KR20090129105A - 구리 이온 검출용 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체,및 이를 이용한 프로브 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구리 이온(Cu^{2 +}) 선택성을 갖는 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체, 이를 이용한 생체 내 구리 이온 검출방법 및 이를 포함한 생체 내 구리 이온 검출용 프로브에 관한 것이다.

본 발명에 따른 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체는 구리 이온과 매우 강한 결합을 하여 구리 이온에 대해 선택성이 뛰어나고, 생체 내에서 구리 이온 검출방법으로 유용하게 사용할 수 있다.

로다민 유도체, 플루오레세인 유도체, 구리 이온

Description

구리 이온 검출용 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체, 및 이를 이용한 프로브{Rhodamine derivative, fluorescein derivative and probes theirof}

본 발명은 구리 이온 선택성을 갖는 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 프로브 및 이를 이용한 생체 내 구리 이온 검출방법에 관한 것이다.

금속-선택적 형광성 화학센서는 세포의 금속 이온의 검출에 유용한 도구로서 작용하고, 따라서 세포 및/또는 기관 내에 생물학적으로 관련된 금속 이온을 검출하기 위해 광범위하게 개발되어 왔다.

다양한 전이 금속 이온 중에, 구리 이온은 인체 내 존재하는 중금속 이온 중 세 번째로 그 양이 많으며, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 씨토크롬 c 산화효소 및 티로시나아제를 포함하여, 다양한 금속효소를 위한 촉매적 보조인자로서 중요한 역할을 한다. 그러나, 과량 존재하는 경우, 구리는 활성 산소 종의 생성에 관여하여 신경퇴행성 질환을 초래한다는 점에서 독성을 나타낸다고 할 수 있다. 구리의 독성 성질로 인해 세포는 세포 내의 구리 분포에 대해 엄격한 통제를 한다. 그럼에도 불구하고 세포 내 구리의 흡수 및 방출은 속도론적으로 빨리 진행되어, 세포 내 구리 농도는 한 시간 내에 20배로 증가될 수 있다. 세포질, 미토콘드리아, 소포체 효소 등은 산화환원 보조인자(cofactor)로써 구리를 필요로 하지만, 산소 및 반응성 산소종과 비조절된 구리 이온의 반응은 단백질, 핵산, 지질의 산화를 야기한다.

이와 같이, 금속이온들은 생체 내의 역할 혹은 환경적 측면으로 인해 그 농도를 손쉽고 정확하게 알아낼 필요가 있어 그 중요성 만큼이나 많은 연구가 진행되고 있으며, 환경학적으로 그 검출방법이 중요하다 할 수 있다. 이와 관련하여, 구리 이온용 형광성 프로브는 이들 금속 이온의 생물학적 중요성 때문에 널리 개발되어 왔다.

생체 내 주요물질과 이온들에 대한 새로운 센서의 설계와 연구는 그 동안 활발히 진행되어져 왔다. 최근 초분자(supramolecule)화학에 대한 이해와 연구는 선택적으로 이온 혹은 여러 가지 다른 종류의 손님화합물들과 결합할 수 있는 주인화합물의 설계에 큰 가능성을 보여왔으며, 최근 이러한 초분자 화합물을 형광물질에 연결시킴으로써 손님화합물과의 선택적 결합을 형광변화를 이용하여 보다 손쉽게 관찰할 수 있는 형광 화학센서(fluorescent chemosensor)의 개발에 대한 연구에 큰 도움을 주고 있다.

형광이란 특정한 광파장(여기파장)을 갖는 광자가 표지분자(indicator molecule)와 충돌하고, 그 충돌의 결과로 전자가 고에너지 준위로 여기하면서 일어나는 광화학적 현상이다. 여러 분석 방법 중에서 형광을 이용하는 방법은 아주 뛰 어난 감도로 인해 10^-9 M 농도에서도 신호를 관찰할 수 있는 큰 장점을 가지고 있다. 최근에는 이러한 성질을 이용하여 양이온, 음이온 그리고 중성유기분자들에 대한 형광 화학센서에 대한 연구들이 발표된 바 있다 (A. P. de Silva 등, Chem. Rev. 1997, 97, 1515).

보론산은 인접한 디올기를 포함하는 물질에 대해 고친화성을 갖는다고 알려져 있고, 따라서 탄수화물용 형광성 화학센서로 이용되어 왔다. 또한, 스틸벤일 보론산은 Hg^{2 +}를 모니터하기 위한 항체-계열 센서에 있어 보조인자로서 활용되어 왔다. 그러나, 금속 이온을 직접 검출하기 위한 보론산 계 형광성 화학센서의 사용에 대한 전례는 존재하지 않는다.

이에, 본 발명자들은 금속이온들 중 구리 이온(Cu^{2 +})에 대해 선택적인 형광화학센서에 대하여 연구하던 중, 보론산을 포함하는 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체를 합성하게 되었으며, 상기 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체는 생체 내 구리 이온에 대해 선택적으로 작용함으로 인하여 구리 이온 결합 현상의 확인에 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 구리 이온(Cu^{2 +}) 선택성을 갖는 보론산을 포함하는 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체를 이용한 생체 내 구리 이온(Cu^{2 +})을 검출하는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체를 포함하는 생체 내 구리 이온(Cu^{2 +})을 검출하는 프로브를 제공하고자 한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 로다민 유도체를 제공한다.

[화학식 1]

(여기서, R은 B(OH)₂이다.)

또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 플루오레세인 유도체를 제공한다.

[화학식 2]

(여기서, R은

이다)

본 발명에 따른 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체는 그 구조내에 포함되는 고리가 개방되는 독특한 공정으로 구리 이온과 결합하여 구리 이온용 보론산 계 형광성 및 발색성 화학센서로 사용할 수 있다. 상기 화학센서는 포유류 세포 및 척추동물 생체 내 구리 이온의 검출에 실제적으로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 구리 이온 선택성을 갖는 로다민 유도체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 로다민 유도체의 제조방법은 2-포르밀페닐보론산 및 로다민 하이드라지드를 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 로다민 유도체를 이용한 생체 내 구리 이온을 검출하는 방법을 제공한다. 구리 이온의 검출 원리는 하기와 같다.

상기 로다민 유도체는 pH7.4에서 20mM HEPES(5% CH₃CN) 중에 무색 용액을 형성하고, 스피로락탐 형태로 대부분 존재한다. 상기 용액에 Cu^{2 +}을 가하면, 분홍색이 발생되고 생성되는 종은 진한 오렌지색 형광(도 1b)을 나타낸다. 흡수(λ_max = 556㎚) 및 방출(λ_max = 572㎚)의 변화량은 Cu^{2 +}-로다민 유도체 착물(도 1a)을 형성하는 Cu²⁺유도된 스피로락탐 고리 개방과 관련되어 있다. 과량의 구리 이온 킬레이터로 씨클렌(cyclen)이 Cu^{2 +}-로다민유도체 착물을 포함하는 용액에 첨가될 때, 분홍색 및 노란 형광색이 사라지고, 로다민 유도체가 재생되며 이는 씨클렌 처리된 Cu^{2 +}-로다민 유도체 착물의 HPLC 분석에 의해 확인될 수 있다.

따라서, Cu^{2 +}-유도된 스피로락탐 링의 개방은 가역 공정이다. 잡 플롯(job plot) 결과, 상기 로다민 유도체와 Cu^{2 +}의 결합은 1:1의 양론비를 갖는다는 것을 알 수 있다. Cu^{2 +}-에 대한 상기 로다민 유도체의 결합 상수(association constant)는 형광성 적정 실험의 결과 10⁴ M^-1의 크기이며, 바람직하게는 4.5×10⁴ 내지 5.4×10⁴ M^-1이다.

Ag⁺, Ca^{2 +}, Co^{2 +}, Cd^{2 +}, Cs⁺, Hg^{2 +}, K⁺, Li⁺, Mg^{2 +}, Mn^{2 +}, Na⁺, Ni^{2 +}, Rb⁺, Sr^{2 +} 및 Zn²⁺와 같은 다른 금속 이온은 상기 로다민 유도체에 있어서 색상 및 형광성 변화를 촉진하지 못한다(도 1c). 금속 이온 경쟁 실험을 통해 상기 로다민 유도체의 구리 이온에 대한 결합은 다른 금속 이온에 영향을 받지 않는다는 것을 알 수 있다. 즉, 상기 결과는 상기 로다민 유도체가 구리 이온에 대해 고선택적으로 반응한다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 로다민 유도체는 포도당 및 과당(각각 1mM)과 같은 인접한 디올-함유 탄수화물의 첨가시 어떤 의미있는 형광성 변화를 나타내지 않았다.

또한, 보론산 대신 수소로 치환된 로다민 유도체를 pH 7.4에서 HEPES(5% CH₃CN) 중의 Cu^{2 +}로 처리한 결과, 형광 물성에 변화가 없음을 알 수 있다. 즉, 로다민 유도체에 있어서 구리 이온과 결합을 위해 보론산 부분의 중요성을 나타낸다.

또 다른 대조구로서, 파이렌 보론산과 같이 다른 금속 인식 부위가 없는 단순한 보론산 유도체를 동일한 조건하에서 Cu^{2 +}로 처리하는 경우, Cu^{2 +} 첨가시 아세토니트릴 중에 455 ㎚에서 독특한 엑시머 피크를 나타내었으며, 이는 보론산 기와 Cu²⁺ 간의 상호작용을 나타낸다. 잡 플롯(job plot) 결과, 파이렌 보론산과 Cu^{2 +}의 결합은 2:1의 양론비를 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 엑시머는 보론산 부분 및 Cu^{2 +} 간의 상호작용을 통한 파이렌 고리 사이에 적층되어 형성되는 경향이 있다. 대조구 실험뿐만 아니라 로다민 유도체의 형광성 및 발색성 변화에 기초하여, Cu^{2 +} 의 본 발명에 따른 로다민 유도체에 대한 결합은 도 1a에 나타낸 바와 같이 스피로락탐의 고리-개방 공정으로 설명될 수 있다.

또한, 본 발명은 구리 이온 선택성을 갖는 화학식 2의 플루오레세인 유도체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 플루오레세인 유도체의 제조방법은 마니히(Mannich) 반응을 통해 2,7-디클로로플루오레세인 및 2-(N-메틸아미노메틸) 페닐보론산을 응축시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 플루오레세인 유도체는 구리 이온과 상호작용시에 로다민 유도체와는 전혀 다른 유형의 형광성 응답을 나타낸다.

즉, 구리 이온의 부재시에, pH 7.4에서 20 mM HEPES(5% CH₃CN) 중의 플루오레세인 유도체 용액은 연한 황색이고, 강한 황색 형광을 나타낸다. 이 용액에 Cu^{2 +} 의 첨가는 연한 황색에서 분홍색으로의 색변화와 동시에 형광성이 크게 감소하고, 약한 청색 전이(~ 9㎚)를 나타낸다(도 2). 잡 플롯(job plot) 결과 상기 프루오레세인 유도체와 Cu^{2 +}의 결합은 1:2의 양론비를 갖는다는 것을 알 수 있다. Cu^{2 +}에 대 한 상기 플루오레세인 유도체의 결합 상수는 형광성 적정 실험의 결과 10³ M^{- 2} 의 크기이고, 바람직하게는 7.5×10³ 내지 9.5×10³ M^-2이다. 최종적으로, 상기 플루오레세인 유도체는 다른 금속 이온에 비해 Cu^{2 +}에 대해 높은 선택성을 보인다(도 2c).

여기서, 붕소-질소간의 상호작용은 기술분야의 당업자에게 공지된 사실이며, 벤질 질소로부터 유래한 광-유도된 전자 전달(PET) 메커니즘을 차단할 수 있다. 즉, 화학식 2의 플루오레세인 유도체는 상대적으로 강한 형광성을 나타낸다. Cu^{2 +}의 첨가시에, 이 이온들은 도 2a에 나타낸 바와 같이 보론산 및 페놀의 OH와 착물화된다.

상기 과정은 3급 아민 부분을 유리시키고, 이는 PET 공정을 재생시켜 형광성의 소멸을 유도할 수 있다. 색상 변화는 또한 Cu^{2 +}이 페놀의 산소와 결합하는 것을 보조하고, 이는 페놀레이트를 형성할 수 있다.

상기 플루오레세인 유도체와 구리 결합에 대한 보론산의 영향은 pH 7.4에서 HEPES(5% DMSO) 중에 보론 산기가 수소로 치환된 화합물과 Cu^{2 +}를 인큐베이트함으로써 알 수 있다. 즉, 구리 이온에 의해 유도되는 수소 치환된 플루오레세인 유도체는 형광성 변화가 나타나지 않고, 이는 구리 이온과 결합에 대한 보론산 부분의 중요성을 의미한다.

본 발명에 따른 보론산을 포함하는 로다민 유도체 및 플루오레세인 유도체는 구리 이온(Cu^{2 +})과 매우 강한 결합을 하여 구리 이온(Cu^{2 +})에 대해 선택성이 뛰어나고, 또한, 생체 내에서 구리 이온(Cu^{2 +}) 검출방법으로 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 화학식 1의 로다민 유도체의 제조

로다민 히드라자이드(0.46g, 1 mmol)을 20 mL 무수에탄올에 용해시켰다. 과량의 2-포르밀페닐보론산(4 mmol)을 첨가하고, 에어 배쓰(bath) 내에서 6시간 동안 환류시켰다. 그리고 나서 에탄올을 완전히 증발시키고, 조(crude) 생성물을 컬럼(중성 알루미나; MC+MeOH; 98+2) 상에서 정제하여 0.280g(47%)의 화학식 1의 화합물을 분홍색 고체로서 얻었다.

Mp: 195-197 ℃;

¹H NMR (250 MHz, CDCl₃) δ 8.13 (s, 1H), 8.11 (m, 1H), 7.94 (m, 1H), 7.85 (2, 2H, B-(OH)₂), 7.39 (m, 2H), 7.24 (m, 2H), 7.01 (m, 2H), 3.22 (q, 8H, J = 7.1 Hz), 1.06 (t, 12H, J = 7.1 Hz);

¹³C NMR (62.5 MHz, CDCl₃) δ 165.2, 152.9,152.7, 149.2, 138.4, 138.2, 133.8, 133.3, 130.1, 129.6, 129.2, 128.4, 128.2, 127.6, 123.7, 123.6, 108.4, 104.5, 97.7, 65.1, 44.3, 12.6;

FAB Mass m/z = 571.3 (M-H₂O+H)⁺, calc. for C₃₅H₃₆BN₄O₃= 571.3.

실시예 2 : 화학식 2의 플루오레세인 유도체의 제조

2,7-디클로로플루오로세인(0.8g, 2.00 mmol) 및 파라포름알데히드(0.47 g, 16.00 mmol)를 15 mL의 CH₃CN에 용해시키고 교반하였다. 20 mL의 CH₃CN 중에 포함되는 2-메틸아미노메틸보론산(1.3 g, 8.00 mmol)을 첨가하고 나서, 15 mL의 H₂O를 첨가하였다. 반응 혼합물을 24시간 동안 환류시켰다. 그리고 나서, 진공 상에서 용매를 제거하고, 아세톤(100%)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 잔류물을 제거하였다. 다시 에틸아세테이트-메탄올(9:1, v/v)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 녹여서 분리한 생성물을 정제하여 수율 24%의 순수한 생성물을 얻었다.

Mp: 124-126 ℃;

¹H NMR (250 MHz, CD₃OD) δ 8.16 (m, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.65-7.70 (m, 2H), 7.39-7.49 (m, 8H), 7.22 (m, 2H), 4.42 (m, 4H), 4.34 (s, 4H), 2.73 (s, 6H);

¹³C NMR (62.5 MHz, CD₃OD) δ 174.3, 172.9, 157.7, 155.8, 140.2, 134.6, 131.9, 131.8, 131.2, 131.1, 131.0, 130.9, 130.5, 130.3, 128.2, 112.1, 108.7, 105.9, 79.5, 60.8, 52.4, 50.0, 49.7, 49.3, 49.0, 48.7, 48.3, 48.0, 40.4;

FAB Mass m/z = 755.19 (M+H)⁺, calc. for C₃₈H₃₅B₂Cl₂N₂O₉= 754.19.

실시예 3 : 형광측정성 금속 이온 적정 용액의 제조

이중 증류된 탈염수를 사용하여 1 mM의 금속 과염소산염 저장 용액(stock solution)을 제조하였다. 또한, 아세토니트릴 내에 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물의 저장 용액을 제조하였다. 상기 저장 용액들을 제조 당일에 사용하였다.

시험액은 40 ㎕의 탐침 저장 용액을 시험관에 넣고, 각 금속 저장액의 적당량(0~ ㎕)을 가한 다음, 20 mM HEPES 완충액(pH 7.4)으로 용액을 4 mL로 희석시켜 제조하였다.

모든 측정에서, 여기파장(excitation)은 505 ㎚ 또는 504 ㎚이었다. 여기 및 방출의 슬릿폭(slit width)은 1.5 또는 3 ㎚이었다.

실험예 1 : 화학식 1의 화합물 및 구리 이온으로 인큐베이트한 포유류 세포의 이미지화

쥐(Murine P19) 세포를 배양 배지(10% 태아 소 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)) 내에 웰(well) 당 10⁴ 셀의 밀도로 6-웰 플레이트에 시드하였다. 24시간 후, 배양 배지 내에서 P19 세포를 0.5 mM Cu(ClO₄)₂로 30분 동안 인큐베이트하였다. PBS로 세척하여 잔류 구리 이온을 제거한 후, 상기 세포를 50 μM 의 화학식 1의 화합물에 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다.

쥐(Murine 3T3-L1) 섬유아세포(fibroblast)를 배양 배지 내에 웰 당 10⁴ 셀의 밀도로 6-웰 플레이트에 시드하였다. 24시간 후, 배양 배지 내에서 3T3-L1 세포를 0.5 mM Cu(ClO₄)₂로 30분 동안 인큐베이트하였다. PBS로 세척하여 잔류 구리 이온을 제거한 후, 상기 세포를 50 μM 의 화학식 1의 화합물에 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다.

쥐(Murine C2C12) 세포를 배양 배지 내에 웰 당 10⁴ 셀의 밀도로 6-웰 플레이트에 시드하였다. 24시간 후, 배양 배지 내에서 C2C12 세포를 0.5 mM Cu(ClO₄)₂로 30분 동안 인큐베이트하였다. PBS로 세척하여 잔류 구리 이온을 제거한 후, 상기 세포를 50 μM 의 화학식 1의 화합물에 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다.

사람(Human HCT-15) 결장암 세포를 배양 배지 내에 웰 당 10⁴ 셀의 밀도로 6-웰 플레이트에 시드하였다. 24시간 후, 배양 배지 내에서 C2C12 세포를 0.5 mM Cu(ClO₄)₂로 30분 동안 인큐베이트하였다. PBS로 세척하여 잔류 구리 이온을 제거한 후, 상기 세포를 50 μM 의 화학식 1의 화합물에 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 구리 이온 및 화학식 1의 화합물로 인큐베이트한 세포들을 형광 현미경(Stemi 2000-C, ZAISS, 독일)으로 이미지화 하였다.

실험예 2 : 화학식 1의 화합물 및 수은 이온으로 인큐베이트한 사람 근육 세포의 이미지화

사람 근육 생체검사(biopsy)는 김현우 박사(연세대학교 의과대학)에 의해 풍부하게 제공되었다. 사람 근육 섬유는 Bonavaud, S. et al.(In Vitro Cell Dev . Biol. Anim . 2002, 38, 66-72)에 의해 개발된 절차에 따라 분리되고 배양되었다. Ham's F10 배지(Gibco) 내의 0.2% 콜라게나제(collagenase(Sigma))를 함유하는 페트리 디쉬 내에 근육 샘플을 37℃에서 90분 동안 소화(digest)시키고, PBS로 수회 세척하였다. 대부분의 사람 근육 섬유를 효소에 의한 소화 후 조직으로부터 분리하였다. 입구가 매우 큰 파스퇴르 피펫으로 근육 단편을 반복적으로 분말화하여 단일 근육 섬유를 분리하였다. 분리한 근육 섬유를 최종적으로 한 방울의 매질인 Ham's F10 배지에 포함되어 마트리겔(matrigel, Collative Biomedical Products, 1mg/mL)이 코팅된 6-웰 플레이트(BioCoat) 내로 플레이트되고, 플레이팅 배지(Ham's-F10 배지 내에 10% FBS, 1% chick embryo extract(CEE, Sera Laboratories International사) 포함)를 첨가하기 전에 적어도 4시간 동안 부착되도록 하였다. 트립신화에 의해 상기 세포의 수를 측정하고, 10% FBS, 1% CEE, 50unit/mL의 페니실린 및 50g/mL의 스트렙토마이신이 보충된 DAEM 내에서 배양하였다.

사람 근육 세포를 배양 배지(10% FBS, 50unit/mL의 페니실린 및 50g/mL의 스트렙토마이신이 보충된 DAEM) 내에 웰 당 10³ 셀의 밀도로 6-웰 플레이트에 시드하고, 배양 배지 내에서 30분 동안 1 mM Cu(ClO₄)₂로 인큐베이트하였다. PBS로 세척하여 잔류 구리 이온을 제거한 후, 상기 세포를 배지 내에 37℃에서 30분간 50 M 의 화학식 1의 화합물로 인큐베이트하였다. 구리 이온 및 화학식 1의 화합물로 인큐베이트한 세포들을 형광 현미경으로 이미지화 하였다.

실험예 3 : 화학식 1의 화합물 및 수은 이온으로 인큐베이트한 제브라피쉬의 이미지화

제브라피쉬는 28℃에서 보관되고, 최적의 번식 조건을 유지하였다. 짝짓기 용으로, 수컷 및 암컷 제브라피쉬를 28℃에서 12시간 밝음/12시간 어두움 싸이클로 한 탱크 내에 보존시키고 나서, 알의 산란은 오전에 빛 자극을 부여하여 발생시켰다. 거의 모든 알을 즉시 수정시켰다. 5-일령 제브라피쉬를 E3 embryo 배지(15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1mM MgSO₄, 1 mM CaCl₂, 0.15 mM KH₂PO₄, 0.05 mM Na₂HPO₄, 0.7 mM NaHCO₃, 10^-5% 메틸렌블루; pH7.5)내에 보존하였다. 상기 5-일령 제브라피쉬를 E3 배지 내에 28℃에서 30분간 1 mM Cu(ClO₄)₂로 인큐베이트하였다. PBS로 세척하여 잔 류 구리 이온을 제거한 후, 제브라피쉬를 28℃에서 30분간 50 M 의 화학식 1의 화합물로 추가로 인큐베이트하였다. 제브라피쉬를 형광 현미경으로 이미지화 하였다.

보론산-결합된 화학식 1의 로다민 유도체를 포함하는 프로브의 포유류 세포 및 생체 내에서 구리 이온을 검출하는 능력을 고찰하였다. 실험예 1의 쥐(murine) P19 태아 암종 세포의 형광성 현미경 분석의 결과는, 화학식 1의 로다민 유도체가 세포막을 통과하고, 세포 내 구리 이온에 대한 강한 형광 응답을 보인다는 것을 나타낸다(도 3a). 반면에, 외부 구리 이온이 없이 단지 화학식1의 로다민 유도체로만 처리한 세포들은 매우 약한 형광성을 보인다(도 3b).

또한, 실험예 3과 같이 5일령 제브라피쉬(zebrafish)의 경우, 형광 현미경 이미지는 제브라피쉬 내 구리 이온이 상기 프로브에 의해 형광성 있게 검출된 것을 나타낸다(도 3c). 그러나, 외부 구리 이온이 없는 프로브로만 처리된 제브라피쉬는 난황 부분에서 매우 약한 형광 신호를 나타낸다(도 3d).

상기 프로브는 구리 이온에 선택적으로 응답한다. 본 발명의 화학센서는 Cu²⁺와 착물화 시에 반대의 형광성 변화를 보인다. 즉, 모노보론산-결합된 로다민 유도체의 형광성은 Cu^{2 +}의 존재 하에 크게 증진되지만, 비스보론산-결합된 플루오레세인 유도체의 형광성은 Cu^{2 +}에 의해 선택적으로 소멸된다. 상기 화학센서 모두 Cu^{2 +}의 육안 검출을 가능하게 한다.

도 1은 본 발명의 로다민 유도체의 (a) 구리 이온 결합, (b) 형광 및 발색 변화, 및 (c) 구리 이온에 대한 선택성을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 플루오레세인 유도체의 (a) 구리 이온 결합, (b) 형광 및 발색 변화, 및 (c) 구리 이온에 대한 선택성을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 로다민 유도체를 포함한 프로브를 사용하여 생체 및 세포내 구리 이온 검출 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 pH7.4의 20 mM HEPES(5% CH₃CN) 중에서 다양한 농도의 Cu^{2 +}로 pH7.4에서 화학식 1의 화학센서(3μM)를 형광 적정한 것을 나타낸 것이다.

도 5는 pH7.4의 20 mM HEPES(5% CH₃CN) 중에서, 과잉 금속 이온(250 당량)의 존재 하에 Cu^{2 +}(50 당량)에 따른 pH7.4에서 화학식 1의 화학센서(3μM)의 형광 변화를 나타낸 것이다.

도 6은 (a) CH₃CN 내에 Cu^{2 +}의 첨가시 화학식 5의 형광 변화(342 nm에서 여기) 및 (b) CH₃CN 내에 화학식 5 및 Cu^{2 +}의 잡 플롯(342 nm에서 여기, 416 nm에서 방출)을 나타낸다.

도 7은 pH7.4의 20 mM HEPES(5% DMSO) 중에서, 다양한 금속 이온(100μM)의 첨가시 화학식 2의 화합물(2μM)의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이다(504 nm에서 여 기).

도 8은 화학식 1의 화합물 및 Cu^{2 +}로 인큐베이트된 세포 및 생명체를 나타낸 것이다( a)는 쥐(C2C12) 근아종세포(myoblast), b)는 사람 근육 세포, c)는 결장암 세포(HCT-15), d)는 쥐(3T3-L1) 섬유아세포).

도 9는 CDCl₃에서 화학식 1의 화합물의 ¹H NMR(250 MHz)을 나타낸 것이다.

도 10은 CDCl₃에서 화학식 1의 화합물의 ¹³C NMR(62.5 MHz)을 나타낸 것이다.

도 11은 CD₃OD에서 화학식 2의 화합물의 ¹H NMR(250 MHz)을 나타낸 것이다.

도 12는 CD₃OD에서 화학식 2의 화합물의 ¹³C NMR(62.5 MHz)을 나타낸 것이다.

Claims (6)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 로다민 유도체:

   [화학식 1]

   

   여기서, R은 B(OH)₂이다.
2. 하기 화학식 2로 표시되는 플루오레세인 유도체:

   [화학식 2]

   

   여기서, R은

   

   이다.
3. 2-포르밀페닐보론산 및 로다민 하이드라지드를 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 청구항 1의 로다민 유도체의 제조방법.
4. 마니히(Mannich) 반응을 통해 2,7-디클로로플루오레세인 및 2-(N-메틸아미노메틸) 페닐보론산을 응축시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 청구항 2의 플루오레세인 유도체의 제조방법.
5. 청구항 1 또는 청구항 2의 화합물을 이용한 생체 내 구리 이온(Cu^{2 +}) 검출방법.
6. 청구항 1 또는 청구항 2의 화합물을 포함하는 생체 내 구리 이온(Cu^{2 +}) 검출용 프로브.

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