CZ293582B6 - Polynukleotidová sekvence, vektor, který ji obsahuje, hostitel a expresivní systém s obsahem tohoto vektoru, polypeptid, fúzní protein, způsob výroby polynukleotidové sekvence a její použití - Google Patents

Abstract

Polynukleotidová sekvence kódující fúzní protein a obsahuje ve směru 5'-3' a ve stejném otevřeném čtecím rámci: a) sekvenci kódující protein jaderné inkluze a viru CYVV s primární sekvencí, odpovídající polypeptidu, danému aminokyselinami 4 až 437 v sekvenci ID č. 2 v přehledu sekvencí, nebo jeho mutaci či variantu mající podobnou proteolytickou specifitu jakou má protein jaderné inkluze a viru CYVV, b) sekvenci kódující štěpný peptid AsnCysSerPheGlnX, kde X je zbytek aminokyseliny, který se volí ze skupiny Gly, Ale, Val a Ser, přičemž peptid je rozpoznatelný a štěpitelný uvedeným proteinem jaderné inkluze a viru CYVV nebo jeho mutací či variantou, a c) alespoň jednu sekvenci kódující exogenní polypeptid. Součást řešení tvoří také vektor, který tuto sekvenci obsahuje, hostitel a expresivní systém s obsahem tohoto vektoru, odpovídající polypeptid, fúzní protein, způsob výroby této polynukleotidové sekvence a její použití.ŕ

Description

Polynukleotidová sekvence, vektor, který ji obsahuje, hostitel a expresivní systém s obsahem tohoto vektoru, polypeptid, fúzní protein, způsob výroby polynukleotidové sekvence a její použití

Oblast techniky

Tento vynález se vztahuje na polypeptidové expresivní systémy vyžadující štěpení prekurzorových produktů a na proteázy použitelné v takových systémech. Tento vynález se dále vztahuje na nový polypeptid mající schopnost redukovat dichloroindofenol a oxidovaný glutathion, na DNA kódující tento nový polypeptid, na vektory obsahující takovou DNA, na hostitele transformované takovými vektory a na léčebné přípravky obsahující tento polypeptid. Tento vynález dále pojednává o monoklonálních protilátkách proti tomuto polypeptidu, postupu izolace a purifíkace tohoto polypeptidu s použitím těchto protilátek.

Dosavadní stav techniky

Potyviry tvoří skupinu virů, jejichž genom je tvořen jednovláknovou RNA o délce přibližně 10 000 bází. Tyto viry napadají rostliny takových tříd jako jsou Solabaceae. Pro genom potyvirů je charakteristické, že má extrémně dlouhý otevřený čtecí rámec, čili ORF, [Dougherty, W. G. aHieber, E. (1980), Virology 101: 466-474.; Allison, R. a kol. (1986), Virology 154: 9-20]. Aby došlo k expresi jednotlivých proteinů kódovaných v rámci otevřeného čtecího rámce, je překládaný polyprotein štěpen dvěma typy proteáz, které jsou oba rovněž kódovány v tomto otevřeném čtecím rámci [Dougherty, W. G. a Carrington, J. C. (1988), Ann. Rev. Phytopath. 26: 23-143].

Virus TEV (Tobacco etch virus) patří mezi viry kmene potyvirideae a tvoří jaderné inkluze, které lze v infikovaných buňkách barvit trypanovou modří. Tyto jaderné inkluze zjevně obsahují dva typy proteinů. Prokázalo se, že jedním z nich je virová proteáza, která byla označena jako jaderná inkluze a, nebo také NIa [J. Virol., 61: 2540-2548 (1987)].

Proteázy jaderné inkluze potyvirů rozeznávají a štěpí peptidové sekvence obsahující jedno z míst Gln-Gly, Gln-Ser a Gln-Ala. Má se rovněž za to, že tato sekvence je hexametrická a objevuje se na C-konci příslušné NIa v daném polyproteinu.

Byly určeny kompletní sekvence viru TEV a TVMV (tobacco vein mottling virus), dalšího příslušníka kmene potyvirů, a porovnávání homologních míst umožnilo lokalizaci genů pro proteiny jaderných inkluzí těchto virů v jejich genomech [Virology, 154: 9-20 (1986); Nucleic. Acid. Res., 14: 5419-5430 (1986)].

Virus CYVV (Clover Yellow Veins Virus) je rovněž potyvirus. Do této doby byl sekvenován pouze gen nacházející se na 3'konci genomu CYVV společně s povrchovým proteinem, který je tímto genem kódován [Uyeda, I. a kol. (1991); Intervirol. 32: 234-245], Struktura oblasti NIa v tomto genomu nebyla předem objasněna ani nebyla tato příslušná oblast izolována.

Tvorba exogenních proteinů expresivními systémy může být s použitím technik známých pracovníkům v tomto oboru jednoduchou záležitostí. Nicméně existuje mnoho polypeptidů, které v exogenních systémech nelze snadno exprimovat. Problém může být v tom, že takový polypeptid nemůže být exprimován ve velkém množství, což nelze upravit pouhým umístěním regulačního genu ve směru proti směru exprese. Dále to může být způsobeno možností, že posttranskripční úpravy potřebné pro získání zralé formy se neuskutečňují nebo se uskutečňují nesprávně.

Například mnoho eukaryotických polypeptidů je zpočátku překládáno s methioninem na Nkonci, který je následně deletován a vzniká tak zralá forma polypeptidu. Toto zpracování se

-1 CZ 293582 B6 nemůže u prokaryot odehrát, proto se musí hledat alternativní prostředky pro získání potřebné exprese. Jedna z takových technik zahrnuje sloučení požadovaného exogenního proteinu s proteinem vázajícím maltózu nebo s glutathion-S-transferázou například pročištěním exprimovaného fuzního proteinu a následným štěpením proteázou, jako je faktor Xa, enterokinázou nebo thrombinem. Hlavní nevýhodou této nepohodlné metody je skutečnost, že vyžaduje dva purifikační kroky, které vedou k výrazným ztrátám konečného produktu.

Patent US 5 162 601 popisuje využití proteázy viru TEV při výrobě polyproteinu majícího spojovací sekvence mezi proteiny, které mají být exprimovány, jako je lidská tPA. Uvedený patent však pouze popisuje klonování násobného genu kódujícího tento polyprotein do hostitelského organismu a nepopisuje expresi ani purifíkaci proteolyticky štěpeného konečného produktu.

Kyslík pro metabolickou energii je v buněčném prostředí obecně poskytován ve formě oxidačních činidel. Oxidovaná forma, ve které je kyslík využíván, je většinou volný radikál, jako je superoxid (OJ), peroxid (H₂O₂) nebo vodíkové radikály (OH^-), které jsou všechny redukovány, aby po reakci vytvořily vodu (H₂O). Kyslíkový plyn sám je silně oxidační, ale termín „aktivovaný kyslík“ je zde používán ve vztahu ke kyslíku a molekulám obsahujícím kyslík, které mají vyšší oxidační číslo než atmosférický kyslík. Nejsilnější formou aktivovaného kyslíku je jeho volný radikál, což je molekula nebo atom mající jeden nebo více nespárovaných elektronů.

Volné radikály jsou nestabilní, a pokud nejsou pod řádnou kontrolou, mohou denaturovat lipidy, proteiny a nukleové kyseliny. Z toho vyplývá, že ačkoli je aktivovaný kyslík životně důležitým prvkem, je zároveň potenciálně zdraví škodlivý a musí být pod přísnou kontrolou. Dokonce i malá množství aktivovaného kyslíku mohou vyvolat vzhledem ke své vysoké reaktivitě poruchy. Z toho důvodu nejsou organismy schopny přežít, pokud nejsou vybaveny obrannými mechanismy zamířenými proti aktivovanému kyslíku.

V buněčném prostředí musí být umístění, množství a čas tvorby aktivovaného kyslíku přísně vyváženo schopností buněk neutralizovat nebezpečí představované aktivovaným kyslíkem. Tuto schopnost typicky zabezpečují obranné mechanismy, které využívají vlastní antioxidanty nebo antioxidační enzymy. V kontextu tohoto vynálezu je termín „antioxidant“ obecně používán pro přirozeně se vyskytující látky, které mají schopnost zabránit nebo potlačit autooxidaci například lipidů. Termín „antioxidační enzym“ je obecně používán pro enzym katalyzující reakci, která eliminuje aktivovaný kyslík. Termín „antioxidační akce“ je sestaven na základě těchto termínů.

V řadě abnormálních situací dochází ke tvorbě nadbytečného množství aktivovaného kyslíku. Takovými případy jsou pro člověka například stresové situace, používání drog, kouření, chirurgické zákroky, transplantace orgánů, ischemické choroby z důvodu mozkové mrtvice nebo infarktu myokardu. Tato vysoká množství aktivovaného kyslíku jsou větší, než jaká mohou dané kontrolní systémy zpracovat, takže přebytečný aktivovaný kyslík může způsobit další poškození organismu vážným narušením normálních buněk. Výsledný tzv. oxidační stres je odpovědný za velké množství dalších zdravotních potíží.

Vezměme si jako příklad arteriosklerózu. Za jednu z příčin tohoto onemocnění je považován výskyt lipoproteinů s nízkou hustotou, které byly oxidovány aktivovaným kyslíkem [Steinberg, D. (1983), Arteriosclerosis 3, 283-301]. Rovněž se předpokládá, že oxidační stres se přímo podílí na příčinách a důsledcích mechanismů spojených s výskytem metabolických poruch a vaskulámích komplikací při diabetů [Kondo, M. vyd., „Approaches from Modem Medicine (4) Free Radicals“, Medical View Pub., str. 138-146].

Aktivovaný kyslík je rovněž zapleten do dalších patologických stavů a okolností, jako jsou ischemické poruchy (poruchy provázející reperfuzi, ischemická srdeční onemocnění, cerebroischemie ischemická enteritida, a pod.), edémy, vaskulámí hyperpermeabilita, záněty, poruchy žaludeční slíznice, akutní pankreatitida, Crohnova nemoc, vředová kolitida, poruchy jater,

-2CZ 293582 B6

Paraquatova nemoc, rozedma plic, chemokarcinogeneze, karcinogenní metastázy, dýchací úzkostný syndrom dospělých, disseminovaná intravaskulámí koagulace (DIC), zákaly, předčasná retinopatie, autoimunitní onemocnění, porfýrémie, hemolytická onemocnění, středomořská anemie, Parkinsonova nemoc, Alzheimerova nemoc, epilepsie, poruchy z ultrafialového záření, 5 poruchy z ozáření, omrzliny a popáleniny.

Jak na povrchu, tak uvnitř buňky existuje několik obranných mechanismů sloužících výhradně účelům zneškodnění aktivovaného kyslíku vytvořeného fyziologickými cestami.

Níže uvedené antioxidanty a antioxidační enzymy z vnitřního prostředí buňky jsou známy pro své schopnosti zpracovat a eliminovat aktivovaný kyslík. Například v peroxizomech se vyskytuje kataláza, která redukuje a odstraňuje peroxid vodíku. Glutathionperoxidáza se vyskytuje v cytoplazmě mitochondrií. Tento enzym redukuje a detoxikuje peroxid vodíku a peroxidy lipidů v přítomnosti redukovaného glutathionu. Například transferin, feritin a laktoferin potlačují tvorbu aktivovaného kyslíku tím, že stabilizují ionty železa, zatímco ceruloplazmin působí podobně při využití iontů mědi. Superoxid dismutáza, která je rovněž přítomna v cytoplazmě mitochondrií, katalyzuje redukci superoxidů za vzniku peroxidu vodíku, který je dále eliminován například katalázou. Dále vitamíny C a E, redukovaný glutathion a některé další nízkomolekulární látky mají rovněž schopnost redukovat a eliminovat aktivovaný kyslík.

Na druhé straně takové látky, jako je extracelulámí superoxid dismutáza, extracelulámí glutathion-peroxidáza a redukovaný glutathion existují v extracelulámím prostředí a mají podobné mechanismy působení jako jejich protějšky vyskytující se uvnitř buněk. Avšak ve srovnání se situací uvnitř buňky je počet antioxidantů a antioxidačních enzymů vně buňky podstatně nižší a pouze několik z nich vykazuje antioxidační účinky v extracelulámím prostředí.

Redukovaný glutathion má významnou funkci při udržování redukovaného stavu jak vně, tak uvnitř buňky. Jeho vzorec je uveden níže. Glutathion byl poprvé objeven jako látka vyskytující se v kvasinkách v roce 1888 de-Rey-Pailhadem a byl po izolaci v roce 1921 pojmenován 30 Hopkinsem jako glutathion.

Vzorec glutathionu;

Η OH O

I III II

HOOC-C-CH₂-CH₂-C-NH-C-C-NH-CH₂-COOH

II nh₂ch

I

SH

Glutathion se skládá ze tří aminokyselin: kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu. Thiolové skupiny dvou molekul glutathionu mohou být oxidovány za vzniku disulfidické vazby v přítomnosti aktivovaného kyslíku, čímž tento aktivovaný kyslík redukují.

Glutathion vzniká především v játrech a v těle cirkuluje prostřednictvím plazmy. V normálním organismu se glutathion vyskytuje téměř výhradně v redukované formě. Pakliže se zvýší hladina jeho oxidované formy, znovu se vytvoří redukovaná forma působením glutathionreduktázy v přítomnosti NADPH (nikotinadenindinukleotidfosfát). Tak ochraňuje redukovaný glutathion buněčné membrány před oxidačními poruchami prostřednictvím své redukční funkce, která 45 redukuje aktivovaný kyslík na volné radikály. Dalším výsledkem této antioxidační vlastnosti redukovaného glutathionu je obrana proti účinkům radioaktivity a jeho využitelnost jako léčebného přípravku při zákalech. V posledních letech bylo rovněž publikováno, že u pacientů s AIDS jsou značně sníženy systémové hladiny redukovaného glutathionu, čímž se dokazuje, že reduko

-3CZ 293582 B6 váný glutathion má pro organizmus zásadní důležitost. Při nenormálních podmínkách může být však množství aktivovaného kyslíku tak vysoké, že doslova veškerý glutathion je v oxidovaném stavu, takže aktivovaný kyslík není odstraňován tím nejrychlejším možným způsobem.

Dalším příkladem je lidský thioredoxin. Je to látka, která využívá svou redukční aktivitu k několika fyziologickým procesům, které zprostředkovává jak na povrchu, tak uvnitř buňky. Lidský thioredoxin (rovněž známý jako Adult T Cell Leukemia Derived Factor, ADF) byl klonován jako faktor, který má schopnost indukovat receptory interleukinu 2 (IL-2R) u dospělých T buněk leukemických buněčných linií. Je to reduktáza závislá na thiolu, obsahující ve svých aktivních místech dva cysteinové zbytky a mající schopnost redukovat aktivovaný kyslík a volné radikály.

Kromě indukce receptorů IL-2 může lidský thioredoxin rovněž: podporovat buněčný růst u B buněk kmene 3B6, které byly infikovány Epstein-Barr virem (EBV), chránit před faktorem nádorové nekrózy (TNF) odvozeného od monocytů linie U937 a chránit proti poškození vaskulámích endoteliálních buněk neutrofily. Dále působí lidský thioredoxin ve intracelulámím prostředí na transkripční faktoiy NFkB, JUN a FOS prostřednictvím své redukční aktivity, Čímž podporuje vazebnou aktivitu DNA a umožňuje tak zvýšení transkripční činnosti. V současné době se vyvíjí lidský thioredoxin jako léčebný přípravek pro poruchy z ozáření a při poruchách provázejících reperfúzi, revmatické artritidě a zánětech. Všem těmto poruchám lze zabránit schopností jeho redukční aktivity vedoucí k ochraně buněk před poškozením.

Jak bylo již dříve zmíněno, z fyziologického hlediska je nesmírně důležité udržovat vnitrobuněčné i mimobuněčné prostředí v redukovaném stavu eliminací aktivovaného kyslíku a volných radikálů. Předpokládá se, že existuje mnoho dosud nepopsaných antioxidantů a antioxidačních enzymů jak uvnitř, tak vně buňky, které hrají důležitou roli při odstraňování aktivovaného kyslíku a volných radikálů. Bylo by tedy nadmíru užitečné nalézt redukující látky, které by měly schopnost opětovně vytvářet například redukovaný glutathion. Taková látka by mohla pomoci při takových abnormálních stavech, jaké byly popsány výše v tomto textu.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří polynukleotidová sekvence kódující fúzní protein a obsahuje ve směru 5-3' a ve stejném otevřeném čtecím rámci:

a) sekvenci kódující protein jaderné inkluze a viru CYW s primární sekvencí, odpovídající polypeptidu, danému aminokyselinami 4 až 437 v sekvenci ID č. 2 v přehledu sekvencí, nebo jeho mutaci či variantu mající podobnou proteolytickou specifítu jakou má protein jaderné inkluze a viru CYVV,

b) sekvenci kódující štěpný peptid AsnCysSerPheGlnX, kde X je zbytek aminokyseliny, který se volí ze skupiny Gly, Ale, Val a Ser, přičemž peptid je rozpoznatelný a štěpitelný uvedeným proteinem jaderné inkluze a viru CYVV nebo jeho mutací či variantou, a

c) alespoň jednu sekvenci kódující exogenní polypeptid.

Druhým cílem tohoto vynálezu je předložit DNA kódující požadovaný protein a zároveň kódující tuto novou proteázu v úseku DNA výše proti směru exprese od daného proteinu, dále sekvenci mezi těmito dvěma uvedenými sekvencemi kódující peptid štěpitelný danou proteázou, přičemž všechny uvedené sekvence jsou ve stejném otevřeném čtecím rámci. Dalším záměrem je poskytnout protein kódovaný touto DNA, vektor obsahující danou DNA a expresivní systém zahrnující daný vektor, ve kterém je daný vektor schopen autonomní replikace v příslušné hostitelské buňce, kde takovýto systém obsahuje nukleotidovou sekvenci potřebnou pro autonomní replikaci.

-4CZ 293582 B6

Jako alternativa je prvním záměrem tohoto vynálezu předložení sekvence nukleotidů kódující nový polypeptid mající redukční aktivitu in vivo. Je rovněž naším záměrem poskytnou DNA, která kóduje peptid mající schopnost redukovat dichloroindofenol a oxidovaný glutathion.

Dalším záměrem tohoto vynálezu je předložení rekombinantního vektoru obsahujícího výše uvedenou DNA a schopného autonomní replikace v příslušné hostitelské buňce tím, že obsahuje sekvenci bází potřebnou pro takovou autonomní replikaci.

Ktomu je dalším cílem tohoto vynálezu poskytnout hostitelské mikroorganismy, které byly transformovány výše uvedeným rekombinantním vektorem. A zároveň poskytnout výše uvedený peptid jako produkt exprese v transformované hostitelské buňce a poskytnout monoklonální protilátky proti takovému peptidu.

V současné době jsme určili a klonovali novou proteázu z CYVV (NIa) a došli jsme k překvapivému zjištění, že je možné využít NIa CYVV jako část fůzního proteinu, který může být exprimován v takových hostitelských buňkách jakými jsou E. coli, a který umožňuje produkci velkého množství tohoto fůzního proteinu, který se může sám štěpit za vzniku požadovaného exogenního proteinu. Gen pro CYVV NIa může být stabilně udržován a exprimován v Escherichia coli a exprimovaný NIa protein si ponechává svojí aktivitu specifické proteázy, a to i v případě, kdy tento protein tvoří část fůzního proteinu.

Zároveň jsme objevili DNA kódující nový polypeptid, který je schopný redukovat dichloroindofenol rovněž známý jako dichlorfenol-indofenol, 2,6-dichlorindofenoI nebo 2,6-dichlor-4[(4-hydroxyfenyl)imino]-2,5-cyklo hexadien-l-on a oxidovaný glutathion, přičemž řečený polypeptid lze získat ve velkém množství při použití vhodných technik genového inženýrství. Tento polypeptid je zvláště užitečný v léčbě stavů v důsledku oxidačního stresu nebo spojených s oxidačním stresem nebo dalších nemocí způsobených aktivovaným kyslíkem, jako je arterioskleróza, diabetus a ischemická onemocnění (včetně poruch provázejících reperfuzi, ischemických chorob srdečních, mozkové ischemie a ischemické enteritidy).

Takže jako první aspekt prvního provedení tohoto vynálezu zde uvádíme sekvenci polynukleotidu, přičemž uvedená sekvence obsahuje ve směru od 5' do 3' a ve stejném otevřeném čtecím rámci:

a) sekvenci kódující protein jaderné inkluze a viru CYVV nebo jeho mutaci či variantu, přičemž tato mutace či varianta má podobnou proteolytickou specifitu jako protein jaderné inkluze a viru CYVV;

b) sekvenci kódující peptid rozeznatelný a štěpitelný uvedeným proteinem jaderné inkluze a viru CYVV nebo mutaci či variantu takového peptidu,

c) alespoň jednu sekvenci kódující polypeptid.

Tento vynález rovněž popisuje sekvenci kódující protein jaderné inkluze a viru CYVV nebo jeho mutaci či variantu, přičemž tato mutace či varianta má podobnou proteolytickou specifitu jako protein jaderné inkluze a viru CYW.

Tento vynález dále popisuje vektor, zvláště expresivní vektor, který obsahuje výše určenou sekvenci.

Tento vynález za další popisuje hostitelské organismy transformované tímto výše uvedeným vektorem spolu s expresivním systémem obsahujícím uvedené hostitele a uvedený expresivní vektor a zároveň polypeptid vytvářený pomocí takového expresivního systému.

-5CZ 293582 B6

V alternativním provedení tohoto vynálezu uvádíme jako první aspekt sekvenci polynukleotidu kódující polypeptid mající sekvenci aminokyselin o číslech 1 až 526 o sekvenčním čísle ID: 12 nebo sekvenci, která kóduje mutaci nebo variantu řečeného polypeptidu za předpokladu, že takový polypeptid kódovaný touto polynukleotidovou sekvencí je schopen redukovat dichloroindofenol a oxidovaný glutathion.

Rovněž zde popisujeme vektor, především expresivní vektor, obsahující výše určenou sekvenci.

Tento vynález za další ještě popisuje hostitelské organizmy transformované tímto výše uvedeným vektorem spolu s expresivním systémem obsahujícím uvedeného hostitele a uvedený expresivní vektor a zároveň polypeptid vytvářený pomocí takového expresivního systému.

Tento vynález dále popisuje výše uvedený polypeptid pro využití v terapii a rovněž využití takového polypeptidu v léčbě a profylaxi stavů způsobených nebo majících souvislost s oxidačním stresem nebo jakoukoli nemocí způsobenou aktivovaným kyslíkem, a zároveň léčebné přípravky obsahující takový polynukleotid.

Dále zde uvádíme protilátky, obzvláště monoklonální protilátky, a jejich ekvivalenty proti polypeptidu. Tento vynález dále popisuje metodu výroby takových protilátek a metody purifikace takového polypeptidu s využitím těchto protilátek.

Přehled obrázků na výkresech

Tento vynález bude ilustrován následujícími obrázky, ve kterých:

Obr. 1 uvádí restrikční mapu cDNA oblasti pro NIa izolované z CYVV-cDNA;

Obr. 2 uvádí konstrukci plazmidu pKNI5' obsahujícího 5'-oblast NIa;

Obr. 3 uvádí konstrukci plazmidu pKNI5IL obsahující část genu IL-11 a 5'-oblast NIa;

Obr. 4 uvádí primery, které byly použity při přípravě fragmentu DNA pro 5'IL a DNA fragmentu CIN3, ve kterých jsou fúzovány 3'-konec genu NIa a 5'-konec IL-11;

Obr. 5 uvádí fúzi DNA fragmentu CIN3 a DNA fragmentu IL5' pomocí PCR;

Obr. 6 uvádí konstrukci plazmidu pKSUN9;

Obr. 7 je restrikční mapa plazmidu pUCKM31-7;

Obr. 8 je srovnávací diagram nukleotidových sekvencí 3'-konce v pUCKM31-7 a pcD-31;

Obr. 9 je konstrukční diagram plazmidu pSRa31-7;

Obr. 10 je diagram začlenění sekvence kódující histidinový hexamer do pUCKM31-7;

Obr. 11 je konstrukční diagram pMAL31-7;

Obr. 12 je graf hodnocení redukční aktivity dichlorofenol-indofenolu;

Obr. 13 uvádí stanovení redukční činnosti oxidovaného glutathionu.

-6CZ 293582 B6

Tento vynález bude ilustrován nejdříve odkazem na první provedení tohoto vynálezu, ale následují diskuze rovněž přísluší i druhému provedení tohoto vynálezu, pokud není zcela zřejmé, že se tato diskuze na druhé provedení tohoto vynálezu nevztahuje.

Polynukleotidová sekvence tohoto vynálezu je přednostně uváděna ve formě DNA a odkazy na tuto sekvenci jsou pro účely tohoto vynálezu chápány především ve formě DNA, avšak tyto odkazy zahrnují rovněž RNA tam, kde to je vhodné. RNA není využívána přednostně vzhledem k omezené praktičnosti této formy nukleové kyseliny. Například mRNA může být exprimována v oocytech Xenopus laevis nebo v translačním systému pšeničných klíčků, avšak ani jeden z těchto systémů není z ekonomických důvodů praktický pro výrobu většího množství fuzního proteinu.

Termín „peptid“ je v tomto textu používán pro molekulu obsahující 2 nebo více aminokyselin spojených peptidovou vazbou. Jako takový zahrnuje tento termín oligopeptidy, polypeptidy a proteiny. Termín „fuzní protein“ znamená jakýkoli jednotlivý polypeptid získaný kombinací dvou nebo více dalších peptidových sekvencí.

Rovněž se předpokládá, že sekvence tohoto vynálezu bude chápána ve dvouvláknové formě. Tento vynález rovněž předpokládá opačnou sekvenci k odpovídající sekvenci tohoto vynálezu. Tato dvouvláknová (nebo ds) sekvence tohoto vynálezu může mít jeden nebo dva „lepivé“ (kohezní) konce, přičemž v tomto případě nemusí pozitivní a negativní řetězce přesně souhlasit.

Protein kódovaný sekvencí uvedenou v a) výše má štěpit peptid kódovaný sekvencí uvedenou v b) výše, aby uvolnil polypeptid(y) kódované sekvencí c) výše, je-li sekvence tohoto vynálezu exprimována ve vhodném expresivním systému.

Štěpení fúzního proteinu se může odehrávat kdykoli poté, co byly translatovány výše uvedené sekvence a) a b). Je zřejmé, že není nutné aby byl polypeptid kódovaný výše uvedenou sekvencí c) před štěpení zcela translatován, nicméně jsme v praxi zjistili, že alespoň některé z fúzních proteinů, pokud ne jejich většina, jsou před štěpením kompletně přeloženy.

Tam, kde sekvence c) kóduje více než jeden polypeptid, je nezbytné kódovat další štěpnou sekvenci mezi jednotlivé kódované polypeptidy, pokud není žádoucí získat násobné neštěpené fúzované polypeptidy.

Pokud výše uvedená sekvence c) kóduje více jak jeden polypeptid, pak může být tato sekvence citlivá v transkripčním prostředí na atenuaci. Při procesu atenuace se transkripce sekvence mRNA, která je předmětem tohoto vynálezu, zastavuje dříve než byla přečtena celá mRNA, aby byly polypeptidy, které jsou umístěny blíže 3'-konci, produkovány v menší míře než polypeptidy umístěné poblíž 5'-konci. Atenuace nepůsobí obecně potíže kromě případů, kdy je kódováno několik polypeptidů a/nebo jsou kódované polypeptidy velmi dlouhé.

Zároveň je výhodné, aby výše uvedená sekvence c) kódovala pouze jeden polypeptid, pokud není žádoucí připravit větší množství peptidů pro společné využití nebo kde je fúzováno větší množství polypeptidů. V ostatních případech je nutné izolovat jednotlivé polypeptidy po štěpení, což může být nepohodlné a přinášet velké ztráty při purifikaci konečného produktu.

Avšak tam, kde výše uvedená sekvence c) kóduje více než jeden polypeptid a kde jsou mezi jednotlivými kódovanými polypeptidy štěpné sekvence, tam není nezbytně nutné, aby tyto štěpné sekvence byly rozpoznávány CYVV NIa. Pro takovou štěpnou sekvenci mezi sekvencí a) a 5'koncem sekvence b) je však nutné, aby byla rozpoznatelná pro proteázu kódovanou sekvencí a). Tam, kde je to potřeba nebo kde je přijatelné umožnit fúznímu proteinu samoštěpení za vzniku velkého množství polypeptidů, tam je možné, aby byla jakákoli další štěpná sekvence rozpoznatelná proteázou kódovanou sekvencí a). Nicméně takovéto další sekvence mohou být vybrány tak, aby byly štěpitelné dalšími způsoby tak, aby byl fuzní protein štěpen po transkripci svojí NIa

-7CZ 293582 B6 částí za vzniku NIa a polyproteinu. NIa pak může být odstraněna a polyprotein pak štěpen například faktorem Xa nebo trypsinem.

Štěpný peptid kódovaný výše uvedenou sekvencí b) (zde rovněž uváděné jako „štěpná sekvence“ a „štěpný peptid“) může být sekvence, která je zcela nebo částečně obsažena v některé ze sekvencí kódovaných sekvencemi a) a c) („NIa“ nebo „proteáza“ a „polypeptid“). Takže Nkonec štěpného peptidů může být zároveň obsažen v C-konci sekvence proteázy, zatímco Ckoncová část štěpného peptidů může být zahrnuta v N-koncové části polypeptidu. V takovém případě nemůže takovýto štěpný peptid existovat nezávisle a rozpoznávací místo pro proteázu je vytvořeno z C-konce proteázy a N-konce polypeptidu.

Štěpný peptid může být rovněž zahrnut pouze v části proteázy nebo polypeptidu. V takovém případě bude N-konec štěpného peptidů normálně zahrnut v C-koncové části proteázy a Nkoncová část polypeptidu bude buď přímo spojená se štěpnou sekvencí, nebo se mezi polypeptidem a spojovníkem může vyskytovat jeden nebo více zbytků aminokyselin.

Tam, kde je mezi štěpnou sekvencí a proteázou a/nebo štěpnou sekvencí a polypeptidem jeden nebo více zbytků aminokyselin, tam by počet a povaha těchto aminokyselinových zbytků měla být taková, aby nebránila působení proteázy. Přebytečné aminokyselinové zbytky na N-konci polypeptidu nejsou obecně ku prospěchu tam, kde musí být tyto zbytky odstraněny, aby se získala zralá forma polypeptidu. Většinou je lepší, pokud neexistují žádné kontraindikace, vytvořit štěpný peptid tak, aby se zralá forma požadovaného proteinu získala štěpením fúzního proteinu. Nicméně je však možné získat protein mající Gly, Ser nebo Ala připojený například k N-konci. Tyto aminokyselinové zbytky mohou být v případě potřeby odstraněny působením vhodné aminopeptidázy.

V některých případech může být žádoucí kódovat mezi N-konec polypeptidu a štěpnou sekvenci aminokyselinu prolin. Toto řešení umožňuje štěpení zbytků až ke zbytku prolinu například působením aminopeptidázy P (3.4.11.9), avšak nikoli dále za tento prolin. Místo toho může být zbytek prolinu odstraněn působením prolin iminopeptidázy za vzniku zralého proteinu. Toto řešení představuje jedno z předních provedení tohoto vynálezu.

Sekvence a) kóduje proteázu, která je schopná štěpit fúzní protein kódovaný sekvencí tohoto vynálezu. V tomto vynálezu je touto proteázou proteáza jaderné inkluze a viru CYVV nebo její mutace či varianta mající podobnou proteolytickou specifítu jako má proteáza jaderné inkluze a viru CYVV.

Proteáza jaderné inkluze a viru CYVV je kódována nukleotidy číslo 10 až 1311 v sekvenci o čísle ID: 1 podle přehledu sekvencí, zatímco primární sekvence NIa je dána aminokyselinami číslo 4 až 437 v sekvenci č. ID: 2 podle přehledu sekvencí. Tyto sekvence jsou nové a tvoří součást tohoto vynálezu stejně jako jejich mutace či varianty.

Jaderná inkluze a má proteolytickou aktivitu, která specificky hydrolyzuje peptidové vazby mezi Gln-Ala, Gln-Gly nebo Gln-Ser v peptidovém substrátu. Navíc jsme zjistili, že NIa může štěpit Gln-Val. Takže jsme zjistili, že CYW NIa může na rozdíl od jiných proteáz kmene potyvirů štěpit sekvenci AsnCysSerPheGlnX, kde X je kterýkoli aminokyselinový zbytek, avšak zvláště Gly, Ala, Val nebo Ser a především Gly, Ala nebo Ser. (Odkazy na NIa v tomto textu znamenají CYVV NIa (tj. jadernou inkluzi a Clover Yellow Vein Virus, pokud nebude uvedeno jinak).

Je zároveň zřejmé, že peptidy obsahující sekvenci AsnCysSerPheGlnX mohou být štěpeny NIa zvláště tam, kde je taková sekvence stericky přístupná působení NIa. Tím tento vynález zároveň poskytuje systém přípravy polypeptidu, ve kterém je prekurzorová forma tohoto polypeptidu obsahující danou sekvenci AsnCysSerPheGlnX štěpena NIa. Tento systém může rovněž obsahovat další kroky podle potřeby buď před, po a nebo současně se štěpením NIa.

-8CZ 293582 B6

Ačkoli obecně dáváme přednost použití sekvence kódující přirozeně se vyskytující NIa (podle sekvence č. ID: 2), tento vynález zároveň předpokládá využití mutací či variant NIa.

Jak již bylo řečeno, měla by taková proteáza mít stejnou nebo podobnou specifitu jako přirozeně se vyskytující NIa. Z tohoto hlediska by taková proteáza obecně měla mít značnou sekvenční homologii se zbytky aminokyselin 4 až 437 v sekvenci číslo ID: 2 kromě případů, kdy je odborníkům jasné, že taková výrazná variace je možná beze změny rozpoznávací sekvence nebo snížení aktivity pod přijatelnou úroveň.

Obecně je vhodné, aby byla aktivita kteréhokoli daného proteinu závislá na určité konzervované oblasti této molekuly, zatímco ostatní oblasti mají pouze malý význam ve spojení s jejich určitými sekvencemi a mohou být prakticky nebo zcela nadbytečné. Tím tento vynález zahrnuje varianty a mutace takové sekvence, které stále projevují specifitu podobnou přirozeně se vyskytující NIa. Takové varianty a mutace zahrnují například delece, adice, inzerce, inverze, repetice a substituce (například substituce nahrazující jeden hydrofílní zbytek jiným, avšak nikoli nahrazující zbytek silně hydrofílní silně hydrofobním zbytkem jako pravidlo). Malé změny budou mít všeobecně malý vliv na aktivitu, pokud nejsou v důležité části molekuly, a takové změny mohou být vedlejším produktem genetických manipulací, například při vytváření nových restrikčních míst, pokud jsou taková místa zapotřebí.

V obecných případech nenastane žádný zvláštní důvod pro změny ve struktuře NIa kromě zvláštních případů, které jsou odborníkům v oboru známy. Většina mutací a variací v sekvenci aminokyselin či v kódující sekvenci bude skutečně výsledkem izolace nové varianty původního divokého typu viru. Avšak ani úmyslné ani náhodné modifikace nejsou z tohoto vynálezu vyjmuty za předpokladu, že daná proteáza má nezbytnou specifitu a dostatečnou proteolytickou aktivitu.

Tak, jak je termín „nepříznivý účinek“ používán v této patentové přihlášce, znamená účinek na specifitu nebo aktivitu, který uděluje proteáze výrazně nižší účinnost, než jakou má přirozeně se vyskytující výše uvedená NIa, a to do takové míry, že aktivita takové proteázy je snížena pod užitečnou mez.

Může být provedeno mnoho substitucí, adicí a podobných modifikací. Jediným omezením je, aby nebyla nepříznivě ovlivněna účinnost proteázy. Tento vynález dále zahrnuje „varianty“, přičemž tento termín je používán ve spojení s přirozeně se vyskytující CYW NIa, která úzce koresponduje se sekvencí ID: 2, ale která se mění způsobem očekávaným u široké populace. Do této definice spadají varianty alel a ty peptidy z jiných kultivarů, které vykazují podobný typ aktivity a mají příbuznou sekvenci.

Ani NIa ani protein z druhého provedení tohoto vynálezu nemusí zcela korespondovat se sekvencí určenou v ID: 2 a ID: 12. Jediným požadavkem je, aby každý měl potřebnou aktivitu, a to i tehdy, jestliže je polypeptid pouze frakcí celé přirozené sekvence nebo mutací či variací takové frakce.

Předpokládá se, že geny eukaryot jako je gen pro interferon, vykazují polymorfísmus [srovnej., Nishi, T. a kol. (1985), J. Biochem. 97, 153-159]. Tento polymorfismus vede v některých případech k substitucím jedné nebo více aminokyselin v polypeptidu nebo k případům, kde přes substituci v sekvenci nukleotidů nedochází k žádným změnám v sekvenci aminokyselin.

Tak může být kódující sekvence polynukleotidu rovněž upravena jakýmkoli potřebným způsobem za předpokladu, že nedojde k žádným nepříznivým účinkům na aktivitu výsledné proteázy. Mohou se provést bodové mutace či jiné změny, aby se například přidalo nebo vyjmulo restrikční místo nebo jinak napomohlo dalším genetickým manipulacím/expresím nebo pro posílení či jiné vhodné úpravy molekuly NIa.

-9CZ 293582 B6

Termíny „mutace“ a „varianta“ jsou v této přihlášce rovněž používány s odvoláním na sekvenci polynukleotidu a takový odkaz musí být sestaven příslušným způsobem, mutatis mutandis. Je rovněž vhodné, aby se mutace či varianta sekvence peptidu vždy odrazila v kódující nukleotidové sekvenci, v opačném směru to nemusí vždy platit. Proto je možné značně změnit nukleotidovou sekvenci (viz dále v diskuzi o degeneraci genetického kódu), aniž by to jakýmkoli způsobem ovlivnilo sekvenci polypeptidu. Takové mutace a varianty nukleotidové sekvence spadají do záběru tohoto vynálezu.

Bylo například stanoveno, že protein, který se získá náhradou cysteinového kodonu v genu pro interleukin 2 (IL-2) serinovým kodonem, má stále schopnost vykazovat aktivitu IL-2 [Wang, A. a kol. (1984), Science 224: 1431-1433]. Takže do tohoto vynálezu spadají sekvence kódující přirozeně se vyskytující nebo syntetické proteiny, které mají aktivitu příslušné NIa.

Pro odborníky v oboru nebude těžké zpětně vytvořit gen kódující NIa, která je předmětem tohoto vynálezu.

Vzhledem k degeneraci genetického kódu není nutné, aby jakákoli taková zpětně vytvořená sekvence dobře či jakkoli hybridizovala s jakoukoli danou komplementární sekvencí zpětně vytvořenou z toho samého peptidu. Tento faktor je odborníkům v oboru dostatečně znám a degenerace jakékoli dané sekvence je často tak rozsáhlá, že je téměř nemožné syntetizovat i jen krátké komplementární oligonukleotidové sekvence, které by sloužily jako nukleotidové sondy pro přirozeně se vyskytující oligonukleotidové sekvence.

Degenerace genetického kódu je taková, že například mohou existovat 4 nebo více možných kodonů pro nejčastěji se vyskytující aminokyseliny. Z toho je zřejmé, že s počtem aminokyselinových zbytků se počet možných kódujících sekvencí pro kterýkoli daný peptid exponenciálně zvyšuje. Z toho důvodu je vhodné, aby byl počet možných kódujících sekvencí pro NIa tohoto vynálezu šest nebo více. Je však žádoucí vyrovnat obsah G + C podle použitého expresivního systému a dále zvážit další faktory důležité pro daný expresivní systém, jako je třeba frekvence kodonu.

Jak již bylo řečeno, může být hybridizace nespolehlivým ukazatelem homologie sekvencí, přesto je vhodné, aby sekvence vykazovaly více jak 50% homologii, lépe 70% a ještě lépe 80% homologii se sekvencí č. ID: 1. V každém případě je vhodné, aby sekvence kódovala výše uvedenou proteázu. Tento vynález zároveň předpokládá možné využití vedoucí sekvence umístěné upstream od sekvence proteázy. Tato možnost by umožnila extemalizaci fúzního proteinu z hostitele a jeho shromažďování například v supematantu. Výsledný vyloučený fúzní protein by se pak štěpil a polypeptidy by se sbíraly. Pro takovou signální sekvenci se může použít jakákoli vhodná sekvence, zvláště byla-Ii taková sekvence vytvořena speciálně pro daný expresivní systém.

Tento vynález zároveň počítá s vektory obsahujícími sekvenci tohoto vynálezu. Pro tento vynález není rozhodující obecná povaha vektorů, které budou podle tohoto vynálezu použity. Obecně řečeno pro odborníky v oboru bude jasné, které expresivní vektory a konstrukce budou vhodné pro použití pro tento vynález a budou je přesně vybírat podle toho, čeho chtějí dosáhnout s danou sekvencí, jako klonování nebo exprese.

Vhodné expresivní vektory mohou být založeny na fázích nebo plazmidech. Oba typy vektorů upřednostňují určitý typ hostitele, avšak je možné tyto vektoiy upravit tak, aby vyhovovaly i jinému hostiteli. Další vhodné vektory zahrnují kosmidy, retroviry a další přenašeče, které mohou nebo nemusí být pro daný systém specifické. Vhodné regulační sekvence jako je rozpoznávací místo, promotor, operátor, induktor, terminátor a další sekvence nezbytné nebo vhodné pro regulaci exprese jsou opět snadno přístupné odborníkům v oboru a mohou být spojeny buď s CYW, nebo s použitým vektorem, nebo mohou být odvozeny od kteréhokoli jiného vhodného zdroje. Vektory mohou být vytvořeny a upraveny jakýmkoli vhodným způsobem.

-10CZ 293582 B6

Rozumí se, že sekvence ID: 2 představuje dostatečnou sekvenci na to, aby kódovala celou NIa. Terminátory, promotory a další takovéto regulační sekvence mohou být podle potřeby přidány tak, aby například zprostředkovávaly ligaci s vhodným vektorem, expresi nebo obojí.

Je samozřejmé, že fragment DNA kódující NIa tohoto vynálezu spolu s kterýmkoli dalším fragmentem kódujícím štěpící sekvenci a fragmentem kódujícím daný polypeptid(y) musí být snadno zabudovatelný do jakéhokoli vhodného vektoru. V ideálním případě má použitý vektor vhodná restrikční místa pro snadnou inzerci. Pro ligaci však mohou být použity například i tupé konce, i když tato varianta může vést k nejasnostem v otevřeném čtecím rámci a orientaci vloženého fragmentu. V takovém případě je potřeba otestovat hostitele transformované transfekčním vektorem a vybrat vektory mající nezbytný fragment vložen ve správné orientaci ave správném otevřeném čtecím rámci. Za účelem ověření otevřeného čtecího rámce daného fragmentu je vhodné sestrojit konstrukt ze sekvencí a), b) a c), který pak může být vložen přímo do vektoru, čímž se zamezí nejistotám při získávání potřebného expresivního vektoru. Pro odborníky v oboru opět nebude obtížné vybrat touto cestou vektory vhodné pro daný expresivní systém.

Požadovaný fůzní protein může být exprimován například transformací E. coli získaným plazmidem, výběrem transformantů pomocí ampicilinu nebo jiným vhodným způsobem a přidáním tryptofanu nebo jiného vhodného induktoru promotoru (jako např. kyseliny indolakrylová). Míra exprese může být ověřena elektroforézou v SDS polyakrylamidovém gelu - SDS - PAGE [Laemmli a kol., Nátuře, (1970), 227, pp. 680 - 685].

Je rovněž vhodné, aby se tam, kde jsou například používány jiné vektory, používaly stejně vhodné a přijatelné selekční znaky nebo alternativní metody selekce a/nebo jakýkoli vhodný promotor podle požadavků nebo jeho výhodnosti pro daný případ.

V případě, že má být fúzní protein sklízen z hostitelských buněk, je potřeba sebrat transformované buňky, rozrušit je třeba sonikací a odstředit. Rozrušení buněk může být rovněž provedeno štěpením enzymy s použitím například celulózy nebo třepáním s nějakou přísadou, jako jsou například skleněné kuličky. Jsou však upřednostňovány metody jako sonikace, protože nevyžadují žádné další přísady. Vzniklý supematant může být testován na aktivitu polypeptidu a produkty štěpení mohou být určeny například pomocí SDS-PAGE.

Pro získání produktu exprese jsou vhodné běžné techniky purifíkace proteinů.

DNA tohoto vynálezu může být připravena izolací genomové RNA viru CYVV [Uyeda, I. a kol. (1975) Ann. Phytopath, Soc. Japan 41: 92-203], Vhodným zdrojem CYW je Americká sbírka typových kultur č. PV 123 (Američan Type Culture Collection No. PV 123). V každém případě může být CYVV virus definován jako virus, který způsobuje nekrózu u Vicia faba.

Genomová RNA může být získána z partikulí CYW, které byly získány z infikovaných rostlin, a dvouvláknová cDNA může být poté připravena známými metodami reverzní transkripce. Dobrým indikátorem při ověřování, zda se jedná o mutaci či variantu stejného kmene CYVV, je homologie sekvencí. Je známo mnoho typů potyvirů a všechny se liší ve své patogenitě. Rozhodování, zda daný virus tvoří samostatného člena určité skupiny, je založeno na sérologické příbuznosti proteinů virového obalu a homologii sekvencí aminokyselin. Proto viry, jejichž primární sekvence aminokyselin jsou z 90 % homologní, jsou považovány za příslušníky stejného kmene, zatímco viry, jejichž primární sekvence aminokyselin má homologii nižší než 70 %, jsou považovány za příslušníky odlišných kmenů [Shukla, D. D. a Ward, C. W. (1989), Arch. Virol. 106: 171-200]. Na základě odlišných vlastností proteinů obalu viru CYVV použitého v tomto vynálezu [Uyeda, I. a kol. (1991), Intervirol. 32: 234-245], je virus CYVV uznáván jako samostatný člen kmene potyvirů. Tudíž kterýkoli virus mající homologii primárních sekvencí aminokyselin proteinů virového obalu 90 % a vyšší nebo jakýkoli virus zjistitelný jako pozitivní

-11 CZ 293582 B6 pomocí ELISA testů při použití anti-CYVV antiséra (například Americká sbírka typových kultur č. PVAS-123: CYVV antiserum), je definován jako kmen viru CYW.

Různé druhy rostlin, na kterých může být CYVV pěstován, zahrnují: Phaseolus vulgaris, Vicia faba a Pisum sativum, ale používají se především Viciafaba, zvláště kultivar Wase-soramame.

Nejpoužívanější metoda pro purifikaci virových partikulí zahrnuje homogenizaci a vylisování listu nebo listů infikované rostliny ve vhodném pufru, po kterém následuje extrakce organickým rozpouštědlem, jako je chloroform, a opakovaná centrifugace zakončená centrifugací v sacharózovém hustotním gradientu.

Jedním ze způsobů, jak potvrdit, zda je získaný virus virem CYVV, může být prohlídka virové partikule v elektronovém mikroskopu. Dalším způsobem je inokulace Vicia faba virovou partikulí a následné pozorování, zda se objeví nějaké symptomy.

Mezi vhodné metody extrakce genomové RNA z virových partikulí je metoda používající guanidinthiokyanát/fenol, metoda guanidinthiokyanát/trifluorcesiová a metoda fenol/SDS. My však dáváme přednost alkalické metodě využívající centrifugací v sacharózovém hustotním gradientu [Dougherty, W. G. a Hiebert, E. (1980) Virology 101: 466-474].

RNA získaná výše popsaným způsobem může být pak testována za účelem zjištění, zda skutečně kóduje proteázu pomocí translace v bezbuněčném translačním systému. Autolýza (samoštěpení) může být pak zjištěna tam, kde RNA kóduje více produktů celkové translace než jen proteázu, sledováním jakýchkoli změn v molekulové hmotnosti produktů získaných z iyzátů. Takovéto sledování může být provedeno například pomocí protilátek proti proteinům virového obalu.

Je zapotřebí, aby se translační produkt průběžně testoval pomocí protilátek proti proteinům virového obalu například genomovou RNA, která byla translatována po injekci do oocytů Xenopus laevis [Gurdon, J. B. (1972), Nátuře 233: 177-182], nebo použitím králičích retikulocytů či translačního systému pšeničných klíčků [Schleif, R. F. a Wensink, P. C. (1981) v „Practical Methods in Molecular Biology“ Springer-Verlag, N.Y.].

Jednovláknová DNA může být syntetizována s použitím takto získané genomové RNA jako templátů a reverzní transkriptázy. Dvouvláknová ds-cDNA může být syntetizována zjednovláknové (ss) cDNA podle standardních postupů. Vhodné metody včetně metody nukleázy SI [Efstratidiatis, A. a kol. (1976), Cell 7: 279-288; Okayama, H. a Berg, P. (1982), Mol. Cell. Biol, 2: 161-170 a další], Landovy metody [Land, H. a kol. (19981) Nucleic Acids Res. 9, 2251-2266] a metody O. Joon Yooa [Yoo, O. J. a kol. (1983) Proč. Natí. Acad. Sci. USA 79, 1049-1053]. Z těchto různých možností dáváme přednost použití metody Gublera-Hoffmana [Gubler, U. a Hoffman, B. J. (1983), Gene 25: 263-269].

Takto získaná ds-cDNA může být pak inkorporována do klonovacího vektoru, jakým je třeba plazmíd nebo fág λ, a výsledný rekombinantní vektor může být poté zaveden do mikroorganismu jako například Escherichia coli. E. coli kmen DH5a je obzvlášť vhodný. Transformanti pak mohou být selektováni podle jejich rezistence na baktericidní látky, jako je tetracyklin nebo ampicilin, s použitím metod odborníkům v tomto oboru dostatečně známých.

Transformace může být například provedena metodou Hanahana [Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol. 166: 557-580], ve které je rekombinantní DNA vektor zaveden do buněk, které byly reakcí s chloridem vápenatým, hořečnatým nebo rubidným uvedeny do kompetentního stavu.

Níže jsou uvedeny vhodné metody pro selekci transformantů obsahujících NIa DNA.

-12CZ 293582 B6 (1) Screening pomocí nukleotidové sondy

Je zapotřebí začít od CYVV divokého typu. Jedním ze způsobů izolace příslušné RNA je pak použití cDNA nukleotidové sondy s tím, že byla stanovena sekvence aminokyselin NIa (použitá část sekvence aminokyselin může být z kterékoli oblasti NIa). Tak je syntetizován oligonukleotid odpovídající příslušné sekvenci aminokyselin. Obecně má vybraná sekvence aminokyselin obsahovat co nejmenší počet degenerací, protože jinak by bylo nezbytné vytvořit několik nukleotidových sond s použitím všech možných variant kodonů. V takovém případě je pravděpodobně užitečné vzít v úvahu frekvenci kodonu. Rovněž mohou být použity násobné nukleotidové sekvence a pro odstranění lišících se nukleotidů může být použit inosin. Pak může být sonda označena radioizotopem ³²P, ³⁵S nebo biotinem. Transformované kmeny pak mohou být zjištěny fixací denaturované plazmidové DNA na nitrocelulózový filtr s použitím radioaktivně značených sond a pozitivní klony mohou pak být zjištěny autoradiografií.

(2) Použití PCR nukleotidové sondy

Při této technice mohou být syntetizovány pomocí PCR oligonukleotidy odpovídající známé části sekvence aminokyselin jak z pozitivního, tak z negativního řetězce nukleové kyseliny [Saiki, R. K. a kol. (1988), Science 239: 487-491]. Tyto oligonukleotidy mohou pak být v kombinacích použity pro amplifikaci fragmentu DNA kódujícího NIa. Vhodnou templátovou DNA je cDNA získaná prostřednictvím reverzní transkripce virové genomové RNA, o které je známo, že kóduje NIa. Takto připravené fragmenty DNA jsou označeny radioizotopy ³²P, ³⁵S nebo biotinem, a s touto sondou je pro selekci požadovaného klonu provedena hybridizace kolonií nebo plaků.

(3) Screening pomocí exogenní tvorby daného proteinu v živočišných buňkách

Tato metoda zahrnuje kultivaci transformovaného kmene za účelem amplifíkace genu, po které následuje transfekce tohoto genu do živočišných buněk (většinou buď použitím plazmidu, který je schopen replikace a obsahuje oblast promotoru transkripce, nebo plazmidu, který se může integrovat do příslušného chromozomu), aby byl exprimován protein kódovaný daným genem. Kmen může být selektován na základě měření příslušné aktivity.

(4) Selekce pomocí protilátek proti NIa

Protilátky se vytvářejí proti jaderným inkluzím (NIa a NIb) z rostliny infikované CYVV nebo proti proteinu tvořenému expresivním vektorem ve vhodném systému. Takové protilátky nebo protilátky proti takovým protilátkám mohou potom určovat požadovanou NIa nebo kmen.

(5) Translační systém selektivní hybridizace cDNA transformantů se hybridizuje s mRNA z buněk exprimujících NIa, jak již bylo uvedeno výše. mRNA vázaná na cDNA se pak disociuje a odebere. Získaná mRNA je v translačním systému, například injekcí do oocytů Xenopus laevis nebo v takovém bezbuněčném systému jako jsou králičí retikulocyty nebo translační systém pšeničných klíčků, přeložena na protein. Požadoaný kmen je selektován podle aktivity NIa nebo detekcí NIa pomocí protilátek na NIa.

DNA kódující NIa z CYVV může být z požadovaných kmenů získána známými metodami [např. Maniatis, T. a kol. (1982), „Molecular Cloning A Laboratory Manual“ Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.]. Z buněk je například separována frakce, která odpovídá vektorové DNA a to oblast DNA, která kóduje daný protein je z řečené plazmidové DNA vystřižena.

Sekvence DNA může být určena buď chemickou metodou (Maxamova a Gilbertova technika) [Maxam, A. M. a Gilbert, W. (1980), „Methods in Enzymology“ 65, 499-276], nebo použitím metody sekvenování pomocí koncových inhibitorů syntézy DNA při použití fágu M13 [Messing, J. a Vieira, J. (1982), Gene 19: 269-276].

-13 CZ 293582 B6

V posledních letech je tendence nahradit radioizotopy pro určování sekvence DNA bezpečnějšími fluorochromy. Sekvenování pomocí koncových inhibitorů syntézy DNA je nyní navíc prováděno automaticky pod kontrolou počítačové techniky. Systémy odečítání sekvencí bází po elektroforéze se rovněž rychle vyvíjejí a zahrnují například sekvenační automat „CATALYST 800“ a sekvenátor 3 73A DNA (Perkin-Elmer Japan Applied Biosystems). Tyto systémy umožňují účinné a bezpečné určení sekvencí bází DNA.

Vektory použité v tomto vynálezu mohou být obecně organizovány tak, aby se exprimovaly ve „standardních buňkách“ buď prokaryotických, nebo eukaryotických. Navíc vložením vhodného promotoru a sekvence pro fenotypovou expresi do daného vektoru může být takový gen exprimován v různých hostitelských buňkách.

Vhodné prokaryotické organismy zahrnují Escherichia coli a Bacillus subtilis. Pro fenotypovou expresi požadovaného genu může vektor rovněž obsahovat replikon pocházející z druhu, který je kompatibilní s hostitelským organismem. V E. coli může plazmid obsahovat počátek replikace a promotor jako lac nebo UV5. Upřednostňovány jsou ty vektory, které udělují transformovaným buňkám odlišný fenotyp.

Jako hostitelský organizmus jsou nejčastěji používány Escherichia coli, kmen JM 109 odvozený od E. coli kmene K12. Současné vektory pro E. coli jsou obecně selektovány z pBR322 nebo série plazmidů pUC, ale mohou být v případě potřeby použity i jiné kmeny a vektory. Mezi promotory vhodné pro E. coli patří laktosový promotor (lac), tryptofanový promotor (trp), tryptofan-laktosový promotor (tac), lipoproteinový promotor (lpp), promotor XPL (z fágu λ) a Tu promotor (tufB - Tu elongační faktor polypeptidového řetězce), avšak tento vynález se neomezuje pouze na tyto promotory.

Vhodné kmeny Bacillus subtilis zahrnují kmen 207-25. Mezi vhodné vektory patří mimo jiné pTUB288 [Ohmura, K. a kol. (1984), J. Biochem. 95: 87—93], Vhodným promotorem je regulační sekvence genu pro α-amylázu Bacillus subtilis. Je to vhodný příklad, jak může být signální sekvence peptidu (z α-amylázy) použita pro sekreci mimo buňku.

Pokud je potřeba exprimovat fůzní protein v eukaryotických buňkách, pak mohou být použity buňky z obratlovců, hmyzu, kvasinek, rostlin, atd. Upřednostňovaným typem obratlovčích buněk jsou COS buňky, zvláště pak buňky COS-1 [např. Gluzman, Y. (1981), Cell 23: 175-182] nebo buňky zvaječníků čínského křečka (CHO) deficientní na dihydrofolátreduktázu [Urlaub, G. a Chasin, L. A. (1980), Proč. Nati. Acad. Aci. USA 77, 4216-4220], avšak tento vynález se neomezuje pouze na tyto možnosti.

Jak již bylo zmíněno, jsou jako buňky obratlovců často používány COS buňky, a ty mohou být například použity pro tento vynález. Expresivní vektory obsahující replikon SV40 mají schopnost autonomní replikace v COS buňkách a jsou vybaveny promotorem transkripce, terminační sekvencí pro transkripci a jedním nebo více místy pro sestřih. Expresivní vektory obsahující požadovanou sekvenci DNA mohou být použity pro transformaci COS buněk pomocí několika metod, jako je například DEAE-dextranová metoda [Luthman, H. a Magnusson, G. (1983), Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308], metoda koprecipitace s fosforečnanem vápenatým - DNA [Graham, F. L. a van der Eb, A. J. (1973), Virology 52, 456-457] a metoda elektroporace [Neumann, E. a kol. (1982), EMBO J. 1, 841-845],

Pokud jsou jako hostitelské buňky použity buňky CHO, pak je vhodné použít vektor schopný exprimovat gen neo, který poskytuje rezistenci na G418. Mezi vhodný vektory nesoucí tento signální znak patří pRSVneo [Sambrook, J. a kol. (1989): „Molecular cloning - A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, NY] a pSV2-neo [Southem, P. J. a Berg, P. (1982), J. Mol. Appl. Genet, 1, 327-341]. Transformanti pak mohou být selektováni na základě rezistence na G418.

-14CZ 293582 B6

Vybrané transformanty je pak možno pěstovat běžnými metodami a v případě druhého provedení tohoto vynálezu je polypeptid produkován jak uvnitř buněk, tak i do extracelulámího prostředí. Vhodné kultivační médium může být vybráno z běžně používaných médií podle druhu vybraných hostitelských buněk. Například pro COS buňky může být podle potřeby do médií jako RPMI1640 nebo upraveného Dulbecco media Eagle (DMEM) přidáno médium obsahující krevní složky, jako je třeba fetální hovězí sérum.

Pokud by praktik dával přednost použití hmyzích buněk, pak může použít buňky odvozené od buněk ze Sprodoptera frugiperda [Smith, G. E. a kol. (1983), Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165].

Vhodné kvasinky zahrnují pekařské kvasnice (Sacharomyces cerevisiae) a kvasinky Schizosaccharomyces pombe.

Mezi vhodné rostlinné buňky patří buňky z Nicotiana tabacum a Oryza sativa.

Rozumí se, že výše uvedené hostitelské organismy musí být standardními hostiteli, aby odborník s nimi pracující byl schopen vybrat vhodné hostitele pro daný případ.

Vhodné expresivní vektory pro buňky obratlovců zahrnují ty, které mají promotor umístěný proti směru exprese od genu, který se má exprimovat, společně s takovými místy jako je místo pro sestřih RNA, místo pro polyadenylaci, sekvence pro ukončení transkripce a aby dále měly v případě potřeby i počátek replikace. Vhodným příkladem takového expresivního vektoru je pSV2dhfr, který má časný promotor SV40 [Subramani, S.a kol. (1981), Mol. Cell. Bio. 1: 854864].

Mezi vhodné expresivní systémy pro hmyzí buňky patří kultivované buňky zSpodoptera frugiperda. Vhodné expresivní vektory mají například polyhedrinový promotor bakulovirů umístěný proti směru exprese od genu, který má být exprimován, společně s místem pro polyadenylaci a částí genomu AcMNPV (Acutographa califomica nuclear polyhedrosis virus) potřebnou pro homologní rekombinaci. Jedním z příkladů je pBacPAK8 [Matuura, Y. a kol. (1987), J. Gen. Virol. 68: 1233-1250],

Pro expresi v eukaryotech jsou běžně používány kvasinky jako Saccharomyces cerevisiae. Expresivní vektor vhodný pro kvasinky může obsahovat například promotor pro alkoholdehydrogenázu [Bennetzen, J. L. a Halí, B. D. (1982), J. Biol. Chem. 257: 3018-3025], promotor pro kyselou fosfatázu [Miyahara, a kol. (1983), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 1-5] nebo promotor pro karboxypeptidázu Y [Ichikawa, K. a kol. (1983), Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1686-1690]. V takovém případě může být rovněž použita signální sekvence z karboxypeptidázy Y, čímž se umožní sekrece do extracelulámího prostředí.

Mezi expresivní vektory vhodné pro rostliny patří například pBI121, který má promotor 35S (odvozený od časného promotoru viru květákové mozaiky), polyadenylační sekvenci genu pro syntézu nopalinu z Agrobacterium tumefaciens a transferovou sekvenci genu z Agrobacterium tumafaciens [Jefferson, R. A. a kol. (1987), EMBO J. 6: 3901-3907]. Tyto vektory mohou být zavedeny do rostlinných buněk takovými metodami, jako je infekce Agrobacterium tumefaciens a elektroporace.

Plazmid pKK388-l (vyráběný firmou Clonetech) má promotor trc a je vhodný pro použití v Escherichia coli. Tento vektor má schopnost autonomní replikace v kmenech odvozených od Escherichia coli kmen K12, jako je například kmen JMI09. Tento vektor může být bez potíží zaveden do Escherichia coli známými metodami. Takovýto kmen pak může být zaočkován do kultivačního média, například do LB média, a po nějakou dobu pěstován.

-15 CZ 293582 B6

Promotor trc pak může být aktivován například přidáním izopropyl-fi-galaktopyranosidu (IPTG), který promotor indukuje. Po další kultivaci může být exprimovaný protein z buněk extrahován rozrušením buněk třeba v sonikátoru. Pakliže je potřeba vytvořit protein, který má na N-konci Pro, je vždy vhodné použít jako hostitele Escherichia coli.

Při použití popsaných metod a v případě potřeby i příkladů provedení vynálezu, může být frakce úspěšně transformovaných buněk obsahujících požadovaný polypeptid z kultury izolována známými purifikačními metodami podle fyzikálních a chemických vlastností polypeptidu.

Mezi použitelné metody patří reakce jako precipitace proteinu, ultrafíltrace, různé chromatografíe [jako je molekulové síto (gelová filtrace), adsorpční chromatografíe, chromatografíe na iontoměničích, afínítní chromatografíe a HPLC], dialýza a kombinace těchto metod.

Při určování, zda má exprimovaný protein NIa požadovanou proteázovou aktivitu, se může použít reakce purifíkovaného NIa proteinu se substrátovým proteinem obsahujícím štěpnou sekvenci pro takovouto proteázu. Takovým substrátem může být například produkt exprese genu kódujícího fúzní protein, kterým je mimo jiné protein virového obalu (přirozený substrát pro NIa) společně s jadernou inkluzí b (NIb) [Dougherty, W. G. a kol. (1988), EMBO J. 7: 1281-1287]. Takový fuzní protein může být izolován z virové genomové cDNA a zaveden do expresivního vektoru. Výsledný expresivní vektor je pak zaveden do vhodné hostitelské buňky, kde se pak tvoří daný fúzní protein. Výsledný fúzní protein pak může být separován a purifíkován známými způsoby, jako jsou precipitace proteinů nebo chromatografíe.

Takto separovaný a purifíkovaný substrátový protein pak může reagovat s řečenou proteázou ve vhodném pufrovaném roztoku při vhodné teplotě za vzniku produktu reakce. Odebraný produkt reakce pak může být vystaven elektroforéze a Western blotu při použití protilátek proti proteinu virového obalu, které umožňují rozlišit aktivitu proteázy podle rozdílů v pohyblivosti jednotlivých pruhů. Při této metodě je rovněž možné použít syntetické oligonukleotidy obsahující vhodnou štěpnou sekvenci.

Proteolytická aktivita proteázy tohoto vynálezu může být zjištěna bez purifíkace. Aktivita může být měřena připojením genu proteázy v sekvenci a ve stejném otevřeném čtecím rámci po směru exprese od promotoru, jakým je třeba trc promotor, a proti směru exprese od štěpné sekvence proteázy. Jestliže je proteáza aktivní v produktu exprese, pak bude na Western blotu pozorovatelný pruh s vyšší pohyblivostí než pro pruh s fuzním proteinem.

Získáním pruhu, u kterého bylo pozorováno štěpení, z gelu a analýzou koncové sekvence aminokyselin konvenčními metodami lze potom zjistit, zda byl protein štěpen v požadované peptidové vazbě.

Protein, který se má získat, může být produkován například jako fúzní protein spolu s takovým proteinem, jako je glutathion-S-transferáza, a NIa tohoto vynálezu pak může být použita pro štěpení spojovací sekvence in vitro. Dalším možným způsobem je přímá exprese požadovaného proteinu v hostitelské buňce ve formě fuzního proteinu spolu s řečenou proteázou. Požadovaný protein je tak připravován samoštěpením.

V případě potřeby může být NIa snadno vyráběna s velkými výtěžky a ve vysoké Čistotě použitím výše uvedených metod a takto získaná rekombinantní NIa tohoto vynálezu může pak být použita jako proteáza.

Je-li potřeba chemicky syntetizovat molekuly DNA tohoto vynálezu, pak mohou být připraveny konvenčními metodami, jako je metoda nukleotidtrifosfátů [Hunkapiller, M. a kol. (1984), Nátuře 310: 105-111] nebo metodou chemické syntézy nukleových kyselin [Grantham, R. a kol. (1981), Nucleic Acids Res. 9: r43-r74]. V případě potřeby mohou být provedeny potřebné modifikace těchto nukleotidových sekvencí konvenčními metodami, jako například místně specifickou

-16CZ 293582 B6 mutagenezí při použití primeru obsahujícího syntetický oligonukleotid kódující požadovanou modifikaci [Mark, D. F. a kol. (1984), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 5662-5666],

Hybridizace může být provedena, jak jsme již uvedli, například použitím nukleotidové sondy označené [a-³²P]dCTP v metodě náhodných příměrů [Feinberg, A. P. a Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13] nebo nick translací [Maniatis, T. a kol., „Molecular Cloning - A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.], DNA je fixována na pevnou fázi například adsorpcí na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu a následným zahřátím nebo ozářením ultrafialovým zářením. Pevná fáze se pak klasicky ponoří do prehybridizačního roztoku obsahujícího 6x SSC, 5% Denhardtův roztok a 0,1% SDS a inkubuje se při 55 °C po dobu 4 hodin nebo déle. Předem připravená nukleotidová sonda je pak přidána k prehybridizačnímu roztoku až do specifické aktivity 1 x 10⁶ cpm/ml a směs se inkubuje přes noc při teplotě 60 °C. Poté je pevná fáze pětkrát omyta 6x SSC po pěti minutách při pokojové teplotě. Následuje 20ti minutové promývání při teplotě 57 °C a autoradiografie, která určí, zda daná DNA hybridizovala nebo ne. Toto je specifický případ a jsou možné i další rovnocenné postupy.

Požadovaný protein může být připraven buď štěpením uvnitř buněk, nebo mimo ně.

Metoda přímého štěpení uvnitř buněk

DNA kódující NIa je spojena sDNA kódující požadovaný protein přes štěpnou sekvenci, především Gln-Gly, Gln-Ser nebo Gln-Ala. Výsledná DNA kódující fúzní protein je vložena do vektoru obsahujícího promotor a terminátor. Tento vektor je pak použit pro expresi ve vhodných hostitelských buňkách. Exprimovaný fúzní protein se sám štěpí prostřednictvím proteázové aktivity, čímž poskytuje peptid, ve kterém je k N-konci požadovaného proteinu peptidovou vazbou vázán Gly, Ser nebo Ala. Zvláště vhodným proteinem pro expresi je IL—11.

Tam, kde je potřeba odštěpit od N-konce jakýkoli aminokyselinový zbytek u vzniklého proteinu, může to být provedeno způsobem výše uvedeným při použití například aminopeptidázy P, která ponechává na konci prolinový zbytek, je-li potřeba.

Některé expresivní systémy již obsahují aminopeptidázu P. Avšak není-li aminopeptidáza přítomna a je potřeba štěpit N-koncové aminokyselinové zbytky in šitu, pak může být do hostitelské buňky zaveden expresivní vektor pro aminopeptidázu. Aminopeptidáza P je známý protein a sekvence genu pro tento protein je odborníkům snadno dostupná.

Pokud potřebujeme získat protein, který začíná na N-konci prolinem, pak je obecně výhodné prodloužit kultivaci, abychom poskytli aminopeptidáze P dostatek času k činnosti.

Prolin na N-konci, může být odstraněn katalytickou činností prolin-imunopeptidázy (3.4.11.5) exprimované endogenně nebo exogenním expresivním vektorem (enzym je známým proteinem a sekvence jeho genu je odborníkům snadno přístupná). Prolinový zbytek může být štěpen po získání z expresivního systému, ve kterém je fúzní protein sekretován z buněk.

Tak tento vynález dovoluje výrobu proteinů s libovolným aminokyselinovým zbytkem na jeho N-konci.

Tak, kde je výsledkem tohoto vynálezu polypeptid mající na N-konci Ala, může být tento alaninový zbytek odstraněn katalytickým působením alanin-aminopeptidázy (3.4.11.14), která je opět dobře známým enzymem a sekvence jejího genu je opět odborníkům snadno přístupná. Tato technika rovněž umožňuje výrobu polypeptidu s volně volitelným zbytkem na N-konci.

Takový protein pak může být izolován a purifikován známými metodami.

- 17CZ 293582 B6

Metoda extracelulámího štěpení

NIa může být vytvořena zavedením vhodné DNA do vektoru, který je potom zaveden do vhodného expresivního systému. Výsledná NIa exprimovaná transformovanými buňkami může být pak purifikována ve sloupci s iontoměničem, ve filtrační gelové koloně nebo v koloně s reverzní fází. NIa může být popřípadě exprimována jako fúzní protein s jiným polypeptidem, jako je glutathion-S-transferáza nebo protein vázající maltózu, který může být separován a purifíkován pomocí glutathionové kolony nebo maltózové kolony. Po štěpení purifikovaného produktu enterokinázou nebo faktorem Xa může být NIa purifikována a použita.

Mezitím je připravován prekurzor proteinu obsahující rozpoznávací místo pro NIa (štěpná sekvence). Ta může být přítomná na daném místě nebo může tento protein tvořit část fůzního proteinu, se kterým může být vhodným spojovníkem (štěpnou sekvencí) spojena například glutathion-S-transferáza nebo protein vázající maltózu. Tento prekurzor může být štěpen in vitro v reakci s NIa ve vhodném pufru. V případě potřeby může být zbytek aminokyseliny odstraněn z N-konce výše uvedenými metodami. Výsledný protein může být opět izolován a purifíkován známými metodami.

Pokud jde o druhé provedení tohoto vynálezu, věříme, že přirozeně se vyskytující redukující peptid má sekvenci uvedenou pod číslem ID: 12 a skládá se z 526 aminokyselin svalinem na svém N-konci.

Přirozeně se vyskytující DNA kódující tento peptid má podle našeho názoru sekvenci nukleotidů 70 až 1647 vyznačenou jako sekvence ID: 11.

Peptid tohoto vynálezu má schopnost redukovat oxidovaný glutathion a dichloroindofenol. Takovýto popis tohoto peptidu je sice přesný, avšak poněkud krkolomný, takže peptid tohoto vynálezu bude označován jako peptid nebo protein KM31-7.

Protein KM31-7 má původ v organismu nebo je mutací či variantou takového proteinu, takže přináší minimální problémy s jeho toxicitou a/nebo antigenicitou.

V druhém provedení tohoto vynálezu je za prekurzora proteinu KM31-7 pokládán polypeptid o sekvenci -23 až 526 se sekvenčním číslem ID: 12. Jako takový zahrnuje tento vynález rovněž tento prekurzor a jeho mutace či varianty zároveň se sekvencí polynukleotidů kódující takový prekurzor.

Následující diskuze se týká především druhého provedení tohoto vynálezu. Mnoho postupů popsaných výše v souvislosti s NIa CYW bude pochopitelně použitelných i pro izolaci, klonování a expresi DNA kódující peptid tohoto vynálezu. Většina rozdílností bude dána skutečností, že NIa CYVV je protein rostlinného viru, zatímco peptid tohoto vynálezu je živočišný protein. Dále budou uvedeny základní postupy pro získání exprimovaného specifického polypeptidu z živočišných buněk technikami genetických rekombinaci.

mRNA kódující peptid KM31-7 může být vytvořena známými metodami a reverzní transkripcí převedena na ds-DNA. Jako zdroj původní mRNA mohou být použity jakékoli vhodné živočišné buňky, buněčné linie nebo tkáně, my však dáváme přednost buňkám buněčné linie KM-102 odvozených od lidských buněk kostní dřeně [Harygaya, K. a Handa, H. (1985), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3447-3480].

Pro extrakci mRNA ze savčích buněk mohou být použity různé metody. Ve většině případů se používají metody používající guanidinthiokyanát a horký fenol nebo metoda guanidinthiokyanátkyseliny chlorovodíkové, ale obecně je nejvíce používána metoda používající guanidinthiokyanát a chlorid česný.

-18CZ 293582 B6

Vzhledem k tomu, že většina mRNA přítomné v cytoplazmě eukaryotických buněk má na 3'konci sekvenci polyA, může být purifíkace savčí mRNA provedena adsorpcí na v koloně celulózy obsahující oligo(dT), čímž se využije tato vlastnost mRNA. Eluovaná mRNA může být dále frakcionována takovými metodami, jako je centrifugace v sacharózové hustotním gradientu.

Kontrola, zda taková mRNA skutečně kóduje požadovaný peptid, může být provedena translací této mRNA ve vhodném systému, jakým je například oocyt Xenopus laevis, králičí retikulocyty nebo pšeničné klíčky (supra).

Měření redukující aktivity exprimovaného produktu může být provedeno následujícím způsobem.

i) Stanovení aktivity redukující dichlorindofenol

Metodika tohoto stanovení byla popsána Beinertem, H. v „Methods in Enzymology“ (1962), 5, 546.

Příprava 50 μΜ dichlorindofenolu (Sigma) je naředěn 20mM fosfátovým pufrem a 0,5 M NaCl (pH 7,8). Do kyvety (SARSTEDT, 10 x 4 x 45 mm) se napipetuje 1 ml tohoto roztoku a přidá se vzorek na měření. Do kyvety se při pokojové teplotě přidá 15 μΐ 1 mM NADPH (BoeringerMannheim) ředěný stejným pufrem pro započetí reakce. Aktivita reduktázy pak může být stanovena absorpcí oxidovaného dichloroindofenolu při 600 mm nebo stanovením poklesu absorpce NADPH při 340 nm.

ii) Stanovení aktivity redukující oxidovaný glutathion

Metodika tohoto stanovení byla popsána Nakajimou, T. a kol. v „New Basic Esperimental Methods in Biochemistiy (6) - Assay Methods Using Biologicai Activity“, 3-34.

mM oxidovaný glutathion (Boehring-Manngeim) se připraví s 20 mM fosfátovým pufrem a 0,5 M NaCl do pH 7,8. Vzorek reduktázy se napipetuje do kyvety (10x4x4 mm), kam se dále přenese 15 μΐ tohoto roztoku. Pro spuštění reakce se do kyvety dále při pokojové teplotě přidá 15 μΐ 1 mM NADPH připraveného ve stejném pufru. Redukční aktivita reduktázy pak může být stanovena následným poklesem absorpce při 340 nm.

Pro odvození ds-DNA od mRNA mohou být použity různé výše uvedené metody. Mezi tyto metody patří metoda používající nukleázu Sl, Landova metoda a metoda O. Joon Yooa (supra), my však v tomto případě dáváme přednost metodě Okayama-Berga [Okayama, H. a Berg. P. (1982), Mol. Cell. Biol. 2, 161-170].

Takto získaná ds-cDNA pak může být zavedena do klonovacího vektoru a výsledný rekombinantní plazmid pak může být vnesen výše uvedenými způsoby do Escherichia coli.

Kmen obsahující požadovanou DNA kódující daný peptid tohoto vynálezu může být selektován různými způsoby, které se shodují s postupy popsanými v souvislosti s výběrem transformantů obsahujících NIa DNA a které mohou být potřebným způsobem přizpůsobí momentálním potřebám. Například, je-li pro přípravu nukleotidové sondy použita PCR, pak vhodnou templátovou DNA je buď výše popsaná cDNA, nebo genomová DNA.

Ve druhém provedení tohoto vynálezu je možné použít primární screening, aby se snížil počet transformovaných kmenů, které se budou muset testovat. Primární screening je možný z toho důvodu, že peptid tohoto vynálezu je příbuzný s cytokiny, takže jeho mRNA obsahuje AUUUA motiv společný pro mRNA cytokinů [Shaw, G. a Kamen, R. (1986), Cell 46: 659-667]. Proto může být pro primární screening použita syntetická oligonukleotidová sonda, která je komplementární k motivu AUUUA. Potom může být proveden test na produkci exogenního proteinu v savčích buňkách.

-19CZ 293582 B6

DNA kódující daný peptid může být potom z vektoru vystřižena a sekvenována způsobem podobným jako pro situaci popsanou v souvislosti s NIa DNA. Fragment DNA může být pak opět zaveden do vhodného vektoru a použit pro transformaci prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk podle potřeby.

Protein KM31-7 může být použit buď samostatně, nebo v kombinaci s jedním nebo více léčebnými přípravky jako prevence léčby stavů způsobených nebo majících souvislost s oxidativním stresem či jakoukoli další nemocí způsobenou aktivovaným kyslíkem. Takové stavy zahrnují, avšak nejsou omezeny pouze na, arteriosklerózu, diabetes, ischemické poruchy (jako poruchy při reperfúzi, ischemická choroba srdeční, cerebroischemie a ischemická enteritis), edémy, vaskulámí hyperpermeability, záněty, poruchy žaludeční mukózy, akutní pankreatitidu, Crohnova nemoc, vředovou kolitidu, poruchy jater, Paraquatovu nemoc, rozedmu plic, chemokarcinogenezi, karcinogenní metastázy, DIC, katary, předčasnou retinopatii, autoimunitní onemocnění, porfyremii, hemolytická onemocnění, středozemní anemii, Parkinsonovu nemoc, Alzheimerovu nemoc, epilepsii, poruchy způsobené ultrafialovým zářením, poruchy způsobené radioaktivitou, omrzliny a popáleniny.

Léčebná směs druhého provedení tohoto vynálezu obsahuje farmakologicky aktivní množství peptidu KM31-7 a jeho přijatelný nosič.

Léčebná směs druhého provedení tohoto vynálezu může být aplikována v různé formě. Orální aplikace může být provedena ve formě tablet, kapslí, granulí, prášku nebo sirupu. Parenterální aplikace zahrnuje injekce, infuze a čípky. Odborníkům budou jistě známy další vhodné způsoby aplikace.

V případě, že peptid tohoto vynálezu má být aplikován injekcí nebo infuzí, pak je potřeba připravit apyrogenní přípravek peptidu v lékařsky přijatelném vodném roztoku vhodném pro parenterální aplikaci. Příprava roztoku polypeptidu tak, aby vyhovoval požadavkům na pH, izotonicitu a stabilitu, bude předmět technické expertizy odborníků v tomto oboru.

Dávkování a forma aplikace může odborníky snadno stanovena s přihlédnutím na stav pacienta, tělesnou hmotnost, pohlaví, věk, dietu, závažnost dalších infekcí, čas podání a dalších klinicky důležitých faktorů. Normální dospělá orální dávka se bude pohybovat v rozmezí od 0,01 mg do 1000 mg denně. Toto množství může být podáno v jediné dávce nebo jako několik dávek v rozmezí 24 hodin. Při parenterálním podání tohoto peptidu může být podáno v jedné podkožní, nitrosvalové nebo nitrožilní injekci 0,01 mg až 100 mg.

Pro celkovou charakterizaci proteinu KM31-7 bylo důležité získat specifické protilátky na tento protein. Takové protilátky jsou užitečné při stanovení funkcí proteinu KM31-7, jeho množství, čistotu a distribuci v tkáních.

Proto byly získány hybridomy produkující anti KM31-7 protilátky technickou očkování laboratorních zvířat polypeptidem vyprodukovaným E. coli transformovanými pMAL31-7, přípravou hybridomů produkujících protilátky společně s myelomovými buňkami, screeningem a klonováním takových hybridomů. Protilátky produkované výslednými hybridomy měly schopnost rozpoznat polypeptid získaný zbezsérového supematantu kultury COS-1 buněk transformovaných pSRa31 -7.

Tak tento vynález rovněž popisuje protilátky, především monoklonální, nebo jejich ekvivalenty, které specificky rozpoznávají protein KM31-7 nebo jeho mutaci či variantu.

Protilátky popsané v tomto vynálezu jsou zaměřeny proti proteinu KM31-7, jeho mutaci nebo variantě. Je vhodné, aby tyto protilátky byly polyklonální nebo monoklonální, přičemž lepší jsou monoklonální, protože polyklonální protilátky jsou většinou spojeny s nespecifičností. Pro

-20CZ 293582 B6 jednotnost výsledků ať již při terapii nebo při purifíkaci proteinu KM31-7 jsou vhodnější monoklonální protilátky.

Protilátky pro účely tohoto vynálezu mohou být připraveny z kteréhokoli živočicha. U protilátek vytvořených u jiných organismů než lidských však mohou nastat problémy s antigenicitou. Proto je lépe vytvořit protilátky, které co nejvíce připomínají lidské protilátky, čehož může být dosaženo buď chemickými, nebo genetickými úpravami odborníkům dostatečně známými.

Tento vynález rovněž předpokládá anti-idiotypové protilátky, tj. protilátky jejichž rozpoznávací místo rozpoznává vazebná místa výše uvedených protilátek. Takovéto protilátky lze získat aplikací původních protilátek vhodným zvířatům. Je pochopitelné, že tento proces může účinně pokračovat bez zastavení, přičemž každá odpovídající generace protilátek bude buď původní, nebo anti-idiotypová. Avšak pokud se nebude provádět selekce protilátek na správné rozpoznávací místo po každé generaci, může se specifita takových protilátek postupně vytratit. Antiidiotypové protilátky mohou být užitečné na příklad při testu volných protilátek proti KM31-7.

Tento vynález zároveň předpokládá tvorbu fragmentů protilátek tohoto vynálezu, které mají schopnost rozpoznávat protein KM31-7 a molekul nesoucích vazebná místa pro takové protilátky. Takové fragmenty a molekuly jsou v tomto textu označovány jako „ekvivalenty“ protilátek tohoto vynálezu.

Pro transformaci E. coli byl použit plazmid pMAL31-7. Produkt exprese byl purifikován a použit k imunizaci laboratorních zvířat. Slezinné buňky očkovaných zvířat byly použity pro přípravu hybridomů fúzí s myelomovými buňkami, ze které byly získány klony produkující anti-KM31-7 monoklonální protilátky ve vysokém množství a o dobré stabilitě (tento klon byl pojmenován MKM150-2 a uložen v Fermentation Research Instituts of the Agency of Industrial Science and Technology, Japonsko, pod registračním číslem FERM BP-5086). Kultura tohoto klonu poskytuje ze svého supematantu anti-KM31-7 monoklonální protilátky.

Výsledné anti-KM31-7 monoklonální protilátky reagují imunochemicky sfuzním proteinem získaným zavedením expresivního vektoru pMAL31-7 do E. coli. Tyto protilátky zároveň imunochemicky reagují s proteinem KM31-7 získaným ze supematantu kultury savčích buněk transformovaných cDNA kódující KM31-7.

Při přípravě monoklonálních protilátek je nutné dodržovat dále uvedené postupy, které se skládají z:

(a) purifikace biopolymeru, který má být použit jako antigen, (b) imunizace myší injekcemi antigenu a ve vhodné chvíli přípravy buněk produkujících protilátky ze sleziny pomocí krevních vzorků a jejich testů, (c) přípravy myolomových buněk, (d) fuze slezinných a myelomových buněk, (e) selekce skupin hybridomů produkujících požadované protilátky, (f) přípravy jednotlivých klonů, (g) velkoobjemové kultivace hybridomů pro přípravu monoklonálních protilátek nebo podle potřeby pěstování myší infikovaných hybridomy, (h) testování fyziologické aktivity nebo vlastností výsledné monoklonální protilátky označením reaktantu.

-21 CZ 293582 B6

Dále bude popsána příprava monoklonálních protilátek anti-KM31-7 s odkazem na výše uvedené metody. Je zřejmé, že není nutné přesně dodržovat následující popisy a že je možné použít jakoukoli vhodnou metodu. Pro přípravu protilátek je například možné použít jiné buňky než slezinné a myelomové stejně tak, jako je možné použít slezinné nebo myelomové buňky jiných živočichů. Následující postup představuje v současné době nej používanější metodu přípravy monoklonálních protilátek anti-KM31-7.

(a) Purifíkace antigenu

Fúzní protein získaný expresí pMAL31-7 v£. coli a jeho purifikací je účinným antigenem. Kultura E. coli TB-1 transformovaná pMAL31-7 byla indukována izopropyl-|3-d-thiogalaktopyranosidem (IPTG). Exprimovaný fúzní protein byl purifíkován afinitní chromatografii s použitím kolony samylózou (New England BioLabs). Protein KM31-7 purifikovaný zbezsérového supematantu kultury COS-1 buněk transformovaných pSRa31-7 je rovněž účinným antigenem.

(b) Příprava buněk produkujících protilátky

Purifikovaný fuzní protein získaný podle bodu (a) je smíchán s kompletním nebo nekompletním Freundovým adjuvans nebo s látkou jakou je potaš a výslednou vakcínou jsou imunizována laboratorní zvířata. Nejpoužívanějšími laboratorními zvířaty jsou myši BALB/c, protože většina použitelných myelomů získaných z myší byla odvozena právě od kmene BALB/c a navíc byl tento kmen myší dopodrobna prostudován. Další výhodou případu, kdy jsou myelomy i buňky produkující protilátky získány z BALB/c myší, je, že takto získané hybridomy mohou být pěstovány v břišní dutině myší BALB/c. Tím poskytuje použití myší kmene BALB/c výhody představované snadným získáním monoklonálních protilátek z ascitu bez nutnosti využívat složité postupy. Tento vynález se nicméně neomezuje pouze na použití myší BALB/c.

Antigen může být aplikován v jakékoli vhodné formě jakou je třeba podkožní injekce, intraperitonální injekce, nitrožilní, nitrosvalové injekce nebo nitrokožní injekce. My dáváme přednost podkožním nebo intraperitonálním injekcím.

Imunizace může být provedena jednou nebo při více příležitostech ve vhodných intervalech. Nejvhodnějším režimem je očkování a následné přeočkování jednou nebo víckrát v intervalech od 1 do 5 týdnů. Účinnost tohoto postupu může být zvýšena, je-li pravidelně testován titr řečeného antigenu v séru imunizovaných zvířat a zvířata s dostatečně vysokým titrem protilátek jsou pak použita pro získání buněk produkujících protilátky. Buňky produkující protilátky pro následnou fúzi jsou ze zvířat izolovány převážně 3 až 5 dnů po očkování.

Metody testování titru protilátek zahrnují například různé známé techniky, jako je RIA (radioizotopová imunoassay), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), techniky fluorescentních protilátek a pasivní hemaglutinace, ale nejvýhodnějšími technikami pro svojí citlivost, rychlost, přesnost a možnost automatizace jsou RIA a ELISA.

Uvádíme popis vhodného ELISA testu. Antigen se adsorbuje na pevnou fázi. Povrch pevné fáze je pak vysycen proteinem nepříbuzným s daným antigenem, jako například hovězí sérumalbumin (BSA), aby se blokovaly veškeré povrchové oblasti, na kterých není adsorbován antigen. Pevná fáze je pak omyta a vystavena postupně ředěnému vzorku primární protilátky (např. myšímu séru). Veškeré anti-KM-7 protilátky ve vzorku se vážou s antigenem. Po omytí jsou přidány anti-myší protilátky ve vazbě s enzymem, aby se mohly navázat na vázané myší protilátky. Po omytí je přidán substrát enzymu a titr protilátek pak může být spočítán měřením takových parametrů, jako je změna barvy způsobená rozkladem substrátu.

-22CZ 293582 B6 (c) Příprava myelomových buněk

Jako zdroj myolomových buněk jsou především používány zavedené linie myších buněk. Vhodnými příklady takovýchto linií jsou třeba myelomové buněčné linie P3-X63 Ag8-Ul (P3-U1) odvozené původně od myší BALB/c rezistentních na 8-azaguanin [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], P3-NSI/l-Ag4.1 (NS-1) [European J. Immunology, 6: 511-519 (1976)], SP2/0-Agl4 (SP-2) [Nátuře, 276: 269-270 (1978)], P3-X63Ag8.653 (653) [J. Immunology, 123: 1548-1550 (1979)] a P3-X63-AG8 (X63) [Nátuře 256, 495-497 (1975)]. Tyto buněčné linie mohou být kultivovány ve vhodném médiu, jakým je například 8-azaguaninové médium (médium RPMI-1640 obsahující 8-azaguanin, 1,5 mM glutamin, 5x10'⁵ M 2-merkaptoethanol, 10 pg/ml gentamycin a 10 % fetální telecí sérum), médium IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium nebo médium DMEM (Dulbecco's Modifíed Eagle's Medium. Počet buněk se ke dni fúze zvýší na nejméně 2 x 10⁷ předkultivací v běžném médiu známém jako kompletní GIT [5,5 ml MEM roztoku neesenciálních aminokyselin (NEAA, Gibco), 27,5 ml NCTC109 (Gibco), 6 ml roztoku penicilin-streptomycin (Sigma) a 11 ml 200 mM roztoku glutaminu (Sigma) v 500 ml média GIT (Wako Pure Chemical Industry)] 3 až 4 dny před fúzí buněk.

(d) Fůze buněk

Buňky produkující protilátky jsou plazmatické buňky a jejich prekurzory jsou lymfocyty. Mohou být získány z vhodných míst jednotlivých zvířat, jako je slezina, lymfatické uzliny, periferní krev nebo z jakékoli vhodné kombinace těchto orgánů. Nejpoužívanějšími jsou však slezinné buňky.

Buňky produkující protilátky jsou sklizeny 3 až 5 dnů po poslední imunizaci od myší, které mají alespoň zde popsaný titr. Výsledné buňky produkující protilátky jsou pak fúzovány s myelomovými buňkami získanými podle c). V současnosti je nejvíce používán postup fúze slezinných buněk s myelomovými buňkami při použití ethylenglykolu vzhledem k nízké hladině buněčné toxicity a snadné manipulaci s těmito složkami. Tento postup se provádí následujícím způsobem:

slezinné buňky a myolomové buňky se důkladně promyjí médiem nebo fyziologickým roztokem tlumeným fosfátem (PBS) a smíchají tak, aby se poměr mezi slezinnými buňkami a myolomovými buňkami pohyboval přibližně mezi 5 až 10:1. Pak se tato směs centrifuguje. Odstraní se supematant a shluk buněk se rozruší a za stálého míchání se přidá roztok polyethylenglykolu (PEG, molekulová hmotnost od 1000 do 4000). Po několika minutách se buňky opět centrifugují. Supematant se opět odstraní a usazené buňky jsou resuspendovány ve vhodném množství kompletního GIT obsahujícího 5 až 10 ng/ml myšího IL-6 a poté jsou přeneseny do komůrek kultivační destičky. Jakmile se potvrdí růst buněk v každé komůrce, je médium nahrazeno HAT médiem (kompletní GIT obsahující od 5 do 10 ng/ml myšího IL-6, ΠΓ⁶ až 10~³M hypoxantin, 10’⁸ až 10~⁷M aminopterin a ΠΓ⁶ až ÍO^M thymidin).

(e) Selekce skupin hybridomů

Kultivační destička je inkubována v inkubátoru s CO₂ atmosférou při 30 až 40 °C po dobu 10 až 14 dnů. Během této doby se přidává každý 1. až 3. den čerstvé HAT médium v množství odpovídajícím polovině původního objemu.

Myelomové buňky pocházejí z buněčné linie rezistentní na 8-azaguanin a jak myolomové buňky, tak hybridomy složené pouze z myelomových buněk nemohou přežívat v médiu HAT. Avšak hybridomy obsahující část buněk produkujících protilátky a hybridomy složené z myolomových buněk a buněk produkujících protilátky mohou v tomto médiu přežít. Hybridomy složené pouze z buněk produkujících protilátky nejsou schopny života, takže potřebné hybridomy obsahující buňky produkující protilátky a myelomové buňky mohou být tímto způsobem snadno selektovány.

-23 CZ 293582 B6

HAT médium je nahrazeno HT médiem (ve kterém je vynechán aminopterin) v těch komůrkách, ve kterých byl pozorován růst kolonií. Část supematantu z kultury je odebrána a testována na přítomnost protilátek anti-KM31-7 například pomocí ELISA testů.

Výše uvedený postup používá buňky z buněčné linie rezistentní na 8-azaguanin, avšak mohou být použity i jiné buněčné linie za předpokladu, že umožňují selekci hybridomů. Složení média se v těchto případech samozřejmě rovněž změní.

(f) Klonování

Hybridomy podle (e), u kterých byla stanovena produkce specifických protilátek anti-KM31-7, jsou přeneseny na novou kultivační destičku. Mohou být použity různé klonovací metody, jak je vysetí, (kde jsou hybridomy podrobeny analýze omezeného ředění, tak, aby každá komůrka obsahovala pouze jeden hybridom), metoda měkkého agaru, (kde jsou vyseté kolonie přeneseny do měkkého agarového média), vysévací metoda, (kde jsou jednotlivé buňky přemístěny pomocí mikromanipulátoru), a třídicí klonovací metoda, (ve které jsou jednotlivé buňky oddělovány buněčným třídičem). Analýza omezeného ředění se vzhledem ke své jednoduchosti používá nej častěji.

Klonování pomocí omezeného ředění se opakuje 2x až 4x u těch komůrek, ve kterých je opakovaně pozorován titr protilátek. Klon soustavně vykazující tvorbu protilátek anti-KM31-7 je pak vybrán jako ten pravý hybridom.

(g) Příprava monoklonálních protilátek kulturou hybridomů

Hybridom vybraný podle (f) je pak kultivován v běžném médiu. Velkoobjemová kultivace se pak provádí pomocí rotace kultury buď ve velkoobjemových lahvích, nebo v míchačce. Anti-KM317 monoklonální protilátky se mohou získat ze supematantu z kultury gelovou filtrací a pak sebráním a purifikací frakce IgG. Hybridomy mohou být navíc pěstovány v břišní dutině stejného kmene myší (např. výše uvedené myši BALB/c) nebo například myší Nu/Nu. Jednoduchou metodou přípravy monoklonálních protilátek je použití soupravy na přípravu monoklonálních protilátek (např. MAbTrap GII z Pharmacia).

(h) Určení monoklonální protilátky

Určení izotypu a podtřídy monoklonální protilátky získané podle (g) může být provedeno následujícím způsobem. Příklady určování monoklonálních protilátek zahrnují Ouchterlonyho metodu, ELISA test a RIA test. Ačkoli je Ouchterlonyho metoda velice jednoduchá, má jednu nevýhodu, a tou je nutnost zahuštění monoklonální protilátky v případě její příliš nízké koncentrace.

Ať už je použit test ELISA nebo RIA, může být v obou případech supematant přímo vystaven pevné fázi, na kterou byl adsorbován antigen. Při určování typu podtřídy protilátky mohou být použity sekundární protilátky specifické pro každý typ podtříd IgG. Může se rovněž použít souprava izotypů (například izotypová souprava myších monoklonálních protilátek od firmy Amersham). Kvantifikace proteinu může být provedena metodou Folin-Lowryho nebo měřením absorbance při 280 nm [1,4 (OD₂₈₀) = 1 mg/ml imunoglobulinu].

V následujících případech byla monoklonální protilátka získaná z hybridomů označených MKM150-2 definována jako izotyp třídy IgG a jako příslušník podtřídy IgGl.

Monoklonální protilátka získaná podle tohoto vynálezu má vysokou specifitu pro protein KM317. Tuto monoklonální protilátku lze navíc získávat dlouhodobě a ve vhodném množství pomocí kultivace výše zmíněných hybridomů. Tato monoklonální protilátka může být použita pro izolaci a purifikaci proteinu KM31-7 a tato izolace a purifikace proteinu KM31-7 řečenou

-24CZ 293582 B6 monoklonální protilátkou pomocí imunoprecipitace s použitím reakce antigen-protilátka tvoří součást tohoto vynálezu.

Tento vynález bude dále doplněn podle doprovodných, ne však jediných, příkladů. Veškeré roztoky jsou vodné, připravené z deionizované vody a tam, kde jsou uvedena jejich %, se jedná o objemová procenta, pokud není uvedeno jinak. Pokud nejsou metody určeny jinak, jedná se o metody, které lze nalézt v „Molecular Cloning - A Laboratory Manual“ [druhé vydání, Sambrook, J., Fritsch, E. F. aManiatis, T. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Metody přípravy roztoků a ostatních médií, které nejsou specifikovány přímo u jednotlivých příkladů, jsou uvedeny v další části tohoto textu pod hlavičkou „Použité chemikálie a roztoky“.

A) Zdrojový materiál pro CYVV

List, který byl infikován virem CYVV a který byl uchováván ve zmrzlém stavu [CYW-izolát č. 30: Uyeda, I. a kol. (1975), Ann. Phytopath. Soc. Japan 41: 192 - 203] byl rozdrcen v desetinásobném objemu inokulačního pufru.

Namnožení viru bylo provedeno s použitím Vicia faba kultivaru Wase-Soramame, který vytvořil druhý dospělý list. Dospělý list byl přestříkán karborundem (síťovina 400) a pak inokulován získanou tekutinou pomocí skleněné špachtle. Přibližně osm až deset dnů od inokulace se u listu vyvinula síťovitá mozaika. Tento list byl odstraněn a použit jako zdroj CYVV viru.

B) Purifikace viru

Listy izolované podle A) byly rozsekány v řezačce obsahující trojnásobný objem extrakčního pufru. Po rozsekání byly listy dále rozmělněny ve třecí misce. Výsledný přípravek byl pomalu míchán při pokojové teplotě po dobu jedné hodiny s použitím motorové míchačky s nerezovým míchadlem. Tekutý přípravek byl poté protlačen dvojitou gázou.

Všechny následující postupy byly prováděny při teplotě 4 °C.

Surová tekutina byla smíchána s polovičním objemem chloroformu a směs byla míchána v míchačce Waring. Pak byl přípravek centrifugován po dobu 15 minut při 6000 x g. Po centrifugaci byla odebrána tekutá vrstva a byl k ní přidán polyethylenglykol (PEG # 6000) ke konečné koncentraci 4 % (váhová %).

Výsledná směs byla míchána na ledě po dobu jedné hodiny a pak byla ponechána na ledě další hodinu. Takto získaná tekutina byla pak centrifugována při 6000 x g po dobu 15 minut a byl odebrán precipitát jako frakce obsahující virus. Tento precipitát byl resuspendován v 50 ml 10 mM fosfátového pufru (pH 7,4) obsahujícího 0,5 M močovinu a pak smíchán se stejným objemem tetrachlormethanu. Výsledný přípravek byl prudce míchán po dobu 5 minut, po které byl přípravek centrifugován v 3000 x g po dobu 10 minut. Vodná fáze byla pak centrifugována v ultracentrifuze při 4 °C, 30 000 ot/min po dobu 90 minut v rotoru Hitachi RP-30. Vzniklá peleta byla odebrána jako frakce obsahující virus.

Peleta byla resuspendována v 10 mM fosfátovém pufru obsahujícím 1% Triton XI00 (pH 7,4) a tato suspenze byla centrifugována při 4 °C, 8000 x g, po dobu jedné minuty. Vzniklý supematant byl navrstven do zkumavky se vzrůstajícím hustotním gradientem sacharózy 10 až 40 % (40 %: 10 ml, 30 %: 10 ml, 20 %: 10 ml, 10 %: 10 ml - tato kolona byla ponechána přes noc při teplotě 4 °C), která byla předem připravena s lOmM fosfátovým pufrem (pH 7,4). Jakmile byla zkumavka navrstvena, byla centrifugována v ultracentrifuze při teplotě 4 °C, 23 000 ot/min a po dobu 120 minut v rotoru Hitachi PRS25.

Po centrifugaci byla trubice se sacharózovým hustotním gradientem frakcionována pomocí frakcionátoru (model UA-2: výroba ISCO Co.) vybaveného detektorem pro OD₂₆₀ nm. Frakce,

-25CZ 293582 B6 které měly hustotu sacharózy asi 20 až 30 % a adsorbovaly při OD₂6o nm byly brány jako frakce obsahující virus.

Odebraná frakce s virem byla ředěna dvojnásobným objemem 10 mM fosFátového pufru (pH 7,4) a centrifugována v teplotě 4 °C, 40 000 ot/min a po dobu 90 minut v rotoru Hitachi RP-65. Výsledný precipitát byl resuspendován v 10 mM fosfátovém pufru (pH 7,4), čímž se získal roztok čistého viru.

C) Izolace virové RNA

Genomová RNA viru CYW obsahuje kolem 10 000 bází a je na svém 3'-konci polyadenylována. Kombinace délky a polyadenylace způsobuje, že je při použití konvenčních metod jako je metoda fenol/dodecyl sulfátu sodného nebo metoda guanidinthiokyanátu obtížné extrahovat celou RNA bez ztrát. Proto byla virová genomá RNA připravena alkalickou metodou centrifugace v hustotním gradientu sacharózy.

500 μΐ virového roztoku (u kterého bylo spočítáno, že obsahuje 2 mg viru podle výpočtu, že 1 mg/ml viru má optickou densitu při 260 nm o hodnotě 2,5) bylo přidáno k degradačnímu roztoku a směs byla ponechána v klidu 20 minut při laboratorní teplotě. Poté byla směs navrstvena do zkumavky obsahující sacharózový hustotní gradient od 0 % do 33,4 % (33,4 %: 1,4 ml, 30,4 %: 7,6 ml, 27 %: 7,0 ml, 23 %: 6,3 ml, 18,7 %: 5 ml, 12 %: 3,2 ml, 0 %: 2,7 ml, přičemž sloupec sacharózového hustotního gradientu byl ponechán přes noc v teplotě 4 °C), který byl připraven s 1 x SSC. Použitý pufr byl rovněž lx SSC a navrstvená zkumavka byla poté centrifugována v ultracentrifuze v rotoru Hitachi RPS-27 při teplotě 15 °C, 24 000 ot/min a po dobu 9 hodin. Po této době bylo dno trubice propíchnuto, aby se mohl frakcionovat sacharózový hustotní gradient. Frakce virové genomové RNA byla určena měřením a absorbance každé frakce při 260 nm. Virová genomová RNA sedimentovala v sacharóze o hustotě kolem 20 až 30 %. Bylo vytěženo kolem 25 pg genomové RNA.

D) Syntéza virové cDNA cDNA byla syntetizována s použitím genomové RNA jako templátu připraveného podle postupu uvedeného v C). Syntéza cDNA byla provedena pomocí zařízení cDNA Synthesis Systém Plus (výrobce Amersham). Výsledná cDNA byla purifíkována na koloně Sephadexu G50 (ochranná známka, výroba Pharmacia) a k 5'-konci purifikované cDNA byl pomocí dCTP a terminální deoxynukleotid transferázy (výroba společností Bethesda Research Laboratories) přidán řetězec póly C. Příprava plazmidu pBR322 (výroba Bethesda Research Laboratories) byla provedena štěpením plazmidu restrikčním enzymem Pstl a následným přidáním 3'póly G řetězce na oba konce. K tomuto přípravku byla pak přidána cDNA a směs byla inkubována po dobu 5 minut při teplotě 65 °C. Po této době byla směs dále inkubována při 57 °C po dobu 2 hodin. Konečná směs byla postupně ochlazována, aby se póly C řetězec cDNA mohl hybridizovat s póly G řetězcem plazmidu.

E) Transformace

Kmen Escherichia coli HB 101 byl transformován plazmidem připraveným podle D) výše s použitím metody chloridu vápenatého. Kultura kmene E. coli HB 101 pro vysetí byla připravena třepáním přes noc v tekutém LB médiu. Z této kultury bylo odebráno 0,5 ml jako inokulum do 50 ml čerstvého tekutého LB média a toto inokulum bylo třepáno při 37 °C, dokud nebyla dosažena optická densita odpovídající při 550 nm hodnotě 0,5. Buňky bakterií byly z kultury odebrány centrifugací při teplotě 4 °C, 5000 x g, po dobu 5 minut. Vzniklá peleta byla opatrně resuspendována v 25 ml pufru s Tris-Ca a ponechána na ledu 5 minut. Výsledná suspenze byla opět centrifugována při 4 000 x g 4 minuty a peleta byla resuspendována v 5 ml pufru s Tris-Ca a opět ponechána na ledu po 2 hodiny, aby se získaly kompetentní buňky.

-26CZ 293582 B6

100 μΐ nového plazmidu získaného postupem D) bylo přidáno k 200 μΐ kompetentních buněk získaných podle předchozího postupu a směs byla ponechána na ledu po dobu 30 minut. Po této době byla směs inkubována při 42 °C 2 minuty a pak byl přidán 1 ml tekutého LB média. Výsledná kultura byla pěstována za stálého třepání při teplotě 37 °C další hodinu. Tato směs pak byla vyseta na pevné LB médium obsahující 12,5 pg/ml tetracyklinhydrochlorid a 1,5% agar. Buňky byly kultivovány přes noc při teplotě 37 °C, aby vznikla knihovna klonů cDNA.

F) Příprava a selekce plazmidu pNS51

Knihovna cDNA rekombinantního plazmidu byla analyzována pomocí metody alkalického SDS. Uvádíme zde podrobnější popis této metody.

ml tekutého LB média byly inokulovány kolonií bakterií rezistentních na tetracyklin avšak citlivých na ampicilin. Tato kolonie byla získána z kultury na pevném LB médiu podle postupu E). Výsledná suspenze byla pěstována přes noc při teplotě 37 °C a za stálého míchání. Buňky byly získány centrifugací v 10 000 x g a resuspendovány v 70 ml lyzačního pufru obsahujícího dalších 16 μΐ roztoku lysozymu (10 mg/ml). Po pětivteřinovém třepání, během kterého se vytvořila suspenze, byla směs ponechána 5 minut při laboratorní teplotě. Po této době bylo přidáno 160 ml roztoku alkalického SDS a výsledná směs byla nejdříve promíchána několikerým převrácením nádoby, a pak byla ponechána na ledu 5 minut. Dále bylo ke směsi přidáno 120 ml 5 M octanu draselného a směs byla opět ponechána na ledu dalších 5 minut. Po této době byla směs centrifugována při 10 000 x g 5 minut při teplotě 4 °C.

Po centrifugací byl supematant přenesen do čisté nádoby a bylo k němu přidáno 250 ml izopropanolu a výsledná směs byla ponechána na ledu 30 minut. Po této době byla směs opět centrifugována při 10 000 x g po dobu 5 minut a usazená peleta byla rozpuštěna v 100 μΐ TE pufru [10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 8,0)]. Poté byla provedena extrakce fenolem přidáním stejného množství fenol/chloroform/izoamylalkoholu (25:24:1) k výsledné směsi za prudkého míchání. Směs byla centrifugována při 10 000 x g po dobu 5 minut při teplotě 4 °C (v tomto textu je tento postup označována jako fenolová extrakce).

100 μΐ vodní vrstvy získané centrifugací bylo smícháno s 10 μΐ 3 M octanu sodného (pH 5,2) a 250 μΐ ethanolu a vzniklá směs byla ponechána na suchém ledu 10 minut, aby vyschla. Frakce nukleové kyseliny byla získána centrifugací při lOOOxg po dobu 5 minut (tento postup je při použití stejných objemů supematantu, ethanolu a roztoku octanu sodného označován v tomto textu jako ethanolová precipitace).

Získaná peleta byla resuspendována v 50 μΐ roztoku RNázy A (10 mg/ml vTE pufru) a pak inkubována 1 hodinu při 37 °C. Po této době bylo k inkubované suspenzi přidáno 30 ml roztoku polyethylenglykolu (2,5 M chlorid sodný, 20% polyethylenglykol # 8000) a směs byla ponechána na ledu 1 hodinu. Pak byla směs centrifugována při 10 000 x g 5 minut při teplotě 4 °C, aby se oddělila frakce DNA jako peleta. Poté byla ještě dvakrát provedena ethanolová precipitace pro získání čisté plazmidové DNA.

Purifikovaná plazmidová DNA byla štěpena restrikčním enzymem Pstl a podrobena elektroforéze v 1% agarózovém gelu s použitím roztoku TBE. Po elektroforéze byl gel použit pro hybridizaci Southem blotem [Southem, E. M. (1975), J. Mol. Biol. 89: 503-517]. Přesněji byl gel třepán v denaturačním roztoku 40 minut, pak přenesen do neutralizačního pufru, kde byl třepán 2 hodiny.

Po třepání byl gel přenesen na polyurethan-esterovou houbu obsahující 20x SSC, aby se DNA převedla na membránu Hybond-N (obchodní značka Amersham) umístěnou na houbě. Poté byla DNA ponechána, aby se přemístila na Hybond-N membránu, membrána byla třepána v lx SSC 10 minut a pak vysoušena při 80 °C po dobu jedné hodiny, aby se DNA fixovala na membránu.

-27CZ 293582 B6

Pak byla membrána ponořena do prehybridizačního roztoku [5 ml formamidu, 1 ml 50x Denhardtova roztoku, 2,5 ml 20x SSC, 100 ml kvasničné tRNA (50 mg/ml), 100 ml 10% SDS a 1,3 ml redestilované vody] a inkubována 3 hodiny při 50 °C.

Virová genomová RNA, která byla štěpena Mg²⁺, byla použita jako nukleotidové sonda. Přesněji, 4 μΐ 5x denaturačního pufru bylo přidáno k 16 μΐ roztoku získaného podle postupu C) obsahujícího 1 pg virové RNA a směs byla inkubována 3 hodiny při 37 °C. 5 μΐ roztoku denaturované RNA obsahujícího 100 ng RNA (založeno na výpočtu, že lmg/ml RNA má OD₂₆₀ 20) bylo získáno ethanolovou precipítací, po které následovalo zahřátí na 70 °C po dobu 5 minut a následné zchlazení na ledu.

K roztoku denaturované RNA byly přidány 4 μΐ 5x značkovacího pufru, 1 μΐ 3,3 mM [γ-³²P] ATP (0,37 MBq) a 10μ1 redestilované vody. Ke směsi bylo přidáno 20 U roztoku polynukleotidkinázy T4 [vyrobené u Takara Shuzo], poté následovala inkubace 30 minut při 37 °C. Neinkorporované [γ-³²P] ATP byly odstraněny ethanolovou precipítací opakovanou pětkrát.

Výsledná označená sonda byla přidána do hybridizačního roztoku [5 ml formamidu, 2 ml 50% dextransulfátu, 200 μΐ 50x Denhardtova roztoku, 2,5 ml 20x SSC, 50 μΐ kvasničné tRNA (50 mg/ml), 100 μΐ 10% SDS, 1,3 ml redestilované vody] do konečné koncentrace 5 x 10⁵ cpm/ml aHybond-N membrána upravená podle výše uvedeného postupu byla do tohoto roztoku přenesena, aby proběhla hybridizace. Hybridizace probíhala při 50 °C přes noc. Poté následovalo promytí třepáním v 2x SSC obsahujícím 0,1% dodecylsulfát sodný (SDS) při teplotě 60 °C. Tento postup byl třikrát opakován a membrána Hybond-N byla dále omyta 0,lx SSC obsahující 0,1% SDS třepáním při laboratorní teplotě po dobu jedné hodiny a pak vysušena.

Autoradiografie ukázala, že plazmid, který jsme označili pNS51, obsahuje vložený fragment sestávající z přibližně 6500 bp, kteiý hybridizoval s virovou genomovou RNA.

G) Stanovení sekvence inzertu pNS51

Aby mohla být stanovena restrikční mapa cDNA klonované v pNS51, byl plazmid štěpen těmito restrikčními enzymy: BamHI, EcoRI, Hind III, KpnI, Ncol, Pstl, Sáli, Sphl, Sací, Smál, Xhol, Xbal a jejich dvojicemi. Vzniklá restrikční mapa je uvedena na obrázku 1.

Každý fragment získaný štěpením restrikčními enzymy Sáli a Pstl byl vložen do M13mpl9 RF DNA. To bylo provedeno pomocí štěpení pNS51 restrikčními enzymy Pstl a Sáli a rozdělením produktů štěpení elektroforézou v 5% polyakrylamidovém gelu s použitím lx TBE. Gel byl obarven ethidiumbromidem v koncentraci 1 gg/ml, aby bylo možno určit jednotlivé pruhy v ultrafialovém světle. Proužky gelu obsahující jednotlivé pruhy DNA byly vystřiženy žiletkou a podrobeny elektroeluci v elektroeluátoru (vyrobeném firmou Amicon) vybaveném Centriconem30 (vyrobeném firmou Amicon).

Každý fragment byl pak vložen do M13mpl9 s použitím soupravy pro ligaci DNA [vyrobené Takara Shuzo], M13mpl9 byl předtím štěpen buď pouhým Sáli, nebo jak Pstl tak Sáli a poté ošetřen alkalickou fosfatázou.

Výsledný M13mpl9 RF-DNA, (do kterého byly fragmenty vloženy pomocí DNA T4 ligázy), byl zaveden do kmene E. coli JM109 s použitím metody chloridu rubidného. Jediná kolonie kmene JM109, která byla pěstována na minimálním agarovém médiu M9, byla inokulována do tekutého SOB média, ve kterém byla pěstována za stálého míchání přes noc. 0,6 ml této kultury bylo přidáno do 50 ml čerstvého tekutého SOB média a pěstována za stálého míchání přes noc. 0,6 ml této kultury bylo přidáno do 50 ml čerstvého tekutého SOB média a pěstována za stálého míchání při teplotě 37 °C až do hustoty OD6oonm 0,5. Buňky byly poté odděleny centrifugací při 5000 x g

-28CZ 293582 B6 při teplotě 4 °C po dobu 10 minut. Peleta byla jemně resuspendována v 25 ml pufru TFB1 a ponechána na ledu 20 minut.

Suspenze byla opět centrifugována při 3000 x g po dobu 5 minut. Peleta byla resuspendována v 2 ml pufru TFB2 a ponechána na ledu 20 minut, aby se vytvořily kompetentní buňky.

Rekombinantní M13mpl9 RF-DNA získaná podle výše popsaného popisu byla použita v množství mezi 1 až 10 μΐ po ligaci a smíchána s 100 μΐ kompetentních buněk a ponechána na ledu 1 hodinu. Po této době byla směs inkubována při 42 °C 1,5 minuty, pak bylo ke směsi přidáno 500 μΐ tekutého SOC média a směs byla kultivována za stálého třepání v 37 °C další hodinu.

K výsledné kultuře bylo za stálého míchání přidáno médium 2x YT obsahující 0,8% agar, 30 μΐ 100 mM IPTG, 10μ1 10% 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-galaktosid (X-gal) a 100μ1 indikátoru bakterií (kultura kmene JMI09 pěstovaného přes noc při třepání v médiu 2x YT při 37 °C). Takto upravená kultura byla nalita na pevné medium 2x YT obsahující 1,2% agar. Po utuhnutí byla směs pěstována přes noc v 37 °C. Rekombinantní fágy se pak projevily jako bílé plaky.

Každý ze vzniklých bílých plaků byl inokulován do média 2x YT obsahujícího indikátor bakterií v množství 1/100 a kultivace pokračovala přes noc při třepání v 37 °C. Po centrifugaci při 10 000 x g po dobu jedné minuty byl supematant zmražen nebo uskladněn v 4 °C jako fágový roztok a peleta buněk byla zpracována obvyklým postupem pro přípravu plazmidu, aby bylo možno získat RF dsDNA (v tomto textu pod zkratkou RF-DNA), která je intermediátem replikace tohoto fága. Přítomnost vloženého fragmentu byla potvrzena štěpením restrikčními enzymy.

Tímto způsobem byl získán 51SS/M13mpl9 (tj. M13mpl9 obsahující fragment Sall/Sall, který je naopak částí genomu 51PS5'/M13mpl9 obsahujícího fragment Pstl-Sall z 5'-oblasti genomu CYVV). Z těchto fágových klonů byly purifikovány molekuly RF-DNA alkalickým SDS a centrifugaci v hustotním gradientu cesium chloridu pomocí standardních technik.

Z výsledné DNA, která byla nejdříve štěpena BamHI, aby se dosáhlo kohezních 5'konců, bylo odebráno 5 pg, které byly dále štěpeny KpnI, aby se získaly kohezní 3'konce. Podle protokolu k systému Erase-a-base (vyrobenému firmou Promega), byla dále přidána exonukleáza pro postupné delece bází z kohezních 5' konců veškerých cDNA linearizovaných plazmidů. Reakce s exonukleázou pokračovala 10 minut a v čase mezi 1 a 10 minutami byly odebírány vzorky. Protože má vektor kohezní 3'-konec, není exonukleázou napadán. Konce různých vzorků získaných v období mezi 1. a 10. minutou byly zatupeny reakcí snukleázou SI a ligovány do kruhové formy použitím DNA ligázy T4.

Výsledná cirkulámí rekombinantní M13mpl9 RF-DNA byla zavedena do E. coli kmene JM 109 s použitím metody chloridu rubidného popsané výše. Rekombinantní fágy obsahující různé délky inzertů cDNA byly získány jako bílé plaky.

RF-DNA byla extrahována ze subklonů rekombinantních fágů získaných výše uvedenými prostředky pro selekci klonů obsahujících inzerty různé délky. Vybrané klony byly kultivovány odděleně inokulací do tekutého média 2x YT obsahujícího indikační kmen E. coli a byly pěstovány přes noc při teplotě 37 °C. Po této době bylo z každé kultury odebráno 1,5 ml, které byly centrifugovány při 4 °C, 10 000 x g, 5 minut. Jeden ml supematantu byl přenesen do čisté kyvety, do které bylo přidáno 250 ml vodného roztoku 20% polyethylenglykolu (20% polyethylenglykol # 8000, 2,5 M chlorid sodný), zamícháno a ponecháno na ledu 30 minut. Směs byla potom centrifugována v 10 000 x g 5 minut při teplotě 4 °C a výsledná peleta byla resuspendována v 100 μΐ pufru TE. Z každého vzorku byla pak získána genomová jednovláknová DNA (zde uváděná jako ssDNA) pomocí fenolové extrakce a fenolové precipitace jako předtím.

-29CZ 293582 B6

Sekvence nukleotidů každého subklonu získaného podle výše uvedeného postupu byla pak určena metodou využívající dideoxynukleotidů a ssDNA jako templátu. Přesněji řečeno byla fágová ssDNA označena [a-³²P] dCTP (220 TBq/nmol, vyrobenou firmou Amersham) s použitím soupravy dCTP 7-deaza-sekvenázy verze 2.0 (vyrobeno USB). Výsledný produkt reakce byl analyzován elektroforézou v 5% polyakrylamidovém gelu obsahujícím 8 M močovinu a s použitím pufru lx TBE. Gel byl vysušen a sekvence nukleotidů byla určena autoradiografií.

Analýzou sekvencí nukleotidů fragmentů 5'-PstI-SalI a M-Sall-Sall zpNS51 jsme stanovili celkový počet bází na 3839.

Výsledkem hledání otevřeného čtecího rámce (zde pod zkratkou ORF) ve výše získané sekvenci bylo nalezení jednoduchého ORF pro daný polypeptid na pozitivním vláknu genomu viru. Pak byla určena sekvence polypeptidu kódovaného v tomto ORF. Porovnáním homologie této oolypeptidové sekvence se známými sekvencemi s použitím GeneBank ukázalo homologii s TEV-HAT.

Je známo, že viry jako TEV, plum pox virus (švestkový poxvirus) nebo poliovirus (živočišný virus) uzrávají činností proteázy a že proteáza obecně štěpí peptidové vazby obsahující spojení Gln-Ala, Gln-Ser nebo Gln-Gly [Willing, J. a van Kammen, A. (1988), Arch. Virol. 98: 1-26]. Analýzou štěpných míst proteinu virového obalu CYVV-č. 30 jsme rovněž mohli detekovat tři štěpné sekvence v odvozené sekvenci daného polypeptidu [Uyeda, I. a kol. (1991), Intervirology 32: 234-245]. Podle jednoho tohoto štěpeného místa bylo určeno, že sekvence polypeptidu od Gly na místě 4 a Gin v pozici 437 v sekvenci aminokyselin, je jadernou ínkluzí z viru CYVV.

H) Příprava fúzního proteinu CYVV-NIa/lL-11

DNA určená podle G) jako kódující DNA pro NIa z CYVV byla tandemově spojena do rámce na svém 3'-konci sDNA kódující lidský interleukin 11 (IL-U), přes spojovací sekvenci kódující Gln-Ala.

Bylo prošetřeno následující:

za prvé, zda DNA určená v G) kóduje NIa mající proteolytickou aktivitu, za druhé, zda daná proteáza štěpí požadované aminokyselinové sekvence, za třetí, zda proteázová aktivita NIa pokračuje, když je NIa součástí fuzního proteinu společně s požadovaným heterologním proteinem způsobem podobným způsobu jakým takové štěpení probíhá v buňce infikované virem, za čtvrté, zda si kterýkoli heterologní protein získaný štěpením takového fuzního proteinu udržuje integritu, strukturu a funkci.

Protože samotná NIa vzniká excizí z prekurzoru virového polypeptidu, nemá cistron NIa žádný iniciační kodon. Proto oje nezbytné přidat na 5'-konec genu pro NIa iniciační kodon ATG. 3'konec genu NIa musí být rovněž spojen s 5'-koncem genu IL-11 ve stejném čtecím rámci. Abychom vyřešili tento problém, byla NIa modifikována s použitím techniky PCR s využitím štěpného místa Xhol, které je uprostřed genu pro NIa.

Byly připraveny PCR primery, pomocí kterých mohl být vložen do 5'-konce NIa (NIa5') iniciační kodon ATG a rozpoznávací místo pro restrikční enzym. Připravené sekvence byly 5'GTCCATGGGGAAAGTAAGAGAACA3' (uváděné jako NSATG, sekvenční č. ID: 3) a sekvence uváděná jako NSX1, sekvenční č. ID 4: 5'ACTCTGAGACCGTGCTCGAG3'.

-30CZ 293582 B6

K 1 pg plazmidové pNS51 DNA bylo přidáno 0,8 μΐ roztoku dNTP (25 mM každého zdATP, dTTP, dCTP a dGTP), lOx Taq pufru (vyrobeného firmou Promega) a 1 pg každého výsledného primeru a směs byla doplněna na 100 μΐ redestilovanou vodou. Pro spuštění reakce PCR bylo přidáno 5U DNA polymerázy rozpuštěných v pufru lOx Taq. Program PCR byl cyklus při 92 °C po dobu jedné minuty, 1 minutu při 37 °C a 2 minuty při 72 °C, který byl opakován dvacetkrát a po kterém následoval jednoduchý cyklus po dobu 1 minuty při 92 °C, 1 minutu při 37 °C a 30 minut při 72 °C.

Výsledná amplifikovaná DNA byla extrahována fenolem, precipitována ethanolem a analyzována elektroforézou v 5% polyakrylamidovém gelu. Po obarvení ethidiumbromidem byl pruh obsahující DNA vystřižen z gelu a podroben elektroeluci Cetreluterem (výroba Amicon) vybaveným Centriconem-30 (výroba Amicon). Po eluci byl eluovaný fragment DNA koncentrován a separován centrifugací při 7500 x g s použitím Centricon (Amicon) při teplotě 4 °C po dobu 45 minut. Výsledný koncentrát DNA byl dále purifikována fenolovou extrakcí a ethanolovou precipitací.

Odděleně byl štěpen 1 pg plazmidu pKK388-l (výroba Clonetech), ve kterém bylo rozpoznávací místo pro Sací nahrazeno rozpoznávacím místem pro Xhol, restrikčními enzymy Ncol a Xhol a defosforylován alkalickou fosfatázou z telecího střeva [zde uváděné pod zkratkou CIAP, výroba Takara Shuzo]. Výsledná DNA byla ligována pomocí ligační soupravy (výroba Takara Shuzo) s 100 ng pKK388-l, který byl rovněž štěpen Ncol a Xhol defosforylován stejným způsobem. Takto získaná rekombinantní DNA byla klonována do E. coli, kmen JM 109. Tak byl získán plazmid pKNI5', který měl inzert v normální orientaci po směru exprese od trc promotoru z pKK388-l (obr. 2).

Plazmid pCD20-2 [Kawashima, I. a kol. (1991), FEBS L. 283: 199-202] obsahuje cDNA kódující prekurzor IL-11 (Pre-IL-11) a mající signální sekvenci pro sekreci. Tento plazmid byl štěpen restrikčními enzymy BamHI a Apal a byla vystřižena oblast obsahující jak prekurzor IL11 (Pre-IL-11), tak promotor SV40. Fragment byl ligován do míst BamHI a Apal v pBLUESCRIPT II Sk+ a poté opět štěpen restrikčními enzymy Xhol a KpnI, čímž vznikl gen, který kóduje protein postrádající N-konec zralého IL-11 (Mat-IL-11).

Výsledný fragment Mat-IL-11 (postrádající svůj N-konce) byl integrován do pKNI5' působením ligázy T4. Tento fragment byl předtím štěpen restrikčními enzymy Xhol a KpnI a rovněž ošetřen CIAP. Výsledný konstrukt jsme označili pKNI5IL (obr. 3). Byly syntetizovány čtyři druhy PCR primerů pro ligaci specifických sekvencí na C-konci NIa s Mat-IL-11 přes Ala za současné dodržení stejného čtecího rámce. Jsou to tyto příměry:

5'AGGAAAAGAGTTCCTCGAGC3' (označovaný jako NSX2, sekvenční č. ID: 5)

5'AATTGTTCATTCCAAGCACCTGGGCCACCACCTGGC3' (označovaný jako NSJ001P, sekvenční č. ID: 6)

5OCCAGGTGGTGGCCCAGGTGCTTGGAATGAACAATT3' (označovaný jako NSJ002N, sekvenční č. ID: 7)

5'TTGTCAGCACACCTGGGAGCTGTAGAGCTC3' (označovaný jako ILSAC, sekvenční č. ID: 8)

V první PCR reakci byl použit pár primerů NSX2 a NSJ002N s pNS51 DNA jako templátem pro amplifikaci oblasti inzertu kódujícího C-konce NIa (označované jako oblast CNI3). Odděleně byla provedena jiná PCR reakce s použitím páru primerů NSJ001P a ILSAC s pNS51 DNA jako templátem pro amplifikaci oblasti inzertu kódujícího N-konec peptidů LL—11 (označovaného jako

-31 CZ 293582 B6

5'IL oblast). Pro PCR byl použit program s cyklem 1 minutu při 92 °C, 1 minutu při 37 °C a 2 minuty při 72 °C, který byl opakován dvacetkrát a po kterém následoval jednoduchý cyklus 1 minuta při 92 °C, 1 minuta při 37 °C a 30 minut při 72 °C. Produkty získané tímto PCR postupem byly extrahovány fenolem, precipitovány ethanolem a pak podrobeny elektroforéze v 5% polyakrylamidovém gelu. Pruh gelu obsahující amplifikovanou DNA byl vystřižen a DNA byla získána elektrickou cestou zpruhu gelu použitím metody elektroeluce popsané výše. Výsledky jsou uvedeny na obr. 4.

Výsledné dva amplifikované fragmenty DNA byly oblasti primerů NSJ001P a NSJ002N, tj. 3'koncová část fragmentu CIN3 DNA a 5'-koncová Část fragmentu 5'IL DNA, které mají částečnou homologii v sekvenci nukleotidů. Takže pokud se provede opět PCR s použitím primerů NSX2 a ILSAC, bude homologní část hybridizovat takovým způsobem, že můžeme získat fúzovanou DNA obsahující části obou genů, přičemž homologní část funguje jako spojovník (obr. 5). Získané fragmenty DNA CIN3 a 5'IL byly smíchány a opět byla provedena PCR s použitím pouze fragmentů NSX2 a ILSAC jako primerů. Program PCR sestával z 10 cyklů: 1 minuta při 92 °C, 1 minuta při 37 °C a 2 minuty při 72 °C. Po tomto cyklu následoval jednoduchý cyklus 1 minutu při 92 °C, 1 minutu při 55 °C a 30 minut při 72 °C. Po reakci s fenolem a precipitaci alkoholem a po elektroforéze v 5% polyakrylamidovém gelu byl získán fragment CNI3IL DNA, ve kterém byly spojeny fragmenty CNI3 a 5'IL. Metoda je uvedena na obrázku 5.

Fragment CNI3IL DNA byl štěpen restrikčním enzymem Xhol a výsledný fragment vložen pomocí T4 DNA ligázy do pKNI5', který byl předem štěpen restrikčním enzymem Xhol a defosforylován CIAP. Výsledný plazmid byl klonován do E. coli kmene JM 109. Aby mohl být vybrán klon, do kterého byl fragment vložen ve správné orientaci, byly plazmidy z jednotlivých klonů extrahovány a byla provedena PCR s použitím primerů NSX2 a ILSAC. Při použití tohoto systému je možno určit druh DNA z klonu, do kterého byl fragment vložen ve správné orientaci. Byl získán plazmid pKSUN9, ve kterém jsou ve stejném čtecím rámci přes štěpnou sekvenci Gln-Ala spojeny NIa a Mat-IL-11 (obr. 6).

I) Exprese Ala-IL-11 v bakteriální buňce

E. coli nesoucí plazmid pKSUN9 (zde uváděný pod zkratkou KSUN9) byly kultivovány třepáním přes noc v teplotě 37 °C v 5 ml LB média obsahujícího 42 pg/ml ampicilinu. Z výsledné kultury byly odebrány 2,5 ml, které byly přidány do 250ml čerstvého LB média (obsahujícího stejné množství ampicilinu) a dále kultivovány v 37 °C za stálého třepání až do dosažení optické density rovnající se při 600 nm hodnotě 1,0. Jakmile bylo dosaženo zákalu OD₆₀o - 1,0, bylo přidáno IPTG do konečné koncentrace 0,1 mM a směs byla pěstována za stálého třepání při 28 °C dalších 12 hodin.

Druhá kultura byla připravena totožným způsobem kromě toho, že konečná kultura byla pěstována 36 hodin nebo déle při teplotě 28 °C a s IPTG v konečné koncentraci lmM, aby byl získán zralý IL—11, (který má na N-konci prolin).

J) Western blotting

Pro stanovení funkčnosti pKSUN9 v E. coli a testování, zda zkonstruovaný rekombinantní gen se exprimuje, byla použita technika Western blottingu.

Obě kultuiy, tj. 12ti hodinová a 36ti hodinová, indukované IPTG byly zpracovány následujícím způsobem. Z 2 ml kultury byly získány buňky centrifugací při 3 000 x g, 4 °C po dobu 5 minut a peleta byla resuspendována v 100 μΐ 20 mM pufru s boritanem sodným (upraveným na pH 9,0 pomocí 0,1 N NaOH). Výsledná suspenze byla sonikována (Handysonic UR-20P, výroby Tomy Seiko Co.) v nastavení 8 po dobu 2 minut. Rozrušené buňky byly poté centrifugovány při

-32CZ 293582 B6 lOOOOxg, 4 °C po dobu 10 minut. Supematant obsahující frakci rozpustného proteinu byl odebrán. Z tohoto supematantu bylo odebráno 5 μΐ, které byly použity v elektroforéze v 12% SDS polyacrylamidovém gelu podle metody Laemmliho [Laemmli, U.K. (1970), Nátuře 227: 680-685],

Po elektroforéze byl gel třepán v transferovém pufru (25 mM Tris, 192 mM glycin, 20% methanol) po dobu 5 minut a blotován do kousku membrány PVDF (Trans-Blot Transfer Medium, výroba Bio-Rad Laboratories) reakcí při 15 V po dobu 1 hodiny s použitím TransBlot-SD Semi-Dry Transfer Cell (výroba Bio-Rad Laboratories). Blotovaná PVDF membrána byla omývána médiem PBS-Tw 10 minut. Omytá PVDF membrána byla přenesena do PBS-Tw obsahujícího 5 % odstředěného mléka (výroba Snow Brand Milk Products) při 37 °C po dobu 1 hodiny (pro blokování).

Po blokování byla PVDF membrána dále omývána v PBS-Tw 10 minut a dvakrát po 5 minutách a poté byla přenesena do anti-IL-11 králičího séra, které bylo rozpuštěno v 10 000 násobku PBS-Tw, a inkubována v 37 °C 20 minut. Pak byla PVDF membrána opět omývána PBS-Tw jednou 10 minut a dvakrát 5 minut.

Pak byla PVDF membrána přenesena do antikráličích kozích IgG protilátek značených křenovou peroxidázou (výroba Amersham), která byla rozpuštěna v 5000 násobku PBD-Tw, a pak inkubována v 37 °C po dobu 20 minut. Po této době byla PVDF membrána opět omyta PBS-Tw, jednou 10 minut a 4krát po pěti minutách.

Po tomto promývání bylo k PVDF membráně přidáno zesílené reagens chemiluminescenční detekce (ECL), a pruhy, které reagovaly s anti-IL-11 protilátkou, se projevily po kontaktu PVDF membrány s rentgenovým filmem po dobu mezi 30 vteřinami až 5 minutami.

Western blotem bylo možno u obou kultur, tj. u 12ti hodinové i 36-ti hodinové, nalézt signální pruhy odpovídající svou molekulovou hmotností přibližně 50 kDa a 23 kDa. Pruh 23 kDa vykazoval v podstatě stejnou aktivitu jako zralý IL—11 použitý jako kontrola. Tím se ukázalo, že 23 kDa signální pruh je IL—11, který byl odštěpen z fúzního proteinu NIa/IL-11 proteolytickou aktivitou NIa v místě spojovací sekvence Gln-Ala. Z toho bylo vydedukováno, že těžší pruh (50 kDa) byl neštěpený fiizní protein.

Protein o 23 kDa získaný z 12ti hodinové kultury bude označován jako 23 kDa-ΟΝ a 23 kDa protein získaný z 36ti hodinové kultury bude označován jako 23 kDa-35hr.

K) Purifíkace proteinů 23 kDa-ΟΝ a 23 kDa-36hr

Proteiny 23 kDa-ΟΝ a 23 kDa-36hr byly purifikovány, aby mohla být zjištěna aminosekvence na jejich N-konci. Od každé kultury, tj. 12ti hodinové a 36ti hodinové, bylo získáno 250 ml postupem uvedeným ví) výše. Každá tato kultura pak byla dále zpracována následujícím způsobem. Kultura byla centrifugována při 5000 x g ve 4 °C po dobu 15 minut, peleta byla resuspendována v 10 ml 20 mM boritého pufru (pH 9,0), rozrušena ve francouzském lisu a v sonikátoru. Frakce rozpustného proteinu byla získána jako supematant centrifugací v 15 000 x g, 4 °C po dobu 30 minut.

Výsledná frakce rozpustného proteinu pak byla podrobena chromatografií na koloně se slabým iontoměničem s použitím FPLC, výroba Pharmacia, při dodržení těchto podmínek:

Kolona: CM Toyopearl Pack 650 M (2,2 x 20 cm, výroba Toso)

Eluční pufr: A = 10 mM kyselina boritá - hydroxid sodný (pH 9,0), 13 mM chlorid draselný B = 10 mM kyselina boritá - hydroxid sodný (pH 9,0), 13 mM chlorid draselný, 400 Mm chlorid sodný

-33CZ 293582 B6

Průtok: 2,5 ml/min

Objem frakce: 5 ml/kolona

Byl použit koncentrační gradient jako lineární gradient z eluátu A do eluátu v rozmezí 120 min.

Každá eluovaná frakce byla pak podrobena ELISA testu, aby bylo možno stanovit frakci obsahující IL-11.

ELISA test byl proveden následujícím způsobem. Každá komůrka 96ti komůrkové titrační destičky (Maxisoap, výroba Nunc) byla naplněna 100 μΐ 50 mM pufru uhličitanu sodného (pH9,6) obsahujícího 1 Mg/ml anti-IL-11 myší monoklonální protilátky a destička pak byla inkubována jednu hodinu při teplotě 37 °C. Po této době byl každá komůrka čtyřikrát promyta médiem PBS-T (PBS obsahující 0,1% Tween 20).

Každá takto získaná frakce FPLC byla ředěna 100 násobkem PBS-T a rozdělena do komůrek v alikvotních množstvích 100 μΐ/komůrka. Destička byla inkubována v 37 °C 1 hodinu, komůrky byly opět promyty PBS-T a pak bylo do každé komůrky přidáno 100 μΐ králičího anti-IL-11 IgG ředěného PBS-T do konečné koncentrace 1 Mg/ml.

Destička byla dále inkubována 1 hodinu při 37 °C, omyta PBS-T a pak bylo do každé komůrky přidáno 100 μΐ anti-králičí IgG kozí protilátky značené alkalickou fosfatázou (výroba Gibco Bethesda Research Laboratories), která byla ředěna 3000x PBS-T. Destička byla opět inkubována při 37 °C 1 hodinu a poté omyta PBS-T. Každá komůrka pak byla naplněna 100 μΐ roztokem substrátu alkalické fosfatázy. Destička byla inkubována při laboratorní teplotě

I hodinu. Po této době bylo měřeno zabarvení každé komůrky jako absorbance při 405 nm, aby bylo možno nalézt požadovanou frakci.

Frakce z FPLC postupu, které ELISA test určil jako obsahující látku reagující s králičí anti-IL-

II protilátkou (frakce 19 až 25), byly sebrány, lOOx koncentrovány pomocí Centprep-10 (výroba Amicon) a potom puštěny v elektroforéze na 12% SDS polyakrylamidovém gelu podle metody Laemmliho (supra). Gel byl poté použit pro elektro-blotting na kus PVDF membrány způsobem podobným tomu, který byl použit při postupu Western blotu, avšak s použitím membrány Problot (výroba Applied Biosystems) místo membrány PVDF.

Po blotování byla membrána kompletně omyta redestilovanou vodou, obarvena Coomassie Brilliant Blue R-250 a odbarvena 50% methanolem. Pruh obsahující protein, který ve Western blotu reagoval s anti-IL-11 protilátkou, byl vystřižen.

Sekvence aminokyselin na N-konci proteinu byly analyzovány pomocí sekvenátoru proteinů (výroba Applied Biosystems). N-koncová sekvence pruhu z 23 kDa-ON, který reagoval s antiIL-1 1 protilátku byla určena jako:

Ala-Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly- (sekvenční č. ID: 9)

Tato sekvence odpovídá aminosekvenci -1 až +6 aminosekvence zralého proteinu EL—11. Na základě těchto zjištění bylo vydedukováno, že protein 23 kDa získaný z 12ti hodinové kultury, který reagoval s anti-IL-11 protilátkou, byl Ala-IL-11. Proto je zřejmé, že tento protein byl vytvořen proteolytickou aktivitou NIa štěpící fúzní protein NIa/IL-11 v místě Gln-Ala specifické štěpné sekvence.

N-koncová sekvence tohoto pruhu z 23 kDa-36hr, který reagoval s anti-IL-11 protilátkou, byla stanovena takto:

Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro- (sekvenční č. ID: 10)

-34CZ 293582 B6

Tato sekvence odpovídá sekvenci aminokyselin +1 až +7 zralého IL-11. Proto jsme mohli dojít k následujícím závěrům.

Po indukci IPTG byl fúzní protein NI/IL-11 schopen exprese v E. coli.

Kultivaci po dobu 12 hodin po indukci byl fuzní protein NIa/IL-11 štěpen ve specifické štěpné sekvenci v místě peptidové vazby Gln-Ala proteázovou aktivitou NIa.

Po štěpení peptidové vazby NIa se v E. coli exprimoval zralý IL-11, který však měl na svém Nkonci navíc alanin.

Kultivací po dalších 24 hodin poté, co došlo k expresi Ala-IL-11, vyzrál tento protein v IL-11, ve kterém byl z původního Ala-IL-11 deletován alanin původně umístěný na N-konci tohoto proteinu.

Na základě těchto zjištění jsme vyvodili, že protein 23kDa získaný 36ti hodinovou kultivací byl zralý typ proteinu IL-11, jehož N-konec byl Pro.

Bylo proto stanoveno, že IL-11 může být exprimován jako fuzní protein s NIa a že aktivita NIa může štěpit specifickou spojovací sekvenci obsahující Gln-Ala za vzniku Ala-IL-11. Další pěstování poskytlo zralý IL-11, kde byl faktory přítomnými v E. coli deletován alaninový zbytek a tak obnažen prolin na N-konci.

Pro zjištění, zda jsou exprimované IL-11 a Ala-IL-11 biologicky aktivní, byla jako index určena aktivita inhibičního faktoru adipogeneze. Skutečnost, že IL-11 má adipogeneticky inhibiční aktivitu, byla popsána již dříve [Kawashima, I. a kol. (1991), FEBS L. 283: 199-202].

L) Měření inhibičního efektu na morfologické změny buněk 3T3-L1 na adipocyty.

Aktivita AGIF použité v tomto vynálezu byla určena následujícím postupem. Byly použity embryonální fibroblasty buněčné linie 3T3-L1 [Green, H. a Kehinde, O. (1974), Cell 1: 113— 116] koupené zATCC. Tyto buňky byly ve všech případech pěstovány ve smíšené vlhké atmosféře 10% CO₂ - 90% vzduchu při 37 °C a subkultivovány v médiu A. Indukce adipogenní diferenciace byla provedena podle postupu Rubina a kol. [Rubin, C. S. a kol. (1978), J. Biol. Chem. 253: 7570-7578].

Buňky 3T3-L1 byly resuspendovány v médiu A do hustoty 1,0 x 104 buněk/ml, vysetých do 48 komůrkové destičky. Po třech dnech se začaly buňky shlukovat. Médium pak bylo nahraženo čerstvým médiem A a po kultivaci další 2 dny bylo médium vyměněno za médium indukující adipogenezi, tj. médium B. Současně bylo přidáno 0,5 ml testovacího vzorku. Médium bylo vyměňováno za čerstvé médium B a přidávány čerstvé vzorky každé dva dny.

Vyčerpané médium B v komůrkách bylo nahrazováno médiem C pro pěstování adipocytů, přičemž se u různých komůrek začínalo v různých časech mezi 4. a 7. dnem po přidání prvního vzorku.

Po kultivaci v médiu C po dobu dvou dnů byly buňky fixovány 5% formaldehydem. Tukové částice, které se nahromadily v buňkách, a buněčná jádra byly obarveny Oil Red 0 a hematoxylinem. Byla provedena mikrografíe a spočítán počet jader a buněk, které nashromáždily obarvené tukové částice. Adipogenetický poměr (AR) byl spočítán podle následujícího vzorce:

počet buněk hromadících tukové částice

AR (%) = 100 x-----------------------------celkový počet jader

-35CZ 293582 B6

Fixace buněk a barvení Oil Red 0 a hematoxylinem byly provedeny podle postupů popsaných Joshio Mimotem a Shojiro Takayamou v „Vedstures on Clinical Testing“, sv. 12, „Pathology“ (1982) vydaných Ishiaku Shuppanem.

M) Metody stanovení inhibiční aktivity lipoproteinlipázy

Stanovení bylo provedeno podle metody popsané Beutlerem a kol. [Beutler, B. A. a kol. (1985), J. Imunol. 135: 3972 -3977]. Adipogeneticky diferencované 3T3 - LI buňky byly připraveny podle postupu uvedeného v odstavci L) s výjimkou toho, že po indukci diferenciace na adipocyty nebyly přidávány žádné zkušební vzorky. Místo toho byly tyto zkušební vzorky přidávány spolu s čerstvým médiem C a buňky byly kultivovány po dobu 18 hodin.

Po této době bylo odstraněno médium a buňky byly dvakrát omyty PBS (-) (fyziologický roztok tlumený fosfátem, výroba Nissui Seiyaku) a každá komůrka pak byla naplněna 300 μΐ média D a buňky byly kultivovány další hodinu. Z každé kultury bylo odebráno 100 μΐ supernatantu a u těchto vzorků byla měřena aktivita lipoproteinlipázy (LPL). Tato měření byla prováděna triplicitně pro každý vzorek a pro výpočet byly použity průměry.

Aktivita LPL se měří metodou popsanou Nilsson - Ehlem a Schotzem [Nilsson - Ehle, P. a Schotz, M. C. (1976), J. Lipid Res. 17: 536 - 541], Alikvoty supernatantu získané výše uvedeným způsobem byly smíchány se stejným objemem roztoku substrátu LPL. Reakce probíhala při teplotě 37 °C po dobu 120 minut. Reakce byla zastavena přidáním 1,05 ml 0,1 M pufru s uhličitanem draselným (pH upraveno 0,1 M boritanem draselným na 10,5) a 3,25 ml směsi metanol: chloroform : heptan [141 : 125 : 100 (v/v)] za intenzivního míchání. Směs byla poté centrifugována při 3000 x g 15 minut při laboratorní teplotě. Obsah ³H ve fázi voda/metanol byl změřen v tekutém scintilačním roztoku měřícím přístrojem.

Jednotka aktivity LPL je definována jako aktivita, která vytvoří jeden pmol mastných kyselin za minutu. 13 mM glycero!tri-[9, 10 (n)-³H]oleát v roztoku substrátu byl připraven rozpuštěním glyceroltri-[9, 10 (n)-³H]oleátu (37,0 GBq/moI), výroba Amersham, vtrioleinu (výroba Sigma) následovaným purifikací pomocí chromatografie na koloně se silikagelem.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady se vztahují k proteinu redukujícímu glutathion podle druhého provedení tohoto vynálezu.

Příklad 1

Extrakce poly(A) +/- RNA z buněk KM-102

Buňky KM-102 byly pěstovány v 36 plastikových kultivačních miskách o průměru 15 cm v upraveném Iscovo minimálním základním médiu (Boeringer Mannheim) obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra. Po nárůstu buněk do zákalu byl přidán forbolmyristylacetát (PMA) a vápenatý ionofor A23187 (Sigma) do konečné koncentrace 10 ng/ml a 0,2 μΜ. Kultivace pokračovala při 37 ^Qc. Po 3, 6 a 14 hodinách bylo sklizeno 12 misek, obsah každé misky byl odděleně rozpuštěn v roztoku guanidinthiokyanátu a byla odebrána tekutá fáze.

Izolace poly(A) ⁺RNA byla provedena v podstatě podle postupu z „Molecular Cloning A Laboratory Manual“ [Maniatis, T., a kol. (1982): 196 - 198]. Následuje podrobný popis tohoto postupu.

-36CZ 293582 B6

Každá odebraná tekutá fáze byla zpracována následujícím způsobem. Tekutina byla opakovaně natažena a vypuštěna z lOml injekční stříkačky s jehlou 21G. Byly přidány 3 ml roztoku 5,7 M CsCl - 0,1 M EDTA (pH 7,5). Směs byla centrifugována v kyvetách Polyaromar v centrifuze RPS 40 - T (Hitachi Koki). Přípravek buněk byl poté navrstven na roztok v kyvetách až do jejich úplného naplnění.

Po centrifugaci při 30 000 ot/min po dobu 18 h při teplotě 20 °C byla vzniklá peleta resuspendována v 400 μΐ destilované vody a precipitována etanolem. Výsledná peleta byla rozpuštěna ve 400 μΐ destilované vody a za stálého míchání bylo přidáno stejné množství směsi chloroform/1butanol (4 : 1 v/v). Vodná vrstva byla oddělena centrifugaci. Poté byla opět provedena precipitace etanolem a peleta byla rozpuštěna v 600 μΐ destilované vody, čímž byla získána celá RNA. Z každého vzorku sebraného o 3, 6 a 14 hodinách a stimulovaného PMA/A 23187 bylo získáno kolem 4,5 mg celkové RNA.

Dále bylo sebráno 600 pg od každého ze 3 typů celkové RNA získaných výše uvedeným postupem a purifikace poly(A) ⁺RNA byla provedena chromatografií na sloupci oligo(dT) celulózy.

Celková RNA byla rozpuštěna v adsorpčním pufru a inkubována při 65 °C po dobu 5 minut. Výsledný roztok byl aplikován na sloupec oligo(dT) celulózy (Pharmacia, typ 7) v adsorpčním pufru a eluován elučním roztokem. Tímto postupem bylo získáno 100 pg poly(A) ⁺RNA.

Příklad 2

Příprava cDNA knihovny cDNA knihovna byla připravena metodou Okayama-Berga.

Pro reakci bylo použito 5 pg poly(A)⁺RNA a 24 U reverzní transkriptázy (Seikagaku Corp.). Reakce probíhala při 42 °C po dobu 1 hodiny ve 20 pl reakčního roztoku reverzní transkriptázy.

Reakce byla zastavena přidáním 2 pl 0,25 M EDTA a lpi 10% SDS. Roztok byl poté deproteinizován 20 pl směsi fenol/chloroform (1:1 v/v). Proteinová frakce byla odstraněna centrifugaci a k supematantu bylo přidáno 20 pl 4 M octanu amonného a 80 pl ethanolu. Směs byla ponechána v teplotě -70 °C po dobu 15 minut. Po této době byl precipitát separován centrifugaci, promyt 70% alkoholem a vysušen podtlakem.

Vysušený precipitát byl rozpuštěn v 15 pl reakčního roztoku terminální transferázy a zahříván v 37 °C po dobu 3 minut. Pak bylo k reakční směsi přidáno 18 U terminální deoxynukleotidyltransferázy (Pharmacia). Reakce probíhala 5 minut. Poté byla reakce ukončena přídavkem 1 pl 0,25 EDTA a 0,5 ml 10% SDS a roztok byl deproteinizován fenol/chloroformem (podle postupu uvedeného výše). Proteinový frakce byla odstraněna centrifugaci. Supematant byl odebrán a důkladně promíchán s 15 pl 4M octanu amonného a 60 pl ethanolu. Směs byla chlazena v -70 °C po dobu 15 minut a precipitát byl separován centrifugaci.

Výsledná peleta byla rozpuštěna v 10 pl pufru pro restrikční enzym a k roztoku byly přidány 2,5 U restrikčního enzymu HindlIL Účinného štěpení bylo dosaženo inkubací směsi v 37 °C po dobu 1 hodiny.

Reakční roztok byl poté deproteinizován fenol/chloroformem a ethanolovou precipitací. Supematant byl ponechán v teplotě -70 °C po dobu 15 min. Výsledný precipitát byl separován centrifugaci a rozpuštěn v 10 pl TE pufru [lOmM Tris-HCl (pH 7,5) a 1 mM EDTA]. 1 pl výsledné směsi byl doplněn do objemu 10 pl reakčním roztokem obsahujícím lOmM Tris-HCI

-37CZ 293582 B6 (pH 7,5), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl a 10 ng spojovací DNA zakončenou oligo(dG) [spojovník 3'-oligo(dG) pL-1 HindlII, PharmaciaJ. Směs byla inkubována po dobu 5 minut v 65 °C a poté 30 minut ve 42 °C. Reakční směs byla zchlazena ledovou vodou. Poté bylo přidáno 10 μΐ lOx ligačního pufru, 78 μΐ destilované vody a 8 U T4 DNA ligázy. Reakční roztok byl ponechán přes noc v teplotě 12 °C.

Následující den bylo k reakční směsi přidáno 10 μΐ 1 M KC1, 1 U ribonukleázy H a 33 jednotek DNA polymerázy I, 4 U T4 DNA ligázy, 0,5 μΐ roztoku dNTP (20 mM dATP, 20 mM dCTP, 20 mM dGTP) a 0,1 μΐ 50 pg/ml hovězího sérumalbuminu (BSA) a výsledná směs byla zahřívána při teplotě 12 °C 1 hodinu a další hodinu při teplotě 25 °C. Po této době byl reakční roztok 5x naředěn destilovanou vodou a okamžitě použit pro transformaci E. coli DH5a s použitím Hanahanovy metody [Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol. 166: 557 - 580], čímž byla připravena cDNA knihovna buněk KM - 102.

Příklad 3

Příprava oligonukleotidové sondy

Na základě sekvence AUUUA na napřekládané 3’ oblasti mRNA cytokinů byl chemicky syntetizován oligonukleotid 5’-TAAATAAATAAATAA-3' (sekvenční č. ID.13) skládající se z 15 bází a označený ATT-3. Syntéza byla provedena s použitím automatického syntezátoru 380 B (Perkin - Elmer Japan Applied Biosystem) podle návodu dodavatele. Použitou metodou byla metoda fosfoamiditová podle Carutherse a kol. [Matteucci, M. D. a Caruthers, Μ. H. (1981), J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191)]. Po syntéze 15-mer byly nukleotidy odděleny od podpory a byla odstraněny ochranné skupiny. Výsledný roztok oligonukleotidů byl lyofilizován, aby vytvořil prášek, který byl pak rozpuštěn v destilované vodě a skladován při teplotě -20 °C až do chvíle použití.

Příklad 4

Screening cDNA knihovny

6500 kolonií vytvořených z cDNA knihovny připravené v příkladu 2 bylo fixováno na nitrocelulózový filtr podle metody popsané Grunsteinem a Horgnessem [Grunstein, M. a Hogness, D. S. (1975) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965],Sonda ATT-3 připravená podle příkladu 3 byla na 5-konci označena ³²P standardním postupem (viz „Molecular Cloning - A laboratory“), a označená sonda byla použita pro hybridizaci kolonií.

Prehybridizace byla provedena při 37 °C po dobu 3 hodin v následujícím prostředí: 6x SSC, lx Denhardtův roztok, 0,25% SDS, 0,5% pyrofosfát sodný a 100 μg/ml denaturované DNA lososího sperma. Hybridizace probíhala přes noc při 31 °C v následujícím prostředí: 6x SSC, lx Denhardt solution, 17 mg/ml kvasničná tRNA a 0,05% pyrofosfát sodný obsahující ATTT-3 sondu značenou ³²P.

Následující den byl nitrocelulózový filtr 2 hodiny omýván roztokem 6x SSC obsahujícím 0,05% pyrofosfát sodný při laboratorní teplotě.

Plazmidová DNA byla extrahována z pozitivních klonů následujícím způsobem. Náhodně bylo vybráno několik klonů a dideoxy metodou byly určeny částečné sekvence cDNA. Tyto částečné sekvence byly testovány na homologii nukleotidových sekvencí se sekvencemi registrovanými v EMBL nebo GenBank databázi přes počítač a bylo stanoveno, že některé z těchto částečných

-38CZ 293582 B6 sekvencí klonů detekovaných pomocí ATT-3 mělo homologní části s částmi Alu repetice [Schmid, C. W. a Jelínek, W. R. (1982) Science 216, 1065-1070)].

Fragmenty DNA obsahující sekvenci Alu repetice byly připraveny z lidské genomové DNA a označené ³²P standardním postupem. Tato značená DNA byla použita jako sonda v hybridizaci kolonií s použitím 33 klonů definovaných výše a ukázalo se, že 12 z těchto klonů obsahovalo tuto Alu repetici. Byla stanovena délka inzertu cDNA každého ze zbývajících klonů. Tato délka byla různá a pohybovala se v rozsahu 50 až 3600 bází.

Na inzertech cDNA ze zbývajících 21 klonů bylo provedeno mapování restrikčními enzymy a byly stanoveny částečné nukleotidové sekvence stejným způsobem jako bylo uvedeno výše. Tyto částečné sekvence pak byly testovány ohledně homologních oblastí s nukleotidovými sekvencemi registrovanými v EMBL nebo GenBank databázi pomocí počítače a byly vybrány klony obsahující nové sekvence.

Příklad 5

Northern hybridizace klonu č. 31

Jeden z klonů, klon č. 31 (označený pcD-31) měl cDNA inzert kolem 560 bp. Z tohoto cDNA inzertu z pcD-31 byl získán fragment (292 bp) a byl označen ³²P pro použití v Northern blotu jako sonda s použitím poly(A)⁺RNA připravené z buněk KM-102 podle postupu jako v příkladu 1. Tato hybridizace byla použita pro stanovení délky přirozeně se vyskytující mRNA, která odpovídá inzertu pcD-31.

Postup při Northern hybridizaci byl následující. Z KM-102 buněk bylo připraveno 5,5 mg poly(A)+RNA a inkubováno při 50 °C 1 hodinu ve směsi 1 M glyoxalu, 50% dimetylsulfoxidu (DMSO) a 0,01 M hydrogenfosfátu disodného (pH 7,0). Na konci této doby byly kinkubační směsi přidány 4 μΐ elektroforetického barviva a směs byla pak rozdělena elektroforézou na 1% agarózovém gelu v lx TAE.

Po elektroforéze byla RNA z agarózového gelu přes noc převedena na nylonovou membránu (BioRad, Zeta-Probe) při použití 20x SSC pomocí metody kapilárního přenosu (viz „Molecula Cloning - A Laboratory Manual“). Po přenosu byl filtr opatrně omyt 2x SSC, osušen vzduchem a pak dodatečně sušen při 80 °C 2 hodiny, aby se fixovala mRNA.

Fragment Pstl-Aatl z pcD-31 byl značen ³²P s použitím DNA značícího systému Multiprime (Amersham).

Prehybridizace byla prováděna na filtru po dobu 3 hodin při 37 °C v roztoku obsahujícím 5xSSCP, 2,5x Denhardtův roztok, 50% formamid, 10 mM hydrogenfosfát disodný (pH7,0), 0,5% SDS a 100 pg/ml denaturované DNA z lososího spermatu.

Hybridizace pak byla na filtru provedena přes noc při 42 °C v roztoku obsahujícím sondu značenou ³²P, 5x SSCP, lx Denhardtův roztok, 50% formamid, 10 mM hydrogenfosfát disodný (pH 7,0), 0,1% SDS a 100 mg/ml denaturované DNA lososího spermatu. Následující den byl filtr nejdříve omýván 1 hodinu při 37 °C roztokem obsahujícím 50% formamid, 5x SSC a 0,1% SDS, a pak 2 hodiny omýván v té samé teplotě roztokem obsahujícím 40% formamid, 5x SSC a 0,1% SDS. Nakonec byl filtr omýván při laboratorní teplotě po dobu 15 minut roztokem 2x SSC. Následná autoradiografie ukázala, že inzert cDNA klonu pcD-31 zde není v celé délce a že kompletní délka odpovídající mRNA je 3,9 kb (stanoveno z kalibrační křivky založené na molekulové hmotnosti markérů).

-39CZ 293582 B6

Příklad 6

Příprava čerstvé knihovny pro screening cDNA klonu pcD-31

Čerstvá knihovna byla připravena s použitím systémů cDNA Synthesis Systém Plus a cDNA Cloning Systém (XgtlO, adapterová metoda, dodávané Amershamem).

Do reakce bylo vloženo 5 μg poly(A)⁺RNA extrahované z buněk KM-102 (podle postupu jako v příkladě 1) a 100 U reverzní transkriptázy. Reakce probíhala při teplotě 42 °C 40 minut v 50 μΐ reakčního roztoku reverzní transkriptázy. Po této době bylo k reakčnímu roztoku přidáno 20 μΟϊ [a-32P]dCTP, 93,5 μΐ pufru druhého vlákna, 4 U ribonukleázy Ha 115 U DNA polymerázy I (všechny roztoky dodávány v soupravě). Směs pak byla inkubována při 22 °C 1 hodinu a nakonec zahřívána na 70 °C po dobu 10 minut. Po této tepelné reakci bylo k reakční směsi přidáno 10 U T4 DNA polymerázy (dodávané v soupravě) a reakce dále probíhala dalších 10 minut při 37 °C.

Reakční směs pak byla zbavena proteinů fenol-chloroformovou deproteinizací. Reakční roztok byl centrifugován, odebrán supematant a smíchán s 250 μΐ 4 M octanu sodného a 1 ml ethanolu. Směs byla ponechána přes noc v teplotě -20 °C, precipitát byl oddělen centrifugací. Výsledná peleta byla rozpuštěna v 30 μΐ sterilní vody. Z výsledného roztoku bylo odebráno 10 μΐ a přidáno ke směsi 2μ1 pufru pro ligázu/kinázu, 250 pM EcoRI adaptéru a 5 U T4 DNA ligázy (vše dodáváno v soupravě) a výsledná směs byla inkubována přes noc při 15 °C.

Celý reakční roztok byl pak aplikován na frakcionační kolonu, aby byl odstraněn EcoRI adapter. Reakční roztok byl pak rozdělen na alikvotní objemy po 120 μΐ a každý alikvot byl smíchán s 200 μΐ 0,25x TE pufru. Byly shromážděny frakce od č. 10. do 17., koncentrovány butanolem na celkový objem 120μ1.

Celý koncentrovaný přípravek pak byl smíchán s 55 μΐ sterilní vody, 20 μΐ pufru ligáza/kináza a 40 U T4 polynukleotidkinázy (vše dodáváno v soupravě) a výsledná směs byla inkubována 30 minut při 37 °C. Poté byla reakční směs třikrát deproteinizována fenol-chloroformovou metodou, precipitována ethanolem a ponechána přes noc při teplotě -20 °C. Výsledný precipitát byl oddělen centrifugací a rozpuštěn v 10 μΐ sterilní vody, čímž vznikl vzorek cDNA.

Ke každému vzorku cDNA o objemu 2 μΐ byl přidán 1 pg EcoRI ramene ÁgtlO, 1 ml ligáza/kináza pufru a 2,5U T4 DNA ligázy (vše poskytováno v soupravě) a pak následovala inkubace přes noc při 15 °C. Vzorek obsahující 4 μΐ cDNA byl připraven stejným způsobem. Každý vzorek byl pak dále zpracován následovně. Veškerý vzniklý reakční roztok byl nejdříve přidán k 10 ml extraktu A (poskytovaného v soupravě) a takto vzniklá směs pak byla přidána k 15 μΐ extraktu B (poskytovaného v soupravě). Výsledná směs byla 20 minut inkubována v 20 °C, aby mohla proběhnout reakce balení in vitro.

Po této době bylo k reakčnímu roztoku přidáno 470 μΐ SM pufru a pak byla směs uskladněna v 4 °C. Kmen E. coli NM514 byl po reakci s 10 mM MgSO₄ infikován skladovaným roztokem, čímž vznikla XgtlO knihovna cDNA KM-102.

Příklad 7

Screening cDNA knihovny

Zkombinovaných cDNA knihoven připravených podle příkladu 6 bylo získáno 2 x 10⁵ plaků, které byly následně fixovány na nylonové filtry (Hybond N, Amersham) následujícím způsobem.

-40CZ 293582 B6

Infikované E. coli připravené podle příkladu 6 byly kultivovány na 9 cm miskách obsahujících pevné LB médium tak, aby se na každé misce vytvořilo mezi 1 a 2 x 10⁴ plaky.

Příklad 8

Příprava nukleotidové sondy a hybridizace

Sondy značené ³²P byly vytvořeny z pcD-31 (získaného podle příkladu 4) označením fragmentů Pstl-Aatl a EcoT221-AatI (223 bp) z pcD-31 pomocí systému Multiprime DNA Labelling Systém. Byla provedena hybridizace plaků na filtrech získaných podle příkladu 7 při použití uvedených sond.

Prehybridizace byla provedena umístěním těchto filtrů do reakčního roztoku obsahujícího sondy značené ³²P a připravené podle výše uvedeného postupu, 50% formamid, 5x SSCP, lxDenhardtův roztok, 0,01 M hydrogenfosfátu disodného (pH 7,0), 0,1% SDS a 100 pg/ml denaturované DNA z lososího spermatu. Inkubace probíhala přes noc při 37 °C.

Následující den byl filtr nejdříve omýván 3 hodiny při laboratorní teplotě roztokem obsahujícím 50% formamid, 5x SSC a 0,1% SDS, a pak 5 minut promýván při laboratorní teplotě 2x SSC. Autoradiografie ukázala 80 pozitivních klonů získaných tímto prvním screeningem.

S použitím klonů, které byly opakovaně identifikovány jako pozitivní, byly opakovány postupy příkladu 7 a 8 ještě třikrát (čtverný screening) a na konci bylo určeno celkem 17 pozitivních klonů. Z každého z těchto 17 klonů byla izolována cDNA a pomocí EcoRI byly vyštěpeny inzerty. Délka každého cDNA inzertu byla ověřena elektroforézou na agarózovém gelu a byl izolován klon 31-7, který měl cDNA inzert o délce 3,9 kbp odpovídající celkové délce původní mRNA.

Příklad 9

Restrikční mapování klonu č. 31-7

Klon č. 31-7 byl štěpen EcoRI, aby byl izolován a purifíkován fragment o 3,9 kb obsahující cDNA inzert. Tento fragment byl pak vložen do pUC18 pomocí T4 DNA ligázy. E. coli DH5a byly transformovány tímto novým plazmidem. Transformované buňky byly selektovány podle rezistence na ampicilin a klon pUCKM31-7 obsahující inzert 3,9 kb cDNA byl určen štěpením DNA EcoRI a následnou elektroforézou v agarózovém gelu.

pUCKM31-7 byl štěpen každým z těchto restrikčních enzymů: HindlII, Sací, Xbal, Smál, BglII, EcoT22I a Aatl nebo jejich dvojicemi. Výsledné fragmenty byly analyzovány gelovou elektroforézou a délka každého fragmentu byla změřena použitím markéru <|)XÍ74HaeIII jako indikátoru. Výsledná restrikční mapa je uvedena na obr. 7.

Příklad 10

Stanovení sekvence klonu č. 31-7

Celková nukleotidová sekvence inzertu cDNA v pUCKM31-7 byla určena dideoxymetodou využívající fág M13. Část této sekvence byla analyzována sekvenátorem 373A DNA Sequencer (Perkin-Elmer Japan Applied Biosystems). Výsledná sekvence nukleotidů má sekvenční číslo ID: 11 a je uvedena v přiloženém přehledu sekvencí.

-41 CZ 293582 B6

Inzert cDNA zpUCKM31-7 je dlouhý 3815 bází a má otevřený čtecí rámec složený z 549 aminokyselin počínaje methioninem. Zjevně chybí poly(A) konec. Srovnání sekvencí bází na 3'konci inzertu pcD-31 se sekvencí klonu pUKCM31-7 ukazuje, že inzert z pUCKM31-7 postrádá pouze konec poly(A) a nic víc.

Porovnání sekvencí bází a aminokyselin bylo provedeno pomocí databází nukleotidů EMBL, GenBank, NBRF a SWISS-PROT. Nejtěsnější souhlasnost, která byla nalezena, činila 35,3% homologii peptidové sekvence s lidskou glutathionreduktázou. Z toho bylo vyvozeno, že ORF inzertu cDNA z pUCKM31-7 jasně kóduje nový polypeptid. Tento nový polypeptid je uvedena 10 pod sekvenčním číslem ID: 12 v přiloženém seznamu sekvencí.

Přikladli

Exprese a purifíkace nového polypeptidu

Konstrukce vysoce expresivního vektoru a exprese v COS-1 buňkách pUCKM31-7 byl štěpen HindlII a fragment 3003 bp obsahující cDNA inzert byl izolován a 20 purifikován standardními technikami. Konce výsledného fragmentu byly zatupeny s použitím soupravy DNA blunting kit (Takara Shuzo).

Mezitím byl vysoce expresivní vektor pcDL-SRa296 [Takabe, Y. a kol. (1988) Mol. Cell. Biol.

8, 466-472] štěpen Pstl a KpnI a konce byly zatupeny pomocí uvedené soupravy. Zatupený 25 inzert byl pak ligován do zatopeného plazmidu pomocí reakce T4 DNA ligázy. E. coli pak byly pomocí metody chloridu vápenatého transformovány výslednou DNA. Vzniklé transformanty Amp^R byly selektovány a byl analyzován plazmid DNA zachycený v buňkách.

Štěpením plazmidu HindlII a BglII, po kterém následovala elektroforéza v agarózovém gelu pro 30 detekci 800bp fragmentu, byl selektován kmen, ve kterém byl směs transkripce cDNA totožný s SRa promotorem. Vybraný plazmid byl označen pSRa31-7 (obr. 9). SRa promotor obsahuje počáteční promotor SV40 a sekvenci R-U5 LTR zHTLV—1 a aktivita jeho promotoru je desetkrát až stokrát silnější než samotného počátečního promotoru SV40.

Dále byly COS-1 baňky transfekovány výsledným plazmidem pSRa31-7. Transfekce COS-1 buněk byla provedena elektroporaci pomocí zařízení pro zavádění genů GTE-1 (Shimadzu).

COS-1 buňky byly pěstovány v sedmi lahvích o objemu 150 cm³, z nichž každá obsahovala ml DMEM (s 10% fetálním hovězím sérem) až do částečného zákalu na dně lahví. Kultury 40 pak byly sklizeny, ke každé z nich byly přidány 3 ml roztoku trypsin-EDTA (lOx koncentrovaný roztok dodávaný Sigmou) a byly ponechány při laboratorní teplotě dokud se neoddělily buňky.

Pak byl přidán 1 ml inaktivovaného fetálního hovězího séra a 9 ml čerstvého roztoku tiypsinEDTA. Buňky pak byly sebrány centrifugaci. Takto sebrané buňky byly dvakrát promyty PBS(~) pufrem a resuspendovány v pufru PBS(-) do hustoty 6 x 10⁷ buněk/ml.

Mezitím byl cesium-chloridovou metodou připraven plazmid DNA a doplněn do 200 pg/ml pufrem PBS(-).

Z obou výše uvedených PBS(-) přípravků buněk a plazmidu bylo odebráno 20 μΐ a jejich směs 50 byla umístěna do komory obsahující elektrody v rozestupu 2 mm. Na směs pak byly aplikovány dva pulzy v intervalu 1 sekundy o síle 600V a trvání 30 psec.

Elektrodová komora byla chlazena při 4 °C 5 minut a pak byla směs buňky-DNA uvnitř smíchána s 10 ml DMEM obsahujícího 10 % fetálního bovinního séra. Tato směs byla přenesena

-42CZ 293582 B6 na Petriho misku a kultivována přes noc při 37 °C v atmosféře 5% CO₂. Následující den byl z kultury odebrán supematant, buňky byly omyty bezsérovým DMEM médiem a pak resuspendovány v 10 ml DMEM a kultivovány v 37 °C další 3 dny. Po této době byl sklizen supematant.

Supematant byl rovněž sklizen z negativní kontroly. Jako negativní kontrola byl použit plazmid pcDL-SRa296 neobsahující žádný inzert cDNA, který však byl jinak připraven podobným způsobem jako testovaná kultura.

Jeden ml supematantu z každé testované kultury a z negativní kontroly byl zpracován následujícím způsobem. K. supematantu byla pro vysrážení proteinů nejdříve přidána kyselina trichloroctová (TCA) a precipitát byl oddělen centrifugací. Tento precipitát byl omyt ledovým acetonem, vysušen vzduchem a poté rozpuštěn ve vzorkovém pufru pro elektroforézu v SDSpolyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) obsahujícím 2-merkaptoethanol. Pak byla provedena SDS-PAGE na 12,5% gelu za redukčních podmínek.

Po elektroforéze byly pruhy obarveny stříbrem s použitím stříbrného barviva „Daiichi“ (Daiichi Chemical Detection). Tímto způsobem bylo obarveno několik specifických pruhů z testovaného vzorku (molekulová hmotnost kolem 60 000).

Protože molekulová hmotnost polypeptidu kódovaného v pSRa31-7 je kolem 60 000 a protože bylo vydedukováno, že je nepravděpodobná přítomnost aminosekvence, která by způsobovala posttranslační modifikace přidáváním postranních sacharidových řetězců, bylo stanoveno těchto několik specifických pruhů odpovídá danému polypeptidu kódovanému cDNA z pSRa31-7.

Příklad 12

Příprava vysoce expresivního plazmidu pro buňky COS-1

Dalším krokem bylo ověření, zda těch několik specifických 60 kDa pruhů určených v příkladu 11 je stejných jako jsou polypeptidy kódované inzertem z pSRa31-7. Dalším záměrem bylo stanovení N-konce sekvence aminokyselin tohoto polypeptidu. Proto byl vytvořen klon s dalšími šesti histidinovány zbytky přímo před terminačním kodonem kódovanými pro C-konec polypeptidu kódovaného inzertem pSRa31-7. Histidinové zbytky mají vysokou afinitu pro NI²⁺ a cílem byly exprimovat polypeptid mající histidinový hexamer (6x His), který by mohl být purifikován pomocí afinitní chromatografie na koloně s nábojem NI²⁺.

Nejdříve byl syntetizován oligonukleotid se 66 bázemi: 5'-CTAGCGCTCTGGGGCAAGCATCCTCCAGGCTGGCTGGCTGCCACCACCACCACCACCACTGATCTAGACT-3' (sekvenční č. ID: 14) a komplementární řetězec o 66 bázích a tyto byly purifikovány s použitím automatického syntezátoru DNA Automated DNA Synthesizer 394 (Perkin-Elmer Japan Applied Biosystems). Oba přípravky oligonukleotidů byly smíchány a inkubovány 3 minuty v 70 °C a dodatečně zahřívány 30 minuty při 37 °C, aby proběhla teplotní hybridizace. Následně byly fosforylovány konce pomocí T4 polynukleotidkinázy.

Výsledný dvouvláknový (ds) fragment byl pomocí T4 DNA ligázy ligován do pUCKM31-7, který byl předem štěpen Eco47III. Tento konstrukt je uveden na obr. 10. E. coli DH5 byly transformovány DNA metodou využívající chlorid vápenatý a výsledné transformované kmeny byly selektovány a testovány, aby byl získán pUCKM3 l-7His. Analýzou části relevantní sekvence bází tohoto pUCKM31-7 bylo potvrzeno, že v části pUCKM31-7His nejsou žádné abnormality.

-43CZ 293582 B6

Vysoce expresivní plazmid pro COS-1 buňky byl připraven subklonováním inzertu z pUCKM31-7His do pcDL-SRa296.

pUCKM31-7His byl štěpen Xball a HindlII, fragmenty byly purifikovány a konce fragmentů byly zatupeny použitím jedné jednotky Klenowova fragmentu za přítomnosti 2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2mM dGTP, 2 mM dTTP, 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 10 mM MgSO4, 0,1 mM dithiotreitolu a 50 pg/ml BSA.

Mezitím byl vysoce expresivní vektor pcDL-SRa296 štěpen Pstl a KpnI a konce byly zatupeny soupravou DNA blunting kit. Zatupený fragment byl pak ligován do zatupeného plazmidu pomocí T4 DNA ligázy. Výsledný plazmid byl pak použit pro transformaci E. coli DH5a. Transformanti byly selektováni a testováni. Kmen, ve kterém byl směr transkripce cDNA totožný se směrem promotoru SRa, byl vybrán a plazmid tohoto kmene byl označen pSRa31-7His. Buňky COS-1 byly transfekovány výsledným plazmidem pSRa31-7 a bezsérový supematant byl získán postupem stejným jako v příkladu 7.

Příklad 13

Purifikace a analýza aminokyselinové sekvence na N-konci

600 ml supematantu získaného podle příkladu 12 bylo dialyzováno proti 17 objemům dialyzačního pufru po dobu 15 hodin při teplotě 4 °C. Pufr byl nahrazen dalšími 17 objemy dialyzačního pufru a dialýza pokračovala při 4 °C další 4 hodiny.

Dialyzovaný přípravek pak byl podroben afinitní chromatografií používající FPLC (Fast Protein Polynukleotide Liquid Chromatography - Pharmacia) v následujících podmínkách.

Kolona:20 ml ProBond™ Resin (Invitrogen) naplněná XK16/20 (φ2,0 x 20 cm, Pharmacia)

Eluční pufr:

A) 20 mM fosfátového pufru (pH 7,8) obsahující imidazol, 0,5 M NaCl

B) 20 mM fosfátový pufr (pH 7,8) obsahující 300 mM imidazol, 0,5 M NaCl.

Průtok: 1 ml/min

Frakční roztok: 5 ml/kolona

Eluční podmínky: po odebrání 4 frakcí elučním pufrem A) bylo odebráno 16 frakcí elučním pufrem B) a frakce byly očíslovány v pořadí od 1 do 20.

300 μΐ každého vzorku z výsledných frakcí bylo precipitováno TCA a vzniklý precipitát byl připraven pomocí SDS-PAGE využívající 12,5% gel v redukčních podmínkách jako předtím. Barvením stříbrem byly detekovány pruhy, a nichž tři byly poblíž frakce č. 10. Přítomnost těchto tří pruhů ukázala, že inzert pSRa31-7His kóduje polypeptid mající tři různé délky sráznými sekvencemi na N-konci.

Zbytek frakcí 7 až 14 byl koncentrován TCA precipitací a precipitát byl použit v SDS-PAGE s 10% gelem v redukčních podmínkách. Proteinové pruhy pak byly z polyakrylamidového gelu přeneseny na polyvinil difluoridový film (PVDF) (ProBlot™, Applied Biosystems) pomocí přenosového zařízení na gelové membrány (Marisol, KS-8441) při 9 V a v přítomnost transferového pufru [0,02% SDS, 20% methanol, 25 mM Tris-boritá (pH 9,5)] při 4 °C po dobu 2,5 hodiny.

-44CZ 293582 B6

Po této době byla membrána obarvena 0,2% naftolovou modročemí (Sigma) a tři pruhy odpovídající těm, které byly dříve určeny, byly z membrány vystřiženy. Byla stanovena sekvence každého pruhu k šesté aminokyselině od N-konce pomocí pianového sekvenátoru proteinů (Shimadzu, PPSQ-10). Sekvence N-konec pruhu s druhou zjevně největší molekulovou hmotností (molekulová hmotnost kolem 60 000) byla následující:

Val-Val-Phe-Val-Lys-Gln (aminokyseliny 1 až 6 sekvence č. ID: 12).

Těchto šest aminokyselin odpovídá prvním šesti aminokyselinám ORF z klonu 31-7 a také odpovídá sekvenci šesti aminokyselin počínaje 24. aminokyselinou (Val) z N-konce prekurzorového polypeptidu kódovaného inzertem cDNBA z SRoc31-7His. Proto by měla delece aminokyselin 1 až 23 z N-konce tohoto prekurzoru polypeptidu vést k sekreci zralé formy proteinu začínající valinovým zbytkem.

Příklad 14

Stanovení redukční aktivity

i) Konstrukce expresívního vektoru

Polypeptid purifíkovaný v předchozím příkladu byl získatelný v extrémně malých množstvích, jak byl exprimován z COS-1 buněk. Nebylo tudíž možné použít tento polypeptid k dalším účelům, jako jsou testy aktivity. Bylo tedy nezbytné najít způsob, jak exprimovat tento polypeptid kódovaný cDNA inzertem v pSRa31-7 v alternativním hostiteli, který by umožňoval produkci množství vhodných pro purifikaci a testy. Následující postupy byly použity pro dosažení tohoto záměru.

pUCKM31-7 byl štěpen HindlII, fragment 3003 bp obsahující cDNA inzert byl izolován a purifíkován a konce byly zatupeny pomocí DNA soupravy pro tento účel. Tento fragment byl dále štěpen Xbal.

Expresivní vektor pMAL-c [Guan, C. a kol. (1987) Gene 67, 21-30] byl štěpen Xbal a Stul. Pomocí Xbal upravený fragment HindlII byl poté ligován do tohoto štěpeného plazmidu pomocí T4 DNA ligázy. Výsledný konstrukt je uveden na obr. 11. Tento konstrukt byl pak použit pro transformaci E. coli TB-1 a byli vybráni a testováni transformanti Amp^R. Kmen, ve kterém byl směr transkripce cDNA totožný s transkripcí promotoru byl vybrán a takto získaný plazmid byl označen pMAL31-7.

ii) Exprese a purifikace fúzního proteinu

Vysetá kultura E. coli nesoucí pMAL31-7 byla připravena kultivací při třepání přes noc při 37 °C v 3 ml LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. Následující den byl přidán lml počáteční kultury do 100 ml čerstvého kultivačního LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a kultivace pokračovala za stálého třepání a teplotě 37 °C, dokud nebylo dosaženo zákalu 0,5 při OD₆oonm. V té chvíli bylo ke kultuře přidáno IPTG do konečné koncentrace 0,1 mM a kultivační bujón byl kultivován dále za třepání při 37 °C.

Následující den byly bakteriální buňky odděleny z kultury centrifugací při 6500 ot/min po dobu 20 minut při 4 °C. Peleta pak byla resuspendována v 10 ml kolonového pufru a buňky byly ve výsledné suspenzi rozrušeny pomocí ultrazvukového desintegrátoru. Celé buňky a buněčné fragmenty pak byly získány centrifugací v 8800 ot/min po dobu 30 min při 0 °C a frakce rozpuštěného proteinu byla odebrána v podobně supematantu. Jeden ml této rozpustné frakce pak byl aplikován na chromatografickou kolonu s amylózou (New England Biolabs).

-45CZ 293582 B6

Eluční pufr pro chromatografií byl připraven přidáním maltózy k lOml kolonového pufru do konečné koncentrace 10 mM.

Negativní kontrolní vzorky byly rovněž testovány chromatografií. Negativní kontrola byla připravena podobným způsobem kromě toho, že byl použit vektor pMAL-c bez cDNA inzertu. Pak byla testována redukční aktivita proteinu v chromatografických vzorcích.

i i i) Stanovení redukční aktivity

Stanovení redukční aktivity bylo provedeno v kyvetě (SARSTEDT, 10 x 4 x 45 mm) s použitím dichlorofenolindofenolu (DCIP) a oxidovaného glutathionu.

a) Stanovení redukční aktivity pomocí DCIP

Z každého chromatografického vzorku získaného v ii) bylo podle návodu v soupravě Protein Assay Kit (Bio-Rad) odebráno 90,4 pg a každý byl odděleně smíchán s 1 ml 50 μΜ DCIP (Sigma). Pak bylo ke každému vzorku přidáno 15 μΐ 1 mM NADPH (Boehringer-Mannheim) a pokaždé byly měřeny hodnoty absorbance při OD₆oonm a OD₃₄₀nm. Výsledný pokles absorbance při obou vlnových délkách je uveden na obr. 12. Z obrázku je zřejmé, že pouze vzorek pMAL31-7 obsahuje faktor, který redukuje DCIP.

b) Stanovení redukční aktivity pomocí oxidovaného glutathionu

K 90,4 pg každého chromatograficky získaného vzorku podle ii) a naneseného do samostatné kyvety bylo přidáno 15ml 10 mM oxidovaného glutathionu. Do každé kyvety bylo přidáno 15 μΐ 1 mM NADPH a pokaždé byla změřena absorbance při OD₃₄₀nm. Výsledky jsou uvedeny na obr. 13 a je z nich zřejmé, že pouze vzorek pMAL31-7 obsahuje protein, který je schopen redukovat oxidovaný glutathion. Bylo rovněž pozorováno, že nedochází k žádné spotřebě NADPH, pokud není přítomen žádný oxidovaný glutathion, takže z tohoto bylo vyvozeno, že protein ze vzorku pMAL31-7 může redukovat oxidovaný glutathion pouze v přítomnosti NADPH.

Příklad 15

Purifikace a analýza sekvence aminokyselin na N-konci

Z příkladu 13 bylo vyvozeno, že COS-1 buňky transfekované pSR 31-7His exprimovaly polypeptid mající tři typy N-konců.

V odděleném experimentu byli imunizováni králíci fuzním proteinem získaným z E. coli transformovaných pMAL31-7. Záměrem toho experimentu byla příprava polyklonální protilátky proti proteinu KM31-7. Byl proveden Western blotting s použitím této polyklonální protilátky a ukázalo se, že tři typy pruhů jsou rovněž zjistitelné v supematantu bezsérové kultury získaného z COS-1 buněk transfekovaných pSRa31-7. Tento výsledek je podobný výsledku získanému v příkladu 13.

COS-1 buňky byly proto transfekovány pSRa31-7 s cílem získat větší množství bezsérového supematantu, které by umožnilo purifikaci a analýzu N-koncové sekvence proteinu KM31-7.

COS-1 buňky byly transfekovány pSRa31-7 a byly pěstovány 3 dny vPetriho miskách o průměru 15 cm, přičemž každá obsahovala 30 ml DMEM. Supematant této kultury byl po těchto třech dnech sebrán a do každé misky bylo přidáno čerstvé médium v objemu 30 ml.

-46CZ 293582 B6

Kultivace pokračovala další tři dny. Opět byl sklizen supematant z kultury. Ostatní aspekty transfekce a kultury byly podle popisu v příkladu 11, avšak bylo pěstováno 199 misek.

Sklizené supematanty byly slity dohromady. Po centrifugaci bylo získáno 10 litrů bezsérového supematantu, které byly dialyzovány přes noc proti 10 mM Tris-HCl (pH 9,0). Chromatografíe na iontoměniči byla na dialyzovaném přípravku provedena osmkrát v následující podmínkách a s použitím FPLC (Pharmacia):

Kolona: 20 mL DEAE Sepharosy Fast Flow (Pharmacia) plněné do XK16/20 (φ2,0 x 20 cm, Pharmacia)

Eluční pufry:

A) 10 mM Tris-HCl (pH 9,0)

Β) 10 mM Tris-HCl (pH 9,0) - 0,5 M NaCl

Průtok: 1 ml/min

Frakční roztok: 3 ml/kolona

Eluční podmínky: eluční pufr A s přechodem na eluční pufr B v lineárním koncentračním gradientu během 60 minut.

Frakce eluované pro každou koncentraci NaCl od 0,1 M do 0,4 M byly odebrány a shromážděny. Poté byly dialyzovány přes noc proti dialyzačnímu pufru obsahujícímu 0,1 M Tris-HCl, 5 mM EDTA (pH 7,6) a 1 mM 2-merkaptoethanol. Dialyzovaný přípravek byl pak puštěn na afínitní chromatografické koloně plněné 2', 5'- ADP Sepharose 4B (Pharmacia) při následujících podmínkách:

Kolona: 20 ml 2', 5-ADP Sepharosa 4B plněná do XK16/20 (φ2,0 x 20 cm,

Pharmacia)

Eluční pufry:

A) 0,1 M Tris-HCl, 5 mM EDTA (pH 7,6) 1 mM 2-merkaptoethanol

B) 0,1 M Tris-HCl, 5 mM EDTA (pH 7,6) 1 mM 2-merkaptoethanol

Průtok: 0,5 ml/min

Frakční roztok: 2 ml/kolona

Eluční podmínky: eluční pufr A postupně změněný na eluční pufr B v lineárním koncentračním gradientu během 120 min.

100 μΐ alikvoty z každé výsledné frakce byly precipitovány TCA a precipitáty byly puštěny na SDS-PAGE při použití 12,5% gelu při redukčních podmínkách.

Po elektroforéze byl gel barven stříbrem pro detekci proteinových pruhů. Počínaje frakcí #11 byly získány tři pruhy.

Všechny zbylé frakce od #11 do #14 pak byly koncentrovány precipitací TCA a precipitát byl analyzován na SDS-PAGE v 12,5% gelu v redukčních podmínkách. Protein byl pak převeden z gelu na ProBlot PVDF membránu (Applied Biosystems) ihned po elektroforéze. Po přenosu proteinu na membránu byla membrána obarvena 0,2% amidočemí a byly vystřiženy tři proteinové pruhy. Analýza N-koncové sekvence byla provedena pomocí sekvenátoru proteinů v plynné fázi.

N-konec daného pruhu mající zjevně nejmenší molekulovou hmotnost ze všech třech typů byl stanoven na Lys-Leu-Lys-Met. Těchto pět aminokyselin odpovídá pěti aminokyselinám počínaje 49. aminokyselinou naN-konci polypeptidu kódovaného cDNA inzertem pSRa31-7. Proto

-47CZ 293582 B6 bylo vyvozeno, že štěpení tohoto peptidů vmiste 48. zbytku vede kjedné zralé formě tohoto proteinu začínající lysinem na N-konci.

Příklad 16

Příprava monoklonální protilátky proti proteinu KM31-7.

(a) Příprava antigenního proteinu

Vysetá kultura E. coli nesoucí pMAL31-7 byla připravena kultivací smyčky buněk třepáním přes noc při 37 °C v 3 ml LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. 1 ml narostlé kultury byl inokulován do 100 ml čerstvého LB média obsahujícího 50pg/ml ampicilinu a tato kultura byla pěstována za stálého třepání při 37 °C do dosažení zákalu 0,5 při OD₆₀onm. V tomto stadiu bylo do kultivačního bujónu přidáno IPTG do konečné koncentrace 0,1 mM a kultivace pokračovala při třepání v 37 °C přes noc.

Z takto vypěstované kultury byly buňky získány centrifugaci při 6500 ot/min, 20 minut při 4 °C a peleta byla resuspendována v 10 ml kolonového pufru. Buňky ve výsledné suspenzi byly rozrušeny ultrazvukovým dezintegrátorem a vzniklá tekutina byla centrifugována při 8000 ot/min při teplotě 0 °C po dobu 30 minut. Výsledný supematant obsahoval frakci rozpuštěného proteinu.

Frakce rozpustného proteinu pak byla aplikována na chromatografíckou amylózovou kolonu o objemu 1 ml. Eluce byla provedena 10 ml kolonového pufru obsahujícího 10 mM maltózu. Fúzní protein získaný chromatografíckou cestou byl uskladněn a později použit jako antigen.

(b) Příprava slezinných buněk z imunizovaných myší

Ke 2 ml antigenu (odpovídajícím 200 pg) purifikovanému podle a) byly přidány 2 ml Freundova kompletního adjuvans, aby vznikla emulze. Tato emulze byla nabrána do 5ml stříkačky se skleněnou spojkou a emulze byla použita k imunizaci osmitýdenních samců myší BALB/c podkožními injekcemi.

Počínaje druhým kolem imunizace bylo jako adjuvans použito Freundovo nekompletní adjuvans, ostatní postup byl jinak zachován. Imunizace byla provedena dohromady čtyřikrát zhruba každé dva týdny.

Od druhého očkování byly odebírány krevní vzorky ze žilní pleteně očního pozadí okamžitě po očkování a v séru byl měřen titr protilátek anti-KM31-7 pomocí ELISA testů na pevné fázi.

ELIS A anti-KM31-7 na pevné fázi

Do každé komůrky 96tikomůrkové destičky (Costar) bylo jako antigen naneseno mezi 150 a 200 μΐ (což odpovídá kolem 200 ng fúzního proteinu) bezsérového supematantu získaného z kultury COS-1 buněk transfekovaných pSRa31-7. Destička pak byla ponechána přes noc v 4 °C, aby se potáhly dna komůrek. Následující den byla miska třikrát omyta 0,1% Tweenem 20/fyziologický roztok tlumený fosfátem (0,1% Tween 20/PBS) a pak byly komůrky naplněny 100 μΐ BSA připravené na 10 pg/ml sPBS a destička byla ponechána jednu hodinu při laboratorní teplotě.

Po této době byla destička opět třikrát omyta 0,1% Tweenem 20/PBS. Do každé komůrky bylo naneseno 30-100 μΐ primárních protilátek ve formě sériově ředěných vzorků (na příklad myší sérum, supematant hybridomové kultury nebo monoklonální protilátka) a destička byla ponechána pří laboratorní teplotě 1 hodinu.

-48CZ 293582 B6

Po této době byla destička opět třikrát omyta 0,1% Tweenem 20/PBS a pak byla do každé komůrky přidána sekundární protilátka v množství 100 μΐ. Sekundární protilátka byla připravena 3000násobným ředěním roztoku kozího anti-myšího IgG-peroxidázového komplexu (Amersham) nebo 3000násobným ředěním kozího anti-myšího IgG alkalického fosfatázového komplexu (BIO-RAD). Pak byla destička ponechána 1 až 2 hodiny při laboratorní teplotě.

Po této době byla destička opět omyta třikrát 0,1% Tweenem 20/PBS a pak bylo do každé komůrky přidáno 100 μΐ buď roztoku substrátu peroxidázy (BIO-RAD, Peroxidase Substráte Kit ABTS), nebo 10% diethanolaminu obsahujícího 0,001% roztok para-nitrofenyl fosfátu. Destička pak byla ponechána 15 až 30 minut při laboratorní teplotě. Titr protilátek byl počítán měřením absorbance při 415 nm nebo 405 nm pomocí sčítacího zařízení (BIO-RAD).

(c) Příprava myších myelomových buněk

Myší myelomové buňky P3-X63-Ag8.653 (653) (ATCC č. CRL-1580) rezistentních na 8azaguanin byly kultivovány v normálním mediu (kompletní GIT) za účelem získat minimálně 2 x 10⁷ buněk.

(d) Příprava hybridomů

1,4 x 10⁸ slezinných buněk imunizovaných myší získaných po imunizačním režimu vb) bylo důkladně omyto DMEM (Nissui Pharmaceutical). Omyté buňky pak byly smíchány s 1,5 x 10⁷ myších slezinných buněk P3-X63-Ag8.653 (653) připravené podle c) a výsledná směs byla minut centrifugována při 800 ot/min.

Skupina buněk obsahující směs slezinných buněk a P3-X63-Ag8.653 (653) byla sebrána jako peleta a byla rozrušena. Předem byl připraven 50% roztok polyethylen glykolu 4000 s DMEM a tento roztok byl nakapán na polámané buňky v průběhu 1 minuty při míchání o rychlosti 2 ml/min. Pak bylo k buněčnému přípravku přidáno DMEM podobným způsobem po dobu 1 minuty při rychlosti 2 ml/min. Tento postup byl ještě jednou opakován u obou roztoků, tj. polyethylen glykolu a DMEM. Nakonec bylo přidáno 16 ml DMEM postupně v průběhu 3 minut. Výsledný buněčný přípravek pak byl centrifugován 6 minut při 800 ot/min. Výsledný supematant byl odebrán, buňky resuspendovány v 35ml kompletního GIT obsahujícího 5 až 10 ng/ml myšího IL-6.

(e) Screening hybridomů

Do každé komůrky 96ti komůrkové destičky (Sumitomo Bakelite) bylo naneseno 100 μΐ suspenze připravené podle d). Pak byla destička inkubována při 37 °C v inkubátoru s 7,5% CO₂. Po dnech inkubace bylo do každé komůrky přidáno 50μ1 HAT média. Po dalších 4 dnech inkubace bylo do každého přidáno dalších 50 μΐ HAT média. Poté následovaly další 3 dny inkubace. Po této době byl z každé komůrky, u které byl pozorován růst kolonií fúzovaných buněk, odebrán vzorek supematantu a byl testován titr protilátek anti-KM31-7 ELISA testem na pevné fázi popsaném v b). Médium odebrané na vzorky bylo ihned nahrazeno HT médiem.

(f) Klonování

Klonování buněk z komůrek, které byly označeny jako pozitivní opakovaně třikrát analýzou omezeného ředění. Tyto klony, u kterých byl pozorován stálý titr protilátek, byly vybrány pro použití jako hybridomové linie buněk produkujících anti-KM31-7 monoklonální protilátky. V tomto stadiu byl proveden test ELISA nejen, jak bylo popsáno v b), ale rovněž jako kontrolní ELISA, přičemž byl použit bezsérový supematant z kultury získaný zCOS-1 buněk transfekovaných pcDL-pSRa296 pro přípravu pevné fáze. Proto byly pro klonování vybrány ty

-49CZ 293582 B6 buněčné linie, které reagovaly v dřívějším ELISA testu, ale nereagovaly v pozdějším kontrolním ELISA testu.

(g) Purifíkace monoklonální protilátky

Z kultury hybridomové buněčné linie produkující anti-KM31-7 monoklonální protilátku byl sebrán supematant, sterilizován filtrem 0,22 pm (Millipore), a pak byla protilátka purifikována pomocí MAbTrap GII (Pharmacia).

(h) Analýza monoklonální protilátky

1) Antigenní specifita monoklonální protilátky

Imunologickým precipitačním testem s použitím bezsérového supernatantu odebraného z kultury COS-1 buněk transfekovaných pSRa31-7 bylo potvrzeno, že monoklonální protilátka je specifická pro KM31-7 protein.

2) Klasifikace monoklonální protilátky

Tento test byl proveden s použitím soupravy izotypů monoklonálních protilátek (Amersham). Bylo stanoveno, že protilátka patří do podtřídy IgGl.

Příklad 17

Izolace a purifíkace proteinu KM31-7 používající reakci antigen-protilátka

To bylo provedeno podle postupu uvedeného v příkladu 16 h) 1). Stejný test byl opakován s použitím supernatantu s protilátkou a bezsérového supernatantu získaných z COS-1 buněk transfekovaných pcDL-pSRa296.

1,4 pg monoklonální protilátky bylo přidáno k 1,7 ml každého bezsérového supernatantu a reakce probíhala při pokojové teplotě 1 hodinu při centrifugování v 20ot/min v mikrozkumavkách 2,2 m. Kontrola byla provedena s použitím bezsérového supernatantu získaného z COS-1 buněk transfekovaných pSRa31-7, avšak bez přidání monoklonální protilátky.

Do každé zkumavky bylo pro adsorpci protilátky přidáno 30 μΐ Proteinu G Sepharose 4 Fast Flow (Pharmacia), který byl předem promyt 0,1% Tweenem 20/PBS, a centrifugace pokračovala dalších 30 minut při laboratorní teplotě a rychlosti 20 ot/min.

Po této době byla každá směs centrifugována několik vteřin při 10 000 ot/min v mikrocentrifuze a supematant byl opatrně odstraněn, aby nedošlo k žádným ztrátám sedimentu. Pelety pak byly jednotlivě omyty 0,1% Tweenem 20/PBS, centrifugovány v mikrocentrifuze a opět omyty, to vše celkem pětkrát.

Výsledný sediment byl resuspendován ve vzorkovém pufru pro SDS-PAGE obsahujícím 10 μΐ 2-merkaptoetanolu. Každá suspenze byly 2 minuty ohřívána při 90 °C a pak byla provedena SDS-PAGE v 12,5% gelu v redukčních podmínkách. Po elektroforéze byl produkt převeden z polyakrylamidového gelu na nitrocelulózový film (BIO-RAD). Western blotting byl proveden s použitím polyklonální anti-KM31-7 protilátky popsané v příkladu 1 části (a). Bylo stanoveno, že monoklonální protilátka anti-KM31-7 specificky precipituje protein KM31-7 z bezsérového supernatantu z kultury COS-l/pSRa31-7.

- 50CZ 293582 B6

Příklad 18

Příprava fuzního proteinu CYVV-NIa/KM31-7

Aby mohl být protein KM31-7 exprimován technikou CYVV-NIa proteázy, je nutné spojit 3'konec genu pro NIa ve stejném ORF jako je DNA pro protein KM31-7. Proto byly provedeny následující dvoustupňové postupy.

i) Zavedení 3'-postranního řetězce (Smal-Xbal, 1006 bp) KM31-7 cDNA do pKSUN9

Plazmid pSRa31-7 byl štěpen restrikčními enzymy Smál a Xbal, aby byl získán Smal-Xbal fragment o 1006 bp obsahující 3'-konec KM31-7 cDNA. Výsledný fragment byl odebrán a purifikován v 0,8% agarózovém gelu při použití GENECLEANII (Funakoshi Japan).

Mezitím bylo podobným způsobem štěpeno Smál a Xbal 5 mg plazmidové DNA pKSUN9 a vzniklé fragmenty byly defosforylovány hovězí alkalickou fosfatázou (Alkaline Phosphatase E. coli Cl5, Takara Shuzo, Japan). Výsledná defosforylovaná linearizovaná DNA byla ligována s fragmentem Smal-Xbal KM31-7 pomocí ligační soupravy (Takara Shuzo) a takto připravený konstrukt byl použit k transformaci kmene E. coli JM109. Transformanti byli selektováni a testováni, aby byl nalezen klon pNIa31-7SX obsahující fragment Smal-Xbal.

ii) Spojení proteázy NIa a KM31-7

Aby mohl být C-konec sekvence NIa spojen sN-koncem sekvence KM31-7, subtypu majícího valin na N-konci ve stejném čtecím rámci, byly připraveny čtyři typy příměrů pro PCR využívající Perkin-Elmer Japan Applied Biosystems Model 392 DNA Synthesizer. Primery jsou následující:

5'GGT CAG CAC AAA TTT CCA 3'

5'AAA CAC AAC TTG GAA TGA ACA ATT 3'

5'TCA TTC CAA GTT GTG TTT GTG AAA 3'

5'CAT AGG ATG CTC CAA CAA 3' sekv. č. ID: 14 (1) sekv. č. ID: 16 (2) sekv. č. ID: 17 (3) sekv. č. ID: 18 (4)

První kolo PCR bylo provedeno s použitím 1 pg plazmidové DNA pKSUN9 jako templátu. Do reakce bylo vloženo 100 pmol každého primeru (l)a(2)a 1/10 objemu desetinásobné koncentrace roztoku reakčního pufru Taq polymerázy a nakonec 5 jednotek Taq polymerázy (Takara Shuzo) v uvedeném pořadí. PCR reakce byla nejdříve provedena 3 minuty při 72 °C. Pak následovalo 30 cyklů: 1 minuta při 94 °C, 2 minuty při 55 °C a 3 minuty 72 °C, zakončeno reakcí 10 minut při 72 °C. Po PCR reakci byl znásobený DNA produkt podroben elektroforéze v 8% polyakrylamidovém gelu. Proužky gelu obsahující DNA byly určeny barvením ethidiumbromidem a byly vystřiženy. K rozlámaným proužkům bylo přidáno 300 μΐ elučního pufru (0,5 octan amonný, 1 mM EDTA, pH 8,0) a pak následovala inkubace přes noc při 37 °C. Centrifugací se získal supematant, který obsahoval purifíkovanou a amplifikovanou DNA.

Opět byla provedena PCR podobným způsobem při použití 1 pg pUCKM31-7 plazmidové DNA jako templátu a primerů (3) a (4). Výsledná DNA byla purifíkována jako předtím.

Amplifikovaný fragment z první PCR obsahoval sekvenci kódující zbytky zN-konce proteinu KM31-7 počínaje Val-Val-Phe přes 31 bp proti směru exprese od místa Xhol v NIa. Amplifikovaný fragment z druhé PCR obsahoval sekvenci kódující Asn-Cys-Ser-Phe-Gln z Ckonce NIa přes 32 bp po směru exprese od místa Smál v cDNA KM31-7.

Při PCR provedené s použitím obou fragmentů DNA vzniklých z uvedených dvou PCR reakcí spolu s primery (1) a (4) je výsledkem reakce hybridizované vlákno sestávající z 9 bp 3'-konce

-51 CZ 293582 B6

NIa a 15 bp sekvence kódující požadovaný N-konec KM31-7. Tak je možné vytvořit sekvenci fúzované DNA s touto částí jako spojovníkem.

Na základě této logiky bylo provedeno druhé kolo PCR stejným způsobem a znásobený fragment 5 byl pak získán z gelu.

iii) Zavádění NIa/KM31-7 DNA do _PNIa31-7SX pg plazmidové DNA zpNIa31-7SX získané podle i) bylo štěpeno Xhol a Smál a výsledná

DNA byla defosforylována reakcí s hovězí alkalickou fosfatázou. Produkt PCR připravený podle ii) byl rovněž štěpen Xhol a Smál a výsledný fragment byl ligován se štěpeným defosforylovaným pNIa31-7SX pomocí ligační soupravy. Výsledný konstrukt byl použit k transformaci E. coli kmene JMI09.

Transformanti amp^R byly selektováni a testováni. Screening byl proveden digescí Xhol a následnou elektroforézou. Byly vybrány klony mající pouze pruh o 8,0kbp. Plazmidy selektovaných klonů byly pak štěpeny HindlII a opět elektroforeticky rozděleny. Vybraný plazmid měl pruh 330 bp odpovídající části inzertu NIa cDNA. Tento plazmid byl označen pNIa31-7V a obsahoval Xhol a Smál PCR produkt.

Byla určena sekvence bází klonu pNIa31-7 a bylo potvrzeno, že sekvence kódující NIa a KM317 byly spojeny ve stejném otevřeném čtecím rámci a s nezbytnou štěpnou sekvencí Gln-Val umístěnou mezi NIa a proteinem KM31-7.

iv) Produkce proteinu KM31-7

Western blottingem bylo potvrzeno, že pNIa31-7V byl v E. coli funkční a že protein KM-31-7 byl exprimován konstruovaným rekombinantním genem.

Počáteční kultura E. coli nesoucí plazmid pNIa31-7V byla pěstována přes noc za třepání v 3 ml LB média obsahujícího 50pg/ml ampicilinu. Jeden ml této počáteční kultury byl přidán ke 100 ml čerstvého média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a kultivace pokračovala třepáním při 37 °C až do dosažení zákalu 1,0 při OD₆o₀nm. V tomto stadiu bylo přidáno ke kultivačnímu bujónu IPTG do konečné koncentrace lmM a kultura pak byla inkubována v 28 °C další dvě noci za stálého 35 třepání.

Po této době byl 1 ml kultury přenesen do mikrocentrifugační zkumavky a byl centrifugován 5 minut při 15 000 ot/min. Supematant byl odstraněn a peleta byla smíchána s 300 μΐ sterilované vody a 300 μΐ roztoku vzorkového pufru pro SDS-PAGE obsahujícího 2-merkaptoethanol, aby 40 se polámaly usazené buňky. Vzniklá suspenze byla zahřívána 2 minuty v 95 °C a pak bylo 10 μΐ této suspenze použito pro SDS-PAGE v 8% gelu při redukčních podmínkách.

Po elektroforéze byl protein přenesen z gelu na nitrocelulózovou membránu prostřednictvím kontaktu gelu s touto membránou a inkubací v přítomnosti roztoku transkripčního pufru (25 mM 45 Tris-HCl, 1,4% glycin a 20% methanol) při 4 °C po dobu 2,5 hodin v 19 V a s použitím zařízení na transkripci gel - membrána (Marisol Japan).

Nitrocelulózová membrána pak byla omyta 20 ml PBS-T médiem a blokování bylo prováděno 1 h v 20 mi PBS-T obsahujícího 5% odstředěné mléko (Snow Brand Co., Ltd.). Po této době byla 50 membrána omyta dvěma dávkami 20 ml PBS-T a pak ponechána po 90 minut v reakci v 20 ml PBS-T obsahujícího Ιμΐ lOOx ředěného králičího séra anti-KM31-7 (primární protilátka) sterilní vodou. Nitrocelulózový film pak byl omýván dvakrát 15 minut a opět dvakrát po pěti minutách 20 ml PBS-T.

-52CZ 293582 B6

Omytá membrána pak byla umístěna do lázně s 3000x ředěnou kozí protilátkou anti-králičí IgG značenou peroxidázou (BIO-RAD) v PBS-T (použité jako sekundární protilátka výše) a ponechána v lázni 1 hodinu. Pak byla membrána omyta 20 ml PBS-T a přenesena do lázně detekční látky ECL (Amersham). Pruhy, které reagovaly s anti-KM31-7 protilátkou byly určeny autoradiografícky.

Byl proveden Western blotting a byly označeny pruhy mající molekulovou hmotnost přibližně 60 000. Tento pruh vykazoval stejnou mobilitu jako protein mající druhou nejvyšší molekulovou váhu ze tří proteinů KM31-7 detekovaných zbezsérového supematantu získaného transfekcí buněk COS-1 pomocí pSRa.31-7 použitého jako kontroly.

Použité chemikálie a roztoky x M fosfátový pufr x M roztok Na₂HPO₄ upravený na požadované pH pomocí x M roztoku NaH₂PO4.

Inokulační pufr

0,1 M Tris-HCl pufr, pH 7,0,0,05 M EDTA, 1% 2-merkaptoethanol.

Extrakční pufr

0,1 M Tris-HCl pufr, 0,05 M EDTA, 1% 2-merkaptoethanol, pH 7,0.

Degradační roztok

200 mM uhličitan amonný, 2% SDS, 2 mM EDTA, 400mg/ml bentonit a 20 mg/ml proteáza K (pH9,0).

lxSSC

0,15 MNaCl, 0,015 M citrát trisodný, pH 7,0.

Tekuté LB médium g Bacto Tryptonu (Difco), 5 g kvasničného extraktu Bacto yeast (Difco) a 5 g chloridu sodného, vše doplněno do 1 litru destilovanou vodou.

Pufr Tris-Kalcium mM Tris, 50 mM chlorid vápenatý, pH upraveno na 7,4 kyselinou chlorovodíkovou.

Lyzační pufr

0,17 g sacharózy, 250 μΐ 1 M pufru Tris-HCl (pH 8,0), 200 μΐ 0,5 M EDTA (pH 8,0), vše doplněno 20 ml destilovanou vodou.

Roztok alkalického SDS

0,2 M hydroxid sodný, 1% SDS.

Roztok TBE

100 mM Tris, 100 mM kyselina boritá, 1 mM EDTA.

Denaturační roztok

1,5 M chlorid sodný, 0,5 M hydroxid sodný.

Neutralizační roztok

0,5 M Tris, 3 M chlorid sodný (pH 7,4).

50x Denhardtův roztok

1% polyvinil pyrrolidin, 1% hovězí sérumalbumin, 1% Ficoll 400. Tento roztok je pak naředěn destilovanou vodou tak, aby se dosáhla požadovaná koncentrace.

-53CZ 293582 B6

5x denaturační pufr

125 μΐ 1 M glycinu (pH 9,0), 25 μΐ 1 M chloridu hořečnatého, 850 μΐ redestilované vody.

5x značkovací pufr μΐ 1 M Tris-HCI pufru (pH 7,9), 5 μΐ 1 M chloridu hořečnatého, 2,5 μΐ 1 M dithiotreitolu, 9,2 μΐ redestilované vody.

Solný roztok 10 x M9

0,145 M hydrogenfosfát disodný, 0,172 M dihydrogenfosfát draselný, 0,187 M chlorid amonný, 0,137 M chlorid sodný, pH 7,0.

M9 minimální agarové médium ml ΙΟχ M9 solného roztoku, 100 μΐ 1 M síranu hořečnatého, 1 ml 20% glukózy, 50 μΐ 1% soli thiamin hydrochloridu, 1 ml 0,01 M chloridu vápenatého a 13 ml redestilované vody. Vše smícháno, sterilizováno filtrací a pak nalito na misky ihned po přidání 50 ml 3% baktoagaru.

Tekuté SOB médium g baktotryptonu, 2,5 g kvasničného extraktu (bactoyeast), 100 μΐ 5 M chloridu sodného a 125 μΐ 1 M chloridu draselného, vše smícháno dohromady a doplněno do 500 ml destilovanou vodou. Po autoklávování bylo přidáno 5 ml 1 M chloridu hořečnatého a 5 ml síranu hořečnatého.

PufrTFBl ml 1 M 2-(N-morfolino)ethanesulfenová kyselina (MES - upravená na pH 6,2 pomocí 1 N HC1), 6,045 g chloridu rubidného, 0,735 g bihydrátu chloridu vápenatého smíchaného s 4,94 g tetrahydrátu chloridu vápenatého, pH upraveno ledovou kyselinou octovou na 5,8 a doplněno do 500 ml redestilovanou vodou. Sterilováno filtrací.

PufrTFB2 ml 1 M 2-(N-morfolino)propanesulfenové kyseliny (MOPS), 1,102 g bihydrátu chloridu vápenatého, 0,12 g chloridu rubidného a 15 ml glycerolu, smícháno, pH upraveno na 6,5 ledovou kyselinou octovou, do 100 ml doplněno redestilovanou vodou a sterilizováno filtrací.

Tekuté SOC médium ml tekutého SOB média, 90 μΐ 20% glukózy.

Medium 2x YT g baktotryptonu, 5 g kvasničného extraktu (bactoyeast) a 5 g chloridu sodného, smícháno a doplněno do 1 litru redestilovanou vodou.

Medium PBS-Tw mM hydrogenfosfát disodný, 20 mM dihydrogenfosfát sodný, 100 mM chlorid sodný, 0,1% Tween 20.

Médium PBS-T g chloridu sodného, 0,1 g dihydrogenfosfátu draselného, 1,45 g dodekahydrátu hydrogenfosfátu disodného, 0,1 g chloridu draselného a 0,1 g azidu sodného, vše smícháno a doplněno do 1 litru redestilovanou vodou, pH 7,4.

Roztok substrátu alkalické fosfatázy

0,01 % p-nitrofenylfosfátu rozpuštěného v 10% vodném roztoku diethanolaminu, který byl upraven na pH 9,8 kyselinou chlorovodíkovou.

-54CZ 293582 B6

Médium A

DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium, obsahující 4,5 g/1 glukózy), 10% inaktivované fetální hovězí sérum (Hyclone) a 10 mM HEPES (pH 7,2).

Médium B

DMEM (obsahující 4,5 g/1 glukózy) 10 mM HEPES (pH 7,2), 3% inaktivované hovězí fetální sérum, 5 pg/ml hovězího inzulínu (výroba Sigma), 8 pg/ml d-biotinu (výroba Sigma), 4 mg/ml kyseliny panthotenové (výroba Sigma), 1,0 mM dexamethason (Sigma) a 0,5 mM izobutylmethyxantin (Aldrich).

Médium C

DMEM (obsahující 4,5 g/1 glukózy), 5% inaktivovaného hovězího fetálního séra, 10 mM HEPES (pH 7,2), 100 ng/ml hovězího inzulínu a 10 U/ml heparinu sodného (výroba Novo Industry Co.).

Roztok substrátu LPL mM glycerol tri-[9,10(n)-³H] oleát (51,8 KBq/pmol, výroba Amersham), 1,3 mg/ml L-afosfatidylcholin distearoyl (výroba Sigma Co.), 20 mg/ml hovězí serumalbumin (výroba Sigma, co.), 135 mM Tris hydrochlorid [Tris-HCl (pH 8,1), výroba Sigma Co.], 16,5% (v/v) glycerol a 16,5% (v/v) inaktivované hovězí fetální sérum.

Roztok guanidin thiokyanátu

M guanidin thiokyanát, 1% sarkosyl, 20 mM kyselina ethylenediamintetraoctová (EDTA), 25 mM citrát sodný (pH 7,0), 100 mM 2-merkaptoethanol a 0,1% antifoam A (Sigma).

Adsorpční pufr

0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA a 0,1% SDS.

Eluční roztok mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA a 0,05% SDS.

Reakční roztok reverzní transkriptázy vzorku 2 ml Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl₂, 30 mM KC1, 0,3 mM dithiothreitol, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dTTP, 10 pCi[a-³²P]dCTP a 1,4 pg vektoru primerové-DNA (3'-oligo(dT)koncový pcDV-1, Pharmacia).

Reakční roztok terminální transferázy

140 mM kakodylát draselný, 30 mM Tris-HCl (pH 6,8), lmM CoCl₂, 0,5 mM dithiothreitol, 0,2 pg polyA a lOOmM dCTP.

Pufr pro restrikční enzym mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂ a 1 mM dithiotreitol.

10-objemů ligačního pufru mM ATP, 660 mM Tris-HCl (pH 7,5), 66 mM MgCl₂ a 100 mM dithiotreitol.

Elektroforetický pigment

50% glycerol, 0,01M hydrogenfosfát disodný (pH 7,0) a bromfenolová modř.

lxTAE

0,04 M Tris-acetát, 0,001 M EDTA.

lx SSCP

120 mM NaCl, 15 mM citrát sodný, 13 mM dihydrogenfosfát draselný a 1 mM EDTA.

-55CZ 293582 B6

Reakční roztok pro reverzní transkriptázu vzorku 6 lx pufr syntézy prvního vlákna, 5% pyrofosfát sodný, 100 jednotek inhibitoru ribonukleázy, 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dTTP, 0,5 mM dCTP a 3,75 pg primeru oligo(dT), vše poskytováno v cDNA Cloning Systém (Amersham).

SM pufr

100 mM NaCl, 8 mM MgSO4.7H20, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) a 0,01 % želatina.

Dialyzační pufr mM fosfátový pufr (pH 7,8) a 0,5 M NaCl.

Kolonový pufr mM Tris-HCl (pH 7,4), 200 mM NaCl a 1 mM EDTA.

Roztok reakčního pufru pro Taq polymerázu

Taq obsahující 500 mM Tris-HCl (pH 8,3), 500 mM KC1, 15 mM MgC12, 100 mM dATP,

100 mM dCTP, 100 mM dGTP, 100 mM dTTP a 2 mg/ml želatiny.
Přehled sekvencí
Sekvenční č.ID:	1
Délka sekvence:	1320
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Počet vláken:	dvouvláknová
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	cDNA na mRNA
Anti-sense:	ne
Původní zdroj: Organizmus: Vlastnosti:	CYVV
1 - 1320ECDS
10-1311 E	mat-peptid
Popis sekvence:

AAG TTC CAA GGG AAA AGT AAS AGA ACA AGA CAA AAG

TTG AAG TTC AGA

48

Lys Phe Gin Gly Lys Ser Lys Arg Thr Arg

Gin Lys

Leu

Lys Phe 15

Arg

1

5

10

GCG

GCA

AGA

GAC

ATG

AAG

GAT

CGT

TAT

GAA

GTG

CAT

GCC

GAT

GAG

GGG

96

Ala

Ala

Arg Asp

Met

Lys

Asp Arg

Tyr

Glu

Val

His

Ala

Asp

Glu

Gly

20

25

30

ACT

TTA GTG

GAA

AAT

ΤΤΓ

GGA

ACT

CGT

TAT

TCA

AAG

AAA

GGC

AAG

ACA

144

Thr

Leu

Val

Glu

Asn

Phe

Gly

Thr

Arg

Tyr

Ser

Lys

Lys

Gly

Lys

Thr

35

40

45

AAA

GGT

ACT

GTT

GTG

GGT

TTG

GGT

GCA

AAA

ACA

AGA

CGG

TTC

ACT

AAC

192

Lys

Gly

Thr

Val

Val

Gly

Leu

Gly

Ala

Lys

Thr

Arg

Arg

Phe

Thr

Asn

50

55

60

-56CZ 293582 B6

ATG Met 65

TAT GGT TTT

GAC CCC

ACG GAG TAT

TCA TTT GCT AGG TAT CTT GAT

240

Tyr

Gly

Phe

Asp

Pro 70

Thr

Glu Tyr

Ser

Phe Ala 75

Arg Tyr Leu Asp 80

CCA

ATC

ACG

GGT

GCA

ACA

TTG

GAT

GAA

ACC

CCA

ATT

CAC

AAT

GTA

AAT

288

Pro

Ile

Thr

Gly

Ala 85

Thr

Leu

Asp

Glu

Thr 90

Pro

Ile

His

Asn

Val 95

Asn

TTG

GTT

GCT

GAG

CAT

TTT

GGC

GAC

ATA

AGG

CTT

GAT

ATG

GTT

GAC

AAG

336

Leu

Val

Ala

Glu 100

His

Phe

Gly Asp

Ile 105

Arg

Leu

Asp

Met

Val 110

Asp

Lys

GAG

TTA

CTT

GAC

AAA

CAG

CAC

TTA

TAC

CTC

AAG

AGA

CCA

ATA

GAA

TGT

384

Glu

Leu

Leu 115

Aap

Lys

Gin

His

Leu 120

Tyr

Leu

Lys

Arg

Pro 125

Ile

Glu

Cys

TAC

TTT

GTA

AAG

GAT

GCT

GGT

CAG

AAG

GTG

ATG

AGG

ATT

GAT

CTA

ACA

432

Tyr

Phe 130

Val

Lys

Asp

Ala

Gly 135

Gin

Lys

Val

Met

Arg 140

Ile

Asp

Leu

Thr

CCC

CAC

AAC

CCA

TTG

TTG

GCA

AGC

GAT

GTT

AGC

ACA

ACC

ATA

ATG

GGT

480

Pro 145

His

Asn

Pro

Leu

Leu 150

Ala

Ser

Asp

Val

Ser 155

Thr

Thr

Ile

Met

Gly 160

TAT

CCT

GAG

AGA

GAA

GGT

GAA

CTC

CGT

CAA

ACT

GGA

AAG

GCA

AGG

TTA

528

Tyr

Pro

Glu

Arg

Glu 165

Gly

Glu

Leu

Arg

Gin 170

Thr

Gly

Lys

Ala

Arg 175

Leu

GTC

GAC

CCA

TCA

GAG

TTG

CCC

GCG

CGG

AAT

GAG

GAT

ATT

GAT

GCA

GAG

576

Val

ASp

Pro

Ser 180

Glu

Leu

Pro

Ala

Arg 185

Asn

Glu

Asp

Ile

Asp 190

Ala

Glu

TTT

GAG

AGT

CTA

AAT

CGC

ATA

AGT

GGT

TTG

CGC

GAC

TAT

AAT

CCC

ATT

624

Phe

G1U

Ser 195

Leu

Asn

Arg

Ile

Ser 200

Gly

Leu

Arg Asp Tyr 205

Asn

Pro

Ile

TCA

CAA

AAT

GTT

TGC

TTG

CTA

ACA

AAT

GAG

TCA GAA

GGC

CAT

AGA

GAG

672

Ser

Gin

Asn

Val

Cys

Leu

Leu

Thr

Asn

Glu

Ser

Glu

Gly

His

Arg

Glu

210 215 220

-57CZ 293582 B6

AAG ATG TTT GGA ATT GGA TAT GGT TCA GTG ATC ATT ACA AAT CAA CAT

720

Lys 225

Mec

Phe

Gly

Ile Gly 230

Tyr

Gly

Ser

Val

Ile 235

Ile Thr

Asn Gin His 240

CTG

TTC

AGA

AGG

AAT

AAT

GGG

GAG

TTA

TCA

ATT

CAA

TCC

AAG

CAT

GGC

768

Leu

Phe

Arg

Arg

Asn

Asn

Gly

Glu

Leu

Ser

Ile

Gin

Ser

Lys

His

Gly

245

250

255

TAC

TTC

AGA

TGC

CGC

AAC

ACC

ACA AGC TTG

AAG

ATG

CTG

CCT

TTG

GAG

816

Tyr

Phe

Arg

Cys

Arg

Asn

Thr

Thr

Ser

Leu

Lys

MeC

Leu

Pro

Leu

Glu

260

265

270

GGA

CAT

GAC

ATT

TTG

TTG

ATT

CAG

TTA

CCA

AGG

GAC

TTT

CCA

GTG

TTT

864

Gly

His

Asp

Ile

Leu

Leu

Ile

Gin

Leu

Pro

Arg

Asp

Phe

Pro

Val

Phe

275

280

285

CCA

CAA

AAG

ATT

CGC

TTT

AGG

GAG

CCA

AGA GTG

GAT

GAC

AAA

ATT

GTT

912

Pro

Gin

Lys

Ile

Arg

Phe

Arg

Glu

Pro

Arg

Val

Asp

Asp

Lys

Ile

Val

290

295

300

TTG

GTC

AGC

ACA

AAT

TTC

CAG

GAA AAG

AGT

TCC

TCG

AGC

ACG

GTC

TCA

960

Leu

Val

Ser

Thr

Asn

Phe

Gin

Glu

Lys

Ser

Ser

Ser

Ser

Thr

Val

Ser

305

310

315

320

GAG

TCC

AGT

AAC

ATT

TCA

AGA

GTG

CAG

TCA

GCC

AAT

TTC

TAC

AAG

CAT

1008

Glu

Ser

Ser

Asn

Ile

Ser

Arg

Val

Gin

Ser

Ala

Asn

Phe

Tyr

Lys

His

325

330

335

TGG

ATC

TCA

ACA

GTA

GCA

GGA

CAC

TGT

GGA

AAC

CCT

ATG

GTT

TCG

ACT

1056

Trp

Ile

Ser

Thr

Val

Ala

Gly

His

Cys

Gly

Asn

Pro

Met

Val

Ser

Thr

340

345

350

AAA

GAT

GGA

TTT

ATT

GTA

GGT

ATC

CAC

AGT

CTT

GCT

TCA

TTG

ACA

GGC

1104

Lys

Asp

Gly

Phe

Ile

Val

Gly

Ile

His

Ser

Leu

Ala

Ser

Leu

Thr

Gly

355

360

365

GAC

GTT

AAC

ATC

TTC

ACA

AGC

TTT

CCG

CCG

CAG

TTT

GAG

AAC

AAA

TAT

1152

Asp

Val

Asn

Ile

Phe

Thr

Ser

Phe

Pro

Pro

Gin

Phe

Glu

Asn

Lys

Tyr

370

375

380

-58CZ 293582 B6

CTA CAG Leu Gin 385

AAG CTC AGT

GAA CAC ACA TGG TGT AGT GGA TGG AAA CTA AAT 1200

Lys

Leu Ser

Glu His 390

Thr

Trp

Cys Ser Gly Trp Lys Leu Asn

395

400

CTT

GGA

AAG

ATT

AGT

TGG

GGT

GGA

ATC

AAC

ATT

GTG

GAG

GAT

GCA

CCT

1248

Leu

Gly

Lys

Ile

Ser

Trp

Gly

Gly

Ile

Asn

Ile

Val

Glu

Asp

Ala

Pro

405

410

415

GAA

GAG

CCC

TTT

ATA

ACA

TCC

AAG

ATG

GCA

AGC

CTT

CTT

AGT

GAT

TTG

1295

Glu

Glu

Pro

Phe

Ile

Thr

Ser

Lys

Met

Ala

Ser

Leu

Leu

Ser

Asp

Leu

420

425

430

AAT

TGT

TCA

TTC

CAA

GCA

AGT

GCG

1320

Asn

Cys

Ser

Phe

Gin

Ala

Ser

Ala

435

440

Sekvenční č.ID:	2
Délka sekvence:	440
5 Typ sekvence:	aminokyseliny
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	protein
Anti-sense:	ne
Původní zdroj:
10 Organizmus:	CYVV
Vlastnosti:

- 437 E mat-peptid

Popis sekvence:

Lys Phe Gin Gly Lys Ser Lys

Arg

Thr Arg Gin Lys Leu Lys Phe Arg

1

5

10

15

Ala

Ala

Arg

Asp

Met

Lys

Asp

Arg

Tyr

Glu

Val

His

Ala

Asp

Glu

Gly

20

25

30

Thr

Leu

Val

Glu

Asn

Phe

Gly

Thr

Arg

Tyr

Ser

Lys

Lys

Gly Lys

Thr

35

40

4S

Lys

Gly

Thr

Val

Val

Gly

Leu

Gly

Ala

Lyš

Thr

Ařg

Arg

Phe

Thr

Asn

50

55

60

-59CZ 293582 B6

Met Tyr Gly 65

Phe Asp

Pro 70

Thr Glu Tyr Ser Phe Ala Arg Tyr Leu Asp

75

80

Pro

lle

Thr

Gly

Ala

Thr

Leu

Asp

Glu

Thr

Pro

lle

His

Asn

Val

Asn

85

90

95

Leu

val

Ala

Glu

His

Phe

Gly Asp

lle

Arg

Leu

Asp

Met

val

Asp

Lys

100

105

110

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Gin

His

Leu

Tyr

Leu

Lys

Arg

Pro

lle

Glu

Cys

115

120

125

Tyr

Phe

Val

Lys Asp

Ala

Gly

Gin

Lys

Val

Met

Arg

lle

Asp

Leu

Thr

130

135

140

Pro

His

Asn

Pro

Leu

Leu

Ala

Ser

Asp

Val

Ser

Thr

Thr

Xla

Met

Gly

145

150

155

160

Tyr

Pro

Glu

Arg

Glu

Gly

Glu

Leu

Arg

Gin

Thr

Gly Lys

Ala

Arg

Leu

165

170

175

Val

Asp

Pro

Ser

Glu

Leu

Pro

Ala

Arg

Asn

Glu

Asp

lle Asp

Ala

Glu

180

185

190

Phe

Glu

Ser

Leu

Asn

Arg

lle

Ser

Gly

Lau

Arg Asp Tyr

Asn

Pro

lle

195

200

205

Ser

Gin

Asn

Val

Cys

Leu

Leu

Thr

Asn

Glu

Ser

Glu

Gly

His

Arg

Glu

210

215

220

Lys

Met

Phe

Gly

lle

Gly Tyr Gly

Ser

Val

lle

lle

Thr

Asn

Gin

His

225

230

235

240

Leu

Phe

Ar? Arg

Asn

Asn

Gly

Glu

Leu

Ser

lle

Gin

Ser

Lys

His

Gly

245

250

255

Tyr

Phe

Arg

Cys Arg

Asn

Thr

Thr

Ser

Leu

Lys

Met

Leu

Pro

Leu

Glu

260

265

270

Gly

His

Asp

lle

Leu

Leu

lle

Gin

Leu

Pro

Arg

Asp

Phe

Pro

Val

Phe

275

280

285

Pro

Gin

Lys

lle

Arg

Phe

Arg

G1U

Pro

Arg

Val

Asp

Asp

Lys

lle

Val

290

295

300

Leu

Val

Ser

Thr

Asn

Phe

Gin

G1U

Lys

Ser

Ser

Ser

Ser

Thr

Val

Ser

305

310

315

320

G1U

Ser

Ser

Asn

ile

Ser

Arg

Val

Gin

Ser

Ala

Asn

Phe

Tyr Lys

His

32S

330

335

Trp

lle

Ser

Thr

Val

Ala

Gly

His

Cys

Gly

Asn

Pro

Met

val

Ser

Thr

340

345

350

Lys

Asp

Gly

Phe

lle

Val

Gly

lle

His

Ser

Leu

Ala

Ser

Leu

Thr

Gly

355 360 36S

Asp Val Asn Ile Phe Thr Ser Phe Pro Pro Gin Phe Glu Asn Lys Tyr

370

375

380

Leu

Gin

Lys

Leu

Ser

Glu

His

Thr

Trp

Cys

Ser

Gly Trp

Lys

Leu

Asn

385

390

395

400

Leu

Gly

Lys

Ile

Ser

Trp Gly Gly

Ile

Asn

Ile

Val

Glu

Asp

Ala

Pro

405

410

415

Glu

Glu

Pro

Phe

Ile

Thr

Ser

Lys

Met

Ala

Ser

Leu

Leu

Ser

Asp

Leu

420

425

430

Asn

Cys

Ser

Phe

Gin

Ala

Ser

Ala

435

440

Sekvenční Č.ID:	3
Délka sekvence:	25
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	další typy DNA, syntetická DNA
Anti-sense:	ne

Popis sekvence:

GTCCATGGGG AAAAGTAAGA GAACA25

Sekvenční č.ID:	4
Délka sekvence:	20
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	další typy DNA, syntetická DNA

Popis sekvence:

ACTCTGAGAC CGTGCTCGAG20

Sekvenční č. ID:	5
Délka sekvence:	20
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	další typy DNA, syntetická DNA

Popis sekvence:

AGGAAAGAG TTCCTCGAGC17

Sekvenční č. ID:	6
Délka sekvence:	36
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	další typy DNA, syntetická DNA

Popis sekvence:

AATTGTTCAT TCCAAGCACC TGGGCCACCA CCTGGC 36

-61 CZ 293582 B6

Sekvenční č. ID:	7
Délka sekvence:	36
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	další typy DNA, syntetická DNA

Popis sekvence:

GCCAGGTGGT GGCCCAGGTG CTTGGAATGA ACAATT 36

Sekvenční č.ID:	8
Délka sekvence:	30
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Topologie:	lineami
Typ molekuly:	další typy DNA, syntetická DNA

Popis sekvence:

TTGTCAGCAC ACCTGGGAGC TGTAGAGCTC 25

Sekvenční č. ID:	9
Délka sekvence:	7
Typ sekvence:	aminokyseliny
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	protein

Popis sekvence:

Ala Pro Gly 1	Pro Pro Pro Gly 7 5
Sekvenční č. ID:	10
Délka sekvence:	7
Typ sekvence:	aminokyseliny
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	protein

Popis sekvence:

Pro Gly Pro 1	Pro Pro Gly Pro 7 5
Sekvenční č. ID:	11
Délka sekvence:	1650
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Počet vláken:	dvouvláknová
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	cDNA na mRNA

Původní zdrojový organizmus: Homo sapiens Vlastnosti:

Charakteristika exprese symbolu: CDS

Umístění: 1..1647

Metoda pro stanovení charakteristiky: E Charakteristika exprese symbolu: mat_peptid

-62CZ 293582 B6

Umístění: 70..1647

Metoda pro stanovení charakteristiky: sig peptid

Umístění: 1..69

Metoda pro stanovení charakteristiky: E

Sekvence:

ATG Met -23

TCA TGT GAG GAC GGT CGG GCC CTG GAA GGA ACG CTC TCG GAA TTG

48

Ser

Cys

Glu -20

Asp Gly

Arg Ala

Leu -IS

Glu Gly

Thr

Leu Ser Glu Leu -10

GCC

GCG

GAA

ACC

GAT

CTG

CCC

GTT

GTG

TTT

GTG

AAA

CAG

AGA

AAG

ATA

96

Ala

Ala

Glu

Thr

Asp

Leu

Pro

Val

Val

Phé

Val

Lys

Gin

Arg

Lys

Ile

-5

1

5

GGC

GGC

CAT

GGT

CCA

ACC

TTG

AAG

GCT

TAT

CAG

GAG

GGC

AGA

CTT

CAA

144

Gly

Gly

His

Gly

Pro

Thr

Leu

Lys

Ala

Tyr

Gin

Glu

Gly

Arg

Leu

Gin

10

IS

20

25

AAG

CTA

CTA

AAA

ATG

AAC

GGC

CCT

GAA

GAT

CTT

CCC

AAG

TCC

TAT

GAC

192

Lys

Leu

Leu

Lys

Met

Asn

Gly

Pro

Glu

Asp

Leu

Pro

Lys

Ser

Tyr

Asp

30

35

40

TAT

GAC

CTT

ATC

ATC

ATT

GGA

GGT

GGC

TCA

GGA

GGT

CTG

GCA

GCT

GCT

240

Tyr

Asp

Leu

Ile

Ile

Ile

Gly Gly Gly

Ser

Gly Gly

Leu

Ala

Ala

Ala

45

50

55

AAG

GAG

GCA

GCC

CAA

TAT

GGC

AAG

AAG

GTG

ATG

GTC

CTG 1

SAC TTT GTC

288

Lys

Glu

Ala

Ala

Gin

Tyr

Gly

Lys

Lys

Val

Met

Val

Leu

Asp :

Phe Val

60

65

70

ACT

CCC

ACC

CCT

CTT

GGA

ACT

AGA

TGG

GGT

CTT

GGA

GGA

ACA '

TGT GTG

336

Thr

Pro

Thr

Pro

Leu

Gly

Thr

Arg

Trp

Gly

Leu

Gly

Gly

Thr

Cys

Val

75

80

85

AAT

GTG

GGT

TGC

ATA

CCT

AAA

AAA

CTG

ATG

CAT

CAA

GCA

GCT

TTG

TTA

384

Asn

Val

Gly

Cys

Ile

Pro

Lys

Lys

Leu

Met

His

Gin

Ala

Ala

Léu

Leu

90

95

100

105

GGA

CAA

GCC

CTG

CAA

GAC

TCT

CGA

AAT

TAT

GGA

TGG

AAA GTC

GAG

GAG

432

Gly

Gin

Ala

Leu

Gin

Asp

Ser

Arg

Asn

Tyr

Gly

Trp

Lys

val

Glu

Glu

110

115

120

ACA

GTT

AAG

CAT

GAT

TGG

GAC

AGA

ATG

ATA

GAA

GCT

GTA

CAG

AAT

CAC

480

Thr

Val

Lys

His

Asp Trp Asp Arg

Met

Ile

Glu

Ala

Val

Gin

Asn

His

125

130

135

-63CZ 293582 B6

528

ATT GGC TCT TTG AAT TGG Ile Gly Ser Leu Asn Trp 140

GGC TAC CGA GTA GCT CTG

CGG GAG AAA AAA Arg Glu Lys Lys 150

Gly Tyr 145

Arg

Val Ala Leu

GTC

GTC

TAT

GAG

AAT

GCT

TAT GGG

CAA

TTT

ATT

GGT

CCT

CAC

AGG

ATT

Val

Val

Tyr

Glu

Asn

Ala

Tyr Gly

Gin

Phe

Ile

Gly

Pro

His

Arg

Ile

155

160

165

AAG

GCA

ACA

AAT

AAT

AAA

GGC AAA

GAA

AAA

ATT

TAT

TCA

GCA

GAG

AGA

Lys

Ala

Thr

Asn

Asn

Lys

Gly Lys

Glu

Lys

Ile

Tyr

Ser

Ala

Glu

Arg

170

175

180

185

576

624

TTT Phe

CTC ATT GCC

ACT GGT GAA AGA

CCA CGT TAC TTG GGC ATC CCT GGT

672

Leu

Ile Ala

Thr 190

Gly

Glu Arg

Pro

Arg 195

Tyr

Leu Gly Ile

Pro Gly 200

GAC

AAA

GAA

TAC

TGC

ATC

AGC

AGT

GAT

GAT

CTT

TTC

TCC

TTG

CCT

TAC

720

ASp

Lys

Glu

Tyr

Cys

Ile

Ser

Ser

Asp

Asp

Leu

Phe

Ser

Leu

Pro

Tyr

205

210

215

TGC

CCG

GGT

AAG

ACC

CTG

GTT

GTT

GGA

GCA

TCC

TAT

GTC

GCT

TTG

GAG

768

Cys

Pro

Gly

Lys

Thr

Leu

Val

Val

Gly

Ala

Ser

Tyr

val

Ala

Leu

Glu

220

225

230

TGC

GCT

GGA

TTT

CTT

GCT

GGT

ATT

GGT

TTA

GAC

GTC

ACT

GTT

ATG

GTT

816

Cys

Ala

Gly

Phe

Leu

Ala

Gly

Ile

Gly

Leu

Asp

Val

Thr

Val

Met

Val

235

240

245

AGG

TCC

ATT

CTT

CTT

AGA

GGA

TTT

GAC

CAG

GAC

ATG

GCC

AAC

AAA

ATT

864

Arg

Ser

Ile

Leu

Leu

Arg

Gly

Phe

Asp

Gin

Asp

Met

Ala

Asn

Lys

Ile

250

255

260

265

GGT

GAA

CAC

ATG

GAA

GAA

CAT

GGC

ATC

AAG

TTT

ATA

AGA

CAG

TTC

GTA

912

Gly

Glu

His

Met

Glu

Glu

His

Gly

Ile

Lys

Phe

Ile

Arg

Gin

Phe

val

270

275

280

CCA ATT

AAA

GTT

GAA

CAA

ATT

GAA

GCA

GGG

ACA

CCA

GGC

CGA

CTC

AGA

960

Pro

Ile

Lys

val

G1U

Gin

Ile

Glu

Ala

Gly

Thr

Pro

Gly Arg

Leu

Arg

285

290

295

GTA

GTA

GCT

CAG

TCC

ACC

AAT

AGT

GAG

GAA

ATC

ATT

GAA GGA

GAA

TAT

1008

Val

Val

Ala

Gin

Ser

Thr

Asn

Ser

Glu

Glu

Ile

Ile

Glu Gly

Glu

Tyr

300 305 310

64CZ 293582 B6

AAT ACG GTG ATG CTG GCA ATA GGA AGA GAT GCT TGC ACA AGA AAA ATT 1056

Asn Thr val Mee Leu Ala IIe Gly Arg Asp Ala Cya Thr Arg Lys ile

315 320325

GGC TTA GAA ACC GTA GGG GTG AAG ΑΤΑ AAT GAA AAG ACT GGA AAA ATA1104

Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys Ile Asn Glu Lys Thr Gly LysIle

330 335 340345

CCT Pro

GTC ACA

GAT GAA Asp Glu 350

GAA Glu

CAG ACC AAT GTG CCT TAC ATC TAT GCC ATT 1152

Val

Thr

Gin

Thr

Asn

Val Pro 355

Tyr Ile Tyr

Ala 360

Ile

GGC

GAT

ATA

TTG

GAG

GAT

AAG

GTG

GAG

CTC

ACC

CCA

GTT

GCA

ATC

CAG

1200

Gly

ASp

Ile

Leu

Glu

Asp

Lys

Val

Glu

Leu

Thr

Pro

val

Ala

Ile

Gin

365

370

375

GCA

GGA

AGA

TTG

CTG

GCT

CAG

AGG

CTC

TAT

GCA

GGT

TCC

ACT

GTC

AAG

1248

Ala

Gly Arg

Leu

Leu

Ala

Gin

Arg

Leu

Tyr

Ala

Gly

Ser

Thr

Val

Lys

380

385

390

TGT

GAC

TAT

GAA

AAT

GTT

CCA

ACC

ACT

GTA

TTT

ACT

CCT

TTG

GAA

TAT

1296

Cys

Asp Tyr

Glu

Asn

Val

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Thr

Pro

Leu

Glu

Tyr

395

400

405

GGT

GCT

TGT

GGC

CTT

TCT

GAG

GAG

AAA

GCT

GTG

GAG

AAG

TTT

GGG

GAA

1344

Gly

Ala

Cys

Gly

Leu

Ser

Glu

Glu

Lys

Ala

Val

Glu

Lys

Phe

Gly

Glu

410

415

420

425

GAA

AAT

ATT

GAG

GTT

TAC

CAT

AGT

TAC

TTT

TGG

CCA

TTG

GAA

TGG

ACG

1392

Glu

Asn

Ile

Glu

Val

Tyr

His

Ser

Tyr

Phe

Trp

Pro

Leu

Glu

Trp

Thr

430

435

440

ATT

CCG

TCA

AGA

GAT

AAC

AAC

AAA

TGT

TAT

GCA

AAA

ATA

ATC

TGT

AAT

1440

Ile

Pro

Ser

Arg

Asp

Asn

Asn

Lys

Cys

Tyr

Ala

Lys

Ile

Ile

Cys

Asn

445

450

455

ACT

AAA

GAC

AAT

GAA

CGT

GTT

GTG

GGC

TTT

CAC

GTA

CTG

GGT

CCA

AAT

1488

Thr

Lys

Asp

Asn

G1U

Arg

Val

Val

Gly

Phe

His

Val

Leu

Gly

Pro

Asn

460

465

470

-65CZ 293582 B6

1536

GCT GGA Ala Gly

GAA Glu

GTT ACA

CAA GGC TTT Gin Gly Phe 480

GCA GCT GCG CTC AAA TGT GGA CTG

val

Thr

Ala Ala

Ala Leu 485

Lyg Cyg Gly

Leu

475

ACC

AAA

AAG

CAG

CTG

GAC

AGC

ACA

ATT

GGA

ATC

CAC

CCT

GTC

TGT

GCA

Thr

Lys

Lys

Gin

Leu

Asp

Ser

Thr

Ile

Gly

Ile

His

Pro

Val

Cys

Ala

490

495

500

505

GAG

GTA

TTC

ACA

ACA

TTG

TCT

GTG

ACC

AAG

CGC

TCT

GGG

GCA

AGC

ATC

Glu

Val

Phe

Thr

Thr

Leu

Ser

Val

Thr

Lys

Arg

Ser

Gly

Ala

Ser

Ile

510

515

520

CTC

CAG

GCT

GGC

TGC

TGA

Leu

Gin

Ala

Gly

Cys

1584

1632

1650

525

Sekvenční č.ID: Délka sekvence: Typ sekvence: Počet vláken: Topologie: Typ molekuly:

526 aminokyseliny jednovláknová lineární peptid

Popis sekvence:

Meh

Ser

Cys

Glu

Asp

Gly Arg

Ala

Leu

Glu

Gly

Thr

Leu

Ser

Glu

Leu

-23

-20

-15

Ί0

Ala

Ala

Glu

Thr

Asp

Leu

Pro

Val

Val

Phe

val

Lys

Gin

Arg

Lys

Ile

-5

1

5

Gly

Gly

His

Gly

Pro

Thr

Leu

Lyg

Ala

Tyr

Gin

Glu

Gly

Arg

Leu

Gin

10

15

20

2Ξ

Lys

Leu

Leu

Lys

Met

Asn

Gly

Pro

Glu

Asp

Leu

Pro

Lys

Ser

Tyr

Asp

30

35

40

Tyr

Asp

Leu

Ile

Ile

Ile

Gly Gly

Gly

Ser

Gly

Gly

Leu

Ala

Ala

Ala

45

50

55

Lys

Glu

Ala

Ala

Gin

Tyr Gly

Lys

Lys

Val

Met

Val

Leu

Asp

Phe

Val

60

65

70

Thr

Pro

Thr

Pro

Leu

Gly

Thr

Arg

Trp Gly

Leu

Gly Gly

Thr

Cys

Val

75

80

85

Asn

Val

Gly

Cys

Ile

Pro

Lys

Lys

Leu

Met

His

Gin

Ala

Ala

Leu

Leu

90

95

100

105

Gly

Gin

Ala

Leu

Gin

Asp

Ser

Arg

Asn

Tyr

Gly

Trp

Lys

Val

Glu

Glu

110

115

120

Thr

Val

Lys

His

Asp Trp

ASp

Arg

Met

Ile

Glu

Ala

Val

Gin

Asn

HiS

125

130

135

-66CZ 293582 B6 lle Gly Ser Leu Asn Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lys Lys 140 145 150

Val Val Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Gin Phe lle Gly Pro His Arg lle

155

160

165

Lys Ala Thr Asn .

Asn

Lys <

Gly

Lys

Glu

Lys

lle

Tyr

Ser

Ala

Glu

Arg

170

175

180

185

Phe Leu lle Ala 1

Thr <

Gly <

Glu

Arg

Pro

Arg

Tyr

Leu

Gly

lle

Pro

Gly

190

195

200

Asp Lys Glu Tyr i

Cys

lle .

Ser

Ser

Asp

Asp

Leu

Phe

Ser

Leu

Pro

Tyr

205

210

21S

Cys Pro Gly Lys ‘

Thr

Leu '

Val

Val

Gly

Ala

Ser

Tyr

Val

Ala

Leu

Glu

220

225

230

Cys

Ala

Gly

Phe

Leu

Ala

Gly

lle

Gly

Leu

Asp

Val

Thr

Val

Met

val

235

240

245

Arg

Ser

lle

Leu

Leu

Arg

Gly

Phe

Asp

Gin

Asp

Met

Ala

Asn

Lys

lle

250

2SS

260

265

Gly

Glu

His

Met

Glu

Glu

His

Gly

lle

Lys

Phe

lle

Arg

Gin

Phe

Val

270

275

280

Pro

lle

Lys

Val

Glu

Gin

Zle

Glu

Ala

Gly

Thr

Pro

Gly Arg

Leu

Arg

285

290

295

Val

Val

Ala

Gin

Ser

Thr

Asn

Ser

Glu

Glu

lle

lle

Glu

Gly

Glu

Tyr

300

305

310

Asn

Thr

Val

Met

Leu

Ala

lle

Gly

Arg

Asp

Ala

Cys

Thr

Arg

Lys

lle

315

320

325

Gly

Leu

Glu

Thr

Val

Gly

Val

Lys

lle

Asn

Glu

Lys

Thr

Gly

Lys

Zle

330

335

340

345

Pro

Val

Thr

Asp

Glu

Glu

Gin

Thr

Asn

val

Pro

Tyr

lle

Tyr

Ala

lle

350

355

360

Gly

Asp

lle

Leu

Glu

Asp

Lys

Val

Glu

Leu

Thr

Pro

Val

Ala

lle

Gin

365

370

375

Ala

Gly

Arg

Leu

Leu

Ala

Gin

Arg

Leu

Tyr

Ala

Gly

Ser

Thr

Val

Lys

380

385

390

Cys

Asp

Tyr

Glu

Asn

Val

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Thr

Pro

Leu

Glu

Tyr

395

400

405

Gly

Ala

Cys

Gly

Leu

Ser

Glu

Glu

Lys

Ala

Val

Glu

Lys

Phe

Gly

Glu

410

415

420

425

Glu

Asn

lle

Glu

Val

Tyr

His

Ser

Tyr

Phe

Trp

Pro

Leu

Glu

Trp

Thr

430

435

440

lle

Pro

Ser

Arg Asp

Asn

Asn

Lys

Cys

Tyr

Ala

Lys

lle

lle

Cys

Asn

445

450

455

Thr

Lys

Asp

Asn

Glu

Arg

Val

Val

Gly

Phe

His

Val

Leu

Gly

Pro

Asn

460

465

470

-67CZ 293582 B6

Ala

Gly 475

Glu Val

Thr

Gin Gly Phe Ala Ala Ala Leu

Lys Cys Gly Leu

480

485

Thr

Lys

Lyg

Gin

Leu

Asp

Ser

Thr

Ile

Gly

Ile

His

Pro

Val

Cys

Ala

490

495

soo

505

Glu

Val

Phe

Thr

Thr

Leu

Ser

Val

Thr

Lys

Arg

Ser

Gly

Ala

Ser

Ile

510

515

520

Leu

Gin

Ala

Gly

Cys

525

Sekvenční č. ID:	13
Délka sekvence:	15
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Počet vláken:	dvouvláknová
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	další typy DNA, syntetická DNA

Popis sekvence:

TAAATAAATA AATAA

Sekvenční č. ID:	14
Délka sekvence:	66
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Počet vláken:	dvouvláknová
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	další typy DNA, syntetická DNA

Popis sekvence:

CTAGCGCTCT GGGGCAAGCA TCCTCCAGGC

TGGCTGCCAC CACCACCACC ACCACTGATC TAGACT 66

Sekvenční č.ID:	15
Délka sekvence:	18
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	další typy DNA, syntetická DNA

Popis sekvence:

GGTCAGCACA AATTTCCA

Sekvenční č.ID:	16
Délka sekvence:	24
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	další typy DNA, syntetická DNA

Popis sekvence:

AAACACAACT TGGAATGAAC AATT

-68CZ 293582 B6

Sekvenční č. ID:	17
Délka sekvence:	24
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	další typy DNA, syntetická DNA

Popis sekvence:

TCATTCCAAG TTGTGTTTGT GAAA

Sekvenční č.ID:	18
Délka sekvence:	18
Typ sekvence:	nukleová kyselina
Topologie:	lineární
Typ molekuly:	další typy DNA, syntetická DNA

Popis sekvence:

Claims (41)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polynukleotidová sekvence kódující fúzní protein, která obsahuje ve směru 5-3' a ve stejném otevřeném čtecím rámci:

   a) sekvenci kódující protein jaderné inkluze a viru CYVV s primární sekvencí, odpovídající polypeptidu, danému aminokyselinami 4 až 437 v sekvenci ID č. 2 v přehledu sekvencí, nebo jeho mutaci či variantu mající podobnou proteolytickou specifitu jakou má protein jaderné inkluze a viru CYVV,

   b) sekvenci kódující štěpný peptid AsnCysSerPheGlnX, kde X je zbytek aminokyseliny, který se volí ze skupiny Gly, Ale, Val a Ser, přičemž peptid je rozpoznatelný a štěpitelný uvedeným proteinem jaderné inkluze a viru CYVV nebo jeho mutací či variantou, a

   c) alespoň jednu sekvenci kódující exogenní polypeptid.
2. 2. Polynukleotidová sekvence podle nároku 1, která je DNA.
3. 3. Polynukleotidová sekvence podle nároku 1 nebo 2 ve dvouřetězcové formě.
4. 4. Pozitivní polynukleotidová sekvence odpovídající polynukleotidová sekvenci kteréhokoli předchozího nároku.
5. 5. Polynukleotidová sekvence podle kteréhokoli předchozího nároku, v níž sekvence c) kóduje více než jeden exogenní polypeptid a mezi jednotlivými kódovanými polypeptidy jsou kódovány další štěpné sekvence definované v nároku 1 v bodu b).
6. 6. Polynukleotidová sekvence podle nároku 5, v níž jsou další štěpné sekvence rozpoznatelné jadernou inkluzí a viru CYW.

   -69CZ 293582 B6
7. 7. Polynukleotidová sekvence podle kteréhokoli předchozího nároku 1 až 4, jejíž sekvence c) kóduje pouze jeden polypeptid.
8. 8. Polynukleotidová sekvence podle kteréhokoli předchozího nároku, jejíž sekvence b) je buď zcela, nebo částečně obsažená buď v jedné ze sekvencí a) a c), nebo v obou.
9. 9. Polynukleotidová sekvence podle kteréhokoli nároku 1 až 7, v níž je kódován jeden nebo větší počet aminokyselinových zbytků mezi štěpným peptidem kódovaným sekvencí b) a polypeptidem kódovaným sekvencí c).
10. 10. Polynukleotidová sekvence podle kteréhokoli předchozího nároku, která štěpením fúzního proteinu kódovaného touto sekvencí prostřednictvím proteinu jaderné inkluze a kódovaného sekvencí a) dává vznik polypeptidu majícímu doplňkovou aminosekvenci na svém N-konci, přičemž konečným zbytkem je zbytek glycinu, šeřinu nebo alaninu.
11. 11. Polynukleotidová sekvence podle nároku 10, v níž uvedený zbytek glycinu, šeřinu nebo alaninu je v případě potřeby odstranitelný působením vhodné aminopeptidázy.
12. 12. Polynukleotidová sekvence podle kteréhokoli předcházejícího nároku, v níž prolinový zbytek je kódován mezi N-koncem polypeptidu a C-koncem štěpného peptidů.
13. 13. Polynukleotidová sekvence podle nároku 12, v níž kterýkoli zbytek za uvedeným prolinovým zbytkem může být štěpen působením aminopeptidázy P (3.4.11.9).
14. 14. Polynukleotidová sekvence podle nároku 13, v níž po štěpení až k danému prolinu může být tento prolinový zbytek odstraněn působením proliniminopeptidázy (3.4.11.5).
15. 15. Polynukleotidová sekvence podle kteréhokoli předchozího nároku, v níž je alaninový zbytek kódován mezi N-koncem polypeptidu a C-koncem štěpného peptidů.
16. 16. Polynukleotidová sekvence podle nároku 15, v níž kterýkoli zbytek umístěný za uvedeným alaninovým zbytkem může být štěpen působením aminopeptidázy P (3.4.11.9) a štěpení tohoto alaninového zbytku může být provedeno katalytickým působením alaninaminopeptidázy (3.4.11.14).
17. 17. Polynukleotidová sekvence podle nároku 8, v níž je sekvence b) zcela obsažena v sekvenci

    a) a c).
18. 18. Polynukleotidová sekvence podle kteréhokoli předchozího nároku, v níž je sekvence a) dána nukleotidy č. 10 až 1311 pod sekvenčním č. ID: 1 podle přehledu sekvencí.
19. 19. Polynukleotidová sekvence podle kteréhokoli předchozího nároku jejíž sekvence a) kóduje polypeptid daný aminokyselinami číslo 4 až 437 v sekvenci č. ID: 2 v přehledu sekvencí.
20. 20. Polynukleotidová sekvence podle kteréhokoli předchozího nároku, která sdílí přinejmenším z 90 % sekvenční homologii se zbytky 10 až 1311 v sekvenci č. ID: 1.
21. 21. Polynukleotidová sekvence podle kteréhokoli předchozího nároku, která dále kóduje vedoucí sekvenci proti směru exprese od sekvence a).
22. 22. DNA, která hybridizuje sDNA mající nukleotidovou sekvenci danou čísly 10 až 1311 v sekvenci č. ID: 1 v přehledu sekvencí a ve které řetězec odpovídající orientaci kóduje protein mající proteázovou účinnost, přičemž podmínky pro hybridizaci používají 6x SSC při 60 až 70 °C.

    -70CZ 293582 B6
23. 23. Vektor, obsahující polynukleotidovou sekvenci kteréhokoli předcházejícího nároku 1 až 22.
24. 24. Vektor podle nároku 23, který je expresivním vektorem.
25. 25. Hostitel, transformovaný vektorem podle nároku 23 nebo 24 s výjimkou buněk lidského původu.
26. 26. Expresivní systém, v němž je hostitel s výjimkou buněk lidského původu transformován vektorem podle nároku 24.
27. 27. Expresivní systém podle nároku 26, v němž je hostitelem E. coli.
28. 28. Polypeptid, obsahující sekvenci danou zbytky 4 až 437 v sekvenci č. ID: 2 nebo její mutaci či variantu.
29. 29. Polypeptid, který má sekvenci danou zbytky 4 až 437 v sekvenci č. ID: 2.
30. 30. Polypeptid, který má sekvenci danou zbytky 4 až 437 v sekvenci č. ID: 2 nebo její mutaci či variantu.
31. 31. Použití polynukleotidové sekvence podle nároku 1 pro přípravu polypeptidu, kde je prekurzor tohoto polypeptidu štěpen proteinem jaderné inkluze a viru CYVV nebo jeho mutací či variantou.
32. 32. Použití podle nároku 31, při němž je uvedený prekurzor fuzním proteinem.
33. 33. Použití podle nároku 31 nebo 32, při němž je prekurzorová forma polypeptidu obsahující sekvenci AsnCysSerPheGlnX štěpitelná proteinem jaderné inkluze a viru CYVV nebo jeho mutací či variantou.
34. 34. Použití podle nároku 33, při němž je produkt štěpení zralou formou daného polypeptidu.
35. 35. Fůzní protein, kódovaný polynukleotidovou sekvencí podle kteréhokoli nároku 1 až 22.
36. 36. Expresivní systém podle nároku 26 nebo 27, v němž peptid kódovaný sekvencí a) může autolýzou dát vznik polypeptidu majícímu dodatkovou N-koncovou aminosekvenci, jejímž koncovým zbytkem je zbytek glycinu, šeřinu nebo alaninu, a ve kterém lze aminopeptidázou hostitele uvedený N-koncový zbytek odstranit.
37. 37. Expresivní systém podle nároku 26 nebo 27, v němž peptid, kódovaný sekvencí a) může autolýzou dát vznik polypeptidu majícímu na dodatkové N-koncové aminosekvenci prolinový zbytek a 0, 1 nebo řadu dalších aminokyselinových zbytků a kde kterékoli dodatkové aminokyselinové zbytky za uvedeným prolinovým zbytkem lze odstranit aminopeptidázou P (3.4.11.9).
38. 38. Expresivní systém podle nároku 37, v němž po štěpení až k prolinovému zbytku může být tento prolinový zbytek odstraněn působením proliniminopeptidázy (3.4.11.5).
39. 39. Expresivní systém podle nároku 26 nebo 27, v němž peptid kódovaný sekvencí a) může autolýzou dát vznik polypeptidu majícímu dodatkový alaninový zbytek na N-konci a 0, 1 nebo řadu dalších aminokyselinových zbytků a v kterém jakékoli dodatkové aminokyselinové zbytky za daným alaninovým zbytkem lze odstranit aminopeptidázou P (3.4.11.9) a alaninový zbytek lze odstranit působením alaninaminopeptidázy (3.4.11.14).

    -71 CZ 293582 B6
40. 40. Polynukleotidová sekvence podle některého z nároků 1 až 21, v níž se sekvence c) volí z následujících sekvencí

    a) polynukleotidová sekvence, kódující polypeptid, který obsahuje sekvenci aminokyselin od čísla 1 do čísla 526 sekvence č. Π): 12 nebo která kóduje mutaci či variantu řečeného polypeptidu s předpokladem, že takový polypeptid kódovaný touto polynukleotidovou sekvencí je schopen redukovat dichloroindofenol a oxidovaný glutathion,

    b) polynukleotidová sekvence, která má 55% nebo vyšší sekvenční homologii se sekvencí aminokyselin č. 1 až 526 sekvence č. ID: 12,

    c) polynukleotidová sekvence, která sdílí více než 70% sekvenční homologii se sekvencí aminokyselin č. 1 až 526 sekvence č. ID: 12,

    d) polynukleotidová sekvence, která sdílí více než 80% sekvenční homologii se sekvencí aminokyselin č. 1 až 526 sekvence č. 12,

    e) polynukleotidová sekvence, jejíž kódující sekvence obsahuje nukleotidovou sekvenci 70 až 1647 vyznačenou v sekvenci č. ID: 11,

    f) polynukleotidová sekvence podle bodu a), která kóduje polypeptid mající sekvenci -23 až 526 za sekvence č. ID: 12 nebo její mutaci či variantu, za předpokladu, že polypeptid, kódovaný touto polynukleotidovou sekvencí, mají schopnost redukovat dichlorindofenol a oxidovaný glutathion,

    g) DNA, která hybridizuje s polynukleotidovou sekvencí podle kteréhokoli z bodů a) až f) a ve které řetězec s odpovídajícím smyslem kóduje polypeptid mající redukující aktivitu,

    h) DNA podle odstavce g), u níž se v hybridizačních podmínkách používá 6x SSC při 60 až 70 °C.
41. 41. Fůzní protein, kódovaný polynukleotidovou sekvencí podle nároku 40.