CN115960090A

CN115960090A - 一种罗丹明b修饰吡啶配体的制备方法及其光催化抗菌应用

Info

Publication number: CN115960090A
Application number: CN202211738875.2A
Authority: CN
Inventors: 黄怀义; 张志尚; 冯通明; 李文清
Original assignee: Foshan Fourth People's Hospital (foshan Tuberculosis Control Institute); Sun Yat Sen University
Current assignee: Foshan Fourth People's Hospital (foshan Tuberculosis Control Institute); Sun Yat Sen University
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2042-12-30
Also published as: CN115960090B

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种罗丹明B修饰吡啶配体的制备方法及其光催化抗菌应用。本发明提供了一种罗丹明B修饰吡啶配体，该配体在光照条件下可以产生大量超氧阴离子和单线态氧的活性氧物质，可破坏细菌的细胞膜从而灭活细菌，同时对细菌内的NADH/NADPH均有光催化氧化能力，从而破坏菌内氧化还原平衡引起细菌死亡。该配体在光照条件下对金黄色葡萄球菌具有很强的增殖抑制能力(MIC₉₀为0.78μM)。本发明的罗丹明B修饰吡啶可作为光敏剂用于开发成为高效低毒的抗菌光催化药物。

Description

一种罗丹明B修饰吡啶配体的制备方法及其光催化抗菌应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种罗丹明B修饰吡啶配体的制备方法及其光催化抗菌应用。

背景技术

细菌感染严重威胁人类健康，抗生素的滥用和误用导致了多重耐药菌的激增，因此迫切需要开发能够替代传统抗生素的高效、安全的抗菌剂来对抗细菌感染。光动力治疗(PDT)是近年来涌现的新兴癌症治疗手段，目前也逐步应用于抗菌治疗。抗菌光动力治疗(APDT)是一种很有前途的抗菌策略，其主要原理是光敏剂(PSs)在光照条件下生成活性氧气(ROS)，通过生成具有毒性的活性氧(ROS)破坏细胞膜来灭活细菌，可以最大限度地减少细菌耐药性和全身毒副作用。依据ROS产生的光化学反应机制不同，可以将PDT分为I型和II型两种类型。在I型PDT中，被光激发处于激发态的光敏剂最终与细胞内底物通过电子转移途径产生超氧阴离子和羟基自由基；在II型PDT中，则是处于激发态的光敏剂于其周围的氧气之间发生能量转移而产生单重态氧(¹O₂)。因此，光敏剂是整个抗菌光动力治疗过程的核心。

目前只有少数的光敏剂能够用于光动力抗菌，已经获得临床批准的也只有三种，亚蓝，甲苯胺蓝O和吲哚菁绿。同样迫切需要开发更多的光敏剂以应对各种各样的耐药细菌的出现，以满足需求。因此，研究新型的、高效的光敏剂抗菌至关重要，且罗丹明类的光敏剂用于抗菌治疗的研究很少，这个领域的研究具有巨大潜力。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种罗丹明B修饰吡啶配体，该配体在光照条件下可产生大量超氧阴离子和单线态氧，同时对细菌内的NADH/NADPH均有光催化氧化能力。该配体在光照条件下对金黄色葡萄球菌具有很强的增殖抑制能力，可应用于制备抗菌光催化药物。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供了一种罗丹明B修饰吡啶配体，其结构式如(Ⅰ)所示：

本发明还提供了上述的罗丹明B修饰吡啶配体的制备方法，包括如下步骤：

S1、以3-(2-吡啶)苯甲醛与3-二乙氨酚作为反应底物，在对甲基苯磺酸的催化下反应生成2-苯基吡啶衍生物；

S2、2-苯基吡啶衍生物与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌反应生成罗丹明B修饰吡啶配体。

优选地，步骤S1中，所述3-(2-吡啶)苯甲醛和3-二乙氨酚及对甲基苯磺酸的摩尔比为1:(2～2.5):0.15。

优选地，步骤S1中，所述3-(2-吡啶)苯甲醛和3-二乙氨酚以及对甲基苯磺酸溶于冰乙酸中，在70～80℃下回流反应6～8h；更优先地，在70℃下回流反应7h，其反应方程式如下所示：

优选地，步骤S1在保护气体气氛中进行。

优选地，步骤S2中，所述2-苯基吡啶衍生物与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌的摩尔比为2:1。

优选地，步骤S2中，所述2-苯基吡啶衍生物和2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌溶于二氯甲烷中，在室温下回流反应2～3h；更优先地，在室温下回流反应2h，其反应方程式如下所示：

本发明还提供了所述的罗丹明B修饰吡啶配体应用于制备抗菌光催化药物。

优选地，所述抗菌光催化药物为抗金黄色葡萄球菌的光催化药物。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。即所述药物以罗丹明B修饰吡啶配体作为主要活性成分，与药学上可接受的载体和/或赋形剂混合制备成组合物，并制备成临床上可接受的剂型。

更优选地，所述赋形剂是指可用于药学领域的稀释剂、黏合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稳定剂以及其他一些药用基质。

更优选地，所述载体是药物领域中可接受的功能性药用辅料，包括表面活性剂、助悬剂、乳化剂以及一些新型药用高分子材料，如环糊精、壳聚糖、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸聚乳酸共聚物(PLGA)、透明质酸等。

更优选地，本发明对上述药物或光敏剂的剂型没有特殊的限制，可以制成本领域技术人员熟知的片剂、胶囊剂、栓剂和粉针剂等。所制备的制剂可以是经口服或胃肠外方式(例如静脉、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其制备成肠衣片剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的罗丹明B修饰吡啶配体的制备方法为先以3-(2-吡啶)苯甲醛与3-二乙氨酚作为反应底物，在对甲基苯磺酸的催化下反应生成2-苯基吡啶衍生物，然后2-苯基吡啶衍生物在2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌的氧化作用下制得罗丹明B修饰吡啶配体。本发明提供的罗丹明B修饰吡啶配体在光照条件下可以产生大量超氧阴离子和单线态氧的活性氧物质，可破坏细菌的细胞膜从而灭活细菌，同时对细菌内的NADH/NADPH均有光催化氧化能力，从而破坏菌内氧化还原平衡引起细菌死亡。该配体在光照条件下对金黄色葡萄球菌具有很强的增殖抑制能力(MIC₉₀为0.78μM)。本发明的的罗丹明B修饰吡啶可作为光敏剂，用于开发成为高效低毒的抗菌光催化药物。

附图说明

图1为罗丹明B修饰吡啶配体的紫外吸收光谱；

图2为罗丹明B修饰吡啶配体光催化产生超氧阴离子的能力；

图3为罗丹明B修饰吡啶配体光催化产生单线态氧的能力；

图4为罗丹明B修饰吡啶配体光催化氧化NADH的能力；

图5为罗丹明B修饰吡啶配体光催化氧化NADPH的能力；

图6为罗丹明B修饰吡啶配体对金黄色葡萄球菌的暗毒性与光毒性。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。

实施例1罗丹明B修饰吡啶配体的合成

1、2-苯基吡啶衍生物的合成反应式如下：

根据上述化学反应式，制备过程具体如下：

往100ml单口瓶中加入3-(2-吡啶)苯甲醛(1.00g，5.46mmol)、3-二乙氨基酚(1.80g，10.92mmol)、对甲基苯磺酸(141mg，0.819mmol)和冰乙酸(50ml)，抽真空再用氮气交换三次，并用氮气球联通体系使反应于氮气气氛下进行；将所得混合溶液置于油浴中搅拌，反应体系呈黑色，从RT(29℃)以10℃/min的升温速率升温至70℃，再以70℃持续回流反应8h，期间利用TLC(HEX：EA＝3:1)监控反应完全，反应后在搅拌下自然降至室温；反应后的混合溶液在60℃下减压浓缩干燥，得深紫色固体，加入水(40ml)，用10％氢氧化钠溶液调节至pH＝7，用DCM(30ml)萃取2次，合并有机相并用水(30ml)洗，最后在41℃下减压浓缩干燥得紫色泡沫状固体产物，收率为50.5％，该产物的核磁氢谱信息如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(d,J＝4.6Hz,1H),7.89(d,J＝8.2Hz,2H),7.73(dt,J＝12.6,7.8Hz,2H),7.32(d,J＝8.1Hz,2H),7.25-7.18(m,1H),6.75(d,J＝9.2Hz,2H),6.19(d,J＝6.6Hz,4H),5.62(s,1H),3.27(q,J＝7.0Hz,8H),1.11(t,J＝7.0Hz,12H)。

2、罗丹明B修饰吡啶配体的合成反应式如下：

根据上述化学反应式，制备过程具体如下：

将步骤1制得的2-苯基吡啶衍生物(1.5g，3.03mmol)加入二氯甲烷(30ml)中并在室温下搅拌溶解，再加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ，0.343g，1.51mmol)，在室温下搅拌回流反应2h，将所得混合溶液于35℃下减压浓缩干燥，经硅胶柱纯化得到紫色固体产物，收率为20.6％。该产物的核磁氢谱信息如下：

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.75(d,J＝4.8Hz,1H),8.23(d,J＝7.7Hz,2H),7.86(d,J＝5.6Hz,2H),7.51(d,J＝7.8Hz,2H),7.39(d,J＝9.4Hz,2H),6.89(d,J＝9.5Hz,2H),6.83(s,2H),5.29(s,1H),3.63(q,J＝7.2Hz,8H),1.28(t,J＝4.6Hz,12H)。

实施例2罗丹明B修饰吡啶配体的性能表征

1、罗丹明B修饰吡啶配体在不同溶剂中的吸光度测定

分别以磷酸盐缓冲液(PBS)、二氯甲烷(DCM)、乙腈(MeCN)为溶剂，将实施例1的罗丹明B修饰吡啶配体配成10μM样品溶液，然后使用双光束紫外可见分光光度计记录样品的紫外吸收光谱，结果如图1所示，说明其吸收波长在PBS中最好。

2、罗丹明B修饰吡啶配体生成超氧阴离子的能力测定

使用二氢罗丹明123(简称DHR 123)测定罗丹明B修饰吡啶配体生成超氧阴离子的能力。当溶液中有超氧阴离子产生时，DHR 123会立刻捕获溶液中的超氧阴离子，DHR123被氧化生成荧光衍生物罗丹明123，使得发射亮绿色荧光(Ex/Em＝500/536nm)，其中荧光强度上升即可表明在溶液中生成了超氧阴离子。通过荧光分光光度计监测含待测样品和DHR123混合溶液在光照不同时间下的荧光光谱的变化，即可反映超氧阴离子的产生能力。

将两支含罗丹明B修饰吡啶配体(5μM)和DHR 123试剂(5μM)的水溶液置于比色皿中，分别测定黑暗/光照(白光，15mW/cm²)条件下其超氧阴离子的生成能力。罗丹明B修饰吡啶配体在黑暗条件下不生成超氧阴离子，光照条件的超氧阴离子生成能力如图2所示，该罗丹明B修饰吡啶配体随着受光照时间增长，产生超氧阴离子的量越大，在光照后具有很强的产生超氧阴离子的能力。

3、罗丹明B修饰吡啶配体生成单线态氧的能力测定

使用单线态氧探针9，10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(简称ABDA)测定新型罗丹明B修饰吡啶配体生成单线态氧的能力。当溶液中有单线态氧产生时，ABDA会立刻捕获溶液中的单线态氧，反应生成一种内源性的氧化产物，使得ABDA的特征吸收峰下降，其中ABDA吸收峰的下降速率即为单线态氧的产生速率。通过紫外可见分光光度计监测待测样品和ABDA混合溶液在光照不同时间下的紫外可见吸收光谱的变化，即可反映单线态氧的产生能力。

将两份同样含有罗丹明B修饰吡啶配体(5μM)和ABDA试剂(200μM)的水溶液置于比色皿中，分别测定黑暗/光照(白光，15mW/cm²)条件下其单线态氧生成能力。罗丹明B修饰吡啶配体在黑暗条件下不生成单线态氧，光照条件的单线态氧生成能力如图3所示，随着光照时间的延长，ABDA的吸光度逐渐降低，表明ABDA被单线态氧降解，表明光照射罗丹明B修饰吡啶配体时可有效产生单线态氧。

4、罗丹明B修饰吡啶配体光催化氧化NADH/NADPH的能力测定

将含罗丹明B修饰吡啶配体(5μM)和NADH/NADPH(A_339nm＝1.0)的PBS溶液置于石英比色皿中，放在光源下分别辐射5、10、15和20min，测定光照条件下其氧化NADH/NADPH的能力，并以黑暗条件作为对照组。

罗丹明B修饰吡啶配体对NADH的光催化氧化能力测试结果如图4所示，光照条件下的还原型辅酶NADH的峰强逐渐减小，而对照组的变化极小，表明罗丹明B修饰吡啶配体在光辐射下能将还原型辅酶Ⅰ(NADH)氧化成其氧化态(NAD⁺)，该配体对NADH有光催化氧化能力。

罗丹明B修饰吡啶配体对NADPH的光催化氧化能力测试结果如图5所示，光照条件下的还原型辅酶NADPH的峰强逐渐减小，氧化态NADP⁺的峰强逐渐增大，而对照组的变化极小，表明罗丹明B修饰吡啶配体在光辐射下能将还原型辅酶Ⅰ(NADPH)氧化成其氧化态(NADP⁺)，该配体对NADH有光催化氧化能力。

5、罗丹明B修饰吡啶配体对金黄色葡萄球菌的暗毒性和光毒性

采用典型的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌作为研究对象，研究罗丹明B修饰吡啶配体的光动力抗菌作用。将金黄色葡萄球菌接种于新鲜LB培养基中，在37℃下，150rpm振荡至指数期。然后通过测量细菌在600nm处的光密度来确定细菌浓度。具体实验方法如下：

将过夜培养的金黄色葡萄球菌用LB培养基稀释至1×10⁵CFU/mL，然后采用半倍稀释法配置一系列浓度梯度的含药菌液。即往稀释后的菌液中加入罗丹明B修饰吡啶配体(50μM)进行梯度稀释，配置8个浓度梯度(0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50μM)。将配好后的菌悬液(100μL)依次加入96孔板中，并往阴性对照组加入100μL无菌无药物的LB培养基，阳性对照组加入不含药的菌液。黑暗组置于37℃静态培养箱中培养18h，读取OD＝600nm的吸光度。光照组静态孵2h后，用白光光源照射20min(60mW/cm²)，再放回培养箱中孵育16h。观察阴性对照组是否澄清，澄清则证明数据可靠，用酶标仪测定600nm处的吸光度。

MIC值是指细菌在不同存活率下所需的药物浓度，其中MIC₉₀是指在一批试验中杀灭90％受试菌所需的药物浓度，MIC越小说明毒性越强，存活率的计算公式如下：

存活率(％)＝(C_实验组-C_{阴性对照组})/(C_{阳性对照组}-C_{阴性对照组})×100％。

如图6所示，不同浓度的罗丹明B修饰吡啶配体在黑暗与光照处理条件下对金黄色葡萄球菌的杀伤效果不同。实验中的罗丹明B修饰吡啶配体在无光照情况下，对金黄色葡萄球菌具有一定毒性，但是在光照条件下罗丹明B修饰吡啶配体对金黄色葡萄球菌具有很强的生长抑制能力，只需0.78μM的药物浓度即可使1×10⁵CFU/mL的金黄色葡萄球菌的存活率下降为10％以下，即光照MIC₉₀＝0.78μM，表明本发明的罗丹明B修饰吡啶配体具有开发成为高效的抗菌光敏剂的巨大潜力。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种罗丹明B修饰吡啶配体，其特征在于，其结构式如(Ⅰ)所示：

2.权利要求1所述的罗丹明B修饰吡啶配体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S2、2-苯基吡啶衍生物与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌反应生成罗丹明B修饰吡啶配体；

所述2-苯基吡啶衍生物的结构式为：

3.根据权利要求2所述的罗丹明B修饰吡啶配体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述3-(2-吡啶)苯甲醛和3-二乙氨酚及对甲基苯磺酸的摩尔比为1:(2～2.5):0.15。

4.根据权利要求2所述的罗丹明B修饰吡啶配体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述3-(2-吡啶)苯甲醛和3-二乙氨酚以及对甲基苯磺酸溶于冰乙酸中，在70～80℃下回流反应6～8h。

5.根据权利要求2所述的罗丹明B修饰吡啶配体的制备方法，其特征在于，步骤S1在保护气体气氛中进行。

6.根据权利要求2所述的罗丹明B修饰吡啶配体的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述2-苯基吡啶衍生物与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌的摩尔比为2:1。

7.根据权利要求2所述的罗丹明B修饰吡啶配体的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述2-苯基吡啶衍生物和2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌溶于二氯甲烷中，在室温下回流反应2～3h。

8.权利要求1所述的罗丹明B修饰吡啶配体应用于制备抗菌光催化药物。