TW459046B - Expression systems utilizing autolyzing fusion proteins and a novel reducing polypeptide - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（，） 發明領域 本發明僳關於需要切割前驅物産物之多呔表現条統， 及此類条統中所使用之蛋白酶。本發明又關於一種可將 二氣靛酚和氣化之麩胱甘呔予以還原之新穎多呔，编碼 此新穎多ffe之DNA,含此DHA之載體，轉形此載體之宿主 ，和内含此多呔之藥學組成物。此外，本發明亦關於對 抗此多呔之單株抗體，和使用此抗體單離並純化此多呔 之方法。 先前技術 馬鈐馨y病毒組（potyviruses)為一群各具有單肢， 近約 10,000鹼基之RtU基因組且感染如S◦lanaceqe科植 物之病毒。馬鈴罄y病毒基因組其持徵為具有一個極長 之開讀框，或 0RF, [ Dougherty, W.G.和 Hiebert.E. (1980)，Virology 101: 466-474; Allison, I{，等人 (1986), ViroUgy 1 54: 9 -20〕。為表現被编碼於 0RF 中之個別蛋白質，乃將轉譯之多蛋白質以兩類型之蛋白 酶（其均亦被编碼於0RF中）切開〔Dougherty, W.G.和 Carrington, J.C. (1988) ,Αηη. Rev. Phytopath. 26: 23-143]。 煙草花葉侵毒性病毒（TEV)為馬鈐薯y病毒族之一員 ，且此病毒産生核包涵體，其可於感染細胞中被台則藍 (trypan blue)所染色。此核包涵體顙然由兩種蛋白質 所組成，其一已被證明為一種病毒蛋白酶，且被命名為 核包涵體 a,或 NIa〔J.Viro丨.，61: 2540-2548(1987)〕 〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇'〆297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ί ^ : ^ Α7 Β7 五、發明説明（> ) 馬鈴lly病毒組之核包涵體a蛋白酶辨識並切割一含 有一種Gln-Gly,GU-Ser和Gin-Ala之胜呔序列，且蔵信 此序列為六元體並出現在多蛋白質中相關NIa之C終端。 切割為於兩個殘基之之間造成上述的二元體。 TEV和煙草脈斑駁病毒（TVMV)(馬鈴薯y病毒族之另一 員）之完整的基因組序列已被確定，且同質性搜尋已確 認此些病毒之NIa的位置在其個別之基因組中〔Virology, 154： 9-20(1986)； Nucleic Acid Red.,14： 5417-5430 (1986)〕。 三窠草黃脈病毒，或CYVV,亦為一種馬鈐薯y病毒。 然而，僅有出現在CYVV基因組3’端之基因與其编碼之外 殼蛋白已被定序列〔Uyeda, I.等人（1991), Intervirol. 3 2:2 34 - 2 45〕。基因組之NIa區域的構造既未被事先說 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) it 0 單 被 未 亦 a T1 Η 之 應 對 且 明 之性 知源 熟外 蓋於 此地 用易 使容 可能 ，不 質呔 白多 勺 性多 源許 外有 産卻 生 ， 統而 条然 現 〇 表行 由進 經術 技 現正 表修 量地 大然 被全 法被 無而 Ife因 多基 於節 在調 能置 可放 題游 問上 其以 。僅 現法 表無 被常 中通 統此 糸且 - 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 會 不 式 型 熟 成 令 rtu 逹 以 飾 修 後 〇 錄生 轉發 要地 需確 能正 可不 其以 ’ 或 地 ’ 外生 S 發 予於 酸不 胺並 硫理 甲處 端此 終 。 N-式 以型 初熟 最成 呔得 多取 的以 物除 生刪 核被 真後 多隨 許其 如譯 例轉 以 式結 方糖 1 芽 另麥 之與 現質 表白 到蛋 達性 可源 現外 發的 須欲 必所 此將 因括 , 包 生一 發之 中術 物技 生類 核此 原 〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） B7五、發明説明（ί ) 合蛋白質，或麩胱甘Sfes-轉移酶融合，例如，將被表琨 的融合蛋白質純化且其後以蛋白酶，如Xa因子，腸激酶 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 其 —質3Ϊ表 供物 ΐ 但高自原 肪必地可氧 與 "白 Κ 於¾¾白匿的 式化 較為或 脂為意亦化 須 在 。1蛋^1物 型mp性有式子 將傲注氣活 必 M失is多 Μ 産 的超 ί 化具型分 可命常化抗 數 缺流 ΐ 之IJit終 劑如ίρ氧氣的之P1J生非活抵 次 要的 列 之 化， 高氣力子 ，對須，一 生 主上VI序 1 割 氣基),為大強電 制氧必性以 産 之質TE子 I 切 以由- 身比最對 控化且應設 和 法實用接 ^ 白 般自0H本於之配 當活-反裝 量 方物使連1¾蛋 一 呈 — 氣關氧未 適然害的非 ， 竭 基 的産，有"於 中般?|氣係化上 未雖傷度除 置 煩終示具JC對 境 一 U 。 J活以 若，康高體 α位， 麻成掲間rf。 環式):0)氧。或 且此健於物活之 5 此造01質Jtl中 胞型 22 化子個 ，因的由生存氧 π 。此,6白此主 細化20(Η活分一 定。在，的法化 割 ，62蛋(1,宿 e 於活Η2水 r 氧有 安性潛量活無活 ,JS /IV. 切驟，之 Η 一 示氣之 ί 成語含具 不變一小，則 ， 以步 現，入掲之中tt形術和種 為酸為徹果否中 予化No表申殖未用氣 W 原之氧一 型核亦以結，境 酶純利欲纟選則源用 i 還用之為 典和其使。轉環 血個專所tp因化能.使 被使位其 基質但即病機胞 凝兩國其類基純謝於),後所電， 由白，。疾禦細 或要美於人多和代 。2 用處化基。自蛋的制致防於 ，需 一如之現 應(0使此氧由子 ，需控導之 J-------f 4-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家槺準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 中和伴隨之危險之細胞能力仔細地平衡。此能力典型由 一使用其所擁有之抗氣化剤或抗氧化酵素之防禦機轉所 提供。於本發明之上下文中，「抗氧化劑」為天然存在 物質之總稱，其能預防或抑制如脂肪的自身氣化。術語 「抗氧化酵素」一般僳指一種酵素，其催化將活化氣移 除之反應，術語「抗氧化作用」同此推論。 於許多不正常的環境中産生過量的活化氧，如當一個 人被壓抑,服藥，吸煙.動手術，具有一器官移植時，或 其若於來自腦或心肌梗塞之缺血時。此大量為高於身體 控制条统所能移除者，因此過量的活化氣可再傷害身體 ,嚴重地損害正常細胞。結果，所謂的氧化壓迫乃摟負 許多疾病狀況。 以動脈硬化為例，由活化氧所氣化之低比重脂蛋白的 出現被認為是疾病的一個病因〔Steinberg, D. (1983), Arteriosclerosis 3,283-301]。氧化壓迫亦被認為與 伴随糖尿病發生，代謝不正常和血管併發症之機轉中的 起因和功效緊密有關[Kondo, M, ed.,”Approaches from Modern Hedicine(4)Free Radicals",Medical V i e w P u b .,第 1 3 8 - 1 4 6 ]。 活化氧亦關連其他病理狀態和情況，如：缺血性疾病 (如再灌通疾病，缺血性心臓病，腦缺血症，缺血性睹炎 等），水腫，血管摻透性過大，發炎，胃黏瞑疾病，急 性胰炎，克隆氏病，潰瘍性结腸炎，肝病，帕拉夸氏 病，肺氣腫，化學癌生成，癌轉移，成人呼叫痛苦症候 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 459 04 6 a? B7 五、發明説明（Γ ) 群，散布性血管内凝固作用（DIC),白内障，早熱性視 網膜病，自體免疫疾病，坡菲林ώ症，溶血性疾病，地 中海型貧血，帕金森氏病，阿耳滋海黙氏病，癲癇，紫 外線放射疾病，放射性疾病，凍瘡和灼傷。 於細胞内部和外部均存在許多防禦機轉，其主要目的 為將生理上産生的活化氧移除。 細胞内地，抗氧化劑和抗氧化酵素，如下所列者，已 知為處理並移除活化氣者。過氣化氫酶為存在於過氧化 物酶體中，且此酵素還原並移除過氧化氫。麩胱甘呔過 氣化酶出現於細胞質和粒線體中，且此酵素於還原態麩 胱甘呔存在下，將過氣化氫和脂防過氣化物還原並去毒 。例如，鐵傳遞蛋白，鐵蛋白和乳鐵蛋白經由安定鐵離 子而可抑制活化氧的生成，而血漿銅藍蛋白對銅離子亦 表現出類似的功能。此外，例如超氧化物技化酶（其存在 於細胞質和粒線體中）催化超氧化物之還原作用以形成 過氧化氫，此過氧化氫其後以例如，過氣化氫酶予以移 除。此外，維生素C和Ε ,還原麩胱甘肽和其他低分子 量化合物亦能還原並移除活化氣。 經濟部中央標準局負工消費合作杜印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 另一方面，此類藥劑如細胞外超氧物岐化酶，细胞外 麩胱甘呔過氧化酶和還原麩胱甘肱存在於細胞外之環境 中，且其具有如上所列細胞内柑對物之類似作用型式。 然而，與細胞内的情況相比，其有較少類型之細胞外抗 氧化劑和抗氧化酵素，且僅少數展現出細胞外抗氧化作 用。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 4 59 0 46 A7 B7 五、發明説明（b ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 還原麩胱甘Ife具有保持細胞内和外之還原狀態的重要 功能，且其以下式代表。麩胱甘呔首先於1 888年被de-Rey-Pailhade發現於酵母中，且其後於1921年被Hopkins 單離為一化合物後而被命名為麩胱甘肱。

HOOC-C-CH2-CH2-C-NH-C-C-NH-CH2-COOH

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SH 麩胱甘fe為由三種胺基酸所組成；麸胺酸，半胱胺酸 和甘胺酸。兩値麩胱甘呔分子中之硫醇基可於活化氣存 在下被氧化形成一雙硫鍵，藉此將活化氧還原。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 麩晄甘肽主要於肝臓中産生，且經由血漿於體内循 璟。於正常身體中，麩胱甘肽幾乎全部以還原型式存在 。當氣化型式濃度增加時，其後還原型式藉由麩胱甘fe 還原酶於菸鹼醯胺線嘌昤二核苜酸磷酸酯（NADPH)存在下 之作用而被再産生。因此，還原的麩胱甘肽藉由將活化 氧和自由基予以還原，而可保護細胞膜免於氧化疾病和 功能。具有此抗氧化性質之結果，使得還原態麩胱甘肽 亦可保護對抗放射活性之影锻且可用於做為白内障之治 療藥。近來已被報導AIDS患者之還原態麩胱甘呔金身濃 度降低，其傾於指出還原態麩胱甘呔於身體中之角色乃 極為重要。然而，於不正常之情況中，活化氧之量可為 如此高，令所有麩胱甘呔為於氧化狀態，使得活化氧不 能儘可能快速的移除。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） H U 4 δ Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 ( 7 ) i 1 人 類 硫 氧 化 還 原 蛋 白 為 Μ 由 其 還 原 活 性 « 於 細 胞 内 和 1 1 外 蓮 用 各 種 生 理 作 用 之 物 質 的 第 二 個 實 例 0 人 類 硫 氧 化 1 還 原 蛋 白 (亦已知為成人T 細胞白血病衍生因子， ADF) 請 先 1 為 被 選 殖 成 —‘ 可 於 成 人 T 細 胞 白 血 病 細 胞 % 中 誘 發 間 白 閲 1 質 2 細 胞 受 ΜΟ 握 (IL- 2R)之因子。 其為- -在其活性位置具有 背 Λ 1 I 之 1 兩 個 半 胱 胺 酸 之 硫 醇 依 存 性 還 原 酶 9 且 可 將 活 化 氧 和 S 注 意 1 I 由 基 予 以 還 原 0 事 項 1 | 再 1 除 了 誘 發 IL -2細 胞 受 體 會 人 類 硫 氧 化 還 原 蛋 白 亦 促 空 進 被 愛 本 氏 頓 病 毒 (ΕΒ V )感染之B 細胞株3B6 中 細 胞 的 生 長 頁 1 1 > 保 護 抵 抗 衍 生 白 早 核 球 源 細 胞 条 U937 之 腫 瘤 m 死 因 子 1 1 (TNF) 並保護抵抗墙中性白血球之血管内皮細胞的損 1 I 害 Ο 又 t 於 細 胞 内 之 環 境 中 t 人 類 硫 氧 化 還 原 蛋 白 經 由 1 訂 1 其 還 原 活 性 而 作 用 於 雄 轉 錄 因 子 NFKB 9 JUN和 FOS ， 藉 以 提 高 DNA結合活性並使其作用增加轉錄活性。 人類硫氧化 1 I 還 原 蛋 白 巨 前 已 被 發 展 成 為 放 射 活 性 疾 病 之 保 護 劑 * 1 1 及 再 灌 通 疾 病 * 風 濕 性 關 節 炎 和 發 炎 之 治 療 藥 » 所 有 此 1 I 類 疾 病 均 可 錢 由 其 還 原 活 性 保 護 抵 抗 細 胞 損 害 之 能 力 而 I 被 保 護 0 i 1 如 上 所 述 Μ 由 移 除 活 化 氣 和 白 由 基 而 將 細 胞 内 和 細 1 1 胞 外 之 環 境 均 維 持 在 一 還 原 狀 態 乃 為 生 理 上 極 為 重 要 0 1 I 咸 信 許 多 抗 氧 化 劑 和 抗 氣 酵 素 9 於 細 胞 内 和 外 » 均 具 有 Γ 扮 演 移 除 活 化 氧 和 g 由 基 的 角 色 Ο 依 此 其 極 為 有 用 1 發 現 - 能 再 産 生 之 還 原 物 質 * 例 如 還 原 態 麩 胱 甘 呔 〇 此 1 類 物 質 可 η 助 如 上 述 之 不 正 9 常 的 身 體 情 況 0 1 1 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） A7 B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明 ( ) 1 1 發 明 概 1 1 1 本 發 明 之 第 一 巨 的 在 於 提 供 __- 種 新 穎 蛋 白 酶 » 编碼此 1 蛋 白 酶 之 核 甘 酸 序 列 f 内 含 编 碼 此 蛋 白 酶 之 DNA序列的 請 先 1 載 體 f 和 被 該 載 體 轉 形 的 宿 主 細 胞 〇 閱 讀 1 本 發 明 之 第 二 的 在 於 提 供 编 碼 所 欲 蛋 白 質 且 亦编碼 面 1 I 之 1 該 蛋 白 質 上 游 之 新 穎 蛋 白 酶 的 DN A , -於該兩種序列間之 意 1 | 序 列 又 再 m 碼 可 被 該 蛋 白 酶 切 割 之 胜 t 所 有 該序列 事 項 1 I 再 為 於 相 同 的 開 謓 框 中 〇 另 —' 百 的 在 於 提 供 種 攸 該DHA 填 寫 本 编 碼 之 蛋 白 質 * 和 内 含 該 DH A之載體及- -包括該載體之 頁 1 I 表 現 % 統 9 該 載 體 可 於 適 當 的 宿 主 細 胞 中 白 主 性 地複製 1 1 例 如 藉 由 包 括 自 主 性 複 製 所 需 的 核 苜 酸 序 列 0 1 I 另 外 % 本 發 明 之 首 要 百 的 在 於 提 供 — 種 核 甘 酸 序列， 1 訂 其 碼 具 有 生 體 内 還 原 活 性 之 新 穎 多 〇 其 困 的亦在 i 於 提 供 此 類 DNA , 其编碼- -可接二氣靛酚和氧化態麩胱 1 I 甘 肽 予 以 還 原 之 胜 肽 〇 1 1 本 發 明 之 再 一 目 的 在 於 提 供 一 種 包 括 上 述 DN A之重組 ! J 載 體 該 載 體 可 於 適 當 的 宿 主 細 胞 中 白 主 性 地 複 製，例 I 如 藉 由 具 有 一 可 白 主 性 複 製 之 鹼 基 序 列 0 1 1 更 且 本 發 明 之 又 再 困 的 在 於 提 供 種 已 被 上述重 1 I 組 載 體 轉 形 之 宿 主 細 胞 微 生 物 〇 其 a 的 亦 在 於 提 供上述 1 I 胜 做 為 轉 形 宿 主 細 胞 之 表 現 産 物 * 並 提 供 « 種 對抗該 1 Γ 胜 呔 之 C1B 早 株 抗 BM m 0 1 吾 等 現 今 鑑 視 並 選 m 該 新 穎 的 C YV V 蛋 白 酶 (INa )且意 1 外 地 發 現 其 可 使 用 C YV V K la 做 為 融 合 蛋 白 質 的 __. 部分， 1 1 -10- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（9 ) 其可於如大腸桿菌之宿主中表現並允許可自我切割取得 所欲外源性蛋白質之融合蛋白質大量産生。此CYVV N la 基因可於大腸捍菌中安定地保持並表現，且表現的NIa 保留其做為專一蛋白酶之活性，即使當此蛋白質形成融 合蛋白質之一部分。 吾等亦發現一 DNA，其编碼該可將二氯靛酚{亦已知 為二氯酚靛酚，2,6-二氣靛酚，或2,6-二氣-4-[(4_羥 苯基）亞胺基]-2,環己二烯-卜酮）和氧化態麩胱甘版 予以還原之新穎多肽，該多肽可藉由使用適當的遣傳工 程技術而被大量取得。此多呔特別可用於氣化性壓迫所 引起，或相關狀況，或任何由活化氧所引起之疾病，如 動脈硬化，糖尿病和缺血性疾病（包括再灌通疾病，缺 血性心臓病，腦缺血症和缺血性腸炎）的治療。 因此，本發明第一實施例之首要目的在於提供一種聚 核甘酸序列，其中該序列於5 ’至3 ’方向和相同開讀框中 包括： a) —種序列，其編碼為三葉草黃脈病毒核包涵體3蛋 白質，或其具有類似三葉草黃脈病毒核包涵體a蛋白 質之蛋白水解專一性的突變體或變異體； b) —種序列，其編碼為一可被該三葉草黃脈病毒核包 涵體a蛋白質或該突變體或變異體辨認且切割之胜肽 ;和 c )至少一個序列编碼一多呔。 本發明亦提供一種序列编碼三葉草黃脈病毒核包涵體 -1 1 - 本紙張尺度適用中画國家標準（CNS ) A<t規格（2〗〇X297公釐） I.---------取ΐτ一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明 (' ) 1 1 a 蛋 白 質 * 或 其 具 有 類 似 二 葉 Μ 黃 脈 病 毒 核 包 涵 體 a 蛋 1 1 白 水 解 專 一 性 的 突 變 體 或 變 異 體 〇 1 本 發 明 再 提 供 種 載 體 » 特 別 疋 一 種 表 現 載 體 V 内 含 請 先 ! 如 上 定 義 之 序 列 〇 閱 讀 1 本 發 明 又 再 提 供 種 以 如 上 定 義 載 體 轉 形 之 宿 主 1 和 背 1 | 之 1 一 種 表 現 % 統 其 包 括 該 宿 主 和 該 表 現 載 體 > 和 由 該 表 注 意 1 I 現 % 統 所 産 生 之 多 呔 0 事 項 1 I 再 1 * 於 發 明 之 另 —* 具 jam 體 例 中 9 其 首 要 巨 的 在 於 提 供 9 種 寫 本 取 聚 核 甘 酸 序 列 r 其 編 碼 —* 具 有 序 列 ID Η 0 . 12胺 基 酸 數 百 頁 S_»* 1 I 1 至 5 2 6之胺基酸序列的多呔， 或其编碼該多Ife之突變 1 1 BPtl Βέ 或 變 異 ttdfc m f 規 定 被 聚 核 甘 酸 序 列 编 碼 之 多 肱 可 將 二 1 [ 靛 酚 和 氧 化 態 麩 胱 甘 呔 予 以 S|PB m 原 〇 1 亦 提 供 種 載 體 * 特 別 是 —‘ 種 表 現 載 體 > 内 含 如 上 定 1T 1 義 之 序 列 〇 1 I 本 發 明 又 再 提 供 ___* 種 以 如 上 定 義 載 體 轉 形 之 宿 主 » 和 1 [ 種 表 現 % 統 r 其 包 括 該 宿 主 和 該 表 現 載 體 > 和 一 由 該 1 表 現 糸 統 所 産 生 之 多 0 I 本 發 明 亦 提 供 治 療 之 上 述 多 Sk » 和 此 類 多 呔 於 由 氧 化 1 1 性 壓 迫 所 引 起 或 相 關 之 狀 況 > 或 任 何 由 活 化 氣 所 引 起 [ i 之 疾 病 的 治 療 和 預 防 * 和 包 括 此 多 肽 之 藥 學 組 成 物 〇 1 I 其 又 再 提 供 種 對 抗 此 多 呔 之 抗 體 » 恃 別 是 〇〇 早 株 抗 體 Γ 和 其 相 等 物 1 且 本 發 明 額 外 提 供 一 種 産 生 此 類 抗 體 之 1 方 法 和 使 用 此 抗 體 純 化 多 肽 之 方 法 〇 1 圃 而 7 簡 OCT 单 説 明 1 1 -1 2- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 459046 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 B7 _五、發明説明（η ) 本發明將以其相關之附匾予以說明，其中： 圖1為由CYVV-cDNA單_之NIa區域cDNA的限制期輿圖； 圖2為示出内含NIa 5'區域之質體PKNI5’方構築； 圃3為示出内含一部分IL-11基因和NIa 5’匾域之質 體POI5IL的構築； 圏4為示出製備5 ’ I L D H A Η段，C I H3 D H A Η段所使用 之引子且其中NIa基因之3’-終端和IL-11基因之5’-终端 為被融合： _5為示出CIN3 DNAH段和ILS'DNA片段以PCR之融合； 函6為示出質體PKSUH9之構築； 園7為PUCKH 31-7之限制酶興圖： _8為pUCKM 3卜7和pcD-31中3'終端核甘酸序列之比 較圔； 圓9為pSR α 31-7之構築圖； 匾10為組胺酸六元醱编碼序列導入pdCKM 31-7之圖； 圖11為PMAL31-7之構築圔； 豳12為二氛酚-靛酚邇原活性之分析圖；和 圖13為氣化態麩胱甘肽之邇原活性的拥定。 發明：> 拄细堪沭 本發明將先以參考本發明之第一具體例予以說明，但 下列討論亦適於本發明之第二具體例，除非該討論顯然 不適用於第二具髏例。 可察知•本發明之聚核甘酸序列一般較佳為以DNA型 式，且基於此理由，此*之參考一般為對DNA。然而， -13- I,--------V-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度逋用中國國家梯率（CNS ) A4規格（210X297公釐） 459046 B7 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (彳 ) 1 1 此 類 參 考 若 Isgri 適 當 * 亦 可 包 括 RNA〇 RH A並 不 是 如 此 令 人 m 1 1 意 t 因 為 其 使 用 性 受 實 際 所 限 0 例 如 9 mRMA 可 於 蝤 卵 細 1 胞 中 或 於 一 麥 芽 溶 胞 産 物 糸 統 中 表 現 t 但 其 於 經 濟 基 礎 請 先 1 均 無 法 實 際 用 於 生 産 大 量 的 融 合 蛋 白 質 0 閱 讀 1 此 處 所 使 用 之 術 語 ”胜呔” 意 指 任 何 經 由 胜 呔 鍵 連 接 包 έ 1 I 之 1 括 2 或 以 上 胺 基 酸 之 分 子 〇 如 此 » 此 ilr* 術 語 包 括 寡 胜 * 注 意 1 I 多 Sfe 和 蛋 白 質 〇 術 語 ”融合蛋白質” 臨 网 於 任 何 經 由 結 合 事 項 1 I 再 1 兩 個 或 以 上 其 他 胜 序 列 之 at* 早 —1 多 呔 Ο 寫 本 亦 可 察 知 t 本 發 明 之 序 列 較 佳 為 以 雙 股 之 型 式 • 且 本 頁 ^ 1 I 發 明 亦 正 視 對 應 於 本 發 明 序 列 之 反 jit 思 義 序 列 〇 本 發 明 之 1 1 雙 股 (或d S ) 序 列 可 具 有 或 二 個 ”黏狀末端” » 於 反 意 義 1 j 和 義 股 之 情 形 中 並 不 需 t=ti* 兀 金 對 應 Ο I 1 田 本 發 明 序 列 於 __. 適 當 表 現 % 統 中 被 表 現 時 上 述 a ) IT 1 序 列 所 编 碼 之 蛋 白 質 傾 向 於 切 割 上 述 b) 序 列 所 m «9η 碼 之 胜 1 I 肽 而 釋 出 上 述 C ) 序 列 所 编 碼 之 多 肽 〇 1 1 融 合 蛋 白 質 之 切 割 可 於 上 述 a } 和 b) 序 列 被 轉 譯 後 之 任 1 i 何 時 間 進 行 0 如 此 9 可 察 知 上 述 C ) 所 编 碼 之 多 於 切 割 I 前 不 需 被 兀 全 轉 譯 〇 妖 /·»·»-» 而 9 實 際 上 吾 等 發 現 至 少 某 些 1 ! 融 合 蛋 白 質 < 若 不 為 主 要 的 f 為 於 切 割 前 J~*T* 7C 全 被 轉 譯 〇 1 l 於 上 述 C ) 序 列 编 碼 多 於 個 多 肽 時 » 則 其 需 要 编 碼 另 1 1 外 位 於 各 编 碼 多 呔 間 之 切 割 序 列 f 除 非 其 例 如 欲 取 得 __· 1 Γ 未 切 割 ， 融 合 的 多 數 多 肽 〇 1 若 上 述 C ) 序 列 «κΡ· 碼 „* 値 以 上 多 Sfe » 則 此 序 列 易 於 轉 錄 1 環 境 中 被 減 弱 〇 於 減 弱 過 程 中 本 發 明 mRH A 序 列 之 轉 錄 1 1 -1 4- 1 ! [ 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） A7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 編。和 製否能 碼被之欲時辨式 j例 列话w"^包獨 所生碼 欲。可 編要間意呔所方5JSI可 序包自含被法 端産編 其時並 各需端其多酶他 W 質 割 s可無 3'被被 非合煩 於不 5 於之白其 白 切 ” 分並 列量肽 除融麻 且並列。多蛋被ap蛋¾11或 部 fe 序之多 -摘為 ，列序識眾之可NI多s.ha''^ 端胜 於者阔 呔敷其 呔序b)辨備碼為其而 FLNIl 終割 近碼數 多多且 多割和所製编其被 a 软、C 切 較编於 傾此，。上切列酶以列令可INtgy,,' 之 ， 得所了 一 將離費以此序白開序可後卩 ί纟丨ilfe中 使端除 C 碼於單浪個則 3 蛋切 a 列錄liffe丨 胜例 ’5'，外编或防的一 ，為之我被序轉 ^ 。胜IJ,中胜割此 止於題以僅，多物碼時係碼自可的於 割割 ^ 列 y 切於5- 其 序 -停近問形佳用各産编列需编行列外質 切切 |序卩而。- 前較一情較使將終列序所列進序另白 酶之 之 ，分 HA於為之亦同後成序割其序質割類蛋 _白碼纟碼纟列部 mR少非長般共割造C)切 。a)白切此合 蛋编δϊ编 序端 ) 部較並常一供切而述個識被蛋的擇融 ^ 胰所)«所 端終 0 全以般非列以於用上一辨需合外選得 口或列 ^ 列)ο終 Ν ('取，一為序ffe要作於有所必融另.使ai子序¾序fe"c 之 明 讀Ife用呔C)胜需化，具.la列令何而 ，«1因：^.!1幻多之肽 説 於多作多述數其純而間 N 序受任然者生xa述31和”酶多 明 用之弱或上多，由然sfevv割接則。割産以上43)和白於 發 作碼減 \ 備則經 多CY切或-識切，如 和於，蛋含 ' 五 J-------f衣------訂------j (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

五、發明説明 (丨 4 ) I I 立 的 存 在 f 且 蛋 白 酶 辨 識 位 置 為 由 蛋 白 酶 之 C 終 端 和 多 I I 呔 之 N 終 端 所 組 成 〇 I 切 割 胜 亦 可 僅 被 包 含 於 蛋 白 酶 或 多 呔 中 0 於 此 例 中 ，·~· 請 先 I 4 切 割 胜 呔 之 N 終 端 正 常 被 包 含 於 蛋 白 酶 之 C 終 UU 端 部 分 η I 1 而 多 Ife 之 N 終 端 部 分 可 直 接 連 接 到 切 割 序 列 或 於 多 背 & I | 之 I 和 連 接 子 之 間 可 具 有 —- 個 或 以 上 之 胺 基 酸 殘 基 〇 注 意 I | 於 切 割 序 列 和 蛋 白 酶 和 / 或 切 割 序 列 和 多 Sfe 之 間 具 有 事 項 I | 再 I 個 或 以 上 胺 基 酸 殘 基 方 面 則 此 類 殘 基 之 數 g 和 性 質 寫 本 釀 為 不 致 於 妨 礙 蛋 白 酶 之 作 用 〇 多 呔 N 終 端 上 2ja 過 量 的 胺 頁 s_x I I 基 酸 殘 基 並 無 利 處 f 而 必 須 將 此 類 殘 基 移 除 * 以 取 得 多 I I 呔 之 成 熟 型 式 〇 一 般 較 佳 > 儘 可 能 9 且 無 不 當 下 * 靈 巧 I I 地 處 理 此 切 割 胜 肽 * 使 得 可 於 融 合 蛋 白 質 之 切 割 上 取 得 I I 訂 I 所 欲 蛋 白 質 的 成 熟 型 式 〇 妷 Μ、、 而 » 其 兀 全 可 能 取 得 一 蛋 白 質 具 有 例 如 G ly , Se r或A I a 連 結 至 R 終 端 » 且 若 音 /ϊΣ\ 欲 r 可 I I 將 其 以 適 當 的 胺 基 胜 呔 酶 之 作 用 以 移 除 〇 I I 於 某 例 子 中 其 乃 欲 於 多 呔 N 終 端 和 切 割 序 列 之 間 编 碼 個 脯 胺 酸 0 此 令 殘 基 之 切 割 ， 例 如 以 胺 基 胜 肽 I 酶 P (3 .4 .1 1 . 9) 之 作 用 * 至 多 達 脯 胺 酸 殘 基 而 非 超 過 I I 〇 此 脯 胺 酸 殘 基 其 激 可 經 由 脯 胺 酸 亞 胺 基 胜 呔 酶 之 作 用 I | 被 移 除 9 以 産 生 成 熟 蛋 白 質 0 此 構 成 本 發 明 之 較 佳 具 體 I | 例 〇 I I a ) 序 列 所 编 碼 之 蛋 白 酶 可 切 割 本 發 明 序 列 所 编 碼 之 融 I I 合 蛋 白 質 〇 於 本 發 明 中 t 此 蛋 白 酶 為 三 葉 草 黃 脈 病 毒 核 I 包 涵 體 a 蛋 白 酶 t 或 其 具 有 類 似 三 葉 草 黃 m 病 毒 核 包 涵 I I -I 6 - I I I I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Ad規格（210 X 297公釐） 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（β ) 體a蛋白酶之蛋白水解專一性的突變體或變異體。 三葉草黃脈病毒NIa蛋白酶為被序列表中序列ID No.1 之核苜酸數目10至U11所編碼，而NIa的原序列被指定 為序列表中序列ID No. 2之胺基酸數目4至437。此些序 列為新穎，且形成本發明之一部分，其突變體和變異體 亦同。 核包涵體3具有蛋白水解活性，其專一地將受質胜肽 中G I η - A 1 a , G 1 η - G 1 y或G U - S e r之間的胜呔鍵水解。此外 ，吾等亦發現NIa可切割Gln-Val。因此，舆馬鈴|fy病 毒族之其他蛋白酶大不相同，吾等發現CYVV NIa (此處 提及之NIa應為意指CYVV NIa,除非另外指明）可切割序 列Asn Cys Ser Phe Gin X,其中X為任何胺基酸殘基， 主要為Gly, Ala,Val或Ser,而恃別為Gly, Ala或Ser。 亦可察覺，包括序列AsnCysSerPheGlnX之胜肱可被Hla 切割，特別是於此類序列為之體暴露N I a之作用。因此 ，本發明亦提供一種製備多肽的条統，其中内含序列 AsnCysSerPheGlnX之多呔的前驅動型式為被NIa所切割 。此条統亦可包括其他適當的處理步驟，其可於NIa切 割之前，之後或不同時^ 雖然吾等一般較喜愛使用一種編碼天然存在NIa之序 列（相等於序列I D 2 ),但本發明同樣意欲使用N I a之突變 體或變異體。 如所示，蛋白酶應具有相同或類似天然存在Hla之專 一性。於此點，此蛋白酶一般應與序列ID No.2中之胺 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (_ V ) 1 t 基 酸 殘 基 4 至 43 7 共（1 ]負攙實質序列的n ]質性， 除非此 1 1 藝 人 士 熟 知 該 實 質 的 變 化 並 不 改 變 辨 識 序 列 或 降 低 活 \ 1 性 至 可 用 程 度 以 下 0 請 ft 先 1 通 常 * 可 察 知 任 何 指 定 蛋 白 質 的 活 性 為 依 賴 分 子 的 某 閱 1 保 留 區 域 而 其 他 區 域 對 於 其 特 別 序 列 僅 具 有 些 徹 的 重 背 i 1 之 1 要 性 且 可 能 幾 乎 或 兀 全 多 餘 的 〇 依 此 如 上 所 示 ， 本 發 % 1 I 明 包 括 任 何 序 列 上 之 變 異 體 和 突 變 體 其 偽 仍 顯 示 出 類 事 項 1 1 再 似 天 然 存 在 HI a之專- 此類變異體和突變體例如包 4 & 本 括 刪 除 ， 加 成 ， 插 人 r 逆 位 » 重 覆 和 類 型 取 代 (例如， 頁 1 1 通 常 將 親 水 性 殘 基 以 另 一 種 對 強 疏 水 性 並 非 為 強 親 水 性 1 1 者 取 代 )〇 少童的改變- -般對活性具有些撤的影遒， 除 1 j 非 其 為 於 分 子 的 重 要 部 分 中 9 且 此 類 改 變 可 能 為 一 基 因 1 訂 操 作 的 副 産 物 ， 例 如 當 産 生 額 外 的 限 制 位 置 為 意 欲 時 〇 1 通 常 t 一 般 並 m 任 何 特 別 理 由 欲 將 K I a之構造改變， 1 I 除 了 於 此 藝 人 士 所 熟 知 之 情 況 中 〇 的 確 大 部 分 對 胺 基 1 1 酸 或 编 碼 序 列 之 突 變 作 用 和 變 異 作 用 為 原 始 野 生 型 病 1 I 毒 之 新 穎 變 異 作 用 的 卑 離 結 果 0 不 過 ’ 刻 思 且 即 使 外 l 的 修 飾 作 用 亦 不 應 由 本 發 明 中 排 除 ， 前 提 為 該 蛋 白 酶 具 1 I 有 必 須 的 專 性 和 充 分 的 蛋 白 水 解 活 性 〇 1 1 此 處 所 使 用 之 術 語 ”不良效果” 指 任 何 對 專 一 性 或 活 1 I 性 之 效 果 致 使 蛋 白 酶 顯 箸 不 如 上 述 天 妖 存 在 Ν I a有效， 1 1 至 其 活 為 降 至 有 用 濃 度 以 下 之 程 度 〇 1 1 許 多 取 代 作 用 加 成 作 用 等 可 被 進 行 t 且 其 限 制 僅 為 1 其 活 性 不 被 不 良 地 影 m 〇 通 常 1 對 活 性 之 不 良 效 果 僅 可 1 1 -1 8 ~ 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 459046 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (彳 7 ) 1 1 能 在 於 若 N I a之3 -D (三 三级） 構 造 被 嚴 重 影 響 時 G 1 1 此 處 所 使 用 之 術 語 ”突變體” 偽 關 於 序 列 中 胺 基 酸 殘 基 J i 之 刪 除 ， 加 成 * 插 入 ， 逆 位 和 置 換 對 活 性 faff m 不 良 影 鬱 者 請 先 1 〇 本 發 明 別 包 括 ”變異體" ♦ 此 術 語 % 用 於 有 關 天 然 存 在 閲 1 C YV V N I a I 其 密 切 地 對 應 於 序 列 ID 2 f 但 於 大 多 數 中 以 背 1 1 之 1 可 期 望 之 方 式 與 其 不 同 〇 於 此 定 義 中 存 在 有 對 偶 W 異 和 意 1 I 來 白 其 他 培 養 之 顯 示 出 類 似 型 活 性 和 具 有 相 關 序 列 之 胜 事 項 1 I 再 1 呔 0 填 寫 本 可 察 知 本 發 明 第 二 具 體 例 之 Κ I a和蛋白質均不需要完 頁 1 I 全 對 赃 應 於 序 列 ID 2和 1 2所 述 之 序 列 0 其 僅 需 各 具 有 所 欲 1 1 活 性 ， 縱 使 此 多 呔 僅 為 天 然 序 列 全 部 之 一 部 分 ， 或 即 使 1 1 為 此 部 分 之 突 變 體 或 變 異 體 〇 1 1 真 核 生 物 之 基 因 r 如 干 擾 素 基 因 t —‘ 般 被 用 以 說 明 多 玎 1 形 現 象 [ 參 見 Hi s h i， J .等人（ 1985), J .B i 〇 c h e so .97 , I I 153- 159] 〇 此多形現象造成某些情形其中- -個或以上 1 1 之 胺 基 酸 為 於 多 呔 中 被 取 代 » 和 其 他 情 形 其 中 縱 使 核 甘 1 J 酸 序 列 之 取 代 % 對 胺 基 酸 序 列 亦 無 改 變 0 1 因 此 1 其 可 察 知 聚 核 甘 酸 编 碼 序 列 亦 可 以 任 何 所 欲 方 1 1 式 修 飾 I 前 提 為 對 蛋 白 酶 活 性 無 不 良 效 果 〇 點 突 變 和 其 1 | 他 改 變 可 以 加 成 或 刪 除 限 制 位 置 逹 到 » 例 如 4 在 其 他 方 1 | 面 可 幫 助 基 因 操 作 / 表 現 » 或 增 加 或 在 其 他 方 面 利 於 修 1 1 飾 N I a分子。 1 1 術 a tta ”突變體”和 ”變異體” 此 處 亦 用 於 有 關 聚 核 甘 酸 序 1 列 » 旦 此 類 參 考 rtftr 於 適 當 方 式 中 被 準 用 推 論 〇 其 可 察 知 1 1 -1 9- I 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家橾嗥（CMS ) A4規格（210X297公釐） 459046 A7 B7 經濟部中央榇準局員工消費合作社印裝 五、發明説明 (^ ) 1 1 雖 然 胜 序 列 之 突 變 體 或 變 異 體 總 曰 疋 被 反 映 於 编 碼 之 1 1 核 苷 酸 序 列 中 9 但 反 之 不 需 要 為 真 〇 依 此 » 在 不 曰 影 饗 \ 1 胜 肽 序 列 情 況 下 其 對 待 實 質 地 改 變 之 核 苜 酸 序 列 是 可 能 讀 /t 先 1 的 (參見下列遣傳密碼簡併性之討論） » 此 類 核 甘 酸 序 列 閱 讀 1 之 突 變 體 和 變 異 體 為 於 本 發 明 之 範 畴 中 0 背 面 1 | 之 1 例 如 己 實 經 由 將 間 白 質 2 (I L -2 )基因中的半胱胺 注 意 1 I 酸 密 碼 子 以 絲 胺 酸 密 碼 子 取 代 所 得 到 之 蛋 白 質 仍 能 表 現 事 項 1 I 再 IL -2活 性 [ ya n g ’ A •等人（ 1 98 4 ), S c 1 e η c e 225 : 143 1 - 4 寫 本 取 1 43 3〕 〇 因 此 t 只 要 序 列 编 碼 天 然 存 在 或 合 成 之 蛋 白 頁 '---· 1 | 質 具 有 適 當 的 N I a活性， 則其被包含於本發明中。 1 1 一 编 碼 本 發 明 N I a之基因可被此藝人士由序列ID2輕 易 1 j 地 逆 轉 設 計 〇 1 可 察 知 任 何 一 掘 持 定 的 逆 轉 設 計 序 列 由 於 遣 傳 密 碼 的 1 丁 1 簡 併 性 而 不 需 與 任 何 由 相 同 胜 肽 逆 轉 設 計 之 待 定 的 互 1 I 補 序 列 良 好 或 全 然 地 雜 交 〇 此 為 此 m 人 士 — 般 考 慮 之 因 1 1 素 9 且 任 柯 待 定 序 列 之 簡 併 性 經 常 廣 至 使 其 即 使 以 一 短 1 i 的 互 補 寡 核 酸 序 列 做 為 天 然 存 在 寡 核 酸 序 列 之 探 針 I 亦 極 難 合 成 〇 1 1 密 碼 之 簡 併 性 致 使 其 於 最 常 出 現 的 胺 基 酸 例 如 可 有 4 ! 1 個 或 以 上 可 能 之 密 碼 0 因 此 可 看 到 任 何 特 定 胜 之 可 [ 1 能 编 碼 序 列 數 百 可 依 殘 基 數 巨 對 數 地 增 加 〇 如 此 9 可 察 1 1 知 本 發 明 N I a之可能编碼序列數目可有六個或以上的圖 1 I 示 0 然 而 其 /|^\ 欲 依 相 關 的 表 現 % 統 平 衡 G + C 含 量 且 1 \ 其 他 因 素 如 相 HR 關 表 現 糸 統 之 密 碼 頻 率 __« 般 m 列 入 考 慮 〇 1 1 -2 0 - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (丨9 ) 1 I 如 上 所 示 4 雜 交 作 用 雖 然 可 能 為 序 列 同 質 性 之 不 可 信 1 1 的 指 標 • 但 彼 等 與 序 列 ID 1 顯 示 出 超 過 50% > 較 佳 70% 1 且 更 佳 80% 同 質 性 之 序 列 般 為 較 佳 0 於 各 情 形 中 » 可 請 ! 先 1 察 知 9 如 上 定 義 之 蛋 白 酶 應 為 被 编 碼 的 〇 閱 讀 1 本 發 明 亦 正 視 一 種 蛋 白 酶 上 游 之 前 導 序 列 的 使 用 〇 此 哿 1 | 之 1 例 如 可 令 融 合 蛋 白 質 與 宿 主 具 體 區 別 7 並 於 培 養 上 清 液 注 意 1 I 中 收 集 0 所 得 之 具 體 化 的 融 合 蛋 白 質 其 後 可 令 以 a 我 切 事 項 1 1 再 割 » 並 收 集 多 肽 0 對 於 此 種 訊 號 序 列 » 可 使 用 任 何 適 登 函 寫 本 取 的 序 列 « 特 別 是 其 已 被 明 確 地 發 展 為 特 定 的 表 現 % 統。 頁 1 I 本 發 明 亦 正 視 内 含 本 發 明 序 列 之 載 體 〇 配 合 本 發 明 所 1 1 使 用 之 載 體 的 一 般 性 質 iJUJL 對 本 發 明 並 非 重 要 〇 通 常 ， 適 田 1 1 的 載 體 和 表 現 載 體 和 其 構 築 為 此 蓊 人 士 所 熟 知 > 且 精 確 1 地 依 實 施 者 欲 與 序 列 達 成 如 m 殖 或 表 現 而 選 擇 0 1 丁 1 適 當 的 表 現 載 tuft m 可 基 於 噬 菌 體 或 質 體 * 此 兩 者 一 般 Μ 1 I 宿 主 專 一 i 雖 妖 其 經 常 可 被 設 計 於 其 他 10 主 〇 其 他 適 當 1 t 載 體 包 括 粘 接 質 體 和 逆 轉 錄 酶 病 毒 * 和 任 何 其 他 可 能 或 1 1 I 不 能 對 待 定 % 統 專 之 載 體 〇 適 當 的 控 制 序 列 P 如 辨 識 1 啓 動 基 因 t 操 縱 基 因 誘 發 物 * 終 止 子 和 其 他 對 表 現 1 1 調 節 所 必 要 和 / 或 可 用 之 序 列 * 已 為 此 m 人 士 所 熟 知 9 1 [ 且 可 為 伴 隨 C YV V 或 所 使 用 之 載 體 者 或 可 為 由 任 何 其 他 1 | 適 當 來 源 所 衍 生 者 0 此 載 體 可 以 任 何 適 當 方 式 修 飾 或 設 1 1 計 〇 1 1 可 察 知 序 列 ID 2 代表足夠的序列以编碼整個N I a 0 可 1 加 入 終 止 子 啓 動 基 因 和 其 他 所 欲 之 控 制 序 列 以 使 得 1 1 -21 - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明 C ) 1 1 例 如 利 於 連 接 至 —. 適 當 載 體 中 t 或 利 於 表 現 » 或 利 於 兩 1 1 者 〇 J 1 可 察 知 编 碼 本 發 明 N I a 之 DNA Η 段 ， 與 任 何 編 碼 切 割 序 請 + · 先 1 列 之 片 段 和 m 碼 多 ife 者 可 被 輕 易 地 插 入 任 何 適 當 的 載 體 閱 讀 1 〇 理 論 上 該 受 體 載 體 具 有 適 於 容 易 插 入 之 限 制 位 置 έ I I 之 1 但 亦 可 使 用 例 如 鈍 ±111 m 連 接 t 雖 妖 其 可 能 導 致 於 開 謓 框 和 注 意 1 插 入 方 向 上 的 不 確 定 0 於 此 例 中 9 自 妖 需 測 試 以 轉 感 染 事 項 1 I 再 [ 載 體 予 以 轉 形 之 宿 主 » 以 選 出 具 有 將 所 需 Η 段 以 正 確 方 填 寫 本 向 和 正 確 0RF插入之載體。 為確認該Η段為於正確之0RF 頁 1 I 中 其 乃 欲 製 造 可 被 直 接 插 人 載 體 之 序 列 a ) ，b )和 c )的 1 1 構 築 9 藉 以 降 低 取 得 所 欲 表 現 載 體 之 不 確 定 性 〇 適 當 的 1 1 載 體 白 妖 可 被 此 m 人 士 依 所 欲 之 表 現 % 統 選 取 〇 1 1 訂 1 藉 由 例 如 以 所 得 之 質 體 將 大 腸 桿 菌 轉 形 9 以 安 tb 西 林 或 其 他 適 當 方 式 選 出 轉 形 體 > 並 加 人 色 胺 酸 或 其 他 適 當 I I 的 啓 動 基 因 誘 發 物 (如吲哚丙烯酸） 可 表 現 所 欲 的 融 合 1 1 蛋 白 質 0 表 現 的 程 度 以 SDS聚丙烯醯胺電泳- SDS - PAGE 1 i 分 析 C La e tn ml ;等人， N a t u r e , (1970 )， 227 9 第 6 8 0 - | 6 8 5 頁〕 〇 1 1 亦 可 察 知 » 於 例 如 使 用 % 一 載 體 方 面 * 其 將 可 同 等 接 1 | 受 的 使 用 任 何 適 田 的 選 擇 標 記 或 標 記 i 或 另 一 種 選 擇 方 1 | 法 ) 和 / 或 視 所 需 或 便 利 而 使 用 任 何 適 當 的 啓 動 基 因 〇 1 1 培 養 後 若 該 融 口 蛋 白 質 必 須 由 宿 主 細 胞 收 集 則 將 1 I 轉 形 體 細 胞 適 當 地 收 集 弄 破 * 例 如 以 超 音 波 r 和 白 旋 1 1 落 下 (S p u Ώ d 〇 w η )0 弄破作用亦可以如酵素切開之技術， 1 1 -22- 1 i 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (Η ) 1 1 例 如 使 用 m 雒 素 酶 » 或 以 如 玻 璃 珠 予 以振 盪 * 但 以 如 超 1 ! -tV 曰 波 之 方 法 為 較 佳 i 因 其 不 需 額 外 的 成分 〇 所 得 之 上 清 J 1 液 可 分 析 多 肱 活 性 且 切 割 産 物 例 如 可 以 S D S - P A G E 測 定 0 請 1 先 1 傳 統 之 蛋 白 質 純 化 作 用 乃 適 於 取 得 表現 産 物 〇 閱 • 1 本 發 明 之 DNA可Μ由自三葉草黃脈病毒 [U ye da ,I ‘等 背 面 1 I 之 1 人 (1 97 5 ) An η . Ph y t 0 P at h , So C . J a pa η 41 ： 92 -203 ] 分 離 注 意 1 I R N A基因組而製得。 CYVV之適當源為美國標準菌種塔養 事 項 1 1 再 1 No .P V 1 23 〇 於 任 何 情 況 中 > 三 葉 草 黃 脈病 毒 可 定 義 為 引 填 寫 本 起 SX 豆 (V i c i a f a b a ) 壞 死 之 病 毒 〇 頁 、^ 1 I 基 因 組 RNA可取自CYV V粒子， 其己由感染植物純化且 1 1 逆 轉 錄 而 雙 股 D N A以已知方法製備。 ! I 為 決 定 一 病 毒 是 否 為 C Y V V 木0 同 株 之 突變 體 或 變 異 體 9 1 1 訂 1 序 列 之 同 質 性 偽 為 一 良 好 的 指 標 〇 許 多類 型 之 馬 Μ y 病 毒 為 已 知 » 且 其 於 病 毒 性 上 相 異 〇 一待 定 病 毒 是 否 形 1 I 成 家 族 之 各 別 的 一 員 9 乃 基 於 病 毒 覆 被蛋 白 質 之 血 清 關 1 1 像 和 胺 基 酸 序 列 之 同 質 性 〇 依 此 1 具 有90% 同 質 性 一 级 1 1 胺 基 酸 序 列 之 病 毒 被 認 為 是 相 同 株 » 而具 有 低 於 7096 同 I 質 性 一 级 胺 基 酸 序 列 之 病 毒 被 認 為 疋 不同 的 家 族 成 員 [ 1 1 Sh uk I a t D . D . 和 Wa r d C . W . (1 989 ) ,A r c h * v i r 〇 1 . 106： 17 1 1 | -200 ) 0 基 於 本 發 明 中 所 使 用 之 CYVV 覆被 蛋 白 質 之 各 種 1 I 性 質 C Uy e c a , I . 等 人 (1 99 1 ) ， I n t e r v i r 〇 1 ,3 2 ： 2 3 4 - 245 ] 1 1 > CYVV 被 確 認 為 馬 鈴 m y 病 毒 族 之 獨 立的 一 C9 貝 〇 因 此 * 1 I 任 何 病 毒 其 具 有 90% 或 以 上 覆 ids 攸 蛋 白 質一 级 胺 基 酸 序 列 1 同 質 性 t 或 任 何 病 毒 由 使 用 抗 -CYVV抗血清（例 如 1 1 1 -23- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Μ規格（210X297公釐） A7 459046 B7 五、發明説明（V ) ATCC No.PVAS-123:三葉草黃脈病毒血清）以ELISA偵测 為陽性者，被定義為三葉草黃脈病毒之一株。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) CYVV可於其上生長之各種植物包括：菜豆（Phaseolus vulgaris), Μ 豆和碗豆（Pisum sativum),但以置豆， 特別是翼豆cultivar Wase-soramante為較佳。 純化病毒顆粒之較佳方法包括將感染植物之葉於適當 緩衝液中均質化並壓碎，隨後以一有機溶劑如氯仿萃取 ，並重覆差速離心，隨後以蔗糖密度梯度離心。 一種確認所得病毒顆粒為CYVV之方式，可藉由於電子 顯撤鏡下檢視病毒顆粒而進行。另一為藉由將蠶豆接種 以病毒顆粒，以觀察是否出現任何症狀。 由病毒顆粒萃取基因組RNA之適當方法包括硫氛酸胍/ 酚法，碕氰酸胍/三氣化絶法和酚/ SDS法。然而，吾 等較佳使用鹼性蔗糖密度梯度離心法〔Dougherty, y.G. 和 Hiebert，E.(1980)Virology 101: 466-474〕。 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 如上述取得之RNA其後可被測試確定其確實於一無細胞 轉譯条統中經由轉譯作用编碼一蛋白酶。自溶作用（自 我切開）其後可於偵測RHA所編碼者剛好多於轉譯總産物 中之蛋白酶，傜藉由偵測由溶胞産物所收集之産物分子 量的任何變化。此類偵測可例如以抗-覆被蛋白質抗體 之方式進行。 若所需，轉譯産物之産生可使用抗-覆被蛋白質抗體 ，例如以經由注射入爪蟾卵細胞而被轉譯之之基因組RNA 〔Gurdon, J.B.(1972)，Hature 2.33: 1.77-172〕，或 _ -24-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^59046 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明 (> 〇 1 i 由 使 用 兔 網 鏃 紅 血 球 或麥 芽 溶胞産物 糸統 (Sc h 1 e i f， R . i 1 F .和 We ns in k， P · C , (1 98 1) t I η " P r a c t ί c a 1 M e t h o d s in 1 Mo 1 e C U la r B i ο 1 〇 g TT y Spr ί n g e r - V e r 1 a g . N . Y.〕經 時偵 測。 V 請 1 先 1 ua 早 股 DHA可藉由使用由此两 ί得之基因組R N A做為 一模 板· 閱 ♦ 1 使 用 一 逆 轉 錄 酶 而 合 成， 而 d s - D N A 可 由単 股DU A以下列 f 1 之 1 標 準 步 驟 合 成 0 適 當 的方 法 包括S 1核 酸酶 法〔 注 意 1 Ι Ef s t r a t 1 d i at is t A . 等人 (1 9 7 6 ) , Ce 1 1 7 ：279 - 288 事 項 1 1 再 ι Ok ay am a , Η .和B e r g * Ρ. ( 1 982) , H i 1 .Cel 1 Biol • 2:1 61 4 k 其 他 本 -1 70和 ] * 蘭 氏 法[ La n d m e t h ο d)〔 Land, Η .等 人 頁 1 I (198 1 ) Nu cl e i c Ac id s Re * 9,2251-2266] 和歐瓊幼法 1 1 (0 .J 0 0 η Υο 0 IQ Θ th o d )ί Υ 0 0 ,0 . J .等 人（1983)Pr 0 c * 1 ! Na t 1 * Ac ad .S C I .U S A 79 , 1 049-1053 ]ο 於各種 選擇 中， 1 訂 1 吾 等 較 佳 使 用 古 伯 -霍夫曼法（Gubler -Hof f m a n tn e t h ο d ) [ G u b 1 e r » u. 和 Ho f f man, B .J . (1983 )，G e n e 2 5 ：263 - 1 I 2 69 ] ο ί ! 所 得 之 d s —C DN A 其 後可 腐 合至一選 殖載 體，如 質體 或 1 1 λ 噬 菌 體 中 i 並 將 所 得之 重 組載體轉 形至 一徹生 如 I 大 腸 桿 m » 而 以 大 腸 捍㈣ 株 DH5〇f為恃佳。 轉形體可藉由 1 I 其 對 殺 菌 劑 » 如 四 環 徽素 或 胺比西林 之抗 性，以 此藝 熟 1 ι 知 之 技 術 予 以 選 取 Ο ι I 轉 形 作 用 例 如 可 以 漢那 漢 法進行（Η a n a h a π method) 1 Γ [ Ha n a ha η , D . ( 1 98 3 ) ,J . Μ 〇 1 .Biol. 166 ； 5 5 7 - 5 80 ] * 1 1 4 其 中 重 組 DNA載髏被導入- -預以氣化鈣，氣化鎂或氣化 1 m 處 理 而 呈 應 潛 能 (com p e tent)之細胞中。 1 1 -25- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） 、 1 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明 ( ) t 1 選 取 具 有 Ν I a DNA轉形體之適當方法如下所示。 1 1 (1 )以探針篩選 1 若 欲 由 野 生 型 CY VV 開 始 則 一 種 DET 早 離 適當 RN A之方式 請 ·> * 先 1 為 使 用 —t c D N A 探 針 ) 假 設 N I a之胺基酸序列已被關明( 所 閲 讀 1 使 用 序 列 之 部 分 可 為 來 g N I a之任何區域）。 因此 » 對 應 背 面 1 I 之 1 於 相 Η 胺 基 酸 序 列 之 寡 核 甘 酸 乃 被 合 成 。通 常， 所 選 擇 注 意 1 I 之 胺 基 米 糠 序 列 將 包 括 最 少 量 之 可 能 簡 併性 則 其 將 事 項 1 I 再 1 —•'Jl 需 使 用 各 種 可 能 之 密 碼 組 以 産 生 數 種 探 針。 於此 例 中 t 填 % 本 有 助 於 將 密 碼 子 使 用 m 率 列 入 考 慮 〇 外地 ,可 考 慮 數 頁 1 個 核 甘 酸 序 列 * 且 可 使 用 肌 甘 代 替 不 同 的核 甘酸 〇 其 後 1 1 此 探 針 可 以 放 射 性 同 位 素 * 如 32 P , 汜S或 生物 素 予 以 1 | 標 記 G 轉 形 體 菌 株 其 後 可 藉 由 將 變 性 的 質體 DHA固定於 1 訂 [ 硝 基 纖 維 素 濾 紙 上 ， 使 用 放 射 性 標 記 探 針予 以偵 測 t 陽 性 純 種 % 可 被 放 射 白 顯 術 偵 測 0 1 1 (2 w# m pr.Rm 針 1 1 於 此 技 術 中 t 來 白 對 應 於 已 知 胺 基 酸 序列 一部 分 之 意 1 義 股 和 反 意 義 股 之 寡 核 苜 酸 可 被 合 成 並 進行 聚合 酶 m 反 1 應 [ S a i k ί， R • K .等人（1 988 ), S c i e t\ c e 239 ,4 8 7 - 49 1 ] 1 1 * 其 後 彼 等 可 組 合 使 用 ， 以 放 大 一 编 N I a之DN A片 段 〇 適 1 I 當 的 模 板 DNA為經由已知編碼Ν la 之 病 毒 基因 組RN A的逆 1 I 轉 錄 作 用 所 取 得 之 cDNA 〇 所 製 得 之 D N A Η段以如3 2 P » 1 1 35 s或生物素標記， 並以此探針進行鏡落雜交作用或噬 1 I 菌 體 雜 交 作 用 » 以 選 出 所 欲 之 純 種 % 0 1 (3 )W動物紬朐中外源袢牛産錨撰 1 1 -26- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（/ ) 此方法包括培養一轉形體菌株以放大基因，隨後將基 因轉染至動物細胞中（通常使用一具複製反應潛能且内 含轉錄作用啓動基因區域之質體，或使用一可被整個至 適當染色體中之質體），以表現一被基因编碼之蛋白質 。藉由測量相關活性，可選出一菌體。 (4) 使用一對抗tUa夕抗體的蓰摆 抗體為對抗由一感染CYVV之植物核包涵體（NIa和Nib) 所産生，或為於一適當糸統中對抗由表現載體所産生之 蛋白質而産生。此抗體，或其抗-抗體其後可用於偵測 所欲Ν ΐ a或所欲《株。 (5) 哉崔袢雜v作用餺譯奂統 轉形體cDNA如上述與來自表現NIa細胞之ftiRKA雜交， 並將結合至cDHA之niRHA分離並回收。此回收之mRNA於一 轉譯糸統中被轉譯成蛋白質，例如，藉由注射入爪蟠之 卵細胞中，或進入無細胞糸統如兔網織紅血球或麥芽溶 胞産物中。所欲之菌株藉由檢視NIa活性或藉由以NIa抗 體之方式偵測Η I a而選出。 编號CYVV INa之DNA可以已知方法由所欲轉形體菌株 取得〔參見 Maniatis，T.等人（1982),於”Molecular Cloning A Laboratory Manua丨"冷泉港實驗室，紐約〕 。例如，將對鼴於載體DNA之部分由細胞分離.並將编 碼該蛋白質之DHA區域由該質體DHA中切出。 所得D Η A序列的測定可藉由使用例如莫克馬-革伯化學 修飾法（Haxam-Gilbert chemical modification method) -27 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（2iOX297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（d ) [M a X a m , A.H.和 Gilbert, W. (1980),於"Methods in E]nzymology” 65: 499-276],或使用例如，以 M13 噬菌 體之雙去氧核甘酸鏈終止法〔Messing, J.和Vieira, J . ( 1 9 8 2 ) , Gene 19: 269-276而進行。 近年來，螢光染料乃傾向於取代測定DN A序列所用之 更危險的放射性同位素。此外，雙去氧核甘酸《終止作 用現今一般於電腦控制下由機器人操作。於電泳後讀取 鹼基序列之条統亦增加，旦其例包括"CATALYST 800 ”定 序列機器人和373 NDA序列儀（Perkin-EUer Japan Applied Biosystems)。此些条統致使DNA榮基序列之測 定步驟可有效且安全地進行。 本發明之載體一般被組織成可於”標準細胞”（原核生 物或真核生物）中表現。此外，藉由將一適當啓動基因 和一用於表型（P h e η 〇 t y p i c )表現之序列導人載體中，則 基因可於合適的宿主細胞中表現。 適當的原核生物宿主包括大腸桿菌和枯草桿菌。為了 .相關基因之表型表現（phenotypic expression),載體可 適當地含有一來自與宿主相容種類之複製子。於大腸桿 菌中，一質體可内含一複製原點和一啓動基因序列如lac 或UVS。載體以可基於對轉形細胞之表型特性（表型）賦 予選擇性者為較佳。 大腸桿菌通常被做為宿主，而衍生自大腸桿菌_株K12 之_株<1卩109為一較佳的宿主。大陽桿菌之載體現今一般 選自PBR 322或pUC条統質體，但其他菌株和載體可視所 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (5 -7 ) 1 1 需 使 用 〇 適 於 大 腸桿闇 之啓動 基 因 包 括乳糖 啓 動基因（ 1 1 1 a c ) * 色 胺 酸 啓 動基因 (t Γ P ), 色胺酸-乳糖 (t ac)啓動基 1 因 脂 蛋 白 (1 PP)啓動基因，XPL啓動基因（來 自λ噬菌 請 * 先 t 體 )和多肽鍵延長因子T u (t u f B )啓動基因，但本發明並 鬩 讀 1 不 侷 限 於 此 等 啓 動基因 ο 背 面 1 | 之 1 祜 草 桿 之 適 當菌株 包括菌 株 207 - 25。適 虽 載體包括 意 1 | PTUB228 [Ohm u r a , K .等 人（1984) * J. B i 〇 c h e m . 95:87- 事 項 1 I 再 1 一 93 和 其 他 0 iafc 適 當的啓 動基因 為 枯 草 桿菌α -澱粉酶基 填 寫 本 参 因 之 調 節 序 列 〇 此為一 適當例 9 其 中 訊號胜 呔 序列（來 頁 I I 白 a -澱粉酶） 可 用於細 胞外分 泌 作 用 Ο 1 1 若 欲 於 真 核 生 物細胞 中表現 融 合 蛋 白質， 則 可使用來 1 I 白 脊 椎 動 物 昆 蟲，酵 母，植 物 等 之 細胞。 較 佳之脊椎 1 1 訂 1 動 物 細 胞 為 COS細胞，特別是COS -1 細 胞[如 G 1 u z in a η , Υ . (1 98 1 ) 9 Ce 11 23: 175 -182〕 r 或 缺 乏二氫 m 酸還原酶 [ | 之 中 國 大 鼠 卵 巢 細胞条 (CH0) 〔U r 1 a u b , G.和 Chasin, L , 1 1 A . (1 980 ) • Pr 0 C * Natl .Acad. Sc ϊ . U S A 77 , 42 16-4220] 1 1 t 雖 妖 本 發 明 並 不偏限 於此。 1 如 上 所 示 » cos細胞可適於使用做為脊椎動物宿主細 1 1 咆 j 且 其 可 被 使 用做為 一例。 内 含 S V40複製 子 之表現載 1 I 體 可 於 cos細胞中自主性地複製， 且其被供給- -轉錄作 1 | 用 啓 動 基 因 * 轉 錄作用 終止序 列 和 一 锢或以 上 ,剪接位 1 1 置 〇 内 含 所 欲 DN A序列之表現載體可以各種方法轉形COS 1 I 細 胞 > 例 如 > 以 D E A E -葡聚糖法 (L U t h m a η , Η . 和 1 M a g η U S S 0 η , G 如 (1983) ，N u c 1 e ϊ C A c ids R , 11 ,1295- 1 1 -29- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家橾隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^ 459 046 a? B7 五、發明説明（W ) 1308),礎酸 0-DNA 共沈殺法〔Graham, F,L.和 van der Eb, A.J. (1973),Virology 52, 456-457〕和電穿孔法 [Neumann E.等人（1 9 8 2 ) , EΜB0 J. 1，84 1 - 845〕。 若使用CHO細胞做為宿主細胞，則其適於使用一可表現 neo基因（其用於提供G418抗性）之載體。攜帶此標記之 適當載包括 pRSVneo〔 Sambrook, «J.等人（1989): Molecular Cloning-A Laboratory Manual”，冷泉港實 驗室，紐約〕和 pSV2-neo〔 Southern, P.J.和 Berg.P. (1982), J.Mol. AppI. Genet, 1,327-341]。轉形體 其後可以其對G 4 1 8之抗性選取。 選取之轉形體可以傳統方法培養，而於本發明第二具 體例之情形中，多肽為以細胞内和細胞外兩者所産生， 適當的培綦基可依所使用之宿主細胞，由一般所使用者 選出。例如，於C0S細胞，内含血成分如眙牛血清之培養 基可被添加做為培養基如RPMI-1640培養基或Dulbeco’s 修飾Eagle’s培養基（DMEM)之必需品。 若操作者較欲使用昆蟲細胞，則可使用衍生自草地黏 蟲（Spodoptera frugiperda)之細胞〔Smith, G.E.等人 ( 1 9 8 3 ), Hoi. Cell.Biol.3: 2156-2165]。 適當的酵素包括蓮包酵母（Saccharomyces Cerevisiae )和分裂酵素（Schizosaccharomyces Pombe)。 適當的植物細胞包括來自煙草（Nicotiana tabacum) 及水稻（Cryza sativa)之細胞。 可察知上述宿主為此Μ中之標準宿主，且此藝人士可 -30 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐} (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

4 5 9 0 4 6 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明 卜9 ) 1 1 於 其 中 和 其 他宿 主中 選 出適 當者。 I 1 贫 椎 動 物 細胞 之適 田 表現 載體包括彼 等 具 有一 啓 動基 \ 1 因 位 於 待 表 現基 因之 上 游， 與做為ίίΝ A剪接位置之此類 /V 請 先 1 位 置 聚 腺 甘 酸化 作用 位 置， 和轉錄作用 終 止 序列 且若 閱 f 需 要 » 可 再 具有 一複 M. 原點 。此類表現 載 體 之適 當 例為 背 1 I 之 1 PSV2dhfr ，其具有SV40早期啓動基因〔S u b r a 1 a n i ，S .等 注 意 1 I 人 (1 98 1) Mo 1 . Cell Bio. 1 =854-864] 〇 事 項 1 I 再 1 -A 昆 蟲 細 胞 之適 當表 現 糸統 包括草地黏 蟲 之 培養 細 胞。 填 寫 適 當 的 表 現 載體 例如 具 有桿 狀病毒Po 1 yhe dr ί η啓 動 基因 本 頁 、* ) 1 位 於 待 表 現 基因 之上 游 ,與 一聚腺甘酸 化 作 用位 置 和同 1 1 質 性 重 組 作 用所 需之 Ac MNP V (Acutograp ha C a 1 ί f or π ί c a 1 1 核 多 面 性 病 毒）基因組之一部分。一例為P B a c P AK8 c 1 1 Ha t U u r a , Y .等人（1 9 8 7 }，J ,G e n . V i r ο 1 .68 ： 1233 -1 2 50 ] 〇 1 丁 1 於 真 核 生 物表 現， 通 常使 用酵素，如 麵 包 酵母 (S • 1 1 c e re V i si a e )。酵母之適當表現載體可例如包括酒精去 1 1 氫 m 啓 動 基 因[ B e η η e t z e η » J，L，和 H a 1 1， B . 0.(1982), 1 J j . B 1 0 1 . Ch e w . 2 5 7 ： 30 1 8 - 3 025 ],酸性磷酸酶 c | Mi y a ha r a ,A .等人（1 983 ) , P roc* N a t K Ac ad .Sc i . USA 1 I 80 t 1 - 5〕 或羧基胜呔酶Y啓動基因〔I c h i k a w a , K .等 [ 1 人 .( 1993 ), B 〇 s c i . B i 〇 t e c h . B i o c h e m . 57 : 1686 - 1 1690 ] 0 於 此例 中， 亦 可使 用來自羧基 胜 酶 Y 之訊 I 號 胜 序 列 ,以 逹到 分 泌至 細胞外。 1 | 植 物 之 適 當表 現載 體 例如 包括pB I 1 2 1 其 具 有-35S 啓動 1 I 基 因 (其衍生自花椰菜鑲嵌病毒之早期啓動基因） t 來自 1 1 ^ 3 1 - 1 1 i 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】0X297公釐）

經 部 中 央 準 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 A7 B7 五、發明説明 (>>〇 ) 1 1 根 瘤 土 壤 桿 菌 (A g r 〇 b a c t e r i u m t u m e f a c i e ns )η 0 P a 1 i n e 1 1 合 成 基 因 之 聚 腺 t 酸 化 作用 序 列 » 和根 瘤 土 壤 桿 m 基因 \ 1 轉 移 序 列 [ Je f f e r so η , R . A .等人（ 1 9 8 7 ), E HB 0 J .6 請 [ 先 1 390 1 -390 7〕 0 此類載體可藉由如感染根瘤土壤桿菌和 閱 讀 1 電 穿 孔 作 用 此 類 方 法 入植 物 細 胞 中。 背 1 | 之 1 質 體 Ι3ΪΖ. pKK 388 - 1( 由 Cl ο n e t e c h公司製造） 具 有 一 t Γ C啓 注 意 ( | 動 基 因 且 適 於 在 大 腸 桿 菌中 使 用 0 此表 現 載 ΒΜ 體 可 於 衍生 事 項 1 I 再 1 —4,. 自 大 腸 桿 菌 菌 株 κι 2之菌株中， 如菌株JM109中 白 主 性複 填 寫 本 製 〇 此 載 mg 腰 可 以 上 述 熟 知之 方 法 輕 易地 導 入 大 腸 桿 菌中 頁 1 I 〇 由 此 所 得 之 菌 株 可 被 接種 至 了一 培 養基 r 如 熟 知 之 LB培 1 [ 養 基 中 * 並 培 養 一 陣 子 ο 1 I t Γ C啓動基因可藉由加入例如異丙基- β -半乳糖陬喃 1 1 訂 1 甘 { I P T G ) 而 活 化 > 以 誘 發啓 動 基 因 。於 進 __- 步 培 養 後， 表 現 蛋 白 質 可 藉 由 將 細 胞壓 碎 如 以一 音 波 振 盪 器 ，而 1 | 由 細 胞 中 萃 取 出 〇 若 欲 産生 _· 於 N 終端 具 有 Pr 0之蛋白 1 1 質 » 則 其 般 適 於 使 用 大腸 桿 ** 閎 做 為宿 主 0 1 1 藉 由 蓮 用 上 列 描 述 若需 要 t 可 考慮 伴 隨 的 實 施 例， I 可 由 内 含 所 欲 多 版 之 適 當的 轉 形 細 胞的 培 養 液 中 DD 早 離一 1 1 部 分 (f r a C t i 〇 η ) 並 視 多 呔之 物 化 性 質而 以 已 知 方 法 純化 1 I 0 適 合 此 類 之 方 法 包 括 以蛋 白 質 沈 澱劑 處 理 1 超 過 濾作 1 I 用 « 各 種 層 析 [ 如 分 子 篩層 析 (膠過濾作用） 9 吸 附 性層 1 1 析 » 離 子 交 換 層 析 9 親 和性 層 析 和 高性 能 液 態 層 析 (HPLC ί | )] » 透析和上述方法之組合。 1 j 為 測 定 表 現 之 Ν I a蛋白質是否具有所需的蛋白酶活性， 1 1 -32- * ! 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（W ) 此純化之NIa蛋白質可與一内含蛋白酶切割序列之曼質 蛋白質，如编碼融合蛋白質之基因的表現産物其含有病 毒覆被蛋白質（NIa之天然受質）與核包涵體b(tUb)〔 D 〇 u g h e r t y , y . G .等人（1 9 8 8 )，Ε Μ B 0 J . 7 : ( 1 2 8 1 - 1 2 8 7 ] 度應。此類融合蛋白質可由病毒基因組cDNA中單離並插 入一表現載體中。將所得之表現載體導入一適當的宿主 細胞中，以産生該融合蛋白質。藉由令所得之融合蛋白 質以已知方式，如與一蛋白質沈澱劑或以層析處理，可 分離並純化該融合蛋白質。 由此分離純化之受質蛋白質其後可與該蛋白酶，於一 適當緩衝溶液中，於適當溫度下反應，以回收一反産 物。將此回收之反應産物令以電泳及令以使用抗-覆被 蛋白質抗體之西向點潰（Western blotting),以使得蛋 白酶活性可依帶（b a n d )移動性上之差別而被偵測。於此 方法中，亦可使用一内含適當切割序列之合成寡胜！fe。 本發明蛋白酶之蛋白分解活性可不經純化作用而偵测 。因此，活性可藉由將蛋白酶基因連接於序列和相同之 開讀框中，和於一啓動基因如trc啓動基因之下游，和 於一蛋白酶切割序列之上游而_量。若蛋白酶於表現産 物中為有活性，則以西向點潰可觀察到一移動性高於融 合蛋白質之帶。 由凝膠中回收可觀察到切割之帶並以傳統方法分析其 胺基終端序列，可確立該蛋白質是否於所欲的胜版鍵上 被切割。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（# ) 所欲産生之蛋白質，可例如以一與如麩胱甘！IfeS -轉換 之蛋白質共同形成一融合蛋白質而産生，且本發明之 N I a其後可用於生體外切割連接子序列。於另一方法中 .所欲蛋白質為直接於宿主細胞表現成與該蛋白酶之融 合蛋白質且所欲之蛋白質以自我切割而製得。 若意欲，NIa可使用上述方法輕易地以高産率和高純 度生成，且由此所得之本發明的重組Hla可使用做為一 蛋白酶。 若欲以化學合成本發明之D N A ,則其可以傳統方法製 備，如亞磷酸三酯法〔Hunkapiller,M.等人¢1984), Nature 310: 105-111〕或以核酸之化學合成[Grantham, R.等人（1981)， Nucleic Acids Res.9: r43-「47〕。若 意欲，此等核甘酸序列之部分修飾作用可經由傳統方法 ，如以特定位置突變，使用一含有編碼該所欲修飾作用 之合成寡核苜酸的引子進行〔Mark,D.F.等人（1984), Proc.Natl.Acad.Sci. U S A . 8 1 ： 5662-5666] 〇 如上述，雜交作用可例如藉由使用一標記以〔a-32?] d C T P之探針，例如無規則引子法〔F e in b e rs, A . P .和 Vogelstein,B.(1983)Anal.Biochem.l32: 6-13〕，或 藉由缺口轉譯作用〔Maniatis，T.等人（1982),於” Molecular Cloning A Laboratory Manual”冷泉港實驗 室，紐約〕而確立。D N A以傳統方法，例如以吸附至一 硝基_維素膜或尼龍膜，而被固定於一固相，且於其後 加熱或使用紫外線放射。固相典型地被浸於一預雜交作 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X 297公釐） (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 459046 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作·杜印製 五、發明説明 (Μ ) 1 1 用 溶 液 > 其 内 含 6 > SSC 5% D e n h a r d t ’ s 溶 液 和0 • 196 1 1 S D S並於5 5 1C下培養4 小時或更久。 其次， 於預雜 交作 J 1 用 溶 液 中 加 入 事 先 製 備 之 探 針 .至 最 終比 活 性 為 ,"V 請 1 先 1 1 > < 1 0 6 ' C Ρ ® / m 1， 並將混合液於60t下培養過夜。 其次 閱 it 1 將 固 相 於 室 溫 下 重 覆 五 次 以 6 x SSC 清洗 5 分 鐘》 隨後 t Φ 1 之 1 於 57 V 下 清 洗 20分 _ > 並 進 行 放射 § 顯術 ， 以 確定DKA 意 1 1 是 否 已 被 雜 交 0 可 週 知 此 為 —- 艏待 殊 例， 且 其 他方法亦 事 項 1 | 再 1 .-1 同 等 可 能 〇 填 寫 欲 蛋 白 本 所 質 可 經 由 細 胞 内 直 接切 割 法和 細 胞 外Θ 3割法 頁 1 I 而 製 得 0 1 1 細 胞 鬼 直 捽 切 J!L 法 1 ! 編 碼 Η I a之DN Α為 經 由 一 切 割 序列 » 較佳 為 G 1 n ^ G 1 y， 1 1 訂 1 G 1 η - S e r或G 1 η * A Ϊ a » 與 编 碼 所 欲蛋 白 質之 DNA連接 。所 得 之 DN A編碼- -融合蛋白質並被插至- -含有啓動基 因和 1 I 終 止 子 之 載 體 中 » 並 被 用 於 在 一適 田 宿主 細 胞 中達到表 Ϊ 1 現 0 所 得 之 被 表 現 的 融 合 蛋 白 質經 由 蛋白 酶 活 性而自我 1 1 切 割 ， 藉 此 取 得 __- 胜 呔 9 其 中 G 1 y , S e r或A 1 a 為 經由一胜 1 Hk 鍵 連 接 至 所 欲 蛋 白 質 之 N 终 端。 於 於表 現 之 特佳蛋白 1 1 質 為 IL -I U 1 1 於 欲 由 所 得 蛋 白 質 之 N 终端切割任何殘基時， 刖其 1 [ 可 如 下 進 行 » 例 如 使 用 胺 基 胜 Sk酶 P , 以留下N _終 端P r 〇 1 1 殘 基 (若此為所欲） 〇 ! t 某 些 表 現 % 統 己 存 在 有 胺 基 胜呔 酶 P。然ϋ β , 若 不存 1 I 在 胺 基 胜 肽 酶 P 〇 則欲於在原位切割N -终端胺基酸 殘基 1 1 -35 - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明 (·%4- ) 1 1 > 其 後 可 捋 胺 基 胜 肽 酶 P 之 表 現 載 體 導 入 宿 主 細 胞 中 〇 1 1 胺 基 胜 Sk 酶 P 為 一 種 已 知 蛋 白 質 且 該 酵 素 之 基 因 序 列 1 為 此 藝 人 士 可 容 易 取 得 者 0 請 I 先 1 當 欲 取 得 由 N - 終 端 Pr 〇開始之蛋白質時， 則- -般便 閲 it 1 於 延 長 培 養 的 持 缠 時 間 以 令 細 胞 的 胺 基 胜 肽 酶 P 進 行 背 面 1 1 之 1 作 用 〇 注 意 重 1 1 如 上 述 9 N - 終 端 P r 〇殘基可藉由脯胺酸亞胺基胜肽酶 Ψ 項 ! (3 .4 .1 1 . 5 ) 之 催 化 作 甩 * 内 源 性 地 表 現 或 以 外 源 性 表 再 填 本 現 載 體 予 以 表 現 (此酵素為- *種已知蛋白質， 且該酵素 頁 1 I 之 基 因 序 列 已 為 此 U 人 士 容 易 取 得 者 )而被移除。 另夕卜 1 1 地 » 此 脯 胺 酸 殘 基 可 於 由 表 現 % 統 回 收 後 被 切 割 ， 如 於 ί I 融 合 蛋 白 質 白 細 胞 分 泌 時 Ο 1 訂 1 因 此 t 可 察 知 本 發 明 允 許 具 有 任 何 所 欲 Η - 终 _L〇i m 殘 基 之 蛋 白 質 的 生 産 0 1 I 於 本 發 明 序 列 導 致 一 具 有 A 1 a N - 終 1Λ1Ι 晒 之 多 肽 時 ， 則 其 1 1 可 藉 由 丙 胺 酸 胺 基 胜 呔 酶 (3 .4 .1 1 . 1 4 )( 其 亦 為 一 己 知 酵 1 1 素 ， 且 其 中 之 基 因 序 列 已 為 此 藝 人 士 容 易 取 得 者 )之催 | 化 作 用 而 被 移 除 〇 此 技 術 亦 允 許 具 有 任 何 選 擇 N 終 JJll m 1 1 殘 基 之 多 肽 的 生 産 〇 1 I 所 欲 蛋 白 質 其 後 可 以 熟 知 之 方 法 早 離 並 純 化 〇 1 I 細 i 外 切 割 法 J N I a可藉由將適當的D N A 偶 合 至 其 後 被 包 含 於 適 當 表 i 現 % 統 中 之 載 體 而 産 生 〇 以 轉 形 細 胞 表 現 所 得 之 N I a , 1 其 後 可 使 用 如 離 子 交 換 管 柱 9 凝 膠 過 濾 管 柱 或 逆 相 管 柱 1 1 -36- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐> A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明 (^ ) 1 1 予 以 純 化 〇 另 外 地 9 此 N la可與另- -多肽如麩胱甘fe - S- 1 1 轉 換 酶 或 麥 芽 糖 結 合 蛋 白質 以 一 融 合 蛋 白質 表現 » 其 可 Ϊ 1 分 別 使 用 麩 胱 甘 肽 管 柱 或麥 牙 ftfc 稱 管 柱 予 以分 離和 純 化 〇 ·ν 請 先 1 化 之 産 物 以 陽 激 酶 或 Xa因 子 切 割 後 * 則Ν I a可被純化並 閲 if 1 供 使 用 0 背 1 I 之 1 此 時 * 製 備 内 含 Ν I a辨識序列（切 割 序 列）之蛋白質前 注 意 1 | 驅 物 〇 此 可 存 在 於 —» 持 定處 » 或 此 蛋 白 質可 例如 與 麩 胱 事 項 1 1 再 1 甘 肽 -S -轉移酶或麥穿糖結合蛋白質， 經由適當連接子 填 寫 本 (切割序列）連 接 形 成 融 合蛋 白 質 之 部 分。 前驅 物 與 N la 頁 1 I 於 適 當 緩 衝 溶 液 中 之 反 應， 乃 將 前 驅 物 生物 外切 割 0 若 ! 1 欲 Ν- 終 端 胺 基 酸 殘 基可 如 前 述 移 除 0 1 I 同 前 9 所 得 之 蛋 白 質 可以 已 知 方 法 單 離並 純化 〇 1 訂 [ 關 於 本 發 明 之 第 二 具 體例 9 吾 等 相 倍 天然 存在 還 原 胜 具 有 序 列 ID 1 2所示序列， 由5 26個 胺 基酸 組成 » 以 纈 1 I 胺 基 殘 基 為 Η - 終 丄111 m 0 1 1 等 相 信 編 碼 胜 Sk 之 天然 存 在 DN A具有序列I D Ν 〇 .1 1 1 1 中 所 示 之 核 甘 酸 序 列 70 至 1 6 4 7 〇 I 本 發 明 之 胜 可 將 氣 化態 麩 胱 甘 肽 和 二氯 靛酚 予 以 還 1 1 原 Ο 此 為 胜 Ilk 之 正 確 描 述， 但 有 些 繁 複 ,因 此本 發 明 胜 1 | 於 此 處 亦 稱 為 KH 3 1 - 7胜肽或蛋白質。 1 I KH 3 1 - ?蛋白質為源自身體， 或為其突變體或變異體 1 1 f 以 致 其 於 母 性 和 / 或 抗原 性 上 具 最 少 之問 題。 1 1 於 本 發 明 之 第 二 具 體 例中 y 具 有 序 列 ID 1 2之序列- 23 1 1 至 5 2 6的多肽被認為是K Μ 3 1 - 7蛋白質之前驅物。如此， 1 1 - 3 7 ! 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!0Χ297公釐） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 ) 1 1 本 發 明 亦 包 含 此 > *-刖 m 物 4 和 其 突 變 體 和 變 異 寤 » 如 编 碼 1 1 其 任 —*. 者 之 聚 核 甘 酸 序 列 〇 1 I 下 列 討 olff 為 關 於 本 發 明 第 二 具 體 例 之 要 點 0 想 πτί 明 瞭 9 讀 1 先 1 上 述 有 關 C YV V Η la 之 許 多 步 驟 亦 適 於 编 碼 本 發 明 胜 肽 之 閲 1 D N A的單離， 選殖和表現。 任何差異主要是起源於cyvv t 1 之 1 N I a為- -種植物病毒蛋白質， 而本發明之胜肽為- -棰哺乳 意 1 I 動 物 蛋 白 質 〇 現 今 描 述 以 基 因 重 組 技 術 » 由 哺 乳 動 物 取 事 項 1 1 再 1 -Jk 得 一 表 現 的 特 定 多 肽 之 一 般 步 驟 0 寫 编 碼 本 KH31 -7胜 肽 之 m R N A 可 經 由 熟 知 方 法 取 得 並 逆 轉 錄 頁 、"W- 1 1 至 d s -* C DN A中。 任何適當的哺乳動物細胞， 細胞条或組 1 1 織 可 做 為 起 始 mRNA 之 來 源 ) 但 吾 等 較 m αΛ 使 用 由 人 類 骨 髓 1 I 幹 細 胞 所 衍 生 之 細 胞 糸 KM -1 02 C Ha r ί g a y a ，K .和Η an d a ,Η . 1 訂 (1 98 5 ) ,P Γ 0 C , Na t 1 .A c a d . S c i US A , 82 , 3 447 - 3 480〕 〇 1 為 由 哺 乳 動 物 細 胞 萃 取 ihRH A 可 使 用 各 種 方 法 9 如 硫 1 I 氡 酸 胍 熱 苯 酚 法 或 硫 氰 酸 腮 鹽 酸 胍 法 但 以 硫 氰 酸 胍 氨 1 I 化 绝 法 為 —* 般 較 佳 〇 1 1 由 於 多 數 存 在 於 真 核 生 物 細 胞 之 細 胞 質 中 的 mRHA 9 已 I 知 具 有 3 ' 終 1A1S 端 聚 A 序 列 r 因 此 晡 乳 動 物 m R N A之 純 化 作 用 1 1 > 藉 由 利 用 此 特 性 * 可 以 吸 附 於 一 寡 (dT) 纖 維 素 管 柱 上 1 1 而 進 行 〇 所 洗 提 之 mRNAK 後 可 以 如 +fh 蔗 糖 密 度 梯 度 離 心 法 1 | 予 以 再 分 段 〇 1 1 atRNA 確 實 编 iiiW 碼 所 欲 胜 ffe 的 確 認 9 可 藉 由 將 m R N A於 一 適 1 1 當 糸 統 1 如 瓜 蟾 卵 細 胞 % 統 > 兔 網 ΖώΙ* 織 紅 血 球 糸 統 或 麥 芽 1 I % 統 (參照前文） 中 轉 譯 而 達 成 〇 1 1 m 3 8 - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局負工消費合作杜印製 A7 B7五、發明説明（W ) 表現産物之還原活性的測量可如下述進行。 i) _宙二氣靛酚漠睦a袢 此挪定之方法為由Be inert，H.在” Methods in £)12¥111〇1〇87”（1962)，5,5 46中所述。 以20mM磷酸鹽緩衝液和0.5M NaCl製備50w M二氯黯酚 (Sisma)製劑（ΡΗ7.8),，將此製劑ltn丨置入一光析管（. cuvette) (SARSTEDT, l〇x X 4X 45mm.)中且於其後加入 樣品以測量。15w 1之 ImM NADPH(Boe「丨nger-Mannheim) (以相同緩衝液製成）於室溫下加至光析管中以啓動反應 。還原酶活性其後可依氧化態二氣靛酚於6 0 0 n in下降低 之吸收或依N A D Ρ Η於3 4 0 n m下降低之吸收予以測定^ i Μ剐定氤彳h態麩胱甘Ifc夕澴Μ沃桦 此分析的方法為由NakajUa, Τ.等人在"New Basic Experimental Methods in Biochemistry (6)-Assay Methods Using Biological Activity”， 3-34中所述。 以20mM磷酸鹽緩衝液和0.5H HaC丨製備lOmM氧化態麩 胱甘肋；（Boeringer-Mannheim)製劑至pH7.8在先將樣本 置入光析管（10x4x4mm)後，將此製劑置入。其 後於室溫下將相同緩衝液製成之1 5 w 1 1 mM H A D P Η加至 光析管中以啓動反應。其後麩胱甘肱還原酶活性依於 3 4 0 n m下降低之吸收予以測定。 如上所述之各種方法，可用於由mRNA衍生ds-DNA。其 包括S 1核酸酶法，蘭氏法和歐琪幼法（參照前文），但於 此例中吾等認為使用Okayama-Berg法較佳〔Okayama H. -39- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 ®濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 [ ) 1 1 和 Be r g 9 P . (1 982 ) ,Μ 〇 1 * Cell Biol . 2, 161-170 ] 1 1 由 此 所 得 之 d s -C 如前所述可被併入- -選殖載體中 [ [ 並 將 所 得 之 重 組 質 體 導 入 大腸 桿 菌中。 r--V 請 先 ! 内 含 编 碼 本 發 明 胜 之 所欲 DN Α的g株可依各種方法 閱 [ 選 取 如 前 述 有 關 選 取 内 含N I 3 D N A之轉形體者， 其可 背 面 1 I 之 1 具 有 任 何 週 田 的 修 飾 步 驟 。例 如 ,若使用 P C R以製備一 注 意 1 I 探 針 t 則 適 當 的 模 板 DN A可為前述之cDNA, 或基因組DNA。 事 項 1 [ 再 1 於 本 發 明 之 第 二 具 體 例 中， 可 使用一初 级篩選 以 減少 填 寫 本 策 需 測 定 之 轉 形 饈 Μ 株 數 Ο 此初 级 篩選係為 可能的 f 因為 頁 ^ 1 1 本 發 明 胜 Sk 為 關 於 細 胞 分 裂素 (C ytokine),致使 其 mRR A 1 i 參 與 AUUU A圖式同於細胞分裂素之mRNA(Sh a w , G * 和 K a a e η , 1 1 R · (1 986 ) 9 Ce 11 46 , 6 59 - 66 7 ) 〇 因此，於初级篩選中可 1 1 訂 1 使 用 互 補 於 AU ΟΑ圖式之合成的寡核甘酸探針。 其後 可 進 行 經 由 分 析 哺 乳 動 物 細胞 中 内源性蛋 白質産 生 之篩 1 I 選 〇 1 1 编 碼 胜 1 的 DNA可由載體切出並以類似上述有關Ν la 1 i I DN A之方式定序列。 再如上述， 此DN A片段 可被偶 合 至一 適 當 的 載 體 並 如 所 欲 用 以 轉形 ___ 原核生物 或真核 生 物宿 1 1 主 〇 1 I KH31 -7 蛋 白 質 可 ota 早 獨 使 用或 與 以一種或 以上其 他 治療 1 | 藥 併 用 以 預 防 和 治 療 由 氣 化性 壓 迫所引起 或相關 狀 況， 1 1 或 任 何 由 活 化 氧 所 引 起 之 疾病 0 此類狀況 包括， 但 不倜 1 I 限 於 ， 動 脈 硬 化 1 糖 尿 病 ,缺 血 性疾病（如再灌疾病， 1 缺 血 性 心 臓 病 » 腦 缺 血 症 和缺 血 性腸炎）， 水匯， 血管 1 1 -40- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標华（CNS ) A4規格（210X 297公釐） A7 B7 經濟部中夬標隼局員工消費合作社印製

五、發明説明 (>,9 ) 1 1 m 透 性 過 大 t 發 炎 * 胃 黏 膜 疾 病 » 冠' 性 胰 炎 1 克 降 氏 病 1 1 * 潰 瘍 性 結 腸 炎 > 肝 病 帕 拉 夸 氏 病 (P a r a q u a tr S 1 i d i s e as e ) * 肺 氣 腫 j 化 學 癌 生 成 ♦ 癌 轉 移 » 成 人 呼 吸 痛 請 1 先 1 苦 症 候 群 9 散 佈 性 血 管 内 凝 固 作 用 (D 1C), 白内障， 早 鬩 1 熟 性 視 網 膜 病 白 asm m 免 疫 疾 病 I 坡 菲 林 血 症 * 溶 血 性 疾 f 1 1 之 1 病 > 地 中 海 型 貧 血 9 帕 金 森 氏 病 阿 耳 滋 海 黙 氏 病 > 癲 注 意 1 1 癇 9 紫 外 線 放 射 疾 病 1 放 射 性 疾 病 f 凍 瘡 和 灼 傷 0 事 項 1 1 再 L 本 發 明 第 二 具 am 體 例 之 藥 學 組 成 物 包 含 製 藥 有 效 量 之 KM 4 本 策 -7胜 和 其 製 藥 容 許 載 體 〇 頁 1 1 本 發 明 之 組 成 物 可 以 各 種 型 式 投 予 J 如 以 額 劑 » 膠 囊 1 1 ， 顆 粒 » 粉 末 和 糖 漿 之 型 式 經 P 投 予 % 或 以 注 射 劑 ， 浸 1 1 劑 和 栓 劑 之 型 式 非 經 腸 投 予 〇 其 他 適 當 的 投 予 型 式 為 此 1 訂 1 m 人 士 所 熟 知 0 於 本 發 明 胜 Ilk 為 以 注 射 劑 或 浸 m 投 予 之 情 形 中 * 無 熱 1 I 原 之 胜 肽 製 劑 為 以 適 於 非 經 腸 投 予 之 製 藥 容 許 水 溶 液 製 1 1 成 〇 令 多 呔 溶 液 製 劑 符 合 所 需 之 pH 等 張 性 和 安 定 性 為 1 1 於 此 m 人 士 之 專 業 知 識 中 0 I 投 予 劑 量 和 型 式 可 由 此 藝 人 士 輕 易 地 決 定 * 考 慮 之 標 1 1 準 如 患 者 狀 況 t 體 重 » 性 別 9 年 齡 * 飲 食 » 其 他 感 染 之 1 l 嚴 重 性 投 予 時 間 和 其 他 臨 床 上 的 顯 著 西 素 〇 通 常 1 正 1 1 常 成 人 之 □ 服 劑 量 為 約 0 . 01 mg 至 約 1000 Ϊ0 g / 每 天 0 此 量 1 1 可 以 卑 __. 劑 量 或 以 數 次 劑 量 以 24小 時 内 投 予 〇 當 胜 為 1 I 被 非 m *κΤ1 腸 投 予 時 可 經 由 皮 下 i 肌 肉 内 或 靜 脈 内 注 射 約 1 0 . 01 Rl g 至 約 100m g /毎次投予。 1 1 -41 - 1 1 1 I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） ^59046 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (4。 ) 1 1 為 兀 全 描 述 KM3 1 -7 蛋 白 質 則 取 得 對 此 蛋 白 質 具專 一 1 1 性 之 抗 體 乃 為 非 常 重 要 〇 此 類 抗 m 辰 可 用 於 KM3 1 功能 t | 定 量 9 純 化 和 組 織 分 布 之 分 析 中 0 請 1 依 此 産 生 抗 -KM3 1 - 7抗體之雜種瘤可藉由將實驗動物 先 閱 讀 1 1 接 種 以 PHAL 3 1 - 7轉形大腸捍gi所産生之多呔， 製備- 背 1 I 之 1 骨 髓 細 胞 瘤 細 胞 與 抗 體 ΓΪΛΪ 産 生 細 胞 之 雜 種 瘤 » 隨 後 筛選 並 注 意 1 1 選 殖 此 雜 種 瘤 而 取 得 0 此 雜 交 瘤 所 産 生 之 抗 體 » 可辨 識 事 項 1 I 再 1 一 ι 由 以 p S R α 31 -7 轉 形 之 cos - 1細胞之無血清培養上清液 寫 本 蒗 所 取 得 之 多 肽 0 頁 t t 因 此 t 本 發 明 又 提 供 * 種 抗 腊 ， 較 佳 為 (JC* 単 株 抗 sum HS t 或 ί i 其 均 等 物 * 其 專 一 地 辨 識 KH3 1 -7 蛋 白 質 * 或 KH31 -7蛋 白 1 [ 質 之 突 變 髖 或 變 異 體 0 1 i 本 發 明 之 抗 體 為 直 接 對 抗 KH3 1 -7 蛋 白 質 或 其 突 變體 或 玎 i 變 異 體 〇 可 察 知 該 抗 m 可 為 多 株 或 早 株 j 但 以 αα 早 株型 式 I I 為 較 佳 〇 其 乃 因 多 株 抗 m 膜 般 伴 隨 著 不 確 定 性 〇 為使 結 1 1 果 — 致 例 如 無 論 是 於 治 療 或 於 純 化 KM3 1 -7 蛋 白 質， 其 1 i 較 佳 使 用 Dka 早 株 抗 aait 體 0 I 本 發 明 抗 體 可 由 任 何 適 田 的 動 物 製 得 〇 妖 而 j 於抗 體 1 1 為 非 人 類 時 産 生 抗 原 性 之 問 題 〇 於 此 點 9 其 可 將抗 體 1 I 設 計 成 更 接 近 相 似 於 人 類 抗 體 0 此 可 藉 由 此 藝 熟 知之 化 1 I 學 或 遣 傳 修 M- 飾 作 用 而 逹 成 〇 1 1 本 發 明 亦 正 視 抗 -遣傳性型抗體， 01 , 其辨識位置可 1 i 辨 識 上 述 抗 體 之 辨 識 位 置 的 抗 aat 痕 0 此 類 抗 -遣傳性型抗 1 1 體 可 藉 由 將 原 始 抗 體 投 予 至 一 過 當 動 物 而 製 得 〇 可察 知 1 1 -42- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 452 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（u ) 此步驟可無窮有效地於各對應於原始或抗-遣傳性型傳 代中持缠。然而，若抗體未於各傳代後以正確辨識選出 ，則其專一性可有效地流失。抗-遣傳性型抗體例如可 用於分析游離之抗- KM31-7抗體。 本發明亦正視本發明抗皚之片段，其可辨識KH31-7蛋 白質，和搞帶此類抗體辨識位置之分子。此類Η段和分 子於此處稱為本發明抗體之”均等物”。 質體pHAL 31-7被甩於轉形大腸桿菌且該表現産物被 純化並用於使實驗動物免疫。取自免疫動物之脾細胞用 以製備一雜種瘤，俱藉由與骨髄瘤細胞融合，並取得高 濃度且良好安定性之産生抗- KM31-7單株抗體之純種条（ 此純種糸被命名為MKM150-2並於1995-7-11以寄存號 碼96 0Θ 2 6寄存於食品工業發展研究所）。此純種糸 之培養物於培養上清液中産生抗- KM31-7單株抗體。 所得之抗- KM31-7單株抗體與由大腸桿菌中導人並表現 pMAL 31-7所取得之融合蛋白質以免疫化學方式反應。 此抗體亦與由以编碼KH3卜7 cDNA轉形之哺乳動物細胞 的培養上清液所取得之KM3卜7蛋白質以免疫化學方式反 應。 為産生一單株抗體，一般必須依從下列槪述之步驟。 其組成： * (a) 做為抗原之生物聚合物的純化作用； (b) 藉由抗原之注射使鼠免疫並於適當時間下Μ由採樣 和分析血液由脾製得産生抗體之細胞； -43 - 表紙張尺度通用中國國家橾準{ CNS ) Μ此格（210X297公釐） -----------^------1τ------^ (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 ^ ^,4 59 0.4? A7 B7 五、發明説明（〇 ) (c)製備骨髄瘤細胞； (d )將脾和骨鰱瘤細胞融合； (e) 筛選以選取産生所欲抗體之雜種瘤群； (f) 製備單一純種条（選殖> ; (si培養雜種瘤以大規模生産單株抗體，或視情形將養 殖以此雜交瘤感染之鼠；和 (h)分析生理活性或性質作為所得單株抗體之標記試_。 現今參考上述步驟描述抗- (CM31-7單株抗體之製造。 可察知其升不需要精確地遵從下列描述，且其可使用適 當步驟。例如，可使用脾細胞以外之産生抗體細胞與骨 鎚廇，和産生抗體細胞與其他哺乳動物之骨髓瘤。下列 步驟為目前較佳取得抗- KH31-7單株抗體之方法。 (a )抗原純化作用 由pMal 31-7於大腸桿菌中表現並將産物純化所取得 之融合蛋白質為一有效的抗原。以PMAL31-7轉形之大 腸桿g T B - 1之培養物以異丙基/3 - D -硫半乳糖贿喃甘（ IPTG)所誘發。表現之融合蛋白質其後以使用直鍵澱粉 樹脂管柱（New England BioUbs)之親和性層析予以純 化。由以pSRct 31-7轉形之C0S-1細胞的無血清培養上清 液所純化的KH3 1-7蛋白質亦為一有效的抗原。 (b )斜備産牛抗體細胞 (a)中所得之純化的融合蛋白質與Freund’s完全或不 完金佐劑，或如明礬之佐劑混合，其後以此疫苗將實驗 動物免疫化。BALB/c鼠為用作實驗動物之較佳選擇， -44 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 策 訂 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製

五、發明説明（y) I I 因 為 衍 生 白 鼠 之 大 部 分 有 用 的 骨 m 瘤 7y& 衍 生 白 BALB/ C I I m 〇 更 且 此 鼠 之 特 性 已 被 大 量 詳 細 TTT m 究 〇 再 者 > 若 産 I 生 抗 體 細 胞 和 骨 髄 瘤 均 為 來 η BALB/ c鼠， 則所得之雜 請 I 先 I 種瘤於BALB/ C鼠的腹腔中生長。 因此， 使用BALB/ c 鼠 鬩 ft I 提 供 可 使 単 株 抗 體 輕 易 地 由 腹 水 中 取 得 t 而 不 需 使 用 複 背 I | 之 I 雜 步 驟 之 優 點 〇 雖 妖 如 此 t 本 發 明 並 不 侷 限 使 用 BALB/ c 注 意 事 I 鼠 I 〇 項 I 再 I 抗 原 可 以 任 何 適 田 型 式 投 予 9 例 如 以 皮 下 注 射 » 腹 膜 寫 本 7表 内 注 射 » 靜 脈 内 注 射 f 皮 内 注 射 或 肌 肉 内 注 射 9 且 吾 等 頁 、_*»* I 較 佳 以 皮 下 注 射 或 腹 腔 内 注 射 0 I I 免 疫 作 用 可 進 行 次 或 以 適 當 間 隔 進 行 數 次 〇 較 佳 之 I I 攝 生 法 為 使 免 疫 化 且 其 後 追 加 或 更 多 次 以 I 至 5 週 I I 訂 I 之 間 隔 ΰ 若 對 免 疫 化 動 物 血 清 中 該 抗 原 的 抗 歴 力 價 作 定 期 分 析 ♦ 且 具 有 充 分 高 度 抗 體 力 價 之 動 物 被 用 於 提 供 産 i I 生 抗 體 細 胞 > 則 可 提 高 後 續 步 驟 之 有 效 性 0 後 鑛 融 合 所 I I 用 之 産 生 抗 體 细 胞 較 佳 於 最 後 免 疫 作 用 3 至 5 天 後 白 動 I 1 物 早 離 〇 I 分 析 抗 體 力 價 之 方 法 包 括 例 如 各 種 己 知 技 術 » 如 放 射 1 1 性 同 位 素 免 疫 分 析 (RIΑ), 酵素連接免疫吸著劑分析 1 I (ELISA), 螢光抗體技術和被動血球凝集作用， 但R I A和 1 | EL ISA因其靈敏度， 速度， 正確性和自動操作之潛力而 1 為 較 佳 〇 1 EL ISA之適當型式如下。 將抗原吸附至- -固相上且其 1 1 後 將 此 固 相 表 面 暴 露 至 與 抗 原 ftrr. Μ 關 之 蛋 白 質 > 如 牛 血 清 1 1 *45- 1 1 1 I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（44 ) 白蛋白（B S A )，以阻塞未吸附抗原之表面區域。其後清 洗此固相，其後將其暴露至第一抗體之連續稀釋樣品（ 如鼠血清）中。樣品中之任何的抗- KM31-7抗體結合至此 抗原。清洗後，加人第二，酵素連接之抗-鼠抗體並令 其結合至已結合之鼠抗體。清洗後，加入酵素受質旦抗 體力價可藉由測量一參數，如由受質分解作用所引起之 顔色變化，而計算出。 (c )骨馘瘤細_靱· 己確立之鼠細胞糸較佳被用做為骨髓瘤細胞之來源。 此類細胞条之適當例包括來自BALB/c源8 -氤鳥嚓昤抗 性鼠之骨髓瘤細胞条P3-X63Ag8-Ul (P3-U1)〔 Current Topics in Microbiology and Immunology ,81 , 1-7( 1 978)) , P3-HS 1/ 1-Ag4 . 1 (HS-1 ) [European J.

Iniinuno 1 ogy , 6,5 1 1 - 5 1 9 ( 1 97 6 )] , S P 2 / 0 - A g 1 4 ( S P - 2 ) C Nature ,276, 2 6 9 - 2 70 ( 1 9 78 )) , P3-X63-Ag 8.6 5 3 ( 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 653) [J. Immunology,123 ,1548-1550(1979)〕和 P3-X63 -Ag 8( X63)〔Nature 256,495-497(1975)〕。此空細胞 条可於適當培養基，如8-氮鳥嘌呤培養基（RPMI-1640培 養基其内含8 -氮鳥嘌昤，1.5ntM麩醯胺，5X105M 2 -氫 硫基乙醇，lOws/ml健他徽素和10%胎牛血清）， Iscove's 修飾之 Duibecco’s培養基（IMDM)或 Du]beeco's 修飾之Eagle’s培養基（DMEH)中繼代培養。細胞數籍由 以一般培養基，亦已知為完全GIT〔5.5mI之MEM非必需 胺基酸溶液（NEAA, Gibco), 27.5ml 之 NCTC 109(Gibco) -4 6 — 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4 5 9 0 46 A7 B7 五、發明説明（4x ) ，6ml之青徽素-鏈徽素溶液（SUma)和11ml之麩醯胺酸 200mM溶液（Sigroa)於500毫升之GIT培養基中（和光純化 學工業）〕，於細胞融合前3天至4天繼代培養，可於 融合日提高為至少2 X 1 0 7。 (d)細_融合 産生抗體細胞為血漿細胞及其前驅物淋巴細胞。其可 得自各動物之適當位置如脾，淋巴結，周圍血管或其任 何此等之適當組合。然而，以脾細胞最常被使用。 産生抗體細胞於最後免疫作用3至5天後，由至少具 有規定之抗體力價之鼠中收集。所得之産生抗體細胞其 後與上述（C)所得之骨髓瘤細胞融合。此步驟目前最常 使用為令脾細胞與骨_瘤細胞以聚乙二醇融合，因其細 胞毒性相當低且此化合物之操作容易。此步驟如下進行。 脾細胞和骨髓瘤細胞以培養基或磷酸鹽緩衝食鹽水（ PBS)充分清洗，以脾細胞相對於骨髓瘤細胞之約5〜10: 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 1之比例混合，且其後令以離心分離。丢棄上清洗並將 細胞結塊完金弄碎，並攪拌加入聚乙二醇之混合溶液（P E G ,分子量：1000至4000)。數分鐘後，將細胞令以離心 分離。再度丢棄上清液，並將緊密的細胞懸浮於適當里 之内含5至lOng/ffll鼠1L-6之完全GIT中並於其後移至培 養平板之孔口中。一旦各孔口中之細胞生長已被確認， 則將培養基更換以HAT培養基（芫全GIT内含5至10ng/ml 鼠IL-6, 10e至103M次黃嘌昤，10s至107M胺基蝶昤 和1 0 6至1 0 4 Μ胸甘）。 -47 -本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 459〇46 a7 B7 五、發明説明（朴） (e)撰取雜穐瘤群 培養平板於- C02培養器中35至401C下培養10至14天 。於此時，每1至3天加入相當培養基半量之新鮮的HAT 培養基。 骨髓瘤細胞為來自8 -氮鳥嘌昤抗性細胞条且骨髓瘤細 胞和僅由骨髓瘤細胞組成之雜種瘤均無法於HAT培養基中 生存。然而，包括産生抗體細胞部分之雜種瘤（含産生 抗髏細胞和骨髓瘤細胞之雜種瘤）可生存。僅由産生抗 體細咆所組成之雜種瘤刖死亡，致使由骨髓瘤和産生抗 體細胞兩者所組成之雜種瘤可藉由在HAT培養基中培養 而而選出。 於雜種瘤被觀察到發展成菌落之孔口中，將HAT培養 基更換成HT培養基（其中胺基蝶昤為由HAT培養基中移除） 。移出部分之培養上清液並例如以E L I S A分析抗-K Μ 3卜7 抗體力價。 上述步驟為以8 -氮鳥螵昤抗性細胞系描述，但其他細 胞糸亦可使用，只要其允許雜種瘤之選取。所使用之培 養基的組成自然亦於此情況中改變。 (η蓰铕 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由（e)已被確定産生抗-ΚΜ 31-7專一抗體之雜種瘤，被 移至不同平板以進行選殖。可使用各種選殖法，如播種 法（seeding raethodM其中雜種瘤被令以限制稀釋分析， 以使各孔口内含一個雜種廇），軟洋菜法（其中播種菌落 被置入軟洋菜培養基中），播種法（其中以撤操縱器移出 _ 4 8 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2! 0 X 297公釐） 459046 A7 B7 五、發明説明（〇 ) 單一細胞），和分類選殖法（其中館別的细胞為以一細胞 分類器予以分離）。限制稀釋分析因為其簡易性而最常 被使用。 如以限制稀釋分析進行選殖，則對持鑛被觀察到抗體 力價之孔口重覆2至4次。持續展現出産生抗- KM31-7抗 體之純種糸被選出做為雜種瘤之選擇。 U)以雜種瘤掊蕃物製備屋株桥體 由（f)選出之雜種廇其後於一般之培養基中培養^以 大培養瓶或自轉器以旋轉培養進行大量培養。抗- 031-7 單株抗體可取自令細胞上清液進行讓過濾，且於其後收 集並純化IsG分段。此外，雜種瘤亦可於相同鼠種（如上 述之BALB/c鼠）或例如Νιι/Νυ鼠之腹腔中生長。進行此 步驟之簡單方法為使用一單株抗體製劑套組，（如 Pharmacia的 Mab Trap GII)。 (h )鑑亩蜇抶杭體 (g )中所得單株抗體之同型和亞類的測定為如下述進 行。可使用之鑑定技術例包括歐奇待隆尼法（0 u c h t e r 1 ο n y method), ELISA和RIA。雖然歐奇特隆尼法簡單，但其 缺點在於單株抗體之濃度為過低之情形時必需將其濃縮。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 若使用ELiSA或ΙΪΙΑ,則培養上清液可直接暴露於一已 吸附抗原之固相上。對IgG亞類各型專一之第二抗體可 被用以鑑定亞類型式。另外地，可使用一測定同型套組 (例如，A ίο e r s h a m之鼠單株抗體測定同型套組）。可以 Folin-Lowry法或測量在280nm下之吸收〔1.4(0D ) -49 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） A7 B7 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 五、發明説明 1 I — 1 ffl g/ [〇 1 之 免 疫 球 蛋 白 3 進 行 蛋 白 質 的 定 量〇 1 1 於 後 附 之 實 施 例 中 > 由 命 名 為 MKH150 -2之雜種 瘤 所取 L 1 得 之 C3E1 單 株 抗 βΜ 體 被 測 定 為 IsG類同塱且被鑑定為屬於I gG 1. 請 1 先 t 亞 類 鬩 I 讀 1 依 本 發 明 所 取 得 之 単 株 抗 體 時 KHK3 1 - 7蛋白質具有高 背 面 1 I 之 1 專 - 性 0 再 者 由 於 tJtt 卓 株 抗 體 為 持 績 並 以 良好數 量 由培 注 意 1 1 養 上 述 雜 種 瘤 而 取 得 t 因 此 其 可 用 於 KM3 1 -7蛋白 質 之單 事 項 1 t 再 人 離 和 純 化 ψ 且 經 由 使 用 抗 原 -抗體反應之免疫沈澱作用 填 禽 本 今、 以 該 株 抗 體 CIC» 早 離 和 純 化 ΚΜ3 1 -7 蛋 白 質 構成本 發 明之 頁 Sf 1 I —· 部 分 〇 1 1 本 發 明 現 今 以 參 考 後 附 之 未 侷 限 實 施 例 說明。 所 有溶 [ 1 液 為 水 性 且 由 去 離 子 水 製 得 並 以 W / V百分比之型式表示 1 ♦ 除 非 特 別 指 明 〇 若 未 指 明 方 法 > 則 其 可 於"Μ ο 1 e c u 1 a r 1 丁 1 C 1 on ΐ η g * A La bo r a t 0 r y Μ a η ua I" [ 第 — 版 ,S a ffl b r ο ok, 1 | J. Fr it SC h， E . F . 和 Ha n i at is T . (1 9 8 9 ) 冷泉港 實 驗室 1 [ 印 刷 ) 尋 得 〇 溶 液 和 其 他 培 養 基 之 製 備 方 法為列 於 後缠 1 j 部 分 標 題 為 ”培養基” 中 » 其 並 未 列 於 實 施 例中。 實 施例 | 中 所 述 無 技 術 之 方 法 應 可 於 先 > 刖 實 施 例 之 上下文 中 推知。 1 1 A)ΠYV V 來 源 物 質 1 1 以 三 第 草 黃 脈 病 毒 感 染 並 已 於 冷 凍 狀 態 中貯存 之 藥 ί I [ CYV V -單離物N 〇 . 30 ：U ye da ,I • 等 人 (1 97 5 ) , An η , 1 1 Ph y t 0 P a t h . S 0 C J a pa η 41 :1 92 -203 ] 以 10倍容 量 之接 1 1 種 緩 衝 液 磨 碎 〇 I 使 用 已 發 展 第 二 成 葉 之 蠶 豆 C U It 1 V a r W a s e - S 〇 r a m a re e 1 1 -50- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標孪局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（竹） 進行C Y V V之繁殖。將一 Η成葉噴灑以金剛砂（4 0 0網目） 且其後使用一玻璃刮勺接種以上述液體。接種約八至十 天後，被接種之葉己發展成一類似網目之鑲嵌狀況。將 此葉移出並用以做為CYVV之來源。 Β )純化病羞 上述Α)中所單離之藥子以含有3倍容量萃取緩衝液之 切碎機切碎。切碎後，此葉再以一乳缽和杵磨碎。所得 製劑使用一裝配不銹鋼攪拌葉之馬達，於室溫下緩慢攪 拌1小時。經由雙層纱布將液體製劑擠出。 所有後缅為於4 t下進行。 將粗製液以半倍容量之氣彷混合並以一 Waring混合機 混合後，於6 Ο Ο Ο X g下離心製劑1 5分鐘。離心後，收集 水層，並於此部分中加人聚乙二醇（PEGtf6,000)至终濃 度為4% v/v。 所得混合液於冰上攪拌1小時並令於冰上又靜置1小 時。由此所得之液體令於6, OOOxg下離心15分鐘，並回 收沈澱物，為含病毒部分。將此沈澱物懸浮於50nil内含 0.5^尿素之10渊磔酸鹽緩衝液（？《7.4)中且其後以等量 之四氣化碩混合，並劇烈攪拌5分鐘後，將此製劑令於 3, OOOXg下離心10分鐘。其後將水層以Hitachi RP-30 旋轉器於4C下以SO.OOOr'Pii!超離心90分鐘。將所得丸狀 物回收，為含病毒部分。 將九狀物懸浮於内含1% TritonxlOO之10mM磷酸鹽 緩衝液（PH7.4)並將此懸浮液於以δ,OOOXg離心1分 -5 1 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T --ί • ... 1 • ... 1 經濟部中央標隼局負工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（> ) 鐘。上清液於一事先以10mH磷酸鹽緩衝（pH7.4)製備之 漸近10至40%蔗糖密度梯度圓柱管（40% : 10ml, 30% :ΙΟιπΙ， 20% : lOiol, 10%10ml;且已令於 下靜置 過夜）中分層。一旦含上清液之管被分層，則將其於 Hitachi PRS25 旋轉器中，4T：下以 23,000rpm 超離心 120 分鐘C1 離心後，將蔗糖密度梯度圓柱管使用一裝配以0 D 偵潮器之分段器（UA-2型；由ISC0公司製造）進行分段。 將具有約20至30%蔗糖密度且於0D 26Qmi吸收之部分取 含病毒部分。 此回收之病毒部以ΙΟιπΜ磷酸鹽緩衝液（pH7.4)稀釋兩 倍並以Hitachi RP-65旋轉器於4 Ί〇下以4〇,00〇rpffl離 心90分鐘。將所得沈澱物再懸浮於lOmM磷酸鹽缓衝液（

P Η 7 . 4 )中可得一純化之病毒溶液3 c )星離病羞R H A CVYY之基因组RNA包括約10,000痼鹼基且於其3’終端 為被聚腺甘酸化。長度和聚腺苜酸化作用之組合，使得 其於使用傳统的苯酚/十二烷基硫酸鈉法或硫氰酸胍法 萃取全長度RNA時，難無任何流失。依此，病毒基因組 RNA為以鹸性蔗糖密度梯度離心法製備。 將500</1之病毒溶液（其已依1|^/1!11病毒具有2.5之 0 D260nm 之標準算出内含2ms病毒）加至500y 1之降解溶 液中並令於室溫下靜置2 0分鐘。於其後，將混合液於一 只1乂$$(；製備之0%至33.4%蔗糖密度梯度圆柱管（33.4% -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，-fl

A7 B7 五、發明説明（ri ) ：1 . 4m 1 , 30 . 4% ： 7 . Bin 1 , 27%： 7.0ml, 2 3 % ： 6 . 3 in I , 18.7%: 5ml, 1290 :3.2ml, 0% :2.4ml;且包含於 下靜置過夜）中分層。所使用之緩衝液亦為1 X ssc,並 將此分靥之管以以〖3(^丨1?卩5-27旋轉器於15^下以24,000 r p in超離心9小時。於其後，將管底鑽洞以分段蔗糖密度 梯度。病毒基因組RNA部分以測量各部分在260nm下之吸 收而鑑定。病毒基因組R N A之沈降作用發生在約2 0至3 0 % 之蔗糖濃度。所得基因組RNA之産率為約25(ig。

(D )合成疼病nDNA 使用上述c)製得之基因組OA做為模板合成cDNA。cDNA 合成。為使用cDNA合成条統Plus(由Afflershain殺造）進行 。所得之cDNA以Sephadex G50管柱（商品名，由Pharmacia 製造 >純化，並使用dCTP和终端去氣核甘酸轉移酶（由 Bethesda Research Laboratories製造）於純化 eDHA之 5’終端加人聚C鏈。質體PBR322之製劑（由Bethesda Research Laboratories製造）為經由將質體以限制_

經濟部中央標準局員工消費合作社印I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) P s t Ϊ切開且其後於兩終端加入3 1聚G鍵所製得。其後將 cDNA加至此製劑中.並於6510下培養5分鐘後，於57t' 下培養2小時。將所得混合液逐漸冷卻以令c D A H之聚C 鍵與質體之聚G鍵黏接。 (E)轉形 將大腸捍菌菌株Η B 1 0 1以氣化鈣法以上述D )所製得之 新穎質體轉形。藉由在液體LB培養基中振盪過夜製得大 腸桿菌菌株ΗΒ101之種培養物。將0.5πι丨之種培養物接種 -53 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（h ) 至50ml之新鮮液體LB培養基中並將接種物於37t下振盪 培養到0 D 55〇nm為0 . 5。於4 下以5 , 0 0 0 X g離心5分鐘 以回收細菌細胞並將所得之九狀物溫和地憨浮於2 5 m〗之 T「i S -鈣緩衝液中並令於冰上靜置5分鐘。所得懸浮液 再以4,00〇x g離心4分鐘將丸狀物懸浮於5ml之TrMs -鈣 緩衝液中並令於冰上靜置2小時，以産生反應潛能（ coiapectent cel Is) 〇 捋100 « 1上述D )所得之新穎質體加至200 w 1上述所得之 反應潛能細胞中，並令於冰上靜置30分鐘。於其後，將 混合液於42 t下培養2分鐘且於其後加入1 m 1之液體LB 培養基.並將此温合液於3 7 υ下再振盪培養一小時。將 此潖合液塗布於内含12.四環徽素鹽酸鹽和1.5% w/w洋菜之固體LB培養基。將細胞於371下培養過夜，以 得- cDHA純種糸庫。

F )製備和蓰摆皙體dHSFH cDNA重組質體庫使用鹼性-SDS法分析。更詳言之，其 方法如下。 於2ml之液體LB培養基中接種以由上述E)之固體LB塔養 物所得之對四環徽素抗性但對安比西林敏感之細0菌落 ，並將此懸浮液於371下振盪培養過夜。細胞以10, 000 X g離心回收並懸浮於7 0 w 1内含另外1 6 w 1溶菌酶溶液 U 0 mg / m 1 )之溶胞緩衝掖。於攪拌5秒鐘産生一懸浮液 後，令此懸浮液於室溫下靜置5分鐘。於其後，加入 ISOwl之鹼性- SDS溶液並將試管倒轉數次混合後令於冰 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（Ο ) 上靜置5分鐘。其次加入120/i 1之5M醋酸鉀後再令於冰 上靜置5分鐘。於其後，混合液於下以10,00〇Xg離 心5分鐘。 離心後，將上清液移至一新管中，並再加入250μ1之 異丙醇並將所得之温合液令於冰上靜置30分鐘。於其後 ，再於10,OOOXg離心5分鐘，並將所得之九粒物溶入 100/i 丨之 TE緩衝液中〔10mM Tris, lmM EDTAC pH8.0)J 。加人等量之苯酚/氣仿/異丙醇（2 5 : 2 4 : 1 )並劇烈 混合且於41下以10, OOOXg離心5分鐘，以進行苯酚 萃取（其後此步驟稱為苯酚萃取 由離心所得之100w 1水層，與10w 1之3M醋酸鈉（PH5.2 )和2 5 0 w 1之酒精混合，並令於乾冰上靜置〗0分鐘後， 於1 0 , 0 0 0 X g離心5分鐘，以回收核酸部分（其後，此使 用相同相對量之上清液，酒精和醋酸鈉溶液之步驟稱為 酒精沈澱）。 將所得之丸狀物懸浮於1之OaseA溶液ΠΟμ g/ml 於τ e緩衝液中）並於3 7 υ下培養〗小時。於其後，於此 培養懸浮液中加人3 0 w 1之聚乙二醇溶液（2 . 5 Μ氛化鈉， 2 0 %聚乙二醇# 8 , 0 0 0 ),並令於冰上靜置1小時。於其 後，混合液於4 %下以1 0 , 0 0 0 X g離心5分鐘，以回收 DNA部分，為一九狀物，並進行兩次以上之酒精沈澱以 得到純化的質體D H A。 此純化的質體D N A以限制酶P s t I切開並使用T B E溶液進 行1%瓊脂酷_電泳。電泳後，進行南向點漬雜交作用 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、π 4 59 046 a? B7 五、發明説明（Μ ) (Southern blot hybridization) [ Southern, E . M .( 1975), J.Mol.Biol.89: 503-517]。更詳言之，將駿 於變性溶液中振盪4 0分鐘，其後移轉並於中性緩衝液中 振盪2小時。 振盪後，將膠移轉於一内含2〇x SSC之聚胺甲酸乙酯 海綿上，以將DNA移轉至一位於海綿上之Hybond-H膜（ A li e r s h a m之註册商標）。於D N A移轉至H y b ο n d - H膜上以後 ，將此膜於1XSSC中振盪10分鐘並其後於80*C下乾燥1 小時以固定D Ν Α。將此膜置於預雜交溶液中〔5 m 1之甲醯 胺，lml之 5〇xDenhart’s溶液，2.5ml 之 20XSSC, 100ml 之酵母 tRNM5〇0^/ml) , 100W 1 之 10% SDS 和 1.3毫升之 再蒸餾水〕並於5 0 υ下培養3小時。 使用一已以H g 2 切割之病毒基因組R Ν Α做為探針，更 詳言之，將4 // 1之5 X變性緩衝液加至1 6 w 1上述c )所得 之内含lwl病毒RHA之溶液中，並於37C下培養3小時 。内含100mg RNA之5wl變性RNA溶液（以lffig/ml RNA具 有〇 d 26() 2 〇為基準所算出者）藉由酒精沈澱，其後於7 ο υ 下加熱5分鐘並於冰上驟冷而回收。 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將4!〇1之5/標記緩衝液，1以1之3.31^〔7-32?〕為？？ (0.37MGq),和10w 1之再蒸餾水加至變性之RNA溶液。 加入20ϋ之T4聚核甘酸激酶溶液〔由寶酒造製造〕，隨 後於37它下培養30分鐘。重覆酒精沈澱五次以移除未偶 合之〔7 — 32 ρ ] Α Τ Ρ。 將標記探針加至雜交溶液中〔5 in I之甲醯胺，2 m I之 -56-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 kQ〇4S B7五、發明説明（π) 5%葡聚糖硫酸鹽，200wl之5〇xDenha「dt's溶液，2,5 ml 之 20XSSC, 50ί/1之酵母 tRNA(50ms/m】），lOOwl之 10%SDS, 1,3ml之再蒸餾水]至於濃度為5xl05cP[n/ml ,並將上述所得之H Y b ο n d - N膜移λ此溶液並於5 0 f下培 養過夜令以進行雜交後.於6 0 V下以内含0 . 1 %十二烷 基碕酸納（S D S丨之2 X S S C清洗振盪。此步驟重覆三次， 並將H y b ο n d - N膜再於室溫下以内含0 . 1 S D S之0 . 1 X S S C振 盪清洗1小時，並乾燥， 放射自顯術取得一被命名為P H S 5 1之質體，其具有一 包含約6,500鹼基對（bf>)之已與病毒基因組RNA雜交之插 入片段. G ) ...1.¾.之屋 jiLi.定— 為製備P N S 5 1中所選殖之c D N A的限制輿圖，傜將此質 體各以限制酶；B a πι Η I: , E c 〇 f? i , H i n d Π ί , Κ ρ η ί , N ⑼ I , PstK Sail, Sphl, SacI, Smal, Xh〇r, Xba[,和其配 對予以切開。所得之輿圖示於圖1 ,: 後缠地，將限制_ S a 1 I和P s t I切開所得之各Μ段g入 Μ 1 3 in p〗9 f； F D N A中，其可經由將p N 5 ；!以限制酶P s t ΐ和 S a 1 I切開並捋此切割産物於-5 %聚丙烯醯胺電泳隱上使 用1 X 了 B E而完成..，電泳後，將_以1 g / m 1三溴化乙錠 染色，使其可於ϋ V光下鑑別該帶，以一刮刀將内含各D N A 帶之_條切出並以一裝配C e n t r i c ο η - 3 0 (由A m i c ο η製诰） 之電溶離器（由A ns i c o ri製造）進行電溶離 其後將各片段以D N A連接套組〔由賫酒造製造]插人 -57 - A7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（2]0X297公釐〉 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (ib ) 1 1 事 先 僅 以 S a 11 ，或以P s U和S a 1 I兩者切開， 旦以鹼 性 i 1 酸 酯 酶 處 理 之 Η 13ηι P 1. 9 中 1 將 所 得 之 重 組Ml 3mpl9RF- DN Α (其中該片 段己使用Τ 4 D Η A 請 1 先 1 連 接 酶 插 人 )使用氯化铷法導人大腸桿菌_株J Μ 1 0 9中， 閲 讀 1 將 事 先 已 於 Μ9 最低 洋菜培養 基培養之菌株 J Μ 1 0 9 的 單 一 背 面 1 I 之 1 ** m 落 接 種 至 液 體S 0 B培養基中並振盪培養過夜。將 0 . 6m 1 注 意 ! 1 之 此 過 夜 培 養 液接 種至5 0 m 1 之新鮮液體S0B培養基 中 並 事 項 1 [ 再 於 3 7 °〇 下 振 m 培養 至〇 D 6〇〇niu達到〇 * 5。細 胞於 下 以 f 寫 笨 5， 000 X g 離 心 1 0分 鐘予以回 收並將九狀物 溫和地懸浮於 頁 1 I 25 ml 之 TF B 1 緩 衝液 中並於冰 上靜置2 0分鐘 1 1 懸 浮 液 再 以 3，0 0 0 X g 離心 5分鐘，並將 丸狀物懸浮於 1 1 2 m i之T F B 2緩衝液中並於冰上靜置2 0分鐘， 以取得 反 應 1 訂 1 潛 能 細 胞 上 述 所 得 之 重組 Μ 1 3 m p 1 9 F R - D N A於連接後使用1 至 1 0 w 1 1 I 之 份 量 並 與 100 U 1 之反應潛 能細胞混合並 今於冰上靜置 1 i 1 小 時 於 其 後， 混合液於 4 2 υ下培養1 . 5分鐘並 於 其 ! 丄 後 加 人 5 0 0 y 1 之液 體S 0 C培養基並於3 7 f下再振盪 培 養 1 1 小 時 1 1 將 含 含 0 . 8 % 洋菜，3 0 κ 1 IOObiH IPTG , 1 0 y 1 10¾ i 1 5- 溴 -4 _氣- 3 - 吲8朵 基-卜半乳糖1f ί X - ε a 1 ) 和 1 0 0 u 1指示 I 菌 (株 J Μ 1 09於2Χ ΥΤ培養基中37^0下振盪培養之 過 夜 1 1 培 養 物 )之2 X YT培 養基振盪 加至上述所得 之培養液中， 1 I 並 榑 此 混 合 物 倒入 内含1.2%洋菜之固體2 X ΥΤ培養基中 1 I η 於 混 合 液 固 化後 ，^ 3 7°C 下培養過夜、 重組噬_體隨 I 1 -Βδ - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） A7 B7 經濟部中央標隼局負工消費合作社印製 五、發明説明 (η ) 1 1 後 顯 示 為 白 色 噬 m 斑 1 1 將 各 白 色 噬 菌 斑 接 種 至 内 含 1 ./ 1 00 量 指 示 菌 之液 體 [ ! 2 X Y T培養， 並於3 7 °C下振盪培養過夜 於1 0 , 0 0 0 X g離 請 先 1 心 1 小 時 後 r 將 上 清 液 於 4 f冷藏貯存做為- -噬菌體溶 閲 讀 1 液 t 並 將 細 咆 丸 狀 物 以 標 準 步 驟 處 理 以 製 備 —«. 質體 .用 背 1 I 之 1 以 回 收 FR 雙 股 DN A ( 其 後 * 簡 稱 為 RF -ON A ), 此為噬菌體 注 意 1 I 之 複 製 中 間 物 插 入 Η 段 之 存 在 以 限 制 酶 切 開 予以 確認。 事 項 1 I 再 因 此 取 得 51SS/ Μ 1 3 in P 19 ( 即 H1 3 ΪΗ p1 9 内 含 -Sal I/Sa ] 填 本 Η 段 * 其 依 次 為 — 内 含 來 自 C YV V 基 因 組 5 ' 區 域 之PS t I - 頁 Ν_^ 1 I S a 1 Γ η 段 的 5 1 PS5 ' /H 13 m p 1 9 基 因 組 的 一 部 分 RF- DN ή 1 1 為 以 齡 性 -S DS和 氨 化 铯 密 度 梯 度 離 心 依 標 準 步 驟由 此些 1 | 噬 菌 體 純 化 厂1 1 訂 所 得 之 純 化 的 DN A 5 t £ g 苜 先 以 Ba m Η I切割以取得5 ，突 1 出 末 I出 彌 9 且 其 後 再 以 Kp η [切 割 可 取 得 3 ' 突 出 末 端 其次 1 I » 依 據 Er as e - a - b a s e 条 統 (由P Γ 0 me g a 製 造 >所附之説明 1 書 加 入 核 酸 外 切 酶 > 以 由 各 cD N A 直 線 化 之 質 體 的5 ' 突出 1 丄 末 端 逐 步 將 鹼 基 刪 除 核 酸 外 切 酶 的 處 理 持 續 1 0分 鐘， I 並 將 樣 品 於 1 至 1 0分 鐘 之 間 不 同 時 間 移 出 Γ丨 由 於載 體具 1 1 有 一 3， 突 出 末 » 因 此 其 不 受 核 酸 外 切 酶 攻 擊 ，由 1至 1 1 1 0 分 鐘 時 段 内 所 得 之 各 種 樣 品 以 S 1 核 酸 酶 處 理 成純 端並 1 I 使 用 Τ4 D K A 連 接 酶 連 接 成 一 圓 狀 型 式 1 1 使 用 上 述 之 氯 化 m 法 將 所 得 圓 狀 之 重 組 Η 1 3 in p 1 9 RF- 1 1 DH A導人大陽桿__株^109 中 依 此 t 取 得 具 有可 變長 ! | 度 cDN A 插 人 物 之 重 組 噬 菌 體 > 為 白 色 噔 菌 斑 1 ! -59 - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS >A4規格（210X297公釐） A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、發明説明 ( ^ ) 1 1 由 l·. 述 所 得之 重 組 噬 闇 體 次 純 種 条， 以 傳統 方式萃 出 J 1 出 R F -DN A t 以選 取 具 有 不 同 插 入 物 長度 之 純種 系D 所 選 1· i 出 之 純 種 %、 分別 接 種 至 内 含 ™* 大 腸 桿菌 指 示® 之液體 2 X 請 i 先 1 YT培 養 基 並 於37 °C 振 m 培 養 過 夜 0 於其 後 ,將 1 . 5 m 1之 閱 讀 1 各 培 養 液 於 4 C下以1 〇, 0 00 > 'g 離 心 5分鐘。 將1 ig 1之上 清 背 ώ 1 I 之 1 液 移 至 新 試管 中 並 混 合 加 入 2 50 w 1之 2 0%聚 乙二 :醇 水 注 意 1 I 溶 液 (2 0 96聚乙二醇ft 8 0 0 0 ， 2 . 5H 氯 化鈉 1且其後於 冰上 幸 項 1 I 再 1 上 靜 置 30 分 鐘 ，混 合 液 缠 於 4 1下以1 0,0 00 X g離 心5 分 鐘 填 % 未 並 將 所 得 之丸 狀 物 懸 浮 於 1 00 u 1 之TE 缓 衝液 中Λ 以 前 頁 1 I 述 之 苯 m 萃 取和 酒 精 沈 m 由 各 製 劑 中回 收 單股 DN A (其 後 1 1 簡 稱 為 s S DN A )噬 m 體 基 因 組 1 1 上 述 所 得 之各 純 種 % 其 後 以 雙 去 氧鏈 終 止步 驟， 使 用 ! 訂 S S DN A做為模板， 進行核甘酸之定序列 更詳言之 ,將 1 噬 蘭 體 S S DK A以 [C X " 32 P ] dCTP ( 220TBq / m mol. 由 I t A tn e r s h a m 製 造）使用7 ~去氮- 定 序 酶 2 . 0型d C T P套組 (由 USB E ί 1 製 造 >予以標記. 所得之反應産物於一内含8M頭素 之5% 丄 聚 丙 烯 醯 胺 電泳 m 上 跑 並 使 用 1 X TBE做 為 緩衝 液，. 將 m I 乾 燥 * 並 以 放射 白 顯 術 測 定 核 甘 酸 序列 ：! 1 1 m 由 分 析 PNS5 1之5 T _ Ps t I -S a 1 ί Η段和Μ -Sal I "S all Η 1 1 段 的 核 甘 酸 序列 r 可 確 定 總 計 3 . 8 3 9健鹼基。 I 於 述 序 列中 調 查 開 讀 框 (其後簡稱為0 R F )之結 果， 1 1 於 病 毒 基 因 組的 + 義 股 上 偵 測 到 多Ife 的 Ε1ΕΪ 単一 0RF 。其 1 1 後 測 定 到 0 R F中编碼的多序列. 將此多呔序列使 用 1 Ge n e Ba n k 與 已知 序 列 柙 tb 較 進 行 同 源性 捜 査， 得知與 t 1 -6 0 λ 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） 459046 at B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (S9 ) 1 i TE V - H A T之同源性 1 1 已 知病 毒如 TE V , 李子天花病毒或灰質 炎 柄母 (- -動物 1· 1 病 毒 )經由蛋白酶之作用而成熟，且該蛋 白 酶一 般 切 割一 請 1 λ 1 内 含 Gin- Ala. G 1 η -Ser或 Gin- G 1 y鐽之胜 鍵〔 y ί 11 ink 閱 1 J . 和 van K a m m e η t A . ( 1 98 8 ), A r c h . V i r 〇 1 . 98 ： 1 - 26 J C 背 τέ 1 | 之 1 吾 等 亦能 偵潮 於 所 演繹之肽序 列中的三画切割序列， 其 注 意 1 I 為 分析 C YV V -N 〇 . 30 [ Uyeda, I .等人（1 99 1 )， 事 項 1 I 再 1 人 In t e Γ V ί Γ 〇 1 〇 s y 32 ：234-245] 覆被蛋白 質 之切 割 位 置 ▲ 寫 本 笨 的 結 果Γ 由此 切 割位置之一 ,可測定出由胺基酸序列 頁 1 | 第 4 位置 Gly至第437位置GU之多呔為來 白 C” V之 核 包 1 1 涵 體 a「 1 | Η ) 製 I 丄二 1—丄融—洽 1 F白質 1 訂 上 述G ) 中被 鑑 定 為編CYVV N la之 DNA , 為 經由 m itn 碼 Gin- 1 Ala之連接序列縱向連接在其3 '端至編碼 人 類間 白 素 1 1 ( 1 I I L -1 1 )之 D N A 〇 1 L 檢 視 下列 ： 1 丄 首 先， 上述 G ) 中 所鑑定之DNA是否編碼 ™- 具有 蛋 白 水 I 解 活 性之 N la ； 1 1 第 一 ,蛋 白酶 疋 否 切割所欲的 胺基酸序列 1 1 第 二 ♦ 田 N la為與- -所欲的異質性蛋白質 以 一類 似 病 母 1 I 感 染 細胞 中存 在 之 方式共同為 融合蛋白質之一部分時， 1 1 N I a是否仍展現出蛋白酶活性 和 1 1 第 四 1 锻 由切 割 此 類融合蛋白 質所取得之任何異質性蛋 I | 白 質 是否 維持 兀 整 性，結構和 功能。 1 1 -61- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX29?公釐） 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（k ) 由於HI a本身為由一病秦前驅物多肽切出所産生，因此 N I a順反子並具有起始密碼子。因此，其需於N I a基因之 5 ’終端加入起始密碼子A TG HI a基因之3 ’终端亦必需於 相同0 R F中與I L - I ΐ基因之5 ’終端連接。為解決此些問題 ，偽使用聚合_鍵反應（PCR)技術藉由利用存在於NIa基 因中心之5( h ο I切割位置而將Ν I a修飾：. 為加入起始密碼子A T G和適於選殖至N I a 5 '終端（Ν ΐ a 5 ’） 之限制酶N c ο I辨識位置，乃製備P C R引子。所製備之序列 為 5'GTCCATGGGG/UAAGTAA(iAGAACA3'(稱為 NSATG ;序列 IN Νο·3)和 5’ACTCTGAGACCGTGCTCGAG3’（稱為 NSX1 ；序列 ID Ν 〇 . 4 ),, 將 1 之 dTNP溶液（25mM之各 dATP,dTTP,dCTP和 dGTP) .1 0 X T a q緩衝液（由P r 〇 m e g q製造）和1 a g之各所得引子 加至1. ¢/ g之質體P N S 5 1 D Ν A中，並以再蒸餾水將混合液 加至1 0 0 u 1。將1 0 X T a q緩衝液製得之5 [I D Ν A聚合酶加 人，至進行PCR.、PCR程式為92T1 1分鐘，37P 1分鐘和 72T： 2分鐘之同期重覆20次，接著進行92t 1分鐘， 1分鐘和7 2 Τ' 3 0分鐘之單一周期。 將所得之放大D Ν Α令以苯酚萃取和酒精沈澱.並於5 % 聚丙烯醛胺電泳_上抱。一内含D Ν A之帶為以溴化乙錠 染色偵測，且將此帶由賴上切出並今以一裝配C e n t r i c ο η -3 0 (由A m i c ο n製造）之電溶離器（由A m i c ο n製造）進行電 溶離.，溶離後，將溶離之[)Ν Α片段使用C e rt t r i c ο M A in i c ο η ) 於4 °C下以7 , 5 0 0 x g離心4 5分鐘予以濃縮回收.:.所得之 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） I ί 人 衣 訂 * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部中央標隼局—工消費合作社印製 A7 五、發明説明（Μ ) D N A濃縮物再以苯酚萃取和酒精沈澱純化。 另外地，將lus之質體pKK 388-li由Clonetech製造） ί其中S a c I辨識位置已被X h ο I辨識位置所取代）以限制酶 N c ο I和S h ο I切割並以牛腸鹼性磷酸酶〔其後簡稱為C I A P ;由寰酒造製浩]去礤酸化。將所得之D N A以連接套組（ 由寰酒造製造）與亦如上述以N c ο I和X h ο I切割並去磷酸 化之100ns PKK388-1連接，並將由此所得之重組DNA選 殖至大腸桿_ J Μ 1 0 9中：，經此取得於f> K K 3 8 8 - 1 t r c啓動 基因下游正常方位中具有一插入物之質體PKNI5’（圖2丨.-., 質_1^〇2〇-2[1(3¥35^013，1.等人（1991),卩£8$1. 283 : 199-202]方内含编碼R-11前驅物（Pre-IL-ΙΙ)和 具有分泌訊號序列之c D H A 此質體以限制酶B a m H I和A p a ί 切割，並將具有I L - 1 1前驅物（D r e - ϊ L - 1 1 )和S V 4 0啓動基 因之區域切出.將此H段連接至p B L U E S C (Π P T I I S K + 之B a m Η i和A p a I位置並再以限制酶5( h ο I和K p η I切割，産 生一编碼缺乏成熟IL-l(Hat-IL-ll)N终端蛋白質之基 因。 所得之Mat-IL-ΙΙΗ段（缺乏其卜終端）使用T4連接酶 偶合人事先已以限制酶X h ο I和K p n U刀割並亦以C I. A P處理 之Ρ Ο ΐ 5 '中。吾等命名為構築物p K N I 5 I L (圖3 )為將N I a 之C终端的待定序列經由A 1 a與M a t - I L - 1 1連接且同時保 持相同的讀框，乃合成四種P C R引子： 5'AGG/UAAGAGTTCCTCGAGC 3'(稱為 NSX2;序列 ID No:5)， 5，AATTGTTCATTCCAAGCACCTGGGCCACCACCTGGC 3，（稱為 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） km n^i Bn^i ^ ^^^1 ^^1^1 \OJ^^^^1 fetr^i n E^p— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) B7 五、發明説明) NSJ001P;序列 ID No:6), 5，GCCAGGTGGTGGCCCAGGTGCTTGGAATGAACAATT 3’（稱為 NSJ002H ；序列 ID No.7 ),和 序列 I D H 〇 : 8 >。 第一摘PCR反應為使甩NSX2和NSJ002N引子對，以PNS 51 DNA做為模板而進行，以放大编碼NIa C终端插入物 區域（命名為C HI 3區域）。另外地，另一個P C R反應為使 用NSJ001P和ILSAC引子對，以pNS51 DNA為楔板而進行 ，以放大编碼IL-11胜IfeN終端插人物區域（命名為5’IL 區域）,至於PCR程式，92t 1分鐘，37¾ 1分鐘和72t 2分鐘之固期重覆20次，其後進行92t： 1分鐘，37t： 1 分鐘和7 2 C 3 0分鐘之單一周期。由各P C R步驟所得之産 物以苯酚萃取並以酒精沈澱，且其後令以5%聚丙烯醯 胺穆電泳。將内含放大D N A帶之隱連膠切出並使用上述 電溶離法將D N A由嘐切Η回收結果示於圖4 c 所得之兩値放大DNA片段為引子NSJ001P和NSJ002N區 域，即CIN3 DHAH段3'終端部分和5’IL DNAH段之5’終 端部分，其於接甘酸序列中具有部分的同質性。因此， 經濟部中央標率局員工消費合作杜印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 若PCR再使用引子NSX2和ILSAC進行，則同質部分將會雜 交，使得可取得包括兩者基因部分之融合D N A ,此同質 部分像做為一連接部分（圖5>。依此，將回收之CIN3 DHA Η段和5 ’ I L D N A片段混合並做使用N S X 2和1: L S A C做為引 子再度進行PCR。此PCR程式由10値周期之：92t 1分鐘 -6 4 * 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（Η ) ,3 7 Τ ΐ分鐘和7 2 f 1分鐘；隨後以2 0個周期之：9 2 °C 1分鐘，4 5 1分鐘和7 2 T1 2分鐘；隨後以單一周期 之：9 2 Τ〇 1分鐘，5 5 t 1分鐘和7 2 °C 3 0分鐘所組成，： 以苯酚處理和酒精沈殿後，進行5 %聚丙烯醯胺嘐電泳 ，可得-C N I 3 I L D N A片段其中C N I 3和5 ' I L為融合。方法 示於圖5中 C N I 3 I L D N A Η段以限制酶X h ο I切割並將所得之片段使 用T 4 D ff A連接酶插人一事先以限制酶X h ο I切割並以C I A P 睨磷酸化之p K N I 5 ’中將所得質體選殖至大腸桿g菌株 JM109中，.為選擇一 CNI3ILH段已於正確方向插入之純種 条，乃由所得之純種集將質體萃取並使用引子N S X 2和 I L S A C進行P C R 使用此糸統，只有來自Μ段為插人正確 方向之純種系的D Ν Α帶為可被偵測的：取得Ν I a和M a t - I L -1 1為於相同讀框中經由一切割列G U - A 1 a連接之質體 P K S II N 9 (圖（3 ),, I ) A 1 A - I L - 1 1於細蘭細朐中之表現 摘帶質體p It S U N 9之大腸桿g (其後簡稱為0株K S U N 9 ) 於5 sn 1内含4 2 " 1 / si 1安比西林之L B培養基中，於3 7 °C下 振盪培養過夜。將2 . 5 m 1之此K S U N 9培養液加至2 5 0 m 1新 鮮之L B培養基（内含同量之安比西林）並於3 7 °C下培養直 到OD600mn達到Κ0.· 一旦0D6〇〇nm已達到U0,加入1PTG 至終濃度0 . 1 m Η並將混合液於2 8 °C下再振盪培養1 2小時ώ 依據完全相同的步驟製造第二培養液，除了含1 m Η濃度 之I P T G之最終培養物於2 8 °C下培養3 6小時或更久，以取 -6 Γ)- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) " 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（“） 得成熟I L - 1 1 (其具有Η -終端P r 〇 ) „ J )西向點漬. 進行西向點漬以測定P K S U N 9於大腸桿菌中是否具有 機能性及亦測定構築之重組基因是否表現C. 以I P T G所誘發之各1 2和3 6小時之培養液再如下處理。 由2 m丨之培養液中以4 Γ 3 , Ο Ο Ο X g離心5分鐘回收細胞 ，並將丸狀物懸浮於1 0 0 u 1之2 0 m Μ硼酸納緩衝液中（以 0 .丨H H a Ο Η調整至ρ Η 9 . 0 )。所得之懸浮液以設定8之音 波振燙器（H a n d u s 〇 b i c 1J R - 2 Ο Ρ ,由 Τ 〇 m y S e i k 〇 公司製造） 處理2分鐘，以弄碎細胞並其後於4 ‘C下以1 Ο , Ο Ο 0 x g離 心1 0分鐘。.固收内含可溶蛋白質部分之上清液。將5 ii 1 之上.清液依L a e in m丨i法於1 2 % S D S聚丙烯醯胺電泳膠上 ϊβ Γ Laemra 1 ί , U . Κ . f 1 9 7 Ο ) , Nature 2 27 ： 68 0 - 68 5 ] 電泳後，將謂於一移轉鍰衝液< 2 5 m Μ T r ί s , 1 9 2 m M甘 胺酸.20%甲醇}中振盪5分鐘並使用Trans-Blot-SD Semi-Dry Transfer' Cell (由 Bio-Rad宵驗室製造）於 15 V 下處理1小時，將其點漬至一 Η P V D下膜（T r· a n s - B I 〇 t Transfer Medium,由Bio-Rad實驗室製造）上，:.所點潰之 P V D F膜於P B S ~ T w培養基中清洗1 0分鐘，將已清洗之P V I) 下膜於3 7 t：移轉至内含5 %脱脂牛奶（由雪印乳製品製造 }之P B S - T w中1小時以進行阻斷（b 1 〇 c k i n g > t, 阻斷後，將P V D F _再以P B S - T w清洗1 0分鐘一次及5分 鐘兩次，並於其後移轉至已於P B S - T w中稀釋1 0 , 0 0 0倍之 抗-I L - 11兔血清.並於3 7 t下培養2 0分鐘。此P V D F膜其 -66" 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X 297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 459046 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ br ) 1 1 後 再以 P BS - Tw 清洗1 0分 鐘 -一次及5 分 鐘兩 次 1 1 其後 將此 P V DF膜移轉 至 已於P B S - Tw 中稀 釋5 , 000倍之 \ 1 以 辣根 過氣 化 酶標記之 抗 -兔I g G山 羊 抗體 (由A in e r μ h a m 請 先 ! 製 造）， 並於3 7 °C下培養2 0分鐘，.於其後， 將Ρ V D F膜再 閱 讀 1 以 PBS- Tw清 洗 1 0分鐘一 次 和各5分 鐘 4 --k Γ. 背 面 1 | 之 1 於此 再度 清 洗後，將 P V D F膜以加 強 化學 發光 (ECU 注 意 1 1 測 試劑 (由A me r s h a m製浩） 處理，並 將 PVDF 膜與 X光H 接 事 項 1 1 再 Ϊ --^1. 觸 3 0秒 至5 分 鐘以使與 抗 -IL-11 抗 體 反應 之帶 顯現c 填 寫 本 袈 上述 西向 點 清之結果 1 由1 2小時 和 36小 時之 培養液 均 頁 1 1 可 偵測 到對 應 於約5 0 k D a和约2 3 k D a 分 子量 之訊 號帶。 此 1 1 2 3 k D a帶基本上展現與做為對照之成熟I L - 1 1相 同的移 動 1 I 性 „因 此， 此 2 3 k D a訊號帶顯然為己被N I a 之蛋 白水解 活 1 訂 性 在G 1 η - ή 1 a連接序列切出N I a / I L _ 1 1融合蛋白質的T L - 1 1 1 「其 可推 知 較重的帶 (5 0 k D a )為未切割之融合蛋白質。 1 I 此後 ,由 1 2小時培養 所得之2 3 k D a蛋白質稱為2 3 k D a 1 1 -0 N且由3 6小時培養液所得之2 3 k D a 蛋 白質 稱為 23kDa~ 3 6 1 L it r K ) 純.化. ..2.3 . .k. I) 51〜 DJ 和…2_3iD a.r 1 1 將 23kDa - 0 N 和2 3 k卩a - 36 hr蛋白質 纯 化， 以測 定其Ρ 終 1 1 端 之胺 基酸 序 列...依上 述 1 )所述之 相 同步 驟取 得各2 5 0 in 1 1 [ 之 12- 小時 和 小時 培 養液，各 培 養液 再如 下處理 〇 1 1 培 養液 於4 下以5 , 0 0 0 X s離心1 5分鐘並將丸狀物懸浮 1 1 於 10m! 之20 m ¥. 硼酸鹽緩 衝 m ( ρ Η 9 . 0 )中並各以- - F r e n c h 1 I 壓 榨器 和一 波振盪器 弄 碎於4 °C下以1 5,00 0 X g離 心 1 1 -67- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X29*7公釐） Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (Η ) 1 i 3 0分 鐘 後 可回 收可 溶性蛋 白 質 部分 9 為上 清 液 ο 1 1 所 得 之 可溶 性蛋 白質部 分 其 後使 用 P h a r m a c i a製造 之 1 F P L C 以 下 列條 件進 行弱離 子 交 換柱 層 析： r—V 请 J 先 1 柱 CM T 〇 y ο p e a r 1 P a c k 6 5 0 M (2 .2 X 20( ! m , 閲 讀 1 由To S 0製造） 背 A 1 I 之 1 溶 離 縷 衝 液： 注 意 1 I A = 1 0 m Μ ΐΐ 酸 -氫氧化納（ρ Η 9 · 0 ) 13« nM 事 項 1 1 再 氛化 鉀 4 寫 本 裝 B = 1 OmH硼 酸 -氫氧化鈉（ρΗ9. 0 ) > 1 3ϋ nM 頁 V_^ 1 I 氯化 鉀，400m Μ 氨化 納 Γ. 1 1 流 速 2 . 5 m 1 /分鐘 1 1 分 段 量 5m 1 / 管 1 訂 所 使 用 之 濃度 梯度 為由溶 離 液 A至 溶 離液 B 之 直 線1 弟度 1 歴 1 2 0分鐘 I ! 各 溶 離 部分 编以 酵素連 接 免 疫吸 收 分析 (ELISA), 以 1 1 I 鑑 定 内 含 IL-1 1之部分. 1 EI I S A如下進行 96孔口- 疫平 板 (Max is o a Ρ ； 由 H u n c I m 造 )之各孔口注入1 0 0 1 ί 内 含 1 u ε / 1 1抗 -IL - 11 鼠單株 1 1 抗 atut 體 5 0 ιηΜ碩酸 鈉緩 衝液（P H9 .6 )並將平板於3 7 °C下培 養 1 1 1 小 時 於其 後， 各孑L 口 以 Ρ B S - Τ培養基（ PBS内含0 1% I Tw β e η 20 )清洗四次。 1 1 上 述 所 得之 各FPLC部分 以 Ρ B S - Τ稀釋1 0 0倍 並 以 1 00 u 1 1 1 / 孔 Ρ 之 量注 人孔 口中 平 板 於37 V 下培 養 1 小 時 ，將 1 I 孔 □ 再 以 P BS - T清洗，且於其後在各孔口注入1 00 U 1以 1 1 -6 8 - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（w) p B S - T稀釋至终濃度 1 y s / m 1之抗-I L - 1 1兔I S G。 平板再於3 7 υ下培養1小時並以P B S - T清洗，且其後 在各孔口注人100^丨以？83-1'稀釋至3.000倍之鹼性磷酸 酶標記之山羊抗- 抗體（由（Hbco Bethesda研究實驗 室製造平板再於3 7 ΊΓ下培養1小時並以P B S - T清洗，. 各孔口注人1 0 0 w 1之鹼性磷酸酶受質溶液。平板於室溫 下再培養3 0分鐘至1小時後，將各孔口之顔色於4 0 5 n 下測量趿光度，以鑑定所欲之部分 將取自P PL C步驟之被上逑E L I S A步驟鑑定為含有與兔 杭-I L -〗1抗體反應物質之部分（分段编號1 9至2 5 )混合， 以 Cent.p「ep-10(由 Amicon製造）濃縮 100倍，並依 Laemmli 法於1 2 % S D S聚丙烯醯電泳膠上跑（參見前文U此隱其 後以上述西向點漬步驟中所使用之類似方式電點漬至一 Η P V I) F 膜上：，但使用 P r· 〇 b 1 〇 t 膜（由 A p p i i e d B i 〇 s y s t. e hi s 製造）做為P V D F膜。 點漬後，此膜以再蒸餾水充分清洗，以C ο ο πί a s s i e亮 藍R - 2 5 0染色，以5 0 %甲醇去染色，並將在西向點漬中 與抗-I L - 11杭體反應之蛋白質含有帶切出。 此蛋白質H終端之胺基酸序列使用一蛋白質定序儀（: A p p丨i e d Β ί 〇 s y s t e m製造）分析來自2 3 K D a - 0 H之與抗-i L -〗1抗體反應之帶的N終端序列被潮定為：

Ala-Pr〇-Gly-Pr〇-Pro~Pr〇-Gly-(序歹U ID Η 〇.9) 此序列對應於成熟I L -1 1蛋白質之胺基酸序列的-1至 + 6胺基酸序列，，基於此發現，可推知來自1 2 -小時培養 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） IJI - - - - - - ^ ^ - - - - j - -1 -1 [ n n (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（w ) 液，並與抗-I L -1 1抗體反應之2 3 K D a蛋白質為ή U Μ [.-] 1 依比，其顯然此蛋白質為由Ν I a之蛋白水解活性切割 N I a / I L - 1 1融合蛋白質之特定切割序列中的G 1 η - A 1 a位 置所産生-, 來自23KDa~36hr之與抗- U-11抗體反應之帶的N終端 序列被測定為：

Pr〇-fily~Pro_Pr〇-Pro_Gly_Pr〇-(^ ?fj ID No. 10) 此序列對應於成熟I L - 1 1之胺基酸序列+ 1至+ ?。依此 ，吾等可得到下列結論。 以I D T G誘發性.N 1: a / I L - 11融合蛋白質可於大腸桿® 中表現 藉由在誘發作用後進行1 2小時培養，此表現的fH a / I L - 1 1融合蛋白質被N I a之蛋白酶活性切割在恃定切割序 列中之G U - A I a胜呔鍵 於以N I a切割胜肽鍵後，於其N -終端具有額外A 1 a之 成熟I L 1為於大腸桿菌中表現。 藉由A 1 a - I L - 1 1表現確立後再培養2 4小時，則A丨a - I L -11成熟為IL-U,其中出琨在Ala-U-〗]N終端之AU 殘基刖被刪除。 基於上述發琨，可推斷由3 6小時培養後所取得之2 3 K丨)a 蛋白質為I L - 1 1之成熟型，其N終端為P r 〇 . 因此，確立Π. - U可以與Hi a以一融合蛋白質表現且N I a 之活性可切割一内含G 1 η - A 1 a之待定連接序列，以取得 A丨a - U, - 1 繼_培養削可取得成熟I L - 1 1 ,其中丙胺酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4C格（2丨0X297公釐） I, j 策 訂 f (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (1.9 ) 1 1 殘 基 由 存 在於 大 腸 桿 菌 中 之 因 子 而 被 刪 除 r 而 暴 露 出 脯 1 1 胺 醅 N - 終 J,tlT ife . \ 1 為 確 認 表琨 之 I L -1 1和A ! a -IL - 11 具 有 生 物 活 性 ♦ 乃 測 請 先 1 定 脂 肪 生 成抑 制 因 子 (AG IF ) 活 性 做 為 一 指 標 :1 事 實 上 IL- 閱 讀 1 11 具 有 脂 肪生 成 抑 制 活 性 已 於 先 前 被 證 明 [ Ka w a sh i ffl a , 背 1 I 之 1 I . 等 人 (1 99 1) FEBS L .283 ： 199- 2 02〕 〇 注 意 1 事 1 L ) m S. mi: 至jmmi也.上._之1.制效..果. 項 I 再 ··-J·.- 本 發 明 中所 使 用 測 定 AG IF活 性 之 方 法 如 下 使 用 me 購 S 填 寫 本 策 Aim WL 胚胎 m 維 母 細 胞 細 胞 % 3T3 - L 1 [ G r e e η , Η . 和 頁 1 I Ke hi n d e , 0 .( 1974 C el 1 1 ： 11 3 - 11 6] 所有情形之 1 1 細 胞 為 於 10% C0 5 — 90% 空 氣 之 混 合 溼 大 氣 環 境 37 cp 下 1 I 培 養 並 以 培養 基 A 繼 代 培 m C· 脂 肪 生 成 分 化 之 誘 發 作 用 1 訂 依 Ru b i Γ1等λ所述之下列步驟進行 〔R u b i η ,C .S ，等人 1 (1. 9 7 8 ) » J . B i 〇 1 .C he ΠΙ . 25 3 ； 7 5 7 0 - 7 5 7 8 ] i · 1 I 將 3T3- L1細 咆 懸 浮 於 培 養 基 A 中 ’ 至 密 度 1 . 0 > (1 0 4 1 I 細 胞 / m 1 ,播 種 於 -4 8孔口之多群簇碟（ 由 Co as t e f製造 丄 * 0 . 5扣1 /孔口） 上 t 並 培 養 1 培 養 3 天 後 * 此 細 胞 逹 到 1 匯 集 (c ο n f 1 u e n c e ) 培 養 基 其 後 更 換 成 新 鮮 的 培 養 基 A , 1 1 且 其 後 再 培養 2 天 * 此 培 養 基 更 換 成 脂 肪 生 成 誘 發 培 養 1 1 基 (培養基B)且同時加入0 .5ml 之 試 驗 樣 品 此 培 養 基 每 1 1 兩 天 更 換 以新 鮮 的 培 養 基 B 和 新 鮮 的 樣 品 1 [ 於 第 · 次加 入 試 驗 樣 品 後 之 彦 4 至 7 天 間 * 對 不 同 孔 ί 1 Π 於 不 同 次數 下 開 始 使 用 脂 肪 細 胞 保 持 培 養 基 (培養基 1 I C ) 代 替 培 養基 Β 更 換 孔 P 中 所 用 盡 之 培 養 基 .·> 1 1 -7 1 - 1 1 1 1 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 7^ ) 1 i 於 培 養基 C 中 培 養 2 天 後. 以5 96甲醛 固定 分 1 1 1 別 以 Π ί 1 Re d Of 1蘇木素將任何堆積於細 胞和 細胞核中 \ 1 之 脂 肪 頼粒 染 色 |-| 進 行 顯 撤照 相並計算堆積脂肪 顆 粒之 請 1 核 數 巨 和細 胞 數 g 〇 脂 肪 生成 率U R )為依下列公 式 計算： 閲 A R ( % )= :1 00 X 堆穑脂肪顆粒之細 咆數 巨 背 1 I 之 1 注 | 意 1 事 1 核之總數 項 I 再 固 定 細胞 和 以 0 ΐ 1 Re d 0和蘇木素染色 依Yo s h ϊ 0 Η ϊ t 〇 m 〇 填 寫 策 和 Sh 〇 ,i i r 〇 Ta k a y a m a 於” L e c t u r e s on C 1 i n i cal T e s t ϊ n g 尽 頁 1 I ”第1 2冊.” Pa t h ο 1 OR Μ y (1 9 8 2 ) ，由 I s h ϊ y a k u Shu P P an出 1 1 版 中 所 述之 方 法 進 行 1 1 Μ ) 測 定 脂…蛋. 白， 置- 脂.16. 腹 胤- ..制…@ — m—法—. 1 訂 依 Be u t 1 e Γ等人所述之方法進行潮定〔 B € u t 1 e r ,B .A . 1 等 人 (1 9 8 5 ) j. I m HI 0 no !. 13 5： 3 972-3977]., 脂 肪 生成 1 | 分 化 之 3T3 - L 1 細 胞 如 上 述 L )製 備，除了當誘發分 化 成脂 1 1 肪 細 咆 時並 未 加 人 試 驗 樣 品.. 取代以同時加入試 驗 樣品 m 新 m 的培 養 基 c 並 將 細 胞培 養U小時，- 1 於 其 後， 移 除 培 養 基 並 將細 胞以P B S (- )(磷 酸鹽緩衝 1 1 I 之 食 趨 ΠΤΧ 水， 由 K i s s u i. S e ί y a k u 製造）清洗 兩次 並於各孔 1 1 □ 注 入 3 0 0 w 1 之 培 養 D 並 再培 養1小時：, 各取出 100ml 1 1 之 培 養 上清 液 用 以 測 量 脂 蛋甶 質脂肪酶（ LPL ) 活性， 各 1 I 樣 品 呈 被 測 量 以 得 到 均值.. . 1 1 L P L活性為如N i 1 S S on -Ehle和 Schotz所 述測 定 ：N i 1 s s ο η 1 I -Eh 1 e , P .和 Sc h 〇 t z ,Μ .C .( 1976 ),J , L i P ! d Re s . 1 7 5 36 1 1 - 7 2 - 1 I 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 459〇46 A7 B7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 五、發明説明（W ) 1 1 -5 4 1 -h 述 所 得 之 上 清液各 與等量 之LP[,受質 溶液 混合 1 1 並 令 於 3 7 f 下 反 應 1 2 0分鐘。加入1 . 0 5 m !之0 .1 Μ碳酸 押 \ 1 緩 衝 液 (以0 .1 硼 酸 鉀 調 整至pH < 0 . 5 > 和 3 , 2 5 in 1甲 醇： 氣 請 1 仿 庚 烷ί 141： 1 25 τ 1 00 ( v / v )]之 混合液 並劇烈攪拌 閱 讀 1 以 停 \k 反應 1-1 混 合 液 其 後於室 溫下以 3，0 00 X g 離心 15 背 1 I 之 1 分 鐮 r. 水-甲醇層之Ξ Η 含量以 液體閃 爍計數 器計算：、 注 意 1 I αα 军 位之 LP L活性定義為毎分鐘産生1 y m 〇 1脂 肪酸 之 事 項 1 I 再 乂 活 性 ί·_ 受質 溶 液 中 之 13 mM甘油 三〔ί)， 10(h)- 3 Η 〕油 酸 填 本 m 藉 由 以三 油 酸 甘 油 酷 (由 S i s m a製造 )稀釋甘油 二- 〔9, 頁 1 I 10 (η )- 3 Η 1 油酸酯ί 3 7 .OGBq/ mol) (¾ Amers ham 製造 ), 1 1 其 後 於 矽顧 柱 層 析 上 純 化而製 得。 1 I 下 列 簧施 例 係 關 於 本 發明麩 胱甘呔 還原蛋 甶質之具體 1 訂 例 1 實 施 例 1 1 I 由 ΚΜ -1 02 Μ 胞 萃 取 聚 UL:―…―-RJfi 1 | 將 KM -102 細 胞 於 36 健 塑躍. 15公分 直徑之 培養皿中以 1 丄 内 含 1 0¾胎 牛 血 清 之 Is cove 1 s 修飾最 低必需 培養葚（ I Bo e r ΐ η s e r - H a η η he i πι )培養於細胞生長至匯集 後， 加入 1 佛 波 醇 肉豆 7Ε 基 醋 酸 fli (PMA)和鈣離子載體A23 18 7(S ί g πι a .) i 1 至 終 濃 度分 別 為 10 n g / tn 1 和 0 · 2 w H ,並於3 7 t:下 繼績 培養 1 1 於 3 . 6和1 4小時後收集1 2痼培養皿， 且各分別 溶於 硫 1 1 氡 酸 胍 溶液 中 並 收 集 液 體層，-. 1 t 聚 (A )+ RN A之 單 離 基 本上如 ：Hoke υ 1 a r C t 0 π i n g - A 1 I La b 〇 r η t 〇 r y Μ an u a 1 " r Μ a n i a t is,T.等人（1982) 第 1 96 - 1 1 -73- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 v， A7 B7 五、發明説明（P ) 1 9 8頁]所述進行，、下列為步驟之詳細描述^ 各回收之液體層分別如下處理。將液體重覆地由一裝 設有2〗G注射針之1 0毫升注射槍身油出並排出。於一相 配於RPS40-T離心機（Hitachi koki)旋轉容器大小之 Polyaromar離心管中事先加人3ml之5.7H CsC卜0.1EDTA (P Η 7 . 5 )溶液。其後將細胞製劑覆蓋於該管之溶液上， 直到該管裝滿 於2 0 t下以3 0 , 0 0 0 r ρ ra離心.，1 8小時後，將所得之九 狀物懸浮於4 0 0 w 1之蒸餾水中，隨後進行酒精沈澱。捋 該九狀物溶於4 0 0 w I之蒸餾水中並攪拌加入等量之氛仿 / 1 - 丁醇混合液（4 : 1 v / v )並離心收集水層，。再進行一 次酒精沈澱，並將丸狀物溶於6 0 0 w 1之蒸餾水中，以得 f部Ο A。由各3 , 6和1 4小時所得之P M A / A 2 3 1 8 7刺激樣品 ，可取得約4 . 5毫克之全部R N A。 由此方式所得之三種類型之全部R N A各6 0 0 // s被聚集 並進行寡（d T )纖雒素柱層析，以純化聚（A ) + R N A。 將兮部R N /1溶入吸附緩衝液中並於6 5 下加熱5分鐘。 所得溶液載入裝有吸附繅衝液之募（d T )纖維素柱（ P h a r m s c U ,第7堅），拔以溶離溶液進行溶離，以回收 100t/g 之聚 U)+ OA-, 實施_ Μ 2 製備c_Mi廬. 以 Okayama-Be「g法製備- cDNA庫，-, g之聚（A)+ RNA和24單位之逆轉錄酶（Seikagaku -74- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^ 、取 訂 | (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（W ) C 〇 r p .)於2 0 w 1之逆轉錄酶溶液中，4 2 t下反應1小時：、 加入2«1之0.25只〖0丁4和11/1之10%505以停止反應， 並於其後以2 0 w 1之苯酚/氛仿混合液（1 : 1 v / v丨將其 去蛋白質化。離心移除蛋白部分後，於上清液中加入2 0 w I之4M醋酸銨和80ίζ 1之乙醇，並於- 70t下冷卻15分 鏡，於其後.離心分離收集沈澱物，以7 5 %；酒精清洗並 於減壓下乾燥。 將乾燥之沈澱物溶於1 5 w 1之終止轉移酶反應溶液並 於3 7 °C下溫熱3分鐘。於此時間終了，於反應溶液中加 人18單位之终端去氣核甘酸基轉移酶（Pharmacia)並令 其反應5分鐘-加入1 w 1之0 . 2 5 Μ E D T A和0 , 5 ΰ 1之1 0 % 5 D S以停止反瞎並以苯酚-氣仿去蛋白質化（如前述）具離 心移除蛋白質部分。收集上清液並與1 5 w 1之4 Μ醋酸銨和 6 0 w I之乙醇充分混合，.此混合液於-7 (TC下冷卻1 5分鐘 並以離心收集沈澱物。 所得之丸狀物溶於1 0 « 1之限制酶緩衝液中.並加入 2 . 5單位之限制酶H i n d I I I ,令於3 7 Τ」下靜置1小時，以 進行水解^ 反應溶液以苯酚-氛仿去蛋白質化後.酒精沈澱，並 將上清液於-7 0 °C下冷卻1 5分鐘，.:，離心收集沈澱物並溶 入 1 0 w 丨之 T E 緩衝液：1 0 m Μ T r i s - H C 1 ( p Η 7 . 5 )和 1 m Μ E D 'Γ A 1中.-.將1 u ]之此溶液製成1 0 w 1内含1 0 m Μ T r U - H C 1 (pH7.5), ImM EDTA, lOOmM NaCl 和 lOng寡（dG)_尾連接 子 DN/\「3'_ 寡（dG)_ 尾 pL-1 Kindlll連接子，Pharmacia〕 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ,斧 訂

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（料） .隨後以6 5 °C加熱5分鐘並於4 2 t1溫熱3 0分鐘反應混 液冰水冷卻，隨後加入1 Ο 1之1 Ο X建接酶緩衝液，7 8 w 1 之蒸餾水和8單位之T 4 D Μ A連接_。反匾溶液保持於 1 2 T1下過夜 次日，將反應渥液與1 0 w 1之1 Μ K C 1， 1單位之核糖 酸酶Η，3 3單位之D Ν Α聚合酶I . 4單位之Τ 4 D Ν Α連接酶， 0. 5 w 1之 dNTP溶液（20mM dAΤΡ , 20mΜ dCTP.20mH dGTP和 20mM dTTP>和Ο.ΐϋ 1之50i；s/ni丨牛血清白蛋白（BS/U混 合，並先於1 2 溫熱1小時且其後於2 5 °C下溫熱1小時 。於其後，反應溶液以蒸餾水稀釋五倍並立即使用 Hanahan法 ί Hanahan, D. <1983) J.Moi. 8^01.166,557-5 8 0 ]將大腸桿菌D Η 5 c(轉形，籍以製備Κ Μ - 1 0 2細跑之 c ί) Ν Α 庫 實胞例_ 3, 製備寡核1.酸..探....針._ 基於細胞激動素m R N A之3 '非轉譯區中之A U U U A序列， 化學合成15-鹼基寡核甘酸5’-TAAATAAATAAATAA-3’（序 列I D N 〇 . 1 3 ),命名為A T T - 3。使用3 8 0 B自動D N A合成儀 (Perkin-fniner· Japan Applied Biosysl, ems)依其所附 手册提供之方向進行合成，、所使用之方法為C a r u t h e r s 等人所述之憐醇胺法[M a 11 e u c c i，H . D .和C a r u t h e r s，M . H.(1981)J. Am,Chem.Soc.l 03,3185-319 1.]。合成 15-mer· 後，將所得之寡核甘酸自支持物分離並移除保護基，_,將 此寡核甘酸溶液冷凍乾燥以得一粉末，其後溶於蒸餾水 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

.1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7 _ 五、發明説明（5 ) 中並於-2 0 °C下貯鹺直到使用時.， 實施例4 篩選cDM.庫 將6 , 5 0 0産自上述實施例2。c D Η A庫之閡落依G r u n s t e i η 和 HonKness所述方法〔Gt-unstein,M.和 Hogioe_ss，D.S,( 1975)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961-3965] 固定於一硝基纖維素過濾膜上，實施例3製備之A 了 T - 3 探針依標準方法（參見"Molecular Clon〖ng-A Laboratory M a n ii a丨Μ以β P進行5 ’ -標記，並將標記探針用於菌落雜 交作用. 預雜交作用為於3 7 t以下列進行3小時：6 X S S C , 1 X D e n h a「d t 溶液，0 . 2 5 % S D S， 0，0 5 焦磷酸鈉和 1 0 0 w g / m 1之變性鮭魚精子I) N A ,:，其後雜交作用為於3 1°C以下 進行過夜：6 X S S C , 1 X丨)e n h a r d U容液，1 7 // s / m 1之酵 母t R N A和0 . 0 5 %之内含32 P -標記探針/\ TT T - 3之焦磷酸銷。 於次日，將硝基纖維素過濾膜於室溫下以内含0 . 0 5 % 焦礤酸納之6 X S S C溶液清洗2小時_.後缠以放射自顯術 得到3 3値陽性純種系 質體D N A以下列標準步驟由陽性純種糸中萃取=任意 灌取數個純種集並以雙去氣法測定其部分c D N A之核苷酸 序列...I比些部分序列其後偽經由艏人電腦檢視與Ε Μ B L或 G e η B a n k資料庫中所登錄之核甘酸序列的同質性且可確 知某《以A T T - 3偵測之純種糸的部分序列與A 1 u重覆之部 分具有同質性〔Schmid, C.W.和 Jelinek, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 __B7 _ 五、發明説明（外）

Science 216, 1065-10701 - 内含A U重覆序列之D N A Η段K F列標準步驟，由人類 基因組D Ν Α製得並以Ώ Ρ標記此標記D Ν Α為於使用上述 所鑑定之3 3艏純種系的菌落雜交作用中被用做為探針， 日.其顯然纯種糸中之1 2腩為具有A 1 u重覆測定剩餘2 1 個純種条各c D N A插入物之長度，旦確知其S度可為5 0至 3 , 6 0 0鹼基之範圍不定，， 對剩餘2 1阔純種系之c D N A插人物進行限制酶繪_，且 部分之核If酸序列如上測定，、此些部分序列其後如上經 由個人電腦檢視與Ε Μ B L或G e η B a n k資料庫所登錄之核If酸 序列的同質性，並_出具有新穎序列之純種条 菁施例5 純種条H o . 3 1之北向_雜交作甩... 純種/备之一，純種系N 〇 . 31 (命名為p c D - 3 1 )具有約Γ> 6 0 b p 之c I) tU捅人物，由p d 3 1之c D N A插人物取得P s t I - A a t ϊ H段（2 9 2 b p )並以32 P檫記用以做為使用由K M - 1 0 2細胞 製得之聚（A > + R N A之北向點漬步驟中的探針（i衣類似實施 例1之步驟）.、此雜交作用為用以測定相對於P c D - 3 1插人 物之天然存在ffiRHA的長度，. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 北向雜交作用之步驟如下，由K Μ - 1 0 2细胞製得5 . 5 « 1 之聚（A ) + R N A Η.於5 0 :C下於1 Μ乙二醇，5 0 %二甲基亞 砸（ί) M S 0)和0 . 0 1 Μ磷酸氣二納（ρ Η 7 . 0 )之混合液中培養1. 小時於眈時間終了，於培養混合液中加入4 /j 1之電泳 色素並於1 %珣脂_膠上於〗X 了 A Ε中進行電泳，、 -78-本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 459046 B7 五、發明説明（π ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

電泳後，將瓊脗_瞟上之R N A使甩2 0 X S S C ,以毛細管 轉移法（襄見”Molecular* Cloning-A Laboratory Manual )過夜轉移至尼龍膜嫌紙（Bio RadiZeta-Probe)。轉移 後，將濾紙以2 X S S C溫和清洗，風乾，並額外於8 0 °C下 乾燥2小時，以固定m R N A p e D - 3 1 之 P s t I - A a t I Η 段使用 M u 1 ti p r U e D H A 標記条統 (A κι e r s h a hi )以 32 P 標記：， 預雜交作用為於濾紙上，3 7 T」下於一内含5 x S S C P , 2 . 5 x D e n h a r cl t游液，5 0 %甲醯胺，1 0 in H磷酸氣二鈉（p Η 7.0), 0.5%SDS和100u 變性鲑魚精子DNA之溶液 中進行3小時。 雜交作用其後為於濾紙上，4 2 "X〕下於一内含32 P -標記 探針，5\330卩，1\〇6以3「<^溶液，50%甲醱胺，1〇1^ 磷酸氣二納U Η 7 . 0 ) , 0 , 1 % S D S和1 0 0 w 1 / ra 1變性鲑魚 精子D ff Α之溶液中進行過夜；、次日，濾紙先於3 7 °C下， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 以一内含5 0 %甲醋胺，5 X S S C和0 . 1 % S D S之溶液清洗1 小時，其後於同溫下以一内含4 0 %甲醯胺，5 X S S C和 0 . 1. % S D S之溶液清洗2小時，且最後於室溫下以2 X S S C 溶液清洗1 5分鐘。後續的放射自顯術顯示出p c D 31純種 桊之cDNA捅人物並非為全長度，且對應於eRHA之全長度 為3 . 9 k b (基於分子鼉標誌之校正曲線所測得）、， 實施例6 製備筛選.純缓i p d D - 3.1_. e_D.N. A、之盤_1直. 使用cDNA合成条統Mus和cDNA選殖系統<λ stlO,適 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） A7 459〇46 B7 五、發明説明（Μ) 應子法（adapter method,由Amersham提供>_製備新鮮的 cDNA 庫' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由（C Μ ~ 1 0 2細胞萃取出之5 u s聚（A ) + R N A (依類似實施 例1.之步驟）和1.0 0單位之逆轉錄酶於5 0 w 1之逆轉錄酶 反應溶液中，4 2 t下反應4 0分鐘。.於其後，於反應溶液 中加 \ 2〇wi：i 之「ct-32P〕dCTP,93.5«l 之第二股緩衝 液，4單位之核_核酸酶Η和1 1 5單位之D N A聚合酶I (所 有以套組提供），首先於1 2 υ下培養1小時，其後於2 2 °C 下1小時最後於7 0 f下加熱1 0分鐘。加熱處理後，將 1 0單位之T 4 D N A聚合酶（以套組提供）加至反應溶液中並 含於3 7 t下反應1 0分鐘，-. 反應混合液其後進行苯酚-氛仿去蛋白質作用，，將反應 溶液離心並收集上清液，且與2 5 0 w 1之4 Μ醋酸玆和1 tn 1之 乙醇温合均勻r，混合液於-2 0 10下冷卻過夜並離心收集 沈澱物所得之丸狀物溶於3 0 /i 1之無菌水中，:，移出1 0 w I 溶液並加至2 w 1連接酶/激酶鍰衝液，2 5 0 p m ο 1 e之E c 〇 R I 適應子和5單位之T 4 D N A連接酶（所有均以套組提供）之 混合液中且將此混合液於15 υ下培養過夜。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將全部的反應溶液被載入尺寸分段管柱（套組提供1中， 以移除E c 〇 RI適應子，、反應溶液以1 2 0 w 1 —份收集並將 各份與2 0 0 u 1之0 . 2 5 X T E緩衝液混合，捋第1 0和第1 7部 分匯集並以丁醇濃縮至總體積1 2 0 u 1 -, 全部的濃縮製劑其後與55w 1之無菌水，20w 1之連接 酶/激酶緩衝液和4 0單位之T 4聚核甘酸激酶（所有均以 本紙張尺度適用中國國家揉隼（CNS ) A4规格（210X297公釐） ^ ο 9 Ο 4 ti Α7 Β7 五、發明説明（W ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 套組提供）狺合，並於3 7 T〕下培養3 0分鐘，：於其後，反應 混合液以苯酚-氛仿法去蛋白質化三次並以酒精沈澱且 於-2 (Γ€下冷卻過夜.，所得沈澱物以離心收集並溶於1 0 u 1 之無蘭水中.以得c D Ν Α樣品η 於各2u 1之cDNi\樣品中加入I// 1 Eco「I猜之AgtlO, I之連接酶/激酶緩衝液和2 . 5單位之T 4 D Η A連接酶 (所有均以套組提供），隨後於1 5 °C下培養過夜。，内含 4 w 1 c I) N A樣品之樣品以相同方式製備。各樣品其後再 如下處理.、將所得之反應溶液金部先加至1 0 " 1之萃取 物Α (以套組提供）Η其後將此混合液加至1 5 w 1之萃取物 β (以套相提供），並將此混合液於2 (TC下培養2 0分鐘， 以今其産生生髖外装镇反應（p a c k a I n g r e a ίί t丨ο η >。 於其後，加人4 7 0 ra 1之S M媛衝液並其後於4 t：下貯存。 以1 0 m H M s S 0 4處理之大陽捍ϋ菌株N Μ 5 1 4其後以貯存 溶液感染，以製造Κ Μ - 1 0 2 c D Ν Α之λ g t 1 0庫。 實施例7 篩選e DM庫 將2X 10s個得自實施例6製得之狺合cDNA庫的噬菌 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 >之 am分 sh公 e 9 Affl個 N 十 d 於 〇 菌 iyb桿 (H腸 上大 紙的 滤染 龍感 .¾被 於之 定得 固製 驟 6 步例 列施 下霄 以將 斑 形 板 平 每 得 使 養 培 上 板 平 之 基 養 培 B 定 固 含 内 至 X 2 上 板 平 於 壓 輕 紙0 龍 尼 得 斑0 職 値 考 參 供 18以 用號 使記 C 做 上 置 板位 平定 至選 移俩 轉 3 斑於 0 噬 使 膠置 該靜 將下 並 P _ Λ1 洞 打 紙 濾 將 針 射 注 於 今 紙 濾 本紙張尺度埠用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X2?7公釐） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (叫 1 1 5 牵 1 0分 鐘 且於 其後 剝 除 並 浸 入 m 性 溶 液 (0 .1 N Na 0H , 1 1 1 . 5 Μ N a C 1 ) 2 0秒 甘 後 將 濾 紙 轉 移 至 中 性 溶 液 ! 0 . 2M \ 1 Tr is -HC 1 (P Η 7 . 5 ) , 2 X SSCP ] 20秒 至 1 分 JM f 且 其 次於 fK 請 .1 先 1 宰 溫 下風 乾 2小 時。 取 後 t 濾 紙 於 80 下 乾 燥 2 小 時。 閱 讀 1 I 奮 施 例8 背 面 1 I 之 1 探 針 製備 和 雜交. .作_甩.. 注 意 1 举 1 使 用Mu u i p r 1 me D N A 標 記 系 統 將 來 自 PC D - 3 1 之 Ps t I 項 I 再 -A a t f片段和E c 〇 T221 -A at I .H 段（ 22 3b P ) 榡 記 以 由 pc D-31 4 寫 本 - (由實施例4 取得製備32 P -標記探針.Λ 使用上y έ探針於 頁 V_^ 1 I 奮 施 例7 中 所得 之濾 紙 —t 進 行 噬 -Η m 斑 雜 交 作 用 1 1 預 雜交 作 闬蒱 由將 濾 紙 置 於 . S096 甲 酵 胺 5 X S S C Ρ 1 1 1 2 . 5 X D e η hard t溶液， 0 ,0 1 Μ m 酸 氫 二 m (pH7 .0 ), 0.5,¾ 1 訂 SDS 和 1 0 0 ί ί 1 / m 1變性鲑魚精子D H A浴 中 並 於 37 V 下 培養 1 2 小 時而 進 行、 1 I 雜 交作 用 藉由 將濾 紙 置 於 一 内 含 上 述 製 備 之 32 P標記 1 I 探 針 和50 % 甲醯 胺， 5 X S S C Ρ， 1 X De nh a r d t 溶 液 * 0. 0 1 Μ 1 1 m 酸 氣二 納 (pH7 .0 ), 0 . 1% SDS 和 1 00 U g/ ml 變 性 鮭 魚精 I 子 DN Α之反應溶液中並於3 7 下培養過夜而進行， 1 I 次 R， 濾 紙先 於室 溫 下 以 内 含 50% 甲 pim 胺 9 5 X S S C 1 ί 和 0 . 1 % S D S 之溶 液清 洗 3 小 時 » 且 其 後 於 室 溫 下 以 2 X SSC i f 清 洗 5分 鐘 放 射自 顯 術 顯 示 出 在 此 初 次 篩 選 中 取 得80 1 1 個 陽 件純 種 %，， 1 1 每 次使 用 鑑定 為陽 性 之 純 糸 再 重 覆 宵 施 例 7 和 8之 1 I 步 驟 H '-k (四次筛選） - Ά 取 後 取 得 17 個 陽 性 純 種 % ,由 1 1 -82- 1 1 1 ί 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐} 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 5 9 0 4 6 A7 B7五、發明説明（q) ΐ 7腩純種条各軍離出c D N A並以E c 0 R I切出插人物.，各c D N A 插人物之長度以瓊脂糖膠電泳調査並單離出相對於原始 mRNAf長度，具有3.9kbp之cDNA插人物的純種#：no.31-7 奮施例9 純種集N 〇 . 3 1 - 7之限.亂隨_.繪.1 將純種系η 〇 . 3 1 - 7以E c 〇 R ί切開，以單離並純化内含c D H A 插λ物之3 . 9 k b Η段，.其後使用T 4 D N A連接_將此片段插 入p If C 1 8中。大腸捍M D Η 5 ct以此新質體進行轉形。選取 抵杭安比西林之轉形細胞且具有3.9kbb cDNA插入物之 純種条p 1J C K Μ 3 1 - 7為經由將D N A Μ E c 〇 R I切開並令切割之 D Ν Α進行瓊脂_ _電泳而鑑定。 PIJCKM31-7以各限制酶 Hindlll, SacI,Xbal,SmaI， B s 1 I I，E c ο T 2 2 I和A c t I ,或其配對予以切割，對各Η段 進行璁脂糖縣電泳並使用λ H i n dl I I /必X 1 7 4 H a e I I :丨標記 做為指標測最各H段之長度.，所得之限制酶輿圖示於圖 7 ,, 實施例1 0 純種系Ro，31-7.之..序列測_定 p IJ C K Μ 3 1 - 7之c D H A插人物的全部核苜酸序列為使用Μ 1 3 噬舗體以雙去氧法測定，.此外，序列之一部分以3 7 :·ί A D N A 定序儀(Perkin-Elsier Japan Applied Biosystems)分 析n所得之核甘酸序列為所附序列表之I D N o . 1 1 ,, PUCKM31-7之cDNA插人物為3815鹼基長，且顯然具有 由5 49値胺基酸所組成之開讀框，起始於甲硫胺酸。顯 -83- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標隼局員Η消費合作杜印製 ή^^〇45 Αν Β7五、發明説明（A ) 然缺乏聚U )尾部，.p C D - 3 1插人物之3 ’终端鹼基序列與 純種条PUCKM3 1- 7之序列相比，可知pUCKMf(31-7插入物 僅失去聚（A ) II部部分（圖8 ), Ε Μ B L和G e η B a n k核甘酸資料庫和N B R F和S ΙίΙ S S - P R Ο T資 料庫被評估以分別比較齡之胜呔序列Irb較鹼基和胺基酸 序列。最接近之配對為與人類麩胱甘呔還原酶3 5 . 3 %同 罾性之胖）fe序列。依此，可推斷P C K Μ 3 1 - 7之c D N A插入 物的[)R F顯然編碼-新穎多呔。此新穎多fe為所附序列表 之序列I D N 〇 1 2， 實施例1 1 新潁多Jfe之表現和純1, 構架-高表現載體並於C0S-1細胞中表琨。 p U C K Μ 3 1 - 7以H i n d 1 II切割並依下列標準步驟將内含 c D N A插人物之3 0 0 3 i> p K段單離並純化所得Η段之终端 使用一 D Ν Α鈍化套組（D N A b 1 u n t i n s k i t，賨酒迪）予以 鈍化.-, 同時，將高表現載體PcDL-SRa 296〔 Takabe,Y.等人 „ Π 9 8 8 ) Μ ο 1 · C e 1 1 . B i 〇 卜 8，4 6 6 - 4 7 2 ]以 P s t I 和 K p m I 切 割並使用D N A鈍化套組將其終端鈍化。其後將此鈍插人 物以T 4 D N A連接酶連接至反應中之鈍化質體。其後以氮 化鈣法將此D 轉形至大腸桿菌，並選出A m p R轉形體且 分析生物體中所保留之質體D N A。 明確地，將cDNA轉錄作用方向與SRc(啓動基因方向相 同之蘭株，經由以H ί n d I I [和B d I切割質體後，以ί奠脂醣 -84- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 4 4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五 '發明説明（^ ) 瞬電泳找出一 8 0 0 b p Η段而選出，且所選出之質體命名為 ρ S R ct 3卜7 (圖9 ) ,., S R α啓動基因包括S V 4 0起始之啓動基 因和Η T L V - 1長終端重覆（L T R )之R - ϋ 5序列，旦具有強於 僅S V 4 0起始之啓動基因1 0至1 0 0倍之啓動基因活性。 其次，以所得之質體P S 1? « 3 1 - 7將C 0 S - 1細胞轉感染。 [f) S - 1細胞之轉感染作用使用G Τ Ε - 1基因導人裝置（ S h i m a d z u )以電穿孔作用進行，， COS-1細咆於七铜 150cm3燒瓶，各内含2 5 ml之DMEM {内含1 〇 %胎牛血清）之底部生長至半匯集。收集培養液 並各以3 m丨之胰蛋白酶-E D T A溶液（1 0 X溶液，購自S i g m a ) 處理巨令於室溫下靜置直到細胞分離.，其後加入1 ra 1之 未活化胎牛血清和9 m !之新鮮的胰蛋白酶-E D T A溶液並以 離心收集細胞，..收集之細胞以P B S (-)缓衝液清洗兩次並 懸浮於P B S (- >鍰衝液至密度6 X 1 0 7細胞/ n> 1。 同時，以氛化絶法製備質體D N A並以P S β (-)缧衝液調 ^ 2 5 0 u g / in 1 ., 將上述P B S (-)製劑之細胞和質體各2 0 ν 1混合並將此 渥合液置於一内含以2 m m間隔放置電極之室中：.對該混 合液以1秒鏡之間隔施以兩値6 0 0 V脈衝，各持缠3 0 w秒·· 將電極宰於4°C下冷卻5分鐘且其後將内部之細胞-DH A 混合液與1 0毫升内含1 0 %胎牛血清之D Μ E Μ混合。將此混 合液轉移至一培養皿並於3 7 t下5 % C 0 ?_環境下培養過夜 次曰，垚棄培養上清液.以無血清D Μ E Μ清洗細胞且懸 浮於1 0 η丨之D Μ Ε Μ中並於3 7 °C下培養3天，於其後，收集 ~ 8 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -'° 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 _B7_ 五、發明説明（糾） 細胞上清液。 由陰性對照組亦收集培養上清液β陰性對照組使用内 含無CDNA插入物之質體pcDL-SRcr 296,但其以類似試驗 培養液之方式製備。 陰性對照組和試驗培養液之培養上清液各lral分別如 下處理。上清液首先以三氨醋酸（TCA)處理以沈澱蛋白 質，並以離心分離收集沈澱物。所得沈澱物以冰冷卻之 丙酮清洗並風乾且於其後溶於内含2 -氫硫基乙醇之SDS -聚丙烯醯胺膠電泳（SDS-PAGE)樣品緩衝液中。SDS-PAGE 其後於還原條件下於一 12.5%膠上進行。 使用銀染色試劑"D a i i c h i "(第一化學偵測）之銀染色 為於電泳後在帶上進行。來自試驗樣品培養上清液之數 艏特定帶（分子量：約60,000)被染色β 由於编碼於pSRa 31-7之多呔的分子量為約60, 000, 因此其亦可由胺基酸序列推知，後轉譯修飾作用以添加 糖側鍵並未為真，可推斷此數個持定帶對應於由PSR« 3 1 - 7之c D N A所编碼之多肽。 曹旃例1 2 恝備r:ns-iM_：>高宑描皙鵲 下列步驟為證明實施例11中所鑑定之數個持定6QkDa 帶同於pSRa31-7之插入物所编號之多|fee其亦欲測定 此多呔之N-終端胺基酸序列。依此，乃製備一純種条， 其中六個額外His殘基為pSRtf 31-7插入物所编碼多呔之 C終端编碼，直接位於停止密碼之前。組胺酸殘基對 -8 6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210'乂297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

• T

、1T 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7_ 五、發明説明（奴）

Ni2 +具有高親和力且此目的在於表現一具有組胺酸六 元體（6XHis)之多肽，其可使用裝有Ni2+之親和性樹 脂柱予以純化。 首先，使用一自動的DNA合成儀394(Perkin-Elmer Japan Applied Biosystems)合成並純化一 66 値基赛 核甘酸。 5'-CTAGCGCTCT6GGGCAAGCATCCTCCAG6CTGGCTGCCGCCACCA CCACCACCACTGATCTAGACT-3，（序列 ID Νο.4) 和互補之66鹼基股。將兩個寡核甘酸製劑混合並於70 °C 下培養30分鐘且於37 °C下額外溫熱30分鐘，以令其黏接 〇後鑛地，使用T4-寡核甘酸激酶將其終端去磷酸化。 將所得之雙股（ds)H段使用T4 DNA連接_連接至已事 先以EC047III切開之ρ!ΚΚ31-7φβ其構築示於圖10。大 腸桿iiDH5a:經由氱化鈣法以此DNA轉形並將所得之轉形 菌株選出並篩S,可得pUCKM31-7Hise藉由分析此 pUCKH31-7His之相關的鹺基序列之部分，可確認於插人 片段之PUCKM3卜7HisK段之部分並無異常。 C0S-1細胞之髙表現霣體其後藉由將pUCKM3卜7His插 入物次選殖至pcDL-SRar 296中而製得。 Ρ ϋ C K Μ 3卜7 H i s以X b a I和H i n d I I I切閉，純化此Η段並 使用 1 單位之 Klenow 片段於 2·Μ dATP，2_·Μ dCTP，2aM dGTP, 2mH dTTP, 50mH Tris - HC 1 { pH7 . 2 ) , 10mM MgS04 ，0.1ioH二硫蘇醇和5〇iUg/iil BSA存在下將片段之終端 鈍化。 -8 7 - 本紙張;^適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（钭） 同時，高表現載體pcDL-SRa 296以PstI和ΚρπΙ切開並 以DN Α鈍化套組將其弄成鈍端。此鈍的片段其後使用Τ4 DNA連接酶連接至一鈍化質體。所得質體其後用以轉形 大腸桿菌DH5a。其後將轉形體選出並篩選。選出一種 cDNA轉錄作用之方向同於SRct啓動基因方向之睹株，並 將此菌株之質體命名為pSRor 31-7His。以此質體pSRa 31 -7His將C0S-1細胞轉感染並以類似實施例11所述方式取 得無血清上清液。 奮掄例1 3 紳化和N-終端胺某酸庠列分析 將60〇ml實施例12所得之上清液對17倍體積之透析緩衝 液於4 °C下透析15小時。将緩衝液更換以另外的17倍體積 之透析緩衝液並繼缋於4 °C下再透析4小時。 將透析製劑於下列條件下使用FPLC(快速蛋白質聚核 甘酸液體層析- Pharmacia)進行親和性層析： 柱：20hi1 之 ProBond™ 樹脂（Invitrogen)裝人 XK16/20 ψ {Φ 2.0 X ZOcm^Pharmacia)。 溶離缓衝液： A) 20mM磷酸鹽緩衝液（PH7.8)内含200ηιΜ咪唑， 0 . 5 Μ N a C 1 B) 20mM磷酸鹽緩衝液（pH7_8)内含300«iM味唑， 0 . 5M NaC 1 流速： 1ml/分鐘 分段溶液：5 m 1 /管 -8 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T A7 B7 經濟部中央標率局員工消費合作杜印製 五、發明説明 (g? ) I 1 分 離 條 件 : 以 溶 離緩衝液A )回收 4分 段，以溶 離 缓 衝 1 1 液 B) 回收16分段後， 且各 部分依序 由 1 至 J 1 2 0 编 號。 請 1 先 ! 取 出 3 0 0 // 1 各 分 段樣品並分別令 以TCA沈澱處理並如 閱 ★ 1 刖 述 製 備 沈 澱 物 且 令於還原條件下 以12 .5 %膠進 行 SD S 背 [ | 之 1 -P AGE 0 此銀染色法偵測帶並偵測到三橱聚集於部分η 0 . 注 意 1 I 10 周 圍 的 帶 ο 此 3 帶的存在意指pSKa 3 卜7B i s插 入 物 m 事 項 1 I 再 碼 一 具 有 3 傾 不 同 長度之不同N終 端序 列的多呔 0 4 本 剩 餘 的 部 分 7 至 14以TC A沈澱作用濃縮並將沈澱物令 頁 、/ 1 1 於 還 原 條 件 下 以 10 %膠進行SDS-PA SE 0 其後將蛋 白 質 帶 1 1 使 用 一 膠 膜 轉 移 裝 置（Marisol，ks- 8 4 4 1 )以9V於轉移緩衝 1 | 液 [ 0 . 0 2 % SD S， 2 0 % 甲醇，2 T r i s -硼酸鹽（PH9 . 5) 1 訂 ] 存 在 中 於 4。。下， 由聚丙烯醢胺醪轉移至一聚偏二_ 1 乙 烯 (P VD F) 膜 上 (P roBlot™, Appled B iosystem S ) 2 . 5 1 1 小 時 0 1 1 於 其 後 t 將 膜 以 0 _ 2 %萊酚藍黑（ S i g m a)染色， 並 將 對 1 1 應 於 先 前 鑑 定 三 帶 者由膜上切出， 並將 各帶之序 列 使 用 f 一 氣 相 蛋 白 質 序 列 ^ (Shiraadzu,PP SQ- 1 〇)測定至 終 端 1 1 之 第 Μ 胺 基 酸 〇 具有第二大觀分 子量 (多分子量約 1 | 6 0 ,〇 〇 〇 )之帶的N 終端為如下： 1 1 Va 1 - Va 1 ~ Ph e - Va l-Lys-Gln(序列 ID N 〇 . 12之胺 基 酸 1 η 〇 s , 1至6 ) [ | 此 等 六 個 胺 基 酸 對醮於純種条3 1 -7之 0RF的最先六個 1 胺 基 酸 且 亦 對 應 於 pSRor 31-7His 和 pSRcr 3 1-7 c D N A插 入 1 1 -89- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 _B7_ 五、發明説明（絲） 物所编碼之前驅動多呔N终端的第24個胺基酸（Val)開 始之六铜胺基酸序列。依此，由此前驅物多呔之N端刪 除胺基酸數目1至23則導致起始於Val殘基之蛋白質成 熟型式的分泌。 富施例14 測亩漠鹿活件 i)構铤寿現載_ 由C0S-1細朐表現時，先前實施例中所純化之多呔僅取 得極少量。因此，其不可能使用此多呔用於其他目的， 如活性分析。依此，其需要找出一種方式以於另一種宿 主中表現pSRcr31-7 cDNA插入物所编之多呔，使可産 生適於純化和分析的量。為逹成此目的，進行下列步驟。 PUCKM31-7以Hindlll切開，單離並純化内含cDNA插入 物之3Q[)3bpH段且使用一 DNA鈍化套紐將其终端弄鈍。 此Η段其後再以X b a I切開。 表現載體 PMAL-C〔 Guan，C.等人（1987)Gene 67,21-30〕 以Xbal和StuI切開，且使用T4 DNA連接酶將上述Xba-I 修飾之HindllH段連接至此切割質體。所得構築物示於 圖11。此構築物其後用於轉形大腸桿菌TB-1並選出且篩 選AmpR轉形體。選出一種cDNA轉錄方向同於啓動基因 方向之K株，並將由此所得之質體命名為PMAL31-7。 i i)寿現和純化融合蛋白皙 載有PMAL31-7之大臈桿_種培養液藉由在内含50# g/ oil安比西林之3ml LB培養基中37 °C下振盪培養過夜而製 -9 0 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

4 Ο46 Α7 Β7 五、發明説明（幻） 得。次日，將lml之種培養液加至100ml内含50/ig/ml 安比西林之新鮮的LB培養基中，並在37 °C下振盪培養至 〇 D eoonin到逹ϋ . 5。於此哨段，於培養液中加人1 P T G至 終濃度O.liaM，並將培養液再於37°C下振盪培養過夜。 次日，於4 °C下以6 5 0 0 r p m離心2 0分鐘，以由過夜之培 養液回收細菌細胞。其後將九狀物懸浮於lOffll之柱緩衝 液中並將懸浮液中之細胞以超音波崩散器弄碎。全部之 細胞和細胞片段其後於D °C以8 8 0 0 r p 離心3 Q分鐘予以移 除，且可溶性蛋白質部分呈上清液回收。其後將此可溶 部分lull於直鐽殿粉樹脂柱上層析（New England Biolabs)。 層析用之溶離緩衝液藉由將麥芽糖加入lOml之柱緩衝 液中至終濃度10mM而製得。 陰性對照組亦進行層析。此陰性對照組使用類似步驟 製備，除了使用無任何cDNA插人物之pMAL-c載體。其後 分析層析樣品蛋白質之還原活性。 i i i)酬宙掲鹿活袢 使用二氣酚-靛酣（D C I P )和氧化態麩胱甘肽於一光析 管（S A R S T E D T , 1 0 X 4 X 4 6 m m )中進行還原活性之測定。 a )使用IK丨P測宙撢脖沃袢 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 將上述ii)中所得之各層析樣品90.4a g(以蛋白質分 析套組（B i 〇 - R a d )測定）分別與 1 m 1 之 5 0 p M D C I P ( S i g ffl a ) 混合。其後於各樣品中加人1 5 # 1之1 m Μ N A D P H ( Boeiiringer-Mannhein)並經時測定 OD 6〇〇nm 和 O 34〇nm 之吸光值。結果於兩波長之吸光均降低，如圖12所示， -9 1 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（和） 且可得知僅PMAL31-7樣品内含還原DCIP之因子。 b )使用Μ化能麩胱甘Ife漸亩莓Μ活忡 於上述ii)中所得之各層析樣品90.4# g中加入15ml之 lOraM氣化態麩胱甘(Boeringer-Mannheim)且其事先置 入各光析管中。於各光管中加人15#1之lraM NADPH,並 經時測定〇 D 34〇nm吸光度。結果示於圖13，且可得知僅 有來自PMAL31-7樣品之蛋白質可將氣化態麩胱甘予以 還原。亦可觀察到當無氣化態想胱甘呔存在時，則無 NADPH消耗，因此可推斷來自pMAL31-7樣品之蛋白質僅於 N A D P Η存在中可將氧化態麩胱甘呔予以還原。

實施例H 純化和分析Ν -終端胺某醅序列 由實施例13,可推斷C0S-1細胞以pSRa 31-7His轉感 染，乃表現一具有三種類型N终端之多呔。 於一各別試驗中，令兔以來自大腸桿菌轉形以P M A L 3 1 - 7 所回收之融合蛋白質予以兔疫化，以取得一對抗Κ Μ 3 1 - 7 蛋白質之多株抗體製劑。使用此多株抗體進行西向點漬 ，且顯然三種類型之帶亦可於以pSRa31-7轉感染C0S-1 細胞之無血清培養上清液中偵測到。此結果類似於實施 例1 3中所得者。 依此，C0S-1細胞以pSRa 31-7轉感染目的在收集大量 的無血清培養上清液，以允許KM31-7蛋白質之N终端序 列的純化和分析。 C0S-1細胞以pSRtr 31-7轉感染並於150mKi各内含30ml -92* 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣- '11 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 ) 1 i DMEM 之 培 養 皿 中 培養 3 天 〇 於 其 後 收 集 培養 上 清 液 ，並 1 1 於 各 中 加 入 3 0 m 1新鮮 的 培 養 基 並 市 繼 缠 培養 3 天 ο 再一 1 次 y 收 集 培 養 上 清液 轉 感 染 和 培 養 之 其他 方 向 述 於實 請 1 先 1 施 例 1 1 中 但 培 養1 9 9個平碟。 閱 讀 1 將 所 收 集 的 上 清液 混 合 並 於 離 心 後 收 集到 10公 升 之無 背 1 之 1 血 清 培 養 上 清 液 ,且 以 10 ifiM T r i s - H C 1 ( PH9 . 0 ) 透 析 過夜 注 意 1 I 〇 其 後 使 用 FP L C (P h a r tn a c i a )於下歹 J條件下對透析之製 事 項 1 I 再 1 人 劑 進 行 八 次 離 子 交換 層 析 填 寫 本 衣 柱 : 2 0 m 1 之 D E A AE S e Ph a r o s e Fa St F 1 〇 w ( Ph a r m a c i a ) 頁 1 1 裝 入 XK 16/20 (Φ 2 .0 X 2 0 cm ί Ph a r m a c i a ) 1 1 溶 離 缓 衝 液 ： 1 I A) 1 0 m Μ T r i s - HC 1 ( PH 9 . 〇 ) 1 訂 B) 10 m Μ T r i s - H C 1 ( PH 9 . 0 ) - 0 _ 5 Μ Ν a Cl 1 流 速 ： 1 D1 1 / 分鐘 i | 分 段 溶 液 : 3 01 1/ 管 1 1 溶 離 條 件 ; 溶 離緩 衝 液 A 以 直 線 濃 度梯 於 6 0 分 鐘之 1 1 時 段中 轉 換 為 溶 離 m 衝 液 Bs I 收 集 並 混 合 0 . 1至0 .4 Μ各N aC 1濃度丙 ί溶離之部分， 並 1 1 以 内 含 0 . 1 Μ T r i s - H C 1， 5 m M ED Τ A (ρ Η 7 • 6 )和 1 m Μ 2 -氫 1 1 硫 基 乙 醇 之 透 析 緩衝 液 透 析 過 夜 0 其 後 令此 透 析 製 劑於 1 I 下 列 條 件 下 使 用 2 ' - 5 1 AD P S e Ph a r OS e 4 B ( Ρ ha Γ Π1 a c i a ) 1 進 行 親 和 性 層 析 * 1 柱 2 0 m 1之 2 ' , 5 1 - AD Ρ S e Ph a r o s e 4 B 裝入 X K 16 / 2 0 1 I ( φ 2 . 0 X 2 0 c m， P ha Γ ffl a c i a ) 1 1 -9 3 - 1 1 i 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（t ) 溶離缓衝液： A ) 0 1 Μ T r i s - H C 1，5 in Μ E D T A ( p Η 7 . 6 )，1 m Μ 2 -氫硫基乙醇 Β ) Ο . 1 H Τ r i s - Η C 1 , 5 m Μ Ε D Τ A ( ρ Η 7 . 6 ) , 1 in Μ 2 -氫硫基乙 醇，1 Ο 1 Μ Ν AD Ρ Η 流速：G. 5ml /分鐘 分段溶液：2 m 1 /管 溶離條件：溶離緩衝液A以一直線濃度梯度於120分 鐘之時段中轉換為溶離緩衝液Ββ 各分段之1CI0# 1以TCA沈澱並將沈澱物於還原條件下 使用12.5%膠進行SDS-PAGE。 電泳後，瞟以銀染色，以偵測蛋白質帶。由部分# 1 1 開始取得三個帶。 剩餘之部分# 1 1至# 1 4其後以T C Α沈澱濃縮並將沈澱物 於還原條件下使用1 2 . 5 %膠進行S D S - P A G E。於電泳後將 蛋白質由曝上轉移至一 ProBlot PVBF膜（Applied Biosystems)。將蛋白質轉移至膜上後，此膜以0.2%桊 酚藍黑染色並將三個蛋白質帶切出。其後使用氣相蛋白 質序列儀進行N終端序列分析。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣- 、-° 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 之 S 帶Ly 於為 定 測 被 者 量 子 分 小 最 之 型 類 種 三 有 具 然 顯 端 終 α R S Ρ 於 應 對 酸 基 胺 個 五 等 此 成 由W的 端 質 Nfiff蛋 肱 Mys r 司 L 多端 之靖 碼此I 依N-编。於 所 物 ® 基開 搭 Aif個一 D 五成 e的造 -7始， 3 開®α 酸 基 胺 個 9 4 第 第 切 的 基 殘 個 式 型 熟 Α4 S Ν C /1- 準 標 家 國 國 中 用 適 度 尺 張 紙 I本 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（W ) Μ備對杭KM 31-7蛋内曹：> 垔抶杭體 (a)製備抗庖蛋白皙 載有PMAL31-7之大腸桿菌種培養物藉由將一線圈細胞 於内含5G；ul/inl安比西林之3ml L8培養基中，37°C下 振盪培養過夜而製得。將lml之種培養液接種至内含50 A 1/ ml安比西林之100ml新鮮的LB培養基中並於37 °C下 振盪培養直到〇 D 6()(5nm到逹G . 5。於此階段，將I P T G加 至培養液中，至終濃度O.lmM,並再於37°C下振盪培養 過夜。 細胞於4 °C下以6 5 0 G r p m離心分離過夜培養液而予以回 收，並將丸狀物懸浮於1 0 in 1之柱緩衝液中。懸浮液中之 細胞使用一超音波崩散器予以弄碎並將此液體於（]°C下 以8，Q 0 0 r p ns離心3 Q分鐘。所得之上清液有可溶性蛋白質 部分。 將此可溶性蛋白質部分於lral之直鏈澱粉樹脂柱上層 析。以内含IGbiM麥穿糖之ΙΟιπΙ柱緩衝液進行溶離^其後 將得自層析之融合蛋白質貯_並於後續使用做為抗原。 (b )勃備申疮彳h ^鼠_細朐 將2ml之Freund's完全佐劑加至上述a)純化之2ml抗原 中（相當2 0 0 a g )，以形成一乳化物。將此乳化物吸入一 裝設有玻璃連接處之5ml注射槍中，並將此乳化物經由皮 下注射，用以免疫化8週齡之BA L B / c公鼠。 由第二次免疫作用開始時，使用F r e u n d 1 s不完全佐劑 做為佐劑，但仍依據同於第一次免疫作用之步驟。免疫 ^ 9 5 - 本紙張尺度適用中國國家標辛（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.

，1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印紫 A7 _B7_ _ 五、發明説明（94 ) 作用總共進行四次，以約每2週一次免疫之進度進行。 第二次免疫作用開始，於免疫前立即由眼睛基底之靜 脈網狀組鏰採血，且以固相酵素連接免疫吸著劑分析（ EUSA)測定血清中之抗- 031-7抗體之力價。

固相抗二1M3卜7ELISA 將取自轉感染C0S-1細胞以pSRa 31-7之無血清培養 上清液150至200# 1 (對應約為200ng之融合蛋白質）置於 9 6孔口 ELISA平板（Costal*)之各孔口中，以做為抗原β 其後令平板於4 °C下靜置過夜，以覆被平板孔口之底部 表面。次曰，平板以0.1%Tween 20/磷酸鹽緩衝食鹽 水（O.lTween 20/PBS)清洗3次且其後於各孔口加入1〇〇 y 1之以PBS製成之BSA並令於室溫下靜置1小時β 於其後，平板再以0.1% Tween 2D/PBS清洗三次。 將30-100# 1以連績稀釋樣品型式之第一抗體（例如，鼠 血清，雜種瘤培養上清液或單株抗醱）加至各孔口中， 並令平板於室溫下靜置1小時。 於其後，平板再以G.l% Tween 20/ PBS清洗三次且其 後於各孔口中加入100^1之第二抗體β第二抗體被製成 山羊抗•鼠TgG-過氣化酶複合物（Amersbam)之3000倍稀 釋溶液或山羊抗-鼠IgG鹼性磷酸酶複合物（BI0-RAD)之 3000倍稀釋溶液Q平板其後於室溫下靜置1至2小時。 於其後，平板再以G.196Tween 20/PBS清洗三次，且 其後於各孔口加入1Q0# 1之過氧化酶受鼠溶液（BI0-RAD ，過氧化酶受質套組ABTS)或1G%内含0.QQ196磷酸對- -9 6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) " 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 459046 A7 B7 五、發明説明（π ) 硝基苯酯溶液之二乙醇胺。其後令平板於室溫下靜置15 至30分鐘，其後使用徹平板讀數器（BIO-RAD)測畺415nm 或405nnt下之吸光，計算出抗體力價。 (c )制腊窗.骨馘瘤細朐 將8-氮火瞟昤抗性鼠骨®瘤細胞P3-X63-Ag 8.653(653) (ATCC no.CRL-1580)於一般之培養基（完全GIP)中培養， 以取得最少2 X 1 〇 7細胞。

(d)製備雜種I 將上述b)免疫攝生法後所取得之1.4X 10s傾免疫化鼠 髀細胞充分以DHEM(Nissui製藥）清洗β其後此清洗之細 胞與上述C)製備之1.5Χ 1〇7鼠骨铺瘤細胞P3-X63-Ag 8.653(653)混合，並將所得之混合液於800rpn下離心6 分鐘。 收集呈丸狀物之由脾細胞和？3163-48 8.653(653)細 胞混合液所組成之細胞群並將其弄碎》事先製備聚乙二 醇40G0(聚乙二醇#400(〇舆DMEH之50%溶液，並将此溶液 以2ml /分鐘之攪拌速率以1分鐘之時段滴於弄碎之細胞 上。而後DMEM以類似方式以3ml /分鐘之速度添加至細胞 製物中逹1分鐘，此步驟對聚乙二醇和溶液均再重 覆一次。最後，以3分鐘之時段徐徐地加入16ml之DHEM 。所得之細胞製物其後於8 0 0 r p B下離心6分鐘。丟棄上 清液並將細胞懸浮於内含5至1 0 n g / in 1鼠I L - 6之3 5 nt 1完全 G I T 中 0 (e >篩選雜種瘤 -97- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CMS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 苯- 訂

4 "丨 抵剛__ 五、發明説明（朴） 將上述d)製備之100/u 1懸浮液加至96孔口平板（Sumitomo Bakelite)之各孔口中，其後於37°C下於7.5% C02恒 溫箱中培養β培養7天後，於各孔口加入之BAT培 養基。再培養4天後，於各孔口中再加入50# 1之HAT培 養基。乎板其後再培養3天。於其後，於可觀察到融合 細胞菌落生長之孔口中採取樣一部分的培養上清液，並 以上述b)中所逑之固柑£1*13 4分析抗-〇31-7抗體之力價 ,被採樣之培養立印置換以HT培養基。 (f)截 m 由試驗為陽性之孔口以限制稀釋分析重覆三奔細胞選 殖。選出彼等被觀察出具有一致抗睦力價之純種糸做為 産生抗-KM31-7單株抗體之雜種瘤細胞糸。於此階段， 使用轉威染C0S-1細胞以pcDL-pSRa 29 6所得之無清培養 上清液進行上述b)所述之ELISA，且亦進行對照之ELISA ，以製備固相。依此，選取與前者反應但不與對照之 ELIS A反應之細胞条用於選殖，而得融合發Μ KM-150-2。 f g〗紳彳h蜇抶抗餺 經濟部中央樣隼局員工消費合作社印製 收集來自産生抗- KM31-7箪株抗體之雜種瘤細胞条的 培養上清液，並以0.22# 濾紙（Mill ip ore)過濾滅菌且 於其後使用MAb Trap Gll(Pharnacia)純化抗體。 (h )分析盟抶杭鵲 1 ) H姝抗體杭庖恵一袢 使用得自以PSR« 31-7轉感染C0S-1細胞之無血清培n 上清液，以免疫沈澱試驗，確認單株抗體對KH31-7蛋白 -98- 本紙張尺度適用中國國家橾率（CNS > Α<»坑格（210X2?7公煃） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 ( 97 ) 1 ! 質 為 專 一 0 1 1 2 ) 早 株 1 體 分 類 1 此 試 驗 為 使 用 —. 鼠 單 株 抗體同型 套 組（A in e r s h a m )進行 請 1 先 » 且 此 抗 體 被 鑑 定 為 属 於 I gG 1亞類 〇 閲 1 奮施..Μ. 1 7 1 I 之 1 1 用 杭 Μ -抗艚反I*垔雒祐紳仆，Κ Μ ：ϊ 1 - 7蛋白曾 注 1 此 為 以 實 施 例 1 6h ) 1 )所 述進行。 使 用得自C 0 S- 1細胞轉 意 事 項 1 1 再 1 上 染 以 PC D L -P S R a 2 9 6之抗體和無血清上清液， 亦重覆 填 本 求 相 同 試 驗 〇 頁 1 I 於 1 . 7m】之各無血清上清液加入1 .4 A g之單賴 抗體並 1 1 令 於 室 溫 下 反 應 1 小 時 S 同時於2 . 2瓜1離心管中以2 0 r p m ! | 離 心 〇 對 昭 組 為 使 用 得 白 C 0 S - 1細胞轉感染以p S R α 3 1-7 1 之 無 血 清 之 清 液 j 但 未 加 入單株抗 HJMf 髖 ο 吞J" 1 將 先 以 G . 1 % T w e e η 2 0/ PBS清 洗 之3 0 # 1蛋白質G 1 I S e P h a r 0 S e 4 Fa s t F Ιο w ( Pharmaci a ) 加至各管 中， 以吸 1 1 附 抗 體 並 持 缅 於 室 溫 下 以 2 0rPni之速度離心30分鐘。 1 於 其 後 ♦ 將 各 混 合 液 於 離心機中 以 1 0 0 0 0 r p IB 離心 數秒 1 鐘 * 且 其 後 將 上 清 液 小 心 地丢棄， 以 使不流失 任何 沈澱 1 I 物 0 丸 狀 物 各 别 以 0 . 1 % Τ ween 20/ P BS清洗並 於其 後以 1 I 類 似 方 式 微 離 心 並 清 洗 五 次。 1 | 將 所 得 之 沈 澱 物 懸 浮 於 内含1 0 # 1 2-氫硫基 乙醇 之 1 SD S - PAGE 樣 品 緩 衝 液 中 〇 各懸浮液 於 9 0 °C下加 熱2 分鐘 1 * 且 其 後 於 還 原 條 件 下 使 用 1 2 _ 5 % 膠 進行S D S - PAGE 〇電 1 I 泳 後 ， 將 産 物 由 聚 丙 烯 醏 胺瞜轉移 至 一硝基鐵 維素 薄膜 1 1 -9 9 - I i 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ______ B7_ 五、發明説明（Μ ) (BIO-RAD)。使用實施例1所述之多株抗-KH31_7抗體進 行西向點潰，（a )部分和抗-K Η 3 1 - 7單株抗體被测出專一 性地沈澱來自COS-1/pSRa 31-7無血清培養上清液之km 3 1-7蛋白質。 奩施例1 8 製N T a / K M m - 7 gt 会蛋白皙 為使用CYVV-NIa蛋白酶技術表現KH31-7蛋白質，其需 於相同0RF中連接NIa基因之3'终端做為KH31-7蛋白質DKA »依此，進行下列二階段步驟。

i) cDHA^ 3 ' #1 If (SamT-Xh^T-lonR hD)m X DKSIlNg 由 為取得内含KM31-7 eDNA 3’端之Smal-Xbal片段（i,〇〇6 bp)，乃將7；ug之pSRor31-7質體DNA以限制酶Sinai和 Xbal切開，並使用 GENECLEANII(Funakoshi Japan)以 〇 . 8 %瓊脂醣媛將所得之Η段收集並純化。 同時，5 # g之p K S 1丨Ν 9質體D Ν Α亦類似地以S m a I和X b a I 切開，並以牛齡性磷酸酶（Alkaline Phosphatase大腸 桿菌C75,日本賫酒造）將此切割片段予以去磷酸化。 所得之去磷酸化，直線化之DNA使用一連接套組（寶酒造） 與Smal-Xbal KM-31片段連接，並將此構築物用於轉形 大腸桿菌菌株J Μ 1 0 9 β選出轉形體並筛選取得一内含S ^ a j -Xbal片段之純種系p〇Ia31-7SX。 ii )建接_N la蛋白飽和ΚΜ.Ί1 -7 為將NIa之C終端序列與於相同謓框中具有Val N -終 -1 0 0 ™ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2IOX2?7公釐） — ^-------上 '4------訂------( (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁〕 ' 459046 A7 A7 B7 五、發明説明（竹） 端殘基之031-7亞型的N終端序列連接，乃使用Perkin 築四種聚合酶鍵反應（PCR)引子tt引子如下： 5f GGT CAG CAC AAA ΤΤΓ CCA 3f SEQ. ID NO. 15 (1) S, AAA CAC AAC TTG GAA TGA ACA ATT 3» SEQ, ID NO. 16 {2) 5，TCA TTC CAA GTT GTG TTT QTQ AAA 3' SEQ. ΤΠ NO. V7 (.¾) 5* CAT AGG ATQ CTC CAA CAA 31 SEQ. ID NO. 18 (4) 進行第一回合PCR為使用lyu g之pKSUN9質體DNA做為模 板。於反應溶液中依序加人引子（1)和（2)各IOOpboI和 1/ 1(1體積之10倍濃Taq聚合酶反應緩衝溶液及5單位之 Taq聚合酶（寶酒造）。PCR反應先於72-C下進行3分鐘， 隨後進3 Q次周期之：9 4 °C 1分鐘，5 5 T： 2分鐘和7 2 X： 3分鐘，且結束於72°C 1Q分鐘。PCR反應後，將增大之 D N A産物令以8 %聚丙烯醯胺膠電泳。内含D N A之膠條以 漠化乙銳染色鑑定並弄碎。於各暖碎條中加入3(]〇# 1之 溶離緩衝液（Q.5醋酸銨，ImM EUTA，ρΗ8·0)並於37°C下 培養過夜。離心取得内含純化並放大之D N A的上清液。 再以相同方式進行PCR，但使用g之PJJCKM31-7質體 D N A做為模板號使用引子（3 )和（4 )，且如上述純化D N A。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由第一次PCR所得之放大Η段内含编碼來自KM31-7蛋 白質Ν终端殘基之序列，起始於Val-Va卜Phe,直逹NIa 之Xhol位置上游的3 1hp。由第二次pCli所得之放大片段 内含编碼來自Nla C終端之Asn-Sys-Ser-Phe-Gln,直逹 KM3 1-7 cDNA之 Snal位置上游的 32bpe -1 0 1 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 459〇46 at _B7__ 五、發明説明（、w) 依此，當使用二個pc κ所得之D N A片段與引子（1)和（4) 進行PCR時，其結果為一個由NIa 31終端96p和编碼所欲 KM31-7終端序列15bp所組成之雜交股。因此，可産生― 個與此部分做為連接之融合DNA序列。 此理論之結果，PRC之第二回合正好以此方式進行’

並由謬回收加強之Η段。 i i i) HI a / Κ Η 3 1 - .7 D i)中製得之 5//g pNIa31-7SX 質體 DNA 以 Xhol 和 Smal 切開，並以牛鹼性磷酸酶處理將DNA去磷酸化e ii)中製 備之P C R産物亦以X h ο I和S m a I切開並於其後將所得之片 段使用一連接套組，與已切開去磷酸化之PN〖a_7SX連接 。所得之構築物用以轉形大腸桿菌菌株J Η 1 0 9。 其後選出並篩選AtapR轉形體^篩選為於電泳後以Xh0 切開而進行。選出僅具有8.Okbp帶之純種糸。所選出之 純種条的質體其後以Hindlll切開並再進行電泳》選出 具有一對應於NIa cDNA插入物330bp帶之質體》此質體 命名為pNla31-7V，且内含Xhol和Sinai PCR産物β 測定純種糸p 1U a 3 1 - 7 V之鹼基序列，並確認编碼Ν I a和 κ M 3 1 - 7之序列於相同0 R F中，與位於N I a和K Η 3 1 - 7蛋白質 之間的必要G丨n - V a丨切割序列相建接。 i v ) ILiOJLll -7 s a m 西向點清確認pNIa3卜7V於大腸桿菌中為具機能性且 KM31-7蛋白質為被構築的重組基因所表現。 載有質體pNIa31-7V之大腸桿菌種培養液於内含50# g -1 0 2 - 本紙張尺度賴中關家標準（⑽）从祕（21GX297公幻 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本I)

、tT A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、發明説明 (> ο 1 ) 1 1 / in 1 安 比 西 林 之 3 m 1 L B培 養基 中 ,振盪培養過夜 0 將 1 m 1 1 1 之 種 培 養 液 加 至 内 含 5 0 Μ 1 / hi 1安比西林之lGOml新鮮的 J 1 L B培 養 基 中 » 並 於 3 7 °C 下 振盪 培 養直到〇D6(M)nm 到達1 . 0 /1. 讀 1 先 1 0 於 此 階 段 t 於 培 養 液 中 加入 IP T G至於濃度1 in Μ , 並將 閱 讀 1 培 養 液 於 2 8 % 下 再 振 盪 培 養兩 夜 Ο 背 面 1 I 之 1 於 其 後 » 將 1 m 1之培養液移至- -離心管中並於1 5 0 0 0 r p in 意 1 I 下 離 心 5 分 m 〇 丢 棄 上 清 液並 將 九狀物與30Q # 1 之無菌 事 項 k. 1 1 水 和 内 含 2 - 氣 硫 基 乙 醇 之 3 0 0 ^1 S D S - P A G E樣品緩衝液 丹 填 寫 丄 本 混 合 以 弄 碎 沈 殿 的 細 胞 Ε 〇 所 得-懸浮液於9 5 °C 下加熱 頁 、_-· 1 I 2 分 鐘 且 其 後 將 10 m I 此 懸 浮液 於 還原條件下於8 %膠上 1 1 進 行 SD S - PAGE 〇 1 | 電 泳 後 > 將 蛋 白 質 由 m 上轉 移 至一硝基纖維素 膜上。 1 訂 此 傜 經 由 膠 與 _ 接 觸 並 於轉 錄 緩衝液（2 5 in Μ T r i s-HC 1 1 ,1 .4 % 甘 胺 酸 和 2 0 % 甲 醇 )存在中，4 °C下培養2 . 5小時 1 | 且 使 用 一 _ 膜 轉 錄 裝 置 (M a r i s 〇 1 Japan)在 19V下 進行。 1 I 硝 基 m 維 素 膜 以 2 0 m ] 之 PBS- T培養基清洗，旦其後於 1 1 内 含 5 %脱脂牛奶（ 雪 印 股 份有 限 公司）之2 0 m 1 P B S - T中 1 進 行 镇 塞 1 小 時 0 於 其 後 ,此 膜 以兩份2 0 m 1之P B s-τ洗 1 ! 濯 並 令 於 内 含 1 # 1以 •flTT m m 水稀 釋 100倍之抗-KM31 -7 兔 MAb 1 1 血 清 (第- *抗體） 的 2 0 m 1 P B S ™ T 中 反應90分鐘。硝 基纖維 1 I 素 膜 其 後 各 以 2 0 m 1 之 P B S - T清洗- ^次15分鐘且其後清洗 1 -一 :k 5 分 鐘 〇 1 1 經 清 洗 之 膜 其 後 置 於 一 以PB S - T稀釋3 , G 0 0倍之 過氧化 1 [ 酶 標 記 抗 -兔] g〔 i山 羊 抗 am 體 (BIG -E AD)(使用做為上 逑之第 1 1 -1 0 3" 1 1 1 [ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210>< 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明) 二抗體）浴中，並令以靜置1小時。此膜其你以20ral之 P B S - T清洗並移至-E C L偵測試劑（A m e r s h a m )浴中，並以 放射自顯術偵測與抗-K Μ 3 1 - 7抗體反應之帶。 進行西向點漬並偵測到一具有約6 G , 0 Q 0分子量之帶β 此帶顯示出同於得自COS-1細胞轉威染以PSRa31-7無血 清上清液，所偵測之具有三種K Μ 3 1 - 7蛋白質之第二大部 分子量之蛋白質做為對照組之相同移動性。 培養基 X Μ鼪醅鹽緩衝液 N a 2 Η Ρ 0 4之Μ溶液，以N a fl 2 Ρ 0 4之Μ溶液調整至所 欲的Pi 榕種缓衝液 0 · 1 Μ T r i s - H C 1 缓衝液，P Η 7 , 0，0 . 0 5 Η E D T A，1 % 2 - 氫硫基乙醇。 萃取緩衝液 0.1M Tris-HCl 緩衝液，0.05M EDTA,1% 2 -氳硫基乙 醇，PH7 · 0。 降解溶液 200mH 磺酸銨，2 % S D S 2 nt Μ E D T A，4 0 0 # g / m 1 膨潤 土和 20；Lig/inl 蛋白酶 k (ρΗ9·0)。

1 x SSC Ο . 1 5 Μ N a C 1，Ο . (Π 5 H 檸樣酸三納鹽，P Η 7 . 0。 液體LB培泰基 10克之Bacto蛋白陳（Difco)， 5克之Bacto酵母萃取 -1 0 4 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、^τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（，4 ) 物（Difco)和5克之氯化鈉，所有以蒸餾水製成1公升。 T r i s -鈣溪衝液 10mM Tris, 5ϋιηΜ氣化鈣，以鹽酸調整至PH7.4。 溶朐總衝液 〇 . 1 7 克之蔗糖，2 5 ί) # }之 1 Μ T r i s - HC 1 鍰衝液（ρ Η 8 . 0 ) ，200/i i 之 0.5Μ EDTA(pH8.0)，以蒸蹓水製成 20ml。 鹼性SD Si容液 0.2M氫氣化鈉，l%SDSe TBE溶液 lOOmM Tris，l〇OmM 棚酸，ImM EDTA。 鮝件溶液 1.5M氮化鈉，（K5M氫氧化鈉。 中和锞衝液 0 5 Μ T r i s, 3 Μ 氯化鈉（p H7 . 4)。 5 0 X DenharcH's溶液 1 %聚乙烯吡咯啶酮，1 %牛血清白蛋白，1 % Ficon 4 〇 (U此溶液其後以適量之再蒸餾水稀釋，以達到所欲 之濃度。 5 X戀忡猓衛液 125/^1 之 1M 甘胺酸（pH9.G), 之 1M 氣化 850#1 之再蒸餾水。

5 X標記緩衝I 2 5 /i 〗之 1 Μ T r i s - H C 〗緩衝液（p Η 7 . 9 ) , 5 # 1 之 1 Μ 氣化 I* ,2.5#1之1Μ二硫蘇醇，9.2#1之再蒸餾水。 -1 0 5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) " 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明 1 Ο X Μ 9鹽溶液 0.145 Μ磷酸氩二銷，Q. 17 2Μ磷酸二氫鉀，0.1 87 Μ氛 化銨，0· U 7 Μ氣化銷，p H 7 . 0。 Μ9慕飪浅堃惊蕃甚 1 0 πι ]之 1 0 X Μ 9 鹽溶液，1 G 0 # i 之 1 Μ 硫酸 _ , 1 m 1 之 2 0 % 葡萄糖，5[)#1之1%硫胺素鹽酸鹽，lml之（].G1M氨化鈣 和13rol之再蒸餾水，混合，過濾滅閨，並於加入50ml之 30% Bac to agar後立即倒人平板。 液體S 0 B培蕃華 將ίΟ克之bacto蛋白賺，2.5克之bacto酵母萃取物， 1 (] 0 A ]之5 Μ氯化鈉和1 2 5 # 1之1 Μ氯化鉀混合並以蒸餾 水製成5 0 0 as 1 c高壓滅_後，加人5 m 1之1 Μ氯化纟|和5 m 1 之1 Μ硫酸鎂。 T F Β 1鍰衝液 得5ml之1Μ 2-(Ν -嗎福啉基）乙烷磺酸（MES -以IN HC1 諝整至6·2), 6·045克之氣化鍋，d. 735克之氯化鈣二水 合物和4·94克之氣化纟|四水合物混合，以冰醋酸調整至 ΡΗ5.8,以再蒸餾水製成並以過濾滅菌。 TFB2键衝液 得lull之1Μ 2-(Ν -嗎福啉基）丙烷磺酸（MOPS), 1.102 克之氛化鈣二水合物，G. 12克之氯化鉤和15ml之甘油温 合，並以冰醋酸調整至PH6.5,以再蒸餾水製成lUDial並 以過濾滅菌。 液體S0C培蕃某 -1 0 6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 A7 459046 B7 五、發明説明（) 5ral之液體SOB培養基，90#1之20%葡萄糖。 2XYT摈泰某 將16克之bacto蛋白賺，5克之bacto酵母萃取物和5 克之氛化鈉混合並以再蒸餾製成1公升。 PBS-Tw惊蕃甚 80mM磷酸氫二納，2GmM磷酸二氫鈉，ΙΟΟηΗ氣化納， 0.1% Tween 2 0 〇 P R S - T惊泰某 將4克之氣化鈉，0.1克之碟酸二氣鉀，1.45克之磷 酸氫二鈉十二水合物，（].1克之氣化鉀和0.1克之叠氮化 鈉以再蒸餾水製成1公升，ΡΗ7.4。 鹾件礤酪酶令曹溶液 將0.01%磷酸對-硝基苯酯溶於事先以鹽酸調整至pH 9 . 8之二乙醇胺水溶掖中。

摈蕃某A DMEM(Dulbecco、修飾 Eagle 培養基，内含 4.5 g/l® 萄糖），10%去活性胎牛血清（由flyclone製造）和10mM HEPES (pH7 . 2 ) 0 培蕃基Β D Η Ε Μ (内含 4 . 5 g / 1 葡萄糖），1 0 m Μ Η E P E S ( ρ Η 7 _ 2 )， 3%去活性胎牛血清，5 mg/ml牛胰島素（由Sigma製造） ,d -生物素（由Sigma製造），Og/ml泛酸（ 由Sigma製造，I.Ga Μ地塞美沙松（由Sigma製造）和0.5 mM異丁基甲基黃嘌昤素（由Aldrich製造 -107- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 /1 A7 B7 五、發明説明Ο4 ) 培養 DMEM(内含4.5g/l葡萄糖）内含5%去活性胎牛血清， 1 Ο ιβΜ HEPE(pH7.2)和 100ng/ml牛膀島素 0 稱泰某[) DMEM (内含4.5g/l#萄糖），5%去活性胎牛血清，ΙΟιηΜ HEPES (ρΗ7·2), 100ng/ml 牛胰島素和 10 U/ral 肝素納（ 由Novo工業股份公司製造）。 LPI,令皙溶麻 13mM甘油三〔9，10(η)-3Η]油酸酯（51.8KBq/#mol, 由Amersham製诰），】.3fflg/ml L-α-磷脂醯膽齡二硬脂 醅基（由Sigma公司製造），20mg/ntl牛血清白蛋白（由 Sigma公司製造），135mM Tris-IiCl〔Tris-HCl (pH8.1) ，Sigma 公司製造〕，16_5%(v/v>甘油和 16·5%(ν/ν)去 活性胎牛血清。 硫気酸胍溶液 4Μ硫氣酸胍，1% Sarkosyl,20mM乙二胺四醋酸（EDTA) ,2511^檸樣酸納（？}}7.0),1(]1|^2-氫硫基乙醇和0.1% 抗泡劑A(Sigma)。

吸箸緩H 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 0.5M N a C 1 , 2 OraM Tris-HCl(pH7.5) ,ΙιηΜ EDTA 和 0.1% S D S 0 lOtnM Tris-HCl(pH7.5) ,lmM EDTA 和 0.05% S D S 乏#轉錄_砭_浓液 -1 0 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 卜 459 046 B7 五、發明説明（W ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 50ml Tris-HCl(pfl8.3),8iM MgCl2 ,30mM KCl.O.SmM 二碕蘇醇，2 in M d A T P，2 m M d G T P，2 m M d T T P，1 t) # C i〔 cf -&P〕dCTP和1.4# g之載體引子- DNA(：T -寡（dT) -尾端 pcDV-l,Phanacia)0 終端轉移酶反應溶液 1 4 0 m Μ 二甲胂酸鉀，3 0 m Μ T r i s - H C 1 ( ρ Η 6 . 8 ) , 1 m Μ CoCl2 ,0.5raM 二硫蘇醇，0.2#g 之聚 A 和 ΙΟΟηιΜ dCTP。 限制酶_緩衝液 50ιπΜ NaCl^OiaM Tris-HCl (ρΗ7·5)，10ϋΐΜ MgC!2 和 1 m M二硫蘇醇e 10倍體穑浦培_溪衛液 IOmM ATP，660mM Tris-HCl(pH7.5)，66mM HgCI2 和 lOOmM二硫蘇醇。 雷泳色棄 5 0 %甘油，D · ϋ 1 Μ磷酸氫二納（ρ Η 7 . 0 )和0 . 4 %溴苯酚 藍。

1 XTAR 0 04 Η Tris -醋酸鹽，0_ 001 Μ EDTA。

1XSSCP 經濟部中失標隼局員工消費合作社印裝 120mM NaCl,i5mM檸樣酸鈉，13mM磷酸二氩鉀和lmM EDT A0 奮施例6之渉輔線醜砭塵溶液 IX第一股合成緩衝液，5%焦磷酸鈉，10單位之核糖 核酸酶抑制劑，ImM dATP, lmM dGTP, ImM dTTP, 0·5ιβΜ -1 0 9 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（2ί〇Χ297公釐） 4 59〇4β Α7 Β7 五、發明説明) dCTP和3.75/ig之寡（dt)引子，所有均由cDNA Cloinig System(Aniershani)所提供。

SH潘衡I lDOfl» N a C 1 , 8ibM M g S 0 4 · 7 Η 2 〇 , 5 0 m Μ T r i s - H C 1 (p H 7 . 5 )和 〇 · (H % 明膠。 诱析锶衝液 2 0 m M磷酸鹽缓衝液（P Η 7 . 8 >和d , 5 Μ N a C 1。 柱緩衝.1 lOntH Tris-HCl(pH7.4)，200nM NaCl 和 ΙιιΜ EDTA。 T a q聚合酶反應纆满溶液__

T a q 内含 5 0 G in Μ T r i s - H C 1 ( p Η 8 3 )，5 0 0 m Μ K C 1 , 1 5 m Μ M g C 1 2 ， 1 〇 〇 niM d ATP , 1 0 0 mH d C TP , 1 0 0 aN dGTP.lOOiM dTTP和2 tng/ml之明膠。

M & C FOLIO: 72626/FP-9510 WANGDOC: 1105D (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 110 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐）

經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（K?) 庠列弟 序列I D N 〇 : 1 序列長度：1 3 2 0 序列類型：核酸 股性：雙股 拓睽學：直線 分子類型：cDNA至 mRNA 反意義：無 來源： 衍生物：三桀草黃脈病毒 外觀： 1-1320 E CDS 10 -ί311 E mat -胜版 序列描逑： AAG TTC CAA GGG AAA AGT AAG AGA ACA AGA CAA AAG TTG AAG TTC AGA 48 Lys Phe Gin Gly Lys Ser Lys Arg Thr Arg Gin Lys Leu Lys Phe Arg 1 5 10 15 GCG GCA AGA GAC ATG AAG GAT CGT TAT GAA GTG CAT GCC GAT GAG GGG 96 Ala Ala Arg Asp Met Lys Asp Arg Tyr Glu Val His Ala Asp Glu Gly 20 25 30 ACT TTA GTG GAA AAT TTT GGA ACT CGT TAT TCA AAG AAA GGC AAG ACA 144 Thr Leu Val Glu Asn Phe Gly Thr Arg Tyr Ser Lys Lys Gly Lys Thr 35 40 45 AAA GGT ACT GTT GTG GGT TTG GGT GCA AAA ACA AGA CGG TTC ACT AAC 192 Lys Gly Thr Val Val Gly Leu Gly Ala Lya Thr Arg Arg Phe Thr Asn 50 55 60 -1 1 1 ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、tT 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS } A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局貝工消费合作社印装 卜459 Ο 46 Α7 _Β7___ 五、發明説明（"Ο ATG TAT GGT TXT GAC CCC ACG GAG TAT TCA TTT GCT AGG TAT CTT GAT 240

Met Tyr Gly Phe Asp Pro Thr Glu Tyr Ser Phe Ala Arg Tyr Leu Asp 65 70 75 80 ， CCA ATC ACG GGT GCA ACA TTG GAT GAA ACC CCA ATT CAC AAT GTA AAT 289

Pro lie Thr Gly Ala Thr Leu Asp Glu Thr Pro lie His Asn Val Asn 85 90 95 TTG GTT GCT GAG CAT TTT GGC GAC ATA AGG CTT GAT ATG GTT GAC AAG 336

Leu Val Ala Glu His Phe Gly Asp lie Arg Leu Asp Met Val Asp Lys 100 105 110 GAG TTA CTT GAC AAA CAG CAC TTA TAC CTC AAG AGA CCA ATA GAA TGT 384

Glu Leu Leu Asp Lys Gin His Leu Tyr Leu Lys Arg Pro lie Glu Cys 115 120 125 TAC TTT GTA AAG GAT GCT GGT CAG AAG GTG ATG AGG ATT GAT CTA ACA 432

Tyr Phe Val Lys Asp Ala Gly Gin Lys Val Met Arg lie Asp Leu Thr 130 135 140 CCC CAC AAC CCA TTG TTG GCA AGC GAT GTT AGC ACA ACC ATA ATG GGT 480

Pro His Asn Pro Leu Leu Ala Ser Asp Val Ser Thr Thr lie Met Gly 145 150 155 160 TAT CCT GAG AGA GAA GGT GAA CTC CGT CAA ACT GGA AAG GCA AGG TTA 528

Tyr Pro Glu Arg Glu Gly Glu Leu Arg Gin Thr Gly Lys Ala Arg Leu 165 170 175 GTC GAC CCA TCA GAG TTG CCC GCG CGG AAT GAG GAT ATT GAT GCA GAG 576

Val Asp Pro Ser Glu Leu Pro Ala Arg Asn Glu Asp lie Asp Ala Glu 180 185 190 TTT GAG AGT CTA AAT CGC ATA AGT GGT TTG CGC GAC TAT AAT CCC ATT 624

Phe Glu Ser Leu Asn Arg lie Ser Gly Leu Arg Asp Tyr Aen Pro lie 195 200 205 TCA CAA AAT GTT TGC TTG CTA ACA AAT GAG TCA GAA GGC CAT AGA GAG 672

Ser Gin Asn Val Cys Leu Leu Thr Asn Glu Ser Glu Gly His Arg Glu 210_215_ _220_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -”— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本X) 、-11 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4规格（2丨〇X 297公兼) 4 59 046 A7 B7 五、發明説明（"Ο AAG ATG TTT GGA ATT GGA TAT GGT TCA GTG ATC ATT ACA AAT CAA CAT 720

Lys Met Phe Gly lie Gly Tyr Gly Ser Val lie lie Thr Asn Gin His 225 230 235 . CTG TTC AGA AGG AAT AAT GGG GAG TTA TCA ATT CAA TCC AAG CAT GGC 76Θ

Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly Glu Leu Ser lie Gin Ser Lys His Gly 245 250 255 TAC TTC AGA TGC CGC AAC ACC ACA AGC TTG AAG ATG CTG CCT TTG GAG 816

Tyr Phe Arg Cys Arg Asn Thr Thr Ser Leu Lys Met Leu Pro Leu Glu 260 265 270 GGA CAT GAC ATT TTG TTG ATT CAG TTA CCA AGG GAC TTT CCA GTG TTT 864

Gly His Asp lie Leu Leu He Gin Leu Pro.Arg Asp Phe Pro Val Phe 275 280 285 CCA CAA AAG ATT CGC TTT AGG GAG CCA AGA GTG GAT GAC AAA ATT GTT 912

Pro Gin Lys lie Arg Phe Arg Glu Pro Arg Val Asp Asp Lys lie Val 290 295 300 TTG GTC AGC ACA AAT TTC CAG GAA AAG AGT TCC TCG AGC ACG GTC TCA 960

Leu Val Ser Thr Asn Phe Gin Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Val Ser 305 310 315 320 GAG TCC AGT AAC ATT TCA AGA GTG CAG TCA GCC AAT TTC TAC AAG CAT 1008

Glu Ser Ser Asn lie Ser Arg Val Gin Ser Ala Asn Phe Tyr Lys His 325 330 335 TGG ATC TCA ACA GTA GCA GGA CAC TGT GGA AAC CCT ATG GTT TCG ACT 1056

Trp lie Ser Thr Val Ala Gly His Cys Gly Asn Pro Met Val Ser Thr 340 345 350 AAA GAT GGA TTT ATT GTA GGT ATC CAC AGT CTT GCT TCA TTG ACA GGC 1104

Lys Asp Gly Phe lie Val Gly lie His Ser Leu Ala Ser Leu Thr Gly 355 360 365 GAC GTT AAC ATC TTC ACA AGC TTT CCG CCG CAG TTT GAG AAC AAA TAT 1152

Asp Val Asn lie Phe Thr Ser Phe Pro Pro Gin Phe Glu Asn Lys Tyr --- ^ tt i ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂_ A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、 發明説明（〃> ) 1 1 CTA CAG AAG CTC AGT GAA CAC ACA TGG TGT AGT GGA TGG AAA CTA AAT 1200 1 I Leu Gin Lys Leu Ser Glu His Thr Trp Cys Ser Gly Trp Lys Leu Asn 1 [ 385 390 395 400 1 CTT GGA AAG ATT AGT TGG GGT GGA ATC AAC ATT GTG GAG GAT GCA CCT 1248 請 1 1 Leu Gly Lys lie Ser Trp Gly Gly lie Asn He Val Glu Asp Ala Pro 閱 ♦ I 405 410 41h 面 之 1 1 GAA GAG CCC TTT ATA ACA TCC AAG ATG GCA AGC CTT CTT AGT GAT TTG 1296 注 章 1 1 GIu Glu Pro Phe lie Thr Ser Lys Met Ala Ser Leu Leu Ser Asp Leu $ 項 再 寫 本 ί 1 1 AAT 420 TGT TCA TTC CAA GCA AGT GCG 425 430 1320 1 丄 Λ-— 1 Asn Cys Ser Phe Gin Ala Ser Ala I 435 440 I 序列I D N 〇 2 1 1 序列長度： 序列類型： 4 4 0 胺基酸 1 訂 1 拓蹼學：直 線 1 I 分子類型： 蛋白質 1 J 反意義：無 1 1 來源： I 微生物.·三 葉草黃 脈病 毒 1 1 I 外觀： 1 1 4-437 E mat -胜 肽 1 I 序列描述： 1 1 I Lys Phe Gin Gly Lys Ser Lys Arg Thr Arg Gin Lys Leu Lys Phe Arg 1 I 1 5 10 15 1 I Ala Ala Arg Asp Met Lys Asp Arg Tyr Glu Val His Ala Asp Glu Gly 1 20 25 30 1 Thr Leu Val Glu Asn Phe Gly Thr Arg Tyr Ser Lys Lys Gly Lys Thr 1 35 40 45 1 Lys Gly Thr Val Val Gly Leu Gly Ala Lys Thr Arg Arg Phe Thr Asn 1 1 50 55 60 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） -U4-- 459046 五、發明説明（"ο

Met Tyr Gly Phe Asp Pro Thr Glu Tyr Ser Phe Ala Arg Tyr Leu Asp 65 70 75 80

Pro lie Thr Gly Ala Thr Leu Asp Glu Thr Pro 11« Hifi Ληιι Val Arm 85 90 95

Leu Val Ala Glu His Phe Gly Asp lie Arg Leu Asp Met Val Asp Lys 100 105 110

Glu Leu Leu Asp Lys GXn His Leu Tyr Leu Lys Arg Pro He Glu Cys 115 120 125

Tyr Phe Val Lys Asp Ala Gly Gin Lys Val Met Arg lie Asp Leu Thr 130 135 140

Pro His Asn Pro Leu Leu Ala Ser Asp Val Ser Thr Thr lie Met Gly 145 150 155 160

Tyr Pro Glu Arg Glu Gly Glu Leu Arg Gin Thr Gly Lys Ala Arg Leu 165 170 175

Val Asp Pro Ser Glu Leu Pro Ala Arg Asn Glu Asp He Asp Ala Glu 180 185 190

Phe Glu Ser Leu Asn Arg lie Ser Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro He 195 200 205

Ser Gin Asn Val Cys Leu Leu Thr Asn Glu Ser Glu Gly His Arg Glu 210 215 220

Lys Met Phe Gly He Gly Tyr Gly Ser Val He He Thr Asn Gin His 225 230 235 240

Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly Glu Leu Ser lie Gin Ser Lys His Gly 245 250 255

Tyr Phe Arg Cys Arg Asn Thr Thr Ser Leu Lys Met Leu Pro Leu Glu 260 265 270 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Gly His Asp lie Leu Leu lie Gin Leu Pro Arg A9p Phe Pro Val Phe 275 280 285

Pro Gin Lys He Arg Phe Arg Glu Pro Arg Val Asp Agp Lys He Val 290 295 300

Leu Val Ser Thr Asn Phe Gin Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Val Ser 305 310 315 320

Glu Ser Ser Asn 工le Ser Arg Val Gin Ser Ala Asn Phe Tyr Lys His 325 330 335

Trp He Ser Thr Val Ala Gly His Cys Gly Asn Pro Met Val Ser Thr 340 345 350

Lys Asp Gly Phe lie Val Gly lie His Ser Leu Ala Ser Leu Thr Gly 355 360 365 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4規格（2丨0 X 297公釐）…卜 A7 B7 經濟部中央標準局舅工消費合作杜印製 五、發明説明（M ) 1 1 Asp Val Asn lie Phe Thr Ser Phe Pro Pro Gin Phe Glu Asn Lys Tyr 1 1 3 70 375 380 1 Leu Gin Lys Leu Ser Glu His Thr Trp Cys Ser Gly Trp Lys Leu Asn L 3Θ5 390 395 400 1 Leu Gly Lys lie Ser Trp Gly Gly lie Asn He Val Glu Asp Ala Pro 請 1 1 405 410 415 先 閱 1 1 Glu Glu Pro Phe lie Thr Ser Lys Met Ala Ser Leu Leu Spr ϊ,ηιι 讀 \ 1 420 425 430 l Asn Cys Ser Phe Gin Ala Ser Ala 之 注 1 435 440 意 事 1 序 列 ID N 〇 : 3 項 iS- 1 序 列 長度： 2 5 填 寫 l 序 列 類型： 核酸 本 t 1 拓 蹼 學：直 線 t 分 子 類型： 其他 合 酸，合成 之DNA 1 1 序 列 描述： 1 1 GTCCATGGGG AAAAGTAAGA GAAC A 25 1 1 序 列 ID Ν ο : 4 訂 序 列 長度： 2 0 1 I 序 列 類型： 核酸 1 I 拓 蹼 學：直 線 1 1 分 子 類型： 其他 核 酸，合成 之D N A 1 序 列 描述： 丄 ACTCTGAGAC CGTGCTCGAG 2 0 1 序 列 ID No； 5 1 1 序 列 長度： 2 0 1 序 列 類型： 核酸 1 I 拓 蹼 學：直 線 1 j 分 子 類型： 其他 核 酸，合成 之DNA 1 序 列 描述： 1 AGGAAAGAG TTCCTCGASC 17 1 1 序 列 ID Mo: 6 1 j 序 列 長度： 36 1 -1 1 6 ** 1 1 1 ---1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標窣（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局—工消費合作社印製 /1 … ;· .. V A7 B7五、發明説明（^ ) 序列類型：核酸 拓蹼學：直線 分子類型：其他核酸，合成之DNA 序列描述： AATTGTTCAT TCAAGCACC TGGGCCACCA CCTGGC 36 序列I D N 〇 : 7 序列長度：3 6 序列類型：核酸 拓蹼學：直線 分子類型：其他核酸，合成之DMA 序列描述： GCCAGGTGGT GGCCCAGGTG CTTGGAATGA ACAATT 36 序列I D N 〇 : 8 序列長度：3 0 序列類型：核酸 拓蹼學：直線 分子類型：其他核酸，合成之DNA 序列描述： TTGTCAGCAC ACCTGGGAGC TGTA6AGCTC 25 序列I D N 〇 : 9 序列長度：7 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直線 分子類型：蛋白質 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（4 ) 序列描述： Ala Pro G 1 y Pro Pro Pro G1y 7 1 5 序列 I D N o : 1 0 序列長度：7 序列類型：胺基酸 拓蹼學：直線 分子類型：蛋白質 序列描述： Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro 7 1 5 序列 I fl N o : 1 1 序列長度：1 6 5 0 序列類型：核酸 股性：雙股 拓蹼學：直線 分子類型：cDNA至 raRNA 來源： 微生物：Homo sapiens 外觀： 符號表現特擻：C D S 出現之位置：1 .. 1 6 4 7 測定特別之方法：E 符號表現待擞：m a t胜肱 -1 1 8- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格ί 210X297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（"7 ) 出現之位置：70, ..1647 測定特擻之方法：E 符號表現待徴：Sig胜肽 出現之位置：1 . . 6 9 _定特徵之方法：E 序列 ATG TCA TGT GAG GAC GGT CGG GCC CTG GAA GGA ACG CTC TCG GAA TTG 48

Met Ser Cys Glu Asp Gly Arg Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ser Glu Leu -23 -20 -15 -10 GCC GCG GAA ACC GAT CTG CCC GTT GTG TTT GTG AAA CAG AGA AAG ATA 96

Ala Ala Glu Thr Asp Leu Pro Val Val Phe Val Lys Gin Arg Lys lie -5 15 GGC GGC CAT GGT CCA ACC TTG AAG GCT TAT CAG GAG GGC AGA CTT CAA 144

Gly Gly His Gly Pro Thr Leu Lys Ala Tyr Gin Glu Gly Arg Leu Gin 10 15 20 25 AAG CTA CTA AAA ATG AAC GGC CCT GAA GAT CTT CCC AAG TCC TAT GAC 192

Lys Leu Leu Lys Met Asn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lys Ser Tyr Asp 30 35 40 TAT GAC CTT ATC ATC ATT GGA GGT GGC TCA GGA GGT CTG GCA GCT GCT 240

Tyr Asp Leu He He He Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala 45 50 55 -119- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁) Γ 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 Α7 Β7_____ 五、發明説明（w) AAG GAG GCA GCC CAA TAT GGC AAG AAG GTG ATG GTC CTG GAC TTT GTC 28Θ

Lys Glu Ala Ala Gin Tyr Gly Lya Lya Val Met Val Leu Asp Phe Val 60 65 70 ACT CCC ACC CCT CTT GGA ACT AGA TGG GGT CTT GGA GGA ACA TGT GTG 336

Thr Pro Thr Pro Leu Gly Thr Arg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys Val 75 80 85 AAT GTG GGT TGC ATA CCT AAA AAA CTG ATG CAT CAA GCA GCT TTG TTA 384

Asn Val Gly Cys lie Pro Lys Lys Leu Met His Gin Ala Ala Leu Leu 90 95 100 105 GGA CAA GCC CTG CAA GAC TCT CGA AAT TAT GGA TGG AAA GTC GAG GAG 432

Gly Gin Ala Leu Gin Asp Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu 110 115 120 ACA GTT AAG CAT GAT TGG GAC AGA ATG ATA GAA GCT GTA CAG AAT CAC 480

Thr Val Lys His Asp Trp Asp Arg Met lie Glu Ala Val Gin Asn His 125 130 135 ATT GGC TCT TTG AAT TGG GGC TAC CGA GTA GCT CTG CGG GAG AAA AAA 528 lie Gly Ser Leu Asn Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lys Lys 140 145 150 GTC GTC TAT GAG AAT GCT TAT GGG CAA TTT ATT GGT CCT CAC AGG ATT 576

Val Val Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Gin Phe lie Gly Pro His Arg lie 155 160 165 AAG GCA ACA AAT AAT AAA GGC AAA GAA AAA ATT TAT TCA GCA GAG AGA 624

Lys Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lys. lie Tyr Ser Ala Glu Arg 170 175 180 185 TTT CTC ATT GCC ACT GGT GAA AGA CCA CGT TAC TTG GGC ATC CCT GGT 672

Phe Leu lie Ala Thr Gly Glu Arg Pro Arg Tyr Leu Gly lie Pro Gly 190 195 200 GAC AAA GAA TAC TGC ATC AGC AGT GAT GAT CTT TTC TCC TTG CCT TAC 720

Asp Lys Glu Tyr Cys lie Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu Pro Tyr 205 . 210 ___215__ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2丨〇X297公釐） (請先閲讀背面之注^^項再填寫本頁) ί衣· 訂

經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 A7 ___B7______ 五、發明説明（) TGC CCG GGT AAG ACC CTG GTT GTT GGA GCA TCC TAT GTC GCT TTG GAG 76Θ

Cys Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Tyr Val Ala Leu Glu 220 225 230 TGC GCT GGA TTT CTT GCT GGT ATT GGT TTA GAC GTC ACT GTT ATG GTT 81¾

Cys Ala Gly Phe Leu Ala Gly lie Gly Leu Asp Val Thr Val Met Val 235 240 245 AGG TCC ATT CTT CTT AGA GGA TTT GAC CAG GAC ATG GCC AAC AAA ATT 864

Arg Ser lie Leu Leu Arg Gly Phe Asp Gin Asp Met Ala Asn Lys rie 250 255 260 265 GGT GAA CAC ATG GAA GAA CAT GGC ATC AAG TTT ATA AGA CAG TTC GTA 912

Gly Glu His Met Glu Glu His Gly lie Lys Phe lie Arg Gin Phe Val 270 275 280 CCA ATT AAA GTT GAA CAA ATT GAA GCA GGG ACA CCA GGC CGA CTC AGA 960

Pro lie Lys Val Glu Gin lie Glu Ala Gly Thr Pro Gly Arg Leu Arg 285 290 295 GTA GTA GCT CAG TCC ACC AAT AGT GAG GAA ATC ATT GAA GGA GAA TAT 1008

Val Val Ala Gin Ser Thr Asn Ser Glu Glu lie lie Glu Gly Glu Tyr 300 305 310 AAT ACG GTG ATG CTG GCA ATA GGA AGA GAT GCT TGC ACA AGA AAA ATT 1056

Asn Thr Val Met Leu Ala lie Gly Arg Asp Ala Cys Thr Arg Lys He 315 320 325 GGC TTA GAA ACC GTA GGG GTG AAG ATA AAT GAA AAG ACT GGA AAA ATA 1104

Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys lie Asn Glu Lys Thr Gly Lys lie

330 335 340 34S CCT GTC ACA GAT GAA GAA CAG ACC AAT GTG CCT TAC ATC TAT GCC ATT 1152

Pro Val Thr Asp Glu Glu Gin Thr Asn Val Pro Tyr He Tyr Ala lie 350 355 360 GGC GAT ATA TTG GAG GAT AAG GTG GAG CTC ACC CCA GTT GCA ATC CAG 1200

Gly Asp lie Leu Glu Asp Lys Val Glu Leu Thr Pro Val Ala lie Gin 365 370 375 本紙張尺度適用中國國家標芈（CNS ) A4規格（2丨OX297公t ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 笨· 訂 A7 B7 經 濟 部 t 矣

I 五、發明説明（^ ) 1 1 1 GCA GGA AGA TTG CTG GCT CAG AGG CTC TAT GCA GGT TCC ACT GTC AAG 124E Ϊ ! 卜 Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gin Arg Leu Tyr Ala Gly Ser Thr Val Lys 1 380 385 390 I 請 κ 先 1 TGT GAC TAT GAA AAT GTT CCA ACC ACT GTA TTT ACT CCT TTG GAA TAT :間 1 Cys Asp Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr 背 面 之 1 395 400 405 1 注 I 意 1 GGT GCT TGT GGC CTT TCT GAG GAG AAA GCT GTG GAG AAG TTT GGG GAA 134； 1事 項 再 1 1 Gly Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Val Glu Lys Phe Gly Glu 1 410 415 420 425 4 寫 本 1 裝 頁 1 GAA AAT ATT GAG GTT TAG CAT AGT TAC TTT TGG CCA TTG GAA TGG ACG 139 I Glu Asn He Glu Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp Pro Leu Glu Trp Thr 1 430 435 440 1 I ATT CCG TCA AGA GAT AAC AAC AAA TGT TAT GCA AAA ATA ATC TGT AAT 144( 1 1 He Pro Ser Arg Asp Asn Asn Lys Cys Tyr Ala Lys He lie Cyg Asn 訂 445 450 455 1 | ACT AAA GAC AAT GAA CGT GTT GTG GGC TTT CAC GTA CTG GGT CCA AAT 1488 1 1 Thr Lys Asp Asn Glu Arg Val Val Gly Phe His Val Leu Gly Pro Asn 1 460 465 470 線 GCT GGA GAA GTT ACA CAA GGC TTT GCA GCT GCG CTC AAA TGT GGA CTG 153€ ! Ala Gly Glu Val Thr Gin Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Cys Gly Leu 1 4 75 480 485 t | ACC AAA AAG CAG CTG GAC AGC ACA ATT GGA ATC CAC CCT GTC TGT GCA 158*： 1 1 1 Thr Lys Lys Gin Leu Asp Ser Thr He Gly lie His Pro Val Cyg Ala 1 490 495 500 505 1 | GAG GTA TTC ACA ACA TTG TCT GTG ACC AAG CGC TCT GGG GCA AGC ATC 163； > 1 Glu Val Phe Thr Thr Leu Ser Val Thr Lys Arg Ser Gly Ala Ser lie 1 I 510 515 520 1 1 CTC CAG GCT GGC TGC TGA 165( ) 1 1 r Leu Gin Ala Gly Cys 1 525 1

本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Μ说格（210X297公D 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 459046 A7 __B7_五、發明説明（〜） 序列 I D N 〇 : 1 2 序列長度：5 2 6 序列類型：胺基酸 股性：單股 拓蹼學：直線 分子類型：胜呔 序列 Met Ser Cys Glu Asp Gly Arg Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ser Glu Leu -23 -20 -15 -10 Ala Ala Glu Thr Asp Leu Pro Val Val Phe Val Lys Gin Arg Lys lie -5 1 5 Gly Gly His Gly Pro Thr Leu Lys Ala Tyr Gin Glu Gly Arg Leu Gin 10 15 20 25 Lys Leu Leu Lys Met Asn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lys Ser Tyr Asp 30 35 40 Tyr Asp Leu lie lie lie Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala 45 50 55 Lys Glu Ala Ala Gin Tyr Gly Lys Lys Val Met Val Leu Asp Phe Val 60 65 70 Thr Pro Thr Pro Leu Gly Thr Arg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys Val 75 80 85 Asn Val Gly Cys lie Pro Lys Lys Leu Met His Gin Ala Ala Leu Leu 90 95 100 105 Gly Gin Ala Leu Gin Asp Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu 110 115 120 Thr Val Lys His Asp Trp Asp Arg Met lie Glu Ala Val Gin Asn His 125 130 135 lie Gly Ser Leu Asn Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lys Lys 140 145 150 Val Val Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Gin Phe He Gly Pro His Arg lie 155 160 165 Lys Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lys lie Tyr Ser Ala Glu Arg 170 175 180 185 Phe Leu lie Ala Thr Gly Glu Arg Pro Arg Tyr Leu Gly He Pro Gly 190 195 200 Asp Lys Glu Tyr Cys lie Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu Pro Tyr 205 210 215 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 459046 A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、 發明説明（ 1 1 Cys Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Tyr Val Ala Leu Glu 1 I 220 225 230 1 \ Cys Ala Gly Phe Leu Ala Gly lie Gly Leu Asp Val Thr Val Met Val 1 235 240 245 -N 锖 先 閲 讀 J Arq Ser He Leu Leu Arg Gly Phe Aep Gin Asp Met ΛΙλ Ληη ΤΙ Λ 1 250 255 260 265 1 1 Gly Glu His Met Glu Glu His Gly lie Lys Phe lie Arg Gin Phe Val 背 面 1 I 270 275 280 之 1 注 I Pro lie Lys Val Glu Gin lie Glu Ala Gly Thr Pro Gly Arg Leu Arg 意 | 285 290 295 事 項 1 | val Val Ala Gin Ser Thr Asn Ser Glu Glu lie He Glu Gly Glu Tyr 再 填 寫 本 頁 1 Asn Thr 300 Val Met Leu Ala He 305 Gly Arg Asp Ala Cys 310 Thr Arg Lys lie 策 1 315 320 325 •W 1 Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys lie Asn Glu Lys Thr Gly Lys lie 1 330 335 340 345 I Pro Val Thr Asp Glu Glu Gin Thr Asn Val Pro Tyr He Tyr Ala lie 1 350 355 360 1 訂 I Gly Asp Ue Leu Glu Asp Lys Val Glu Leu Thr Pro Val Ala lie Gin 36S 370 375 1 I Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gin Arg Leu Tyr Ala Gly Ser Thr Val Lys 1 | 380 385 390 1 | Cys Asp Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr 1 I 395 400 405 - Gly Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Val Glu Lys Phe Gly Glu * 410 415 420 425 1 Glu Asn lie Glu Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp Pro Leu Glu Trp Thr 1 430 435 440 1 lie Pro Ser Arg Asp Asn Asn Lys Cys Tyr Ala Lys ne He Cys Agn 1 I 445 450 455 | Thr Lys Asp Asn Glu Arg Val Val Gly Phe His Val Leu Gly Pro Asn 1 ( 460 465 470 I Ala Gly Glu Val Thr Gin Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Cys Gly Leu 1 | 4 75 480 485 1 Thr Lys Lys Gin Leu Asp Ser Thr lie Gly lie His Pro Val Cys Ala 1 490 495 500 505 1 Glu Val Phe Thr Thr Leu Ser Val Thr Lys Arg Ser Gly Ala Ser lie 1 510 515 520 1 Leu Gin Ala Gly Cys 1 1 525 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210Χ297公釐） 叫 >4·-

iS Α7 Β7 五、發明説明（η 序列 I D Ν 〇 : 1 3 序列長度：1 5 序列類型：核酸 股性：雙股 拓蹼學：直線 分子類型：其他核酸 序列： TAAATAAATA A A T A A 序列 I D N o : 1 4 序列長度：6 6 序列類型：核酸 股性：雙股 拓蹼學：直線 分子類型：其他核酸 序列：

合成之D N A

合成之DN A (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 CTAGCGCTCT GGGGCAAGCA TCCTCCAGGC TGGCTGCCAC CACCACCACC ACCACTGATC 60 TAGACT 66f 序列 I D N o : 1 5 序列長度：18 序列類型：核酸 拓蹼學：直線 分子類型：其他核酸，合成之D N A 序列描逑： GGTCAQCAC A AATTTCCA 18 -1 2 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

經濟部中夬標率局員工消費合作社印I

* Z卜 ' A7 _B7五、發明説明（，斗） 序列 I D N 〇 : 1 6 序列長度：2 4 序列類型：核酸 拓蹼學：直線 分子類型：其他核酸，合成之DNA 序列描逑： AAACACAACT TGGAATGAAC AATT 序列 I D N 〇 : 1 7 序列長度：2 4 序列類型：核酸 拓蹼學：直線 分子類型：其他核酸，合成之DNA 序列描述： TCATTCCAAG TTGTGTTTGT GAAA 序列 I 1) ϊί 〇 : 1 8 序列長度：1 8 序列類型：核酸 拓蹼學：直線 分子類型：其他核酸，合成之DNA 序列描述： CATAGGATGC TCCAACAA (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、17 -12 6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4规格（2iOX；297公釐） 4 2

Claims (1)

1. 459〇4 Α8 BS C8 D8 六、申請專利範圍 ——: 第841〇72〇6號「利用自溶融合蛋白質及新穎還原多肽之表 現系統」專利案 (90年6月19日修正） Λ申請專利範圍： 種編碼融合蛋白質之聚核苷酸序列，呈5，至3，方向 和相同開讀框*其順序爲（a)-(b)-(c)包括： a) 一種序列，其編碼爲三葉草黃脈病毒核包涵體3蛋 白質，如下示序列ID No.1中核苷酸No.10〜1311 ; b) ~種序列，其編碼爲一可被該三g草黃脈病毒核包 涵體a蛋白質辨認且切割之切割胜肽選自Gln-Gly， Gln-Ser 及 Gln-Ala，及 〇—種編碼一多肽之聚核苷酸序列： 序歹 U ID N 〇 . 1 請 先 閱 讀 雨 項 再 硝一 % 本 1 .装 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 AAG TTC GCG GCA ACT TTA AAA GGT ATG TAT CCA ATC TTG GTT GAG TTA TAG τττ CCC CAC TAT CCT GTC GAC TTT GAG TCA CAA AAG ATG AGT AAG AGA ACA AGA AAG TTG AAG TTC AGA AGA GAC ATG GTG GAA AAT ACT GTT GTG GGT TTT GAC ACG GGT GCA GCT GAG CAT CTT GAC AAA GTA AAG GAT AAC CCA TTG GAG AGA GAA CCA TCA GAG AGT CTA AAT AAT GTT TGC TTT GGA ATT AAG GAT TTT GGA GGT TTG' CCC AGG ACA TTG GQQ CAC GCT GGT TTG GCA GGT GAA TTG CCC CGC ATA TTG CTA GGA TAT ΠΤ CAG CGT TAT ACT CGT GGT GCA GAG TAT GAT GAA GAC ATA TTA TAC CAG AAG AGC GAT CTC CGT GCG CGG AGT GGT ACA AAT GGT TCA GAA GTG TAT TCA AAA ACA TCA TTT ACC CCA AGG CTT CTC AAG GTG ATG GTT AGC CAA ACT AAT GAG TTG CGC GAG TCA GTG ATC CAT GCC GAT AAG AAA GGC AGA CGO TTC GCT AGG TAT ATT CAC AAT GAT ATG GTT AGA CCA ATA AGG ATT GAT ACA ACC ATA GGA AAG GCA GAT ATT GAT GAC TAT AAT GAA GGC CAT ATT, ACA AAT GAG G_GG AAG ACA ACT AAC CTT GAT GTA AAT GAC GAA TGT CTA ACA ATG GGT AGG TTA GCA GAG CCC ATT AGA GAG CAA CAT 48 96 144 192 2^0 288 336 384 432 480 528 576 624 672 720 泉 本紙張尺度適用中國國家#準（CNS ) Λ4規格（210X2?7公釐） A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範園 CTG TTC AGA XGG AAT AAT GGG GAG TTA TCA ATT CKk TCC AAG CAT GGC 763 TAC TTC AGA TGC CGC AAC ACC ACA AGC TTG AAG ATG CTG CCT TTG GAG 6l£ GGA CAT GAC ATT TTG TTG ATT CAJj TTA CCA AGG GAC TTT CCA GTG TTT Θ54 CCA CAA AAG ATT CGC ΊΤΓ kCG GAG CCA AGA GTG GAT GAC AAA ATT GTT 912 TTG GTC AGC ACA AAT TTC CAG GAA AAG AGT TCC TCG AGC ACG GTC TCA SSO GAG TCC AGT AAC ATT TCA AGA GTG CAG TCA GCC AAT TTC TAC AAG CAT 1008 TGG ATC TCA ACA GTA GCA GGA CAC TGT GGA AAC CCT ATG GTT TCG ACT 1C 5 6 AAA GAT GGA TIT ATT GTA GGT ATC CAC AGT CTT GCT TCA TTG ACA GGC 1104 GAC GTT AAC ATC TTC ACA AGC TTT CCG CCG CAG TTT GAG AAC AAA. TAT 1152 CTX CAG AAG CTC AGT GAA CAC ACA TGC TGT AGT GGA TGG AAA CTA AAT 1200 CTT GGA AAG ATT AGT TGG GGT GGA 'ATC AAC ATT GTG GAG GAT GCA CCT 124Θ GAA GAG CCC TTT ATA ACA TCC AAG ATG GCA AGC CTT CTT AGT GAT TTG 1296 AAT TGT TCA TTC CAA GCA AGT GCG l32〇 。 2. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸序列，其爲DNA。 3. 如申請專利範圍第2項之聚核苷酸序列，其爲以雙股 之型式。 4. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸序列，其中b)序列 爲全部或部分地被包含於序列a)或c)一者或兩者中。 5. 如申請專利範圍第4項之聚核苷酸序列，其中b)序列 爲全部被包含於a)和c)序列中。 6_如申請專利範圍第〖項之聚核苷酸序列，其中位於b) 序列所編碼之切割胜肽與〇序列所編碼之多肽間之一 個或多個胺基酸基被編碼。 7.如申請專利範圍第1項之聚核苷酸序列，其中其所編 ^之融合蛋白質被a)序列所編碼之核包涵體3蛋白質 切割’產生一多肽，其具有額外的N_終端胺基酸序列， 其終端殘基爲甘胺酸，絲胺酸或丙胺酸殘基。 ----------^------'訂------ - ί ί (請先閱讀背面之注意事項再禎寫本頁) 本纸張尺n用.中國财辟（CNS > (2歐297公度） A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 8. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸序列，其中其所編 碼之融合蛋白質被a)序列所編碼之核包涵體3蛋白質 切割，產生一多肽其具有額外的終端胺基酸序列， 其終端殘基爲甘胺酸，絲胺酸或丙胺酸殘基，若意欲* 該殘基可藉由適當的胺基胜肽酶之作用而移除。 9. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸序列，其中脯胺酸 殘基爲被編碼於多肽N終端和切割胜肽C終端之間。 10. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸序列，其中脯胺酸 殘基爲被編碼於多肽N終端和切割胜肽C終端之間， 藉此允許任何延伸超過脯胺酸殘基之殘基可藉由胺基胺 胜肽酶P(3.4.11.9)之作用而切割。 11. 如申請專利範圔第10項之聚核苷酸序列，其中，於切 割到脯胺酸殘基後，脯胺酸殘基其後可藉由脯胺酸亞胺 基胜肽酶（3.4.11.5)之作用而移除。 12. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸序列，其中丙胺酸 殘基被編碼於多肽N終端和切割胜肽C終端之間。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 13. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸序列’其中丙胺酸 殘基被編碼於多肽N終端和切割胜肽C終端之間’ 藉此允許任何延伸超過丙胺酸殘基之殘基可藉由胺基胜 肽酶P(3.4.11.9)之作用而切割，且丙胺酸殘基可藉由 丙胺酸胺基胜肽酿（3.4·11·14)之催化作用而切割。 14. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸序列’其中》)序列 編碼如下序列表之序列ID No.2中所列胺基酸編號4 -3-本紙張尺度迖用中國國家標準（CNS ) A4現格（2丨〇><297公釐） A8 B8 CS DS 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範園 至 437 之多肽 .· Lys Phe Gin Gly Lya Ser Ly3 Arg Thr Arc Gin Lys Leu Lys Phe Arg 1 5 10 IS Ala Ala Arg A3p Met Lys Asp Arg Tyr Glu vai His λΐ a Asp Glu Gly 20 25 30 Thr Leu Val GIu Asn Phe Gly Thr Arg Tyr Ser Lya Lya Gly Lys Thr 35 40 45 Lys Gly Thr val VaL Gly Lev: Gly Ala Lya Thr Arg Arc pH ^ Thr Asn 50 55 60 Met Tyr Gly Phe Asp Pro Thr Glu Tyr Ser Pha Ala Arg Tyr Leu Asp 65 70 is eo Pro lie Thr Gly Ala Thr Leu Asp Glu Thr Pro lie His Asn Val Aan 85 90 95 Leu Val Ala GIu His Phe Gly ksp lie Arg* Leu Asp Mec vai Asp Lys 100 105 110 GIu Leu Leu Asp Lys Gin His Leu Tyr Leu Lys Arg Pro He Glu Cys 115 120 125 Tyr Phe Val Lys Asp Ala Gly Gin Lys Val Mec Arg lie Asp Leu Thr 130 135 140 Pro His Asa Pro Leu Leu Ala Ser Asp Val Ser Thr Thr lie Mec Gly 145 X50 155 16。 Tyr Pro GIu Arg Glu Gly Glu Leu Arg Gin Thr Gly Lys Ala Arg Leu 1S5 170 17S Val Asp Pro Ser GlU Leu Pro Ala Arg Asn Glu Asp lie Asp Ala Glu 1Θ0 185 190 Phs Glu Ser Leu Asn Arg lie Ser Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro lie 195 200 205 ser G1*t Asn Val Cys Leu Leu Thr Asn Glu Ser Glu Gly His Arg Glu 21Q 215 220 Lys Met Phe Gly lie Gly Tyr Gly Ser Val Ue lie Thr Α3Γ. Gin Hia 225 230 235 240 0〇 «4 _ \ 頁 木紙張尺度適用中1¾國家標準（CNS ) A4坭格（210X297公釐） 請.. 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再〜 裝 訂 線 459046 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly Glu Leu Ser lie Gin Ser Lys His GLy 245 250 25S Tyr Fhe Arc Cys Arg Asc Thr Thr Ser Leu Lys Mec Leu Pro Leu Glu 2S0 2S5 270 Gly His Asp lie Leu Leu lie Gin Leu Pro Arg Asp Phe Pro Val Phe 275 2S0 2 0i Pro Gin Lye lie Arg Phe Arg Glu Prc Arg Val Asp Asp Lys lie Val 290 295 300 Leu Val Ser Thr Asn Phe Gin Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Val Ser 305 3i〇 315 320 Glu Ser Ser ksn lie Ser Arg val Glr* Ser Ala Asn Phe Tyr Lys His 325 330 33S Trp lie Ser Thr Vai Ala Gly Kis Cys Gly Asn Pro Mec Val Ser Thr 340 345 350 Lys Asp Gly Phe lie Val Gly 工le His Ser Leu Ala Ser: Lgu Thr Gly 355 3G0 363 Asp Val Asn lie Phe Thr Ser Phe Pro Pro Gin Phe Glu Asn Lys Tyr 370 37S 3Θ0 Leu Gin 1^3 Leu Ser Glu His Thr Trp Cy3 Ser Gly Trp Lys Leu Asn 385 390 335 400 Leu Gly Lys lie Sar Trp Gly Gly lie lie Vai Glu Asp Ala Pro 405 410 415 Glu Glu Pro Phe He Thr Ser Lys Me： Ala Ser Leu Leu Ser Asp Leu 420 425 430 Asn Cys Ser Phe Gin Ala Ser Ala 厂 43S 440 ’ 、c : ί 15.—種聚核苷酸序列，其編碼如下序列表之序列ID No·1 中所列核苷酸編號至1311之三葉草黃脈病毒核包 涵體a蛋白質： -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4见格（210 X 297公釐） ----------裝------訂------泉 i ( (請先閱讀背面之注意事項再垓寫本頁) 經濟部智慧时產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 'r 459046 六、申請專利範圍 AAG TTC CAA GGG ΑΛΑ AGT AAG AGA ACA AGA CAA AAG TTG AAG TTC AGA GCG GCA AGA GAC ATG AAG GAT CGT TAT GAA GTG CAT GCC GAT GAG GGG ACT TTA C'TG GAA ΛΑΤ ITT GGA ACT CGT TAT TCA AAG AAA GGC AAG ACA AAA GGT ACT GTT GTG GGT TTG' GGT GCA AAA ACA AGA CG<3 TTC ACT AAC ATG TAT GGT TTT GAC CCC ACG GAG TAT TCA TTT GCT AGG TAT CTT GAT CCA ATC ACG GGT GCA ACA TTG GAT GAA ACC CCA ATT CAC AAT GTA AAT TTG GTT GCT GAG CAT TTT GGC GAC ΑΎΑ AGG CTT GAT ATG GTT GAC AAC GAG TTA CTT GAC AAA CA.G CAC TTA TAC CTC AAG AGA CCA ATA GAA TGT TAG TTT GTA AAG GAT GCT GGT CAG AAG GTG ATG AGG ΛΤΤ GAT CTA ACA CCC CAC AAC CCA TTG TTG GCA AGC GAT GTT AGC ACA ACC ΑΤΛ ATG GGT TAT CCT GAG AGA GAA GCT GAA CTC CGT CAA ACT GC-A AAG GCA AGG TTA GTG GAC CCA TCA C-AG TTG CCC GCG CGO AAT GAG GAT ATT GAT GCA GAG TTT GAG AGT CTA AAT CGC ATA AGT GCT TTG CGC GAC TAT AAT CCC ATT TCA CAA AAT GTT TGC TTG CTA ACA AAT GAG TCA GAA GGC CAT AGA GAjG AAG ATG ITT GGA ATT GGk TAT GGT TCA GTG ATC ATT ACk ΛΛΤ CAA CAT CTG TTC AGA AGG AAT ΡΛΊ GGG GAG TTA TCA ATT CAA TCC AAG CAT QQC TAC TTC AGA TGC CGC AAC ACC ACA AGC TTG ^AG ATG CTG CCT TTG GAG GGA CAT GAC ATT TTG TTG ATT CA£j TTA CCA AGG GAC TTT CCA GTG TTT CCA GAA AAG ATT CGC TTT AGG GAG CCA AGA GTG GkT GAC AAA ATT GTT TTG GTC AGC ACA λΑΤ TTC CAG GAA hXG AGT TCC TCG AGC ACG GTC TCA GAG TCC AGT AAC ATT TCA Λ3Α GTG CAG TCA GCC AAT TTC TAC AAG CAT TGG ATG TCA ACA GTA GCA GGA CAC TGT GGA AAC CCT ATG GTT TCG ACT AAA GAT G<3A TTT ATT GTA GGT ATC CAC AGT CTT GCT TCA TTG ACA GGC GAC GTT AAC ATC TTC ACA AGC TTT CCG CCG CAG TTT GAG AAC AAA TAT CTA CAG AAG CTC AGT GAA CAC ACA TGG TGT AGT GGA TGG AAA CTA AAT CTT GGA AAG ATT AGT TGG GGT GGA -ATC AAC ATT GTG GAG GAT GCA CCT GAA GAG CCC ΓΓΤ ATA ACA TCC AAG ATG GCA AGC CTT CTT AGT GM TTG AAT TGT TCA TTC CAA GCA AGT GCG 16. —種表現多肽之方法，其中內含序列AsnCysSer 〇c PheGInX之多肽的前驅物型式經三葉草黃脈病毒核包 涵體a蛋白質切割。 17. —種表現多肽之方法，其中內含序列AsnCysSer PheGInX之多肽的前驅物型式經三葉草黃脈病毒核包 涵體a蛋白質切割，以產生多肽之成熟型式。 本紙张又度適用中国國家標牟（CNS > Λ4規格（2I0X297公釐） 48 56 14 4 192 2^,0 2S8 3:5 354 4 32 4-SO S2S 576 624 c72 720 76S 816 86-i 912 seo 10C8 ΙΟΞδ 1104 1152 12C0 1249 1296 1320 , 請 先 閱 讀 背 άι 之 注 意 事 項 再 填 If 本 頁 經濟部智慧时/!.局S工消費合作杜印製 '，、r , A8 . B8 C8 __ D8 六、申請專利範圍 18·如申請專利範圍第1項之聚核苷酸序列，其再編碼一 序列a)上游之引導序列- 19_一種被聚核苷酸序列編碼之融合蛋白質，於5·至3·方 向和相同開讀框中，其順序爲（a)-(b)-(〇包括： a) 一種序列，其編碼爲三葉草黃脈病毒核包涵體a蛋 白質，如下示序列ID No.1中核苷酸No.10〜1311; b) —種序列，其編碼爲一可被該三葉草黃脈病毒核包 涵體a蛋白質辨認且切割之切割胜肽，選自Gln-Gly， Gln-Ser 及 Gin-Ala,及 c) 一種編碼爲一多肽之聚核苷酸序列； 序歹 ί] ID N 〇 . 1 : AAG TTC CAA GGG AAA AGT AAG AGA ACA AGA CAA AAG TTG AAG TTC AGA 48 Lys Phe Gin Gly Lys Ser Lys Arg Thr Arg Gin Lys Leu Lys Phe Arg 1 5 10 15 GCG GCA AGA GAC ATG AAG GAT CGT TAT GAA GTG CAT GCC GAT GAG GGG 96 Ala Ala Arg Asp Met Lys Asp Arg Tyr Glu Val His Ala Asp Glu Gly 20 25 30 ACT TTA GTG GAA AAT TTT GGA ACT CGT TAT TCA AAG AAA GGC AAG ACA 144 Thr Leu Val Glu Asn Phe Gly Thr Arg Tyr Ser Lys Lys Gly Lys Thr 35 40 45 AAA GGT ACT GTT GTG GGT TTG GGT GCA AAA ACA AGA CGG TTC ACT AAC 192 Lys Gly Thr Val Val Gly Leu Gly Ala Lys Thr Arg Arg Phe Thr Asn 50 55 60 本紙張尺度適用中國1家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------------- - _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

   經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 ATG TAT GGT TTT GAC CCC ACG GAG TAT TCA TTT GCT AGG TAT CTT GAT 240 Met Tyr Gly Phe Asp Pro Thr Glu Tyr Ser Phe Ala Arg Tyr Leu Asp 65 70 75 80 CCA ATC ACG GGT GCA ACA TTG GAT GAA ACC CCA ATT CAC AAT GTA AAT 283 Pro lie Thr Gly Ala Thr Leu Asp Glu Thr Pro lie His Asn Val Asn 85 90 95 TTG GTT GCT GAG CAT TTT GGC GAC ATA AGG CTT GAT ATG GTT GAC AAG 336 Leu Val Ala Glu His Phe Gly Asp lie Arg Leu Asp Men Val Asp Lys 100 105 110 GAG TTA CTT GAC AAA CAG CAC TTA TAC CTC AAG AGA CCA ATA GAA TGT 3 84 Glu Leu Leu Asp Lys Gin His Leu Tyr Leu Lys Arg Pro lie Glu Cys 115 120 125 TAC TTT GTA AAG GAT GCT GGT CAG AAG GTG ATG AGG ATT GAT CTA ACA 432 Tyr Phe Val Lys Asp Ala Gly Gin Lys Val Met Arg lie Asp Leu Thr 130 135 140 CCC CAC AAC CCA TTG TTG GCA AGC GAT GTT AGC ACA ACC ATA ATG GGT 480 Pro His Asn Pro Leu Leu Ala Ser Asp Val Ser Thr Thr lie Met Gly 145 150 155 160 TAT CCT GAG AGA GAA GGT GAA CTC CGT CAA ACT GGA AAG GCA AGG TTA 528 Tyr Pro Glu Arg Glu Gly Glu Leu Arg Gin Thr Gly Lys Ala Arg Leu 165 170 175 GTC GAC CCA TCA GAG TTG CCC GCG CGG AAT GAG GAT ATT GAT GCA GAG 576 Val Asp Pro Ser Glu Leu Pro Ala Arg Asn Glu Asp 工le Asp Ala Glu 180 185 190 TTT GAG AGT CTA AAT CGC ATA AGT GGT TTG CGC GAC TAT AAT CCC ATT 624 Phe Glu Ser Leu Asn Arg He Ser Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro lie 195 200 205 TCA CAA AAT GTT TGC TTG CTA ACA AAT GAG TCA GAA GGC CAT AGA GAG 672 Ser Gin Asn Val Cys Leu Leu Thr Asn Glu Ser Glu Gly His Arg Glu 210 215 220'； :: ; Π -I-----------裝--- ί (請先閱讀背面之汶意事項再填寫本頁) 訂· - 本紙張尺度適角中囤囵家標準（CNS)A4規格（210 X 297公堃） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 )u A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 AAG ATG TTT GGA ATT GGA TAT GGT TCA GTG ATC ATT ACA AAT CAA CAT 720 Lys Met Phe Gly lie Gly Tyr Gly Ser Val lie lie Thr Asn Gin His 225 230 235 240 _ CTG TTC AGA AGG AAT AAT GGG GAG TTA TCA ATT CAA TCC AAG CAT GGC 768 Leu Phe Arg Arg Asn Asn Gly Glu Leu Ser lie Gin Ser Lys His Gly 245 250 2B5 TAC TTC AGA TGC CGC AAC ACC ACA AGC TTG AAG ATG CTG CCT TTG GAG 816 Tyr Phe Arg Cys Arg Asn Thr Thr Ser Leu Lys Met Leu Pro Leu Glu 260 265 270 GGA CAT GAC ATT TTG TTG ATT CAG TTA CCA AGG GAC TTT CCA GTG TTT 864 Giy His Asp He Leu Leu 工le Gin Leu Pro Arg Asp Phe Pro Val Phe 275 280 285 CCA CAA AAG ATT CGC TTT AGG GAG CCA AGA GTG GAT GAC AAA ATT GTT 912 Pro Gin Lys lie Arg Phe Arg Glu Pro Arg Val Asp Asp Lys 工le Val 290 295 300 TTG GTC AGC ACA AAT TTC CAG GAA AAG AGT TCC TCG AGC ACG GTC TCA 960 Leu Val Ser Thr Asn Phe Gin Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Val Ser 305 310 315 320 GAG TCC AGT AAC ATT TCA AGA GTG CAG TCA GCC AAT TTC TAC AAG CAT 100 8 Glu Ser Ser Asn lie Ser Arg Val Gin Ser Ala Asn Phe Tyr Lys His 325 330 335 TGG ATC TCA ACA GTA GCA GGA CAC TGT GGA AAC CCT ATG GTT TCG ACT 105 6 Trp lie Ser Thr Val Ala Gly His Cys Gly Asn Pro Met Val Ser Thr 340 345 350 AAA GAT GGA TTT ATT GTA GGT ATC CAC AGT CTT GOT TCA TTG ACA GGC 1104 Lys Asp Gly Phe He Val Gly lie His Ser Leu Ala Ser Leu Thr Gly 355 360 365 GAC GTT AAC ATC TTC ACA AGC TTT CCG CCG CAG TTT GAG AAC AAA TAT 11B2 Asp Val Asn lie Phe Thr Ser Phe Pro Pro Gin Phe Glu Asn Lys Tyr 370 375 380.: ； ' 乂 本紙張尺度適用_ +同固家標準（CNS)A4規格（210 X 297公g ) ---I-------，裝--------訂---------^ (請先閱讀背面之-;t意事項再填寫本頁) • Λ> Α8 Β8 C3 D8 1320 六、申請專利範圍 CTA CAG AAG CTC AGT GAA CAC ACA TGG TGT AGT GGA TGG AAA CTA ΑΑΤ 12 0 0 Leu Gin Lys Leu Ser Glu His Thr Trp Cys Ser Gly Trp Lys Leu Asn 385 390 395 400 CTT GGA AAG ATT AGT TGG GGT GGA ATC AAC ATT GTG GAG GAT GCA CCT 1248 Leu Gly Lys lie Ser Trp Gly Gly lie Asn lie Val Glu Asp Ala Pro 40B 410 415 GAA. GAG CCC TTT ATA ACA TCC AAG ATG GCA AGC CTT CTT AGT GAT TTG 1296 Glu Glu Pro Fhe 工le Thr Ser Lys Met Ala Ser Leu Leu Ser Asp Leu 420 425 430 AAT TGT TCA TTC CAA GCA AGT GCG Asn Cys Ser Phe Gin Ala Ser Ala 435 440 2 0.如申請專利範圍第19項之融合蛋白質，其除了.三葉草 黃脈病毒核包涵體a蛋白質之外’含唯一多肽。 2艾，如申請專利範圍第19項之融合蛋白質，其中切割胜肽 爲全部或部分地被包含於序列a)或c)任一者或兩者所 編碼之胜肽中。 22.如申請專利範圍第19項之融合蛋白質τ其中切割胜肽 爲全部被包含於序列a)和〇所編碼之胜肽中。 23·如申請專利範圍第19項之聚核苷酸序列，其中一個或 多個胺基酸殘基位於切割胜肽和多肽之間° 2 4.如申請專利範圍第19項之融合蛋白質’其中經由序列 a)所編碼之胜肽的自溶作用產生一多肽’其具有額外的 N終端胺基酸序列，其終端殘基爲甘胺酸’絲胺酸或 丙胺酸之殘基° 25.如申請專利範圍第19項之融合蛋白質’其中脯胺酸殘 基位於多肽N終端和切割胜肽C終端之間。 本紙張尺度適用-國國家標準（CNS)A4規格（2】0 X 297公S ) --------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁> )5J. 經濟部智慧財產局員工消費合作4JL印製 A8 BS C8 D8 經濟部智慧財是局員工涓費合作社印製 六、申請專利範圍 i 1 26· 如申請專利範圍第 19項之融合蛋白質 ’其中丙胺酸殘 1 1 I 基位於多肽 N終端和切割胜肽 c 終端之間。 1 27· 一種多肽， 係稱三葉草黃脈病毒核包涵體 a蛋白 質， 請. 1 先 1 具有蛋白酶活性及如下序列表之序列Ϊ D N 〇· 2 中所列 Μ 讀 1 1 之殘基編號 4至437之序列： 面 之 1 1 注 1 Ly 5 Phe Gin Giy Lya Sar Ly a Arg Thr Arg Gin Lys Leu Lys ?he Arg 事 項 再_ 1 1 Ξ 10 15 1 A1 a Ala Arg Asp MeC Lys Aap Arg Tyr Giu val Kis Al 3. A.gp Gla Giy 填 % 1 裝 1 20 2S 30 本 Thr Leu Val Gla As η Phe Giy Thr Arg Tvr Ser Lys Lya Gly Lys Thr 頁 、〆 1 35 45 1 I ^ys Gly mr Val Val Giy Leu Gly Ala Lya Thr Arg Arg ?ha Thr ΑΞΓ. 1 I 50 55 SO 1 1 Mac Tyr GLy Phe Asp Pro Thr Glu Tyr Ser Pha Ala Arg Tvr Leu Asp 1 S5 70 75 80 訂 Pro lie Thr Gly Ala Thr Leu Asp Giu Thr Pro He Hi 3 Asn val Aar‘ 1 as 90 95 1 | Leu Val AJ.a Glu Hig Phe Gly ILc Arg Leu Asp Mec val λ3? Lys 1 I 100 iOS 110 1 I GLu Leu Leu Asp Lyg Glr- His Leu Tyr Lau Lys Arg Pro lie Glu Cys 1 I Tyr Phe US 120 Val 12S 線 | Val Lyg Asp Ma Gly Gla Lys Mec Arg lie Asp Leu Thr 130 13S 140 1 I ?ro His A3C： Pro Leu Leu Ala Ser A3? Val Ser Thr Thr ILa Mac Giy 1 145 ISO 153 150 1 Tyr Pro Glu J^rg Giu Gly Glu Leu Arg Gin Thr Giy Ly3 Ala Arg Leu 1 IBS 170 175 I Val A^p Pro Ser Glu Leu Pro Ala Arg Asa Glu Asp He Asp Ala Glu 1 I 130 185 190 1 Phs Glu Ser Leu Asn Ms He Ser Gly Leu Arg Asp Tyr pL3a Pro lie i iSS 200 205 1 Ser Gin A〇n val Cya Lau Leu Thr Asr. Glu Ser Glu Gly His Arg Glu 1 210 215 220 1 I - 11- :: 1 〇 1 1 1 本紙张尺度適用中國囷家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 4S9046 A8 BS C8 D8 六、申請專利範圍 Lys Wee Phe GLy lie Glv Τγ~ Gly Ser Val lie lie. Thr Asn Gin Hi3 22S 230 235 240 Leu Fhe Arg Arg Aan Gly Glu Leu Ser Ila Gin Ser Lvs His GLy 24S 250 255 Tyr Phe Arc Cya Arg Asc. Thr Thr Ser Leu Lys Mec Leu Pro Leu C-iu 260 2S5 270 GLy Hia Aap lie Leu Leu lie Gin Leu Pro Arg Asp Phe ?ro Val ?-e 27S 2Θ0 285 Pro Gin. Lys lie Arg Phe Xrg Glu Pro Arg Va.1 Asp Asp Lys lie v=l 29〇 295 300 Leu Val Ser Thr ksn Phe Gin Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Val Sar 310 315 320 Glu Ser Se: A^n lie Ser kg vd C-ln Ser Ala· kn Tyr Lys Kis 325 330 33S Trp Ila Ser Thr Val Ala Gly His Cys Gly Asn Pro Mec Vai Ser Thr 3<〇 34S 350 Lys Asp Gly ?hs lie VaL Gly lie Hia Ser Leu Xla Ser Leu Thr Gly 355 360 365 Asp Val Asn lie Phe Thr Ser ?he Pit。Pr·。Gin ?he Giu Asr‘ Ly3 Ty;： 37Ξ 380 Leu Gin Ly3 Leu Ser Glu His' Thr Trp Cys Sar Gly Tr? Lya Leo Asn -as 390 3SS 40Q Leu Gly Lys lie Ser Trp Glv Glv Ila Ajn lie Vai GLu Asd Ala =r〇 <105 4 10 U5 -------------:1 裝--- ί (請先閱讀背面之';i意事項茗填寫本頁) - -線丨 經濟部智慧財產局員工消f合作社印*'1衣 Glu Glu Pro Phs lie Thr Ssr Lys Mac Ala Ser Leu Leu Ser Asp Leu 420 425 ^30 Asn Cya S«r Phe Glr. Ala Ser Ala 435 440 < 28.—種編碼多肽之聚核苷酸序列，其中該聚核苷酸序列 及多肽序列分別如序列ID號碼II及1 2所示’且序列 ID No.11核苷酸序列編號70至1647之聚核苷酸序列 所編碼具有序列ID No.12胺基酸編號1至526胺基酸 序列之多肽可將二氯靛酚和氧化態麩胱甘肽予以還原； -12- ： . 本紙張尺度適用’中囷岡家標準（CNS)A4規格（210 X 297公发） 45? b 經 濟 部 智慧 財 產 局 員 工 消費 合 作 社 印 製 A8 B8 C8 D3 六 、申請專利範圍 序列ID No .11 : ATG TCA TGT GAG GAC GGT CGG GCC CTG GAA GGA ACG CTC TCG GAA TTG 48 Met Ser Cys Glu Asp Gly Arg Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ser Glu Leu -23 -20 -15 -10 GCC GCG GAA ACC GAT CTG CCC GTT GTG TTT GTG AAA CAG AGA AAG ATA 96 Ala Ala Glu Thr Asp Leu Pro Val Val Phe Val Lys Gin Arg Lys lie -5 1 5 GGC GGC CAT GGT CCA ACC TTG AAG GCT TAT CAG GAG GGC AGA CTT CAA 144 Gly Gly His Gly Pro Thr Leu Lys Ala Tyr Gin Glu Gly Arg Leu Gin 10 15 20 25 AAG CTA CTA AAA ATG AAC GGC CCT GAA GAT CTT CCC AAG TCC TAT GAC 192 Lys Leu Leu Lys. Met Asn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lys Ser Tyr Asp 30 - 35 40 TAT GAC CTT ATC ATC ATT GGA GGT GGC TCA GGA GGT CTG GCA GCT GCT 240 Tyr Asp Leu lie lie lie Gly Gly Giy Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala 45 SO 55 AAG GAG GCA GCC CAA TAT GGC AAG AAG GTG ATG GTC CTG GAC TTT GTC 288 Lys GIu Ala Ala Gin Tyr Gly Lys Lys Val MeC Val Leu Asp Phe Val 60 65 70 ACT CCC ACC CCT CTT GGA ACT AGA TGG GGT CTT GGA GGA ACA TGT GTG 336 Thr Pro Thr Pro Leu Gly Thr Arg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys Val 75 80 85 AAT GTG GGT TGC ATA CCT AAA AAA CTG ATG CAT CAA GCA GCT TTG TTA 384 Asn Val Gly Cys lie Pro Lys Lys Leu Met His Gin Ala Ala Leu Leu 90 95 100 105 GGA CAA GCC CTG CAA GAC TCT CGA AAT TAT GGA TGG AAA GTC GAG GAG 432 Gly Gin Ala Leu Gin Asp Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu 110 115 120 - 13- 3 j j e i 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） S. 請 先 閱讀 背 面 之 注 意 事 項 再- 填 1I裝 頁 訂 4 Ο Α8 Β8 C3 DS 六、申請專利範圍 ACA GTT AAG CAT GAT TGG GAC AGA ATG ATA GAA GCT GTA CAG AAT CAC 480 Thr Val Lys His Asp Trp Asp Arg Met lie Glu Ala Val Gin Asn His 125 130 135 ATT GGC TCT TTG AAT TGG GGC TAC CGA GTA GCT CTG CGG GAG AAA AAA lie Gly Ser Leu Asn Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lys Lys 140 145 ISO 528 GTC GTC TAT GAG AAT GCT TAT GGG CAA TTT ATT GGT CCT CAC AGG ATT Val Val Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Gin Phe 工le Gly Pro His Arg lie 155 160 165 576 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 AAG GCA ACA AAT AAT AAA GGC AAA GAA AAA ATT TAT TCA GCA GAG AGA 624 Lys Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lys lie Tyr Ser Ala Glu Arg 170 175 180 185 TTT CTC ATT GCC ACT GGT GAA AGA CCA CGT TAC TTG GGC ATC CCT GGT 672 Phe Leu lie Ala Thr Gly Glu Arg Pro Arg Tyr Leu Gly lie Pro Gly 190 195 200 GAC AAA GAA TAC TGC ATC AGC AGT GAT GAT CTT TTC TCC TTG CCT TAC 720 Asp Lys Glu Tyr Cys lie Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu Pro Tyr 205 210 215 TGC CCG GGT AAG ACC CTG GTT GTT GGA GCA TCC TAT GTC GCT TTG GAG 768 Cys Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Tyr Val Ala Leu Glu 220 225 230 TGC GCT GGA TTT CTT GCT GGT ATT GGT TTA GAC GTC ACT GTT ATG GTT 816 Cys Ala Gly Phe Leu Ala Gly 工le Gly Leu Asp Val Thr Val Met Val 235 240 245 AGG TCC ATT CTT CTT AGA GGA TTT GAC CAG GAC ATG GCC AAC AAA ATT 864 Arg Ser lie Leu Leu Arg Gly Phe Asp Gin Asp Met Ala Asn Lys lie 250 255 260 265 GGT GAA CAC ATG GAA GAA CAT GGC ATC AAG TTT ATA AGA CAG TTC GTA Gly Glu His Met Glu Glu His Gly lie Lys Phe lie-Arg Gin Phe Val I 270 275 , 280 912 -------------袭'-------訂---------線- ί (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -14 -紙張尺度適用.中國國家標iMCNS)A4規格（210 x 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印s,1^ A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 CCA ATT AAA GTT GAA CAA ATT GAA GCA GGG ACA CCA GGC CGA CTC AGA 9 60 Pro lie Lys Val Glu Gin lie Glu Ala Gly Thr Pro Gly Arg Leu Arg 285 290 295 GTA GTA GCT CAG TCC ACC AAT AGT GAG GAA ATC ATT GAA GGA GAA TAT 1008 Val Val Ala Gin Ser Thr Asn Ser Glu Glu lie lie Glu Gly Glu Tyr 300 305 310 AAT ACG GTG ATG CTG GCA ATA GGA AGA GAT GCT TGC ACA AGA AAA ATT 105 6 Asn Thr Val Met Leu Ala lie Gly Arg Asp Ala Cys Thr Arg Lys lie 315 320 325 GGC TTA GAA ACC GTA GGG GTG AAG ATA AAT GAA AAG ACT GGA AAA ATA 1104 Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys He Asn Glu Lys Thr Gly Lys lie 330 335 340 345 CCT GTC ACA GAT GAA GAA CAG ACC AAT GTG CCT TAC ATC TAT GCC ATT 1152 Pro Val Thr Asp Glu Glu Gin Thr Asn Val Pro Tyr 工le Tyr Ala lie 350 355 360 GGC GAT ATA TTG GAG GAT AAG GTG GAG CTC ACC CCA GTT GCA ATC CAC- 1200 Gly Asp lie Leu Glu Asp Lys Val Glu Leu Thr Pro Val Ala lie Gin 365 370 375 GCA GGA AGA TTG CTG GCT CAG AGG CTC TAT GCA GGT TCC ACT GTC AAG 1248 Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gin Arg Leu Tyr Ala Gly Ser Thr Val Lys 380 385 390 TGT GAC TAT GAA AAT GTT CCA ACC ACT GTA TTT ACT CCT TTG GAA TAT 1296 Cys Asp Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr 395 400 405 GGT GCT TGT GGC CTT TCT GAG GAG AAA GCT GTG GAG AAG TTT GGG GAA 1344 Gly Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Val Glu Lys Phe Gly Glu 410 415 420 425 GAA AAT ATT GAG GTT TAC CAT AGT TAC TTT TGG CCA TTG GAA TGG ACG 1392 Glu Asn lie Glu Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp Pro Leu Glu Trp Thr 430 435 440 ----------I ---4^4·-- ί (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂·

   本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4覘格（210 x 297公S ) A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 ATT CCG TCA AGA GAT AAC AAC AAA TGT TAT GCA AAA ATA ATC TGT AAT 1440 lie Pro Ser Arg Asp Asn Asn Lys Cys Tyr Ala Lys lie lie Cys Asn 445 450 455 ACT AAA GAC AAT GAA CGT GTT GTG GGC TTT CAC GTA CTG GGT CCA AAT 1488 Thr Lys Asp Asn Glu Arg Val Val Gly Phe His Val Leu Gly Pro Asn 460 465 470 GCT GGA GAA GTT ACA CAA GGC TTT GCA GCT GCG CTC AAA TGT GGA CTG 153 6 Ala Gly Glu Val Thr Gin Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Cys Gly Leu 475 4Θ0 485 ACC AAA AAG CAG CTG GAC AGC ACA ATT GGA ATC CAC CCT GTC TGri GCA 1584 Thr Lys Lys Gin Leu Asp Ser Thr lie Gly lie His Pro Val Cys Ala 490 495 500 505 GAG GTA TTC ACA ACA TTG TCT GTG ACC AAG CGC TCT GGG GCA AGC ATC 1632 Glu Val Phe Thr Thr Leu Ser Val Thr Lys Arg Ser Gly Ala Ser lie 510 515 520 CTC CAG GCT GGC TGC TGA Leu Gin Ala Gly Cys 525 1650； ---I------------- . i <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印" 16 本紙張尺度適用屮國囷笮桴準（CNS)A4規格（210 x 297公货） B8 C8 D8 六、申請專利範圍 序列 ID No , 12: Met Ser Cys Glu Asp Gly Arg Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ser Glu Leu -23 -20 Ί5 -10 Ala Ala Glu Thr Asp Leu Pro Val Val Phe Val Lys Gin Arg Lys lie -5 1 5 Gly Gly His Gly Pro Thr Leu Lys Ala Tyr Gin Glu Gly Arg Leu Gin 10 .15 20 25 Lys Leu Leu Lys Met Asn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lys Ser Tyr Asp 30 35 40 Tyr Asp Leu lie lie 工le Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala 45 50 55 Lys Glu Ala Ala Gin Tyr Gly Lys Lys Val Met Val Leu Asp Phe Val 60 65 70 Thr Pro Thr Pro Leu Gly Thr Arg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys Val 75 80 85 Asn Val Gly Cys lie Pro Lys Lys Leu Met His Gin Ala Ala Leu Leu 90 95 100 105 Gly Gin Ala Leu Gin Asp Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu 110 115 120 Thr Val Lys His Asp Trp Asp Arg Met lie Glu Ala Val Gin Asn His 125 130 135 lie Gly Ser Leu Asn Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lys Lys 140 145 150 Val Val Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Gin Phe lie Gly Pro His Arg lie 155 160 165 Lys Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lys He Tyr Ser Ala Glu Arg 170 175 180 185 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -----1--------- — c請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Phe Leu lie Ala Thr Gly Glu Arg Pro Arg Tyr Leu Gly lie Pro Gly 190 195 200 Asp Lys Glu Tyr Cys lie Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu Pro Tyr 205 210 215 Cys Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala Ssr Tyr Val Ala Leu Glu 220 225 230 o\ ^ -17- 本紙張尺度適痢中固固家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ΰ〜j Ο 46』 4 5 9 C .： ^、申請專利範圍 Cys Ala Gly Phe Leu Ala 235 Arg Ser lie Leu Leu Arg 250 255 Gly Glu His Met Glu Glu 270 Pro lie Lys Val Glu Gin 285 Val Val Ala Gin Ser Thr 300 Asn Thr Val Met Leu Ala 315 Giy Leu Glu Thr Val Gly 330 335 Pro Val Thr Asp Glu Glu 350 Gly Asp lie Leu Glu Asp 365 Ala Giy Arg Leu Leu Ala 3Θ0 Cys Asp Tyr Glu Asn Val 395 Gly Ala Cys Gly Leu Ser 410 415 Glu Asn He Glu Val Tyr 430 lie Pro Ser Arg Asp Asn 445 Thr Lys Asp Asn Glu Arg 460 Ala Gly Glu Val Thr Gin 475 Thr Lys Lys Gin Leu Asp 490 495 Glu Val Phe Thr Thr Leu 510 Leu Gin Ala Gly Cys 525 〇 A8 B8 C8 D8 Gly lie 240 Gly Phe His Gly He Glu Asn Ser 305 lie Gly 320 Val Lys Gin Thr Lys Val Gin Arg 385 Pro Thr 400 Glu Glu His Ser Asn Lys Val Val 465 Gly Phe 480 Ser Thr Ser Val Gly Leu Asp Asp Gin Asp 260 lie Lys Phe 275 Ala Gly Thr 290 Glu Glu lie Arg Asp Ala lie Asn Glu 340 Asn Val Pro 355 Glu Leu Thr 370 Leu Tyr Ala Thr Val Phe Lys Ala Val 420 Tyr Phe Trp 435 Cys Tyr Ala 450 Gly Phe His Ala Ala Ala 工le Gly lie 500 Thr Lys Arg 515 Val Thr 245 Met Ala lie Arg Pro Gly lie Glu 310 Cys Thr 325 Lys Thr Tyr lie Pro Val Gly Ser 390 Thr Pro 405 Glu Lys Pro Leu Lys lie Val Leu 470 Leu Lys 4Θ5 His Pro Ser Gly Val Met Val Asn Lys lie 265 Gin Phe Val 280 Arg Leu Arg 295 Gly Glu Tyr Arg Lys lie Gly Lys lie 345 Tyr Ala lie 360 Ala lie Gin 375 Thr Val Lys Leu Glu Tyr Phe Gly Glu 425 Glu Trp Thr 440 lie Cys Asn 455 Gly Pro Asn Cys Gly Leu Val Cys Ala 505 Ala Ser lie 520 .n n n n n n n n I · n n n i n n 一OJ fl n n I^ - A (請先閲讀背面之ii意事項再填寫本頁) -18- 本纸張尺度適用申國國家標準（CNS)A4規柊（2J0 X 297公1 ) 8 888 ABCD 4Θ 96 144 192 240 AAG GGG TTT ATA AGA CAG TTC GTA 912 ACA CCA GGC CGA CTC AGA 960 459046 六、申請專利範圍 2 9.如申請專利範圍第28項之聚核苷酸序列，其中編碼序 列包括如下序列ID Νο·11中所示之核苷酸序列70至 1 647 ： ATG TCA TGT GAG GAC GGT CGG. GCC CTG GAA GGA ACG CTC TCG GAA TTG GCC GCG GAA ACC GAT CTG CCC GTT GTG ΠΤ GTG AAA CAG AGA AAG ATA GGC GGC CAT GOT CCA A.CC TTG AAG GCT TAT CAG GAG GGC AGA CTT CAA AAG CTA CTA AAA ATG AAC GGC CCT GAA GAT CTT CCC AAG TCC TAT GAC TAT GAC CTT ATC ATC ATT GGA GGT GGC TCA GGA GGT CTG GCA GCT GCT AAG GAG GCA GCC CAA TAT GGC AAG AAG GTG ATG GTC CTG GAC ΊΤΓ GTC 239 ACT CCC ACC CCT CTT GGA ACT AGA TGG GGT CTT GGA GGA ACA TGT GTG 3 36 AAT GTG GGT TGC ATA CCT AAA AAA CTG ATG CAT CAR. GCA GCT TTG TTA 3Θ4 GGA CAA GCC CTG CAA GAC TCT CGA AAT TAT GGA TGG AAA GTC GAG GAG 432 ACA GTT AAG CAT GAT TGG GAC AGA ATG ATA GAA GCT GTA CAG AAT CAC 490 ATT GOC TCT TTG AAT TGG GGC TAC CGA GTA GCT CTG CGG GAG ΑΆΑ AAA 528 GTC GTC TAT GAG AAT GCT TAT QGG CAA TTT ATT GGT CCT CAC' AGG ATT S76 AAG GCA ACA AAT AAT AAA GGC AAA GAA AAA ATT TAT TCA GCA GAG AGA 624 τττ CTC ATT GCC ACT GGT GAA AGA CCA CGT TAC TTG GGC Krc CCT GGT 672 GAC AAA GAA TAC TGC ATC AGC AGT GAT GAT CTT TTC TCC TTG CCT TAC 720 tGC CCG GGT AAG ACC CTG GTT GTT GGA GCA TCC TAT GTC GCT TTG GAG · 76Θ TGC GCT GGA TTT CTT GCT GGT ATT GGT ΤΓΑ GAC GTC ACT GTT ATG GTT 816 AGG TCC ATT CTT CTT AGA QQk TTT GAC CAG GAC ATG GCC AAC AAA ATT Θ64 GGT GAA CAC ATG GAA GAA CAT GGC ATC CCA ATT AAA GTT GAA CAA ATT GAA GCA GTA GTA GCT CAG TCC ACC AA.T AGT GAG GAA ATC ATT GAA GGA GAA TAT 1008 AAT ACG GTG ATG CTG GCA ATA GGA AGA GAT GCT TGC ACA AGA AAA ATT 105 6 GGC TTA GAA ACC GTA GGG GTG AAG ATA AAT GAA AAG ACT GGA AAA ΑΤΑ 110Ί CCT GTC ACA GAT GAA GAA CAG ACC AAT GTG CCT TAC ATC TAT GCC ATT 1152 GGC GAT ΑΤΛ TTG GAG GAT AAG GTG GAG CTC ACC CCA GTT GCA ATC CAG 12〇〇 GCA GGA AGA TTG CTG GCT CAG AGG CTC TAT GCA GGT TCC ACT GTC AAG 1.240 TGT GAC TAT GAA AAT GTT CCA ACC ACT GTA ΤΤΓ ACT CCT TTG GAA TAT 1.296 GGT GCT TGT GGC CTT TCT GAG GAG AAA GCT GTG GAG AAG TtT GGG GAA 13 44 GAA AAT ATT GTT TAC CAT AGT TAC TTT_TGG CCA TTG GAA TGG ACG 1392 ATT CCG TCA AGA GAT AAC AAC AAA TGT TAT GCA AAA ATA ATC TGT AAT 144 0 ACT AAA GAC AAT GAA CGT GTT GTG'GGC TTT CAC GTA CTG GGT CGA AAT 1A88 -1 9 - j r1 ? 裝------訂-------線 - ^ (请先閲讀背面之注意事項再蟥寫本頁) 經濟部中央標半局負工消费合作社印製 衣紙張尺度通用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公董） ^53046 經 濟 部 中 央 標 準 局 Μ 工 消 費 合 作 社 印 裝 Α8 Β8 C8 D8 六、申請專利範園 GCT GGA GAA GTT ACA C AA GGC T ΓΤ GCA GCT GCG CTC AAA TGT GGA CTG 1536 ACC A AA AAG CAG CTG GAC AGC ACA ATT G<3A ATC CAC* CCT GTC TGT GCA 15Θ4 GAG GTA TTC ACA ACA TTG TCT.GTG ACC AAG CGC TCT G GG GCA AGC ATC 1632 CTC CAG GCT GGC TGC TGA .·) 1550„ 30·如申請專利範圍第28項之聚核苷酸序列，其編碼- J具 有序列如下ID No. 12 序列-23至 526之多肽 7 Met Ser Cys Glu Aap Gly Arg Ala. Leu Glu Gly thr Leu Ser 3lu Leu -23 •20 -15 *1Q Ala Ala GlU Thr Asp Leu Pro Val Val Phe Val Lys Gin Arg Lys lie -5 1 5 Gly Gly His Gly Pro Thr Leu Lys Ala - Tyr Gin Glu Gly Arg Leu Gin 10 IS 20 25 Lys Lau Leu Lys Mec hsn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lya Ser Tyr ASp 30 3S 40 Tyr Asp Leu lie lie lie Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala 45 50 55 Lys Glu Ala Ala Gin Tyr Gly Lys Lys Val Met Val Leu Aap Phe Val 60 65 70 Thr Pro Thr Pro Leu Gly Thr A_rg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cyg Val 75 80 Q5 Asn Val Gly Cys Ila Pro Lys Lys Leu Met His Gin Ala Ala Leu Leu 90 95 100 105 Gly Gin Ala Leu Gin Αθρ Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu 110 115 120 Thr Vai Lys His Asp Trp ASp Arg Met lie Glu Ala val Gin Asn Hi3 125 130 135 lie Gly Ser Leu Aan Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lys hys 140 145 150 vai Val Tyr Glu Ajgn Ala Tyr Gly Gin Phe He Gly Pro Hia Arg lie 155 ISO 165 Lys Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lya He Tyr Ser Ala Glu Arg 170 175 ISO 135 Phe Leu lie Ala Thr Gly Glu Arg Pro Ajrg Tyr Leu Gly lie Pro Gly 19 0 135 200 Asp Lys Glu Tyr Cys lie Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser beu Pro Tyr 20S 210 215 -- Cya Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala. Ser Tyr Val Ala Leu Glu ^ 220 225 '230 -2 0- 1 π 本紙張尺度逋用中园國家標準（CNS > Λ4规格（21 〇 X 29"7公釐） 請 先 閱 讀 背 Sr 意 事 項 再 填 寫 本 頁 裝 訂 泉 459 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 Cys Ala Gly pne Leu Ala Gly lie Gly Leu Aap Val Thr Val Mec VaL 235 240 245 Arg Ser 工le Leu Leu Arg Gly Phe Asp Gin Asp Met Ala Asn Lys lie 250 255 2S0 265 Gly Glu Hia Met Glu Glu His Gly lie Lyg Fhe lie Arg Gin Phe Val 270 275 230 Pro He Lys Val Glu Gin lie Glu Ala Gly Thr Pro Gly Arg Leu Arg 285 290 29S Val Val Ala Gin Ser Thr Asn Ser Glu Glu He lie Glu Gly Glu Tyr 300 305 310 Asn Thr Val Mec Leu Ala lie Gly Arq Asp Ala Cya Thr Arg Lys lie 315 320 325 Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys lie Asn Giu Lys Thr Gly Lys Xle 330 335 340 345 Pro Val Thr Aap Glu Glu Gin Thr Asn Val Pro Tyr lie Tyr Ala lie 3S0 355 360 Gly Asp lie Leu Glu Asp Ly3 Vai Glu Leu Thr Pro Val Ala lie Gin 355 370 375 Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gin Arg Leu TVr Ala GLy Ser Thr Val Lya 380 3S5 390 Cys A3p Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr 39S 400 405 Gly Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Val Glu Lys Phe Gly Glu 410 415 420 425 Glu Asn Il.e Glu Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp Pro Leu Glu Trp Thr 430 435 440 lie Pro Ser Arg Asp Aan Asn Lys Cya Tyr Ala Lys lie lie Cys Asn 44S 450 455 經濟部中央標準局員工消f合作社印裝 (請先閱讀背面之注項再填寫本頁) Thr Lys Aap Asn Glu Arg Val Val Gly Phe Kia val Leu Gly Pro Asn 450 465 470 Ala Gly Glu Val Thr Gin Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Cya Gly Leu 475 . 480 485 Thr Lys Lys Gin Leu Asp Ser Thr lie Gly lie His pro Val Cys Ala 490 495 500 50S Giu Val Phe Thr Thr Lsu Ser Val Thr Lys Arg Ser Gly Ala Ser lie S1Q SIS 520 Leu Gin Ala Gly Cya 525 〇 2 1 - 本紙張尺度遴用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐> 經濟部智慧財表局員工消費合作社印製 AS B8 C8 D8 六、申請專利範圍 31· 一種多肽1係被如申請專利範圍第28項之聚核苷酸序 列所編碼。 32· 一種多肽，係被如申請專利範圍第29項之聚核苷酸序 列所編碼。 33. —種多肽，係被如申請專利範圍第30項之聚核苷酸序 列所編碼。 34. —種抗體，係爲由命名爲ΜΚΜ 150-2並於1995-7-11 以寄存號碼960026寄存於台灣食品工業發展硏究所之 融合瘤所產生，其專一性地辨識ΚΜ3 1-7蛋白質，具有 如下序列ID No.12中胺基酸No.1〜526所示序列： Mec Ser Cya Glu Aap Gly Arg Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ser Glu Leu 23 · 20 -15 * AJa Ala Glu Thr Asp Leu Pro val Val Phe Val Lys Gin Arg Lys lie •5 1 S Gly Gly Hia Gly Pro Thr Leu Lya Ala^Tyr Gin Glu Gly Arg Leu Gin 10 IS ‘ 20 2S Lys Leu Leu Lys Met: Asa Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lya Ser Tyr Asp 30 35 40 Tyr Asp Leu lie lie lie Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala 45 SO 55 Lys Glu Ala Ala Gin Tyr Gly Ly3 Lys Val Met Val Leu Aap Phe Val 60 65 7 q Thr Pro Thr Pro Leu Giy Thr Arg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys 75 ao es Asn Val Gly Cys lie Pro Ly3 Ly3 Ltu Met His Gin Ala Ala Leu Leu 9〇 95 IQQ i〇5 Gly Gin Ala Leu Gin Αθρ Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu 110 US 120 Thr Val Lys His Asp Trp Asp Arg Met He Glu kla Val Gin Asn Kis L25 130 i35

   本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） ^^^^1 ^^^^1 ^^^^1 —«^^1 -J^^^^1 ^^^^1 ^^^^1 —4 fn^ I： - (請先閱讀背V®之注意事項再填绔本頁) A8 B8 C8 D8 經濟部皆葸財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 lie Gly Ser Leu Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lya Lys 140 145 150 Val Val Tyr Glu Aan Ala Tyr Gly Gin Phe lie Gly Pro Hie Arg lie 155 160 1S5 Lya Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lys lie Tyr Ser Ala Glu Arg 170 175 iso 195 Phe Leu lie Ala Thr Gly Glu Arg Pro Arg Tyr Lsu Gly lie Pro Gly 190 195 200 Asp Lys Glu Tyr Cys lie Ser Ser Asp Xsp Leu Phe Ser Ueu Pro Tyr 205 210 215 Cys Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Xla Ser Tyr val Ala Leu Glu 220 225 230 Cys Ala Gly Pile Leu Ala Gly lie Gly Leu Asp Val Thr Val Mec Val 4 t 235 240 245 Arg Ser lie Leu Leu Arg Gly Phe Asp Gin Asp Met Ala Asn Lys lie 250 255 260 265 Gly Glu His Met Glu Glu His Gly lie Lys Phe lie Arg Glu Phe Val 270 275 2S0 Pro lie Lyg Val Glu Gin lie Glu Ala Gly Thr ?ro Gly Arg Leu Arg 285 290 295 Val Val Ala Gin. Ser Thr Asn Ser Glu Glu lie lie Glu Gly Glu Tyr 300 305 310 Asn Thr Val Mec Leu ^la lie Gly krq Asp Ala Cys Thr Arg Lya He 315 320 325 Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys lie Asn Glu Lys Thr Gly Lya lie 330 335 340 345 Pro Val Thr ASO Glu Glu Gin Thr Asn Val Pro Tyr lie Tyr Ala lie 350 355 360 Gly Asp lie Leu Glu Asp Lys val Glu Leu Thr Pro Val Ala He Gin 355 370 375 Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gin Arg Leu Tyr Ala C-ly Ser Thr Val Lys 380 385 390 Cys Asp Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr 395 400 405 Gly Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Vel Glu Lys Phe Gly GlU 410 415 420 425 Glu Asn n.e GlU Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp pro Leu Glu Trp Thr 430 435 440 -23- . ； π y 本紙張尺度適用中國國家標牟（CNS ) A4現格（21 〇x 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 lie Pro Ser Arg Asp Aan Aan Lys Cys Tyr Ala Lys He lie Cys Asn 44S 450 455 Thr Lys Asp Asn GIu Arg Val Val Gly Phe Hia val Leu Gly Pro Asn 460 465 470 Ala Gly Glu Val Thr Gin Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Cys Gly Leu 475 480 485 Thr Lys Lys Gin Leu A3p Ser Thr lie Gly lie His Pro Vc.1 Cys Ala 490 495 500 SOS Glu Val Ph白 Thr Thr Lsu Ser VaA Th: Lys Arg Ser Gly Ala Ser lie S10 SIS 520 Leu Gin Ala Gly Cys 525 I I 3 5.如申請專利範圍第34項之抗體，其爲一單株抗體。 36.如申請專利範圍第34項之抗體，係爲由命名爲 MKM150-2並於1995-7-11以寄存號碼960026寄存於 台灣食品工業發展硏究所融合瘤所產生，或爲一由命名 爲MKM 15 0-2融合瘤所得之融合瘤所衍生之抗體。 3 7.如申請專利範圍第34項之抗體，係用於單離和純化 KM31-7蛋白質。 3S. —種純化KM 31-7蛋白質之步驟，其包括1)於固定在 抗原-抗體反應之支持體之如申請專利範圍第34項之 抗體結合該KM31-7蛋白質，該抗體由命名爲MKM 15 Ο-ΐ 並於 1995-7-11 以寄 存號碼 960026 寄 存於台 灣食品 工業發展硏究所之融合瘤所產生，2)將該支持體洗除不 純物，3)從支持體解離及回收ΚΜ31-7蛋白質。 -24- 一__ _ 本紙佐尺度適$中國國家標率（CNS ) Λ4規格（2丨0 X 297公釐） 裝 訂— I ί 一 (請先間讀背而之注意事項再承寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 __ D8 — .—- 六、申請專利範圍 39_如申請專利範圍第1項之聚核苷酸序列，其中c)序列 所編碼之多肽爲一種包括如下序列ID No.12之胺基酸 編號1至5Ϊ6胺基酸序列之多肽，但聚核苷酸序列所 編碼之多肽可將二氯靛酚和氧化態麩胱甘肽予以還原： Het Ser Cya Glu Asp Gly Arg Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ser (Slu ’23. *20 -15 ~ ·10 Ala. Ala Glu Thr Asp L,eu Pro Val Val Phe Val Lys Gin Arg Lya lie -5 1 5 Gly Gly His Gly Pro Thr Leu Lys Ala ^Tyr Gin Glu Gly Arg Leu Gin 10 IS ’ 20 25 Lys Leu Leu Lya He巳 Asn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lya Ser Tyr Asp 30 3S 40 . Tyr Asp 工le lie lie Gly Gly Gly Ser Gly Gly ku Ala Ala· Ala 4S 50 SS Lys Glu Ala Ala Gin Tyr Gly Lys Lys Val Met Val Leu Asp Phe Val 60 fiS 70 Thr Pro Thr Pro Leu Gly Thr Axg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys Val 75 SO 05 Asn Val Gly Cys lie Pro Lys Lys L*u Met His Gin, Ala Ala Leu Leu 90 95 100 105 Gly Gin Ala Leu Gin Asp ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu 110 US 120 * H i· S Thr Val Lys His Asp Trp Asp Arg Met He Glu Ala val Gin As 125 咖 135 . ws /-ία LV3 ^Ys lie Gly Ser Leu A^u Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg X4〇 145 150 Val Val Tyr Glu Ala Tyr Gly Gin Phe He Gly Ηιθ 155 160 165 Lys Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Giu Lys lie Tyr Ser 170 175 ISO Leu Arg Ile Ala pro Ar：g Gl./ Phe Leu lie Ala Thr Gly Glu Arg Pro Ajrg Tyr Leu Gly 2〇0 190 195 Asp Lys Giu Ty: Cys lie Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser· Cys Pro 205 210 215 pro Tyr G u Gly Lys Thr Leu Val val Gly Ala Ser Tyr Val ^ia 220 225 23〇 -25_ 本纸張尺度適家標丰（CNS)ϋχ297公慶) ν 459046 D8 經濟部智慧財4局R工消費合作社印製 六、申請專利範圍 i I Cys Ala Gly Phe Leu Ala Gly lie Gly Leu Asp Val Thr Val Met Val 1 | : 235 240 245 1 Arg Ser He Leu Leu Arg Gly Phe Asp Gin Asp Mec Ala Asn Lya lie I 250 255 2£0 26S • 1 Gly Glu His Met Glu Glu His Gly lie Lyg Phe lie Arg Gin Phe Val 請 先 1 270 275 2S0 1 Pro lie Lys Val Glu Gin lie Glu Ala Gly Thr Fro Gly Arg Leu Arg 閱 ! 2SS 290 295 背 ! Val Vai Ala Gin Ser Thr Asn Ser Glu Glu He He Glu Gly Glu Tyr 面 之 1 1 300 305 310 注 意 事 ί Asn Thr val Mec Leu Ala lie Gly Arc Asp Ala Cye Thr Arg Lya Ue 1 315 320 325 項 再 1 Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys lie Asn Glu Lya Thr Gly Lya lie 填― 寫 本 1 装 330 335 340 345 Pro Val Thr Aso Glu Glu Gin Thr Asn Val ΡΓΟ Tyr He Tyr Ala lie 頁 ___ 1 I 350 355 360 1 I Gly Asp lie Leu Glu Asp Ly3 Val Glu Leu Thr Pro Val Ala lie Gin 1 I 365 3 7C 375 1 I Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gin Arg Leu Tyr Ala Gly Ser Thr Val Lys 1 I 380 3SS 390 訂 | Cys Asp Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr 395 400 405 1 Gly Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Val Glu Lys Phe Gly Glu I 410 415 420 425 1 Glu Asn He Glu Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp Pro Leu Glu Trp Thr ! 430 435 440 1 線 I lie Pro Ser Arg Asp ΑθΠ Asn Lys Cya Tyr Ala Lys Ue lie Cys Asn 44S 450 455 1 I Thr hys ASp Asn Glu Arg Val Val Gly Phe Hia Val Leu Gly Pro Asn 1 I 4S0 465 470 1 | Ala Gly Glu Val Thr Gin Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Cva Gly Leu 1 I 475 480 4Θ5 1 I Thr Lys Lys Gin Leu Asp Ser Thr lie Gly* lie His Pro Val Cys Ala 1 j 490 495 SCO SOS 1 I Glu Vai Ptie Thr Thr Leu Ser Val Thr Lys Arg Ser Gly Ala. Ser lie 1 1 | 510 S15 520 Leu Gin Ala Gly Cys 1 525 e 1 1 1 -26- I 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨ΟΧ 297公釐）