintetizáltunk:
5'-AGGAAAAGAGTTCCTCGAGC-3' (jele: NSX2 szekvenciaazonosító szám: 5),
5’-AATTGTTCATTCCAAGCACCTGGGCCACCACCTGGC-3’ (jele:
NSJ001P, szekvenciaazonosító szám: 6),
5'-GCCAGGTGGTGGCCCAGGTGCTTGGAATGAACAATT-3' (jele:
NSJ002N, szekvenciaazonosító szám: 7), valamint
5’-TTGTCAGCACACCTGGGAGCTGTAGAGCTC-3', (jele: ILSCAC, szekvenciaazonosító szám: 8).
····
-84Az első PCR-reakciót az NSX2 és NSJ002N-jelű láncindítók alkalmazásával hajtottuk végre, templátként pNS51-DNS-t alkalmazva, és ily módon az inszertnek azonos régióját amplifikáltuk, mely az NIa-fehérje Cterminális végét kódolta (a régió jele: CNI3-régió). Külön kísérletben egy másik PCR-reakciót hajtottunk végre, az NSJ001P és LLSAC-jelű láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, templátként a pNS51-DNS-t használtuk, és ily módon az inszert azon régióját amplifikáltuk, amely az IL-11-peptid N-terminális végződését kódolta (jele: 5'-IL-régió). A PCR-reakciót az alábbi program szerint hajtottuk végre: egy perc 92 °C, egy perc 37 °C és két perc 72 °C, ezt a ciklust 20-szor ismételtük meg, majd a következő ciklust hajtottuk végre egyszer: egy perc 92 °C, egy perc 37 °C, és harminc perc 72 °C. A PCR-reakció termékeit fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítottuk, majd 5 %-os poliakrilamid-gélben elektroforetizáltuk. Azt a gélcsíkot, amely az amplifikált DNS-sávot tartalmazta, kivágtuk a gélből és a DNS-t elektroelúcióval kinyertük a géldarabból, a fent leírt eljárás alkalmazásával. A kísérlet eredményeit a 4. ábra szemlélteti.
A kapott két amplifikált DNS-fragmens tartalmazta az NSJ001P és az NSJ002N-jelű láncindítóknak megfelelő szekvenciákat, azaz a CIN3-DNSíragmens 3'-végi részletét és az 5'-IL-DNS-fragmens 5'-végi részletét, és az említett láncindítók szekvenciája egymással részlegesen homológ. Ily módon ismételt PCR-reakció végrehajtása útján - amelyben láncindítóként az NSX2 és ILSAC-jelű oligonukleotidokat alkalmazzuk, templátként pedig a két előállított amplifikált DNS-fragmenst - lehetőség nyílik arra, hogy olyan gént amplifikáljunk, amely füzionáltatva tartalmazza az említett két gén megfelelő régióit, mivel a láncindítók homológ régiói a PCR-reakció során egymással
-85•· ·» ···« • * · · * ··· 9« · ··* *··* !
hibridizálódnak, ily módon kapcsoló szekvenciaként funkcionálva (5. ábra). Az elmondottak szerint az előállított CIN3- és 5'-IL-DNS-fragmenseket öszszekevertük és kizárólag NSX2 és ILSAC láncindítók alkalmazásával PCRreakciót hajtottunk végre. A PCR-reakciót az alábbi program szerint végeztük: egy perc 92 °C, egy perc 37 °C és két perc 72 °C, 10 ciklus; egy perc 92 °C, egy perc 45 °C és két perc 72 °C, húsz ciklus; egy perc 92 °C, egy perc 55 °C és harminc perc 72 °C, egy ciklus. A PCR-reakció tennékét fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítottuk, majd 5 %-os poliakrilamid gélben elektroforetizáltuk, és ily módon kinyertük a CNI3-IL-DNSfragmenst, amely fúzionálva tartalmazta a CNI3- és az 5'-IL-fragmenseket. A fentiekben ismertetett eljárás vázlatát az 5. ábrán láthatjuk.
Az előállított CNI3-IL-DNS-fragmenst Xhol-enzimmel emésztettük, és a kapott fragmenst T4 DNS ligáz alkalmazásával előzetesen Xholenzimmel hasított és CIAP-pal defoszforilált pKNI5'-plazmidba ligáltuk. Az így kialakított plazmidot E. coli JM-109-sejtekbe klónoztuk. Abból a célból, hogy a CNI3-IL-fragmenst megfelelő orientációban inszertálódva tartalmazó kiónokat izoláljunk, a kapott rekombináns klónokból plazmidokat izoláltunk, majd NSX2 és ELSAC láncindító oligonukleotidok alkalmazásával az izolált plazmid DNS-eket templátként használva PCR-reakciókat hajtottunk végre. Ebben a szelekciós rendszerben csak azokról a plazmidokról keletkezik detektálható amplifikált fragmens, melyek az inszertet a megfelelő orientációban tartalmazzák. Ezzel az eljárással izoláltuk a pKSUN9-jelü plazmidot, amelyben az NIa-fehérje és a Mat-IL-11-protein kódoló szekvenciája azonos leolvasási fázisban, a Gln-Ala hasító helyet kódoló szekvenciarészleten keresztül kapcsolódik (6. ábra).
-86I) Az Ala-IL-11-protein expressziója baktériumseitekben
A pKSUN9-plazmidot hordozó E. coli sejteket (ezeket a sejteket röviden KSUN9-sejteknek nevezzük) 42 pg/ml amplicillint tartalmazó LBtáptalaj 5 ml-ében egy éjszakán át rázatva tenyésztettük, 37 °C-on. A kapott kSUN9 tenyészetekből 2,5 ml-el 250 ml friss LB-táptalajt oltottunk be (a táptalaj azonos mennyiségű amplicillint tartalmazott), majd a tenyészetet 37 °C-on rázattuk, addig, míg az ODőoonm érték elérte az 1,0-át. Amikor az ODöoonm érték elérte az 1,0-át, a tenyészethez 0,1 mmól/1 végkoncentrációig IPTG-t adtunk, majd a tenyészetet 12 órán át tovább rázattuk 28 °C-on.
Ezután egy második tenyészetet állítottunk elő, pontosan a fent leírtak alkalmazásával, azzal a különbséggel, hogy a végső tenyészetet 36 óráig vagy tovább rázattuk 28 °C-on, 1 mmól/1 EPTG-koncentráció jelenlétében, érett IL-11-fehérje (amely N-terminális aminosavként prolint tartalmazott) előállításának céljából.
B Westem-blot eljárás
A Westem-blot eljárást azért hajtottuk végre, hogy eldöntsük, hogy a pKSUN9-plazmid müködőképes-e E. coli-\m&, valamint annak eldöntésére, hogy a létrehozott rekombináns gén expresszálódik-e.
Valamennyi EPTG-vel indukált 12 és 36 órás tenyészetet az alábbiak szerint dolgoztunk fel. A tenyészetek 2 ml-éből 4 °C-on 5 percig tartó 3000 g-vel végzett centrifugálással kiülepítettük a sejteket, és az üledéket 100 pl mmól/l-es nátriumborát pufferben (a pH-t 0,1 mól/1 nátriumhidroxid alkalmazásával 9,0-re állítottuk be) szuszpendáltuk fel. A kapott sejtszuszpenziót szonikátorral kezeltük (“Handysonic UR-20P”, Tomy
Seiko Co.), két percen keresztül 8-as állásban, és ily módon feltártuk a sej-87teket, majd a szuszpenziót 4 °C-on tíz percig 10.000 g-vel centrifugáltuk. Az oldható proteineket tartalmazó felülúszót kinyertük. A felülúszóból ezután 5 μΐ-t 12 %-os SDS-poliakrilamid gélben elektroforetizáltunk, a Laemmli-féle eljárás alkalmazásával [Laemmli, U. K.: Natúré 227, 680 (1970)].
Az elektroforézist követően a gélt transzfer-pufferben (25 mmól/1 Tris, 192 mmól/1 glicin, 20 % metanol) rázattuk öt percig, majd a fehérjéket PVDF-membránra blotoltuk (Trans-Blot Transfer Medium-ban, Bio-Rad Laboratories) Trans-Blot-SD Smi-Dry Transfer Cell alkalmazásával (BioRad Laboratories) 15 V feszültséggel, egy órán keresztül. A biotolt PVDFmembránt PBS-Tw-oldattal mostuk, tíz percen keresztül. A megmosott PVDF-membránt 5 % Skim Milk-et (Snow Brand Milk Products) tartalmazó PBS-Tw-oldatba vittük át, majd ebben az oldatban egy órán keresztül 37 °C-on állni hagytuk, a membrán blokkolása céljából.
A blokkolás befejezése után a PVDF-membránt továbbmostuk PBSTw-oldatban egyszer 10 percig, majd kétszer 5 percig, ezután a membránt PBS-Tw-ben 10.000-szeresre hígított anti-IL-ll-nyúlszérumba helyeztük, majd húsz percen keresztül 37 °C-on inkubáltuk. A PVDF-membránt ezután ismét PBS-Tw-ben mostuk, egyszer 10 percig, majd kétszer 5 percig.
A PVDF-membránt ezután PBS-Tw-pufferrel 5.000-szeresre hígított tormaperoxidázzal jelölt kecskében termeltetett antinyúl-IgGellenanyagoldatban (Amersham) helyeztük, majd húsz percig 37 °C-on inkubáltuk. A PVDF-membránt ezután ismét PBS-Tw-pufferrel mostuk, egyszer 10 percig és négyszer 5 percig.
*· »
-88Ezután a mosási lépés után a PVDF-membránt erősített kemilumineszcencia (ECL) detekciós reagenssel (Amersham) kezeltük, majd a PVDF-membránt röntgenfilmmel érintkeztettük harminc másodperc és öt perc közötti időtartamig, és ily módon az anti-IL-11-ellenanyaggal reagáló csíkok láthatóvá váltak.
A fentiekben ismertetett Westem-blot eljárással kb. 50 kDa molekulatömegnek és kb. 23 kDa molekulatömegnek megfelelő jelzett csíkokat tudtunk detektálni mind a 12 órás, mind pedig a 36 órás tenyészetekből kiindulva. A 23 kDa molekulatömegnek megfelelő csík a kontrollként használt érett EL-11-fehérjével lényegében azonos mobilitásának bizonyult. Elmondhatjuk tehát, hogy a 23 kDa-nál jelentkező jel feltehetően megfelelt az IL-11 fehérjének, amely a Gin-Alá hasítóhelyen hasadt ki az NIa/H-11 fúziós proteinből, az NIa-fehérje proteolítikus aktivitása folytán. Arra következtettünk, hogy a nagyobb molekulatömegnek megfelelő csík (50 kDa) a hasítatlan fúziós proteinnek felelt meg.
A továbbiakban a 12 órás tenyészetből kiindulva nyert 23 kDa molekulatömegű fehérjét 23-kDa-ON-nek fogjuk nevezni, a 36-órás tenyészetből izolált 23 kDa molekulatömegű proteint pedig 23-kDa-36hr-nek.
K) A 23-kDa-ON és a 23-kDa-36hr-proteinek tisztítása
A 23-kDa-ON és 23-kDa-36hr-proteineket abból a célból tisztítottuk, hogy N-terminális aminosavsorrendjüket meghatározzuk. A I) pontban leírtak szerint előállítottunk 250 ml 12-órás és 250 ml 36-órás tenyészetet. Mindkét tenyészetet az alábbiak szerint dolgoztuk fel. A tenyészetet 15 percig 4 °C-on 5000 g-vel centrifugáltuk, majd az üledéket 10 ml 20 mmól/1es borát pufferben (pH=9.0) szuszpendáltuk fel, a sejteket pedig French
-89press berendezéssel és szonikátor alkalmazásával tártuk fel. A lizátumot ezután 30 percig 4 °C-on 15.000 g-vel centrifugáltuk, majd az oldott fehérjefrakciót tartalmazó felülúszót kinyertük.
A kapott oldott fehérjefrakciót gyenge ioncserélő oszlopkromatográfíának vetettük alá, FPLC-berendezés (Pharmacia) alkalmazásával, az alábbi körülmények szerint:
Oszlop: “CM Toyopearl Pack 650 M” (2,2 x 20 cm, Toso)
Elúciós pufferek: A = 10 mmól/l bórsav - nátriumhidroxid (pH=9,0), mmól/l kálium-klorid
B = 10 mmól/l bórsav - nátriumhidroxid (pH=9,0), mmól/l kálium-klorid, 400 mmól/l nátrium-klorid Folyási sebesség: 2,5 ml/perc
Frakciótérfogat: 5 ml/cső
Az A eluens összetételétől a B eluens összetételéig 120 percig tartó lineáris koncentáricó-gradiens alkalmazásával eluáltuk az oszlopot.
A kromatográfia végrehajtása után valamennyi eluált frakciót enzimmel jelzett immunszorbens vizsgálati eljárásnak (ELISA) vetettük alá, az IL11-tartalmú frakciók azonosításának céljából.
Az ELISA eljárást a következők szerint végeztük. Egy 96 mélyületű mikrotiter-tálca (“Maxisoap”, Nunc) minden mélyületébe 1 pg/ml anti-IL-11 egér monoklonális ellenanyagot tartalmazó 100 μΐ 50 ml/l-es nátriumkarbonát puffért (pH=9,6) helyeztünk, majd a lemezt egy órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk. Az inkubálás után minden mélyületet négyszer kimostunk PBS-Tw-oldattal (0,1 % “Tween 20”-at tartalmazó PBS-oldat).
-90 · · · * ···· ··»·»· · · · · · · · • 9 · 9 9
999 99 · « *
A fentiek szerint kapott frakciók mindegyikét PBS-Tw-oldattal 100szorosra hígítottuk, majd a hígított frakciók mindegyikéből 100-100 μΙ-t a mikrotiter-tálca mélyületeibe helyeztünk. A mikrotiter-tálcát ezután egy órán át 37 °C-on inkubáltuk, majd a mélyületeket ismét PBS-Tw-oldattal mostuk, ezután pedig minden egyes mélyületbe 100 μΐ PBS-Tw-oldattal 1 pg/ml-esre hígított anti-IL-llnyúl-IgG-t helyeztünk.
A tálcát ezután egy órán át 37 °C-on tovább inkubáltuk, majd PBSTw-oldattal mostuk. Ezután a tálca minden mélyületébe 100 μΐ PBS-Twoldattal 3000-szeresre hígított, lúgos foszfatázzal jelölt kecske anti-nyúl-IgG ellenanyagot helyeztünk (Gibco Bethesda Research Laboratories). A tálcát ezután ismét egy órán át 37 °C-on inkubáltuk, majd PBS-Tw-oldattal mostuk. Ezután minden mélyületbe 100 μΐ lúgos foszfatáz-szubsztrát oldatot helyeztünk. A tálcát ezután 0,5-1 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd a mélyületek elszíneződésének mértékét 405 nm-en végzett abszorbancia méréssel határoztuk meg, a keresett frakciók azonosítása céljából.
Az FPLC-eljárással nyert azon frakciókat, melyek az ismertetett ELISA-teszt alapján nyúl anti-IL-11-ellenanyaggal reagálónak bizonyultak (19-25. frakció) összeöntöttük, majd 100-szorosra koncentráltuk, Centprep10 (Amicon) alkalmazásával, majd az összeöntött bekeményített frakciókból mintát vettünk és azt 12 %-os SDS-poliakrilamid elektroforézis gélben megfuttattuk, Laemmli eljárása (lásd fent) alkalmazásával. A gélt ezután egy PVDF-membrándarabra elektroblotoltuk, a Westem-blot eljárásnál leírtakhoz hasonló módon, azzal a különbséggel, hogy PVDF-membránként Problot membránt (Applied Biosystems) alkalmaztunk.
-91 A blotolás után a membránt alaposan megmostuk kétszer desztillált vízben, megfestettük Coomassie Brilliant Blue R-250 festékkel, 50 % metanollal festéktelenítettük, majd azt a proteint tartalmazó csíkot, amelyik a Westem-blot eljárás végrehajtásakor az anti-IL-11-ellenanyaggal reagált, a gélből kivágtuk.
A protein N-terminális aminosav sorrendjét proteinszekvenátor (Applied Biosystems) alkalmazásával határoztuk meg. A 23 kDa-ΟΝ preparátum anti-IL-11 -ellenanyaggal reagáló proteincsíkjának N-terminális aminosavsorrendjét a következőnek találtuk: Ala-Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly (szekvenciaazonosító szám: 9).
Az azonosított szekvencia megegyezik az érett IL-11-protein -1+6 aminosavainak sorrendjével. A meghatározott szekvencia alapján arra következtettünk, hogy a 12 órás tenyészetből nyert 23 kDa-molekulatömegű fehérje, amely anti-IL-11-ellenanyaggal reagál: Ala-IL-11. Az is nyilvánvalónak látszott, hogy ez a fehérje úgy keletkezett, hogy az NIa/IL-11 fúziós fehérjét az NIa-fehérje proteolítikus aktivitása a Gin-Alá specifikus hasítóhelyen elhasította.
A 23 kDa-36hr preparátum anti-IL-11-ellenanyaggal reagáló csíkjának N-terminális aminosavsorrendje a következőnek bizonyult: Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro- (szekvenciaazonosító szám: 10).
Ez a szekvencia megegyezik az érett IL-11-protein +1 - +7 aminosavainak sorrendjével. Az eredmények alapján az alábbi következtetéseket vontuk le.
Az IPTG-vel végrehajtott indukciók követően az NIa/IL-11 fúziós fehérje expresszálódott az E. coli sejtekben.
rj t*
Az indukciót követő 12 órás tenyésztés során az NIa/EL-11 fúziós fe-92hérje elhasadt a Gin-Alá peptidkötés mentén, amely az NIa-proteáz aktivitásának specifikus hasítószekvenciája.
Az említett peptidkötés elhasadása után tehát az E. coli sejtek egy extra N-terminális Ala-aminosavat tartalmazó érett EL-11-fehérjét expresszáltak.
Amennyiben a tenyészetet az Ala-EL-11 expressziójának megtörténte után további 24 órán át tenyésztettük, az Ala-EL-11 EL-11 fehérjévé érett, amely folyamat során az Ala-IL-11-proteint N-terminálisáról az alanin aminosav lehasadt.
Az ismertetett eredmények alapján arra következtettünk, hogy a 36órás tenyészetből kinyert 23 kDa-molekulatömegű fehérje az N-terminális prolin aminosavat tartalmazó érett IL-11-fehérje volt.
Elmondhatjuk tehát, hogy lehetséges volt az EL-11-fehérjét Nlafehérjével alkotott fúziós proteinként expresszálni és az NIa-fehérje aktivitása képes volt az Gln-Ala specifikus kapcsolószekvenciát elhasítani, és ily módon Ala-EL-11 keletkezett. Amennyiben a tenyésztést tovább folytattuk, érett EL-11-fehérje keletkezett, amelyről valamely E. coli sejtekben jelenlévő faktor hatására az alanin aminosav lehasadt, és ily módon az N-terminális aminosav prolin lett.
Annak igazolására, hogy az expresszáltatott IL-11 és Ala-IL-11 fehérjék biológiailag aktívak voltak, meghatároztuk adipogenezis inhibíciós faktor (AGIF) aktivitásukat. Azt a tényt, hogy az IL-11-fehérje adipogenézis inhibíciós aktivitással bír, már korábban kimutatták [Kawashima, I. és mtsai.: FEBS L. 283.199 (1991)].
-V'
1' u
L) A 3T3-L1-sejtek adipocitákká válása során fellépő morfológiai változásokat gátló hatások mérése
A találmány szerinti megoldás kidolgozásakor az alábbi eljárás szerint határoztuk meg az AGIF-aktivitást. Az ATCC-től beszerzett 3T3-Ll-jelű embrionális egérfíbroblaszt sejtvonalat alkalmaztuk [Green, H. és Kehinde, O.: Cell 1, 113 (1974)]. A sejteket minden esetben kevert nedves atmoszférában tenyésztettük (mely 10 % CO2-t és 90 % levegőt tartalmazott, 37 °Con, majd A-táptalajban tenyésztettük őket tovább. Az addipogén differenciáció indukcióját Rubin és mtsai. [Rubin, C.S. és mtsai.: J. Bioi. Chem. 253, 7570 (1978)] eljárása alapján hajtottuk végre.
A 3T3-L1-sejteket A-táptalajban szuszpendáltuk fel, 1,0 x 104 sejt/ml sűrűségig, majd a szuszpenzióból mélyületenként 0,5 ml-t egy 48 mélyületű tenyésztőlemezbe helyeztünk (multicluster dish, Coaster), majd a sejteket tenyésztettük. Három nap tenyésztés után a sejtek összefüggő réteget alakítottak ki. A táptalajt ezután friss A-táptalajra cseréltük, majd további két nap tenyésztés után a táptalajt adipogenézis indukciós táptalajra, azaz Btáptalajra cseréltük és ugyanekkor 0,5 ml vizsgálandó mintát is a mélyületekhez adtunk. A táptalajt két naponta friss B-táptalajra és friss vizsgálandó mintára cseréltük le.
A B-táptalaj helyett az elhasználandó táptalajt a különböző mélyületek esetén különböző napoktól kezdve, az első vizsgálandó minta hozzáadását követő 4-7. napon az elhasználandó táptalajt adipocita fenntartó táptalajra, azaz C-táptalajra cseréltük.
A sejteket két napig tartó C-táptalajban történő tenyésztés után 5 % formaldehiddel fixáltuk, a sejtekben és sejtmagokban összegyűlt zsírré-94szecskéket Oil Red 0, majd hematoxilin festékekkel megfestettük. Ezután mikroszkópos felvételt készítettünk, és megszámoltuk a festett zsírrészecskéket tartalmazó sejtmagok és sejtek számát. Az adipogén arányt (AR) az alábbi egyenlet alapján számítottuk:
AR (%) = 100 x zsírrészecskéket felhalmozó sejtek száma össz-sejtmagszám
A sejtek fixálását, valamint az Oil Red 0 és hematoxilin alkalmazásával végrehajtott festést Yoshio Mitomo és Shojiro Takayama eljárása alapján végeztük (Lectures on Clinical Testing, 12. kötet, Pathology (1982), kiadó: Ishiyaku Shuppan].
M) A lipoprotein lipázt gátló aktivitás meghatározása
A meghatározást Beutler és munkatársai eljárása alapján végeztük [Beutler, B. A. és mtsai.: J. Immonol. 135, 3972 (1985)]. A fenti L) pontban leírtak alapján adipogenikusan differenciált 3T3-L1-sejteket állítunk elő, a fent ismertetett eljárásból annyiban térünk el, hogy az adipocitákká váláshoz vezető differenciálódás indukálásával egyidejűleg vizsgálandó mintát nem adunk a mélyületekbe.
Ehelyett a vizsgálandó mintákat a friss C-táptalajjal egyidejűleg adjuk a mélyületekhez, majd a sejteket további 18 órán át tenyésztjük.
Ezután a táptalajt eltávolítjuk a sejtekről, majd a sejteket kétszer mossuk PBS(-)-oldattal (foszfáttal puffereit sóoldat, Nissui Seiyaku), majd minden mélyületbe 300 μΐ D-táptalajt helyezünk, majd a sejteket további egy órán át tenyésztjük. Ezután a mélyületekből 100 μΐ-es mintákat veszünk, a lipoprotein lipáz (LPL) aktivitás meghatározása céljából, az aktivitást min1
J • · · ·
-95den kísérleti mintából három egymástól független kísérletben határoztuk meg, és a mérési eredményekből átlagot számoltunk. Az LPL-aktivitást Nilsson-Ehle és Schotz eljárása alapján határoztuk meg [Nilsson-Ehle, P. és Schotz, M. C.: J. Lipid Rés. 17, 536 (1976)]. A fentiek szerint előállított felülúszókból vett mintákat azonos térfogatú LPL-szubsztrát oldattal kevertünk össze, majd az enzimreakciót 37 °C-on 120 percig hagytuk lejátszódni. A reakciót ezután 1,05 ml 0,1 m/l-es káliumkarbonát puffer (a pH-t 10,5-re állítottuk 0,1 m/l-es káliumborát oldattal), valamint 3,25 ml metanol : kloroform : heptán elegy [141 : 125 : 100 (térf/térf)] alapos rázatás közben történő hozzáadásával állítottuk le. Az elegyet ezután 15 percen keresztül szobahőmérsékleten 3000 g-vel centrifugáltuk. A vizes metanolos fázis 3Htartalmát folyadék szcintillációs számláló alkalmazásával határoztuk meg.
Az LPL-aktivitás egysége az az aktivitás, amely percenként 1 μιη zsírsavat állít elő. A szubsztrát oldatban lévő 13 mmól/l-es glicerin-tri[9,10(n)-3H]-oleát oldatot úgy állítottuk elő, hogy glicerin-tri-[9,10(n)-3H]oleátot (37,0 GBq/mol, Amersham) trioleinben (Sigma) hígítottunk, majd az oldatot szilikagél oszlopkromatográfiával tisztítottuk.
Az alábbi példát a találmány szerinti megoldás glutation redukáló fehérje vonatkozású megvalósítási módjait szemléltetik.
1. példa
PoliíA)+ RNS kinyerése KM-102 sejtekből darab 15 cm átmérőjű műanyag tenyésztőtálcán KM-102 sejteket tenyésztettünk, a tenyésztölemezek 10 % magzati borjúsavót tartalmazó Iscove-féle módosított minimáltáptalajt (Boeringer-Mannlieim) tartalmaztak. A sejteket addig növesztettük, míg összefüggő réteget alkottak, majd fórból-
• ·
-96mirisztil-acetátot (PMA) és kálcium-ionofor-A12187-et (Sigma) adtunk a tenyésztölemezekhez, sorrendben 10 ng/ml és 0,2 μηι/Ι végkoncentrációig. A tenyésztést 37 °C-on folytattuk. Három, hat és tizennégy óra elteltével 1212 tenyésztőtálcát learattunk, majd minden tenyésztőtálca tartalmát egyenként guanidium-tiocianát-oldatban feloldottuk és a folyékony fázisokat összegyűjtöttük. A poli(A)+-RNS izolálását lényegében a Molecular Cloning - A Laboratory Manual [Maniatis, T. és mtsai., 196. old (1982)] kézikönyvből leírtak szerint végeztük. Az alábbiakban részletesen leírjuk az alkalmazott eljárást.
Az egyes tálcákból begyűjtött folyadékfázisokat külön-külön a következőképpen kezeltük. A folyadékot többször fölszívtuk és kinyomtuk egy 21G-jelű injekcióstűn keresztül, 10 ml-es injekciós fecskendőt alkalmazva. Egy “RPS40-T” centrifuga (Hitachi Koki) rotorjába illeszthető Polyaromar centrifugacsövekbe 3 ml 5,7 mól/1 CsCl - 0,1 mól/1 EDTA (pH=7,5) oldatot adtunk. Az előzőekben előállított sejtlizátumot ezután a centrifugacsövekben lévő oldat fölé rétegeztük, amíg a centriíugacső tele nem lett.
A centrifúgálást 20 °C-on 30.000 ford/perc-cel 18 órán át végeztük, majd a kapott üledéket 400 μΐ desztillált vízben felszuszpendáltuk, majd etanolos kicsapást hajtottunk végre. A kapott üledéket ezután 400 μΐ desztillált vízben oldottuk fel, majd azonos térfogatú kloroform/1-butanol elegyet (4/1, térf/térf) adtunk hozzá keverés közben, majd a vizes fázist centrifugás elválasztás után kinyertük. Ezután ismételten etanolos kicsapást hajtottunk végre, majd a kapott üledéket 600 μΐ desztillált vízben feloldottuk, és így össz-RNS-izolátumot kaptunk. A 12-12 tenyésztőlemezről a PMA/A231871 . 1 • · · « · · · • · · · · · · • · · · · ··· ·· ·· ·
-97stimuiaiast Követően 3, ö es 14 óra elteltevei begyűjtött mintákból kd. 4,54,5 mg össz-RNS-t tudtunk izolálni.
A kapott három típusú össz-RNS-izolátum mindegyikéből 600-600 pg-ot összekevertünk, majd az elegyet oligo-dT-cellulóz oszlopkromatográfiának vetettük alá, és ily módon poli(A)+RNS-t izoláltunk. Az össz-RNSizolátumot adszorpciós pufferben oldottuk fel, majd öt percen keresztül 65 °C-on hevítettük. Az így kapott oldatot felvittük egy oligo-dT-cellulóz oszlopra (Pharmacia, type 7), melyet előzőleg adszorpciós pufferrel ekvilibráltunk, majd az oszlopot eluáló oldattal eluáltuk, és így 100 pg poli(A)4RNS-t izoláltunk.
2. példa cDNS-könyvtár készítése
Az Okayama-Berg eljárás alapján cDNS-könyvtárat készítettünk.
pg poli(A)+RNS-t és 24 egység reverz transzkriptázt (Seikagaku Corp.) reagáltattunk egy órán keresztül 42 °C-on 20 pl reverz transzkriptáz reakcióoldatban.
A reakciót 2 pl 0,25 mól/1 EDTA és 1 pl 10 %-os SDS hozzáadásával állítottuk le, majd az oldatot 20 pl fenol/kloroform elegy (1/1, térf/térf) hozzáadásával fehérjementesítettük. A fehérjetartalmú fázist centrifugálás után eltávolítottuk, és a felülúszóhoz 20 pl 4 mól/1 ammóniumacetát oldatot, valamint 80 pl etanolt adtunk, majd az így kapott reakcióelegyet 15 percig -70 °C-on állni hagytuk. A kapott csapadékot centrifugálással leülepítettük, majd 75 %-os etanollal mostuk, és vákuumban szárítottuk. A szárított csapadékot 15 pl terminális transzferáz reakcióoldatban oldottuk fel, és három percen át ) . I • · • · · · · · « • · · · · · · • · · ♦ · • · · ·< ·· * °C-on melegítettük. Ezután a reakcióelegyhez 18 egység terminális dezoxinukleotid transzferázt (Pharmacia) adtunk, majd a reakcióelegyeket öt percig állni hagytuk. A reakciót ezután 1 μΐ 0,25 mól/l EDTA, valamint 0,5 μΐ 10 % SDS hozzáadásával állítottuk le, majd a reakcióelegyet a fent leírtak szerint fenolkloroformos extrakcióval fehérjementesítettük, és a proteintartalmú fázist centrifúgálással eltávolítottuk. A felülúszót kinyertük, és alaposan elkevertük 15 μΐ 4 mól/l ammóniumacetát oldattal és 60 μΐ etanollal. Ezt az elegyet 15 percig -70 °C-on állni hagytuk, majd a csapadékot centrifiigálással kiülepítettük.
A kapott üledéket 10 μΐ restrikciós enzimpufferben oldottuk fel, majd 2,5 egység HindlII restrikciós enzimet adtunk a kapott oldathoz, és a reakcióelegyet 1 órán át 37 °C-on át állni hagytuk, a restrikciós emésztés megtörténte végett.
A reakcióelegyet ezután fenol-kloroformos extrakciót követő etanolos kicsapással fehérjementesítettük, majd az etanolos reakcióelegyet -70 °C-on 15 percig állni hagytuk. A kapott csapadékot centrifúgálással kiülepítettük, majd 10 μΐ TE-pufferben [10 mmól/1 Tris-HCI (pH=7,5) és 1 ml EDTA] feloldottuk. A kapott reakcióelegyből 1 μΐ-t 10 μΐ-re egészítettünk ki egy 10 mmól/1 HCl-t (pH=7,5), 1 mmól/1 EDTA-t, 100 mmól/1 NaCl-t és 10 nm oligo(dG)-farkazott linker DNS-t [3'-oligo(dG)-farkazott pL-1 HindlII kapcsoló oligonukleotid, Pharmacia] tartalmazó oldattal, majd a reakcióelegyet 5 percig 65 °C-on hevítettük, majd 30 percig 42 °C-on melegítettük. A reakcióelegyet ezután jeges vízfürdőn lehütöttük, majd 10 μΐ lOx ligáz puffért, 78 μΐ desztillált vizet és 8 egység T4 DNS-ligázt adtunk hozzá. A reakcióelegyet ezután egy éjszakán át 12 °C-on tartottuk.
• · · · * ·»*· • · · · · · · • * · · · · « • · · · · ··· ·· ·· ·
-99A reakcióelegyhez a következő napon 10 μΐ 1 mól/l KCl-oldatot, 1 egység ribonukleáz-H-t, 33 egység DNS-polimeráz I-t, 4 egység T4 DNS ligázt, 0,5 μΐ dNTP-oldatot (20 mmól/1 dATP, 20 mmól/1 dCTP, 20 mmól/1 dGTP és 20 mmól/1 dTTP) és 0,1 μΐ 50 pg/ml-es marhaszérumalbumint (BSA) adtunk, majd a kapott reakcióelegyet először egy órán át 12 °C-on tartottuk, majd egy órán át 25 °C-on. A reakcióelegyet ezután desztillált vízzel ötszörösre hígítottuk, és azonnal Echerichia coli DH5-a-sejtek transzformálására használtuk fel, a Hanahan-eljárás alkalmazásával [Hanahan, D.: J. Mól. Bioi. 166, 557 (1983)], és ily módon ΚΜ-102-sejtekben cDNSkönyvtárat hoztunk létre.
3. példa
Qligonukleotid hibridizációs próba előállítása
A citokinek mRNS-ének 3'-végi nem transzlálódó régiójában található AUUUA szekvencia alapján a következő szekvenciájú 15 bázishosszúságú oligonukleotidot szintetizáltuk meg: 5'-TAAATAAATAAATAA-3' (szekvenciaazonosító szám: 13), és az ATT-3 jelöléssel láttuk el. A szintézist a 380B-típusszámú automatikus DNS-szintetizátoron hajtottuk végre (Perkin-Elmer Japan Applied Biosystems), a gyártó által adott használati utasítást követve. A szintézis végrehajtásához a foszfoamidit eljárást alkalmaztuk, melyet Caruthers és munkatársai írtak le [Matteucci, M. D. és Caruthers, Μ. H.: J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)]. A szintézis befejezése után a kialakított oligonukleotidot a szilárd fázisról leválasztottuk, és a védőcsoportokat eltávolítottuk. A kapott oligonukleotid oldatot porrá liofiliI
- 100záltuk, amit azután desztillált vízben oldottunk fel, és felhasználásig -20 °Con fagyasztva tároltuk.
4. példa
A cDNS-könyvtár szűrővizsgálata
Grunstein és Hogness [Grunstein, M. és Hogness, D.S.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975)] eljárása alapján a fenti 2. példa alapján előállított cDNS-könyvtár 6500 kiónját nitrocellulóz filteren fixáltuk. A 3. ábra szerint előállított ATT-3 hibridizációs próbát az 5'-végén 32P-vel megjelöltük, közismert eljárások alkalmazásával (lásd Molecular Cloning - A Laboratory Manual), és a radioaktívan jelölt hibridizációs próba alkalmazásával kolóniahibridizációt hajtottunk végre.
A prehibridizációt három órán keresztül 37 °C-on hajtottuk végre, a következő oldattal: 6x SSC, lx Denhardt-oldat, 0,25 % SDS, 0,05 % nátriumpirofoszfát és 100 pg/ml denaturált lazacsperma-DNS. A hibridizációt ezután 31°C-on hajtottuk végre egy éjszakán keresztül, a következő oldatban: 6x SSC, lx Denhardt-oldat, 17 pg/ml élesztő tRNS és 0,05 % nátrium-pirofoszfát, amely a 32P jelzett ATTT-3 hibridizációs próbát tartalmazta.
A következő napon a nitrocellulóz filtert szobahőmérsékleten két órát át 6x SSC-oldattal mostuk, amely tartalmazott 0,05 mól/1 nátriumpirofoszfátot. A hibridizációt követő autoradiográfia alapján 33 pozitív kiónt találtunk.
A pozitív kiónokból közismert eljárások alkalmazásával plazmidDNS-t izoláltunk. Ezután véletlenszerűen kiválasztottunk néhány kiónt, és a bennük található cDNS szekvenciáját részlegesen meghatároztuk a didezoxi- 101 láncterminációs eljárás alkalmazásával. Ezeket a részleges szekvenciákat azután homológiakereső program alkalmazásával összehasonlítottuk az “EMBL” és a “GenBank” adatbázisokban található szekvenciákkal, személyi számítógép alkalmazásával, és azt találtuk, hogy az ATT-3 hibridizációs próbával izolált kiónok parciális szekvenciái közül néhány homológiát mutatott az Alu-ismétlődés részleteivel [Schmid, C. W. és Jelinek, W. R.: Science 216, 1065 (1982)].
Előállítottunk egy humán genomi DNS-ből származó Alu-ismétlődést tartalmazó DNS-fragmenst, majd a szokásos eljárások alkalmazásával 32Pvel megjelöltük. Ezt a jelzett DNS-t alkalmaztuk hibridizációs próbaként, a fentiek szerint a azonosított 33 kiónon végrehajtott kolóniahibridizációs kísérletben, és ily módon világossá vált, hogy az azonosított kiónok közül 12 az Alu-ismétlődést tartalmazta. A maradék 21 kiónban található cDNS hoszszát valamennyi esetben meghatároztuk, és azt találtuk, hogy az inszertek hosszúsága 50 és 3600 bázis között változott.
A fent maradó 21 klón cDNS-inszertjeit restrikciós enzimes térképezésnek vetettük alá, és a fentiek szerint meghatároztuk részleges nukleotid sorrendjüket. Ezeket a részleges szekvenciákat a fentiek szerint ismét homológiakeresésnek vetettük alá, az “EMBL” és a “GenBank” adatbázisokban található szekvenciákkal, személyi számítógép alkalmazásával és kiválasztottuk azokat a kiónokat, melyek az adatbázisokban nem szereplő szekvenciákat tartalmaztak.
- 102 5. példa
A 31 számú klón Northem-hibridízácíós vizsgálata
A fenti kiónok egyike, a 31 számú klón (melyet PC V-31-nek neveztünk el) kb. 560 bázispár hosszúságú cDNS-inszertet tartalmazott. A pCD31-klón cDNS-inszertjéből kinyertünk egy Pstl-Aatl-fragmenst (292 bázispár), majd 32P-vel megjelöltük, és ezt alkalmaztuk hibridizációs próbaként a KM-102 sejtekből preparált poly(A)+-RNS-en végrehajtott Northemblot eljárásban, amit az 1. példában leírtakhoz hasonlóan hajtottunk végre. Azt a hibridizációs eljárást abból a célból hajtottuk végre, hogy a pCD-31klónban található inszertnek megfelelő természetben előforduló mRNS hosszát meghatározzuk.
A Northem-hibridizációs eljárást az alábbiak szerint hajtottuk végre. A ΚΜ-102-sejtekből 5,5 pg poly(A)+-RNS-t izoláltunk, és az RNS-t 50 °Con egy órán át a következő reakcióelegyben inkubáltuk: 1 mól/l glioxál, 50 % dimetil szulfoxid (DMSO) és 0,01 mól/l dinátrium-hidrogénfoszfát (pH=7,0). Az inkubálást követően a reakcióelegyhez 4 pl elektroforézis festéket adtunk, majd az elegyet 1 %-os agaróz gélben, lx TAE-puffer alkalmazásával elektroforetizáltuk.
Az elektroforézist követően az agaróz gélben található RNS-t egy éjszakán át egy nylon-membránfilterre transzferáltuk, 20x SSC-pufferben, a kapilláris transzfer eljárást alkalmazva (lásd Molecular Cloning A Laboratory Manual). Az RNS-transzfer megtörténte után filtert óvatosan 2x SSC-pufferben mostuk, levegőn megszárítottuk, majd két órán át 80 °C-on tovább szárítottuk, az mRNS fixálása céljából.
, \ . h
- 103 A pcD-31-kiónból származó Pstl-Aatl-fragmenst a Multiprime DNA Labeling System reagenskészlet (Amersham) alkalmazásával 32P-vel jelöltük.
A filtert 3 órán keresztül 37 °C-on prehibridizáltuk a következő oldatban: 5x SSCP, 2,5x Denhardt-oldat, 50 % formamid, 10 mmól/1 dinátrium hidrogénfoszfát (pH=7,0), 0,5 % SDS és 100 pg/ml denaturált lazacspermaDNS.
A filtert egy éjszakán át 42 °C-on a következő oldatban hibridizáltuk: 32P-jelzett hibridizációs próba, 5x SSCP, lx Denhardt-oldat, 50 % formamid, 10 mmól/1 nátrium hidrogénfoszfát (pH=7,0), 0,1 % SDS és 10 pg/ml denaturált lazacsperma-DNS. A következő napon a filtert először egy órán át 37 °C-on a következő oldatban mostuk: 50 % formamid, 5x SSC és 0,1 % SDS, majd ugyanazon a hőmérsékleten két órán keresztül a következő oldatban mostuk: 40 % formamid, 5x SSC, és 0,1 % SDS, majd végül szobahőmérsékleten mostuk a filtert 15 percen keresztül 2x SSC pufferben. A hibridizációt követő autoradiográfia alapján megállapítottuk, hogy a pcD31-klón cDNS-inszertje nem teljes hosszúságú, hanem az inszertnek megfelelő teljes hosszúságú mRNS 3,9 kb nagyságú (a hibridizáló RNS méretét a molekulatömeg markerek mobilitása alapján rajzolt kalibrációs görbe segítségével határoztuk meg).
- 104 -
6. példa
Friss cDNS-könwtár előállítása, a pcD-31-klón cDNS-ével történő szűrővizsgálat céljára
A cDNA Synthesis System Plus, valamint a cDNA Cloning System reagenskészletek (XgtlO, adapter alkalmazásán alapuló eljárás, Amersham) alkalmazásával friss cDNS-könyvtárt készítettünk.
pl reverz transzkriptáz reakciópufferben 5 pg poly(A)+-RNS-t melyet KM-102 sejtekből izoláltunk (az 1. példában leírtakhoz hasonló eljárással) - és 100 egység reverz transzkriptázt reagáltattunk 40 percig 42 °Con. Ezután a reakcióelegyhez 20 pCi [a-32P]dCTP-t, 93,5 pl második szálpuffert, 4 egység ribonukleáz-H-t és 115 egység DNS-polimeráz-I-et (mindezek a reagensek a fent említett reagenskészlet tartozékai voltak) adtunk, majd a reakcióelegyet először egy órán keresztül 12 °C-on, majd egy órán keresztül 22 °C-on, végül pedig 10 percig 70 °C-on inkubáltuk. A 70 °C-os kezelés után a reakcióelegyhez 10 egység T4-DNS-polimerázt (a fenti reagenskészlet tartozéka) adtunk, majd a reakciót 10 percig 37 °C-on engedtük lezajlani.
A reakcióelegyet ezután fenol-kloroformos extrakcióval fehérjementesítettük. A reakcióelegyet ezután lecentrifugáltuk, és a felülúszót kinyertük, majd 750 pl 4 mól/l-es ammónium acetát oldatot és 1 ml etanolt adtunk hozzá és az elegyet jól elkevertük. A reakcióelegyet ezután egy éjszakán át 20 °C-on hűtöttük, majd a csapadékot centrifugálással kiülepítettük. A kapott üledéket 30 pl steril vízben oldottuk fel. A kapott oldat 10 μΐ-ét kivettük, és a következő összetevőket tartalmazó reakcióelegyhez adtuk: 2 pl ligáz/kináz-puffer, 250 pmól EcoRI-adapter, valamint 5 egység T4 DNS ligáz
Ί
- 105 (valamennyi reagens a fent említett reakciókészlet tartozéka), majd a kapott reakcióelegyet egy éjszakán át 15 °C-on tartottuk. Ezután az egész reakcióelegyet a fent említett reagenskészlet tartozékát képező méret szerint elválasztó oszlopra vittük fel, az EcoRI-adapter eltávolítása céljából. A reakcióelegyet ezután 120 μΐ-es alikvot részekre osztottuk, és mindegyikhez 200 μΐ 0,25 x TE-puffert adtunk. A méret szerinti elválasztást követően a 10-17 frakciókat összeöntöttük, és a térfogatot butanol alkalmazásával 120 μΐ-re koncentráltuk.
Az előzőek szerint előállított dekoncentrált preparátum teljes mennyiségéhez 55 μΐ steril vizet, 20 μΐ ligáz/kináz-puffert és 40 egység T4 polinukleotid kinázt adtunk (minden reagens az említett reagenskészlet tartozéka), majd a kapott reakcióelegyet 37 °C-on 30 percig állni hagytuk. A reakcióelegyet ezután háromszor elvégzett fenol-kloroformos extrakció alkalmazásával fehérjementesítettük, majd etanolos kicsapást végeztünk, és az etanolos reakcióelegyet -20 °C-on egy éjszakán át állni hagytuk. A kapott csapadékot centriíugálással kiülepítettük, majd az üledéket 10 μΐ steril vízben feloldottuk, így állítottuk elő a cDNS-mintát.
A fentiek szerint előállított cDNS-minta 2 vagy 4 μΐ-éhez 1 μg XglOEcoRI-kart, 1 μΐ ligáz/kináz-puffert és 2,5 T4 DNS ligázt adtunk (minden reagens az említett reagenskészlet tartozéka), majd a reakcióelegyet egy éjszakán át 15 °C-on tartottuk. Ezután a mintákat az alábbiak szerint kezeltük. A reakcióelegy teljes mennyiségét először 10 μΐ A-extraktumhoz adtuk (az említett reagenskészlet tartozéka), majd a kapott reakcióelegyet 15 μΐ Bextraktumhoz adtuk (az említett reagenskészlet tartozéka), a kapott reakció*1
- 106elegyet ezután 20 percig 20 °C-on állni hagytuk, az in vitro fág-burkolási reakció lejátszódásának céljából.
A reakcióelegyhez ezután 470 μΐ SM-puffert adtunk, és a reakcióelegyet ezután 4 °C-on tároltuk. A fentiek szerint előállított oldattal azután 10 mmól/1 MgSO4-gyel kezelt E. coli NM514-sejteket fertőztünk, és így a KM102-cDNS-ből λgt 10-könyviárat állítottunk elő.
7. példa
A cDNS-könyvtár szűrővizsgálata
A 6. példa szerint készített kombinált cDNS-könyvtárból nyert 2x 105 plakkot az alábbiakban közölt eljárás szerint nylon-membránra (“Hybond N”, Amersham) fixáltunk.
A 6. példa szerint előállított fertőzött E. coli-SQfaktí. tíz darab szilárd LB-táptalajt tartalmazó 9 cm átmérőjű tenyésztőtálcákon tenyésztettük, oly módon, hogy l-2x 104 plakk keletkezett tenyésztőtálcákként. A plakkokat a nylon-filterre vittük át, oly módon, hogy a filtert óvatosan a tenyésztőtálca tetejére helyeztük. Ezután egy 18G-jelű injekcióstűt használtunk arra, hogy a filtert és a szilárd táptalaj felszínét három pontot megjelöljük, a későbbi azonosítás céljából. A filtert ezután 5-10 percig 4 °C-on állni hagytuk, majd óvatosan levettük a szilárd táptalaj felszínéről, és 20 másodpercre lúgos oldatba merítettük (0,1 mól/1 NaOH, 1,5 mól/1 NaCl). A filtert ezután semleges oldatba tettük át [0,2 mól/1 Tris-HCl (pH=7,5), 2x SSCP], ahol 20 másodperc és 1 perc közötti ideig állni hagytuk, majd a filtert szobahőmérsékleten két órán át levegőn szárítottuk. A filtert végül 80 °C-on 2 órán át szárítottuk.
*1
-107-
8. példa
Hibridizációs próba előállítása, hibridizáció
A 4. példa szerint előállított pcD-31-plazmidból 32P-jelzett hibridizációs próbákat állítottunk elő, oly módon, hogy a pcD-31-PstI-AatIfragmensét és az EcoT221-AatI-fragmensét (223 bp) a Multiprime DNA Labelling System reagenskészlet alkalmazásával radioaktívan megjelöltük. A 7. példa szerint előállított filtert a fenti hibridizációs próbákkal plakkhibridizációs próbáknak vetettük alá.
A prehibridizációt úgy hajtottuk végre, hogy a filtert a következő öszszetételű oldatba helyeztük: 50 % formamid, 5x SSCP, 2,5x Denhardt-oldat, 0,01 mól/1 dinátrium-hidrogén-foszfát-oldat (pH =7,0), 0,5 % SDS és 100 pg/ml denaturált lazacsperma-DNS, majd a filtert az oldatban 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk.
A hibridizációt úgy hajtottuk végre, hogy a filtert a fentiek szerint előállított 32P-j elölt hibridizációs próbákat tartalmazó következő összetételű reakcióelegybe helyeztük: 50 % formamid, 5x SSCP, lx Denhardt-oldat, 0,01 mól/1 dinátrium-hidrogén-foszfát-oldat (pH =7,0), 0,1 % SDS és 100 pg/ml denaturált lazacsperma-DNS, majd a filtert a hibridizációs oldatban 1 éjszakán át 37 °C-on állni hagytuk.
A következő napon a filtert először 3 órán át szobahőmérsékleten mostuk a következő összetételű oldatban: 50 % formamid, 5x SSC és 0,1 % SDS, majd 5 percig szobahőmérsékleten mostuk 2x SSC-pufferben. Az autoradiográfia végrehajtása után 80 pozitív kiónt találtunk a fentiek szerint végrehajtott elsődleges szűrés során.
-108 A pozitívként azonosított kiónok alkalmazásával további három alkalommal megismételtük a 7. és 8. példában leírt eljárásokat (4-szeres szűrés), és ily módon végül 17 pozitív kiónt azonosítottunk. Mind a 17 ily módon azonosított kiónból izoláltuk a cDNS-t, oly módon, hogy az inszerteket EcoRI-es hasítással kivágtuk. A cDNS-inszertek hosszát agaróz gél elektroforézis útján határoztuk meg, majd izoláltuk a 31-7-jelű kiónt, amely egy 3,9 kb hosszúságú cDNS-inszertet tartalmazott, amely hosszúság megfelel az eredeti mRNS teljes hosszának.
9. példa
A 31-7-jelű klón restrikciós térképezése
A 31-7-jelű kiónból izolált DNS-t EcoRI-gyel emésztettük és izoláltuk a cDNS-inszertet tartalmazó 3,9 kb hosszúságú fragmenst. Ezt a fragmenst ezután pUC18-plazmidba építettük, T4 DNS ligáz alkalmazásával. A kapott új plazmiddal E. coli DH5oc-sejteket transzformáltunk. A transzformált sejteket ampicillin-rezisztenciájuk alapján szelektáltuk, majd izoláltuk a pUCKM31-7-jelű kiónt, amely egy 3,9 kb hosszúságú cDNSinszertet tartalmazott. A pUCKM31-7-klónt az izolált DNS EcoRI-es emésztését követő agaróz gélelektroforézis útján azonosítottuk.
A pUCK31-7-plazmidot a felsorolt restrikciós enzimekkel és a közülük kiválasztott enzimpárokkal emésztettük: HindlII, SacI, Xbal, Smal, BglII, EcoT22I és Aatl. Az emésztéssel kapott fragmenseket agaróz gélelektroforézisnek vetettük alá, és a fragmensek méretét a XHindIII^X174HaeIII molekulatömeg marker alkalmazásával határoztuk meg. A kapott restrikciós térpépet a 7. ábrán láthatjuk.
*1
- 109 -
10. példa
A 31-7-jelű klón szekvenciaanalízise
A pUCKM31-7-plazmidban található cDNS-inszert teljes nukleotidszekvenciáját meghatároztuk, a didezoxi-láncterminációs eljárás alkalmazásával, M13-fágban. Ezen felül a szekvencia egy részét analizáltuk a 373A DNA Sequencer (Perkin-Elmer Japan Applied Biosystems) alkalmazásával. A kapott nukleotidszekvenciát a leíráshoz csatolt szekvencialistában all. szekvenciaazonosító számon közöljük.
A pUCKM31-7 klón cDNS-inszertje 3815 bázishosszúságú, és egyértelműen tartalmaz egy 549 aminosavhosszúságú nyílt leolvasási fázist, amely metioninnal kezdődik. Az inszertből a poli(A)-farok láthatóan hiányzik. A pcD-31-inszertjének 3'-terminális bázisszekvenciáját összehasonlítva a pUCKM31-7-klón szekvenciájával, kiderült, hogy a pUCKM31-7inszertjéből a poli(A)-farok szekvencián kívül semmi más nem hiányzik (8. ábra).
A meghatározott bázissorrend és a kikövetkeztetett aminosavsorrend alapján homológiakeresést hajtottunk végre az EMBL és a GenBank nukleotid adatbázisokban, valamint az NBRF- és SWISS-PROTadatbázisokban. A talált legközelebbi rokonszekvencia a 35,3 % homológiát mutató humán glutation reduktáz peptid szekvencia volt. Az eredményekből arra a következtetésekre jutottunk, hogy a pUKCM31-7-plazmid cDNSinszertjében található ORF nyilvánvalóan új polipeptidet kódol. A leíráshoz csatolt szekvencialistában ennek az új polipeptidnek a szekvenciáját a 12. szekvenciaazonosító számon közöljük.
•ν
- 110 -
11. példa
Az új polipeptid expresszióia és tisztítása
Az alábbiakban egy nagy mennyiségű expressziót biztosító vektor előállítását, valamint a polipeptid COS-1-sejtekben történő expresszálását ismertetjük.
A pUCKM31-7-plazmidot mindhárom enzimmel emésztettük, majd a kapott 3003 bázispár hosszúságú fragmenst, amely a cDNS-inszertet tartalmazta, a szokásos eljárások alkalmazásával izoláltuk és tisztítottuk. Az izolált fragmenst a Takara Shuzo által forgalmazott reagenskészlet alkalmazásával tompavégűvé tettük.
Egy független kísérletben a nagymértékű expressziót biztosító pcDLSRa296-vektort [Takabe, Y. és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 8, 466 (1988)] megemésztettük Pstl-gyel és KpnI-gyel és az emésztett vektort az említett reagenskészlet alkalmazásával tompavégüvé tettük. A tompavégűvé tett inszertet ezután a tompavégűvé tett plazmidba ligáltuk, T4 DNS ligáz alkalmazásával. A kapott ligátummal ezután E. coli sejteket transzformáltunk, a kálcium-kloridos eljárás alkalmazásával, majd izoláltuk a kapott ampicillinrezisztens transzformánsokat, és analizáltuk a transzformánsokon talált plazmid-DNS-t.
A kapott transzformáns kiónok közül izoláltunk egyet, melyet pSRa31-7-nek neveztünk el, (9. ábra), oly módon, hogy mindhárom és BglII-enzimekkel végzett emésztés és agaróz gélelektroforézis útján azonosítottunk egy 800 bázispáros fragmenst, amiből következően az említett kiónban a cDNS-inszert transzkripciós iránya megegyezett az SRa-promóter transzkripciós irányával. Az SRa-promóter egyrészt tartalmazza az SV40
- 111 korai promótert, valamint a HTLV-1-vírus hosszú terminális ismétlődésének (LTR) R-U5-szekvenciáját, és ez a promóter 10-100-szor erősebb, mint az SV40 korai promóter önmagában.
Az izolált pSRct-31-7-plazmiddal COS-1-sejteket transzferáltunk. A COS-1-sejtek transzfektálását a GTE-l-jelű génbejuttató berendezés (Shimadzu) alkalmazásával, elektroporáció útján valósítottuk meg.
A COS-1-sejteket hét darab 150 cm3-es tenyésztőlombik alján a semi-confluence állapot eléréséig tenyésztettük, mindegyik tenyésztőlombik 25 ml 10 % magzati borjúsavót is tartalmazó DMEM-táptalajt tartalmazott. A tenyészeteket ezután begyűjtöttük, és mindegyiket 3 ml tripszinEDTA-oldattal (a lOx tömény oldatot a Sigma forgalmazza) kezeltük, és a lombikokat szobahőmérsékleten állni hagytuk, amíg a sejtek egymástól szét nem váltak. Ezután 1 ml inaktivált magzati borjúsavót és 9 ml friss tripszinEDTA-oldatot adtunk a sejtekhez, majd a sejteket centrifugálással kiülepítettük. A kiülepített sejteket ezután kétszer megmostuk PBS(-)-pufferrel, majd PBS(-)-pufferben felszuszpendáltuk őket, a sejtszuszpenzió koncentrációját 6x 107 sejt/ml-re állítottuk be.
Ezalatt külön kísérletben a cézium-kloridos eljárás alkalmazásával plazmid-DNS-t izoláltunk, és az izolált plazmid-DNS-ből PBS(-)-pufferben 200 pg/ml-es oldatot állítottunk elő.
A fent említett PBS(-)-pufferben készített sejt- és plazmidpreparátumokból ezután 20-20 μΐ-t összekevertünk, és a kapott elegyet egy egymástól 2 mm távolságra elhelyezett elektródákat tartalmazó elektroporációs kamrába helyeztük. Ezután 1 másodperces intervallumot * .
- 112tartva az elektródokon keresztül két, egyenként 30 ps-ig tartó 600 V-os impulzust adtunk.
Az elektródakamrát ezután 5 percig 4 °C-on hűtöttük, majd a kamrában található sejt-DNS-keverékhez 10 ml 10 % magzati borjúsavót tartalmazó DMEM-táptalajt adtunk. Ezt az elegyet ezután egy Petri-csészébe vittük át, majd 5 %-os CO2 atmoszférában 37 °C-on tartottuk egy éjszakán át. A következő nap a tenyészet felülúszóját elöntöttük, a sejteket friss savómentes DMEM-táptalajjal mostuk, majd felszuszpendáltuk őket 10 ml DMEMtáptalajban, és 3 napig 37 °C-on tenyésztettük őket. A 3 nap elteltével a sejtek felülúszóját begyűjtöttük. A negatív kontrolltenyészet felülúszóját is begyűjtöttük. A negatív kontrolltenyészetet úgy készítettük, hogy a sejteket a pcDL-SRa296-plazmiddal transzferáltuk, amely plazmid cDNS-inszertet nem tartalmazott, a tenyésztés körülményei egyébként azonosak voltak a kísérleti tenyészetek tenyésztési körülményeivel.
A kísérleti tenyészetek és a kontrolltenyészet felülúszóiból 1-1 ml-t a következők szerint dolgoztunk fel. A felülúszót először triklór-ecetsawal (TCA) kezeltük, a fehérjék kicsapása céljából, majd a csapadékot centrifúgálással különítettük el. A kapott csapadékot jéghideg acetonnal mostuk, majd levegőn megszárítottuk, és ezután 2-merkaptoetanolt tartalmazó SDSpoliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) mintafelvivő pufferben oldottuk fel. Ezután redukáló körülmények között 12,5 %-os gélben SDS-PAGEeljárást hajtottunk végre.
Az elektroforézis után a fehérjecsíkokat ezüst festéssel tettük láthatóvá, a Daiichi (Daiichi Chemical Detection) ezüst-festő reagens alkalmazá* · · ·· ···· • · · · · · · · · · «« « ♦ · · * ·
- 113 savai. A kísérleti tenyészetek felülúszóiból néhány specifikus csík festődött (molekulatömeg: kb. 60.000).
Mivel a pSRa31-7-plazmid által kódolt polipeptid molekulatömege kb. 60.000, és a kikövetkeztetett aminosavszekvencia alapján feltételezhető volt, hogy szaharid oldallánc hozzáadásával járó poszttranszlációs módosítások a szóbanforgó fehérje esetén nem valószínűek, arra a következtetésre jutottunk, hogy a kísérleti felülúszókból kimutatott specifikus fehérjecsíkok a pSRa31-7-cDNS-inszertje által kódolt polipeptidnek felelnek meg.
12. példa
COS-1-sejtekben alkalmazható nagymértékű expressziót biztosító plazmid előállítása
A következő lépésben igazolni kívántuk, hogy a 11. példa szerint azonosított specifikus 60 kDa-molekulatömegű fehérjecsíkok azonosak a pSRa31-7-plazmid inszertje által kódolt polipeptiddel. Szintén kívánatos volt a polipeptid N-terminális aminosavsorrendjének meghatározása. Az elmondottaknak megfelelően előállítottunk egy olyan kiónt, amelyben a pSRa31-7-plazmid inszertje által kódolt polipeptid C-terminálisát meghoszszabbítottuk 6 hisztidin aminosawal, közvetlenül a stop-kódon előtt. A hisztidin oldalláncok nagy affinitással kötik a Ni2+-ionokat, és az volt a célunk, hogy előállítsunk egy olyan polipeptidet, amely tartalmaz egy hisztidinhexamert (6xHis), amely polipeptidet NI2+-ionokkal töltött affinitásoszlopon lehet majd tisztítani.
Első lépésben egy Automated DNA Synthesizer 394 (Perkin-Elmer Japan Applied Biosystems) berendezés alkalmával megszintetizáltunk és ·· · · ·«···· · * ·· · ·4 · • · · · * • · · ·· «· 4
- 114megtisztítottunk egy 66 bázishosszúságú oligonukleotidot, melynek szekvenciája a következő volt: 5-CTAGCGCTCTGGGGCAAGCATCCTCCAGGCTGGCTGCCACCA CCACCACCACCACTGATCTAGACT-3' (szekvenciaazonosító szám: 14), és megszintetizáltuk a fenti oligonukleotid 66 bázishosszúságú komplementerét is. Ezután összekevertük az oligonukleotid preparátumokat, majd 30 percen keresztül 70 °C-on inkubáltuk a reakcióelegyet, majd további 30 percen keresztül 37 °C-on tartottuk az elegyet, hogy lehetővé tegyük a hibridizációt. Ezután a láncvégeket T4 polinukleotid kináz alkalmazásával megfoszforiláltuk.
A kapott kettősszálú (ds) DNS-fragmenst T4 DNS ligáz alkalmazásával a pSRa31-7-plazmidba ligáltuk, melyet előzőleg Eco47III restrikciós enzimmel emésztettünk. A kialakított konstrukciót a 10. ábrán láthatjuk. A DNS-konstrukcióval E. coli DH5oc-sejteket transzformáltunk a kálciumkloridos eljárás alkalmazásával, majd a kapott transzformánsokat szelektáltuk, és szűrővizsgálatnak vetettük alá, és így izoláltuk a pUCK31-7HISplazmidot tartalmazó kiónt. A szintetizált fragmens beépülésének pontosságát a pUCKM31-7HIS-plazmid szekvenciája megfelelő részletének szekvenciaanalízisével igazoltuk.
Ezután előállítottunk egy COS-1-sejtekben nagymértékű expressziót biztosító plazmidot, oly módon, hogy a pUCKM31-7HIS-inszertjét pcDL-SRoc296 plazmidba szubklónoztuk.
A pCUKM31-7His-plazmidot Xbal- és HindlII-enzimekkel emésztettük, majd izoláltuk a fragmenseket és a fragmensek végeit tompavégüvé alakítottuk, egy egység Klenow-fragmens alkalmazásával, 2 mmól/1 dATP, 2 « ·
4 · ······ « • ·4 4 « « · • · · * * * *
-115mmól/1 dCTP, 2 mmól/1 dGTP, 2 mmól/1 dTTP, 50 mmól/1 Tris-HCI (pH=7,2), 10 mmól/1 MgSO4, 0,1 mmól/1 ditiotreitol, valamint 50 pg/ml BSA jelenlétében.
A nagymértékű expressziót biztosító pcDL-SRa296-vektort külön kísérletben PstI- és KpnI-enzimekkel emésztettük, majd tompavég kialakító reagenskészlet alkalmazásával tompavégüvé alakítottuk az emésztett vektort. A fentiek szerint előállított tompavégű fragmenst ezután T4 DNS ligáz alkalmazásával a tompavégűvé alakított linearizált plazmidba ligáltuk. A kapott plazmidot E. coli DH5a-sejtek transzformálására használtuk. A transzformánsokat szelektáltuk és szűrővizsgálatnak vetettük alá. Izoláltunk egy olyan transzformánst, amelyben a cDNS-inszert transzkripciós iránya megegyezett az SRa-promóter transzkripciós irányával, és a transzformánsban található plazmidot pSRa31-7His-nek neveztük. A kialakított pSRoc31-7His-plazmiddal COS-l-sejteket transzferáltunk, majd a 11. példában leírtakhoz hasonló módon szérummentes felülúszót nyertünk ki a transzformált sejtek tenyészetéből.
13. példa
A pSRa31-7His-Dlazmid által kódolt polipeptidek tisztítása és N-terminális aminosav-sorrendiük meghatározása
A 12. példa szerint előállított felülúszó 600 ml-ét 17 térfogat dialízispufferrel szemben 4 °C-on 15 órán át dializáltuk. Ezután a puffért kicseréltük újabb 17 térfogat friss dialízis-pufferre, majd a dialízist 4 °C-on további négy órán át folytattuk, a dializált preparátumot ezután FPLC (Fást Protein Polynucleotid Liquid Cromatography, Pharmacia) affinitáskromatográfiás eljárásnak vetettük alá, az alábbi körülmények között:
• · • ♦ · « · · · • · · · ·« · • · · « · • ·· ·· · · 4
-116Oszlop: 20 ml “ProBond™” oszloptöltet (Invitrogen) “XK16/20” oszlopba töltve (0 2.0 x 20 cm, Pharmacia).
Elúciós puffer:
A) 20 mmól/1 foszfátpuffer (pH=7,8), amely 200 mmól/1 imidazolt és 0,5 mól/1 NaCl-t tartalmazott,
B) 20 mmól/1 foszfátpuffer (pH=7,8), amely 300 mmól/1 imidazolt és 0,5 mól/1 NaCl-t tartalmazott.
Folyási sebesség: 1 ml/perc.
Frakciók térfogata: 5 ml/cső.
Elúciós körülmények: szedtünk 4 frakciót A) elúciós pufferrel, majd frakciót B) elúciós pufferrel, és frakciókat 1-20 megszámoztuk.
A kapott frakciókból 300 μΐ-es mintákat vettünk, melyeket különkülön TCA-kicsapásnak vetettünk alá, majd a kapott csapadékot SDSPAGE-felvivő pufferben felvettük, és 12,5 %-os gélben redukáló körülmények között - a fent leírtak szerint - SDS-PAGE-elj árásnak vetettük alá. A fehérjetartalmú csíkokat ezüst-festéses módszerrel azonosítottuk, és három csíkot figyeltünk meg, melyek leginkább a 10. frakcióban és közvetlen környékén voltak láthatók. A három különböző csík jelenléte arra utal, hogy a pSRa-31-7His-plazmid inszertje olyan polipeptidet kódol, mely három különböző hosszúsággal jellemezhető, és a különböző formák N-terminális szekvenciája is különböző.
A 7-14. frakciók maradékát TCA-kicsapással dekoncentráltuk, és a csapadékot SDS-PAGE-elválasztásnak vetettük alá, 10 %-os gélben, redukáló körülmények között. Az elválasztás után a proteincsíkokat a poliakril- 117amid-gélből polivinilidin-difluorid (PVDF) filmre transzferáltuk (ProBlot™, Applied Biosystems) gél-membrán-transzfer-berendezés alkalmazásával (Marisol, KS-8441), amely berendezés 9 V-on működött, transzfer-puffer jelenlétében [0,02 % SDS, 20 % metanol, 25 mmól/1 Tris-Borát (pH=9,5)], 4 °C-on, 2,5 órán át.
A membránt ezután megfestettük 0,2 % naphtol blue black festékkel (Sigma), és a korábban azonosított három csíknak megfelelő fehérjetartalmú csíkokat a membránból kivágtuk, és mindegyik csíkban található polipeptid N-terminális szekvenciáját 6 aminosav-hosszúságig meghatároztuk, egy gázfázisú proteinszekvenátor alkalmazásával (Shimadzu, “PPSQ-10”). A második legnagyobb látszólagos molekulasúllyal jellemezhető csíkban található protein (molekulatömeg: kb. 60.000) N-terminálisának szekvenciája a következőnek bizonyult: Val-Val-Phe-Val-Lys-Gln (a szekvencia megegyezik a 12. azonosítószámú szekvencia 1-6. aminosavainak szekvenciájával).
A fenti 6 aminosav sorrendje megegyezik a 31-7-klón ORF-je első 6 aminosavának sorrendjével, és szintén megegyezik a pSRoc-31-7His-, és pSRa-31-7-klónok cDNS-inszertje által kódolt prekurzor polipeptid Ntenninálisától számítva a 24. aminosavnál (val) kezdődő 6 aminosav szekvenciájával. Az elmondottakból következően amennyiben ennek a prekurzor polipeptidnek az N-terminális 1-23. aminosavait tartalmazó részlete lehasad, az eredmény a Valin aminosawal kezdődő érett formájú fehérje szekréciója kell, hogy legyen.
» ·
- 118-
14. példa
A redukáló aktivitás meghatározása
i) Expressziós vektor előállítása
Az előző példák szerint izolált polipeptidet COS-1-sejtekben expresszálva csak rendkívül kis mennyiségben tudtuk izolálni. Éppen ezért nem volt lehetséges, hogy ezt a polipeptidet a szekvenciaanalízisen kívül más célra is - például aktivitásmeghatározásra - felhasználjuk. Az elmondottak értelmében szükséges volt, hogy a pSRa-31-7-plazmid cDNS-inszertje által kódolt polipeptidet valamilyen módon valamely más gazdasejtben expresszáljuk, amelyben a protein a tisztításhoz és aktivitásvizsgálathoz elégséges mennyiségben keletkezik. A kitűzött célt az alább ismertetett eljárás alkalmazásával valósítottuk meg.
A pUCKM31-7-plazmidot megemésztettük HindlII-enzimmel, és a cDNS-inszertet tartalmazó 3003 bázispáros fragmenst izoláltuk és tisztítottuk, majd a fragmenst tompavég-kialakító reagenskészlet alkalmazásával tompavégűvé tettük. A fragmenst ezután Xbal-enzimmel megemésztettük.
A pMAL-c expressziós vektort [Guan, C. és mtsai.: Gene 67, 21 (1987)] megemésztettük Xbal- és Stul-enzimekkel, majd a fent előállított Xbal-gyel módosított HindlII-fragmenst T4 DNS ligáz alkalmazásával a linearizált plazmidba ligáltuk. Az ily módon kialakított konstrukciót all. ábrán mutatjuk be. A kialakított konstrukciót ezután E. coli TB-1-sejtek transzformálására használtuk, majd amplicillin-rezisztens transzformánsokat szelektáltunk és szűrővizsgálatnak vetettük őket alá. Kiválasztottunk egy olyan transzformánst, amelyben a cDNS transzkripciós iránya megegyezett a
- 119promóter transzkripciós irányával, és az így előállított plazmidot pMAL31-7-nek neveztük.
ii) Fúziós fehérje expresszálása és tisztítása
A pMAL31-7-plazmidot hordozó E. coli sejtekből inokulumtenyészetet készítettünk, egy éjszakán át 37 °C-on történő rázatással, 50 pg/ml amplicillint tartalmazó 3 ml LB-táptalajban. A következő napon az inokulum-tenyészet 1 ml-ével 100 ml friss LB-táptalajt oltottunk be, amely 50 pg/inl amplicillint tartalmazott, majd a baktériumokat 37 °C-on rázatva 0,5 ODöoonm értékig tenyésztettük. A tenyészethez ekkor 0,1 ml/1 végkoncentrációig IPTG-t adtunk, és a tenyészetet egy éjszakán át 37 °C-on tovább rázattuk.
A következő napon a baktériumsejteket a tenyészetből húsz percig tartó 4 °C-on 6500 ford/perc-cel végzett centrifúgálással kiülepítettük. Az üledéket 10 ml oszloppuferben szuszpendáltuk fel, és a kapott sejtszuszpenzióban lévő sejteket ultrahangos dezintegrátor alkalmazásával tártuk fel. A sejteket és sejttörmelékeket ezután a szuszpenzióból 0 °C-on végzett 30 percig tartó 880 ford/perc-es centrifúgálással kiülepítettük, és az oldható fehérjéket tartalmazó felülúszót kinyertük. A felülúszó 1 ml-t ezután amilózgyantát tartalmazó oszlopon (New England Biolabs) megkromatografáltuk.
A kromatográfiás eljárás során alkalmazott elúciós puffért úgy állítottuk elő, hogy 10 ml oszloppuferhez 10 mmól/1 végkoncentrációig maltózt adtunk.
A negatív kontroli-mintát is megkromatografáltuk. A negatív kontrolimintát a fentiek szerint állítottuk elő, azzal a különbséggel, hogy olyan sej• · · · • ··· ··4 • · 4 ·*
4 4 44 444
- 120 teket tenyésztettünk, melyek a pMAL-c-vektort tartalmazták, amely vektor semmilyen cDNS-inszertet nem hordozott. Ezután meghatároztuk a kromatográfiás frakciókban található fehérjék redukáló aktivitását.
iii)A redukáló aktivitás meghatározása
A redukáló aktivitás meghatározását küvettában végeztük (SARSTEDT, 10 x 4 x 45 mm), diklórfenol-indofenol (DCIP), valamint oxidált glutation alkalmazásával.
a) A redukáló aktivitás meghatározása DCIP-alkalmazásával
A fenti ii) pont alapján előállított kromatográfiás frakciókból 90,4 pg fehérjét tartalmazó mennyiséget - a fehérjekoncentrációt Protein Assay Kit (BIO-RAD) alkalmazásával határoztuk meg - külön-külön összekevertünk 1 ml 50 pm/1 DCIP-vel (Sigma). Ezután minden vizsgált mintához 15 pl 1 mmól/l-es NADPH-oldatot (Boehringer-Mannheim) adtunk, majd regisztráltuk az abszorbancia időbeli változását az OD6oonm és az OD340nm értékek rögzítésével. A 12. ábrán mutatjuk be a két különböző hullámhosszon mért abszorbancia-csökkenést, és a kísérleti eredményekből látható, hogy csak a pMAL31-7-plazmidot hordozó sejtekből készített kísérleti minta tartalmaz olyan faktort, amely a DCIP-t redukálja.
b) A redukáló aktivitás meghatározása oxidált glutation alkalmazásával
A fenti ii) pont alapján előállított kromatográfiás frakciókból 90,4 pg proteint tartalmazó mennyiségeket külön küvettákba helyeztünk, majd a küvettákhoz 15 ml 10 mmól/l-es oxidált glutation oldatot (BoehringerMannheim) adtunk. Ezután minden küvettához 15 pl 1 mmól/l-es NADPHoldatot adtunk, majd mértük az OD340nm érték időbeli változását. A kísérleti eredményeket a 13. ábrán mutatjuk be, és a kísérleti eredményekből látható, r
- 121 hogy kizárólag a pMAL31 -7-plazmidot tartalmazó sejtekből izolált proteint tartalmazó kísérleti minta volt képes az oxidált glutationt redukálni. Azt is megfigyeltük, hogy oxidált glutation hiányában NADPH-fogyasztás nem volt kimutatható, és ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a pMAL31-7mintában található protein csak NADPH jelenlétében képes redukálni az oxidált glutationt.
15. példa
Fehérjetisztítás és N-terminális aminosav-sorrend meghatározás
A 13. példa alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a pSRa31-7His-vektorral transzferált COS-1-sejtek három különböző N-terminális végződéssel jellemezhető polipeptidet expresszálnak.
Külön kísérletben nyulakat immunizáltunk a pMAL31-7-plazmiddal transzformált E. coli sejtekből izolált fúziós proteinnel, abból a célból, hogy a KM31-7-fehérje ellen poliklonális ellenanyagot termeltessünk. Az ily módon előállított poliklonális ellenanyag alkalmazásával Westem-blot eljárást hajtottunk végre, és megállapítottuk, hogy a pSRa-31-7-vektorral transzfektált COS-1-sejtek tenyészetének szérummentes felülúszójával ezzel az eljárással is három különböző fehérjecsíkot lehet kimutatni. A kapott eredmény hasonló volt a 13. példában ismertetett kísérleti eredményekhez.
Az elmondottak értelmében COS-1-sejteket transzferáltunk pSRa31-7-vektorral, azzal a céllal, hogy nagy mennyiségű szérummentes feltllúszóhoz jussunk, amely lehetővé teszi a KM31-7-fehérje tisztítását és Nterminális szekvenciaanalízisét.
COS-1-sejteket transzferáltunk pSRa-31-7-plazmiddal, majd a sejteket 150 mm átmérőjű Petri-csészékben, melyek 30 ml DMEM-táptalajt • « ··«>
- 122 tartalmaztak három napig tenyésztettük. A tenyészet felülúszóját ezután kinyertük, majd minden Petri-csészébe 30 ml friss táptalajt helyeztünk, és a tenyésztést további három napig folytattuk. Ezután a tenyészetek felülúszóját ismét begyűjtöttük. A transzfekció és a tenyésztés egyéb körülményei azonosak voltak all. példában leírtakkal, azzal a különbséggel, hogy a tenyésztést 199 Petri-csészében folytattuk.
A begyűjtött felülúszókat ezután összeöntöttük, és centrifúgálás után 10 1 szérummentes felülúszóhoz jutottunk, amit egy éjszakán át 10 mmól/1 Tris-HCl-pufferrel (pH=9,0) szemben dializáltunk. A dializált preparátumot azután nyolc alkalommal ioncserélő kromatográfiának vetettük alá, FPLCberendezés alkalmazásával (Phannacia), a kromatográfía körülményei a következők voltak:
Oszlop: 20 ml DEAE Sepharose Fást Flow (Phannacia) oszloptöltet, XK16/20 (0 2,0 x 20 cm, Phannacia) oszlopba töltve.
Elúciós pufferek:
A) 10 mmól/1 Tris-HCl (pH=9,0),
B) 10 mmól/1 Tris-HCl (pH=9,0), 0,5 mól/l NaCl.
Folyási sebesség: 1 ml/perc.
Frakciótérfogat: 3 ml/cső.
Elúciós körülmények: 60 perces lineáris koncentrációgradiens A pufferből kiindulva B pufferig.
A 0,1 mól/l és 0,4 mól/l nátriumkoncentráció között szedett frakciókat összeöntöttük, majd egy éjszakán át 0,1 mól/l Tris-HCl-t, 5 mmól EDTA-t (pH=7,6) és 1 mmól/1 2-merkaptoetanolt tartalmazó dialízis-pufferrel szemben dializáltuk. A dializált preparátumot ezután affinitáskromatográfiának t , V «···
- 123 vetettük alá, ”2', 5'-ADP Sepharose 4B oszloptöltet (Phannacia) alkalmazásával, az alábbi körülmények között:
Oszlop: 20 ml ”2', 5'-ADP Sepharose 4B oszloptöltet, XK16/20 (0
2,0 x 20 cm, Pharmacia) oszlopba töltve.
Elúciós pufferek:
A) 0,1 mmól/1 Tris-HCl, 5 mmól/1 EDTA (pH=7,6), mmól/12-merkaptoetanol,
B) 0,1 mól/l Tris-HCl, 5 mmól/1 EDTA (pH=7,6), 1 mmól/1 2,merkaptoetanol, 10 mmól/1 NADPH.
Folyási sebesség: 0,5 ml/perc.
Frakciótérfogat: 2 ml cső.
Elúciós körülmények: 120 perces lineáris koncentrációgradiens A pufferből kiindulva B pufferig.
A kapott frakciók mindegyikéből 100 μΐ mintát vettünk, amit TCAkicsapásnak vetettünk alá, és a TCA-csapadékokat 12,5 %-os gélben SDSPAGE-eljárással elválasztottuk, redukáló körülmények között.
Az elekroforézist követően a gélt ezüst-festéssel megfestettük, a proteincsíkok azonosítása céljából. All. frakciótól kezdődően 3 fehérjecsíkot azonosítottunk.
A 11-14. frakciók maradékát összeöntöttük és TCA-kicsapással dekoncentráltuk, majd a csapadékot SDS-PAGE-eljárással elválasztottuk,
12,5 %-os gélben, redukáló körülmények között. Az elektroforézist követően a fehérjéket a gélből egy ProBlot PVDF-membránra (Applied Biosystems) transzferáltuk. A fehérjék membránra történő transzferálását követően a membránt 0,2 % naphthol blue black festékkel megfestettük, «· ·*·· • · ···
- 124 - és a három proteincsíkot a membránból kivágtuk. Ezután gázfázisú proteinszekvenátor alkalmazásával N-terminális szekvenciaanalízist hajtottunk végre.
A három különböző proteincsík közül a legkisebb látszólagos molekulatömegűnek az N-terminális aminosav-sorrendje a következőnek adódott: Lys-Leu-Leu-Lys-Met. Ennek az öt aminosavnak a sorrendje megegyezik a pSRct-31-7-plazmid cDNS-inszertje által kódolt polipeptid N-terminálisától számított 49. aminosavjától kezdődő öt aminosav-szekvenciájával. Az eredményekből azt a következtetést vontuk le, hogy a polipeptid hasítása a 48. aminosavnál az N-terminális lizinnel kezdődő érett formájú proteint eredményezte.
16. példa
A KM31-7-proteín ellen termeltetett monoklonális ellenanyag előállítása
a) Az antigén protein előállítása pMAL31-7-plazmidot hordozó E. coli sejtekből inokulum-tenyészetet készítettünk, oly módon, hogy 3 ml 50 pg/ml amplicillint tartalmazó LBtáptalajba egy szélesztőkaccsal baktériumokat oltottunk és egy éjszakán át 37 °C-on rázattuk a tenyészetet. A kapott inokulum-tenyészet 1 ml-ével 50 pg/ml amplicillint tartalmazó 100 ml friss LB-táptalajt oltottunk be, majd ezt a tenyészetet 37 °C-on rázatva 0,5 OD6oonm értékig tenyésztettük. Ezután a tenyészethez IPTG-t adtunk 0,1 nimól/1 végkoncentrációban, majd a tenyészetet egy éjszakán át 37 °C-on továbbtenyésztettük.
A kapott tenyészetből a sejteket 20 percig 4 °C-on 6500 ford/perc-cel végzett centrifugálással kiülepítettük, majd az üledéket 10 ml oszloppuferben felszuszpendáltuk. A kapott sejtszuszpenzióban a sejteket
- 125 ultrahangos dezintegrátor alkalmazásával feltártuk, és a kapott folyadékot 0 °C-on 30 percig 8000 ford/perc-cel centrifugáltuk. A kapott felülúszó tartalmazta az oldható fehérjéket.
A fentiek szerint előállított oldható fehérjéket tartalmazó frakciót 1 ml amilóz gyantát tartalmazó oszlopon megkromatografáltuk. Az eiúciót 10 mmól/1 maltózt tartalmazó 10 ml oszloppuferrel végeztük. A fentiek szerint kromatográfiásan tisztított fúziós fehérjét eltettük, majd antigénként alkalmaztuk.
b) Immunizált egérlépseitek előállítása
A fenti a) pont szerint előállított antigén 2 ml-éhez (200 pg fehérjét tartalmazott) 2 ml Freund-féle adjutánst adtunk, és emulziót képeztünk. Ezt az emulziót üvegcsatlakozóval ellátott 5 ml-es fecskendővel szívtuk fel, és az emulziót 8 hetes hím BALB/c-egerek szubkután injektálás útján történő immunizálására használtuk.
A második immunizálást az első immunizáláshoz hasonlóan végeztük, azzal a különbséggel, hogy adjuvánsként Freund-féle inkomplett adjuvánst alkalmaztunk. Összesen négy immunizálást hajtottunk végre, kb. két hetenként egy immunizálást végezve.
A második immunizálástól kezdődően az immunizálásokat közvetlenül megelőzően a fundus oculi venosus plexusából vért vettünk, és a szérumból meghatároztuk az anti-KM31-7-ellenanyagtitert, szilárd fázisú enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárást (ELISA) alkalmazva. Szilárdfázisú anti-KM31-7 EL1SA pSRa-31-7-vektorral transzfektált COS-l-sejtek tenyészetének szérummentes fel ül úszójából 150-200 pl-t (mely kb. 200 ng fúziós proteint tar- 126 talmazott) egy 96 mélyületü ELISA-tálca (Costar) mélyületeibe helyeztünk, antigénként. A tálcát ezután egy éjszakán át 4 °C-on állni hagytuk, és így a mélyületek alsó részének felszíne antigénnel burkolódott. A következő napon hat tálcát háromszor mostuk 0,1 % Tween 20/foszfáttal puffereit sóoldattal (0,1 % Tween 20/PBS), majd minden mélyületbe 100 pl PBS-ben készített 10 pg/ml-es BSA-oldatot helyeztünk, és a tálcát egy órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagytuk.
Ezután a tálcát háromszor mostuk 0,1 % Tween 20/PBS-oldattal. Ezután minden mélyületbe 30-100 μΐ első ellenanyagot adtunk, sorozathígított formában (például egérszérumot, hibridóma tenyészetfelülúszót vagy monoklonális ellenanyagot), majd a tálcát szobahőmérsékleten egy órán keresztül állni hagytuk.
Ezután a tálcát ismételten háromszor mostuk 0,1 % Tween 20/ PBSoldattal, majd minden mélyületbe 100 μΐ második ellenanyagot adtunk. A második ellenanyag vagy kecske antiegér IgG-peroxidáz komplex (Amersham) ellenanyag 3000-szeresen hígított oldata volt, vagy pedig kecske antiegér IgG - alkalikus foszfatáz komplex (BIO-RAD) ellenanyag 3000szeresen hígított oldata. A tálcát ezután szobahőmérsékleten 1-2 órán át állni hagytuk.
A lemezt ezután ismételten háromszor mostuk 0,1 % Tween 20/ PBSoldattal, majd vagy 100 μΐ peroxidáz szubsztrát oldatot (BIO-RAD, “Peroxidase Substrate Kit ABTS”) vagy pedig 100 μΐ 0,001 para-nitrofenilfoszfát tartalmú 10 %-os dietanolamin-oldatot adtunk minden mélyületbe. A tálcát ezután 15-30 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk, mely idő után az ellenanyag-titert az abszorbancia 415 nm-en vagy 405 nm-en történő
- 127 meghatározása alapján számítani tudtuk. Az abszorbancia meghatározást mikrotiter-tálca leolvasó berendezésben (microplate reader, BIO-RAD) végeztük.
cl Egér-mielómaseitek előállítása
P3-063-Ag8.653 (653; ATCC, no. CRL-1580) 8-azaguanin-rezisztens egér-mielómasejteket tenyésztettünk normális táptalajban (komplett GIT), minimálisan 2 x 107 sejt előállítása céljából.
d) Hibridómasejtek előállítása
A fenti b) pont szerint előállított 1,4 x 108 immunizált egér lépsejtet alaposan megmostunk DMEM-oldattal (Nissui Phannaceutical). A megmosott sejteket ezután összekevertük 1,5 x 107 P3-X63-Ag8.653 (653) egérmielómasejtekkel, melyeket a fenti c) pont szerint állítottunk elő, majd a kapott keveréket hat percig 800 ford/perc-cel centrifugáltuk.
Ezután a lépsejtek és a P3-X63-Ag8.653 (653) sejtek keverékét tartalmazó üledéket kinyertük, és a sejteket összetörtük. Ezután az összetört sejtekre keverés közben egy perc leforgása alatt 2 ml/perc hozzáadási sebességgel DMEM-oldatban előre elkészített 50 %-os polietilén glikol 4000 (PEG-4000) oldatot csöpögtettünk. Ezután hasonló módon egy perc alatt 2 ml/perc hozzáadási sebességgel a sejtpreparátumhoz DMEM-oldatot csöpögtettünk. Ezt az eljárást egyszer megismételtük mind a polietilén glikol, mind pedig a DMEM-oldatokkal. Végül a sejtkeverékhez három perc leforgása alatt folyamatosan adagolva 16 ml DMEM-oldatot adtunk. A kapott sejtpreparátumot 6 percig centrifugáltuk 800 ford/perc-cel. A kapott feliilúszót elöntöttük, majd a sejteket 35 ml teljes GIT-táptalajban vettük fel, amely 5-10 ng/ml egér IL-6-ot tartalmazott.
-128 -
e) A hibridómák szűrővizsgálata
A fenti d) pont szerint előállított sejtszuszpenzióból 100 μΐ-t helyeztünk egy 96 mélyületü tálca (Sumimoto Bakelité) minden mélyületébe, majd a tálcát 7,5 %-os CO2 atmoszférában 37 °C-on inkubáltuk. Hét nap inkubálást követően minden egyes mélyületbe 50 μΐ HAT táptalajt helyeztünk. További négy nap inkubálás után újabb 50 μΐ HAT-táptalajt adtunk minden mélyületbe. A tálcát ezután három további napig inkubáltuk. Ez idő eltelte után azokból a mélyületekből, ahol a fuzionált sejtek kolóniákat növesztettek, a tenyészet felülúszójának egy részét eltávolítottuk, és a kivett mintákból a fenti b) pontban leírt szilárdfázisú ELISA-eljárás alkalmazásával meghatároztuk az anti-KM31-7-ellenanyag titerét. A kivett sejtfelülúszó minták helyett azonnal azonos mennyiségű HT-táptalajt helyeztünk a mélyületekbe.
f) Klónozás
A pozitívnak mutatkozó mélyületekből származó sejteket határhígításos analízis alkalmazásával háromszor klónoztuk. Azokat a kiónokat, melyek konzisztens ellenanyagtiter-értékeket produkáltak, kiválasztottuk antiKM31-7 monoklonális ellenanyagtermelő hibridóma sejtvonalakként. Ebben a fázisban nem csak a fenti b) pontban leírt ELISA-teszteket hajtottuk végre, hanem kontroll-EL IS A-vizsgálatot is végeztünk, a pcDL-pSRa296plazmiddal transzfektált COS-1-sejtek felülúszóiból mintát véve (ezt a felülúszót használtuk az ELISA-eljárásban a szilárd fázis kialakításához). Az elmondottak értelmében azokat a sejtvonalakat választottuk ki klónozásra, melyek az elsőként leírt ELISA-tesztben pozitívnak bizonyultak, de a kontroll-ELISA-ban nem reagáltak.
- 129 -
g) Monoklonális ellenanyagok tisztítása
Az anti-KM31-7 monoklonális ellenanyagokat termelő hibridóma sejtvonalak tenyészeteinek felülúszóit összegyűjtöttük, majd egy 0,22 μιη pólusátmérőjü filter (Millipore) alkalmazásával sterilre szűrtük, majd az ellenanyagot a felülúszóból izoláltuk a “MAbTrap GII” reagenskészlet (Pharmacia) alkalmazásával.
h) A monoklonális ellenanyagok vizsgálata
1) A monoklonális ellenanyagok antigén specifitása
A monoklonális ellenanyagok KM31-7-fehérje-specifítását pSRoc-317-plazmiddal transzferált COS-1-sejtek szérummentes felülúszójának alkalmazásával végzett immunkicsapásos vizsgálattal igazoltuk.
2) A monoklonális ellenanyagok osztályba sorolása
Az előállított monoklonális ellenanyagok osztályba sorolását egér monoklonális ellenanyag izotípus meghatározó reagenskészlet (Amersham) alkalmazásával végeztük, és a termelt ellenanyagok az IgGl-alosztályhoz tartozónak bizonyultak.
17. példa
A KM31-7-fehérje izolálása és tisztítása antigén fehérje izolálása és tisztítása antigén-ellenanyag-reakció felhasználásával
Az eljárást a fenti 16. példa h) 1) pontja alapján végeztük. A leírt vizsgálatot elvégeztük a pcDL-pSRa296-plazmiddal transzfektált COS-1sejtek tenyészetének ellenanyag- és széruminentes felülúszójával is.
Mindegyik szérummentes felülúszó 1,7 ml-éhez 1,4 pg monoklonális ellenanyagot adtunk, és az antigén ellenanyag reakció lejátszódására egy óra időt hagytunk, mialatt a felülúszókat 20 ford/perc-cel centrifugáltuk,
- 1302,2 ml-es mikrocentrifuga-csövekben. A kontroli-kísérletet úgy végeztük, hogy a pSRa-31-7-plazmiddal transzfektált COS-1-sejtek szérummentes felülúszójához nem adtunk monoklonális ellenanyagot.
μΐ - 0,1 % Tween 20/ PBS-oldattal előzetesen megmosott Protein G Sepharose 4 Fást Flow (Pharmacia) kromatográfiás töltetet adtunk minden centrifugacsőhöz, az ellenanyag abszorbeáltatása céljából, és a centrifugálást 20 ford/perc-cel 30 percen keresztül szobahőmérsékleten folytattuk.
A 30 perc elteltével valamennyi keveréket néhány másodpercig 10.000 ford/perc-cel centrifugáltuk mikrocentrifugában, majd a felülúszót óvatosan elöntöttük oly módon, hogy az üledékből semmi se vesszen kárba. Az üledékeket ezután egyenként megmostuk 0,1 % Tween 20/ PBS-oldattal, majd mikrocentrifugálás következett, és ezt az eljárást ötször megismételtük.
A kapott üledéket felszuszpendáltuk SDS-PAGE-mintafelvevö pufferben, amely 10 μΐ 2-merkaptoetanolt tartalmazott. Minden egyes szuszpenziót két percig 90 °C-on hevítettünk, majd SDS-PAGE-eljárást hajtottunk végre 12,5 %-os gélben, redukáló körülmények között. Az elektroforézist követően a szétválasztott fehérjéket a poliakrilamid-gélből nitrocellulóz filmre (BIO-RAD) transzferáltuk. Az 1) példa a) pontja szerint előállított anti-KM31-7 poliklonális ellenanyag alkalmazásával Westem-blot eljárást hajtottunk végre, és kimutattuk, hogy az anti-KM31-7 monoklonális ellenanyag specifikusan kicsapja a COS-l/pSRa-31-7-sejtek tenyészetének szérummentes felülúszójában található KM31-7-fehérjét.
- 131 -
18. példa
A CYVV-NIa/KM31-7 fúziós fehérje előállítása
Abból a célból, hogy a KM31-7-fehérjét a CYVV-NIa proteázos eljárás alkalmazásával expresszáltatni tudjuk, szükséges, hogy az NIa-gén 3'végét a KM31-7-fehérjét kódoló DNS-hez azonos leolvasási fázisban tudjuk csatlakoztatni. Az elmondottak érdekében az alábbi kétlépéses eljárást hajtottuk végre.
i) A KM31-7-cDNS 3'-végi részletének (Smal-XbaL 1006 bp) bejuttatása pKSUN9-plazmidba
Abból a célból, hogy előállítsuk a KM31-7-cDNS 3'-végét tartalmazó Smal-Xbal-fragmenst (1006 bp), Smal és Xbal restrikciós enzimekkel megemésztettünk 7 pg pSRoc-31-7-plazmid DNS-t, majd a kapott ffagmenst 0,8 %-os agaróz gélből izoláltuk és tisztítottuk, GENECLEAN II reagenskészlet (Funakoshi, Japán) alkalmazásával.
Külön kísérletben megemésztettünk 5 pg pkSUN-9-plazmid-DNS-t, szintén Smal- és Xbal-enzimekkel, és a hasított vektort marhaeredetű lúgos foszfatázzal defoszforiáltuk (Alkaline Phosphatase E. coli C75”, Takara Shuzo, Japán). A kapott defoszforilált linearizált DNS-t összeligáltuk a KM31-CDNS Smal-Xbal-ffagmensével, egy ligációs reagenskészlet alkalmazásával (Takara Shuzo), majd az így kialakított konstrukcióval E. coli JM-109-sejteket transzformáltunk. A kapott transzformánsokat szelektáltuk és szűrő vizsgálatnak vetettük alá őket, és így izoláltuk a pNIa31-7SXplazmidot tartalmazó kiónt, amely tartalmazta a kívánt Smal-Xbalfragmenst.
- 132 ii) A KM31-7-fehérjét és az NIa-proteázt kódoló gének összekapcsolása
Abból a célból, hogy az NIa-fehérje C-terminális szekvenciáját kódoló DNS-t össze tudjuk kapcsolni az N-terminális valint tartalmazó KM31-7fehérjevariáns N-terminális végét kódoló DNS-szekvenciával, azonos leolvasási fázisban, négy különböző típusú polimeráz láncreakció (PCR) indítására alkalmas láncindító oligonukleotidokat szintetizáltunk, a Model 392 DNS Synthesizer berendezés alkalmazásával (Perkin Elmer Japan Applied Biosystems). A megszintetizált láncindító oligonukleotidok szekvenciája a következő:
5-GGT CAG CAC AAA TTT CCA-3' (szekvenciaazonosító szám: 15) (1),
5-AAA CAC AAC TTG GAA TGA ACA ATT-3' (szekvenciaazonosító szám: 15) (2), 5-TCATTC CAAGTT GTG TTT GTG AAA-3' (szekvenciaazonosító szám: 15) (3), 5-CAT AGG ATG CTC CAA CAA-3' (szekvenciaazonosító szám: 15) (4).
Az első PCR-reakciót 1 pg pKSUN9-plazmid-DNS templátként történő alkalmazásával hajtottuk végre. A reakcióelegyhez sorrendben a következő összetevőket adtuk: 100 pmól (1) és 100 pmól (2) láncindító oligonukleotid, 1/10 térfogat lOx Taq-polimeráz reakciópuffer és 5 egység Taq-polimeráz (Takara Shuzo). A PCR-reakciót az alábbiak szerint végeztük: 72 °C 3 perc, 30 ciklus, 94 °C 1 perc, 55 °C 2 perc, 72 °C 3 perc, majd 72 °C 10 perc. A PCR-reakciót követően az amplifikált DNS-terméket 8 %-os poliakrilamid gélben elektroforetizáltuk. A gélben etidium-bromidos festéssel azonosítottuk a DSN-t tartalmazó csíkokat, melyeket azután a gélből kivágtunk. A kivágott géldarabkákat összetörtük és 300 μΐ elúciós puffért adtunk hozzájuk (0,5 mól/l ammónium acetát, 1 mmól/1 EDTA, pH=8,0), majd az összezúzott géldarabkákat az elúciós püffedjen egy éjszakán át 37 °C-on állni
I
- 133 hagytuk. A géldarabkákat centrifiigálással távolítottuk el és a felülúszó tartalmazta a tisztított amplifikált DNS-t.
Ezután egy újabb PCR-eljárást hajtottunk végre a fentihez hasonló módon, azzal a különbséggel, hogy templátként 1 pg pUCKM31-7 plazmidDNS-t használtunk, és láncindító oligonukleotidként a 3 és 4 oligonukleotidot, a keletkezett amplifikált DNS-t a fentiek szerint tisztítottuk.
Az első PCR-reakcióban amplifikált DNS-fragmens tartalmazta a kM31-7-fehérje N-terminális végét kódoló szekvenciát, amely a Val-Val-Pheszekvenciával kezdődik, egészen az NIa-génben található Xhol hasítási helytől 5'-irányban található 31. bázispárig. A második PCR-reakcióval amplifikált DNS-fragmens tartalmazta az NIa-fehérje C-terminális végéről származó Asn-Cys-Ser-Phe-Gln aminosav-sorrendet kódoló DNSszekvenciát, egészen a KM31-7-cDNS-ben található Smal-hasítóhelytől 3'irányban elhelyezkedő 32 bázispárig.
Az elmondottakból következik, hogy amennyiben végrehajtunk egy PCR-reakciót a fenti két PCR-reakcióban keletkezett DNS-fragmenst együttesen templátként használva, az 1 és a 4 láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, a reakció eredményeként egy olyan hibridizált DNS-láncot kapunk, amely az NIa-gén 3'-terminális részéből 9 bázispárt tartalmaz, valamint a KM31-7-fehérje kívánt N-tenninálisát kódoló szekvenciából 15 bázispárt. Ily módon lehetséges egy fuzionált DNS-szekvencia előállítása, amelynek az előzőekben leírt részlete szolgál kapcsolószekvenciaként.
Az elmondottaknak megfelelően végrehajtottunk egy további PCRreakciót, és az amplifikált fragmenst izoláltuk a gélből.
I • ·
- 134 iii) Az NIa/KM31-7-DNS bejuttatása a pNIa31-7SX-plazmidba
Az i) pont szerint előállított pNIa31-7SX-plazmid DNS 5 pg-ját megemésztettük Xhol- és Smal-enzimekkel, majd a kapott DNS-t marhaeredetü lúgos foszfatázos kezeléssel defoszforiáltuk. Az ii) pont szerint előállított PCR-terméket szintén megemésztettük Xhol- és Smal-enzimekkel, majd a kapott fragmenst a linearizált, defoszforilált pNIa31-7SX-plazmidba ligáltuk, ligációs reagenskészlet alkalmazásával. A kapott plazmidkonstrukcióval E. coli JM-109-sejteket transzfonnáltunk.
Ampicillinrezisztens transzformánsokat izoláltunk, és szűrővizsgálatnak vetettük alá őket. A szűrővizsgálatot úgy hajtottuk végre, hogy a transzfonnánsokból izolált plazmid DNS-t Xhol-enzimmel emésztettük, majd az emésztett DNS-t elektroforézissel elválasztottuk. Azokat a kiónokat választottuk ki, melyek kizárólag egy 8,0 kb molekulatömegű DNS-csíkot tartalmaztak. A kiválasztott kiónokból izolált plazmid-DNS-t ezután megemésztettük mindhárom enzimmel, majd ismételten elektroforézist hajtottunk végre. Kiválasztottunk egy plazmidot, amely tartalmazott egy 330 bázispáros csíkot, amely az NIa-cDNS egy részletének felelt meg. Ezt a plazmidot pNIa31-7Vnek neveztük el. Az izolált plazmid inszertként tartalmazta az Xhol- és Smalenzimekkel emésztett PCR-terméket.
Meghatároztuk a pNIa31-7V-plazmid bázissorendjét, és ily módon meggyőződtünk arról, hogy az NIa- és a KM31-7-fehérjéket kódoló szekvenciák azonos leolvasási fázisban kapcsolódtak egymáshoz, oly módon, hogy az Nla-fehérjét és a KM31-7-fehérjét kódoló szekvenciák között a szükséges Gin-Val hasítóhelyet kódoló szekvencia volt található.
ι
- 135 - iv) A KN31-7-fehérie előállítása
Westem-blot eljárással igazoltuk, hogy a pNIa31-7V-plazmid E. coli sejtekben működik, és hogy a megalkotott rekombináns gén expressziója folytán KM31 -7-fehérje keletkezik.
pNIa31-7V-plazmidot hordozó E. coli sejtekből inokulum tenyészetet készítettünk, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó 3 ml LB-táptalajban, egy éjszakán át történő rázatással. Az inokulum tenyészetből 1 ml-t 100 ml friss LBtáptalajhoz adtunk, amely szintén tartalmazott 50 pg/ml amplicillint, majd a tenyészetet 37 °C-on rázattuk, amíg az OD6oonm-érték el nem érte az 1,0-át. Ezen a ponton a tenyészethez IPTG-t adtunk, 1 mmól/1 végkoncentrációig, majd a tenyészetet két további éjszakán át 28 °C-on rázattuk.
Ezután a tenyészetből 1 ml-t mikrocentrifugacsőbe helyeztünk, majd a csövet 5 percig 15.000 ford/perc-cel centrifugáltuk. A felülúszót elöntöttük, és az üledéket felszuszpendáltuk 300 μΐ steril vízbe, majd a szuszpenzióhoz 300 μΐ 2-merkaptoetanolt tartalmazó SDS-PAGE mintafelvevő puffért adtunk, és ily módon a leülepedett sejteket feltártuk. A kapott szuszpenziót két percig 95 °C-on hevítettük, majd a kapott szuszpenzióból 10 μΙ-t 8 %-os gélben SDS-PAGE-eljárásnak vetettünk alá, redukáló körülmények között.
Az elektroforézis után a gélből a fehérjéket nitrocellulóz membránra transzferáltuk. Ezt oly módon értük el, hogy a gélre membránt helyeztünk, majd a gélt és a membránt egy gél-membrán-transzfer berendezésben (Marisol, Japán) transzfer-pufferben (25 mmól/1 Tris-HCl, 1,4 % glicin és 20 % metanol) inkubáltuk, 4 °C-on, 2,5 óráig, és a transzfert 19 V alkalmazásával hajtottuk végre.
• ·
- 136A nitrocellulóz membránt ezután 20 ml PBS-T-oldattal mostuk, majd a membránt blokkoltuk egy órán keresztül 20 ml PBS-T-oldatban, amely tartalmazott 5 % lefölözött tejet (Snow Brand Co., Ltd). A blokkolás után a membránt kétszer leöblítettük 20 ml PBS-T-oldatban, majd 90 percig reagálni hagytuk 20 ml PBS-T-oldatban, amely tartalmazott 1 pl steril vízzel 100szorosra hígított anti-KM31-7 nyúl-MAb-szérumot (első ellenanyag). A nitrocellulóz filmet ezután egyszer 15 percre és kétszer 5 percre 20 ml PBST-oldatban áztattuk.
A megmosott membránt ezután PBS-T-ben oldott 3000-szer hígított peroxidázzal jelzett kecskében nyúl-IgG ellen termeltetett ellenanyagot (BIORAD) tartalmazó oldatba merítettük (második ellenanyag, lásd fent), majd a membránt az oldatban egy órán keresztül állni hagytuk. A membránt ezután 20 ml PBS-T-oldatban mostuk, majd ECL-detektáló reagenst (Amersham) tartalmazó oldatba merítettük, majd az anti-KM31-7-ellenanyaggal reagáló csíkokat autoradiográfiával azonosítottuk.
Az elmondott Westem-blot eljárás végrehajtása után egy kb. 60.000 dalion molekulatömegü fehérjecsíkot detektáltunk. A fehérjecsík elektroforetikus mobilitása azonos volt a pSRa-31-7-plazmiddal transzfektált COS-1-sejtek tenyészetének szérummentes fel ül úszójában detektált három KM31-7-fehérjecsík közül a második legnagyobb molekulatömegnek megfelelő csík mobilitásával.
- 137 TÁPTALAJOK, PUFFEREK x mól/l-es foszfátpuffer
Egy x mól/l-es Na2HPO4-oldat pH-ját a kívánt értékre állítjuk be x mól/l-es NaH2PO4 oldat alkalmazásával.
Inokulációs puffer
0,1 mól/1 Tris-HCl-puffer, pH=7,0, 0,05 mól/1 EDTA, 1 % 2merkaptoetanol.
Extrakcíós puffer
0,1 mól/1 Tris-HCl-puffer, 0,05 mól/1 EDTA, 1 % 2-merkaptoetanol, pH=7,0.
Degradácíós oldat
200 mmól/1 ammónium-karbonát, 2 % SDS, 2 mmól/1 EDTA, 400 pg/ml bentonit, 20 pg/'ml proteáz K (pH=9,0).
lxSSC
0,15 mól/1 NaCl, 0,015 mól/1 trinátrium-citrát, pH=7,0.
Folyékony LB-táptalaj g Bacto Tryptone (Difco), 5 g Bacto yeast extract (Difco), 5 g nátrium-klorid, desztillált vízzel 1 1-re kiegészítve.
Tris-kálcium-puffer mmól/1 Tris, 50 mmól/1 kálcium-klorid, a pH sósavval 7,4-re állítva. Lízis-puffer
0,17 g szacharóz, 250 μΐ 1 mmól/1 Tris-HCl-puffer (pH=8,0), 200 μΐ 0,5 mmól/1 EDTA (pH=8,0), kétszer desztillált vízzel 20 ml-re kiegészítve.
♦ · »
- 138Lúgos SDS-oldat
0,2 mmól/1 nátrium-hidroxid, 1 % SDS.
TBE-oldat
100 mmól/1 Tris, 100 mmól/1 bórsav, 1 mmól/1 EDTA.
Denaturáló oldat
1,5 mmól/1 nátrium-klorid, 0,5 mmól/1 nátrium-hidroxid.
Semlegesítő puffer
0,5 mmól/1 Tris, 3 mmól/1 nátrium-klorid (pH=7,4).
50x Denhardt-oldat % polivinil-pirrolidon, 1 % marhaszérum albumin, 1 % fíkol-400. Az így készített törzsoldatot azután kétszer desztillált vízzel a kívánt koncentrációjúra hígítjuk.
5x denaturáló puffer
125 μΐ 1 mmól/l-es glicinoldat (pl 1-9,0), 25 μΐ 1 mmól/l-es magnézium-klorid-oldat, 850 μΐ kétszer desztillált víz.
5x jelölő puffer μΐ 1 mmól/l-es Tris-HCl-puffer (pH=7,9), 5 μΐ 1 mmól/l-es magnézium-klorid-oldat, 2,5 μΐ 1 mólos ditriotreitol-oldat, 9,2 μΐ kétszer desztillált víz.
lOx M9-sóoldat
0,145 mmól/1 dinátrium-hídrogén-foszfát, 0,172 mól/l káliumdihidrogén-foszfát, 0,187 mól/l ammónium-klorid, 0,137 mól/l nátrium-klorid, pH=7,0.
- 139 Agar-tartalmú M9-minimáltáptalai ml lOx M9-sóoldat, 100 μΐ 1 mól/l-es magnéziumszulfát-oldat, 1 ml 20 %-os glikóz-oldat, 50 μΐ 1 %-os tiamin-hidroklorid sóoldat, 1 μΐ 0,01 mól/l-es kálcium-klorid-oldat, 13 ml kétszer desztillált víz. Az összetevőket összekeverjük, az oldatot szűréssel sterilizáljuk, majd 50 ml 3 %-os Bactoagar-oldat hozzáadása után azonnal Petri-csészékbe öntjük. Folyékony SOB-táptalai g Bactotiyptone, 2,5 g Bactoyeast extract, 100 μΐ 5 mól/l-es nátrium-klorid-oldat, 125 μΐ 1 mól/l-es kálium-klorid oldat. Az összetevőket összekeverjük és desztillált vízzel 500 ml-re kiegészítjük. Autoklávozás után az oldathoz 5 ml 1 mól/l-es magnézium-klorid-oldatot és 5 ml 1 mól/l-es magnézium-szulfát oldatot adunk.
TFBl-puffer ml 1 mól/l-es 2-(N-morfolino)-etán-szulfonsav (MES - a pH-ja 1 mól/l-es sósav-oldattal 6,2-re beállítva), 6,045 g rubídium-klorid, 0,735 g kálcium-klorid-bihidrát, 4,94 g mangán-klorid tetrahidrát. Az összetevőket összekeverjük, a pH-t jégecettel 5,8-ra állítjuk be, majd az elegyet kétszer desztillált vízzel 500 ml-re egészítjük ki, és szűréssel sterilizáljuk. TFB2-puffer ml 1 mól/l-es 2-(N-morfolino)-propán-szulfonsav (MOPS), 1,102 g kálcium-klorid-bihidrát, 0,12 rubídium-klorid, 15 ml glicerin. Az összetevőket összekeverjük, a pH-t jégecettel 6,5-re állítjuk be, majd az elegyet kétszer desztillált vízzel 100 ml-re egészítjük ki, és szűréssel sterilizáljuk.
Folyékony SOC-táptalai ml folyékony SOB-táptalaj, 90 μΐ 20 %-os glükoz-oldat.
» · 9 · • · · · · · · • · · « « · • · · · * • ·· «· ·· «
- 140 2χ YT-táptalai g Bactotryptone, 5 g Bactoyeast extract, 5 g nátrium-klorid. Az összetevőket összekeverjük és az elegyet kétszer desztillált vízzel 1 1-re egészítjük ki.
PBS-Tw-oldat mmól/1 dinátrium-hidrogénfoszfát, 20 mmól/1 nátriumdiliidrogénfoszfát, 100 mmól/1 nátrium-klorid, 0,1 % Twin-20.
PBS-T-oldat g nátrium-klorid, 0,1 g kálium-dihidrogén-foszfát, 1,45 g dinátriumhidrogénfoszfát-dodekahidrát, 0,1 g kálium-klorid, 0,1 nátrium-azid. Az öszszetevőket összekeverjük és az elegyet kétszer desztillált vízzel 1 1-re egészítjük ki, a pH-t 7,4-re állítjuk.
Alkalikus foszfatáz szubsztrát-oldat
0,01 % p-nitrofenil-foszfát, 10 %-os vizes dietanol-amin-oldatban oldva, melynek pH-ját 9,8-re állítottuk sósavval.
A-táptalai
DMEM (Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalaj, amely 4,5 g/1 glükózt tartalmaz), 10 % inaktivált magzati borjúsavó (Hyclone), 10 mmól/1 HEPES (pH=7,2).
B-táptalai
DMEM (4,5 g/1 glükózt tartalmaz), 10 mmól/1 HEPES (pH=7,2), 3 % inaktivált magzati borjúsavó, 5 pg/ml marliaeredetü inzulin (Sigma), 8 pg/ml d-biotin (Sigma), 4 pg/ml pantotén-sav (Sigma), 1,0 μιηόΐ/l dexametazon (Sigma), 0,5 mmól/1 izobutil-metil-xantin (Aldrich).
• · · ν • · · * » • · · ·♦ · ·· * * • «· ·· ·
- 141 C-táptalai
DMEM (4,5 g/1 glükózt tartalmaz), 5 % inaktivált magzati borjúsavó, 10 mmól/1 HEPES (pH=7,2), 100 ng/ml marha-inzulin.
D-táptalai
DMEM (4,5 g/1 glükózt tartalmaz), 5 % inaktivált magzati borjúsavó, 10 mmól/1 HEPES (pH=7,2), 100 ng/ml marha-inzulin, 10 egység/ml nátriumheparin (Novo Industry Co.).
LPL-szubsztrát-oldat mmól/1 glicerin-tri-[9,10 (n)-3H]-oleát (51,8 KBq/μιηόΙ, Amersham), 1,3 mg/ml L-a-foszfatidin-kolin-disztearoil (Sigma), 20 mg/ml marhaszénimalbumin (Sigma), 135 ml/1 Tris-hidroklorid [Tris-HCl (pH=8,l), Sigma], 16,5 térfogat-% glicerin, 16,5 térfogat-% inaktivált magzati borjúsavó. Guanídium-tiocianát-oldat mól/l guanídium tiocianát, 1 % Sarkosyl, 20 mmól/1 etilén-diamidtetraecetsav (EDTA), 25 mmól/1 nátrium-citrát (pH=7,0), 100 mmól/1 2merkaptoetanol, 0,1 % antifoam A (Sigma).
Adszorpciós puffer
0,5 mól/l NaCl, 20 mmól/1 Tris-HCl (pH=7,5), 1 mmól/1 EDTA, 0,1 % SDS.
Elúciós oldat mmól/1 Tris-HCl (pH=7,5), 1 mmól/1 EDTA, 0,05 % SDS.
A 2, példa szerinti reverz transzkriptáz reakcióoldat ml Tris-HCl (pH=8,3), 8 mmól/1 MgCU, 30 mmól/1 K.CI, 0,3 mmól/1 ditiotreitol, 2 mmól/1 dATP, 2 mmól/1 dGTP, 2 mmól/1 dTTP, 10 pCi [a
- 142 32P]dCTP, 1,4 pg vektor-láncindító-DNS (3'-oligo(dT)-farkazott pcDV-1, Pharmacia).
Terminális transzferáz reakcióoldat
140 mmól/1 kálium-kakodilát, 30 mmól/1 Tris-HCl (pH=6,8), 1 mmól/1 CaCb, 0,5 mmól/1 ditiotreitol, 0,2 pg poli-A, és 100 mmól/1 dCTP. Restrikciós enzimpuffer mmól/1 NaCl, 10 mmól/1 Tris-HCl (pH=7,5), 10 mmól/1 MgCl2, 1 mmól/1 ditiotreitol.
lOx ligázpuffer mmól/1 ATP, 660 mmól/1 Tris-HCl (pH=7,5), 66 mmól/1 MgCl2, 100 mmól/1 ditiotreitol.
Elektroforézis festék % glicerin, 0,01 mól/1 dinátrium-hidrogénfoszfát (pH=7,0), 0,4 % brómfenol-kék.
lx TAE-puffer
0,04 mól/1 Tris-acetát, 0,001 mól/1 EDTA.
lx SSCP-oldat
120 mmól/1 NaCl, 15 mmól/1 nátrium-citrát, 13 mmól/1 káliumdihidrogénfoszfát, 1 mmól/1 EDTA.
A 6, példa szerinti reverz transzkriptáz reakcióoldat lx első szál szintézis-puffer, 5 % nátrium-pirofoszfát, 100 egység ribonukleáz inhibitor, 1 mmól/1 dATP, 1 mmól/1 dGTP, 1 mmól/1 dTTP, 0,5 mmól/1 cDTP, 3,75 pg oligo(dT)-láncindító, a felsorolt összetevők rendelkezésre állnak a cDNA Cloning System reagenskészletben (Amersham).
« ·* ** -»»· • · Μ · · · 9 • ··· ·« » • · · · · ··· ·· ·· ·
- 143 SM-puffer
100 mmól/1 NaCl, 8 mmól/1 MgSO4x7H2O, 50 mmól/1 Tris-HCl (pH=7,5), 0,01 % zselatin.
Dialízis-puffer mmól/1 foszfát-puffer (pH=7,8), 0,5 mól/1 NaCl.
Oszloppuffer mmól/1 Tris-HCl (pH=7,4), 200 mmól/1 NaCl, 1 mmól/1 EDTA.
T aq-polimeráz reakciópuffer-oldat
A Taq-polimerázt tartalmazó 500 mmól/l-es Tris-HCl-oldat (pH=8,3), 500 mmól/1 KC1, 15 mmól/1 MgCl2, 100 mmól/1 dATP, 100 mmól/1 dCTP, 100 mmól/1 dGTP, 100 mmól/1 dTTP, 2 mg/ml zselatin.
- 144 SZEKVENCIALISTA
A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 1
HOSSZA: 1320 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kétszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS, mRNS-ről átírva
ANTISZENSZ: nem
EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS: a lóhere sárga erezettségét okozó vírus (CYVV)
SAJÁTSÁG:
1-1320 E CDS
10-1311 E mat-peptide
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
| AAG TTC | CAA Gin | GGG Gly | AAA AGT AAG AGA ACA AGA CAA AAG | TTG AAG TTC AGA | 48 | |||||||||||
| Lys 1 | Phe | Lys 5 | Ser | Lys | Arg | Thr | Arg 10 | Gin Lys | Leu Lys | Phe 15 | Arg | |||||
| GCG | GCA | AGA | GAC | ATG | AAG | GAT | CGT | TAT | GAA | GTG | CAT | GCC | GAT | GAG | GGG | 96 |
| Alá | Alá | Arg | Asp | Met | Lys | Asp | Arg | Tyr | Glu | Val | His | Alá | Asp | Glu | Gly | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| ACT | TTA | GTG | GAA | AAT | TTT | GGA | ACT | CGT | TAT | TCA | AAG | AAA | GGC | AAG | ACA | 144 |
| Thr | Leu | Val | Glu | Asn | Phe | Gly | Thr | Arg | Tyr | Ser | Lys | Lys | Gly | Lys | Thr | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| AAA | GGT | ACT | GTT | GTG | GGT | TTG | GGT | GCA | AAA | ACA | AGA | CGG | TTC | ACT | AAC | 192 |
| Lys | Gly | Thr | Val | Val | Gly | Leu | Gly | Alá | Lys | Thr | Arg | Arg | Phe | Thr | Asn | |
| 50 | 55 | 60 |
- 145-
| ATG Met 65 | TAT GGT | TTT Phe | GAC CCC ACG | GAG TAT TCA TTT | GCT AGG TAT | CTT GAT | 240 | |||||||||
| Tyr | Gly | Asp | Pro 70 | Thr | Glu | Tyr | Ser | Phe 75 | Alá | Arg | Tyr | Leu | Asp 80 | |||
| CCA | ATC | ACG | GGT | GCA | ACA | TTG | GAT | GAA | ACC | CCA | ATT | CAC | AAT | GTA | AAT | 288 |
| Pro | Ile | Thr | Gly | Alá | Thr | Leu | Asp | Glu | Thr | Pro | Ile | His | Asn | Val | Asn | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| TTG | GTT | GCT | GAG | CAT | TTT | GGC | GAC | ATA | AGG | CTT | GAT | ATG | GTT | GAC | AAG | 336 |
| Leu | Val | Alá | Glu | His | Phe | Gly | Asp | Ile | Arg | Leu | Asp | Met | Val | Asp | Lys | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| GAG | TTA | CTT | GAC | AAA | CAG | CAC | TTA | TAC | CTC | AAG | AGA | CCA | ATA | GAA | TGT | 384 |
| Glu | Leu | Leu | Asp | Lys | Gin | His | Leu | Tyr | Leu | Lys | Arg | Pro | Ile | Glu | Cys | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| TAC | TTT | GTA | AAG | GAT | GCT | GGT | CAG | AAG | GTG | ATG | AGG | ATT | GAT | CTA | ACA | 432 |
| Tyr | Phe | Val | Lys | Asp | Alá | Gly | Gin | Lys | Val | Met | Arg | Ile | Asp | Leu | Thr | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| CCC | CAC | AAC | CCA | TTG | TTG | GCA | AGC | GAT | GTT | AGC | ACA | ACC | ATA | ATG | GGT | 480 |
| Pro | His | Asn | Pro | Leu | Leu | Alá | Ser | Asp | Val | Ser | Thr | Thr | Ile | Met | Gly | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| TAT | CCT | GAG | AGA | GAA | GGT | GAA | CTC | CGT | CAA | ACT | GGA | AAG | GCA | AGG | TTA | 528 |
| Tyr | Pro | Glu | Arg | Glu | Gly | Glu | Leu | Arg | Gin | Thr | Gly | Lys | Alá | Arg | Leu | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| GTC | GAC | CCA | TCA | GAG | TTG | CCC | GCG | CGG | AAT | GAG | GAT | ATT | GAT | GCA | GAG | 576 |
| Val | Asp | Pro | Ser | Glu | Leu | Pro | Alá | Arg | Asn | Glu | Asp | Ile | Asp | Alá | Glu | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| TTT | GAG | AGT | CTA | AAT | CGC | ATA | AGT | GGT | TTG | CGC | GAC | TAT | AAT | CCC | ATT | 624 |
| Phe | Glu | Ser | Leu | Asn | Arg | Ile | Ser | Gly | Leu | Arg | Asp | Tyr | Asn | Pro | Ile | |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| TCA | CAA | AAT | GTT | TGC | TTG | CTA | ACA | AAT | GAG | TCA | GAA | GGC | CAT | AGA | GAG | 672 |
| Ser | Gin | Asn | Val | Cys | Leu | Leu | Thr | Asn | Glu | Ser | Glu | Gly | His | Arg | Glu | |
| 210 | 215 | 220 |
• · • · · · · • · · ·
- 146-
| AAG Lys 225 | ATG TTT | GGA ATT | GGA TAT | GGT Gly | TCA GTG ATC | ATT ACA | AAT CAA | CAT His 240 | 720 | |||||||
| Met | Phe | Gly | Ile | Gly 230 | Tyr | Ser | Val | Ile 235 | Ile | Thr | Asn | Gin | ||||
| CTG | TTC | AGA | AGG | ΆΑΤ | AAT | GGG | GAG | TTA | TCA | ATT | CAA | TCC | AAG | CAT | GGC | 768 |
| Leu | Phe | Arg | Arg | Asn | Asn | Gly | Glu | Leu | Ser | Ile | Gin | Ser | Lys | His | Gly | |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| TAC | TTC | AGA | TGC | CGC | AAC | ACC | ACA | AGC | TTG | AAG | ATG | CTG | CCT | TTG | GAG | 816 |
| Tyr | Phe | Arg | Cys | Arg | Asn | Thr | Thr | Ser | Leu | Lys | Met | Leu | Pro | Leu | Glu | |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| GGA | CAT | GAC | ATT | TTG | TTG | ATT | CAG | TTA | CCA | AGG | GAC | TTT | CCA | GTG | TTT | 864 |
| Gly | His | Asp | Ile | Leu | Leu | Ile | Gin | Leu | Pro | Arg | Asp | Phe | Pro | Val | Phe | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| CCA | CAA | AAG | ATT | CGC | TTT | AGG | GAG | CCA | AGA | GTG | GAT | GAC | AAA | ATT | GTT | 912 |
| Pro | Gin | Lys | Ile | Arg | Phe | Arg | Glu | Pro | Arg | Val | Asp | Asp | Lys | Ile | Val | |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| TTG | GTC | AGC | ACA | AAT | TTC | CAG | GAA | AAG | AGT | TCC | TCG | AGC | ACG | GTC | TCA | 960 |
| Leu | Val | Ser | Thr | Asn | Phe | Gin | Glu | Lys | Ser | Ser | Ser | Ser | Thr | Val | Ser | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| GAG | TCC | AGT | AAC | ATT | TCA | AGA | GTG | CAG | TCA | GCC | AAT | TTC | TAC | AAG | CAT | 1008 |
| Glu | Ser | Ser | Asn | Ile | Ser | Arg | Val | Gin | Ser | Alá | Asn | Phe | Tyr | Lys | His | |
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
| TGG | ATC | TCA | ACA | GTA | GCA | GGA | CAC | TGT | GGA | AAC | CCT | ATG | GTT | TCG | ACT | 1056 |
| Trp | Ile | Ser | Thr | Val | Alá | Gly | His | Cys | Gly | Asn | Pro | Met | Val | Ser | Thr | |
| 340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
| AAA | GAT | GGA | TTT | ATT | GTA | GGT | ATC | CAC | AGT | CTT | GCT | TCA | TTG | ACA | GGC | 1104 |
| Lys | Asp | Gly | Phe | Ile | Val | Gly | Ile | His | Ser | Leu | Alá | Ser | Leu | Thr | Gly | |
| 355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
| GAC | GTT | AAC | ATC | TTC | ACA | AGC | TTT | CCG | CCG | CAG | TTT | GAG | AAC | AAA | TAT | 1152 |
| Asp | Val | Asn | Ile | Phe | Thr | Ser | Phe | Pro | Pro | Gin | Phe | Glu | Asn | Lys | Tyr | |
| 370 | 375 | 380 |
- 147-
| CTA CAG | AAG Lys | CTC Leu | AGT GAA CAC | ACA TGG | TGT Cys | AGT GGA | TGG Trp | AAA CTA | AAT Asn 400 | 1200 | ||||||
| Leu 385 | Gin | Ser Glu 390 | His | Thr | Trp | Ser 395 | Gly | Lys | Leu | |||||||
| CTT | GGA | AAG | ATT | AGT | TGG | GGT | GGA | ATC | AAC | ATT | GTG | GAG | GAT | GCA | CCT | 1248 |
| Leu | Gly | Lys | Ile | Ser | Trp | Gly | Gly | Ile | Asn | Ile | Val | Glu | Asp | Alá | Pro | |
| 405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
| GAA | GAG | CCC | TTT | ATA | ACA | TCC | AAG | ATG | GCA | AGC | CTT | CTT | AGT | GAT | TTG | 1296 |
| Glu | Glu | Pro | Phe | Ile | Thr | Ser | Lys | Met | Alá | Ser | Leu | Leu | Ser | Asp | Leu | |
| 420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
| AAT | TGT | TCA | TTC | CAA | GCA | AGT | GCG | 1320 | ||||||||
| Asn | Cys | Ser | Phe | Gin | Alá | Ser | Alá |
435 440
A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 2
HOSSZA: 440 bázispár
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: protein
ANTISZENSZ: nem
EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS: a lóhere sárga erezettségét okozó vírus (CYVV)
SAJÁTSÁG:
4-437 E mat-peptide
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
- 148 -
| Met 55 | Tyr | Gly | Phe Asp | Pro 70 | Thr Glu Tyr Ser Phe Alá 75 | Arg | Tyr | Leu | Asp 80 | ||||||
| Pro | Ile | Thr | Gly | Alá | Thr | Leu | Asp | Glu | Thr | Pro | Ile | His | Asn | Val | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Leu | Val | Alá | Glu | His | Phe | Gly | Asp | Ile | Arg | Leu | Asp | Met | Val | Asp | Lys |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Glu | Leu | Leu | Asp | Lys | Gin | His | Leu | Tyr | Leu | Lys | Arg | Pro | Ile | Glu | Cys |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Tyr | Phe | Val | Lys | Asp | Alá | Gly | Gin | Lys | Val | Met | Arg | Ile | Asp | Leu | Thr |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Pro | His | Asn | Pro | Leu | Leu | Alá | Ser | Asp | Val | Ser | Thr | Thr | Ile | Met | Gly |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Tyr | Pro | Glu | Arg | Glu | Gly | Glu | Leu | Arg | Gin | Thr | Gly | Lys | Alá | Arg | Leu |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Val | Asp | Pro | Ser | Glu | Leu | Pro | Alá | Arg | Asn | Glu | Asp | Ile | Asp | Alá | Glu |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Phe | Glu | Ser | Leu | Asn | Arg | Ile | Ser | Gly | Leu | Arg | Asp | Tyr | Asn | Pro | Ile |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Ser | Gin | Asn | Val | Cys | Leu | Leu | Thr | Asn | Glu | Ser | Glu | Gly | His | Arg | Glu |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Lys | Met | Phe | Gly | Ile | Gly | Tyr | Gly | Ser | Val | Ile | Ile | Thr | Asn | Gin | His |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Leu | Phe | Arg | Arg | Asn | Asn | Gly | Glu | Leu | Ser | Ile | Gin | Ser | Lys | His | Gly |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Tyr | Phe | Arg | Cys | Arg | Asn | Thr | Thr | Ser | Leu | Lys | Met | Leu | Pro | Leu | Glu |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Gly | His | Asp | Ile | Leu | Leu | Ile | Gin | Leu | Pro | Arg | Asp | Phe | Pro | Val | Phe |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Pro | Gin | Lys | Ile | Arg | Phe | Arg | Glu | Pro | Arg | Val | Asp | Asp | Lys | Ile | Val |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Leu | Val | Ser | Thr | Asn | Phe | Gin | Glu | Lys | Ser | Ser | Ser | Ser | Thr | Val | Ser |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Glu | Ser | Ser | Asn | Ile | Ser | Arg | Val | Gin | Ser | Alá | Asn | Phe | Tyr | Lys | His |
| 325 | 330 | 33 5 | |||||||||||||
| Trp | Ile | Ser | Thr | Val | Alá | Gly | His | Cys | Gly | Asn | Pro | Met | Val | Ser | Thr |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Lys | Asp | Gly | Phe | Ile | Val | Gly | Ile | His | Ser | Leu | Alá | Ser | Leu | Thr | Gly |
| 355 | 360 | 365 |
- 149-
| Asp | Val 370 | Asn | Ile | Phe | Thr | Ser 375 | Phe | Pro | Pro | Gin | Phe 380 | Glu | Asn | Lys | Tyr |
| Leu | Gin | Lys | Leu | Ser | Glu | His | Thr | Trp | Cys | Ser | Gly | Trp | Lys | Leu | Asn |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Leu | Gly | Lys | Ile | Ser | Trp | Gly | Gly | Ile | Asn | Ile | Val | Glu | Asp | Alá | Pro |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Glu | Glu | Pro | Phe | Ile | Thr | Ser | Lys | Met | Alá | Ser | Leu | Leu | Ser | Asp | Leu |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Asn | Cys | Ser | Phe | Gin | Alá | Ser | Alá | ||||||||
| 435 | 440 |
A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 3
HOSSZA: 25 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav, szintetikus DNS
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTCCATGGGG AAAAGTAAGA GAACA 25
A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 4
HOSSZA: 20 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav, szintetikus DNS
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACTCTGAGAC CGTGCTCGAG 20
- 150 A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 5
HOSSZA: 20 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav, szintetikus DNS
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGGAAAGAG TTCCTCGAGC 17
A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 6
HOSSZA: 36 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav, szintetikus DNS
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AATTGTTCAT TCCAAGCACC TGGGCCACCA CCTGGC 36
A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 7
HOSSZA: 36 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav, szintetikus DNS
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCCAGGTGGT GGCCCAGGTG CTTGGAATGA ACAATT • · ·
- 151 A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 8
HOSSZA: 30 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav, szintetikus DNS
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTGTCAGCAC ACCTGGGAGC TGTAGAGCTC
A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 9
HOSSZA: 7 bázispár
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: protein
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Alá Pro Gly Pro Pro Pro Gly 7
5
A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 10
HOSSZA: 7 bázispár
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: protein
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro 7
5 • · ·**· ·*·. *·*ί • · · · · · ·
- 152 A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 11
HOSSZA: 1650 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kétszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS, mRNS-ről átírva
EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS: Homo sapiens
SAJÁTSÁG:
Sajátságra utaló megjelölés: CDS
A sajátság elhelyezkedése: 1..1647
A sajátság meghatározásának módja: E
Sajátságra utaló megjelölés: mat-peptide
A sajátság elhelyezkedése: 70...1647
A sajátság meghatározásának módja: E
Sajátságra utaló megjelölés: sig peptide
A sajátság elhelyezkedése: 1..69
A sajátság meghatározásának módja: E
All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
| ATG TCA TGT GAG | GAC GGT CGG GCC | CTG GAA GGA ACG | CTC TCG GAA TTG | 48 | ||||||||||||
| Met -23 | Ser' | Cys | Glu -20 | Asp | Gly Arg | Alá | Leu Glu -15 | Gly | Thr | Leu | Ser -10 | Glu | Leu | |||
| GCC | GCG | GAA | ACC | GAT | CTG | CCC | GTT | GTG | TTT | GTG | AAA | CAG | AGA | AAG | ATA | 96 |
| Alá | Alá | Glu | Thr | Asp | Leu | Pro | Val | Val | Phe | Val | Lys | Gin | Arg | Lys | Ile | |
| -5 | 1 | 5 | ||||||||||||||
| GGC | GGC | CAT | GGT | CCA | ACC | TTG | AAG | GCT | TAT | CAG | GAG | GGC | AGA | CTT | CAA | 144 |
| Gly | Gly | His | Gly | Pro | Thr | Leu | Lys | Alá | Tyr | Gin | Glu | Gly | Arg | Leu | Gin | |
| 10 | 15 | 20 | 25 | |||||||||||||
| AAG | CTA | CTA | AAA | ATG | AAC | GGC | CCT | GAA | GAT | CTT | CCC | AAG | TCC | TAT | GAC | 192 |
| Lys | Leu | Leu | Lys | Met | Asn | Gly | Pro | Glu | Asp | Leu | Pro | Lys | Ser | Tyr | Asp | |
| 30 | 35 | 40 | ||||||||||||||
| TAT | GAC | CTT | ATC | ATC | ATT | GGA | GGT | GGC | TCA | GGA | GGT | CTG | GCA | GCT | GCT | 240 |
| Tyr | Asp | Leu | Ile | Ile | Ile | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Leu | Alá | Alá | Alá | |
| 45 | 50 | 55 |
- 153 -
| AAG GAG GCA | GCC Alá | CAA TAT | GGC AAG AAG GTG | ATG GTC | CTG Leu 70 | GAC Asp | TTT Phe | GTC Val | 288 | |||||||
| Lys | Glu Alá 60 | Gin | Tyr | Gly | Lys 65 | Lys | Val | Met | Val | |||||||
| ACT | CCC | ACC | CCT | CTT | GGA | ACT | AGA | TGG | GGT | CTT | GGA | GGA | ACA | TGT | GTG | 336 |
| Thr | Pro | Thr | Pro | Leu | Gly | Thr | Arg | Trp | Gly | Leu | Gly | Gly | Thr | Cys | Val | |
| 75 | 30 | 85 | ||||||||||||||
| AAT | GTG | GGT | TGC | ATA | CCT | AAA | AAA | CTG | ATG | CAT | CAA | GCA | GCT | TTG | TTA | 384 |
| Asn | Val | Gly | Cys | Ile | Pro | Lys | Lys | Leu | Met | His | Gin | Alá | Alá | Leu | Leu | |
| 90 | 95 | 100 | 105 | |||||||||||||
| GGA | CAA | GCC | CTG | CAA | GAC | TCT | CGA | AAT | TAT | GGA | TGG | AAA | GTC | GAG | GAG | 432 |
| Gly | Gin | Alá | Leu | Gin | Asp | Ser | Arg | Asn | Tyr | Gly | Trp | Lys | Val | Glu | Glu | |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||||
| ACA | GTT | AAG | CAT | GAT | TGG | GAC | AGA | ATG | ATA | GAA | GCT | GTA | CAG | AAT | CAC | 480 |
| Thr | Val | Lys | His | Asp | Trp | Asp | Arg | Met | He | Glu | Alá | Val | Gin | Asn | His | |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||||
| ATT | GGC | TCT | TTG | AAT | TGG | GGC | TAC | CGA | GTA | GCT | CTG | CGG | GAG | AAA | AAA | 528 |
| Ile | Gly | Ser | Leu | Asn | Trp | Gly | Tyr | Arg | Val | Alá | Leu | Arg | Glu | Lys | Lys | |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||||
| GTC | GTC | TAT | GAG | AAT | GCT | TAT | GGG | CAA | TTT | ATT | GGT | CCT | CAC | AGG | ATT | 576 |
| Val | Val | Tyr | Glu | Asn | Alá | Tyr | Gly | Gin | Phe | Ile | Gly | Pro | His | Arg | Ile | |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||||
| AAG | GCA | ACA | AAT | AAT | AAA | GGC | AAA | GAA | AAA | ATT | TAT | TCA | GCA | GAG | AGA | 624 |
| Lys | Alá | Thr | Asn | Asn | Lys | Gly | Lys | Glu | Lys | Ile | Tyr | Ser | Alá | Glu | Arg | |
| 170 | 175 | 180 | 185 | |||||||||||||
| TTT | CTC | ATT | GCC | ACT | GGT | GAA | AGA | CCA | CGT | TAC | TTG | GGC | ATC | CCT | GGT | 672 |
| Phe | Leu | Ile | Alá | Thr | Gly | Glu | Arg | Pro | Arg | Tyr | Leu | Gly | Ile | Pro | Gly | |
| 190 | 195 | 200 | ||||||||||||||
| GAC | AAA | GAA | TAC | TGC | ATC | AGC | AGT | GAT | GAT | CTT | TTC | TCC | TTG | CCT | TAC | 720 |
| Asp | Lys | Glu | Tyr | Cys | Ile | Ser | Ser | Asp | Asp | Leu | Phe | Ser | Leu | Pro | Tyr | |
| 205 | 210 | 215 |
• · • · · · · · • ·
- 154-
| TGC Cys | CCG GGT AAG | ACC Thr | CTG GTT Leu Val | GTT Val 225 | GGA GCA TCC | TAT Tyr | GTC GCT | TTG Leu | GAG Glu | 768 | ||||||
| Pro | Gly 220 | Lys | Gly Alá | Ser | Val 230 | Alá | ||||||||||
| TGC | GCT | GGA | TTT | CTT | GCT | GGT | ATT | GGT | TTA | GAC | GTC | ACT | GTT | ATG | GTT | 816 |
| Cys | Alá | Gly | Phe | Leu | Alá | Gly | Ile | Gly | Leu | Asp | Val | Thr | Val | Met | Val | |
| 235 | 240 | 245 | ||||||||||||||
| AGG | TCC | ATT | CTT | CTT | AGA | GGA | TTT | GAC | CAG | GAC | ATG | GCC | AAC | AAA | ATT | 864 |
| Arg | Ser | Ile | Leu | Leu | Arg | Gly | Phe | Asp | Gin | Asp | Met | Alá | Asn | Lys | Ile | |
| 250 | 255 | 260 | 265 | |||||||||||||
| GGT | GAA | CAC | ATG | GAA | GAA | CAT | GGC | ATC | AAG | TTT | ATA | AGA | CAG | TTC | GTA | 912 |
| Gly | Glu | His | Met | Glu | Glu | His | Gly | Ile | Lys | Phe | Ile | Arg | Gin | Phe | Val | |
| 270 | 275 | 280 | ||||||||||||||
| CCA | ATT | AAA | GTT | GAA | CAA | ATT | GAA | GCA | GGG | ACA | CCA | GGC | CGA | CTC | AGA | 960 |
| Pro | Ile | Lys | Val | Glu | Gin | Ile | Glu | Alá | Gly | Thr | Pro | Gly | Arg | Leu | Arg | |
| 285 | 290 | 295 | ||||||||||||||
| GTA | GTA | GCT | CAG | TCC | ACC | AAT | AGT | GAG | GAA | ATC | ATT | GAA | GGA | GAA | TAT | 1008 |
| Val | Val | Alá | Gin | Ser | Thr | Asn | Ser | Glu | Glu | Ile | Ile | Glu | Gly | Glu | Tyr | |
| 300 | 305 | 310 | ||||||||||||||
| AAT | ACG | GTG | ATG | CTG | GCA | ATA | GGA | AGA | GAT | GCT | TGC | ACA | AGA | AAA | ATT | 1056 |
| Asn | Thr | Val | Met | Leu | Alá | Ile | Gly | Arg | Asp | Alá | Cys | Thr | Arg | Lys | Ile | |
| 315 | 320 | 325 | ||||||||||||||
| GGC | TTA | GAA | ACC | GTA | GGG | GTG | AAG | ATA | AAT | GAA | AAG | ACT | GGA | AAA | ATA | 1104 |
| Gly | Leu | Glu | Thr | Val | Gly | Val | Lys | Ile | Asn | Glu | Lys | Thr | Gly | Lys | Ile | |
| 330 | 335 | 340 | 345 | |||||||||||||
| CCT | GTC | ACA | GAT | GAA | GAA | CAG | ACC | AAT | GTG | CCT | TAC | ATC | TAT | GCC | ATT | 1152 |
| Pro | Val | Thr | Asp | Glu | Glu | Gin | Thr | Asn | Val | Pro | Tyr | Ile | Tyr | Alá | Ile | |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||||
| GGC | GAT | ATA | TTG | GAG | GAT | AAG | GTG | GAG | CTC | ACC | CCA | GTT | GCA | ATC | CAG | 1200 |
| Gly | Asp | Ile | Leu | Glu | Asp | Lys | Val | Glu | Leu | Thr | Pro | Val | Alá | Ile | Gin | |
| 365 | 370 | 375 |
Ί
- 155 -
| GCA Alá | GGA Gly | AGA Arg 380 | TTG Leu | CTG GCT | CAG AGG | CTC TAT GCA GGT | TCC ACT GTC | AAG Lys | 1248 | |||||||
| Leu | Alá | Gin | Arg 385 | Leu | Tyr | Alá | Gly | Ser 390 | Thr | Val | ||||||
| TGT | GAC | TAT | GAA | AAT | GTT | CCA | ACC | ACT | GTA | TTT | ACT | CCT | TTG | GAA | TAT | 1296 |
| Cys | Asp | Tyr | Glu | Asn | Val | Pro | Thr | Thr | Val | Phe | Thr | Pro | Leu | Glu | Tyr | |
| 395 | 400 | 405 | ||||||||||||||
| GGT | GCT | TGT | GGC | CTT | TCT | GAG | GAG | AAA | GCT | GTG | GAG | AAG | TTT | GGG | GAA | 1344 |
| Gly | Alá | Cys | Gly | Leu | Ser | Glu | Glu | Lys | Alá | Val | Glu | Lys | Phe | Gly | Glu | |
| 410 | 415 | 420 | 425 | |||||||||||||
| GAA | AAT | ATT | GAG | GTT | TAC | CAT | AGT | TAC | TTT | TGG | CCA | TTG | GAA | TGG | ACG | 1392 |
| Glu | Asn | Ile | Glu | Val | Tyr | His | Ser | Tyr | Phe | Trp | Pro | Leu | Glu | Trp | Thr | |
| 430 | 435 | 440 | ||||||||||||||
| ATT | CCG | TCA | AGA | GAT | AAC | AAC | AAA | TGT | TAT | GCA | AAA | ATA | ATC | TGT | AAT | 1440 |
| Ile | Pro | Ser | Arg | Asp | Asn | Asn | Lys | Cys | Tyr | Alá | Lys | Ile | Ile | Cys | Asn | |
| 445 | 450 | 455 | ||||||||||||||
| ACT | AAA | GAC | AAT | GAA | CGT | GTT | GTG | GGC | TTT | CAC | GTA | CTG | GGT | CCA | AAT | 1488 |
| Thr | Lys | Asp | Asn | Glu | Arg | Val | Val | Gly | Phe | His | Val | Leu | Gly | Pro | Asn | |
| 460 | 465 | 470 | ||||||||||||||
| GCT | GGA | GAA | GTT | ACA | CAA | GGC | TTT | GCA | GCT | GCG | CTC | AAA | TGT | GGA | CTG | 1536 |
| Alá | Gly | Glu | Val | Thr | Gin | Gly | Phe | Alá | Alá | Alá | Leu | Lys | Cys | Gly | Leu | |
| 475 | 480 | 485 | ||||||||||||||
| ACC | AAA | AAG | CAG | CTG | GAC | AGC | ACA | ATT | GGA | ATC | CAC | CCT | GTC | TGT | GCA | 1584 |
| Thr | Lys | Lys | Gin | Leu | Asp | Ser | Thr | Ile | Gly | Ile | His | Pro | Val | Cys | Alá | |
| 490 | 495 | 500 | 505 | |||||||||||||
| GAG | GTA | TTC | ACA | ACA | TTG | TCT | GTG | ACC | AAG | CGC | TCT | GGG | GCA | AGC | ATC | 1632 |
| Glu | Val | Phe | Thr | Thr | Leu | Ser | Val | Thr | Lys | Arg | Ser | Gly | Alá | Ser | Ile | |
| 510 | 515 | 520 |
CTC CAG GCT GGC TGC TGA
Leu Gin Alá Gly Cys
525
1650 « « ···· • ·
-156A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 12
HOSSZA: 526 bázispár
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
| Met | Ser | Cys | Glu | Asp | Gly | Arg | Alá | Leu | Glu | Gly | Thr | Leu | Ser | Glu | Leu |
| -23 | -20 | -15 | -10 | ||||||||||||
| Alá | Alá | Glu | Thr | Asp | Leu | Pro | Val | val | Phe | Val | Lys | Gin | Arg | Lys | Ile |
| -5 | 1 | 5 | |||||||||||||
| Gly | Gly | His | Gly | Pro | Thr | Leu | Lys | Alá | Tyr | Gin | Glu | Gly | Arg | Leu | Gin |
| 10 | 15 | 20 | 25 | ||||||||||||
| Lys | Leu | Leu | Lys | Met | Asn | Gly | Pro | Glu | Asp | Leu | Pro | Lys | Ser | Tyr | Asp |
| 30 | 35 | 40 | |||||||||||||
| Tyr | Asp | Leu | Ile | Ile | Ile | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Leu | Alá | Alá | Alá |
| 45 | 50 | 55 | |||||||||||||
| Lys | Glu | Alá | Alá | Gin | Tyr | Gly | Lys | Lys | Val | Met | Val | Leu | Asp | Phe | Val |
| 60 | 65 | 70 | |||||||||||||
| Thr | Pro | Thr | Pro | Leu | Gly | Thr | Arg | Trp | Gly | Leu | Gly | Gly | Thr | Cys | Val |
| 75 | 80 | 85 | |||||||||||||
| Asn | Val | Gly | Cys | Ile | Pro | Lys | Lys | Leu | Met | His | Gin | Alá | Alá | Leu | Leu |
| 90 | 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| Gly | Gin | Alá | Leu | Gin | Asp | Ser | Arg | Asn | Tyr | Gly | Trp | Lys | Val | Glu | Glu |
| 110 | 115 | 120 | |||||||||||||
| Thr | Val | Lys | His | Asp | Trp | Asp | Arg | Met | Ile | Glu | Alá | Val | Gin | Asn | His |
| 125 | 130 | 135 | |||||||||||||
| Ile | Gly | Ser | Leu | Asn | Trp | Gly | Tyr | Arg | Val | Alá | Leu | Arg | Glu | Lys | Lys |
| 140 | 145 | 150 | |||||||||||||
| Val | Val | Tyr | Glu | Asn | Alá | Tyr | Gly | Gin | Phe | Ile | Gly | Pro | His | Arg | Ile |
| 155 | 160 | 165 | |||||||||||||
| Lys | Alá | Thr | Asn | Asn | Lys | Gly | Lys | Glu | Lys | Ile | Tyr | Ser | Alá | Glu | Arg |
| 170 | 175 | 180 | 185 | ||||||||||||
| Phe | Leu | Ile | Alá | Thr | Gly | Glu | Arg | Pro | Arg | Tyr | Leu | Gly | Ile | Pro | Gly |
| 190 | 195 | 200 | |||||||||||||
| Asp | Lys | Glu | Tyr | Cys | Ile | Ser | Ser | Asp | Asp | Leu | Phe | Ser | Leu | Pro | Tyr |
| 205 | 210 | 215 | |||||||||||||
| Cys | Pro | Gly | Lys | Thr | Leu | Val | Val | Gly | Alá | Ser | Tyr | Val | Alá | Leu | Glu |
| 220 | 225 | 230 |
- 157• ·· ·· ··** • · · · · · · • · · · · · · * · · · · ··· ·· ·· ·
| Cys | Alá 235 | Gly | Phe | Leu Alá Gly 240 | Ile Gly Leu Asp Val 245 | Thr Val | Met | Val | |||||||
| Arg | Ser | Ile | Leu | Leu | Arg | Gly | Phe | Asp | Gin | Asp | Met | Alá | Asn | Lys | Ile |
| 250 | 255 | 260 | 265 | ||||||||||||
| Gly | Glu | His | Met | Glu | Glu | His | Gly | Ile | Lys | Phe | Ile | Arg | Gin | Phe | Val |
| 270 | 275 | 280 | |||||||||||||
| Pro | Ile | Lys | Val | Glu | Gin | Ile | Glu | Alá | Gly | Thr | Pro | Gly | Arg | Leu | Arg |
| 285 | 290 | 295 | |||||||||||||
| Val | Val | Alá | Gin | Ser | Thr | Asn | Ser | Glu | Glu | Ile | Ile | Glu | Gly | Glu | Tyr |
| 300 | 305 | 310 | |||||||||||||
| Asn | Thr | Val | Met | Leu | Alá | Ile | Gly | Arg | Asp | Alá | Cys | Thr | Arg | Lys | Ile |
| 315 | 320 | 325 | |||||||||||||
| Gly | Leu | Glu | Thr | Val | Gly | Val | Lys | Ile | Asn | Glu | Lys | Thr | Gly | Lys | Ile |
| 330 | 335 | 340 | 345 | ||||||||||||
| Pro | Val | Thr | Asp | Glu | Glu | Gin | Thr | Asn | Val | Pro | Tyr | Ile | Tyr | Alá | Ile |
| 350 | 355 | 360 | |||||||||||||
| Gly | Asp | Ile | Leu | Glu | Asp | Lys | Val | Glu | Leu | Thr | Pro | Val | Alá | Ile | Gin |
| 365 | 370 | 375 | |||||||||||||
| Alá | Gly | Arg | Leu | Leu | Alá | Gin | Arg | Leu | Tyr | Alá | Gly | Ser | Thr | Val | Lys |
| 380 | 385 | 390 | |||||||||||||
| Cys | Asp | Tyr | Glu | Asn | Val | Pro | Thr | Thr | Val | Phe | Thr | Pro | Leu | Glu | Tyr |
| 395 | 400 | 405 | |||||||||||||
| Gly | Alá | Cys | Gly | Leu | Ser | Glu | Glu | Lys | Alá | Val | Glu | Lys | Phe | Gly | Glu |
| 410 | 415 | 420 | 425 | ||||||||||||
| Glu | Asn | Ile | Glu | Val | Tyr | His | Ser | Tyr | Phe | Trp | Pro | Leu | Glu | Trp | Thr |
| 430 | 435 | 440 | |||||||||||||
| Ile | Pro | Ser | Arg | Asp | Asn | Asn | Lys | Cys | Tyr | Alá | Lys | Ile | Ile | Cys | Asn |
| 445 | 450 | 455 | |||||||||||||
| Thr | Lys | Asp | Asn | Glu | Arg | Val | Val | Gly | Phe | His | Val | Leu | Gly | Pro | Asn |
| 460 | 465 | 470 | |||||||||||||
| Alá | Gly | G1U | Val | Thr | Gin | Gly | Phe | Alá | Alá | Alá | Leu | Lys | Cys | Gly | Leu |
| 475 | 480 | 485 | |||||||||||||
| Thr | Lys | Lys | Gin | Leu | Asp | Ser | Thr | Ile | Gly | Ile | His | Pro | Val | Cys | Alá |
| 490 | 495 | 500 | 505 | ||||||||||||
| Glu | Val | Phe | Thr | Thr | Leu | Ser | Val | Thr | Lys | Arg | Ser | Gly | Alá | Ser | Ile |
| 510 | 515 | 520 | |||||||||||||
| Leu | Gin | Alá | Gly | Cys |
525
- 158 A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 13
HOSSZA: 15 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kétszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav, szintetikus DNS
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TAAATAAATAAATAA
A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 14
HOSSZA: 66 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: kétszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav, szintetikus DNS
A 14 AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTAGCGCTCT GGGGCAAGCA TCCTCCAGGC TGGCTGCCAC
CACCACCACC ACCACTGATC 60
TAGACT 66 ··<
-159A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 15
HOSSZA: 18 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav, szintetikus DNS
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGTCAGCACA AATTTCCA 18
A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 16
HOSSZA: 24 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav, szintetikus DNS
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
AAACACAACT TGGAATGAAC AATT 24
A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 17
HOSSZA: 24 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav, szintetikus DNS
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
TCATTCCAAG TTGTGTTTGT GAAA 24 ···· • · * · * · • ♦♦· ·♦ ··· ·· ·» ·
- 160 A SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁMA: 18
HOSSZA: 18 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav, szintetikus DNS
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
CATAGGATGC TCCAACAA ··» ♦·· ·· « < · · · •« * * 9
- 161 SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (73)
1. Fúziós fehérjét kódoló polinukleotid-szekvencia, amely 5'->3'irányban, azonos leolvasási fázisban a következő szekvenciarészleteket tartalmazza:
i) a lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-fehérjéjét kódoló szekvencia, vagy a lóhere sárga erezettségét okozó vírus asejtmagzárvány-fehérjéjéhez hasonló proteolítikus specifítással bíró mutánst vagy variánst kódoló szekvencia;
ii) a lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-fehérjéje vagy annak mutánsa vagy variánsa által felismerhető és hasítható hasítópeptidet kódoló szekvencia; valamint iii) egy vagy több olyan szekvencia, amely polipeptidet kódol.
2. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid-szekvencia, amely DNSszekvencia.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti polinukleotid-szekvencia, amely kettősszálú formában van.
4. Antiszensz polinukleotid-szekvencia, amely az előző igénypontok bármelyike szerinti polinukleotid-szekvencia antiszensz szekvenciája.
5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidszekvencia, amelyben az iii) pont szerinti szekvenciarészlet több mint egy polipeptidet kódoló szekvenciát tartalmaz, és a polipeptideket kódoló szekvenciarészletek között további hasítószekvenciákat kódoló szekvenciarészleteket tartalmaz.
• · * V ·»· ·» · · · ·· ··
- 162-
6. Az 5. igénypont szerinti polinukleotid-szekvencia, amely olyan további hasítószekvenciákat kódoló szekvenciarészleteket tartalmaz, melyek a lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-fehérjéje által felismerhetők.
7. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotid-szekvencia, amelyben az iii) pont szerinti szekvenciarészlet csak egy polipeptidet kódoló szekvenciát tartalmaz.
8. Az előző igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidszekvencia, amelyben az ii) pont szerinti szekvenciarészletet részben vagy egészében, vagy az i) vagy az iii) pont szerinti szekvenciarészlet, vagy mindkettő tartalmazza.
9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotid-szekvencia, amely az ii) pont szerinti hasítópeptidet kódoló szekvenciarészlet és az iii) pont szerinti polipeptidet kódoló szekvenciarészlet között tartalmaz egy egy vagy több aminosavat kódoló szekvenciarészletet.
10. Az előző igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidszekvencia, amely olyan fúziós proteint kódoló szekvenciarészleteket tartalmaz, amely fúziós proteinnek az i) pont szerint kódolt a-sejtmagzárványfehérje által történő hasítása olyan polipeptid keletkezését eredményezi, amelyen egy addicionális N-terminális aminosav-szekvenciarészlet található, és a keletkezett polipeptid terminális aminosava glicin, szerin, vagy alanin lesz.
11. A 10. igénypont szerinti polinukleotid-szekvencia, amely alkalmas aminopeptidáz-aktivitással kívánt esetben eltávolítható glicin, szerin vagy
- 163- alanin terminális aminosavat tartalmazó polipeptid keletkezését lehetővé tevő fúziós proteint kódoló szekvenciarészleteket tartalmaz.
12. Az előző igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidszekvencia, amely a polipeptid N-terminálisát kódoló szekvencia és a hasítópeptid C-terminálisát kódoló szekvencia között egy prolin aminosavat kódoló szekvenciarészletet tartalmaz.
13. A 12. igénypont szerinti polinukleotid-szekvencia, amely olyan polipeptid keletkezését lehetővé tevő fúziós proteint kódoló szekvenciarészleteket tartalmaz, amely polipeptidről a prolin aminosavon túlnyúló aminosavak aminopeptidáz-P (3.4.11.9) aktivitással lehasíthatók.
14. A 13. igénypont szerinti polinukleotid-szekvencia, amely olyan polipeptid keletkezését lehetővé tevő fúziós proteint kódoló szekvenciarészleteket tartalmaz, amely polipeptidről a terminális prolin aminosav - azután, hogy a prolinon túlnyúló aminosavakat lehasítottuk - prolin iminopeptidáz (3.4.11.5) aktivitással lehasítható.
15. Az előző igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidszekvencia, amely a polipeptid N-terminális végét kódoló szekvencia és a hasítópeptid C-terminális végét kódoló szekvencia között egy alanin aminosavat kódoló szekvenciarészletet tartalmaz.
16. A 15. igénypont szerinti polinukleotid-szekvencia, amely olyan polipeptid keletkezését lehetővé tevő fúziós proteint kódoló szekvenciarészleteket tartalmaz, amely polipeptidről az alaninon túlnyúló aminosavak aminopeptidáz-P (3.4.11.9) aktivitással lehasíthatók, és amely polipeptidről a hasítás után terminális pozícióban maradó alanin alanin aminopeptidáz (3.4.11.14) aktivitással lehasítható.
- 164-
17. A 8. igénypont szerinti polinukleotid-szekvencia, amelyben az ii) pont szerinti szekvenciarészletet teljes egészében magában foglalja az i) vagy az iii) pont szerinti szekvenciarészlet.
18. Az előző igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidszekvencia, amelyben az i) pont szerinti szekvenciarészlet megegyezik a szekvencialistában 1. azonosítószámon megadott szekvencia 10-1311. nukleotidjainak szekvenciájával.
19. Az előző igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidszekvencia, amelyben az i) pont szerinti szekvenciarészlet a szekvencialistában 2. azonosítószámon megadott aminosav-szekvencia 4437. aminosavainak megfelelő polipeptidet kódolja.
20. Polinukleotid-szekvencia, amely megegyezik a szekvencialistában 1. azonosítószámon megadott nukleotidszekvencia 10-1311. nukleotidjainak sorrendjével, vagy annak mutánsa vagy variánsa, amely szekvencia a lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-fehérjéjét, vagy a lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-fehérjéjéhez hasonló proteolítikus specifitással bíró mutánst vagy variánst kódol.
21. Az előző igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidszekvencia, amely legalább 90 %-ban homológ az 1. azonosítószámú szekvencia 10-1311. nukleotidjainak szekvenciájával.
22. Az előző igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidszekvencia, amely az i) pont szerinti szekvenciától 5'-irányban egy szignálszekvenciát is tartalmaz.
23. DNS, amely képes hibridizálódni a szekvencialistában 1. azonosítószámon megadott szekvencia 10-1311. nukleotidjainak megfelelő
- 165 szekvenciájú második DSN-sel, és amely DNS-nek megfelelő szensz szál proteázaktivitással bíró fehérjét kódol.
24. A 23. igénypont szerinti DNS, amely 6x SSC-oldatban, 60-70 °C közötti hőmérsékleten képes hibridizálódni a második DNS-sel.
25. Vektor, amely az előző igénypontok bármelyike szerinti polinukleotid-szekvenciát tartalmaz.
26. A 25. igénypont szerinti vektor, amely expressziós vektor.
27. Gazdasejt, amely a 25. vagy 26. igénypont szerinti vektorral van transzformálva.
28. Expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy a 26. igénypont szerinti vektorral transzformált gazdasejtet tartalmaz.
29. A 25. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként Escherichia coli gazdasejtet tartalmaz.
30. Polipeptid, amely a 28. vagy 29. igénypont szerinti expressziós rendszerben lett előállítva.
31. Polipeptid, amely tartalmazza a 2. azonosítószámú szekvencia 4437. aminosavainak megfelelő szekvenciát, vagy annak mutánsát vagy variánsát.
32. Polipeptid, amelynek szekvenciája megegyezik a 2. azonosítószámú szekvencia 4-437. aminosavainak szekvenciájával.
33. Polipeptid, melynek szekvenciája megegyezik a 2. azonosítószámú szekvencia 4-437. aminosavainak szekvenciájával, vagy annak mutánsa vagy variánsa.
34. Expressziós rendszer polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a rendszerben expresszálódó polipeptid prekurzora a lóhere sárga ere• · · ·
- 166 zettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-fehérjéjének, annak mutánsának vagy variánsának enzimaktivitása által elhasad.
35. A 34. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy az expresszálódó polipeptid prekurzora fúziós fehérje.
36. Expressziós rendszer polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az expresszálódó polipeptid prekurzor formája tartalmazza az AsnCysSerPheGlnX aminosav-szekvenciarészletet, amely a lóhere sárga erezettségét okozó vírus a-sejtmagzárvány-fehérjéjének vagy annak mutánsának vagy variánsának enzimaktivitása következtében elhasad.
37. A 36. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy a hasadás eredményeként a polipeptid érett formája expresszálódik benne.
38. Fúziós protein, amelyet az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotid-szekvencia kódol.
39. A 28. vagy 29. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy az i) pont szerinti szekvencia által kódolt polipeptid által kiváltott autolízis folytán olyan polipeptid expresszálódik benne, melyen egy addicionális N-terminális aminosav-szekvenciarészlet található, melynek Nterminális aminosava glicin, szerin vagy alanin, és amely expressziós rendszerben a gazdasejt egy aminopeptidáza az említett N-terminális aminosav lehasadását eredményezi.
40. A 28. vagy 29. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy az i) pont szerinti szekvencia által kódolt polipeptid által kiváltott autolízis folytán olyan polipeptid expresszálódik benne, amelyen egy addicionális N-terminális prolin található, valamint nulla, egy vagy több to- r
-167 vábbi aminosav, és amely polipeptidről a prolinon túli addicionális aminosavak aminopeptidáz-P (3.4.11.9) hatására lehasadnak.
41. A 40. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy amennyiben az expresszált polipeptidről a prolinon túlnyúló aminosavak már lehasadtak, a terminális prolin aminosav prolin iminopeptidáz (3.4:11.5) hatására lehasad.
42. A 28. vagy 29. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy az i) pont szerinti szekvencia által kódolt polipeptid által kiváltott autolízis addicionális N-terminális alanint, valamint nulla, egy vagy több további aminosavat tartalmazó polipeptid expresszióját eredményezi, amely polipeptidről az alaninon túlnyúló addicionális aminosavak aminopeptidáz-P (3.4.11.9) hatására lehasadnak, és a megmaradó Nterminális alanin alanin aminopeptidáz enzimmel (3.4.11.14) lehasítható.
43. Polinukleotid-szekvencia, amely olyan polipeptidet kódol, amely magában foglalja a 12. azonosítószámú szekvencia 1-526. aminosavainak szekvenciáját, vagy a polipeptid mutánsát vagy variánsát kódolja, és a polinukleotid-szekvencia által kódolt polipeptid képes diklór-indofenolt és oxidált glutationt redukálni.
44. A 43. igénypont szerinti polinukleotid-szekvencia, amely legalább 55 %-ban homológ a 12. azonosítószámú szekvencia 1-526. aminosavainak szekvenciájával.
45. A 43. igénypont szerinti polinukleotid-szekvencia, amely több mint 70 %-ban homológ a 12. azonosítószámú szekvencia 1-526. aminosavainak szekvenciájával.
- 168 -
46. A 43. igénypont szerinti polinukleotid-szekvencia, amely több mint 80 %-ban homológ a 12. azonosítószámú szekvencia 1-526. aminosavainak szekvenciájával.
47. A 43-46. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidszekvencia, amelyben található kódoló szekvencia tartalmazza a 11. azonosítószámú szekvencia 70-1647. nukleotidjainak szekvenciáját.
48. A 43. igénypont szerinti polinukleotid-szekvencia, amely a 12. azonosítószámú szekvencia -23-526. aminosavainak sorrendjével megegyező szekvenciájú polipeptidet, vagy annak mutánsát vagy variánsát kódolja.
49. DNS, amely képes hibridizálódni a 43-48. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotid-szekvenciával, és amely DNS szensz szála redukáló aktivitású polipeptidet kódol.
50. A 49. igénypont szerinti DNS, amely 6x SSC-oldatban 60-70 °C közötti hőmérsékleten képes hibridizálódni a 43-48. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotid-szekvenciával.
51. A 43-50. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidszekvencia által kódolt polipeptid.
52. Az 51. igénypont szerinti polipeptid alkalmazása, oxidativ stressz vagy aktivált oxigén okozta betegségek és rendellenességek kezelésére, vagy megelőzésére.
53. Az 51. igénypont szerinti polipeptid alkalmazása, arterioszklerózis, diabétesz vagy isémiás rendellenességek megelőzésére, vagy kezelésére.
54. Az 51. igénypont szerinti polipeptid alkalmazása arterioszklerózis, diabétesz, isémiás rendellenességek, ödéma, vaszkuláris hiperpermeabilitás,
- 169 - gyulladások, gyomornyálkahártya-rendellenességek, akut pankreatitisz, Crohn-kór, fekélyes vastagbél-gyulladás, májrendellenességek, Paraquatkór, pulmonáris emfizéma, kemokarcinogenezis, karcinogén metasztázisok kialakulása, felnőttkori légzőszervi szorongásos szindróma, elszórt intravaszkuláris koaguláció, hályogok, fiatalkori retinopátia, autoimmun rendellenességek, porfirémia, hemolítikus rendellenességek, mediterrán anémia, Parkinson-kór, Alzheimer-kór, epilepszia, ibolyántúli sugárzás okozta rendellenességek, radioaktív sugárzás okozta rendellenességek, valamint fagy ás vagy égés okozta sérülések megelőzésére vagy kezelésére.
55. Az 51. igénypont szerinti polipeptid alkalmazása az 52-54. igénypontok bármelyike szerinti rendellenességek kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyászati készítmény előállítására.
56. Gyógyászati készítmény, amely az 51. igénypont szerinti polipeptid gyógyászatilag hatékony mennyiségét, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
57. Vektor, amely 43-50. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotid-szekvenciát tartalmaz.
58. Az 57. igénypont szerinti vektor, amely expressziós vektor.
59. Gazdasejt, amely az 57. vagy 58. igénypont szerinti vektorral van transzformálva.
60. Expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy az 58. igénypont szerinti vektorral transzformált gazdasejtet tartalmaz.
61. A 60. igénypont szerinti expressziós rendszer, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként Escherichia coli sejteket tartalmaz.
- 170-
62. Polipeptid, amely a 60. vagy 61. igénypont szerinti expressziós rendszerben termelődött.
63. Ellenanyag vagy ellenanyag-ekvivalens, amely specifikusan felismeri a KM31-7-fehérjét, vagy amely specifikusan felismeri a KM31-7fehérje mutánsát vagy variánsát.
64. A 63. igénypont szerinti ellenanyag, amely monoklonális ellenanyag.
65. A 63. vagy 64. igénypont szerinti ellenanyag, amely antigénsajátságok szempontjából hasonlít valamely humán ellenanyagra.
66. Antiidiotípus ellenanyag, amely a 63-75. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag felismerő helyét ismeri fel.
67. Ellenanyag, amelyet a Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology, Japan intézetben FERM BP5086 deponálási számon letétbe helyezett MKM150-2-jelű hibridóma-sejtek által, vagy az MKM150-2-jelű hibridómasejtekből származó hibridómasejtek által termelődött.
68. A 63-67. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag alkalmazása, KB31-7-fehérje izolálására és tisztítására.
69. Eljárás KM31-7-fehérje tisztítására, azzal jellemezve, hogy a tisztítási eljárás során 63-67. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagot alkalmazunk a fehérje megkötésére.
70. Hibridóma-sejtek, melyek tenyészetben 63-66. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagot expresszálnak.
71. MKM150-2-jelű hibridóma-sejtek, melyek a Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology,
Μ A *
- 171 Japan intézetben a FERM BP-5086 deponálási számon vannak letétbe helyezve.
72. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidszekvencia, melynek szekvenciája megegyezik a 43-50. igénypontok szerinti szekvenciák valamelyikével.
73. Fúziós protein, melyet a 72. igénypont szerinti polinukleotidszekvencia kódol.
A meghatalmazott:
• *
Ρ95 02114
KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY
1/14
HOOC
0 II
H 0
I II
C-CH2 -CH2-C- NH-C- C-NH-CH2 -COOH
NH2
SH ( I ) (^^ba^almltoWay,roda Ktt • · · ·
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY
2/U
Ρ95 02114
KÖZZÉTÉTELI
P95 02114 PÉLDÁNY ·· · · ·»·· • · · · • · · · · · • · · · ·· ·· *
5’GTCCATGGGGAAAAGTAAGAGAACA 3'
Ncol
NSATG-láncindító
PCR-amplifikáció DNS-fragmens-izolálás emésztés Ncol-gyel és Xhol-gyel
5' CATGG GGA AAAGTA AG AGAACAA. CCCTTTTCATTCTCTTGTT.
CCAGGAAAAGAGTTCC 3' Nla5’-DNSggtccttttctcaaggagcts' fragmens
3. ábra
DANUBIA ladalmí és Védjegy Iroda Kh Γ46.
• ·
Ρ95 02114
KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY
5/U
TTAACAAGTAAGGTTCGTGGACCCGGTGGTGGACCG «•«««««•a»»·»* » «
5' ...TTTCCAGGAAAAGAGTTCCTCGAGCACGGTCTC... ...TGATTTGAATTGTTCATTCCAAGCAAGTGCG.. ..3'
3i...AAAGGTCCTTTTCTCAAGGAfiCTC6TGCCAGAG... ...ACTAAACTTAACAAGTAAGGTTCGTTCACGC....51
5' AGGAAAAGAGTTCCTCGAGC 3'
NSX2-láncindító !
| PCR-amplifikáció
5'AGGAAAAGAGTTCCTCGAGCACGGTCTC · ρικι ο n KI Q · ·-TGATTTGAATTGTTCATTCCAAGCACCTGGGCCACCACCTGGC31
3'TCCTTTTCTCAAGGAGCTCGTGCCAGAG.. ..ACTAAACTTAACAAGTAAGGTTCGTGGACCCGGTGGTGGACCG5'
Xhol
SacI szignálszekvenciák
NSJ001 P-láncindító
PCR-amplifikáció
51A ATTGTTCATTCCAACCACCTGGGCCACCACCTGGCC CC C.. 3‘TTAA£AAGTAAGGTTCGTGGACCCGGTGGTGGACQjGGGG..
I
4. ábra
Szabadalmi és Védjegy frodu v
DANUBIA
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY
6/14
P95 02114
5'AGGAAAAGAGTTCC TCGAGCACGGTCTC
3'TCCTTTTCTCAAGGAGCTCGTGCCAGAG
CIN3-DNS
TGATTTGAATTGTTCATTCCAAGCACCTGGGCCACCACCTGGC 3* ACTAAACTTAACAAGTAAGGTTCGTGGACCCGGTGGTGGACCG 5' homológ régió]
5'AATTGTTCATTCCAAGCACCTGGGCCACCACCTGGCCCCC 3' TTAACAAGTAAGGTT CGTGGACC CGGTGGTGGACCGGGGG
ACTGGGAGCTCTACAGCTCCCAGGTGTGCTGACAA 3' TGACCCTCGAGATGTCGAGGGTCCACACGACTGTT 5'
CIN3-DNS homológ régió
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16105394 | 1994-07-13 | ||
| JP21839294 | 1994-09-13 | ||
| JP30380994A JP3337178B2 (ja) | 1994-07-13 | 1994-12-07 | クローバーイエローベインウイルスプロテアーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9502114D0 HU9502114D0 (en) | 1995-09-28 |
| HUT72922A true HUT72922A (en) | 1996-06-28 |
Family
ID=27321781
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9502114A HUT72922A (en) | 1994-07-13 | 1995-07-12 | Expression system using autolysable fusion protein and new reducing polypeptides |
| HU0202280A HU0202280D0 (hu) | 1994-07-13 | 1995-07-12 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0202280A HU0202280D0 (hu) | 1994-07-13 | 1995-07-12 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5955072A (hu) |
| EP (2) | EP1251176A3 (hu) |
| KR (1) | KR100417026B1 (hu) |
| CN (4) | CN1090676C (hu) |
| AU (1) | AU696358B2 (hu) |
| CA (1) | CA2153720A1 (hu) |
| CZ (2) | CZ293745B6 (hu) |
| FI (1) | FI953422A (hu) |
| HU (2) | HUT72922A (hu) |
| IL (1) | IL114582A0 (hu) |
| MX (1) | MX9503070A (hu) |
| NO (1) | NO952763L (hu) |
| NZ (1) | NZ272561A (hu) |
| TW (1) | TW459046B (hu) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9904539D0 (sv) * | 1999-12-10 | 1999-12-10 | Alphahelix Ab | Method and device for the handling of samples and reagents |
| FR2824334B1 (fr) | 2001-05-03 | 2003-10-10 | Coletica | Procede pour tester une substance eventuellement active dans le domaine de la lipolyse et son utilisation principalement cosmetique |
| EP1527175B1 (en) * | 2002-06-24 | 2009-05-27 | Exiqon A/S | Methods and systems for detection and isolation of a nucleotide sequence |
| BRPI0611535B1 (pt) | 2005-05-05 | 2021-11-30 | Sensient Flavors Inc | Método para processar células de levedura para produzir beta-glucanos e mananas |
| RU2478709C2 (ru) * | 2005-07-21 | 2013-04-10 | Эбботт Лэборетриз | ЭКСПРЕССИЯ МНОЖЕСТВА ГЕНОВ, ВКЛЮЧАЯ sORF-КОНСТРУКЦИИ, И СПОСОБЫ ЭКСПРЕССИРОВАНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА |
| US20100035300A1 (en) * | 2006-02-27 | 2010-02-11 | Wang Andrew H-J | Producing a Target Protein Using Intramolecular Cleavage by TEV Protease |
| US9206431B2 (en) * | 2007-09-27 | 2015-12-08 | Academia Sinica | Kit for producing recombinant tag-cleavable fusion proteins via at least two different expression vectors allow protein production in two different species host cells |
| US8501449B2 (en) * | 2007-12-04 | 2013-08-06 | Proteon Therapeutics, Inc. | Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof |
| RU2012122240A (ru) * | 2009-10-30 | 2013-12-10 | Эбботт Лэборетриз | Конструкции sorf и экспрессия нескольких генов |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0321973B1 (de) * | 1987-12-23 | 1993-11-03 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Expression der viral kodierten Protease P2A des HRV2 |
| US5162601A (en) * | 1989-11-22 | 1992-11-10 | The Upjohn Company | Plant potyvirus expression vector with a gene for protease |
| US6077694A (en) * | 1990-09-21 | 2000-06-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method for over-expression and rapid purification of biosynthetic proteins |
| ATE257517T1 (de) * | 1991-08-30 | 2004-01-15 | Vertex Pharma | Interleukin 1-beta protease und ihre inhibitoren |
| AU1743795A (en) * | 1994-02-03 | 1995-08-21 | Scripps Research Institute, The | A cassette to accumulate multiple proteins through synthesis of a self-processing polypeptide |
-
1995
- 1995-07-11 US US08/500,635 patent/US5955072A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-12 TW TW084107206A patent/TW459046B/zh not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 HU HU9502114A patent/HUT72922A/hu unknown
- 1995-07-12 NO NO952763A patent/NO952763L/no not_active Application Discontinuation
- 1995-07-12 CA CA002153720A patent/CA2153720A1/en not_active Abandoned
- 1995-07-12 HU HU0202280A patent/HU0202280D0/hu unknown
- 1995-07-13 CZ CZ20014056A patent/CZ293745B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-07-13 EP EP02006860A patent/EP1251176A3/en not_active Withdrawn
- 1995-07-13 MX MX9503070A patent/MX9503070A/es unknown
- 1995-07-13 EP EP95304895A patent/EP0700999A3/en not_active Withdrawn
- 1995-07-13 AU AU24970/95A patent/AU696358B2/en not_active Ceased
- 1995-07-13 NZ NZ272561A patent/NZ272561A/en unknown
- 1995-07-13 CZ CZ19951808A patent/CZ293582B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-07-13 KR KR1019950020656A patent/KR100417026B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-07-13 CN CN95115262A patent/CN1090676C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-13 IL IL11458295A patent/IL114582A0/xx unknown
- 1995-07-13 FI FI953422A patent/FI953422A/fi not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-10-06 US US09/167,151 patent/US6307038B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-02-27 CN CN01110896A patent/CN1320689A/zh active Pending
- 2001-04-25 US US09/842,347 patent/US6743611B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-15 CN CN01133965A patent/CN1385529A/zh active Pending
- 2001-08-15 CN CN01133966A patent/CN1385532A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100417026B1 (ko) | 2004-05-17 |
| US6307038B1 (en) | 2001-10-23 |
| CN1320689A (zh) | 2001-11-07 |
| NO952763D0 (no) | 1995-07-12 |
| IL114582A0 (en) | 1995-11-27 |
| FI953422A (fi) | 1996-01-14 |
| CA2153720A1 (en) | 1996-01-14 |
| US5955072A (en) | 1999-09-21 |
| EP1251176A2 (en) | 2002-10-23 |
| HU9502114D0 (en) | 1995-09-28 |
| US6743611B2 (en) | 2004-06-01 |
| TW459046B (en) | 2001-10-11 |
| EP0700999A2 (en) | 1996-03-13 |
| EP0700999A3 (en) | 1997-04-16 |
| EP1251176A3 (en) | 2002-12-18 |
| CZ293745B6 (cs) | 2004-07-14 |
| CZ293582B6 (cs) | 2004-06-16 |
| AU2497095A (en) | 1996-01-25 |
| MX9503070A (es) | 1997-01-31 |
| CN1385532A (zh) | 2002-12-18 |
| CN1090676C (zh) | 2002-09-11 |
| US20030176688A1 (en) | 2003-09-18 |
| CZ180895A3 (en) | 1996-02-14 |
| NZ272561A (en) | 1997-03-24 |
| HU0202280D0 (hu) | 2002-09-28 |
| AU696358B2 (en) | 1998-09-10 |
| FI953422A0 (fi) | 1995-07-13 |
| CN1126759A (zh) | 1996-07-17 |
| NO952763L (no) | 1996-01-15 |
| CN1385529A (zh) | 2002-12-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1143894A (zh) | 巨噬细胞炎性蛋白-3，-4和-1r | |
| CZ164994A3 (en) | Human variant of kunitz-type protease inhibitor | |
| CN1150804A (zh) | 成纤维细胞生长因子-10 | |
| CZ164494A3 (en) | Human variant of kunitz-type protease inhibitor | |
| IL94602A (en) | Polypeptides and polypeptide equivalents | |
| HUT72922A (en) | Expression system using autolysable fusion protein and new reducing polypeptides | |
| IL171158A (en) | Cliquin inhibitors | |
| JP2916228B2 (ja) | 遺伝子操作した組み換えアプロチニン変異型、均質に処理されたアプロチニン変異型の微生物調製の方法およびその治療学的使用 | |
| WO1994000555A2 (en) | Compositions for the inhibition of protein hormone formation and uses thereof | |
| AU709054B2 (en) | Compositions for the inhibition of TNF formation and uses thereof | |
| CA2217450A1 (en) | Use of an "immunodeficiency-virus suppressing lymphokine (isl)" to inhibit the replication of viruses, in particular of retroviruses | |
| US5998378A (en) | Compositions for the inhibition of TNF hormone formation and uses thereof | |
| CN1032019C (zh) | 生物合成灭活素的方法 | |
| WO1998020034A2 (en) | Novel serine protease inhibitor nucleic acid molecules, proteins and uses thereof | |
| RU2143491C1 (ru) | Полинуклеотидная последовательность (варианты), полипептид (варианты), слитый белок, фармацевтическая композиция, моноклональное антитело, штамм гибридных культивируемых клеток | |
| US5459063A (en) | Plasmodium falciparum ribonucleotide reductase DNA | |
| NZ314127A (en) | Coding sequence of the protease protein cyvv nia from clover yellow vein virus (potyvirus or plant rna virus) and uses thereof | |
| US5843693A (en) | Assay method for screening for inhibitors of proTNF conversion | |
| US6586222B1 (en) | Recombinant PR-3 and compositions thereof | |
| AU687751C (en) | Compositions for the inhibition of protein hormone formation and uses therof | |
| JPH08131178A (ja) | 還元能を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするｄｎａ | |
| WO1994016062A1 (en) | Complement regulatory proteins of herpesvirus saimiri | |
| CN1495258A (zh) | 金属蛋白酶-4的人组织抑制剂 | |
| JP2003033193A (ja) | ヒトシスタチンｅ | |
| MXPA97009390A (en) | Cistatine and hum |