CN114874198A - 一种基于罗丹明-铜配合物的Aβ荧光探针及其应用 - Google Patents
一种基于罗丹明-铜配合物的Aβ荧光探针及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于罗丹明‑铜配合物的Aβ荧光探针，所述探针在Aβ对Aβ表现出高特异性、高灵敏度(15nM)、高亲和力(Kd＝23.4nM)、快速(60s)的响应特性，可以实现定量检测，可用于阿尔兹海默症的早期诊断和检测。
Description
技术领域
本发明涉及疾病诊断探针的制备和应用，属于生物医药检测领域。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是一种脑部疾病，就像冠心病是一种心脏病一样，它也是一种进行性疾病，这意味着随着时间的推移情况会变得越来越糟糕。通常在患者能够察觉到大脑变化的前20年或者更长时间，阿尔茨海默病就已经开始了，因为个体出现记忆丧失和语言问题等明显的症状一般需要经过多年的大脑变化。如果大脑中参与认知和思考的神经细胞或者神经元被破坏，则会导致其认知功能逐渐恶化，尤其是记忆，这将会对患者的个性、社交活动和患者自主性造成严重的影响。并且，随着病情的恶化，大脑其他部位的神经元也会受到损伤或破坏。最终导致的结果就是患者无法独立行走或者自主进食，日常生活活动都无法完成，几乎需要护理人员时刻陪同，这给患者及其家人在经济和精神方面都造成了很大的压力。总之，阿尔茨海默症已经严重影响到老年人，在全世界范围内造成了高死亡率和残疾率。
尽管研究人员在发展治疗策略方面做出了巨大的努力，但迄今为止仍无有效的治疗方法。许多药物在病理学已不可逆转的时候才给予治疗，因此大多也以失败而告终。而且目前AD的临床诊断通常是不准确的，因为它主要基于根据家族病史以及神经和神经心理学观察[162]。因此，亟需发展适当的早期发现和疾病检测的诊断工具以助于进行有效的治疗。
从组织学水平上看，这种疾病的病理特征主要包括β-淀粉样斑块(Aβ)的沉积，神经原纤维缠结和活性氧含量升高(ROS)。其中，含有42个氨基酸的多肽Aβ42被证明是所有Aβ多肽中(36-43)极易聚集的和极高毒性的。细胞外Aβ42不断积累于脑内，对大脑的信息处理会产生极大的影响。因此，作为广泛接受的AD早期诊断生物标志物，Aβ斑块的检测和成像在过去几十年中引起了科研工作者们的极大兴趣。
PET、MRI和PET是临床上最常用的成像技术手段。然而，MRI的灵敏度较低且采集时间长，仅可见较大的斑块或缠结(>50μm)。与MRI相比，放射性标记的PET和SPECT相对具有较高灵敏度，可以显示大多数生理靶标和配体之间的相互作用，如神经递质和脑受体，它们也能够测定人体中特定生物分子的浓度(低至皮摩尔范围)。然而PET由于成本高，缺乏所需同位素，以及半衰期短而受限；SPECT则具有相对较高的背景信号和较差的血脑屏障穿透能力。与放射性成像技术相比，光学成像有多个优点，例如无创性、非放射性和价格便宜，并且可以较高分辨率在体内外对Aβ实现实时可视化等。因此，近红外荧光探针作为Aβ斑块的诊断和显像剂，已成为当今研究的热点之一。
目前，检测Aβ的荧光探针发展迅猛，如以ThT为代表的商业化探针；以MC-1为代表的花菁衍生物；以BAP-2为代表的BODIPY衍生物；以CRANAD-2为代表的姜黄素衍生物；以DBA-SLOH为代表的咔唑衍生物；以QM-FN-SO3为代表的喹啉丙二腈衍生物；以IRI-1为代表的亚氨基香豆素衍生物；以acedan 5为代表的acedan衍生物；以DTM-2为代表的二甲氨基噻吩衍生物；以4a1为代表的吩噻嗪衍生物；以TC为代表的香豆素衍生物等(图1)。但是迄今为止，还没有以罗丹明作为荧光基团的Aβ荧光探针。
发明内容
为解决现有技术中关于Aβ探针效果不优的缺陷，寻找更为灵敏特异性的探针，基于罗丹明-三联吡啶rho-terpy在Cu2+存在时形成了1:1的有机-金属配合物(rho-terpy-Cu)，并且Aβ含有多个与铜的共价结合位点，探针rho-terpy-Cu在Aβ存在时，荧光明显增强，并对Aβ呈现出较高的特异性和亲和力，而且响应时间快，灵敏度高，还可以穿过血脑屏障并结合AD小鼠脑内的Aβ斑块。
本发明的第一个方面是提供一种化合物罗丹明-三联吡啶(rho-terpy)，所述的化合物的分子式如下所示：
其中，R1-R6独立的选自H或C1-C3的烷基；或者，
R1、R5与之间的原子形成六元含氮杂环；
R2与1号碳原子形成六元含氮杂环；
R3、R6与之间的原子形成六元含氮杂环；
R4与2号碳原子形成六元含氮碳环；
优选的，R1选自H、甲基或乙基；
优选的，R2选自H、甲基或乙基；
优选的，R3选自H、甲基或乙基；
优选的，R4选自H、甲基或乙基；
优选的，R5选自H或甲基；
优选的，R6选自H或甲基。
优选的，本发明所述的化合物rho-terpy具体结构式为下列结构式之一：
本发明的第二个方面是提供一种荧光探针，所述的荧光是由rho-terpy与含有Cu2+的化合物反应形成有机-金属配合物rho-terpy-Cu。
优选的，rho-terpy与含有Cu2+的化合物按照摩尔比1:1反应。
在其中的一个具体的实施例中，所述的含有Cu2+的化合物为高氯酸铜(Cu(ClO4)2)。
在另外的一个实施例中，所述的反应为将rho-terpy溶解于甲醇，然后缓慢加入高氯酸铜水溶液，混合均匀后将混合溶液旋干，然后用二氯甲烷和水萃取，水洗获得红色产物，即为rho-terpy-Cu。
本发明的第三个方面是提供一种新的β-淀粉样斑块(Aβ)的小分子探针rho-terpy-Cu的制备方法，所述的方法是将溶解在极性有机溶剂中的rho-terpy与等摩尔的含有铜离子的化合物混合，旋干后萃取，洗涤，最终获得红色化合物。
在一个具体的实施例中，溶解rho-terpy的剂型有机溶剂为甲醇。
在另外一个具体的实施例中，所述的萃取剂使用的为二氯甲烷与水。
本发明的第四个方面是提供利用本发明第二方面的荧光探针或第三方面所述的方法获得的探针定量检测β-淀粉样斑块(Aβ)的方法。
所述的方法为诊断用途或非诊断用途。
具体的，所述的检测方法是利用PBS溶解rho-terpy-Cu获得终浓度在0.5-2μM的rho-terpy-Cu溶液，加入配制好的待测样品，混合均匀后测试其前后荧光光谱变化。
在一个具体的实施例中，所述的检测方法在加入待测样品的100s，优选80秒、更优选60秒内检测荧光，所述的荧光检测波长为595nm。
在另外一个具体的实施例中，所述的方法定量检测β-淀粉样斑块(Aβ)的浓度范围为15-160nM。
本发明的第五个方面是提供发明第一方面的化合物rho-terpy或第二方面的荧光探针或第三方面所述的方法获得的探针在制备检测β-淀粉样斑块(Aβ)试剂中的用途。
在一个具体的实施例中，所述的β-淀粉样斑块(Aβ)为体内的β-淀粉样斑块(Aβ)。
本发明的第六个方面是提供本发明第一方面的化合物rho-terpy或第二方面的荧光探针或第三方面所述的方法获得的探针在制备诊断阿尔茨海默症的产品中的用途。
在一个具体的实施例中，所述的用途是通过定量检测体内的β-淀粉样斑块(Aβ)的含量来实现。
在另外一个具体的实施例中，所述的诊断是通过双光子成像荧光检测β-淀粉样斑块(Aβ)。
在另外一个具体的实施例中，所述的检测是通过免疫荧光的方法检测大脑海马体的切片中β-淀粉样斑块(Aβ)的含量来实现。
本发明的有益效果是：发明开发了一个基于罗丹明-铜配合物的Aβ荧光探针，该探针在Aβ存在时呈现荧光“turn on”的变化，对Aβ表现出高特异性、高灵敏度(15nM)、高亲和力(Kd＝23.4nM)、快速(60s)的响应特性，可以实现定量检测。双光子成像结果表明该探针可以穿过血脑屏障并能与Aβ斑块结合，从而使得探针被“点亮”。离体切片染色结果也证实了该探针确实是与AD小鼠脑切片上的Aβ斑块结合且呈现很亮的荧光。总之，该探针是首个利用罗丹明作为荧光基团的Aβ探针，也是首个利用铜结合Aβ的荧光探针，有望为阿尔兹海默症的早期诊断和检测做出一定的贡献。
附图说明
图1：现有技术已经报道过的Aβ荧光探针。
图2：rho-terpy图谱：图2a：rho-terpy在氘代甲醇中的氢谱；图2b：rho-terpy在氘代甲醇中的碳谱；图2c：rho-terpy的高分辨质谱。
图3：rho-terpy-Cu对Aβ的光谱响应性研究：(a)rho-terpy-Cu与Aβ反应示意图；在PBS中，探针rho-terpy-Cu(1μM)与1当量Aβ作用前后的紫外吸收光谱(b)和荧光光谱(c)，激发波长为540nm。
图4：rho-terpy-Cu对Aβ的选择性：在PBS中，探针rho-terpy-Cu(1μM)与各种天然活性分子(1μM)混合溶液在595nm处的荧光强度，激发波长为540nm。
图5：rho-terpy-Cu对Aβ的响应时间：rho-terpy-Cu(1μM)与1当量Aβ作用时在595nm处的荧光强度与反应时间的关系，激发波长为540nm。
图6：rho-terpy-Cu对Aβ的荧光滴定实验：(a)在PBS中，rho-terpy-Cu(1μM)与Aβ(0-160nM)作用的荧光光谱；(b)595nm处的荧光强度值与Aβ浓度的线性关系图，激发波长为540nm。
图7：rho-terpy-Cu的光稳定性。
图8：Hela细胞与不同浓度的探针rho-terpy-Cu孵育24小时后的细胞存活率。
图9：rho-terpy-Cu与ThT的置换实验：(a)向ThT/Aβ复合物(ThT/Aβ＝1μM:1μM)中逐渐滴加探针rho-terpy-Cu(0-1μM)的荧光光谱变化，左侧是450nm激发下ThT的荧光谱图，右侧是540nm激发下rho-terpy-Cu的荧光谱图；(b)ThT在480nm处的荧光强度和rho-terpy-Cu在595nm处的荧光强度变化趋势。
图10：rho-terpy-Cu稀释浓度在0.1nM至25.6nM之间的SPR分析。
图11：荧光探针与Aβ的分子对接：(a)rho-terpy-Cu与Aβ的分子对接，rho-terpy-Cu以球棒模式显示，氨基酸残基以细棒模式显示，氨基酸受体以表面模式显示；(b)文献已报道的荧光探针与Aβ的分子对接，探针以球棒模式显示，氨基酸残基以细棒模式显示。
图12：rho-terpy-Cu与Aβ溶液的双光子成像：rho-terpy-Cu液滴(1μM)在未加入Aβ(左)和加入Aβ(右)时的双光子信号，激发波长为880nm。
图13：野生型小鼠(WT)和APP/PS1(Tg)小鼠脑部双光子成像。
图14：rho-terpy-Cu与Aβ抗体的免疫荧光染色：A和D是探针rho-terpy-Cu的红色通道(λex＝561nm,10X)；B和E是Aβ抗体的绿色通道(λex＝488nm,10X)；C和F是两个通道的叠加图。
具体实施方式
以下通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。
本发明技术方案中使用的试剂盒仪器如下所示，其仅作为举例证明，本领域中可实现本发明技术方案的常规试剂和仪器也被包含在本发明的范围之内。
一、实验试剂
硫黄素T、高氯酸铜六水合物、Aβ42、二甲基亚砜、二氯甲烷、PBS磷酸盐缓冲液、溴化钾、L-谷氨酸、α-酮戊二酸、L-酪氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-苏氨酸、D-半乳糖、L-苯丙氨酸、Aβ多克隆抗体、Alexa Fluor二抗、CM5芯片、氨基偶联试剂盒、96孔微孔板、CCK-8试剂盒、Hela细胞、DMEM培养基、特级胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶(0.25％)、异氟烷、OCT包埋剂、APP/PS1雌性小鼠、C57雌性小鼠。
二、实验仪器
表1实验仪器及型号
实施例1探针制备及检测
1)合成rho-terpy
将2,2':6',2”-三联吡啶-4'-甲醛(10mmol)，3-羟基-N,N-二乙基苯胺(20mmol)，对甲苯磺酸(1.5mmol)溶于100mL的醋酸溶液中，混合溶液加热至70℃，回流7小时后降至室温。然后用10％的NaOH溶液中和至pH为7，产生的沉淀用滤纸过滤，固体用水洗三次，每次100mL。然后将固体晾干后溶解于100mL二氯甲烷中，加入四氯苯醌(1.23g)后室温搅拌两小时，然后旋干溶剂，用柱层析法提纯得到红色固体(2.95g,产率50％)。
合成过程如下所示：
利用核磁共振和质谱确定化合物的结构，图谱见图2。
2)、探针制备
取一定量纯化后的rho-terpy溶解于甲醇，然后缓慢加入一当量高氯酸铜水溶液，混合均匀后将混合溶液旋干，然后用二氯甲烷和水萃取，有机层用水洗三次，除去溶剂后无需纯化直接得到红色产物，命名为rho-terpy-Cu。
3)母液的配制
将探针rho-terpy-Cu用分析级DMSO标定成1mM的标准溶液备用，密封，避光，置于冰箱上层保存。后续用于各类分析实验时，用缓冲溶液PBS(pH＝7.4)稀释到所需的浓度。
4)天然活性分子的配制
将天然活性分子配制成1mM的标准溶液备用，密封，避光，置于冰箱上层保存。后续用于各类分析实验时，用缓冲溶液PBS(pH＝7.4)稀释到所需的浓度。这些天然活性分子包括：Aβ,Glu,α-KA,Tyr,Pro,Leu,Thr,Phe,D-galactose。
5)光谱性能测试
取1mM的rho-terpy-Cu母液1μL于1mLPBS中，得到终浓度为1μM的rho-terpy-Cu溶液，测试其吸收和荧光光谱，然后加入1μL配制好的Aβ母液，混合均匀后观察溶液吸收和测试发射的变化。
针对探针rho-terpy-Cu对Aβ的响应进行初步定性的测试，发现探针的吸收峰位于580nm，加入1当量Aβ后吸收几乎不变。探针的荧光发射峰位于595nm且荧光很弱，加入1当量Aβ后荧光明显升高，增强约14倍，初步判断该探针具备检测Aβ的条件。与其他荧光探针不同的是，它们在加入Aβ后荧光“turn on”的原因主要是由于构象自由度和旋转限制的降低所造成的。而本发明设计的该探针荧光恢复主要是由于rho-terpy-Cu结合Aβ后，分子内的PET过程被破坏，进而导致罗丹明母体的荧光得到恢复(图3)。
6)荧光滴定实验
取1mM的rho-terpy-Cu母液1μL于1mLPBS中，得到终浓度为1μM的rho-terpy-Cu溶液，测试溶液荧光光谱，然后用PBS将Aβ母液(1mM)稀释100倍后逐渐滴加至反应液，测试混合溶液的荧光光谱。
7)选择性实验
取1mM的rho-terpy-Cu母液1μL于1mLPBS中，得到终浓度为1μM的rho-terpy-Cu溶液，测试溶液荧光光谱，然后加入1μL配制好的待测分子母液，混合均匀后测试其前后荧光光谱变化。
待测分子包括：Aβ,Glu,α-KA,Tyr,Pro,Leu,Thr,Phe,D-galactose。从结果可以看出，探针rho-terpy-Cu对于测试的常见生物活性分子没有明显的响应，对Aβ表现出了高选择性和特异性(图4)，这是作为一个具有应用前景的Aβ荧光探针的必要条件之一，探针与其他生物活性分子没有响应才能确保探针不会受到其他信号的干扰。
8)时间响应的测定
取1mM的rho-terpy-Cu母液1μL于1mLPBS中，得到终浓度为1μM的rho-terpy-Cu溶液，测试溶液荧光光谱，然后加入1μL配制好的Aβ母液，每间隔10秒测试其荧光光谱。
由图5可知，rho-terpy-Cu对Aβ的响应非常迅速，加入Aβ后60s探针的荧光几乎不再增加，表明该响应过程可在60s内完成并达到平衡，因此后续实验均在加入Aβ60s后进行测试。
9)检测限的计算
根据公式LOD＝3σ/κ,其中σ为10个空白样品rho-terpy-Cu(1μM)溶液在595nm处荧光强度的标准偏差，κ为低浓度下595nm处的荧光强度与检测物浓度之间线性关系的斜率。
结果表明当探针浓度为1μM时，在540nm激发波长激发下，随着Aβ浓度增加(0-160nM)，探针的荧光逐渐升高(图6a)，而且探针在595nm处的荧光强度随Aβ浓度呈现良好的线性上升的趋势，经计算得到其检测限为15nM(图6b)，这说明了该探针可以对Aβ实现定量检测。这是其他文献报道的探针所不具备的，它们大多只是荧光增强或减弱，而无法对Aβ实现定量检测。
10)光稳定性实验
取1mM的rho-terpy-Cu母液1μL于1mLPBS中，得到终浓度为1μM的rho-terpy-Cu溶液，测试其吸收值，然后用11W的台灯每间隔2分钟辐照一次并立即测试其吸收变化。
结果发现该溶液的吸光度基本保持不变，表明该探针具有良好的光稳定性，也进一步证明了罗丹明染料良好的光学性质(图7)。
11)探针的细胞毒性
待Hela细胞贴壁生长至整个培养瓶的面积的80％-90％左右时，将Hela细胞进行消化，操作步骤如下：首先去除培养瓶中的培养基(取DMEM培养基500mL，加入5mL的青霉素和链霉素双抗以及50mL的胎牛血清)，取5mLPBS洗细胞三次，然后加入1mL胰蛋白酶进行消化，使细胞脱壁，消化完毕后加入培养基停止消化并吹打至细胞都处于悬浮状态。然后将Hela细胞接种在96孔板上，每孔加200μL，在37℃，5％CO2和95％O2的二氧化碳培养箱中培养24小时直至细胞贴壁，然后加入不同浓度的rho-terpy-Cu溶液，使其最终浓度为0μM，4μM，8μM，12μM，16μM,20μM,24μM，每个浓度设置6个孔，然后在二氧化碳培养箱中培养6小时，弃去孔板上清液，细胞用PBS洗涤三次，然后每个孔分别加入CCK-8试剂100μL，继续培养4小时，随后测量酶标仪在450nm处各孔的吸光值(OD)。
结果如图8所示，当探针的浓度高达24μM时，Hela细胞的存活率仍然高于80％，这说明探针是低毒化合物，可以安全地应用于生物体内。
12)置换实验
硫磺素T(Thioflavin T),又称为碱性黄1(Basic Yellow 1)，是一种具有细胞膜渗透性的苯并噻唑染料，常用来鉴定样本内淀粉样纤维的存在与否，一旦与淀粉样纤维结合后荧光信号明显增强，结合后引起最大激发波长(385nm-450nm)和最大发射波长(445nm-482nm)的迁移，硫磺素T能用来监测堆积的β折叠，也能用来组织学和蛋白质鉴定。为了比较探针rho-terpy-Cu和硫磺素T的亲和力相对大小，本发明进行了置换实验。
取1mM的硫磺素T母液1μL于1mLPBS中，得到终浓度为1μM的硫磺素T溶液，然后加入1μL配制好的Aβ母液，得到1:1的ThT:Aβ复合物，450nm激发波长激发下测试其荧光光谱，然后逐渐加入探针rho-terpy-Cu(0-1μL)至反应液中，测试其混合溶液分别在450nm和540nm激发时的荧光光谱变化。
结果显示：ThT:Aβ复合物在450nm激发时荧光发射峰位于480nm。当探针持续增加，480nm激发条件下发出的荧光会逐步减弱，而595nm激发条件下的荧光则会呈增强趋势，这代表了本发明的探针可以将Aβ从ThT/Aβ复合物中置换出来生成rho-terpy-Cu/Aβ复合物，也就是说探针rho-terpy-Cu具有比商业化探针ThT对Aβ更强的亲和力(图9)。
13)亲和力测试
在25℃下，通过Biacore 8k系统(GE healthcare,Uppsala,Sweden)检测探针rho-terpy-Cu与目标蛋白Aβ结合的亲和力。采用耦合方法将Aβ固定在双核探针芯片CM5上，约776.7个响应单元(RU)。然后在PBS缓冲液中制备化合物的一系列稀释液(25.6nM,12.8nM,6.4nM,3.2nM,1.6nM,0.8nM,0.4nM,0.2nM,0.1nM,0nM)，并以30μL/min的速率依次注入，缓冲液注入120s，解离120s，用1M NaCl溶液再生30s，空白注射法检查结垢效果。通过从活性通道中的信号减去参考通道中的信号来调整信号，以使样品与目标蛋白发生非特异性结合。通过稳态分析，利用BIA评估软件对实验数据进行拟合和分析。
图10所示，本发明选用Aβ作为靶点蛋白固定于CM5芯片上，目标化合物rho-terpy-Cu作为分析物测定各自的解离常数(Kd)，以此来分析化合物与靶点蛋白之间的结合力大小。利用分析软件得到探针对Aβ的亲和力Kd为23.4nM，远远高于商业化探针硫磺素T的亲和力(Kd＝1942nM)[184]
如表2所示，本发明的探针具有比其他很多文献报道的探针更高的亲和力，而且探针选择性和光稳定性都较好，细胞毒性低，综合来看，本发明设计的该探针具有很大的优势。
表2已发表的Aβ探针与rho-terpy-Cu的比较
实施例2计算机模拟小分子与蛋白Aβ的对接实验
首先在RSCB PDB网站(RCSB PDB:Homepage)上下载ID为5kk3的Aβ的PDB结构，并将其作为本研究中对接的蛋白质模型。然后进入殷赋云计算平台(yinfotek.com)，本发明选用了Autodock Vina程序进行计算机模拟分子对接，使用
网格台阶定义以蛋白质为中心的网格盒，其尺寸为
其足够大以包围整个蛋白质并为表面上的对接配体留出足够的空间。对接主要步骤包括导入配体及蛋白，分子对接，结果分析等。步骤如下：
(1)对受体、配体的相关文件做出预先的处理，并完成上传过程；
(2)对接口袋：上传经过处理和正确格式的配体和蛋白文件，对盒子上存在的中心位置进行明确，确定口袋的长宽高；
(3)点击【显示盒子】，对其开展全面的观察：如体积是不是可以满足需求，有没有完全包住口袋等，如果无法符合要求，则可对其中心或长宽高做出适当的调整；
(4)选择【计算模式】，并对参数做出相应的设定；
(5)点击【提交】；
(6)计算完毕后，从【我的项目】->【项目列表】->【项目详情】找到任务，点击【查看】，进入分析页面。通过【视图】分析受体-配体间相互作用，挑选符合预期、能够解释问题的结合模式。通过控制面板调整显示样式，点击【截图】下载高清图片。
结果表明，本发明的探针可以与Aβ蛋白的表面凹槽紧密结合，而且该探针占据了一个由非极性残基GLN15、LEU17和LEU34形成的结合位点，该结合位点主要由疏水相互作用决定(图11(a))。此外，上述SPR分析得到的Kd值与该计算得到的结合能可以很好的对应(-8.76kcal/mol)，进一步证明本发明的探针对Aβ具有很强的亲和力。随后，本发明随机选择了八个文献已报道的有代表性的Aβ荧光探针，分别是DINAR2c、acedan5、MAAD 3、QM-FN-SO3、IRI-1、NIAD4、MC-1、商业化探针硫磺素T与本发明的探针rho-terpy-Cu做比较，在相同参数条件下分别与受体蛋白Aβ进行分子对接。通过归纳总结后本发明惊讶地发现，这些探针的对接结果均具有一个共性，那就是它们与Aβ结合的氨基酸位点都是GLN15、LEU17和LEU34，而这些探针在Aβ存在时荧光也被“点亮”，对接结果与本发明实验观察到的结果是完全一致的，进一步证明本发明设计的探针具有合理性和可行性(图11(b))。
实施例3溶液双光子成像
为了证明rho-terpy-Cu可以应用于体内双光子成像，本发明首先在溶液中初步测试了它的双光子信号，取1mM的rho-terpy-Cu母液1μL于1mLPBS中，得到终浓度为1μM的rho-terpy-Cu溶液，然后滴加一滴至载玻片上，在图像采集过程中用880nm激光实现双光子荧光激发。对于成像，本发明使用配备25X水镜(0.45数值孔径)的双光子显微镜(A1R-MP,Nikon)。然后在该液滴位置加入一滴Aβ溶液(1μM,PBS)，之后在相同条件下完成对双光子信号的收集。
结果表明，在880nm激发波长激发下，几乎观察不到rho-terpy-Cu液滴的荧光，而加入Aβ后，该液滴的发射大大增强，表明rho-terpy-Cu可以对Aβ进行双光子荧光成像(图12)。
实施例4体内双光子成像
所有动物实验都是严格按照中国科技部制订的实验动物护理和使用的方针实施，并获得中国科学院深圳先进技术研究院实验动物伦理委员会的批准，批准号为SIAT-IACUC-200512-YYS-GP-A1281。
首先用100μL的巴比妥钠(2％)分别将一只20月龄的APP/PS1雌性小鼠和一只20月龄的C57雌性小鼠麻醉，然后用注射器尾静脉注射500μL的rho-terpy-Cu溶液(1μM)。随后使用开颅工具通过手术制备颅骨成像窗口，在图像采集过程中，用880nm激光实现双光子荧光激发。对于成像，本发明使用配备25×水镜(0.45数值孔径)的双光子显微镜(A1R-MP,Nikon)。使用512×512μm矩阵采集图像，每帧15秒，持续45分钟，使用ImageJ软件进行图像分析。
结果显示，在880nm激发下，尾静脉注射rho-terpy-Cu后，AD小鼠脑部血管周围出现大量的斑块亮点，而正常小鼠中却未观察到，说明rho-terpy-Cu能够区分正常小鼠和AD小鼠，而且该探针可以穿过血脑屏障，并能在小鼠脑内特异性标记Aβ(图13)
实施例5免疫荧光染色
首先对脑切片进行染色，具体步骤如下：(1)取含有海马体的脑冠状切面组织，将脑片置于0.01mol/L PBS中漂洗3次,每次10min；(2)加入Aβ抗体(稀释度为1:500)，4℃孵育过夜后在PBS中漂洗3次,每次10min，然后使用10％山羊血清进行封闭,室温1～2h；(3)加入荧光二抗(稀释度为1:200),室温避光孵育20min，然后用PBS漂洗3次,每次10min；待切片略干但保持湿润状态下用封闭液封闭。
将封闭好的切片置于正置激光共聚焦显微镜上，然后进行双通道模式成像，其中一个通道收集Aβ抗体在488nm激发下500-550nm波段的荧光，另一个通道收集探针rho-terpy-Cu在561nm激发下580-640nm波段的荧光，并将两个通道的荧光成像图进行叠加，观察探针rho-terpy-Cu与AD小鼠脑切片中Aβ的结合情况。
结果显示：如图13，488nm激发波长激发下，Aβ抗体呈现较亮的绿色荧光，540nm激发波长激发下，探针呈现较强的红色荧光，且转基因AD小鼠脑切片上的荧光斑点与用Aβ抗体观察到的高度一致，良好的共定位进一步证实了本发明的探针与Aβ抗体染色的Aβ斑块是一致的(图14)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种化合物rho-terpy，所述的化合物具有如下结构
其中，R1-R6独立的选自H或C1-C3的烷基；或者，
R1、R5与之间的原子形成六元含氮杂环，R2与1号碳原子形成六元含氮杂环，
R3、R6与之间的原子形成六元含氮杂环，R4与2号碳原子形成六元含氮碳环；
优选的，R1选自H、甲基或乙基；
优选的，R2选自H、甲基或乙基；
优选的，R3选自H、甲基或乙基；
优选的，R4选自H、甲基或乙基；
优选的，R5选自H或甲基；
优选的，R6选自H或甲基。
2.根据权利要求1所述的化合物rho-terpy，其中所述的化合物的具体结构式为下列结构式之一：
3.一种荧光探针，所述的探针是由权利要求1或2所述的化合物rho-terpy与含有Cu2+的化合物按照摩尔比1:1在反应中形成有机-金属配合物rho-terpy-Cu。
4.根据权利要求3所述的荧光探针，其特征在于，所述的含有Cu2+的化合物为高氯酸铜Cu(ClO4)2。
5.一种荧光探针rho-terpy-Cu的制备方法，所述的方法是将溶解在甲醇有机溶剂中的权利要求1或2所述的化合物rho-terpy与等摩尔的含有铜离子的化合物混合，旋干后使用二氯甲烷与水萃取，洗涤，最终获得rho-terpy-Cu。
6.权利要求3-4任一项所述的荧光探针定量检测β-淀粉样斑块(Aβ)的方法，所述的方法为非诊断用途的方法；其特征在于，利用PBS溶解rho-terpy-Cu获得终浓度在0.5-2μM的rho-terpy-Cu溶液，加入配制好的待测样品，混合均匀后测试其前后荧光光谱变化。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在加入待测样品的40-80秒内检测荧光，所述的荧光检测波长为595nm；所述的方法定量检测β-淀粉样斑块(Aβ)的浓度范围为15-160nM。
8.权利要求1-2任一项所述的化合物rho-terpy在制备荧光探针中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，所述荧光探针用于定量检测β-淀粉样斑块(Aβ)。
10.权利要求1-2任一项所述的化合物rho-terpy或权利要求3-4任一项所述的荧光探针探针在制备诊断阿尔茨海默症的产品中的用途。
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