KR20120125980A - 미토콘드리아 표적화된 항산화제에 기초한 약학적 물질 - Google Patents

미토콘드리아 표적화된 항산화제에 기초한 약학적 물질 Download PDF

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에프게니 스테파노비치 예프레모프
바딤 네로노비치 타슐리츠키
레프 세르게에비치 야구진스키
갈리나 아나톨리예브나 코슈노바
나탈리아 블라디미로브나 숨바티안
유리 니콜라예비치 안토넨코
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Abstract

본 발명은 약학 및 의약의 분야게 관한 것이고, 특히, 미토콘드리아-표적화된 화합물을 기초로 약학적 물질의 생산 및 용도에 관한 것이다. 발명은 의약 제조의 유효 성분-약학적 물질에 이루어지는 요구를 충족하는 형태 및 질로 상기 물질을 제조하는 것이 가능하게 만드는, 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 합성, 정제 및 보관을 위한 방법을 개시한다. 또한 발명은 특정한 특성을 갖는 새로운 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 디자인 및 선택을 위한 방법을 개시한다.

Description

미토콘드리아 표적화된 항산화제에 기초한 약학적 물질{Pharmaceutical substances on the basis of mitochondrially addressed antioxidants}
본 발명은 약학 및 의약의 분야에 관련된 것으로서, 특히, 미토콘드리아-표적화된(mitochondria-addressed) 화합물에 기초한 약학적 물질의 생산 및 용도에 관한 것이다.
현재까지 발표된 데이타는 '스쿨라체프 이온(Skulachev ion)'(이 용어는 Green D.E., "The electromechanochemical model for energy coupling in mitochondria", 1974, Biochem. Biophys. Acta., 346:27-78에 의해 명명되었음)에 기초한 새로운 계통의 생물학적 활성 물질 - 미토콘드리아-표적화된 항산화제(mitochondria-addressed antioxidants, MAA)의 약학적 전망이 좋다는 것을 명확하게 입증한다(Skulachev V.P. (2005), IUBMB Life., 57:305-10; Skulachev V.P. (2007) Biochemistry (Mosc)., 72:1385-96; Antonenko Yu.N. 등 (2008), Biochemistry (Mosc).,73:1273-87, Skulachev V.P. 등, (2009), Biochim Biophys Acta., 1787:437-61, Smith R.A. 등, (2008), Ann. N. Y. Acad. Sci., 1147:105-11 참조, 또한 국제특허출원 WO2007046729, 국제특허출원 WO2009005386, 미국등록특허 US 6331532, 유럽등록특허 EP 1047701, 유럽등록특허 EP 1534720 참조).
상기 언급된 자료들은 실험실 조건 - 인 비트로(in vitro) 또는 동물 모델에서 MAA의 연구 결과를 개시한다. 그러나 유효한 약학적 성분(소위 약학적 물질)으로서 화합물을 사용하기 위해서는, 그 화합물은 특정한 요건을 충족해야 한다, 즉:
1. 상응하는 문서, 약전 모노그래프에 요약된 국가적 규제 요건에 완전히 따른다. 주요 요건은 진실성(authenticity), 불순물 함량, 중금속 함량, 수분 함량, 잔류 유기 용매 함량, 살균, 화합물의 정량적 측정 방법, 포장, 표지 및 수송 방법이다.
2. 약학적 활성뿐만 아니라 규제 문서에 리스트된 화합물의 특징은 상정된(postulated) 보관 기간(shelf storage time) 동안 상정된 한계 이내로 보존되어야 한다.
단일 불순물들의 함량뿐만 아니라, 불순물의 총 함량에 특별한 주의가 기울여져야 한다. 특히, 개별적으로 확인될 수 없고 완전히 특징을 분석할 수 없는 단일 불순물들은 불순물의 총 함량의 중요한 부분(대부분의 경우에 - 1% 초과)을 이루지 않아야 한다.
약학적 물질로서 MAA의 실질적 적용에 대한 또다른 중요한 어려움은 MAA에 관련된 발명의 기재에서(상기 참조) 미토콘드리아-표적화된 항산화제로서 청구된 다수의 화합물들이 개시되었다는 것이다. 그러나, 임상 시험을 포함한 실험의 결과들(예를 들면, Antonenko Yu.N. 등 (2008), Biochemistry (Mosc).,73:1273-87 참조)은 개시된 미토콘드리아-표적화된 화합물이 상이한(종종 심지어는 반대의) 생물학적 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 이 점에서, 화합물의 특정한 적용을 위해 적절한 잘-정의되고, 선결정된 특성들을 갖는 생물학적으로 유효한 물질의 디자인을 위한 방법의 개발이 시급하게 남아 있다. 또한 스쿨라체프 이온을 기초로 MAA의 특성 및 생물학적 활성(첫번째 위치에서 - 임상적 활성)을 예측하는 것이 시급하다.
정의
약학적 물질( Pharmaceutical substance ) - 의약적 제조의 성분으로서 사용하기 위해 제조되고 약전 요건을 만족하는 물질.
스쿨라체프 이온( Skulachev - ions ) - 미토콘드리아 막을 투과할 수 있는 지질친화성 양이온 및 음이온.
미토콘드리아- 표적화된 항산화제( Mitochondria - addressed antioxidants , MAA) - 미토콘드리아로 표적화되게 축적될 수 있고 항산화 활성을 갖는 화합물.
본 발명의 측면은 하기에 제공된다:
I. 본 발명은 미토콘드리아-표적화된 항산화제(MAA)를 기초로 약학적 물질의 생산, 특정한 MAA의 디자인 및 선택에 관한 것이고, 이것은 적절한 임상적 임무에 상응한다. 특히, 본 발명은 지질친화성(lipophilic) 양이온 ('스쿨라체프 이온')에 링커 그룹을 통해 부착된 항산화제를 포함하는 MAA 화합물에 관한 것이다. 이 MAA는 하기 일반식 (I)로 기재될 수 있다:
일반식 (I): 화합물의 구조
Figure pct00001
상기 A는 효과기(effector) 모이어티(moiety)이고; L은 링커 그룹이며, n은 1 내지 20의 정수이고; B는 미토콘드리아 내로 화합물의 표적화된 전달을 제공하는 표적 그룹이다.
상기 A는 하기 일반식(II)의 항산화제 및/또는 그것의 환원된 형태일 수 있고
Figure pct00002
상기 m은 1 내지 3의 정수이고; Y는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며; 또는 두 개의 인접한 Y는 서로 연결되어 구조 (III) 및/또는 그것의 환원된 형태를 형성하고:
Figure pct00003
상기 R1 및 R2는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며;
상기 L은
a) 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합, 또는 에테르 결합, 또는 에스테르 결합, 또는 C-S, 또는 S-S, 또는 펩티드 결합을 선택적으로 함유하고; 및 바람직하게는 알킬, 알콕시, 할로겐, 케토 그룹, 아미노 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 직선 또는 분지된 탄화수소 사슬;
b) 또는 자연적 이소프렌 사슬을 포함하는, 링커 그룹이고;
상기 B는
a) Sk는 지질친화성(lipophilic) 양이온이고; Z는 약학적으로 허용가능한 음이온인, 하기 식의 스쿨라체프(Skulachev)-이온 Sk
Sk+Z-
b) 또는 그것의 양이온 형태로 미토콘드리아 내로 투과할 수 있는 양쪽친화성 양쪽성 이온(amphiphilic zwitterion)을 포함하는, 표적 그룹(targeting group)이다.
c) 또한, B의 성분으로서 Sk+는 지질친화성 금속-유기 화합물, 특히, 바람직하게는 하기 구조를 갖는 지질친화성 메탈로포르피린(lipophilic metalloporphyrin)일 수 있고:
Figure pct00004
R1, R2, R3 또는 R4로 표시되는 모이어티를 통해 식 (I)의 화합물의 조성에 포함된다. 상기 남아 있는 치환기 R1, R2, R3 또는 R4는 특히, 분자의 소수성을 증가 또는 감소시키기 위하여 화합물의 요구되는 특성에 따라 선택될 수 있다; Me+는 바람직하게는 Mn, Fe, Co, Cu, Mg 또는 Zn으로부터 선택되는 금속 이온을 나타낸다.
일반식 (I)의 MAA에 속하는 생물학적으로 활성인 화합물의 구조의 예는 하기 개요에 보여진다.
SkQ1 (플라스토퀴노닐-데실-트리페닐포소포니움 (plastoquinonyl-decyl-triphenylphosphonium, PDTP) 브로마이드(bromide))
Figure pct00005
일부 경우에, 본 발명의 구체예에서, 식 (I)의 화합물의 사용하는 것이 바람직하고 상기 산화촉진제는 효과기 모이어티 A, 특히, 하기 구조로 기재된 데스메톡시우비퀴논(desmethoxyubiquinone) 또는 이오놀(ionol)로서 사용된다:
Figure pct00006
식 (I)의 상응하는 화합물은 미토콘드리아-표적화된 산화촉진제일 것이다.
II . 선택을 위한 방법 및 접근법
본 발명의 또다른 측면은 특정한 미토콘드리아-표적화된 화합물의 디자인 및/또는 선택의 방법이다.
II .a 새로운 미토콘드리아 항산화제를 디자인하는 방법
상기 화합물의 화학적, 물리화학적 및 생물학적 특성의 연구는 화합물 (I)의 종류에 속하는 화합물의 디자인을 위한 새로운 접근법을 제안하는 것을 가능하게 하였다. 제안된 모델을 사용하여 미리 결정된 특성을 갖는 새로운 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 구조를 디자인하는 것이 가능하다.
본 발명의 화합물의 제안된 디자인 모델을 일반적으로 기재하는 화합물의 디자인의 개요는 하기 개요에 보여진다:
새로운 미토콘드리아- 표적화된 항산화제의 디자인 모델의 개요
Figure pct00007
상기에서:
P1은 화합물의 안정성 및 생물학적 활성을 책임지는 위치이다. 이 탄소 원자가 치환기를 갖지 않는다면, 그러한 물질은 항산화제로서 최대로 효율적이나 다소 불안정하다. MitoQ보다 10 배 이상 강력한 항산화제인 SkQ1이 예이다. 그러나, MitoQ에서 위치 P1의 메틸 그룹이 존재하면 SkQ1과 비교하여 좀더 안정하게 된다. 또한 링커 '링크(link)'의 조성은 물질의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 물질의 안정성은 '링크'에 에스테르 결합, 펩티드 결합, 설피드 그룹 또는 다른 반응성 그룹의 도입으로 변화될 수 있다.
위치 P2 및 P3는 미토콘드리아 호흡 사슬과의 상호 작용의 조절에 책임이 있다. 이 탄소 원자들 중 하나가 치환기를 갖지 않는다면, 그러한 물질은 화합물이 산화촉진제(pro-oxidant)로 전환되기 때문에 미토콘드리아 호흡 사슬에 의해 환원될 수 없다. 이 위치의 치환기 중 하나 또는 모두의 구조가 호흡 사슬이 상응하는 화합물을 환원 및/또는 산화시키는 것을 가능하게 하지 않는다면 동일한 효과가 달성될 수 있다.
동일한 위치 P2 및 P3의 치환기는 화합물의 산화촉진제(pro-oxidant) 및 항산화제(antioxidant) 특성 간의 비율에 영향을 미칠 수 있다. 위치 P2 및 P3의 산소 원자의 존재는 항산화제의 환원된 또는 부분적으로 환원된 형태(퀴놀 또는 세미퀴논)로 퀴놀의 OH 그룹의 수소 원자와 내부 수소 결합의 형성으로 이어질 수 있다. 그러한 수소 결합은 위치 P2 및 P3에서 산소 원자가 존재하지 않는 (예를 들면, 메틸 그룹이 존재함) 화합물과 비교하여 물질의 항산화 특성을 대폭 줄이는 자유 라디칼 및 활성 산소 종과의 반응에서 OH 그룹의 산화를 방해할 수 있다. 이것은 SkQ1 및 MitoQ에서 이들 특성간의 차이점을 설명할 수 있을 것이다.
P4는 생물학적으로 활성인 물질의 투과 능력을 책임지는 위치이다. 미토콘드리아 내로 투과하는 능력은 화합물의 전하 및 소수성에 따른다. 예를 들면, 인공 막 실험은 위치 P4에서 트리페닐포소포니움(triphenylphosphonium)을 갖는 화합물은 그 위치에서 좀더 소수성 양이온인 로다민 G 모이어티가 존재하는 물질보다 덜 투과한다는 것을 보여준다.
'링크(Link)'는 또한 화합물의 특성에 극적으로 영향을 미칠 수 있는 구조 요소이다. 링커 '링크'의 길이 및 구성은 화합물의 투과 능력에 영향을 미칠 수 있다(도 2). 링커의 길이를 감소시키고 그것의 친수성을 증가시키면 화합물의 투과 능력을 감소시킬 것이다. 또한 링커 '링크'의 조성을 변형하면 화합물의 안정성을 변화시킬 수 있다 - 에스테르 결합, 펩티드 결합, 링커 내로 C-C 결합보다 덜 안정한 다른 결합의 도입은 에스테라제, 펩티다제와 같은 세포 내 효소에 대해 공격받기 쉬운 화합물을 만들수 있다. 또한 이 요소의 길이를 변화시키면 미토콘드리아 호흡 사슬과 화합물의 상호작용의 가능성을 결정하는데 중요한 인자인 이중층 막 사이로 분자의 소수성 부분(항산화 모이어티)의 위치를 변화시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 예측된 생물학적 활성을 갖는 미토콘드리아-표적화된 화합물의 구조(디자인)를 만들기 위한 방법에 관한 것이다. 생물학적 활성은 항산화 효과, 산화촉진제 효과, 미토콘드리아에서 언커플링(uncoupling) 효과, 생물학적 막의 특성 변화, 상이한 수준으로 상이한 전달자를 통환 조절 효과(유전자 발현의 조절, 단백질 활성의 조절, 생물의 호르몬 프로파일의 조절 등)를 포함하는, 생물학적 시스템 및 그것의 모델(즉, 인공 무-세포 시스템, 세포 이하의 분획 및 세포소기관, 세포, 조직 및 기관 또는 전체 생물의 영역)에 대한 영향으로서 정의된다.
II .b 조합 라이브러리를 사용하여 화합물을 디자인하는 방법
본 발명의 또다른 측면은 미토콘드리아-표적화된 화합물의 조합(combinatorial) 라이브러리 및 이 라이브러리로부터 유력한 화합물을 조사 및 선택하는 방법에 관한 것이다. 상기 라이브러리는 미토콘드리아 내로 표적화되게 실제로 축적될 수 있는 일 세트의 일반식 (I)의 화합물들이다. 라이브러리의 화합물들은 '활성화된(activated)' 잔기, 예를 들면, 화합물의 다양한 부위의 부착이 일어나는 것을 통한 할로겐을 함유하는 링커(링커의 부위)로 연결된 지질친화성 양이온인 일반적인 부분을 기초로 포함하여 합성될 수 있다. 다른 말로, 미토콘드리아-표적화된(non-addressed) 화합물의 라이브러리는 라이브러리의 지질친화성 양이온에 비-표적화된 저분자량 화합물을 부착시킴으로써 수득될 수 있다.
II .c 본 발명의 또다른 측면은 요구되는 활성을 갖는 화합물을 선택하기 위하여 라이브러래의 화합물의 생물학적 활성에 대해 시험하는 방법(방법이 자동화 또는 반-자동화된 것이라면 이를 포함함)이다. 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
1) 라이브러리로부터 한 그룹의 후보 물질을 선택하는 것을 가능하게 하는 시험 단계;
2) 선택된 물질 및 있다면 그것의 변형에 기초한 조합 라이브러리를 구축하는 단계;
3) 가장 확연히 요구되는 생물학적 활성을 갖는 화합물을 선택하는 서브라이브러리를 시험하는 단계;
4) 화합물의 모든 가능한 변이체가 시도되거나 또는 요구된 생물학적 활성이 달성될 때까지 단계 1 내지 3을 반복하는 단계.
인공적인 결과의 확률을 상당히 줄일 수 있는 단계 1 및 3에서 생물학적 활성을 시험하기 위한 여러 방법의 조합이 가장 효과적이라는 것을 유의해야 한다. 특정한 시험 방법은 조합 라이브러리에 대한 작업 방법 및 본 발명의 명세서에 기재된 방법에서 공공연하게 이용가능한 문헌적 데이타를 기초로(시험 방법, 결과 해석의 방법, 실험예 참조) 생화학, 생물 물리학, 생물 에너지학, 미생물학, 분자 생물학, 세포 생물학 또는 근대 생물학의 다른 분야에서 자격이 있는 전문가에 의해 응용될 수 있다. 적절한 섹션에 제시된 실험예들은 '개별적인 시험관에서' 미토콘드리아-표적화된 화합물의 활성을 시험하기 위한 방법이고 표준 접근법을 사용한 고도로-생산적인 방법에 의한 조합 라이브러리를 시험하기 위해 쉽게 응용될 수 있다.
III . 시험 방법
본 발명의 다른 측면은 일반식 (I)의 새로운 미토콘드리아-표적화된 화합물의 생물학적 활성을 시험하는 데 사용되는 일 세트의 시험 방법이다. 시험 화합물은 조합 라이브러리의 개별적으로 및 부분으로서 연구될 수 있다. 상기 세트의 시험 방법은 하기 방법을 포함한다:
1) 인 비트로에서 일반식 (I)의 화합물의 산화 환원 특성 및 안정성을 시험;
2) 인공적인 검은 막에 대한 미토콘드리아-표적화된 화합물의 투과 능력을 시험;
3) 그라미시딘(gramicidin) 채널을 포함하는 인공 모델 막을 사용하여 막 단백질에 대한 미토콘드리아-표적화된 화합물의 보호 또는 손상 효과를 시험;
4) 분리된 미토콘드리아에 대한 미토콘드리아-표적화된 화합물의 항산화 또는 산화촉진 효과를 시험;
5) 동물, 식물, 세균 또는 효모 세포 배양에서 미토콘드리아-표적화된 화합물의 항산화 또는 산화촉진 작용을 시험;
6) 세포 배양에서 미토콘드리아-표적화된 화합물의 항-세포자살(anti-apoptotic) 또는 항-괴사(anti-necrotic) 또는 세포자살촉진(pro-apoptotic) 또는 괴사촉진(pro-necrotic) 활성을 시험;
7) 세포에서 미토콘드리아-표적화된 화합물의 축적을 시험;
8) 미토콘드리아-표적화된 화합물의 특정한 활성의 시험으로서, 상기 특정한 활성은 전사 수준, mRNA 안정성 또는 번역에서 어떤 유전자의 활성화, 인산화 또는 탈인산화, 단백질 분해, 글리코실화, 카르보닐화 및 단백질 또는 단백질 복합체의 활성에서의 다른 변화를 포함하는 단백질 변형 수준에서 분명해지는 어떤 대사 경로를 활성화 또는 저해하는 능력으로서 정의되고; 또한 대사 경로의 활성화 또는 저해는 호흡률의 변화, 특정 대사물질의 생성률의 변화, 특정 기질의 소비율의 변화, 외막, 미토콘드리아 막 또는 다른 세포소기관의 막에서 막 전위의 변화, 상기 막의 하나 이상의 이온 전도도의 변화, 세포 세포질 또는 다른 세포 구획에서 pH의 변화를 포함한 어떤 이온 농도의 변화, 생물분자, 소낭 및 세포소기관의 세포내 전달의 변화, 세포 주기 동안의 변화, 세포 분열, 세포 형질 전환, 세포 사멸 또는, 역으로, 세포 생존에 이르는 변화를 포함하는 세포의 다른 생리적 파라미터의 변화로 명확해질 수 있으며;
9) 질병 모델에서 시험 화합물을 포함하는 동물 또는 식물에서 인 비보로 일반식 (I)의 화합물의 생물학적 활성을 시험; 상기 시험은 조합 라이브러리를 초기 시험하는 단계에 적용할 수 있는 것이 아니고 제한된 수의 화합물의 연구에 오직 적용될 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 측면은 상기 화합물의 전망의 예측을 포함하는 새로운 일반식 (I)의 화합물의 특성을 연구하는데 적용된 상기 각 시험들이다. 상기 측면은 의학, 생명공학, 화장품학에서 상기 화합물의 실질적 용도를 위한 측면으로서 정의된다.
IV . 결과 해석의 방법
본 발명의 또다른 측면은 의약, 생명공학, 화장품학에서 후보 화합물의 실질적 사용의 전망을 예측하고 가장 유력한 화합물을 선택하기 위하여 일반식 (I)의 화합물을 시험하는 동안 수득된 결과의 해석을 위한 방법이다.
상기 방법의 주요 요소는 실험예 섹션에 기재된 시험 화합물 SkQ1의 결과와 시험 후보 화합물의 결과를 비교하는 것이다. 따라서, SkQ1은 상당히 유효한 생물학적으로 활성인 화합물이고 의약, 생명공학, 화장품학에 적용될 수 있기 때문에(특허 출원 PCT/RU2006/000394, PCT/RU2006/000546, PCT/RU2006/000547 및 SkQ1에 관한 다른 문헌 참조), SkQ1에 대한 데이터는 다른 일반식 (I)의 화합물의 유효성을 예측하기 위한 시작점, 고정된 점, 표준으로서 고려될 수 있다.
화합물 SkQR1, MitoQ, MitoVitE, DMMQ은 활성의 비교를 위한 다른 표준으로서 제공될 수 있다. 미토콘드리아 호흡 사슬, 바람직하게는 호흡 사슬의 효소 및 조효소에 의해 환원된 시험 화합물에 대한 가능성이 바람직하고, 시험 화합물에서 산화촉진 특성에 대한 항산화 특성의 중요한 우세가 바람직하다.
따라서, 화합물 MitoVitE 및 DMMQ는 일종의 '음성의(negative)' 고정된 점이고, 가장 유력한 화합물의 선택에서 - 항산화제, 유사한 활성을 갖는(미토콘드리아에서 시험되는 수준에서 출발하는) 화합물은 피해져야 한다. 또한 화합물 MitoQ는 '음성의' 고정된 점이다.
그 특성의 시험에 기초하여 새로운 화합물의 선택에서, 그 활성에서 MitoQ 보다 SkQ1에 더 근접한 화합물을 선택해야 한다. 첫번째 위치에서, 활성은 저농도 및 초 저농도에서 항산화 특성을 보이는 능력으로서 정의된다. 그 용량을 증가시키는 미토콘드리아-표적화된 화합물은 다양한 생물학적 대상에 대한 강력한 산화촉진(pro-oxidative) 효과를 갖는다(실험예, 및 또한 Doughan A.K., Dikalov S.I. (2007), Antioxid . Redox Signal. 9:1825-36 참조). 낮은 용량에서, 이 화합물들은 항산화 특성을 보인다.
따라서, 화합물 - 미토콘드리아-표적화된 물질의 가장 중요한 특징은 소위 '적용의 창(window of application)', 즉 이미 항산화 특성을 나타내는 물질의 최소 농도(용량) 및 산화촉진 특성을 나타내는 물질의 최소 농도 (용량)간의 차이이다. 후자의 농도(용량)은 물질의 실질적 적용에서 극도로 바라지 않는 것이고 그러한 적용의 가능성을 상당히 제한할 것이다. 다른 수준에서 '적용의 창'을 평가하기 위한 방법은 실험예 섹션에서 제공된다. SkQ1은 충분한 '적용의 창'을 가지나 MitoQ는 갖지 않기 때문에, 한 쌍의 화합물 SkQ1 - MitoQ은 시험 화합물의 전망을 평가하기 위한 좋은 고정된 점으로서 제공될 수 있다.
시험 화합물의 결과의 해석을 위한 방법은 하기에 제공된다. 방법은 몇 개의 단계로 나뉜다:
1) 인 비트로에서 물질의 특성을 시험하는 것의 결과를 기초로(시험 방법 섹션의 시험 1, 2, 3) 시험 화합물의 항산화 및 산화촉진 특성을 추정할 수 있다; 이것은 항산화제 또는 산화촉진제가 유용한 분야에서 그 적용을 예측하는 것을 가능하게 한다; 또한 인 비트로 시험은 생물학적 막을 통해 투과하는 후보 화합물의 능력을 결정하는 것을 가능하게 하고 따라서 화합물의 생물학적 이용 가능성, 그 안정성 뿐만 아니라생체에서 다양한 장벽(예를 들면, 혈액-뇌 장벽)을 극복하는 그 능력을 예측한다;
2) 본 발명의 측면인 시험 결과의 해석의 예는 실험예 섹션에서 제공된다; 상기 실시예 및 상응하는 해석을 기초로 생화학, 생물물리학, 생물 에너지학, 미생물학, 분자 생물학, 세포 생물학 또는 근대 생물학의 다른 분야의 분야에서 자격이 있는 전문가는 후보 화합물의 시험 결과를 정확하게 평가할 수 있고 요구되는 실질적 적용을 위해 가장 유력하고 가장 적절한 화합물을 선택할 수 있다.
본 발명의 실행가능성 및 제안된 모델의 정확성을 확인하기 위해, 새로운 미토콘드리아-표적화된 항산화제 SkQ3, SkQ4, SkQ5 및 SkQB1이 합성되었다.
V. 본 발명에 의해 전망이 예측되는 화합물의 예:
SkQ3:
Figure pct00008
예측되는 사항: SkQ1과 비교하여 화합물은 더 안정하나 덜 확연한 항산화 특성을 갖을 것이다. 화합물은 식물 생명공학, 진균학 및 미생물학에서 사용될 수 있다.
SkQ4:
Figure pct00009
예측되는 사항: 생물막을 투과하는 능력은 (SkQ1과 비교하여 더 낮다. 그것 때문에 투과의 생물학적 이용 가능성 및 부작용의 심각함은 감소되어야 한다.
SkQ5:
Figure pct00010
예측되는 사항:'스쿨라체프 이온'과 항산화제간의 링커의 길이의 감소는 화합물의 소수성을 감소시키고 막을 통한 화합물의 투과율에 영향을 미칠 수 있다.
일련의 SkQB 화합물은 SkQ1과 비교하여 향상된 투과 능력을 갖는다. 상기 일련은 자연적 화합물, 예를 들면 베르베린이 '스쿨라체프 이온'으로 사용되는 것인 모든 화합물을 포함한다. SkQB 일련의 화합물(예를 들면, 식이 하기에 제공되는 것인 SkQB1)은 향상된 투과 능력을 갖고 그러므로 약학적 관점으로 더 유력하여, 혈액-뇌 장벽 및 혈액-눈 장벽을 극복하는 훨씬 큰 능력을 갖는다. 또한, (팔마틴 뿐만 아니라) 베르베린은 식물 기원의 자연적 화합물이기 때문에, SkQB 일련의 화합물은 덜 심각한 부작용을 갖는다.
Figure pct00011
일반적으로, 베르베린에 기초한 SkQB은 하기 일반식으로 나타낼 수 있다:
SkQB:
Figure pct00012
상기 m은 0 내지 3의 정수(바람직하게는 2, 즉 식의 왼쪽 편은 플라스토퀴논 모이어티임)이고, 'L'은 1 내지 50 유닛의 길이를 갖는 링커로서:
1) 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합, 또는 에테르 결합, 또는 에스테르 결합, 또는 C-S, 또는 S-S, 또는 펩티드 결합을 선택적으로 함유하고; 및 바람직하게는 알킬, 알콕시, 할로겐, 케토 그룹, 아미노 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 직선 또는 분지된 탄화수소 사슬;
2) 자연적 이소프렌 사슬을 포함한다.
바람직하게는, 'L'은 데칸 모이어티이다. 화합물 식의 오른쪽 편은 치환기 원자중 하나를 농한 링커 'L'에 부착된 베르베린 모이어티이다. 부착은 에스테르 결합, 펩티드 결합, 이황화 결합을 포함한 C-C, C-O, C-N, C-S 결합을 통해 이루어질 수 있다. 부착을 포함하는 것은 베르베린의 메톡시 그룹 중 하나를 대신함으로써 에테르 결합을 통해 이루어질 수 있다.
SkQB 일련의 화합물에서, 팔마틴은 베르베린의 위치에 사용될 수 있다.
또한 베르베린 및 팔마틴을 기초로 바람직한 화합물은 하기 화합물들이다:
Figure pct00013
합성 방법 및 상기 화합물의 화학적 특성 및 생물학적 활성의 기재는 실험예 섹션에 제공된다.
VI . 미토콘드리아- 표적화된 항산화제에 기초한 약학적 물질
본 발명의 일 측면은 의학적 실행에서 MAA-기초 약학적 물질을 사용하는 것을 가능하게 하는 조절 문서의 파라미터이고, 특히, 하기 표시자를 포함한다:
1. 하기의 수단에 의해 상세하게 결정된 진실성.
a.제공된 파장 범위에서 분광광도법 및 MAA 시료의 분광광도 연구의 결과와의 비교,
b. IR 분광학. 전반사 장애(Frustrated Total Internal Reflection)의 방법에 의해 얻어진 물질의 적외선 스펙트럼은 선의 위치 및 강도에서 포함된 스펙트럼의 흡수선과 일치된 흡수선을 가져야 한다.
c. 브로마이드에 대한 반응. 클로로포름 층은 노란색으로 변해야 한다.
2. HPLC 방법에 의해 결정된 불순물 함량. 각 개별적인 불순물의 함량은 1.5%를 초과하지 않는다. 총 불순물 함량은 4.0%를 초과하지 않는다.
3. 중금속 함량(0.001%를 초과하지 않음).
4. (에탄올, 메탄올 및 클로로포름과 같은 용매) 잔여 유기 용매 함량.
5. 살균.
6. 물질의 정량.
7. 포장, 표지 및 보관.
8. 확립된 유효 기간.
실제로, 물질 SkQ1, SkQR1, MitoQ 및 기타(상기 참조)을 포함하는 공지된 퀴논-함유 미토콘드리아-표적화된 화합물은 주로 산화된 (퀴논) 형태로 존재한다. 보통 조건 하에서, 산화된 형태는 퀴놀 형태로 부분적으로 환원될 수 있다(도 12 참조). 따라서, 약학적 물질로서 MAA를 사용할 때, 그것의 함량이 5 내지 8%에 도달하거나 그 이상일 수 있는 주요 불순물은 MAA의 환원된 형태이다. 이 형태의 분리 및 상세한 연구는 그것의 높은 화학적 유연성 및 복잡한 산화 환원 전환을 겪는 경향 때문에 어려운 일이다.
다른 한편으로, 크로마토그래피 정제를 위한 표준 방법에 의해 환원된 (퀴놀) 형태가 없는 퀴논 형태로 약학적 물질 MAA의 생산은 이 화합물들의 유사성 때문에 어렵다.
상기 일련의 MAA 제조의 정제 방법에서 맞닥뜨리는 두번째 문제는 특유의 반대 이온(counterion), 예를 들면 브롬(bromine) 이온을 보존할 필요가 있다는 것이다. 이온 교환 또는 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)을 위한 보통의 조건은 상기 불안정한 화합물에 대해 너무 가혹하고 초기 구조에서 반대 이온의 보존을 보증하지 않는다.
따라서, MAA 일련의 제조의 분리 및 정제를 위한 현존하는 방법 및 기법은 그러한 유형의 약학적 물질을 위한 순도의 필요한 파라미터를 제공하지 않는다.
본 발명에서 상기 문제는 하기에 의해 해결될 수 있다:
방법 1. 염이 제거된 완충되지 않은 이동상 시스템에서 비-표준 HPLC의 이용 및 마지막 단계에서 - 제조의 고도로 농축된 용액의 겔 여과.
방법 2. 산화의 효과적인 유도자 또는 퀴논-퀴놀 평형에서 퀴논 형태의 경쟁적 치환기로서 작용하는 비극성 용매에서 작용제의 형태로 MAA의 환원된 형태를 위한 '분자 트랩(molecular trap)'의 이용.
따라서, 본 발명의 또다른 측면은 약학적 물질에 적당한 형태로 MAA를 생산하고 방법 1 및/또는 방법 2를 포함하는 방법이다.
VII . 본 발명의 또다른 측면은 퀴논을 기초로 MAA의 합성을 위한 향상된 방법이다. 향상된 방법은 더 싸고 더 이용가능한 요소를 사용하여 MAA의 산업적 생산(합성)을 가능하게 하고 특히, 플라스토퀴노닐-데실-트리페닐포소포니움 (PDTP) 브로마이드 및 플라스토퀴논의 다른 유도체의 합성의 경우에, 디메틸 히드로퀴논보다 2,3-디메틸페놀이 초기 시약으로서 사용될 수 있다.
합성은 하기 단계로 이루어진다:
1. 존스 시약으로 2,3-디메틸phenol (1)을 2,3-디메틸-1,4-벤조퀴논 (2)으로 산화시키는 단계.
2. 트리페닐포스핀에 11-브로모-운데칸산 (3)의 부착으로 (10-카르복시-데실)트리페닐포스핀 브로마이드 (4)를 형성하는 단계.
3. 질산은 및 암모늄 퍼설페이트의 존재하에 2,3-디메틸-1,4-벤조퀴논 (2)과 생산된 화합물 (4)의 반응에 의해 요구된 화합물 (5)을 형성하는 단계.
합성의 일반적인 개요는 도 13에 제공된다. 좀더 상세하게, 합성은 실험예 8에 기재된다.
도 1. 크산틴과 크산틴 옥시다제의 반응에 의해 형성된 산소 (A) 또는 수퍼옥시드 (B)에 의해 산화된 일반식 (I)의 화합물들의 능력.
도 2. 이중층 막을 통해 투과하는 구조 (I)의 화합물의 능력의 비교 및 막 전위 형성. 비교를 위해, (네른스트 방정식에 따른) 이상적으로 투과하는 단일양이온(monocation)에 대한 추정이 검은색 선으로 보여진다.
도 3. 그라미시딘 채널을 함유하는 인공 모델 막을 사용한 막 단백질에서 미토콘드리아-표적화된 화합물의 보호 또는 손상 효과의 시험. 그라미시딘 채널에 대한 손상은 프탈로시아닌 감광제 (A) 또는 FeSO4, 아스코르베이트 및 터트-부틸 히드로퍼옥시드 (B)의 혼합물의 광활성화에 의해 촉진되었다.
도 4. TPP+ 전극의 사용으로 측정된 미토콘드리아에서 SkQ1 및 SkQ5의 축적.
도 5. 호흡 사슬 요소의 활성에 따른 SkQ1를 환원 또는 산화하는 미토콘드리아의 능력.
도 6. 포타슘 아스코르베이트과 황산철의 혼합물에 의해 야기되는 산화적 스트레스의 조건하에서 SkQ1이 미토콘드리아를 보호한다.
도 7. H2O2 (300 μM)에 의해 유도된 사멸에 대해 세포를 보호한다. 세포는 SkQ1 또는 MitoQ으로 7일 동안 인큐베이트하고 그 후 실험을 위해 접종하였다.
도 8. SkQR1과 HeLa 세포의 짧은 전-인큐베이션 (2시간)은 H2O2 (300 μM)에 의해 유도된 세포의 산화적 스트레스의 수준을 감소시킨다. 낮은 수준의 산화적 스트레스를 갖는 다수의 세포가 추정되는 것(B)의 기초로 세포형광분석법(Cytofluometry) 데이타 (A). 추정은 7회 실험을 기초로 만들어졌다. 데이터는 낮은 DCF-DA 형광의 면적(집단의 50%)에서 다이어그램에 존재하는 대조군 세포에 대해 추정되었고, 이 그룹의 세포는 100%로 수득되고 모든 작용을 위한 표시자는 이 그룹에 상대적으로 추정되었다.
도 9. 7일 동안 SkQ1 (20 nM)으로 세포의 처리는 H2O2 (300 μM)에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대해 HeLa 세포를 보호한다.
도 10. 과산화 수소(100 μM) 및 파라콰트(100 μM)의 존재 하에 대장균 MG1655 pLUX::PsoxS에 발광 유도.
도 11. SkQ1 (10 nM)이 존재하에 과산화 수소(500 μM) 및 파라콰트(100 μM)에 의한 soxS 프로모터의 유도.
도 12. 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 퀴논 및 퀴놀 형태의 평형. R은 지질친화성 이온 ('스쿨라체프- 이온')에 연결된 링커 그룹이다.
도 13. 미토콘드리아-표적화된 항산화제 PDTP의 합성의 향상된 방법의 개요.
실험예
하기는 새로운 미토콘드리아-표적화된 화합물의 개발에 대한 본 발명을 적용하는 가능성을 예시하는 것으로 의도된 실험예이다. 또한 실험(시험)의 결과는 새로운 미토콘드리아-표적화된 화합물을 조사하기 위한 본 발명을 사용하는 분야의 당업자에 의해 개발된(또는 조합 라이브러리로부터 선택된) 새로운 화합물을 위한 전망을 평가하기 위한 시작점이다. 이 점에서, 새로운 화합물을 시험하기 위한 방법이기 때문에, 실험예는 '시험(tests)'이라고 불린다.
실험예 1. 일반식 (I)의 화합물의 산화환원 특성 및 안정성을 인 비트로 시험.
구조 (I)에 상응하는 화합물의 선택에서 제 1 단계는 그것의 산화 환원 특성을 시험하는 것이다. 즉 이 단계에서 미리 결정된 산화촉진제 또는 항산화를 갖는 물질을 선택할 수 있다. 잠재적인 항산화 특성을 갖는 화합물을 선택하는 가장 쉬운 방법은 크산틴와 크산틴 옥시다제의 반응에서 형성된 산소 또는 수퍼옥시드에 의해 산화된 그것의 능력을 시험하는 것이다. 시간에 대한 SkQ1 및 MitoQ의 환원된 형태의 안정성을 이중-빔 파이 유니캠(double-beam Pye Unicam) SP 1100 분광기(잉글랜드)를 사용하여 기록한 240 내지 310 nm 범위에서 상기 화합물들의 절대 흡수 스펙트럼의 분석에 의해 조사하였다. 개발된 방법 하에, 퀴논 유도체들을 20 mM MOPS-KOH, pH = 7.6를 함유하는 매질에서 소듐 테트라히드로보레이트로 환원시켰다. 표준 큐벳은 SkQ1와 MitoQ 중 어느 것도 함유하지 않고, 환원제를 양쪽 큐벳에 첨가 하였으며, 수소가 방출된 후에 측정하였다. 퀴논의 환원 정도는 중량(weighing) 방법에 의해 피크 면적의 크기로 평가하고, 267 nm에서 최대 흡수의 절대값이 비교를 위해 측정하였다. 데이터는 산소에 노출되었을 때, SkQ1의 환원된 (퀴놀) 형태가 MitoQ와 비교하여 대기 중 산소에 의해 산화에 더 저항적이라는 것을 나타낸다(도 1A). 따라서, SkQ1는 산소와 자발적으로 상호 작용하는 것이 덜 쉽고 세포에 대해 덜 유독하다는 것을 잠재적으로 나타내는 라디칼을 형성한다. 한편으로, 화합물들이 크산틴과 크산틴 옥시다제의 작용에서 형성된 산소가 아니라 수퍼옥시드에 의해 산화되면, SkQ1의 산화는 MitoQ의 산화보다 훨씬 더 효과적이었다(도 1B). 이것은 SkQ1이 항산화제로서 좀더 강력하고 그것의 환원된(활성) 형태는 MitoQ와 비교하여 대기 중 산소에 의한 자발적 산화에 좀더 저항적이고 수퍼옥시드 라디칼에 대한 더 높은 친화도를 갖는다는 것을 시사할 수 있다.
실험예 2. 인공적인 검은 막에 대한 미토콘드리아- 표적화된 화합물의 투과 능력의 시험
구조 (I)의 미토콘드리아-표적화된 화합물의 투과 능력을 시험하기 위해, 농도 구배에 따라 이동하는 이중층 인지질 막을 통해 투과하는 이온의 능력에 기초한 방법을 사용하는 것이 제안되었다. 이중층 막은 수성 용액으로 채워진 두개의 챔버를 분리하고 시험 물질을 챔버 중 하나에 첨가하였다. 전하를 띤 물질이 이중층 막을 통해 투과할 수 있다면, 높은 농도의 물질을 갖는 챔버에서 낮은 농도의 물질을 갖는 챔버로 빠른 확산이 일어나고 따라서 막 전위 차이가 만들어진다. 하나의 전하를 전달하고 막을 통해 쉽게 투과할 수 있는 이온에 대해, 10-배 농도 구배는 (네른스트 방정식에 따르면) 60 mV의 전위가 만들어지게 한다.
상기 방법은 막의 지질 이중층을 투과하는 이온의 능력에 대한 다양한 연구에 사용되었고 Starkov AA, Bloch DA, Chernyak BV, Dedukhova VI, Mansurova SA, Symonyan RA, Vygodina TV, Skulachev VP, 1997, Biochem. Biophys Acta, 1318, 159-172의 논문에 상세히 기재되었다. 상기 방법으로, SkQ1, SkQ3, SkQR1 및 MitoQ와 같은, 구조 (I)의 몇몇 물질들을 시험하였다. 5×10-6 내지 5×10-4 M (SkQ3에 대해) 및 5×10-6 내지 5×10-5 M (SkQR1에 대해) 범위인 농도에서 SkQ3 및 SkQR1이 완전히 네른스트 방정식에 따른다는 것을 보여준다. 5×10-5 M 보다 높은 농도에서 SkQR1은 네른스트 방정식에 따르는 것을 중단하는데 이는 아마 높은 농도에서 막을 손상시키는 그것의 능력 때문일 것이다. SkQ1 및 MitoQ 구배는 높은 농도(5×10-5 내지 5×10-4 M의 범위)에서 네른스트 방정식에 따라 전위를 만들기 시작한다. 따라서, 데이터를 기초로, SkQ1 및 MitoQ는 SkQ3 또는 SkQR1과 비교하여 더 적은 투과 능력을 갖는다는 결론을 내릴 수 있다. 가장 높은 투과 능력을 갖는, 즉 잠재적으로 더 생물학적으로 이용할 수 있는 것인 화합물을 신속하게 선택하게 하기 때문에, 이 다소 단순한 방법이 구조 (I)의 제안된 미토콘드리아-표적화된 화합물의 제 1 선택 단계에서 이상적이다.
또한 화합물 SkQB1 및 SkQBP1의 투과 능력을 분석하였다. 그 결과는 상기 화합물들의 높은 투과 능력을 보여주었다(그것의 능력은 SkQ1의 능력보다 더 낮지는 않았다).
실험예 3. 그라미시딘 채널을 함유하는 인공 모델 막을 사용하여 막 단백질에 대한 미토콘드리아- 표적화된 화합물의 보호 또는 손상 효과의 시험
본 실험실에서, 이중층 막, 전도성 단백질 그라미시딘 및 감광제 (Mito Tracker Red, 3회 설폰화된 알루미늄 프탈로시아닌 또는 아연 프탈로시아닌)로 구성되는 단순한 시스템에서 화합물의 항산화 활성을 연구하는 것을 가능하게 하는 방법을 개발하였다. 방법은 그라미시딘 채널을 손상시키는 감광제 분자의 광활성화에 의해 발생되어 이중층 막의 전도 능력에 급격한 감소가 야기되는 활성 산소 종의 능력에 있다. 감광제를 제외하고, 그라미시딘 채널에 대한 손상은 히드록실 라디칼과 같은 고도(highly) 활성 산소 종의 형성을 유발하는 펜톤 반응(펜톤 반응은 FeSO4, 아스코르베이트 및 터트-부틸 히드로퍼옥시드의 혼합물에 의해 개시됨)을 개시함으로써 유도할 수 있다. 상기 방법으로, 화합물 SkQ1, SkQ3 및 MitoQ을 시험하였다. 도 3A는 빛의 짧은 플래쉬에 의한 프탈로시아닌의 광활성화는 이중층 막에서 그라미시딘 채널에 손상 때문에 막 전도에서 강력한 감소로 이어진다는 것을 보여준다. 막 전도의 떨어짐은 수퍼옥시드 디스뮤타제(이것은 수퍼옥시드를 다소 낮은 활성 과산화 수소로 전환을 촉매함)에 의해서뿐만 아니라 소듐 아지드(일중화(singlet) 산소를 포획하는데 상당히 효과적인 시스템)에 의해 효과적으로 차단할 수 있었다. 소듐 아지드 및 수퍼옥시드 디스뮤타제 중 어느 것도 이중층 막의 전도에서 완전히 떨어지는 것을 막지 못한다. 이 사실은 프탈로시아닌의 광활성화는 일중화 산소 및 수퍼옥시드 모두의 발생과 연관된다는 것을 나타낸다. 이 모델에서, SkQ1이 다양한 활성 산소 종에 대해 보호하는 넓은 스펙트럼 항산화제이기 때문에, SkQ1이 가장 효과적이었다. 다른 모델에서, 그라미시딘 채널에 대한 손상은 FeSO4, 아스코르베이트 및 터트-부틸 히드로퍼옥시드의 혼합물에 의해 촉진되는 것으로, SkQ1이 또한 가장 효과적이었고, 반면에 MitoQ 및 SkQ3은 덜 효율적인 항산화제인 것으로 나타났다 (도 3B).
합성된 화합물의 항산화 능력을 시험하기 위해 사용된 상기 방법은 상당히 효율적이고 화합물의 항산화 활성을 평가할 뿐만 아니라 특정한 활성 산소 종을 향한 화합물의 특이성을 결정하는 것을 가능하게 한다. 상기 방법의 표준 물질로서, 활성 산소 종의 넓은 범위를 향해 항산화 활성을 보이는 가장 효율적인 화합물로서 SkQ1을 사용하는 것이 정확할 것이다.
실험예 4. 분리된 미토콘드리아에 대한 미토콘드리아- 표적화된 화합물의 항산화 또는 산화촉진 효과의 시험
연구의 대상이 미토콘드리아인 다수의 방법들이 있다. 높은 정도의 확실성으로 일반식 (I)의 미토콘드리아-표적화된 화합물의 잠재적인 생물활성을 결정할 수 있게 하는 가장 유용한 정보를 주는 방법을 선택하였다.
i) 미토콘드리아에 축적되는 일반식 (I)의 화합물들의 능력을 시험
미토콘드리아에 축적되는 일반식 (I)의 화합물들의 능력은 테트라페닐포스포니움-선택적 전극을 사용하여 시험하였다. 상기 방법은 지질친화성 양이온 테트라페닐포스포니움이 표적 그룹으로서 사용되는 것인 일반식 (I)의 화합물들을 위해서만 사용될 수 있다. 이 전극으로, 미토콘드리아 매트릭스와 매질 간의 테트라페닐포스포니움 양이온 (또는 이 양이온을 포함하는 화합물)의 분포를 측정하는 것이 가능하다. 도 4는 SkQ1이 15 내지 20 분 사이에 미토콘드리아에 축적되는 것을 보여준다. 산화적 인산화 언커플러(uncoupler) FCCP에 의해 유발된 미토콘드리아 막 전위의 떨어짐은 미토콘드리아로부터 다소 적은 수의 SkQ1의 유리로 이어진다. SkQ1이 지질친화성 양이온인 것을 고려하면(SkQ1에 대한 옥타놀/물 분배 비율은 20000/1임), 미토콘드리아의 에너지화(energization)의 정도와 관계없이 SkQ1의 주요 양이 미토콘드리아에 축적된다. 덜 지질친화성인 SkQ5이 SkQ1 대신에 사용된다면, 에너지-독립적 축적의 수준은 현저히 감소된다. 시험된 화합물의 잠재적인 생물학적 이용 가능성을 예측하기 위해서 뿐만 아니라, 미토콘드리아의 기능적 상태에 대한 그들의 축적의 속도에 의존하여, 상기 방법은 미토콘드리아에서 일반식 (I)의 화합물들의 축적의 효율을 조사하게 할 수 있다.
ii ) 미토콘드리아 호흡 사슬에 대한 환원되는 일반식 (I)의 화합물들의 능력 측정.
본 발명에서 제안된 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 핵심적인 장점은 미토콘드리아 호흡 사슬에 의해 환원되는 그것의 능력이다. 미토콘드리아 호흡 사슬로 일반식 (I)의 화합물들의 환원을 연구하기 위해, 랫트 간 미토콘드리아의 분리 배지 중 호흡 기질의 존재 하에 화합물의 산화 및 환원된 형태간의 비율의 변화율을 측정하였다. 측정은 미토콘드리아의 존재 하에 수행하였다. 실험은 SkQ1이 미토콘드리아 호흡 사슬에 의하여 환원될 수 있다는 것을 보여주었다. 산화를 위한 다양한 기질의 사용은 SkQ1이 복합체 I(미토콘드리아가 글루타메이트 및 말레이트에 의하여 에너지화됨) 및 복합체 II(산화의 기질은 숙시네이트) 모두 환원될 수 있다는 것을 보여주었다(도 5A). 내재적 기질의 영향을 제거하기 위해, 복합체 II 저해제인 말로네이트 뿐만 아니라 복합체 I 저해제인 로테논을 사용하였다. 로테논의 존재 하에 말로네이트에 의한 복합체 II의 저해는 아마도 복합체 III에 의해, SkQ1의 산화를 촉진하였다. 믹소티아졸에 의한 복합체 III의 저해는, 차례로, SkQ1을 산화시키는 복합체 III의 능력을 확정하는, 산화를 막았다(도 5B). 복합체 III에 대한SkQ1의 산화는 복합체 I 및 복합체 II에 의한 그것의 환원보다 훨씬 느리다(도 5B). 이 데이터는 에너지화된 미토콘드리아에서, SkQ1이 항산화 특성이 나타나는 것인 주로 환원된 상태(퀴놀 형태)라는 것을 나타낸다.
따라서, 상기 방법은 미토콘드리아 호흡 사슬에 의해 환원되는 일반식 (I)의 화합물의 능력을 연구하도록 하고, 더 나아가, 상기 데이터에 근거하여 시험 화합물의 산화촉진제 또는 항산화 특성을 예측할 수 있다.
iii ) FeSO 4 및 아스코르베이트의 혼합물에 의해 유도된 미토콘드리아 산화적 스트레스의 조건 하에 일반식 (I)의 화합물들의 항산화 활성 시험.
미토콘드리아, 세포 배양 또는 조직에서 산화적 스트레스의 결정을 위해 가장 폭넓게 사용되는 방법 중 하나는 말론디알데히드의 정량적 결정을 위한 방법이다. 이 경우에서 산화적 스트레스는 다양한 방법에 의해 유도될 수 있다: 터트-부틸 히드로퍼옥시드, 큐멘(Cumene) 히드로퍼옥시드, 과산화수소, 크산틴/크산틴 옥시다제, 황산철 및 포타슘 아스코르베이트의 혼합물 등. 실험에서 산화적 스트레스를 개시하기 위해, 황산철 및 포타슘 아스코르베이트의 혼합물을 사용하였다. 미토콘드리아 대사에서, 특정한 양의 H2O2이 형성되나 생리적 조건하에서 다양한 항산화 시스템에 의해 빠르게 사용되기 때문에 위험하지 않다는 것이 알려져 있다. 미토콘드리아를 함유하는 배지에 포타슘 아스코르베이트과 조합한 황산철의 첨가는 H2O2와 제1철(ferrous iron)의 반응(Fenton 반응)을 야기하여 고도 활성 히드록실 라디칼을 형성한다(Fe2 + + H2O2 → Fe3 + + ?OH+ -OH). 차례로, 히드록실 라디칼은 막의 불포화 지방산과 반응하고 그것의 자유 라디칼 산화를 촉진하여, 결국 말론디알데히드의 축적으로 이끈다. 이러한 모델은 일반식 (I)의 화합물을 포함한 다양한 항산화제의 유효성을 연구하기 위해 상당히 적절하다. 도 6은 SkQ1의 항산화 활성을 시험한 결과를 보여준다. 보이는 바와 같이, SkQ1의 가장 높은 항산화 활성은 20 내지 50 nM의 농도에서 이미 나타났다. 미토콘드리아 현탁액에 믹소티아졸 (복합체 III 저해제)의 첨가는 SkQ1의 항산화 능력을 크게 향상시키는 복합체 III에 의한 SkQ1의 산화를 막는다. 결과들은 SkQ1의 항산화 능력을 확실히 하고, 더우기, 미토콘드리아 호흡 사슬에 의해 환원된 항산화의 능력의 중요성을 보여준다.
따라서, 높은 정도의 정확성을 갖는 말론디알데히드의 정량적 측정을 위한 방법은 그것의 효과적 농도를 시험할 뿐만 아니라 시험 화합물의 산화촉진 또는 항산화 특성을 예측하는 것을 가능하게 한다.
실험예 5. 동물, 식물, 세균 또는 균류 세포 배양에서 미토콘드리아- 표적화된 화합물의 항산화 또는 산화촉진 작용의 시험.
세포 배양에서 화합물의 생물학적 활성을 시험하기 위한 다수의 다른 방법이 있다면, 이 섹션은 그것의 단순성 및 정보제공성 때문에, 일반식 (I)의 화합물들을 초기 시험에 가장 적절한 것인 방법들만을 기재할 것이다.
a. 동물 세포 배양에서 미토콘드리아- 표적화된 화합물의 작용을 시험
인간 자궁 상피암 세포 주 HeLa 및 폐와 피부로부터 유래된 정상 인간 배수체 섬유아세포를 일반식 (I)의 화합물의 항산화 능력을 시험하기 위한 모델로서 선택하였다. 화합물의 항산화 능력을 시험하는 것은 세포형광분석법 및 형광 현미경 검사의 방법을 사용하여 수행하였다. 각 세포 배양을 위한 사전 실험에서 세포 괴사(necrosis)의 명확한 신호가 나타나지 않고 중요한 (60 내지 80%) 세포 자살을 유발하는 H2O2의 적정 농도를 선택하였다. 세포 자살성(apoptotic) 세포에서 일어나는 염색질 응집 및 단편화을 결정하기 위해, 형광 염료 훼스트(Hoechst)를 사용하였다. 30분 동안의 인큐베이션의 마지막에 살거나 고정된 세포에 1 ㎍/ml의 농도로 염료를 가하였다. 세포 괴사를 결정하기 위해, 고정되지 않은 세포에 2 ㎍/ml의 농도로 형광 염료 프로피이움 이오디드(propidium iodide, PI)를 가하였다. 세포 자살성 및 세포 괴사성 세포의 백분율은 각각, 분절된 핵(nuclei)을 갖는 세포의 수와 프로피디움 이오디드가 투과할 수 있는 세포를 계수함으로써 결정하였다.
미토콘드리아-표적화된 항산화제를 투과시키는 실험에서 화합물의 투과 능력에 의존하여, 세포 배양으로부터 미토콘드리아에 축적되기 위해 필요한 시간이 달라질 것이라는 것을 인지하는 것이 필요하다.
특히, 세포가 5 내지 7일 동안 SkQ1 및 MitoQ와 인큐베이트되는 경우에만 SkQ1 및 MitoQ는 H2O2에 대한 세포의 저항성을 증가시킨다는 것을 보여주었다. 미토콘드리아 막 전위에서 떨어짐을 유발하는 산화적 인산화 언커플러 FCCP는 SkQ1 및 MitoQ의 보호적 효과를 막았다. 이것은 시험된 화합물이 정말로 미토콘드리아-표적화된다는 것을 시사하는 중요한 대조군이다. 미토콘드리아-표적화된 항산화제인, SkQ1 및 MitoQ은 매우 낮은 농도에서 그 효과를 발휘한다. 특히, SkQ1는 0.2 nM의 농도에서조차 보호 효과를 발휘한다(도 7). 도 7은 SkQ1이 MitoQ와 비교하여, 훨씬 더 효과적으로 죽음에 대항해 세포를 보호하고, 즉 SkQ1이 좀더 효과적인 항산화제라는 것을 보여준다. 임의의 항산화제처럼, SkQ1 및 MitoQ는 산화촉진 활성을 나타내는 것 이상의 한계 농도를 갖고, 특히, 0.5 μM 초과의 SkQ1 및 MitoQ의 농도에서 H2O2에 의해 유도된 세포 사멸 촉진을 유발하는 산화촉진 활성을 나타낸다.
H2O2에 의해 촉진된 산화적 스트레스의 수준을 측정하기 위해, 세포를 형광 염료 DCF-DA (2',7'-디클로로-디히드로플루오레세인 디아세테이트)로 염색한 다음 염료의 형광 수준을 세포 형광분석기로 측정하였다. 이 방법으로, 1 내지 5시간 동안 SkQ1 또는 MitoQ와 세포의 인큐베이션은 세포에서 H2O2-유도된 산화적 스트레스를 막지못했다는 것을 보여주었다. 동시에, 더 높은 투과 능력을 갖는 SkQR1 (소수성 양이온인 로다민 G 모이어티이 테트라페닐포스포니움의 위치에서 표적 그룹으로서 사용되었음)은 정해진 시간 창 내에서, 그리고 SkQ1과 비교하여 더 낮은 농도에서 항산화 활성을 이미 갖는다 (도 8A, B). MitoQ(미표시) 뿐만 아니라 SkQ1(도 9)는 세포와 5 내지 7일의 인큐베이션 후에만 그 항산화 특성을 나타냈다. 결과적인 시간 의존성은 SkQR1, SkQ1 및 MitoQ의 투과 능력과 잘 연관되어 있다(이 양이온의 투과 능력은 하기 순서로 기재될 수 있음: SkQR1 > SkQ1> MitoQ).
따라서, 상기 방법은 산화적 스트레스에 의해 유발된 죽음에 대항하여 세포를 보호하는 일반식 (I)의 화합물의 능력을 결정하는 것을 가능하게 한다. 또한, 상기 방법은 일반식 (I)의 화합물들에 기초한 조제의 치료적 용량 및 투여의 타이밍을 예측하는데 도움을 줄 것이다.
b. 대장균 세포에서 미토콘드리아- 표적화된 화합물의 작용을 시험
일반식 (I)의 미토콘드리아-표적화된 화합물의 산화촉진 및 항산화 특성을 시험하기 위해 대장균 세포에서 산화적 스트레스를 결정하기 위한 방법을 개발하였다. 이 목적을 위하여, 세균 세포에서 산화적 스트레스에서 이온을 투과하는 효과를 연구하기 위해 세균 루시퍼라제를 암호화하는 luxAB 유전자에 기초한 바이오센서 시스템을 생성하였다. 루시퍼라제는 분자 유전학(리포터 유전자), 생화학적 분석(예를 들어, ATP의 흔적 양의 결정), 유전 공학 작업(선별), 생명공학 및 생태학(바이오센서) 등의 연구에서 현재 폭넓게 사용된다. 높은 민감도, 루미노미터나 섬광 계수기의 사용으로 빛 신호의 검출의 용이성, 몇 자리수 내에서 효소 루시퍼라제의 양과 생발광 강도간의 직접적인 비례, 인 비트로 및 인 비보(세포를 손상시키지 않고) 모두에서 측정하는 가능성 및 다른 잇점들은 다양한 유전적 및 생화학적 시험에서 루시퍼라제 유전자의 적용을 지지한다. 개발된 방법에서, 육상 박테리아 포토라브두스 루미네센스 유래의 루시퍼라제를 암호화하는 유전자를 사용하였다 [1]. 그람-음성 박테리아 Ph . 루미네센스는 곤충병원성 선충의 공생자이다. Ph . 루미네센스 유래의 루시퍼라제는 리포터로서 lux 유전자의 사용을 가능하게 하는 높은 열 안정성(45 ℃까지 온도에서 활성이 남아 있음)을 특징으로 한다.
물, 흙, 음식, 공기 등 화학적 오염물질(독성물질)을 시험하기 위해, lux-바이오센서는 현재 두가지 변이체로 사용되고 있다:
1) 독성 물질에 의해 퀀칭되는 생발광에 기초;
2) 독성 물질에 의해 생발광 강도의 유도(증가)에 기초.
첫번째 변이체에 관련된 방법은 세포 현탁액의 생발광 강도에서 감소로 초래되는 루시퍼라제 반응을 간접적으로 영향을 미치는, 세포 대사, 주로 호흡 사슬에서 독성 물질의 저해 효과의 메카니즘의 사용을 포함한다.
두번째 변이체에 관련된 방법은 독성물질에 의해 유도된 세포 발광의 강도의 유도(증가)에 기초한다. 이 방법들은 진화의 과정에서 세균에 의해 개발되고 환경에서 특정한 화학적 물질의 존재에 특이적으로 반응하는 특정한 호흡 인자의 사용을 위한 다양한 선택을 포함한다. 바이오센서의 상기 언급된 그룹은 화학적 화합물과 수용체 단백질(억제물질 또는 활성물질)의 상호작용에 기초하기 때문에 특이성 및 높은 민감도를 제공한다. 박테리아에서, 1) 세포막, 2) 단백질, 3) 염색체(chromosome)(DNA), 및 4) 세포에서 산화적 스트레스를 포함하여 작용하는 독성 물질에 특이적으로 반응하는 조절 시스템을 구별할 수 있다. 또한, 세균은 중금속 및 비소 이온에 특이적으로 반응하는 조절 시스템을 갖는다. grpE: P grp E 프로모터는 세포 단백질에 작용하는 독성 물질(예를 들어, 다양한 페놀 유도체, 알콜)에 대한 바이오센서로서 사용될 수 있다. 상기 프로모터는 열 충격 유전자의 박테리아 게놈 상류에 위치하고 변형, 변성된 단백질이 세포에 나타날 때에만 활성화된다. PrecA SOS 프로모터는 DNA-친화(tropic)작용제(자외선 및 이온화 방사선뿐만 아니라, 미토신 C, 메틸 메탄설포네이트, 디옥신)을 위한 바이오센서로서 사용된다. LexA 단백질이 억제제이다. PrecA 프로모터는 게놈, 즉 DNA 분자에 손상의 유도 시에만 활성화된다. 세포에서 산화적 스트레스를 유도하는(세포에서 히드록실 라디칼(OH.), 수퍼옥시드 이온-라디칼(O2 -), 과산화 수소(H2O2)를 형성하는) 물질을 검출하기 위해, PkatG 및 PsoxS 프로모터가 사용된다. PkatG 프로모터(활성물질 OxyR)는 과산화 수소, 유기 퍼옥시드 등에 특이적으로 반응한다. PsoxS 프로모터는 수퍼옥시드 이온 라디칼이 환경에 나타날 때 활성화된다. 상기 유도성 프로모터를 기초로 lux-바이오센서를 개발하였다.
개발된 방법에 사용된 모든 프로모터는, 상응하는 조절 영역(regulatory region)을 갖고, 특이적 합성된 프라이머의 사용에 의한 PCR 방법에 의해 대장균 K12 MG1655 세균의 게놈으로부터 수득되었다. pBR322 레플리콘과 암피실린에 저항성을 책임지는 bla 유전자(선택적 마커)를 갖는 프로모터가 없는 벡터를 벡터로서 사용하였다. 플라스미드로 프로모터 영역을 끼워넣는 것을 EcoRI-BamHI 위치에서 수행하였다. 다섯개의 유전자인 luxCDABE로 구성되는 Ph. 루미네센스의 lux 오페론을 lux 카세트로 선택하였다.
모든 바이오센서는 일반식 (I)의 미토콘드리아-표적화된 항산화제와 작업하는 적합성을 시험하였다.
일반식 (I)의 미토콘드리아-표적화된 항산화제, 특히, SkQ1 및 MitoQ는 그 구조가 퀴논 유도체를 포함하고 높은 효율로 하전된 막에 축적되기 때문에, 산화적 스트레서에 어떻게든 관련된 바이오센서에 높은 특이성을 가장 가질 것 같다는 것이 밝혀졌다. 그러므로, pLUX::PkatG 및 pLUX::PsoxS 바이오센서의 사용은 최적인 것으로 보인다. 이 과정에서 산화적 스트레스에서 DNA 손상 고정 및 이온 투과의 효과는 pLUX::PrecA 바이오센서를 사용할 때 가능하다. pLUX::PgrpE 및 pLUX::Plac 바이오센서는 양성 및 음성 대조군으로서 명확하게 사용될 것이다.
시험의 첫번째 상(phase)에서, 발광(luminescence)의 최대 유도가 일어나는, 산화적 스트레스 유도의 조건을 선택하였다. 도 10은 바이오센서의 생물발광을 유도하는 H2O2 및 파라콰트(paraquat)의 능력을 보여준다. H2O2의 존재 하에 대장균 MG1655 pLUX::PkatG에서 발광의 유도는 15분 이내에 명확해지고 한 시간 동안 최대값에 도달하였다(도 10A). 대조군 세포와 유도된 세포 간의 발광의 강도의 비율은 H2O2의 최적 농도에서 1/80이다. 파라콰트의 존재 하에 대장균 MG1655 pLUX::PsoxS에서 발광의 유도는 15 내지 20분 사이에 명확해지고 2 시간 동안 최대값에 도달하였다(도 10B). 대조군 세포와 유도된 세포 간의 발광의 강도의 비율은 파라콰트의 최적 농도의 1/100이다.
다음 단계에서, 일반식 (I)의 화합물의 산화촉진 또는 항산화 능력을 시험하는 것이 가능하게 된다. pLUX::PkatG 및 pLUX::PsoxS 바이오센서의 도움으로, 대장균에서 산화적 스트레스의 조건에서 SkQ의 항산화 특성을 시험하였다. 10 μM SkQ는 과산화 수소에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 기인하는 수퍼옥시드 음이온 라디칼에 대항하여 세포를 효율적으로 보호하는 것을 보여주고, 상기 SkQ의 농도는 파라콰트에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대해 주목할만한 효과를 갖지 않았다(도 11). 이런 차이는 과산화 수소와 파라콰트에 의한 활성 산소 종의 다른 방법의 생성 때문일 것이다. 과산화 수소로, 산화적 스트레스는 단시간 동안 유도되고(H2O2는 세포에서 항산화 방어 효소에 의해 능동적으로 분해됨), 반면에 파라콰트에 의해, 산화적 스트레스는 훨씬 오래 지속된다. 또한, 대장균 세포에서, 세포 밖으로 양성 양이온을 배출하는 다제 내성(multidrug resistance, MDR) 시스템은 능동적으로 기능을 한다는 것을 보여준다. 이 효소들의 활성은 SkQ1 및 그 유사체의 효능을 극적으로 감소시킨다. 따라서, H2O2에 의해, SkQ1은 MDR 단백질에 의해 세포 밖으로 배출되기 전에, 산화적 스트레스에 대항하여 세포를 보호할 시간을 갖고, 반면에 파라콰트에 의해, SkQ1는 더이상 효과적이지 않다.
결과들은 개발된 시험 방법이 일반식 (I)의 화합물의 산화촉진 또는 항산화 능력을 시험하기 위한 신뢰할 만하고 빠른 도구라는 것을 보여주었다.
실험예 6. 동물 및 식물에서 일반식 (I)의 화합물의 생물학적 활성의 인 비보 시험.
동물 또는 식물에서 일반식 (I)의 화합물의 인 비보 시험은 이전 섹션의 모든 시험을 투과하고 잠재적인 생물학적 활성을 증명한 화합물에 대해서만 적용할 수 있다. 이것은 인 비보 실험의 준비를 위해 가장 유용한 정보를 주는 결과를 얻기 위해 연구자에 의해 사용되어야 하는 모델을 개발하는 것이 필수적인 약물 작용에 대한 잠재적인 표적에 관하여 완전한 정보를 갖는 것이 필수적이라는 사실 때문이다. 선택 이전 단계에서 인 비보 실험을 위해, 생물학적으로 활성인 약물의 주된 가능성을 평가하는 것을 가능하게하는 가장 단순한 방법이 사용되어야 한다. 이 목적을 위해, 갑각류인 세리오다프니아 아피니스(Ceriodaphnia affinis)같은 작은 무척추 동물이 모델 대상으로 사용될 수 있다. 그 대상, 특히, 동물성 플랑크톤 개체는 환경 오염의 추정, 물질의 추출물의 생물학적 영향에 대한 연구, 식품, 의학적 준비에서 대중적인 시험 대상이 된다. 압도적인 수의 적용에서, 추정은 생존, 시험 대상의 행동 및 어떤 생리적 기능을 고려한 단기 실험으로 이루어진다. 만성 형태에서 약한 영향의 효과의 확인을 위해, 상기 한도로부터 떨어진, 성장 및 생식과 같은 그런 중심적인 개인적 한도는 또한 조절 하에 있다.
만성 형태에서 시험 대상에 대한 화학적 작용제의 효과를 정량화에서, 독성 효과의 상 특성(phase character)이라고 불리는 현상, 즉 잠재적으로 독성 물질에 의해 유발된 구조적 요소의 생물학적 기능 또는 발생의 활성의 억압(depression) 및 자극의 교대가 나타난다. 결과로서, 어떤 농도에서 많은 잠재적인 독성물질은 전체에서 어떤 기능 및 시험 대상에 대해 일시적인 자극 효과를 가질 수 있다. 따라서, 이 경우에 실제로 독성인 준비의 유리한 상에서 존재하는 위험을 배제할 수 있기 때문에 준비의 유리한 효과를 위한 중요한 기준은 생물의 전체 수명이다.
자연적 일생의 기간 동안 갑각류인 세리오다프니아 아피니스의 기본적인 생명 기능에 대한 다른 농도의 준비 SkQ1의 효과는 특별한 주의를 가지고 준비의 자극 효과를 연구하였다.
실험의 첫번째 연속에서 (각 연속에서 동물의 수는 20 개체였음) 에탄올(0.79 mg/l)의 존재에서 갑각류의 생존은 대조군과 상이하지 않았다(도 4). 5.5 및 0.55 nM SkQ1의 농도에서, 갑각류의 생존은 대조군 보다 높았고, 반면에 55 nM의 농도에서, 생존은 더 낮았다. 0.55 및 5.5 nM SkQ1의 농도에서 갑각류의 고정된 군집에서 죽는 시간은 전체 관찰 기간 동안 증가하였고, 반면에 50%에서 죽는 시간은 각각 대조군에서 파라미터의 2 및 1.4 배를 초과하였다(표 1).
표 1. SkQ1에 의해 유발된 세리오다프니아 아피니스의 죽는 고정된 시간(일)
Figure pct00014
0.55 및 5.5 nM SkQ1의 농도에서 갑각류의 평균 수명이 대조군에 비해 높았고, 55 nM SkQ1의 농도에서는 더 낮았으며, 이러한 차이는 통계적으로 중요하다(표 2).
표 2. SkQ1에 의해 유발된 세리오다프니아 아피니스의 평균 수명
Figure pct00015
*- 차이가 통계적으로 유의함
따라서, 이 결과는 수명을 늘이는 결과가 되어 작은 무척추동물의 생명 활성에 대한 유익한 효과를 갖는 SkQ1의 능력을 나타낸다. 또한, 생물에 대한 유익한 효과를 갖는 화합물의 농도를 선택하고, 그것을 고등 동물에서 일반식 (I)의 시험 준비의 생물학적 활성을 시험하는 실험에 사용할 수 있다
실험예 7. '분자 트랩( molecular trap )'을 사용한 미토콘드리아- 표적화된 항산화제의 정제를 위한 방법
1. 에탄올-클로로포름 (1:9) 시스템에서 실리카 겔 전처리한 후 초기 기술적 산물 PDTP (5 g)은 약 85%의 순도를 갖는다. 환원된 형태의 함량은 8%이다.
기본적인 불순물을 제거하기 위해, HPLC 방법을 사용하였다. C18 컬럼, 500 × 45 mm. 이동상-염이 없는 완충되지 않은 물-에탄올 용액. 구배 형태. 시스템 A - 15% 에탄올, 시스템 B - 40% 에탄올.
가운데 분획을 수집한 후 제조의 순도는 약 92%이다. 환원된 형태의 함량은 6%이다.
브로마이드에 대한 초기 및 정제된 생성물의 상대적 정성 반응은 크로마토그래피 정제 후 브로마이드 이온의 보유를 보여준다
물 중 65% 아세토니트릴 중 0.05% 트리플루오로아세트산의 시스템에서 C18 컬럼, 250 × 4.6 mm의 분석적 HPLC는 또한 초기 및 정제된 생성물에 대한 브로마이드 이온(크로마토그램의 시작에서)의 거의 동일한 피크 강도를 보여준다.
2. HPLC에 의한 정제 (3.8 g), 용매 증발 및 높은 진공 하에서 건조된 후, 생성물은 진하고, 맑은 오일이며, 색이 어두운 갈색의 형태를 갖는다. 제조에서 환원된 형태의 함량을 최소화시키기 위해, '분자 트랩'의 방법의 변형을 사용하였다.
오일이 있는 플라스크에 200 ml의 헥산을 부은 다음, 5 ml의 아세톤을 첨가하고 혼합물을 30분 동안 자석 교반기로 격렬하게 교반하였다. 그 다음 용매 층을 조심스럽게 분리하였다. 용매의 분리된 부분의 크로마토크래피 대조군과 잔류 오일이 만들었다. 용매의 HPLC 크로마토그램은 아세톤의 작은 피크와 환원된 형태의 높은 피크만을 포함하였고; 주요 산화된 형태는 소실되었다.
요구되는 생성물의 크로마토그램은 환원된 형태의 함량에서 명확하게 감소를 보여준다.
환원된 형태의 함량을 더 최소화하기 위해, 몇번의 과정을 반복하는 것이 요구될 수 있다.
용매의 신선한 부분의 계속적인 공급(feed) 및 사용된 용액의 처리를 수반하는 자동 형태로 과정을 수행하는 것이 가능하다.
상기 방법으로, 기본적인 물질의 손실이 없다는 것을 유의하는 것은 중요하다. 브로마이드 이온은 보존된다.
생성물의 순도는 약 97%이다. 환원된 형태의 함량은 1.0% 이하이다.
2. 에탄올 용액에서 겔 크로마토그래피.
이 정제 방법은 보관에서 농축된 용액의 정량 병에 넣기, 건조 및 보관소에 넣기 전에 최종 단계로서 적절하다.
제조의 약 3.7 g을 5 내지 6 ml의 에탄올에 녹이고 순수 에탄올(분광광도 법 급)로 전-평형화된 세파덱스 LH-20의 600 × 10 mm 컬럼으로 크로마토그래피시켰다.
처음과 마지막 분획을 버렸다. 주요 분획의 순도는 적어도 98%이다. 환원된 형태의 함량은 0.8 내지 0.9%이다. 제조의 농도는 150 내지 200 mg/ml에 도달할 수 있다. 이 용액은 최종 형태로 분액의 제조 및 물질의 건조에 편리하다.
실험예 8. 플라스토퀴노닐 -데실-트리페닐포스포니움( 플라스토퀴노닐 -데실-triphenylphosphonium, PDTP ) 브로마이드의 합성
합성은 하기 단계를 포함한다:
1. 존스(Jones) 시약으로 2,3-디메틸페놀 (1)을 2,3-디메틸-1,4-벤조퀴논(2)으로 산화시키는 단계.
2. 11-브로모-운데칸산(3)을 트리페닐포스핀에 부착하여 (10-카르복시-데실)트리페닐포스핀 브로마이드(4)을 형성하는 단계.
3. 질산은과 과황산 암모늄(ammonium persulfate)의 존재 하에 2,3-디메틸-1,4-벤조퀴논(2)과 상기 생성된 화합물(4)의 반응에 의해 요구된 화합물(5)을 형성하는 단계.
합성의 개요는 도 2에 표시된다.
2,3-디메틸-1,4- 벤조퀴논(2)의 합성
존스 시약(157 ml의 물 및 70 ml의 농축 황산의 혼합물 중 110 g(0.37 mol)의 Na2Cr2O7×2H2O의 용액)을 230 ml의 에테르 중 20 g(0.16 몰)의 2,3 디메틸페놀의 용액에 교반하면서 첨가하고 상기 혼합물을 24 시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 에테르로 추출하고, 합친 에테르 추출물을 세척한 다음 소성(calcined) 황산 마그네슘으로 건조시키고 회전 증발기에서 용매를 제거한 후 잔여물은 클로로포름 중 실리카 겔에 플래쉬 크로마토그래피(flash chromatography)하였다. 노란색 결정질 물질의 형태인 화합물 2의 수율은 8.7 g (40%)이다.
TCX: Rf (CHCl3) = 0.46; HPLC: τ= 17.4 분 (26.4 분 동안 0-90 % B; A: 10 mM H3PO4, B: AcCN), m.p.58 ℃(56.5-57.5 ℃)1; UV (CH3OH): λmax 209 nm, 256 nm, 344 nm; ESI MS: C8H8O2에 대한 m/z 계산값 136.15; 실측값 136.2.
(10- 카르복시 -데실)트리페닐포스핀 브로마이드(4)의 합성
588 mg (2.24 mmol의 트리페닐포스핀을 530 mg (2 mmol)의 11-브로모-운데칸산에 첨가하고 상기 혼합물을 밀봉된 관에 85℃ 12 시간 동안 두었다. 그 후 상기 혼합물을 클로로포름 - 메탄올 (9:1)의 시스템으로 실리카 겔 컬럼에서 분리시켰다. 맑은 오일 형태인 화합물 4의 수율은 895 mg (85%)이다.
TCX: Rf 0.52 (클로로포름 - 메탄올, 4:1); HPLC: τ= 7.28 분 (11.5 분 동안 5 - 95% B; A: 0.1% TFA; B: 아세토니트릴 중 0.1% TFA); UV 스펙트럼 (0.1% TFA - 아세토니트릴, 38:62): λmax 200 nm, 224 nm, 268 nm; ESI MS: C29H36OP에 대한 m/z 계산값: 447.6; 실측값 448.2 (MH+; 100%).
[10-(4,5-디메틸-3,6- 디옥소 - 시클로헥사 -1,4- 디엔 -1-일)데실]- 트리페닐포스포니움 브로마이드, PDTP 브로마이드 (5)의 합성
5 ml의 물 중 228 mg (1 mmol)의 용액을 80 내지 90℃에서 40 ml의 아세토니트릴과 물의 혼합물 (1:1) 중 135 mg (1 mmol) 2, 526 mg (1 mmol) 4 및 85 mg (0.5 mmol)의 질산 은의 용액에 가하였다. 혼합물을 12 시간 동안 동일한 온도에서 교반하면서 가열하였다. 혼합물을 물로 희석하고 디클로로메탄으로 추출하였다. 작은 부피로 디클로로메탄을 증류한 후, 생성물을 디에틸 에테르로 침전시켰다. 용액을 침전으로부터 분리하고, 침전을 여러 번 재침전시켰다. 마지막에, 침전은 디클로로메탄 - 에탄올의 혼합물(9:1의 비율로)에서 실리카 겔 컬럼으로 정제하였다. [10-(4,5-디메틸-3,6-디옥소-시클로헥사-1,4-디엔-1-일)데실]-트리페닐포소포니움 브로마이드 (PDTP 브로마이드)의 수율은 35%이다.
TCX: Rf (CHCl3 - CH3OH, 4:1) = 0.66; HPLC: τ= 10.1 분 (12 분 동안 5-95 % B; A: 0.05% TFA, B: AcCN 중 0.05% TFA); UV (CH3OH): λmax 198 nm, 226 nm, 260 nm (ε260= 18652 cm-1*M-1), 352 nm; ESI MS: C36H42O2P에 대한 m/z 계산값 537.69; 실측값 537.3.
실험예 9. 미토콘드리아- 표적화된 화합물의 합성 - 유력한 미토콘드리아- 표적화된 항산화제
베르베린 및 팔마틴 SkQ 유도체의 구조:
Figure pct00017
9,10-디메톡시-13-[7-(4,5-디메틸-3,6-디옥소-시클로헥사-1,4-디엔-1-일)헵틸옥시카르보닐-메틸]-5,6-디히드로벤조[g]-1,3-벤조디옥소le[5,6-a]퀴놀리지니움 브로마이드, 1 (13-[7-(4,5-디메틸-3,6-디옥소-시클로헥사-1,4-디엔-1-일)헵틸옥시카르보닐-메틸]베르베린 브로마이드)의 합성의 개요
Figure pct00018
화합물 1은 상온에서 30 분동안 피리딘 중 수소화붕소 나트륨으로 환원시킨 베르베린 비설페이트(5)를 기초로 생성되었고 물로부터 결정화한 후에 화합물 6이 91% 수율로 생성되었다. 화합물 6은 브로모아세트산 메틸 에스터로 알킬화시킨 다음(1 시간, 100℃) 수소화붕소 나트륨과 중간체 화합물을 환원시켜(30 분, 상온) 수성 용액으로부터 에테르로 추출함으로써 분리시킨 화합물 7을 얻었고(80% 수율) 수산화 리튬의 1% 물-메탄올 용액에 의해 1.5 시간 동안 가열함으로써 비누화시켜 화합물 8을 얻었다. 물로부터 결정화한 후 화합물 8의 수율은 61%로 나타났다. 화합물 8은 60℃에서 48 시간 동안 2,3-디메틸-1,4-벤조퀴논 9의 미리 합성된 유도체로 응결된 세슘 염으로 전환시켰다. 화합물 10은 1 시간 동안 메틸렌 클로라이드 용액 중 N-브로모숙신이미드(N-bromosuccinimide, NBS)로 산화시키고, 물로 유기 상을 세척함으로써 초과 NBS를 제거하고 건조시킨 다음, 혼합물을 증발시키고 최종 화합물 1을 에테르로 침전시켰다. 화합물 1의 정제는 30 내지 80%의 0.05% 수성 TFA 중, 0.05% TFA를 함유하는 아세토니트릴의 구배로 HPLC (C18)에 의해 수행되었다. 마지막 두 단계 후에, 전체 수율은 50%로 나타났다.
화합물 2 내지 4를 유사하게 생성하였다.
생성된 화합물들의 특성
13-[7-(4,5-디메틸-3,6-디옥소-시클로헥사-1,4-디엔-1-일)헵틸옥시카르보닐-메틸]베르베린: TCX: Rf (클로로포름 - 메탄올, 65:10) = 0.16; Rf (클로로포름 - 메탄올, 4:1) = 0.39. HPLC: τ= 8.98 분 (11 분 동안 5-95% B; A: 0.05% TFA, B: MeCN 중 0.05% TFA; Luna C18(2)' 0.46×15 cm, 5 ㎛, 1 ml/분). UV (에탄올): λmax 262 nm, 350 nm (ε350= 23850 cm-1*M-1), 430 nm (ε430= 5278 cm-1*M-1). ESI MS: C37H40NO8에 대한 m/z 계산값 626.72; 실측값 626.69.
13-[7-(4,5-디메틸-3,6-디옥소-시클로헥사-1,4-디엔-1-일)헵틸옥시카르보닐-메틸]팔마틴: TCX: Rf (클로로포름 - 메탄올, 65:10) = 0.16; Rf (클로로포름 - 메탄올, 4:1) = 0.39. UV (에탄올): λmax 262 nm, 350 nm, 430 nm. ESI MS: C38H44NO8에 대한 m/z 계산값 642.76; 실측값 642.29.
13-[4-(4,5-디메틸-3,6-디옥소-시클로헥사-1,4-디엔-1-일)부틸옥시카르보닐-메틸]베르베린: TCX: Rf (클로로포름 - 메탄올, 65:10) = 0.23; Rf (클로로포름 - 메탄올, 4:1) = 0.39. HPLC: τ= 7.71 분 (11 분 동안 5-95% B; A: 0.05% TFA, B: MeCN 중 0.05% TFA; Luna C18(2)' 0.46 × 15 cm, 5 ㎛, 1 ml/분). UV (에탄올): λmax 262 nm, 350 nm, 430 nm. ESI MS: C34H34NO8에 대한 m/z 계산값 584.64; 실측값 584.22.
13-[4-(4,5-디메틸-3,6-디옥소-시클로헥사-1,4-디엔-1-일)부틸옥시카르보닐-메틸] 팔마틴: TCX: Rf (클로로포름 - 메탄올, 65:10) = 0.23; Rf (클로로포름 - 메탄올, 4:1) = 0.39. HPLC: τ= 7.73 분 (11 분 동안 5-95% B; A: 0.05% TFA, B: MeCN 중 0.05% TFA; Luna C18(2)' 0.46 × 15 cm, 5 ㎛, 1 ml/분). UV (에탄올): λmax 262 nm, 350 nm, 430 nm. ESI MS: C35H38NO8 에 대한 m/z 계산값 600.68; 실측값 600.87.

Claims (16)

  1. 하기 일반식 (I)의, 미토콘드리아-표적화된 화합물, 항산화제 또는 산화촉진제의 선택을 위한 방법으로서,
    Figure pct00019

    상기 A는 효과기(effector) 모이어티(moiety)이고; L은 링커 그룹이며, n은 1 내지 20의 정수이고; B는 미토콘드리아 내로 화합물의 표적화된 전달을 제공하는 표적 그룹이고, 및
    상기 A는 하기 일반식(II)의 항산화제 및/또는 그것의 환원된 형태일 수 있고
    Figure pct00020

    상기 m은 1 내지 3의 정수이고; Y는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며; 또는 두 개의 인접한 Y는 서로 연결되어 구조 (III) 및/또는 그것의 환원된 형태를 형성하고:
    Figure pct00021

    상기 R1 및 R2는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며;
    상기 L은
    a) 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합, 또는 에테르 결합, 또는 에스테르 결합, 또는 C-S, 또는 S-S, 또는 펩티드 결합을 선택적으로 함유하고; 및 바람직하게는 알킬, 알콕시, 할로겐, 케토 그룹, 아미노 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 직선 또는 분지된 탄화수소 사슬;
    b) 또는 자연적 이소프렌 사슬을 포함하는, 링커 그룹이고;
    상기 B는
    a) Sk는 지질친화성 양이온이고; Z는 약학적으로 허용가능한 음이온인, 하기 식의 스쿨라체프(Skulachev)-이온 Sk
    Sk+Z-
    b) 또는 그것의 양이온 형태로 미토콘드리아 내로 투과할 수 있는 양쪽친화성 양쪽성 이온(amphiphilic zwitterion)을 포함하는, 표적 그룹(targeting group)이고;
    또한 B의 성분으로서 Sk+는 지질친화성 금속-유기 화합물, 특히 바람직하게는 하기 구조를 갖는 지질친화성 메탈로포르피린(metalloporphyrin)일 수 있고:
    Figure pct00022

    R1, R2, R3 또는 R4로 표시되는 모이어티를 통해 식 (I)의 화합물의 조성에 포함되고; 남아 있는 치환기 R1, R2, R3 또는 R4는 상기 화합물의 요구되는 특성, 예를 들면, 분자의 소수성을 증가 또는 감소시키기 위한 특성에 따라 선택될 수 있으며; Me+는 바람직하게는 Mn, Fe, Co, Cu, Mg 또는 Zn으로부터 선택되는 금속 이온을 나타내고,
    하기 단계를 포함하는 것으로서:
    a) 미토콘드리아-표적화된 항산화제 특성의 예비적 예측에 기초한 화합물의 구조의 디자인하는 단계,
    b) 상기 구조식에 상응하는 화합물의 합성 또는 그것 또는 그것의 근접한 유사체가 자연에 존재한다면 그 구조식에 상응하는 화합물의 분리 및 정제하는 단계,
    c) 하기로부터 선택되는 하나 및/또는 그 이상의 시험을 포함하는 일련의 시험을 사용하는 화합물의 생물학적 활성을 시험하는 단계:
    i) 인 비트로에서 일반식 (I)의 화합물의 산화환원 특성 및 안정성을 시험하는 단계;
    ii) 인공적인 검은 막에 대한 미토콘드리아-표적화된 화합물의 투과 능력을 시험;
    iii) 무세포(cell-free) 모델 시스템에서 막 지질 및 단백질에 대한 미토콘드리아-표적화된 화합물의 보호 또는 손상 효과를 시험;
    iv) 분리된 미토콘드리아에 대한 미토콘드리아-표적화된 화합물의 항산화 또는 산화촉진 효과를 시험;
    v) 동물, 식물, 세균 또는 균류 세포 배양에서 미토콘드리아-표적화된 화합물의 항산화 또는 산화촉진 작용을 시험;
    vi) 세포 배양에서 미토콘드리아-표적화된 화합물의 항-세포자살 또는 항-괴사 또는 세포자살촉진 또는 괴사촉진 또는 항산화, 또는 산화 촉진 작용을 시험;
    vii) 세포에서 미토콘드리아-표적화된 화합물의 축적을 시험;
    viii) 전사 수준, mRNA 안정성 또는 번역에서 유전자의 활성화, 특히 인산화 또는 탈인산화, 단백질 분해, 글리코실화, 카르보닐화를 포함하는 단백질 변형 수준 및 단백질 또는 단백질 복합체의 활성에서의 다른 변화에서 분명해지는 요구된 대사 경로를 활성화 또는 저해하는 능력에 대한 미토콘드리아-표적화된 화합물을 시험하는 단계로서, 또한 대사 경로의 활성화 또는 저해는 호흡률의 변화, 대사물질의 생산률의 변화, 기질의 소비율의 변화, 외막, 미토콘드리아 막 또는 다른 세포소기관의 막에서 막 전위의 변화, 상기 막 중 하나 이상의 이온 전도도의 변화, 세포 세포질 또는 다른 세포 구획에서 pH의 변화를 포함한 이온 농도의 변화, 생물분자, 소낭 및 세포소기관의 세포내 전달의 변화, 세포 주기 동안의 변화, 세포 분열, 세포 형질 전환, 세포 사멸 또는, 역으로, 세포 생존에 이르게 하는 변화를 포함하는 세포의 다른 생리적 파라미터의 변화로 명확해질 수 있는 단계;
    ix) 질병 모델에서 화합물을 시험하는 단계를 포함하는 동물 또는 식물에서 인 비보로 일반식 (I)의 화합물의 생물학적 활성을 시험하는 단계,
    d) 화합물 시험의 결과의 해석 및 요구되는 파라미터에 상응하는 가장 유력한 화합물의 선택.
    e) 요구된 미토콘드리아-표적화된 항산화제 또는 산화촉진제를 선택하는 것을 포함하는 것인 미토콘드리아-표적화된 화합물의 선택을 위한 방법.
  2. 일반식 (I)에 상응하는 하나 이상의 미토콘드리아-표적화된 화합물의 모임인 조합 라이브러리로서,
    Figure pct00023

    상기 A는 효과기(effector) 모이어티이고; L은 링커 그룹이며, n은 1 내지 20의 정수이고; B는 미토콘드리아 내로 화합물의 표적화된 전달을 제공하는 표적 그룹이고, 및
    상기 A는 하기 일반식(II)의 항산화제 및/또는 그것의 환원된 형태일 수 있고
    Figure pct00024

    상기 m은 1 내지 3의 정수이고; Y는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며; 또는 두 개의 인접한 Y는 서로 연결되어 구조 (III) 및/또는 그것의 환원된 형태를 형성하고:
    Figure pct00025

    상기 R1 및 R2는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며;
    상기 L은
    a) 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합, 또는 에테르 결합, 또는 에스테르 결합, 또는 C-S, 또는 S-S, 또는 펩티드 결합을 선택적으로 함유하고; 및 바람직하게는 알킬, 알콕시, 할로겐, 케토 그룹, 아미노 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 직선 또는 분지된 탄화수소;
    b) 또는 자연적 이소프렌 사슬을 포함하는, 링커 그룹이고;
    상기 B는
    a) Sk는 지질친화성 양이온이고; Z는 약학적으로 허용가능한 음이온인, 하기 식의 스쿨라체프(Skulachev)-이온 Sk
    Sk+Z-
    b) 또는 그것의 양이온 형태로 미토콘드리아 내로 투과할 수 있는 양쪽친화성 양쪽성 이온(amphiphilic zwitterion)을 포함하는, 표적 그룹이고;
    또한 B의 성분으로서 Sk+는 지질친화성 금속-유기 화합물, 특히 바람직하게는 하기 구조를 갖는 지질친화성 메탈로포르피린(metalloporphyrin)일 수 있고:
    Figure pct00026

    R1, R2, R3 또는 R4로 표시되는 모이어티를 통해 식 (I)의 화합물의 조성에 포함되고; 남아 있는 치환기 R1, R2, R3 또는 R4는 상기 화합물의 요구되는 특성, 예를 들면, 분자의 소수성을 증가 또는 감소시키기 위한 특성에 따라 선택될 수 있으며; Me+는 바람직하게는 Mn, Fe, Co, Cu, Mg 또는 Zn으로부터 선택되는 금속 이온을 나타내는 것인 조합 라이브러리.
  3. 청구항 1에 있어서, 청구항 2에 청구된 화합물의 조합 라이브러리의 분석을 위한 방법.
  4. 를화촉진제 및 항산화제 특성 간의 특정한 비율을 갖고, 하기 일반식 (I)로 표시되는, 청구항 1 또는 3에 청구된 방법을 사용하여 선택되거나 디자인된 미토콘드리아-표적화된 항산화제로서,
    Figure pct00027

    상기 A는 효과기(effector) 모이어티이고; L은 링커 그룹이며, n은 1 내지 20의 정수이고; B는 미토콘드리아 내로 화합물의 표적화된 전달을 제공하는 표적 그룹이고, 및 상기 A는 하기 일반식(II)의 항산화제 및/또는 그것의 환원된 형태일 수 있고
    Figure pct00028

    상기 m은 1 내지 3의 정수이고; Y는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며; 또는 두 개의 인접한 Y는 서로 연결되어 구조 (III) 및/또는 그것의 환원된 형태를 형성하고:
    Figure pct00029

    상기 R1 및 R2는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며;
    상기 L은
    a) 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합, 또는 에테르 결합, 또는 에스테르 결합, 또는 C-S, 또는 S-S, 또는 펩티드 결합을 선택적으로 함유하고; 및 바람직하게는 알킬, 알콕시, 할로겐, 케토 그룹, 아미노 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 직선 또는 분지된 탄화수소;
    b) 또는 자연적 이소프렌 사슬을 포함하는, 링커 그룹이고;
    상기 B는
    a) Sk는 지질친화성 양이온이고; Z는 약학적으로 허용가능한 음이온인, 하기 식의 스쿨라체프(Skulachev)-이온 Sk
    Sk+Z-
    b) 또는 그것의 양이온 형태로 미토콘드리아 내로 투과할 수 있는 양쪽친화성 양쪽성 이온(amphiphilic zwitterion)을 포함하는, 표적 그룹이고;
    또한 B의 성분으로서 Sk+는 지질친화성 금속-유기 화합물, 특히 바람직하게는 하기 구조를 갖는 지질친화성 메탈로포르피린일 수 있고:
    Figure pct00030

    R1, R2, R3 또는 R4로 표시되는 모이어티를 통해 식 (I)의 화합물의 조성에 포함되고; 남아 있는 치환기 R1, R2, R3 또는 R4는 상기 화합물의 요구되는 특성, 예를 들면, 분자의 소수성을 증가 또는 감소시키기 위한 특성에 따라 선택될 수 있으며; Me+는 바람직하게는 Mn, Fe, Co, Cu, Mg 또는 Zn으로부터 선택되는 금속 이온을 나타내고,
    SkQB1, SkQB1A, SkQB1B, SkQBP1, SkQB5, SkQBP5 및 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것인 미토콘드리아-표적화된 항산화제.
  5. 산화촉진제 및 항산화제 특성 간의 특정한 비율을 갖고, 하기 일반식 (I)로 표시되는, 청구항 1 또는 3에 청구된 방법을 사용하여 선택되거나 디자인된 미토콘드리아-표적화된 산화촉진제로서,
    Figure pct00031

    상기 A는 효과기(effector) 모이어티이고; L은 링커 그룹이며, n은 1 내지 20의 정수이고; B는 미토콘드리아 내로 화합물의 표적화된 전달을 제공하는 표적 그룹이고, 및 상기 A는 하기 일반식(II)의 산화촉진제 및/또는 그것의 환원된 형태일 수 있고
    Figure pct00032

    상기 m은 1 내지 3의 정수이고; Y는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며; 또는 두 개의 인접한 Y는 서로 연결되어 구조 (III) 및/또는 그것의 환원된 형태를 형성하고:
    상기 R1 및 R2는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며, 및 상기 A는 바람직하게는 하기 구조를 갖는 데스메톡시유비퀴논 또는 이오놀로부터 선택되고:
    Figure pct00033

    각각,
    상기 L은
    a) 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합, 또는 에테르 결합, 또는 에스테르 결합, 또는 C-S, 또는 S-S, 또는 펩티드 결합을 선택적으로 함유하고; 및 바람직하게는 알킬, 알콕시, 할로겐, 케토 그룹, 아미노 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 직선 또는 분지된 탄화수소 사슬;
    b) 또는 자연적 이소프렌 사슬을 포함하는, 링커 그룹이고;
    상기 B는
    a) Sk는 지질친화성 양이온이고; Z는 약학적으로 허용가능한 음이온인, 하기 식의 스쿨라체프(Skulachev)-이온 Sk
    Sk+Z-
    b) 또는 그것의 양이온 형태로 미토콘드리아 내로 투과할 수 있는 양쪽친화성 양쪽성 이온(amphiphilic zwitterion)을 포함하는, 표적 그룹이고, 또한 B의 성분으로서 Sk+는 지질친화성 금속-유기 화합물, 특히 바람직하게는 하기 구조를 갖는 지질친화성 메탈로포르피린(metalloporphyrin)일 수 있고:
    Figure pct00034

    R1, R2, R3 또는 R4로 표시되는 모이어티를 통해 식 (I)의 화합물의 조성에 포함되고; 남아 있는 치환기 R1, R2, R3 또는 R4는 상기 화합물의 요구되는 특성, 예를 들면, 분자의 소수성을 증가 또는 감소시키기 위한 특성에 따라 선택될 수 있으며; Me+는 바람직하게는 Mn, Fe, Co, Cu, Mg 또는 Zn으로부터 선택되는 금속 이온을 나타내는 것인 미토콘드리아-표적화된 산화촉진제.
  6. 하기 일반식 (I)의 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 생산을 위한 방법으로서,
    Figure pct00035

    상기 A는 효과기(effector) 모이어티이고; L은 링커 그룹이며, n은 1 내지 20의 정수이고; B는 미토콘드리아 내로 화합물의 표적화된 전달을 제공하는 표적 그룹이고, 및 상기 A는 하기 일반식(II)의 항산화제 및/또는 그것의 환원된 형태일 수 있고
    Figure pct00036

    상기 m은 1 내지 3의 정수이고; Y는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며; 또는 두 개의 인접한 Y는 서로 연결되어 구조 (III) 및/또는 그것의 환원된 형태를 형성하고:
    Figure pct00037

    상기 R1 및 R2는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며;
    상기 L은
    a) 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합, 또는 에테르 결합, 또는 에스테르 결합, 또는 C-S, 또는 S-S, 또는 펩티드 결합을 선택적으로 함유하고; 및 바람직하게는 알킬, 알콕시, 할로겐, 케토 그룹, 아미노 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 직선 또는 분지된 탄화수소;
    b) 또는 자연적 이소프렌 사슬을 포함하는, 링커 그룹이고;
    상기 B는
    a) Sk는 지질친화성 양이온이고; Z는 약학적으로 허용가능한 음이온인, 하기 식의 스쿨라체프(Skulachev)-이온 Sk
    Sk+Z-
    b) 또는 그것의 양이온 형태로 미토콘드리아 내로 투과할 수 있는 양쪽친화성 양쪽성 이온(amphiphilic zwitterion)을 포함하는, 표적 그룹이고; 또한 B의 성분으로서 Sk+는 지질친화성 금속-유기 화합물, 특히 바람직하게는 하기 구조를 갖는 지질친화성 메탈로포르피린(metalloporphyrin)일 수 있고:
    Figure pct00038

    R1, R2, R3 또는 R4로 표시되는 모이어티를 통해 식 (I)의 화합물의 조성에 포함되고; 남아 있는 치환기 R1, R2, R3 또는 R4는 상기 화합물의 요구되는 특성, 예를 들면, 분자의 소수성을 증가 또는 감소시키기 위한 특성에 따라 선택될 수 있으며; Me+는 바람직하게는 Mn, Fe, Co, Cu, Mg 또는 Zn으로부터 선택되는 금속 이온을 나타내고,
    이 방법이:
    a) 이용가능한 성분, 특히, 2,3-디메틸페놀로부터 2,3-디메틸-1,4,-벤조퀴논의 생산;
    b) 링커 그룹에 연결된 지질친화성 양이온의 생산, 바람직하게는 지질친화성 양이온의 카르복시알킬 유도체, 특히 바람직하게는 10-카르복시데실 트리페닐포스포니움의 생산의 단계 중 하나 이상을 포함하면 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 합성을 포함하는 것인 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 생산을 위한 방법.
  7. 하기 일반식 (I)의 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 정제를 위한 방법으로서,
    Figure pct00039

    상기 A는 효과기(effector) 모이어티이고; L은 링커 그룹이며, n은 1 내지 20의 정수이고; B는 미토콘드리아 내로 화합물의 표적화된 전달을 제공하는 표적 그룹이고, 및 상기 A는 하기 일반식(II)의 항산화제 및/또는 그것의 환원된 형태일 수 있고
    Figure pct00040

    상기 m은 1 내지 3의 정수이고; Y는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며; 또는 두 개의 인접한 Y는 서로 연결되어 구조 (III) 및/또는 그것의 환원된 형태를 형성하고:
    Figure pct00041

    상기 R1 및 R2는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며;
    상기 L은
    a) 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합, 또는 에테르 결합, 또는 에스테르 결합, 또는 C-S, 또는 S-S, 또는 펩티드 결합을 선택적으로 함유하고; 및 바람직하게는 알킬, 알콕시, 할로겐, 케토 그룹, 아미노 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 직선 또는 분지된 탄화수소;
    b) 또는 자연적 이소프렌 사슬을 포함하는, 링커 그룹이고;
    상기 B는
    a) Sk는 지질친화성 양이온이고; Z는 약학적으로 허용가능한 음이온인, 하기 식의 스쿨라체프(Skulachev)-이온 Sk
    Sk+Z-
    b) 또는 그것의 양이온 형태로 미토콘드리아 내로 투과할 수 있는 양쪽친화성 양쪽성 이온(amphiphilic zwitterion)을 포함하는, 표적 그룹이고; 또한 B의 성분으로서 Sk+는 지질친화성 금속-유기 화합물, 특히 바람직하게는 하기 구조를 갖는 지질친화성 메탈로포르피린(metalloporphyrin)일 수 있고:
    Figure pct00042

    R1, R2, R3 또는 R4로 표시되는 모이어티를 통해 식 (I)의 화합물의 조성에 포함되고; 남아 있는 치환기 R1, R2, R3 또는 R4는 상기 화합물의 요구되는 특성, 예를 들면, 분자의 소수성을 증가 또는 감소시키기 위한 특성에 따라 선택될 수 있으며; Me+는 바람직하게는 Mn, Fe, Co, Cu, Mg 또는 Zn으로부터 선택되는 금속 이온을 나타내고;
    하기 단계로서:
    a) 염이 없는 완충되지 않은 이동상 시스템에서 구배 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 단계,
    b) 에탄올 중 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 단계,
    c) 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 산화된 형태를 제거하는 단계,
    d) 바람직하게는 상기 일반식의 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 환원된 형태의 '분자 트랩'을 사용한 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 환원된 형태를 제거하는 단계로서, 상기 '분자 트랩'은 바람직하게는 중성 pH에서 0.2V 이상의 산화적 유도 전위를 갖는 케토- 또는 퀴논-유사 모이어티를 갖는 화합물로서 정의되고 비활성 용매 바람직하게는 헵탄 또는 헥산에 쉽게 용해할 수 있는 것인 단계들 중 하나 이상을 포함하는 것인 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 정제를 위한 방법.
  8. 바람직하게는 중성 pH에서 0.2V 이상의 산화적 유도 전위를 갖는 케토- 또는 퀴논-유사 모이어티를 갖는 화합물이고 바람직하게는 불활성 용매 바람직하게는 헵탄 또는 헥산에 쉽게 용해할 수 있는 것이고, 및 합성된 미토콘드리아-표적화된 항산화제로부터 환원된 형태를 제거하도록 하는 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 환원된 형태의 '분자 트랩'.
  9. 하기 일반식 (I)의 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 생산을 위한 방법으로서,
    Figure pct00043

    상기 A는 효과기 모이어티이고; L은 링커 그룹이며, n은 1 내지 20의 정수이고; B는 미토콘드리아 내로 화합물의 표적화된 전달을 제공하는 표적 그룹이고; A는 하기 일반식(II)의 항산화제 및/또는 그것의 환원된 형태일 수 있고,
    Figure pct00044

    상기 m은 1 내지 3의 정수이고; Y는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며; 또는 두 개의 인접한 Y는 서로 연결되어 구조 (III) 및/또는 그것의 환원된 형태를 형성하고:
    Figure pct00045

    상기 R1 및 R2는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며;
    상기 L은
    a) 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합, 또는 에테르 결합, 또는 에스테르 결합, 또는 C-S, 또는 S-S, 또는 펩티드 결합을 선택적으로 함유하고; 및 바람직하게는 알킬, 알콕시, 할로겐, 케토 그룹, 아미노 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 직선 또는 분지된 탄화수소;
    b) 또는 자연적 이소프렌 사슬을 포함하는, 링커 그룹이고;
    상기 B는
    a) Sk는 지질친화성 양이온이고; Z는 약학적으로 허용가능한 음이온인, 하기 식의 스쿨라체프(Skulachev)-이온 Sk
    Sk+Z-
    b) 또는 그것의 양이온 형태로 미토콘드리아 내로 투과할 수 있는 양쪽친화성 양쪽성 이온(amphiphilic zwitterion)을 포함하는, 표적 그룹이고;
    또한 B의 성분으로서 Sk+는 지질친화성 금속-유기 화합물, 특히 바람직하게는 하기 구조를 갖는 지질친화성 메탈로포르피린(metalloporphyrin)일 수 있고:
    Figure pct00046

    R1, R2, R3 또는 R4로 표시되는 모이어티를 통해 식 (I)의 화합물의 조성에 포함되고; 남아 있는 치환기 R1, R2, R3 또는 R4는 상기 화합물의 요구되는 특성, 예를 들면, 분자의 소수성을 증가 또는 감소시키기 위한 특성에 따라 선택될 수 있으며; Me+는 바람직하게는 Mn, Fe, Co, Cu, Mg 또는 Zn으로부터 선택되는 금속 이온을 나타내고;
    청구항 6 및 7에 청구된 방법 중 하나를 포함하는 약학적 약물의 형태인 것인 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 생산을 위한 방법.
  10. 하기 일반식 (I)의 미토콘드리아-표적화된 항산화제에 기초한 약학적 물질로서,
    Figure pct00047

    상기 A는 효과기 모이어티이고; L은 링커 그룹이며, n은 1 내지 20의 정수이고; B는 미토콘드리아 내로 화합물의 표적화된 전달을 제공하는 표적 그룹이고; 및 상기 A는 하기 일반식(II)의 항산화제 및/또는 그것의 환원된 형태일 수 있고
    Figure pct00048

    상기 m은 1 내지 3의 정수이고; Y는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며; 또는 두 개의 인접한 Y는 서로 연결되어 구조 (III) 및/또는 그것의 환원된 형태를 형성하고:
    Figure pct00049

    상기 R1 및 R2는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며;
    상기 L은
    a) 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합, 또는 에테르 결합, 또는 에스테르 결합, 또는 C-S, 또는 S-S, 또는 펩티드 결합을 선택적으로 함유하고; 및 바람직하게는 알킬, 알콕시, 할로겐, 케토 그룹, 아미노 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 직선 또는 분지된 탄화수소;
    b) 또는 자연적 이소프렌 사슬을 포함하는, 링커 그룹이고;
    상기 B는
    a) Sk는 지질친화성 양이온이고; Z는 약학적으로 허용가능한 음이온인, 하기 식의 스쿨라체프-이온 Sk
    Sk+Z-
    b) 또는 그것의 양이온 형태로 미토콘드리아 내로 투과할 수 있는 양쪽친화성 양쪽성 이온을 포함하는, 표적 그룹이고; 또한 B의 성분으로서 Sk+는 지질친화성 금속-유기 화합물, 특히 바람직하게는 하기 구조를 갖는 지질친화성 메탈로포르피린일 수 있고:
    Figure pct00050

    R1, R2, R3 또는 R4로 표시되는 모이어티를 통해 식 (I)의 화합물의 조성에 포함되고; 남아 있는 치환기 R1, R2, R3 또는 R4는 상기 화합물의 요구되는 특성, 예를 들면, 분자의 소수성을 증가 또는 감소시키기 위한 특성에 따라 선택될 수 있으며; Me+는 바람직하게는 Mn, Fe, Co, Cu, Mg 또는 Zn으로부터 선택되는 금속 이온을 나타내고,
    산화 및 환원된 형태간의 비율이 산화된 형태의 0.2% 내지 99.8%의 범위에 있고 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 산화 및 환원된 형태간의 비율이 보관의 특정한 조건에서, 보관-수명(shelf-life) 동안 유지되는 것인 약학적 물질.
  11. 청구항 10에 있어서, 산화 및 환원된 형태간의 비율이 좀더 바람직하게는 산화된 형태의 50% 내지 99.5%의 범위에 있는 것인 약학적 물질.
  12. 청구항 12에 있어서, 산화 및 환원된 형태간의 비율이 좀더 바람직하게는 산화된 형태의 97.5% 내지 99.5%의 범위에 있는 것인 약학적 물질.
  13. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 산화 및 환원된 형태간의 비율이 1개월 이상 지속되는 것인 약학적 물질.
  14. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 산화 및 환원된 형태간의 비율이 6개월 이상 지속되는 것인 약학적 물질.
  15. 청구항 10 내지 12에 있어서, 미토콘드리아-표적화된 항산화제의 산화 및 환원된 형태간의 비율이 2년 이상 지속되는 것인 약학적 물질.
  16. 하기 일반식 (I)의 화합물인 약학적 물질로서,
    Figure pct00051

    상기 A는 효과기 모이어티이고; L은 링커 그룹이며, n은 1 내지 20의 정수이고; B는 미토콘드리아 내로 화합물의 표적화된 전달을 제공하는 표적 그룹이고; 및 상기 A는 하기 일반식(II)의 항산화제 및/또는 그것의 환원된 형태일 수 있고
    Figure pct00052

    상기 m은 1 내지 3의 정수이고; Y는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며; 또는 두 개의 인접한 Y는 서로 연결되어 구조 (III) 및/또는 그것의 환원된 형태를 형성하고:
    Figure pct00053

    상기 R1 및 R2는 저급 알킬 또는 저급 알콕시로부터 선택되는 동일하거나 상이한 치환기이며;
    상기 L은
    a) 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합, 또는 에테르 결합, 또는 에스테르 결합, 또는 C-S, 또는 S-S, 또는 펩티드 결합을 선택적으로 함유하고; 및 바람직하게는 알킬, 알콕시, 할로겐, 케토 그룹, 아미노 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 직선 또는 분지된 탄화수소;
    b) 또는 자연적 이소프렌 사슬을 포함하는, 링커 그룹이고;
    상기 B는
    a) Sk는 지질친화성 양이온이고; Z는 약학적으로 허용가능한 음이온인, 하기 식의 스쿨라체프-이온 Sk
    Sk+Z-
    b) 또는 그것의 양이온 형태로 미토콘드리아 내로 투과할 수 있는 양쪽친화성 양쪽성 이온을 포함하는, 표적 그룹이고;
    또한 B의 성분으로서 Sk+는 지질친화성 금속-유기 화합물, 특히 바람직하게는 하기 구조를 갖는 지질친화성 메탈로프로피일 수 있고:
    Figure pct00054

    R1, R2, R3 또는 R4로 표시되는 모이어티를 통해 식 (I)의 화합물의 조성에 포함되고; 남아 있는 치환기 R1, R2, R3 또는 R4는 상기 화합물의 요구되는 특성, 예를 들면, 분자의 소수성을 증가 또는 감소시키기 위한 특성에 따라 선택될 수 있으며; Me+는 바람직하게는 Mn, Fe, Co, Cu, Mg 또는 Zn으로부터 선택되는 금속 이온을 나타내고;
    청구항 1, 3, 6, 7, 9에 청구된된 방법 중 하나 이상을 사용하여 생산되고 약전 요건을 충족하는 것인 약학적 물질.
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