CN114209825B - 亚铜离子响应的no释放和光热协同治疗剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种亚铜离子响应的NO释放和光热协同治疗剂及其应用。所述协同治疗剂由金属‑有机骨架纳米颗粒UiO‑66‑SNO和聚乙烯亚胺修饰的硫化亚铜通过静电自组装得到；首先采用高温溶剂热的方法制备得到UiO‑66‑SH，过亚硝基化反应得到约100 nm的小尺寸的UiO‑66‑SNO；其次通过静电自组装的方法，将聚乙烯亚胺修饰的硫化亚铜与UiO‑66‑SNO结合，得到协同治疗剂。利用癌细胞的酸性环境产生Cu+刺激UiO‑66‑SNO释放NO气体，Cu2‑xS‑PEI可以在1064nm激光下产生光热治疗，最终实现了NO气体治疗和光热治疗的协同治疗效果。

Description

亚铜离子响应的NO释放和光热协同治疗剂及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种亚铜离子Cu+响应的NO释放和光热协同治疗剂及其应用。
背景技术
癌症是世界上最严重的公共健康问题之一，化疗、光动力疗法和光热疗法等直接疗法已被广泛用于癌症治疗。然而，这些疗法都面临一个共同问题，那就是对癌细胞杀伤力有限，并且对正常细胞具有毒副作用。这些缺点严重阻碍了这些疗法在癌症治疗中的有效使用。
气体治疗是一种新兴的、且非常有应用前景的肿瘤治疗新策略。高浓度的NO、CO、H2S和H2可以抑制肿瘤细胞线粒体呼吸和能量代谢，诱导肿瘤细胞凋亡；还可以通过激活正常细胞的抗炎通路来降低传统肿瘤治疗方法对正常细胞产生的非特异性炎性损伤。一氧化氮（NO）是一种气体传递物，在心血管稳态、神经传递和免疫反应等各种生理和病理过程中起着重要作用。其中，目前越来越多的证据表明在癌症生物学领域，相对高水平的NO可作为细胞毒性和细胞凋亡诱导剂。但这些气体分子难以在肿瘤组织中有效蓄积，导致其治疗效果受限；过量NO/CO/H2S进入血液还可能带来气体中毒的风险。因此，如何实现气体分子的肿瘤靶向传输、可控气体释放、并辅助传统的肿瘤治疗方法进行减毒和增效，是肿瘤气体治疗面临的关键科学问题。
利用肿瘤细胞的EPR效应使纳米药物的被动靶向到病灶区，EPR效应是指尺寸在200 nm以下的纳米颗粒更趋向于在肿瘤组织内滞留聚集，从而提高药效减小系统副作用。肿瘤组织中血管丰富，血管壁间隙较宽，结构完整性较差，因而尺寸200 nm以下纳米颗粒在肿瘤组织中具有选择性高通透性和滞留效应。为了实现气体药物的被动靶向运输，纳米药物载体的尺寸应控制在200 nm以下。
因此，通过对一氧化氮供体结构的巧妙的设计，能够通过简单地调节pH、光照、温度来控制供体产生NO的速率；同时通过制备小尺寸的纳米材料实现被动靶向肿瘤细胞，实现靶向气体治疗协同热疗提高肿瘤治疗效果，具有显著意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种Cu+响应的NO释放和光热协同治疗剂。
本发明的另一目的是提供上述协同治疗剂的制备方法及其应用。
为了实现上述目前，本发明采用以下技术方案：
一种Cu+响应的NO释放和光热协同治疗剂，由金属-有机骨架纳米颗粒UiO-66-SNO和聚乙烯亚胺修饰的硫化亚铜通过静电自组装得到；
所述金属-有机骨架纳米颗粒UiO-66-SNO由金属-有机骨架UiO-66-SH经亚硝基化反应得到。
上述Cu+响应的NO释放和光热协同治疗剂，由以下步骤制备得到：
步骤1，采用溶剂热的方法合成UiO-66-SH：将四氯化锆、2,5-二巯基对苯二甲酸、冰醋酸加到N,N-二甲基甲酰胺中，将混合物分散后转入聚四氟乙烯高压反应釜内进行反应，得到UiO-66-SH；
步骤2，制备UiO-66-SNO：将UiO-66-SH、甲醇和甲苯混合分散后，搅拌条件下加入亚硝酸叔丁酯，将混合物在避光搅拌反应，得到UiO-66-SNO；
步骤3，制备油胺包裹的硫化亚铜Cu2-xS：将硫粉溶解在油胺中，再将Cu(acac)2分散在三氯甲烷和油胺的混合液中，然后将两种混合液混合进行反应，得到油胺包裹的Cu2- xS；
步骤4，制备聚乙烯亚胺修饰的硫化亚铜：将聚乙烯亚胺加至二乙二醇中，在氮气保护下搅拌加热至110℃，降温后加入油胺包裹的Cu2-xS，加热反应，得到聚乙烯亚胺修饰的硫化亚铜；
步骤5，将UiO-66-SNO和聚乙烯亚胺修饰的硫化亚铜分散在水中，得到Cu+响应的NO释放和光热协同治疗剂。
上述Cu+响应的NO释放和光热协同治疗剂在制备肿瘤治疗药物中的应用。
本发明提供的协同治疗剂由金属-有机骨架纳米颗粒UiO-66-SNO和PEI修饰的Cu2-xS-PEI通过静电自组装结合得到。由于肿瘤微环境(TME)具有特殊的理化性质（低氧、低pH和高谷胱甘肽等）和失调的生物合成中间体（过表达的过氧化氢、葡萄糖和乳酸等）。在TME中的低pH条件下，Cu2-xS-PEI释放出Cu+进而可以刺激响应NO释放。在1064nm激光器的照射下使Cu2-xS-PEI产生局部高温可以杀死癌细胞，同时产生的热也可以刺激NO的释放。S-亚硝基硫醇具有良好的生物相容性，主要通过Cu2-xS-PEI在TEM的酸性条件下产生的Cu+和近红外激光生热来刺激响应NO的释放，可以实现光热治疗和NO气体治疗的协同治疗，增强了治疗效果。
附图说明
图1为实施例1中UiO-66-SNO纳米颗粒的SEM照片(a)、Zeta电位(b)、 红外光谱(c)和紫外-可见-近红外光谱(d)。
图2为实施例1中UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI纳米颗粒的X射线衍射(XRD)(a)和X射线光电子能谱(XPS)(d)。
图3为实施例1的不同浓度的UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI在1064 nm激光器下的升温曲线
图4为实施例1不同浓度的NaNO2通过Griess法测得的紫外吸收光谱(a)和通过Griess法在波长543 nm处测得的NO标准曲线(R2=0.9991)(b)。
注：Griess法原理是NO在水溶液中极易氧化成NO2 —，在酸性条件下会与氨基苯磺酰胺反应生成重氮盐，再与N-1-萘基乙二胺偶联生成红色染料，在波长543 nm处有吸收。可用此原理检测NO的浓度。
图5为实施例1中UiO-66-SNO在不同pH值下的NO释放曲线(a)和UiO-66-SNO@Cu2-xS在不同pH值下的NO释放曲线(b)。
图6为实施例1的不同浓度Cu+与TMB产生显色反应后测量对应的紫外-可见-近红外吸收曲线(a)和根据(a)图的在652 nm处吸光度计算的Cu+标准曲线(R2=0.9922) (b)。
注：TMB全称为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，Cu+在过氧化氢存在时可发生芬顿反应产生羟基自由基(•OH)，从而使无色的TMB变成蓝色，且在651 nm出有紫外特征吸收峰。可用此原理间接检测Cu+的浓度。
图7为实施例1的UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI在不同pH值下的Cu+释放曲线。
图8为实施例1中UiO-SH@Cu2-xS-PEI、UiO-SNO@Cu2-xS-PEI及UiO-SNO@Cu2-xS-PEI在1064 nm激光照射处理下产生NO的细胞荧光成像。
注：DAF-FM DA为NO荧光探针，在NO存在时在激发波长下发绿色荧光，可追踪细胞内的产生。Hoechst 33342为细胞核染色剂，在激发波长下发蓝色荧光，定位NO荧光成像下细胞的位置。
图9为实施例1中不同浓度的UiO-66-SH@Cu2-xS-PEI、UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI 、UiO-66-SH@Cu2-xS-PEI+1064nm、UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI+1064nm和不加药单独1064 nm激光照射的细胞活性(NIR代表用1064 nm激光照射处理)。
具体实施方式
为详细说明本发明的结构特征、技术手段以及所实现的目的及效果，以下结合实施方式并配合附图进行详细说明。
本发明提供了一种Cu+响应的NO释放和光热协同治疗剂，包括金属-有机骨架纳米颗粒UiO-66-SNO和聚乙烯亚胺(PEI)修饰的硫化亚铜(Cu2-xS-PEI)，通过静电自组装，得到具有气体和光热协同治疗剂UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI，材料因其小尺寸(<200 nm)通过EPR效应被动靶向到癌细胞。
本发明的协同治疗剂具有NO气体治疗和光热治疗的协同治疗功能。一方面，协同治疗剂在肿瘤微环境的酸性条件下Cu+可触发NO的释放；另一方面协同治疗剂含有的Cu2- xS-PEI利用近红外激光产热也可以刺激响应NO释放实现光热治疗并进一步增强NO释放。同时因其尺寸小于200 nm具有被动靶向性，利用肿瘤细胞的EPR效应靶向到病灶区，如此便可以实现肿瘤细胞靶向。因此，本发明的协同治疗剂可以实现NO气体治疗和光热治疗的协同治疗，既提高对治疗病灶区的准确性又增强了治疗效果。
上述制备得到的协同治疗剂能够作为治疗肿瘤的制剂的应用。
所述的治疗肿瘤的制剂为所述协同治疗剂在所述的刺激响应NO气体和近红外光刺激下的气体治疗协同光热治疗。
可以理解的，所述协同治疗能够抑制肿瘤细胞生长并杀死癌细胞，因此，本发明的协同治疗剂是一种高效、低毒、绿色的肿瘤治疗方式。
本发明的肿瘤协同治疗剂的制备方法，其合成原料价格低廉且制备工艺简单、易于大规模生产。此外，利用本发明制备方法得到的协同治疗剂具有良好的单分散性和稳定性、良好的生物相容性以及肿瘤靶向性和具有可控的NO释放。
在本发明中，所述2,5-二巯基对苯二甲酸H2DMBD可以采用市售产品，也可以通过以下步骤合成得到：
(1) 2,5-二（甲基硫代氨基甲氧基）对苯二甲酸二乙酯的合成
将5g的2,5-二羟基对苯二甲酸二乙酯和9g的三乙烯二胺(DABCO)溶于50mL的N,N-二甲基乙酰胺(DMA) 中，冰浴冷却至0 °C；将 9.5g 的 N,N-二甲基硫代甲酰氯溶于25mL的DMA中，超声完全溶解后在氮气(N2)保护下用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上一步溶液中，保持温度在0 °C；滴加完全后将混合液在室温下搅拌16h，产生白色沉淀，抽滤并大量水洗后在真空条下干燥，得到化合物2,5-二（甲基硫代氨基甲氧基）对苯二甲酸二乙酯。
(2) 2,5-二（甲基硫代氨基甲磺酰基）对苯二甲酸二乙酯的合成
在N2保护下，将合成的2,5-二（甲基硫代氨基甲氧基）对苯二甲酸二乙酯在230 °C加热搅拌1h，得到的棕色混合物缓慢冷却至70 °C，用恒压滴液漏斗加入20mL乙醇，慢慢冷却至室温得到淡棕色晶体，抽滤后干燥，最后化合物过柱子提纯后得到2,5-二（甲基硫代氨基甲磺酰基）对苯二甲酸二乙酯。
(3) 2,5-二巯基对苯二甲酸的合成
配制1.3 mol·L-1 KOH乙醇/水(1:1)溶液，并取20 mL脱气1h；将反应得到的2,5-二（甲基硫代氨基甲磺酰基）对苯二甲酸二乙酯溶解在已脱气的KOH乙醇/水(1:1)溶液中，在N2保护下85 °C回流3 h；反应混合物冷却至室温后在冰浴中下加入10mL浓盐酸，产生明黄色沉淀，抽滤、大量水洗后真空干燥，得到配体2,5-二巯基对苯二甲酸（H2DMBD）。
下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
制备协同治疗剂：
(1) 制备配体H2DMBD
A. 2,5-二（甲基硫代氨基甲氧基）对苯二甲酸二乙酯的合成
将5g的2,5-二羟基对苯二甲酸二乙酯和9g的DABCO溶于50mL的DMA 中，冰浴冷却至0°C；将 9.5g 的 N,N-二甲基硫代甲酰氯溶于25mL的DMA中，超声完全溶解后在N2保护下用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上一步溶液中，保持温度在0°C；滴加完全后将混合液在室温下搅拌16h，产生白色沉淀，抽滤并大量水洗后在真空条下干燥，得到化合物2,5-二（甲基硫代氨基甲氧基）对苯二甲酸二乙酯。
B. 2,5-二（甲基硫代氨基甲磺酰基）对苯二甲酸二乙酯的合成
在N2保护下，将合成的2,5-二（甲基硫代氨基甲氧基）对苯二甲酸二乙酯在230°C加热搅拌1h，得到的棕色混合物缓慢冷却至70°C，用恒压滴液漏斗加入20mL乙醇，慢慢冷却至室温得到淡棕色晶体，抽滤后干燥，最后化合物过柱子提纯后得到2,5-二（甲基硫代氨基甲磺酰基）对苯二甲酸二乙酯。
C. 2,5-二巯基对苯二甲酸的合成
配制1.3mol·L-1 KOH乙醇/水(1:1)溶液，并取20mL脱气1h；将反应得到的2,5-二（甲基硫代氨基甲磺酰基）对苯二甲酸二乙酯溶解在已脱气的KOH乙醇/水(1:1)溶液中，在N2保护下85°C回流3h；反应混合物冷却至室温后在冰浴中下加入10mL浓盐酸，产生明黄色沉淀，抽滤、大量水洗后真空干燥，得到化合物2,5-二巯基对苯二甲酸。
(2) UiO-66-SH纳米颗粒
将0.0978 mmol的四氯化锆(ZrCl4)、0.0979 mmol的H2DMBD、500 µL的冰醋酸加到5mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将混合物超声分散后转入聚四氟乙烯高压反应釜内120°C反应24h。反应结束冷却至室温后，用用DMF离心洗涤3次，再用无水乙醇离心洗涤3次，真空干燥得到UiO-66-SH。
所述反应的最佳温度为120 °C，反应时间为24 h。得到的UiO-66-SH纳米颗粒直径约为100 nm。
(3) 制备巯基功能化的UiO-66-SNO
将25mg的UiO-66-SH、10mL甲醇和2.5 mL甲苯，超声分散后，室温磁力搅拌下加入1mL的亚硝酸叔丁酯，将混合物在26℃避光磁力搅拌24h。最后，通过离心收集产物，用无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到UiO-66-SNO。
(4) 制备油胺包裹的Cu2-xS（x=0-1）
将64 mg的硫粉加入12 mL的油胺中，在70℃下油浴0.5h使硫完全溶解在油胺中。在上步反应结束后向反应液注入523.3mg Cu(acac)2(分散在20mL三氯甲烷和5mL油胺混合液)，在70℃下油浴0.5h。离心收集并用乙醇洗涤3次得到油胺包裹的Cu2-xS，将其分散在三氯甲烷中。
(5) 制备PEI修饰的硫化亚铜Cu2-xS-PEI
在50 mg的PEI加入10mL二乙二醇(DEG)中，在氮气保护下剧烈搅拌加热至110℃，自然降至室温。加入分散于三氯甲烷的100mg油胺包裹的Cu2-xS，在60℃下使用旋蒸的方法除去三氯甲烷，氮气保护下加热至240℃，在此温度下维持1h，冷却至室温。加入大量稀盐酸和乙醇稀释后离心并分散于乙醇中。
(6) 制备UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI
将5mg UiO-66-SNO和10 mg 的Cu2-xS-PEI分散在5mL水中，26℃磁力搅拌24h。离心收集并用水洗涤3次得到UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI。
将步骤（6）中的UiO-66-SNO替换为UiO-66-SH，即可制得UiO-66-SH@Cu2-xS-PEI。
性能测试：
1. UiO-66-SNO纳米颗粒的形貌测定
图1是实施例1制备的UiO-66-SNO纳米颗粒的SEM(a)、Zeta电位(b)、紫外-可见-近红外光谱(c)和红外光谱(d)。结果表明，图示(a)中能够观察到合成的UiO-66-SNO纳米颗粒直径为100nm左右。图示(b)可以看出制备的UiO-66-SH和UiO-66-SNO带负电，Cu2-xS-PEI带正电，说明UiO-66-SNO和Cu2-xS-PEI可以通过静电吸附结合。图示(c)可以看出制备的UiO-66-SNO纳米颗粒在真空紫外区区具有很好的光吸收。图示(d)可以看出制备的UiO-66-SNO和UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI均有N=O的伸缩振动和S-N的伸缩振动。
2. 测定UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI的XRD和XPS
图2是实施例1制备的UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI的XRD(a)和XPS(b)。结果表明，图示(a)是UiO-66-SH和UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI的XRD谱图，黑色曲线代表UiO-66-SH的标准曲线，与标准曲线对照可以看制备的材料具备特征的衍射峰。图示(b)中能够观察到合成的UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI含有Cu，O，C，N，Zr，S等元素。
3. 测定UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI的光热曲线
图3为实施例1的不同浓度的UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI在1064 nm激光器下的升温曲线。结果表明，图示可以看出随着UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI的浓度增加，温度也随之升高，说明UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI具有光生热的性能。
4. 绘制NO的标准曲线
图4(a)为实施例1不同浓度的NaNO2通过Griess法测得的紫外吸收光谱。图4(b)为实施例1的UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI通过Griess法在波长543nm处测得的NO标准曲线(R2=0.9991)(b)。
因NO在水溶液中极易氧化成NO2 —，可以用NaNO2的浓度代替NO的浓度。配制不同浓度NaNO2的水溶液，分别为10μМ、20μМ、40μМ、60μМ、80μМ和100μМ。在酸性条件下加入Griess试剂后测其紫外吸收光谱。结果表明，图示4(a)可以看出在543nm处有最大吸收峰，且随着NaNO2浓度的增加最大吸收峰值也随之增大。图示4(b)为根据不同浓度在543nm处对应的紫外吸收值绘制的标准曲线。可以看出二者有很好的线性关系(R2=0.9991)，还可以得到浓度(X)-吸收值(Y)的函数关系：Y=0.01058*X-0.06427。
5. 测定NO的释放曲线
图5为实施例1中UiO-66-SNO在不同pH值下的NO释放曲线(a)和UiO-66-SNO@Cu2-xS在不同pH值下的NO释放曲线(b)。结果表明，图示5(a)可以看出单独的UiO-66-SNO在酸性条件不释放NO，图示5(b) 可以看出UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI在酸性条件下释放NO且在酸性和近红外激光照射共同作用时比单一的酸性处理释放更多的NO。
NO浓度根据图4(b)的NO标准曲线的线性方程得到。
6. 绘制Cu+的标准曲线
图6为实施例1的不同浓度Cu+与TMB产生显色反应后测量对应的紫外-可见-近红外吸收曲线(a)和根据(a)图的在652 nm处吸光度计算的Cu+标准曲线(R2=0.9922) (b)。
Cu2-xS-PEI在酸性条件下会释放Cu+，利用芬顿反应产生的•OH使TMB变成绿色溶液，配制不同浓度Cu2-xS-PEI的水溶液，分别为2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL和10μg/mL。在酸性条件下加入过氧化氢和TMB后测其紫外吸收光谱。结果表明，图示6(a)可以看出在652nm处有最大吸收峰，且随着Cu+浓度的增加最大吸收峰值也随之增大。图示6(b)为根据不同浓度在652nm处对应的紫外吸收值绘制的标准曲线。可以看出二者有很好的线性关系(R2=0.9922)，还可以得到浓度(X)-吸收值(Y)的函数关系：Y=0.07544*X+0.02929。
7. 测定Cu+的释放曲线
图7为实施例1的UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI在不同pH值下的Cu+释放曲线。
将实施例1制备的2mg/mLUiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI水溶液在pH为4.6和7.4的PBS溶液。在第一个小时内每隔10分钟取3mL的反应溶液，然后在2h、3h、4 h、5 h、6h、7h和8h的时间间隔下，离心后取上清夜测量紫外吸收光谱。根据Cu+的标准曲线计算出不同反应时间的上清夜中释放的Cu+，计算出每一个pH条件下不同时间的Cu+释放量。如图7所示，UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI在pH=7.4的中性条件不释放Cu+，在pH=4.6的酸性条件释放Cu+，随着pH的降低，Cu+的释放量不断增加。
8. NO的细胞荧光成像
与HeLa细胞培养线细胞核染色后的NO荧光和细胞核荧光图片
将实施例1制备的UiO-66-SH @Cu2-xS-PEI和UiO-66-SNO @Cu2-xS-PEI配制成300µg/mL(pH = 7.4)PBS溶液，将HeLa细胞以105个/孔的密度接种到3个Ф20mm玻璃底细胞培养皿中(其中有两个皿均加UiO-66-SNO @Cu2-xS-PEI)，并在5% CO2下于37 °C孵育12h。除去旧的培养基，添加1.5mL新鲜培养基，分别加入500µL配好的材料，在5% CO2下于37 °C孵育4h。用PBS洗涤细胞皿以去除未摄取的颗粒，加入1.5mL新鲜培养基和800µL浓度为10µМ的DAF-FM DA(NO荧光探针)，在5% CO2下于37 °C孵育30分钟。用PBS洗涤细胞皿以去除未摄取的探针，加入200µL的Hoechst 33342(细胞核染色剂)，在5% CO2下于37 °C孵育20分钟。用PBS洗涤细胞皿以去除未摄取的染色液，用荧光显微镜观察NO荧光和细胞核荧光成像。从图8中可以看出蓝色荧光代表细胞核的位置，绿色荧光代表NO所在位置，从二者的荧光叠加图可以看出NO多分布于细胞核及其周围。
9. 不同浓度材料UiO-66-SH@Cu2-xS-PEI、UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI 、UiO-66-SH@Cu2-xS-PEI+1064nm、UiO-66-SNO@ Cu2-xS-PEI+1064nm和不加药单独1064 nm激光照射的细胞活性
通过使用噻唑蓝(MTT)测定法测定Hela 细胞的细胞生存力。将细胞以104个/孔的密度接种到96孔细胞培养板中，并在5% CO2下于37 °C孵育12h。然后，不加药的光照组每孔用1064nm激光器照5分钟。加药组以每孔50µL的UiO-66-SH@Cu2-xS-PEI、UiO-66-SNO@ Cu2- xS-PEI 、UiO-66-SH@Cu2-xS-PEI+1064nm、UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI+1064nm分散在DMEM中，其浓度不同（10、20、40、80和160µg/mL）被添加到每个孔。将细胞在5% CO2下于37 °C再孵育24h。孵育后，去除旧培养基，并用PBS洗涤细胞孔以去除未摄取的颗粒，然后添加100µL新鲜培养基。然后向每个孔中加入10µL过滤灭菌的MTT试剂（PBS中5 mg/mL），并将板在37°C下孵育。再孵育4h后，除去培养基，并通过添加DMSO溶解沉淀的甲瓒晶体。使用酶标仪在450nm处测量每个孔中溶解的甲瓒晶体的吸收值。以未加药处理的细胞作为对照组，其细胞活性记为100%，计算出各浓度下的细胞存活率。所有样品均一式三份制备。
通过图9的细胞毒性的结果可以看出，单独激光照射组和UiO-66-SH@Cu2-xS-PEI的细胞活性在97%以上，说明其细胞毒性小，材料的生物相容性好；UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI 、UiO-66-SH@Cu2-xS-PEI+1064nm的细胞活性有所下降，这是因为UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI的Cu2-xS-PEI可以利用癌细胞的酸性环境产生Cu+刺激UiO-66-SNO释放NO，产生气体治疗使细胞活性降低；UiO-66-SH@Cu2-xS-PEI+1064nm的Cu2-xS-PEI可以在1064nm激光下产生局部高温杀死细胞，使细胞活性低；UiO-66-SNO@Cu2-xS-PEI+1064nm细胞活性最低，这是因为癌细胞的酸性环境产生Cu+刺激UiO-66-SNO释放NO的同时还有光热治疗的性能，产生的热也能促进NO的释放来杀死细胞，是通过NO气体治疗和光热治疗的协同治疗增强治疗效果。
本发明提供的协同治疗剂由金属-有机骨架纳米颗粒UiO-66-SNO和PEI修饰的Cu2-xS-PEI通过静电自组装结合得到。首先所述的纳米UiO-66-SH是采用高温溶剂热的方法制备的，接着通过亚硝基化反应得到约100 nm的小尺寸的UiO-66-SNO。其次通过静电自组装的方法，将Cu2-xS-PEI与UiO-66-SNO结合，作为协同治疗剂。利用癌细胞的酸性环境产生Cu+刺激UiO-66-SNO释放NO气体，Cu2-xS-PEI可以在1064nm激光下产生光热治疗，最终实现了NO气体治疗和光热治疗的协同治疗效果。

Claims (8)

1.一种亚铜离子响应的NO释放和光热协同治疗剂，其特征在于：由金属-有机骨架纳米颗粒UiO-66-SNO和聚乙烯亚胺修饰的硫化亚铜通过静电自组装得到；
所述金属-有机骨架纳米颗粒UiO-66-SNO由金属-有机骨架UiO-66-SH经亚硝基化反应得到。
2.权利要求1所述的亚铜离子响应的NO释放和光热协同治疗剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，采用溶剂热的方法合成UiO-66-SH：将四氯化锆、2,5-二巯基对苯二甲酸、冰醋酸加到N,N-二甲基甲酰胺中，将混合物分散后转入聚四氟乙烯高压反应釜内进行反应，得到UiO-66-SH；
步骤2，制备UiO-66-SNO：将UiO-66-SH、甲醇和甲苯混合分散后，搅拌条件下加入亚硝酸叔丁酯，将混合物在避光搅拌反应，得到UiO-66-SNO；
步骤3，制备油胺包裹的硫化亚铜：将硫粉溶解在油胺中，再将Cu(acac)2分散在三氯甲烷和油胺的混合液中，然后将两种混合液混合进行反应，得到油胺包裹的硫化亚铜；
步骤4，制备聚乙烯亚胺修饰的硫化亚铜：将聚乙烯亚胺加至二乙二醇中，在氮气保护下搅拌加热至110℃，降温后加入油胺包裹的硫化亚铜，加热反应，得到聚乙烯亚胺修饰的硫化亚铜；
步骤5，将UiO-66-SNO和聚乙烯亚胺修饰的硫化亚铜分散在水中，得到Cu+响应的NO释放和光热协同治疗剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1中反应条件为120 °C、24 h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2中反应条件为26°C、24 h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤3中反应条件为70℃、0.5h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤4中反应条件为240℃、1h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤5中反应条件为26°C、24 h。
8.权利要求1所述的亚铜离子响应的NO释放和光热协同治疗剂在制备肿瘤治疗药物中的应用。
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