KR20220103297A

KR20220103297A - 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220103297A
Application number: KR1020210005717A
Authority: KR
Inventors: 김현미; 주일로
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2021-01-15
Filing date: 2021-01-15
Publication date: 2022-07-22
Also published as: KR102527406B1

Abstract

본 발명은 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미토콘드리아 내부 표적 도메인 및 미토콘드리아 막 투과 도메인을 포함하는 STAT6 (Signal transducer and activator of transcription 6) 단백질을 유효성분으로 함유하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 STAT6 단백질은 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 부분을 보다 선택적이고 효과적으로 표적함으로써, 관련 질환의 예방, 치료 또는 개선 효과를 증진시킬 수 있다.

Description

미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING MITOCHONDRIAL DYSFUNCTION-RELATED DISEASES}

본 발명은 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 미토콘드리아 외막에 위치하는 STAT6 단백질의 용도에 관한 것이다.

미토콘드리아(mitochondria)는 진핵 생물에서 산소 호흡의 과정이 진행되는 세포 속의 중요한 세포 내 소기관으로, 여러 유기물질에 저장된 에너지를 산화적 인산화 과정을 통해 생명활동에 필요한 아데노신삼인산(ATP)의 형태로 전환시키는 에너지 대사를 하기 때문에 세포의 발전소 역할을 한다. 또한, 시토크롬c와 다른 세포사멸 유도(proapoptosis) 요소의 방출을 조절함으로써 세포사멸을 조절하며, 이 외에도 신호전달, 세포분화, 칼슘의 농도조절, 활성 산소종(ROS) 형성 및 이용 등과 관련된다.

최근 미토콘드리아의 기능 장애, 예를 들어, 해당 과정의 붕괴, 미토콘드리아 효소의 감소, 활성 산소종 증가, 미토콘드리아 수 또는 크기의 변화 등에 의해 발병되는 것으로 알려진 알츠하이머와 같은 신경 퇴행성 질환, 헌팅턴병, 파킨슨병, 당뇨병, 암 및 노화관련 질환 등의 다양한 질병들이 보고되어짐에 따라, 미토콘드리아에 대한 관심과 이에 대한 연구가 증가하고 있다.

이와 관련하여 약물 또는 유전자와 같은 치료 생리활성 물질을 미토콘드리아로 전달하는 방법들이 연구되고 있으며, 보다 선택적이며 효율적으로 미토콘드리아를 타겟함으로써, 관련 질환의 치료 효과를 증진시킬 수 있는 기술의 필요성이 증가하고 있다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0125980호 (2012.11.19. 공개)

본 발명의 목적은 미토콘드리아를 타겟하는 STAT6 단백질을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미토콘드리아 내부 표적 도메인 및 미토콘드리아 막 투과 도메인을 포함하는 STAT6 (Signal transducer and activator of transcription 6) 단백질을 유효성분으로 함유하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 미토콘드리아 내부 표적 도메인 및 미토콘드리아 막 투과 도메인을 포함하는 STAT6 (Signal transducer and activator of transcription 6) 단백질을 유효성분으로 함유하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 STAT6 단백질은 미토콘드리아 내부 표적 도메인 및 미토콘드리아 막 투과 도메인을 포함하고, 상기 도메인들에 의해 STAT6 단백질이 미토콘드리아 외막에 위치할 때, 미토콘드리아의 절편화(fragmentation)를 유도하고 종양 형성을 억제함을 확인한 바, 상기 STAT6 단백질은 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 건강기능식품 조성물로 활용할 수 있다.

상기 STAT6 단백질은 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 부분을 보다 선택적이고 효과적으로 표적함으로써, 관련 질환의 예방, 치료 또는 개선 효과를 증진시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 human STAT6 단백질을 나타낸 것이다.
도 2는 human U373-악성 신경교종(malignant glioma, MG) 세포주에서 도 1의 human STAT6 N-말단 서열의 위치를 관찰한 현미경 이미지이다.
도 3은 mouse B16F10 세포주에서 도 1의 human STAT6 N-말단 서열의 위치를 관찰한 현미경 이미지이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에 따라 미토콘드리아 외막에 자리잡기 위한 STAT6 단백질의 막 투과(transmembrane) 서열을 확인한 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 3에 따라 human STAT6 단백질과 미토콘드리아 타겟팅 서열을 제거한 human STAT6 단백질 (MTS D)을 나타낸 것이다.
도 6은 도 5의 STAT6 단백질들을 293T 세포주에 과발현시켰을 때의 미토콘드리아에 미치는 영향을 관찰한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 4에 따라 STAT6가 종양 형성에 미치는 영향을 확인하기 위해 293T 세포주에서 STAT6 발현이 억제된 안정적 세포주(stable cell line)를 제작하여 이를 웨스턴 블로팅(Western bloting) 실험으로 확인한 것이다.
도 8은 293T Parental 세포와 도 7에 따라 제조된 STAT6 발현이 억제된 세포 (STAT6 KO)를 각각 쥐에 이식한 후, 시간에 따른 종양 부피 변화를 나타낸 그래프이다 (****, P<0.0001; n= 18).
도 9는 도 7의 세포 이식 후, 종양 조직을 적출하여 관찰한 것으로, 상단 도면은 세포 이식 한 달 뒤의 쥐의 모습이고, 하단 도면은 상단 도면의 각 번호가 매겨진 쥐에서 적출한 종양 조직을 촬영한 이미지이다.
도 10은 도 9에 따라 적출한 종양 조직의 무게를 측정한 결과 그래프이다 (**, P< 0.01; n= 18).
도 11은 human STAT6 단백질 (STAT6 WT)과 미토콘드리아 타겟팅 서열이 삭제된 STAT6 단백질 (MTS D)로, 도 7에 따라 제조된 STAT6 KO stable cell line에 이들 STAT6 단백질들을 각각 과발현시켜 stable cell line을 다시 제작하여, 이를 Western bloting 실험으로 확인한 것이다.
도 12는 도 11에 따른 STAT6 KO와 STAT6 WT stable cell line을 쥐에 이식 후, 종양 조직을 적출하여 관찰한 것으로, 상단 도면은 이식 한 달 뒤 종양 적출 직전의 쥐 모습이고, 하단 도면은 적출된 종양을 크기 순서대로 나열한 것이다.
도 13은 도 11에 따른 STAT6 KO와 MTS D stable cell line을 쥐에 이식 후, 종양 조직을 적출하여 관찰한 것으로, 상단 도면은 이식 한 달 뒤 종양 적출 직전의 쥐 모습이고, 하단 도면은 적출된 종양을 크기 순서대로 나열한 것이다.
도 14는 도 11에 따라 제조된 stable cell line 이식 후, 시간에 다른 종양의 부피 변화를 측정한 그래프이다 (****, P<0.0001; STAT6 KO, n=25; STAT6 WT-myc, n=12; MTS D-myc, n=13).
도 15는 도 11에 따라 제조된 stable cell line 이식 후 한 달 뒤, 쥐에서 적출된 종양의 무게를 측정한 그래프이다 (**, P< 0.01; STAT6 KO, n=25; STAT6 WT-myc, n=12; MTS D-myc, n=13).

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 STAT6 (Signal transducer and activator of transcription 6) 단백질, 상세하게는 미토콘드리아 내부 표적 도메인 및 미토콘드리아 막 투과 도메인을 포함하는 STAT6 단백질을 유효성분으로 함유하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, "STAT6 (Signal transducer and activator of transcription 6)" 단백질은 STAT6 유전자에 의해 인코딩된 단백질로, 사이토카인, 호르몬, 성장인자 등 세포내 신호 전달에 관여하는 전사인자 STAT 패밀리 계열에 속한다.

상기 STAT6 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

바람직하게는, 상기 미토콘드리아 내부 표적 도메인은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 human STAT6 내부 서열 중, human STAT6 N-말단 1-30번째 아미노산 서열이 미토콘드리아 타겟팅 효과를 가짐을 확인할 수 있었고, 이를 서열번호 2로 표시하였다.

서열번호 2 : MSLWGLVSKMPPEKVQRLYVDFPQHLRHLL

바람직하게는, 상기 미토콘드리아 막 투과(transmembrane) 도메인은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

상기 미토콘드리아 막 투과 도메인은 상기 미토콘드리아 내부를 표적하는 STAT6 단백질을 미토콘드리아 외막에 위치시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 human STAT6 내부 서열 중, 624-698번째 아미노산 서열이 상기 단백질이 미토콘드리아 외막에 위치하게 하는 막전위 도메인(transmembrane domain) 역할을 함을 확인할 수 있었고, 이를 서열번호 3으로 표시하였다.

서열번호 3 :

AFRSHYKPEQMGKDGRGYVPATIKMTVERDQPLPTPELQMPTMVPSYDLGMAPDSSMSMQLGPDMVPQVYPPHSH

상기의 도메인들에 의해 상기 STAT6 단백질은 미토콘드리아 외막에 위치할 수 있고, 상기 단백질이 미토콘드리아 외막에 축적(accumulation) 될 때, 세포사멸의 시발점이 되는 미토콘드리아의 절편화(fragmentation)를 유도하며, 종양 형성을 억제할 수 있는 바, 상기 STAT6 단백질은 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용할 수 있다.

상기 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환은 허혈성 뇌질환 또는 허혈성 심질환, 뇌졸증, 편두통, 빈혈증, 파킨슨병, 알츠하이머, 근위축성측색경화증(ALS), 미토콘드리아뇌근증, 간경변, 판코니 증후군, 비정형 페닐케톤뇨증, 천식, 당뇨병, 동맥경화, 고혈압, 고콜레스테롤증, 시신경 질환, 비만, 우울증 및 암 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 조성물은 STAT6 단백질의 활성화제 또는 발현촉진제를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 약학 조성물은 상기 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한"이란, 상기 약학 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 의미하고, 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 STAT6 단백질의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3 등을 더 첨가할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.

상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여할 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명은 미토콘드리아 내부 표적 도메인 및 미토콘드리아 막 투과 도메인을 포함하는 STAT6 (Signal transducer and activator of transcription 6) 단백질을 유효성분으로 함유하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 미토콘드리아 막 투과(transmembrane) 도메인은 서열번호 3으로 표시되는 아미노선 서열로 이루어질 수 있으며, 상기 미토콘드리아 내부를 표적하는 STAT6 단백질을 미토콘드리아 외막에 위치시킬 수 있다.

상기의 도메인들에 의해 상기 STAT6 단백질은 미토콘드리아 외막에 위치할 수 있고, 상기 단백질이 미토콘드리아 외막에 축적될 때, 세포사멸의 시발점이 되는 미토콘드리아의 절편화(fragmentation)를 유도하며, 종양 형성을 억제할 수 있는 바, 상기 STAT6 단백질은 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로 활용할 수 있다.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있고, 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 음료 및 각종 드링크, 과실 및 그의 가공식품(과일통조림, 잼 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(햄, 베이컨 등), 빵류 및 면류, 쿠키 및 스낵류, 유제품(버터, 치즈 등) 등이 가능하며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함할 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품학적으로 허용가능한 식품 첨가제 및 적절한 기타 보조 성분을 더 포함하여 제조될 수 있다. 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다. 상기 '식품첨가물공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

상기 기타 보조 성분은 예를 들어, 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환의 예방 또는 개선을 위한 보조제로 섭취될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 미토콘드리아 타겟 STAT6 단백질

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 human STAT6 단백질에 관한 것으로, 상세하게는 human STAT6 단백질 (STAT6 wild type, STAT6 WT)을 구성하는 대략적인 도메인, 624-847번째 아미노산 서열이 삭제된 STAT6 (TAD-deleted STAT6, TAD D), 699-847번째 아미노산 서열이 삭제된 STAT6 (699-847 a.a-deleted STAT6, 699-847 D), 그리고 human STAT6 N-말단 서열(1-50번째 아미노산 서열)을 나타낸 것이다.

* STAT6 단백질의 서열 :

MSLWGLVSKMPPEKVQRLYVDFPQHLRHLLGDWLESQPWEFLVGSDAFCCNLTSALLSDTVQHLQASVGEQGEGSTILQHISTLESIYQRDPLKLVATFRQILQGEKKAVMEQFRHLPMPFHWKQEELKFKTGLRRLQHRVGEIHLLREALQKGAEAGQVSLHSLIETPANGTGPSEALAMLLQETTGELEAAKALVLKRIQIWKRQQQLAGNGAPFEESLAPLQERCESLVDIYSQLQQEVGAAGGELEPKTRASLTGRLDEVLRTLVTSCFLVEKQPPQVLKTQTKFQAGVRFLLGLRFLGAPAKPPLVRADMVTEKQARELSVPQGPGAGAESTGEIINNTVPLENSIPGNCCSALFKNLLLKKIKRCERKGTESVTEEKCAVLFSASFTLGPGKLPIQLQALSLPLVVIVHGNQDNNAKATILWDNAFSEMDRVPFVVAERVPWEKMCETLNLKFMAEVGTNRGLLPEHFLFLAQKIFNDNSLSMEAFQHRSVSWSQFNKEILLGRGFTFWQWFDGVLDLTKRCLRSYWSDRLIIGFISKQYVTSLLLNEPDGTFLLRFSDSEIGGITIAHVIRGQDGSPQIENIQPFSAKDLSIRSLGDRIRDLAQLKNLYPKKPKDEAFRSHYKPEQMGKDGRGYVPATIKMTVERDQPLPTPELQMPTMVPSYDLGMAPDSSMSMQLGPDMVPQVYPPHSHSIPPYQGLSPEESVNVLSAFQEPHLQMPPSLGQMSLPFDQPHPQGLLPCQPQEHAVSSPDPLLCSDVTMVEDSCLSQPVTAFPQGTWIGEDIFPPLLPPTEQDLTKLLLEGQGESGGGSLGAQPLLQPSHYGQSGISMSHMDLRANLSW (서열번호 1)

도 2는 human U373-악성 신경교종(malignant glioma, MG) 세포주에서 도 1의 human STAT6 N-말단 서열의 위치를 관찰한 현미경 이미지로, 도 1의 human STAT6 N-말단 서열 중, 31-50번째 아미노산 서열, 1-30번째 아미노산 서열, 1-20번째 아미노산 서열 뒤에 GFP를 부착한 후, human U373-MG 세포주에 형질주입(transfection) 시켜서 각 아미노산이 서열 세포 내 미토콘드리아에 위치할 수 있는지를 확인한 결과, human STAT6 N-말단 서열 중에서 1-30번째 아미노산 서열이 미토콘드리아에 존재함을 확인할 수 있었다.

* 1-30번째 아미노산 서열 : MSLWGLVSKMPPEKVQRLYVDFPQHLRHLL (서열번호 2)

도 3은 도 2에 따른 실험을 mouse B16F10 흑색종 (melanoma) 세포주에 적용한 것으로, human STAT6 1-30번째 아미노산 서열이 mouse 세포주의 미토콘드리아에서도 존재함을 확인할 수 있었고, human STAT6 1-30번째 아미노산 서열이 인간 외 다른 종(species)의 미토콘드리아에도 위치한다는 사실은 마우스 등을 이용한 동물 실험에도 충분히 사용될 수 있다는 장점을 가진다.

<실시예 2> 미토콘드리아 외막에 자리잡기 위한 STAT6 단백질의 막전위(transmembrane) 서열 확인

도 1에 표기된 세 종류의 STAT6 단백질 (STAT6 WT, TAD D, 699-847 D)이 미토콘드리아 외막에 위치하는 지를 알아보기 위하여, STAT6 단백질들을 각각 발현하는 안정적인 세포주(stable cell line)를 제작하였다.

상기 제작된 세포주에서 미토콘드리아를 추출한 후, NaCl을 처리한 결과, 도 4와 같이, STAT6 WT 및 대표적인 미토콘드리아 외막 단백질인 TOM20, TOM40은 막에 존재하기 때문에 펠렛(Pellet, P)에서 검출이 되고, 대표적인 미토콘드리아 내부에 존재하는 soluble 단백질인 아코니타제 2(Aconitase 2) 및 시토크롬 c(Cytochrome c)는 상층액(Supernatant, S)에서 검출됨을 확인할 수 있다.

그러나 624-847번째 아미노산 서열이 삭제된 STAT6 (TAD-deleted STAT6)는 S에서 검출이 되었고, 699-847번째 아미노산 서열이 삭제된 STAT6 (699-847-deleted STAT6, TAD-deleted STAT6로부터 일부 서열이 회복됨)는 다시 P에서 검출되는 것으로 나타났다. 이는 STAT6의 624-698번째 아미노산 서열이 미토콘드리아 외막에 존재하기 위한 transmembrane 역할을 하는 것으로 사료된다.

* 624-698번째 아미노산 서열 :

AFRSHYKPEQMGKDGRGYVPATIKMTVERDQPLPTPELQMPTMVPSYDLGMAPDSSMSMQLGPDMVPQVYPPHSH (서열번호 3)

<실시예 3> 미토콘드리아 외막에 존재하는 STAT6 단백질의 영향 확인

미토콘드리아 외막에 존재하는 STAT6 단백질의 영향을 확인하기 위하여, 먼저 도 5와 같이, human STAT6 단백질 (STAT6 WT)과 미토콘드리아 타겟팅 서열이 삭제된 STAT6 (MTS D)의 C-말단에 mCherry 형광을 부착시켰다. 미토콘드리아 표지는 미토콘드리아 외막에 존재하는 TOM20 단백질로 염색시켰다.

상기 두 종류의 STAT6 단백질을 각각 293T 세포에 과발현시킨 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, STAT6 WT의 과발현은 미토콘드리아의 절편화(fragmentation)를 유발하지만, 미토콘드리아 타겟팅 서열이 삭제 (MTS D)되면 미토콘드리아에 타겟하지 못할 뿐만 아니라, 미토콘드리아 형태가 원래대로 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 미토콘드리아 외막 단백질로서의 STAT6가 종양 형성에 미치는 영향 확인

미토콘드리아 외막 단백질로서의 STAT6에 의한 미토콘드리아 절편화 효과가 실제로 어떠한 영향을 미칠 수 있는지에 대해 알아보기 위하여, 미토콘드리아 기능이상으로부터 유래하는 다양한 질병 중, 우선 대표적으로 암-종양 형성에 대해 영향을 주는지 확인하였다.

293T 세포주에 CRISPR Cas9을 이용하여 STAT6 발현을 억제시킨 stable cell line (STAT6 KO)을 제조한 후 (도 7), 293T Parental 세포와 STAT6 KO stable cell line을 각각 쥐의 왼쪽다리, 오른쪽 다리에 동시에 이식하여, 종양이 자라는 것을 관찰하였다. 이식 후, 3일에 한 번씩 종양이 자라는 크기를 측정한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, STAT6 발현이 억제된 세포에서 종양 성장이 촉진됨을 확인할 수 있었다 (****, P<0.0001; n= 18).

또한, 상기 세포주 이식 후 1달 뒤, 쥐에서 종양 조직을 적출하여 종양의 크기를 비교하였다. 그 결과, 도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, STAT6 발현이 억제된 세포의 경우, 293T Parental 세포의 경우보다 종양의 크기가 크고 종양의 무게가 많이 증가한 것으로 나타났다. 즉, STAT6 발현 억제는 종양 형성 촉진을 유도함을 확인할 수 있다.

상기 제조된 STAT6 KO stable cell line에 다시 human STAT6 단백질 (STAT6 WT)과 미토콘드리아 타겟팅 서열이 삭제된 STAT6 (MTS D)를 각각 과발현시켜서 도 11과 같이 stable cell line을 제작하였다.

상기 제조된 STAT6 KO stable cell line을 쥐의 왼쪽 다리에 이식하고, human STAT6 단백질 (STAT6 WT)을 다시 과발현시킨 stable cell line을 오른쪽 다리에 이식하여, 1달 동안 종양이 자라는 것을 관찰한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, STAT6 KO 세포를 이식한 경우보다, STAT6 WT를 다시 과발현 시킨 세포를 이식한 경우에서 종양의 크기가 현저히 작아진 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 제조된 STAT6 KO stable cell line을 쥐의 왼쪽 다리에 이식하고, 미토콘드리아 타겟팅 서열이 삭제된 STAT6 (MTS D)를 다시 과발현시킨 stable cell line을 오른쪽 다리에 이식하여, 1달 동안 종양이 자라는 것을 관찰한 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 두 경우 모두 비슷한 크기로 종양이 형성되는 것으로 나타났다.

상기 세 가지 stable cell line을 이식한 후 3일에 한 번씩 종양이 자라는 크기를 측정하고, 1달 뒤에는 쥐에서 종양을 적출하여 무게 측정하여 그래프로 나타내었다.

그 결과, 도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, STAT6 KO와 MTS D의 경우에는 종양 형성이 촉진되었고, STAT6 WT의 경우에는 종양 형성이 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다.

즉, STAT6 발현을 knock out 시킨 후, 다시 STAT6 WT을 과발현시키면 종양 형성이 억제되고, 반대로 STAT6 발현을 knock out 시킨 후, 다시 미토콘드리아 타겟팅 서열이 삭제된 STAT6를 과발현시키면 종양 형성이 다시 촉진되는 바, STAT6의 종양 형성 억제 효과는 미토콘드리아 외막에 존재하는 STAT6 때문임을 확인할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING MITOCHONDRIAL DYSFUNCTION-RELATED DISEASES <130> ADP-2020-0669 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 847 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT6 wild type (STAT6 WT) <400> 1 Met Ser Leu Trp Gly Leu Val Ser Lys Met Pro Pro Glu Lys Val Gln 1 5 10 15 Arg Leu Tyr Val Asp Phe Pro Gln His Leu Arg His Leu Leu Gly Asp 20 25 30 Trp Leu Glu Ser Gln Pro Trp Glu Phe Leu Val Gly Ser Asp Ala Phe 35 40 45 Cys Cys Asn Leu Thr Ser Ala Leu Leu Ser Asp Thr Val Gln His Leu 50 55 60 Gln Ala Ser Val Gly Glu Gln Gly Glu Gly Ser Thr Ile Leu Gln His 65 70 75 80 Ile Ser Thr Leu Glu Ser Ile Tyr Gln Arg Asp Pro Leu Lys Leu Val 85 90 95 Ala Thr Phe Arg Gln Ile Leu Gln Gly Glu Lys Lys Ala Val Met Glu 100 105 110 Gln Phe Arg His Leu Pro Met Pro Phe His Trp Lys Gln Glu Glu Leu 115 120 125 Lys Phe Lys Thr Gly Leu Arg Arg Leu Gln His Arg Val Gly Glu Ile 130 135 140 His Leu Leu Arg Glu Ala Leu Gln Lys Gly Ala Glu Ala Gly Gln Val 145 150 155 160 Ser Leu His Ser Leu Ile Glu Thr Pro Ala Asn Gly Thr Gly Pro Ser 165 170 175 Glu Ala Leu Ala Met Leu Leu Gln Glu Thr Thr Gly Glu Leu Glu Ala 180 185 190 Ala Lys Ala Leu Val Leu Lys Arg Ile Gln Ile Trp Lys Arg Gln Gln 195 200 205 Gln Leu Ala Gly Asn Gly Ala Pro Phe Glu Glu Ser Leu Ala Pro Leu 210 215 220 Gln Glu Arg Cys Glu Ser Leu Val Asp Ile Tyr Ser Gln Leu Gln Gln 225 230 235 240 Glu Val Gly Ala Ala Gly Gly Glu Leu Glu Pro Lys Thr Arg Ala Ser 245 250 255 Leu Thr Gly Arg Leu Asp Glu Val Leu Arg Thr Leu Val Thr Ser Cys 260 265 270 Phe Leu Val Glu Lys Gln Pro Pro Gln Val Leu Lys Thr Gln Thr Lys 275 280 285 Phe Gln Ala Gly Val Arg Phe Leu Leu Gly Leu Arg Phe Leu Gly Ala 290 295 300 Pro Ala Lys Pro Pro Leu Val Arg Ala Asp Met Val Thr Glu Lys Gln 305 310 315 320 Ala Arg Glu Leu Ser Val Pro Gln Gly Pro Gly Ala Gly Ala Glu Ser 325 330 335 Thr Gly Glu Ile Ile Asn Asn Thr Val Pro Leu Glu Asn Ser Ile Pro 340 345 350 Gly Asn Cys Cys Ser Ala Leu Phe Lys Asn Leu Leu Leu Lys Lys Ile 355 360 365 Lys Arg Cys Glu Arg Lys Gly Thr Glu Ser Val Thr Glu Glu Lys Cys 370 375 380 Ala Val Leu Phe Ser Ala Ser Phe Thr Leu Gly Pro Gly Lys Leu Pro 385 390 395 400 Ile Gln Leu Gln Ala Leu Ser Leu Pro Leu Val Val Ile Val His Gly 405 410 415 Asn Gln Asp Asn Asn Ala Lys Ala Thr Ile Leu Trp Asp Asn Ala Phe 420 425 430 Ser Glu Met Asp Arg Val Pro Phe Val Val Ala Glu Arg Val Pro Trp 435 440 445 Glu Lys Met Cys Glu Thr Leu Asn Leu Lys Phe Met Ala Glu Val Gly 450 455 460 Thr Asn Arg Gly Leu Leu Pro Glu His Phe Leu Phe Leu Ala Gln Lys 465 470 475 480 Ile Phe Asn Asp Asn Ser Leu Ser Met Glu Ala Phe Gln His Arg Ser 485 490 495 Val Ser Trp Ser Gln Phe Asn Lys Glu Ile Leu Leu Gly Arg Gly Phe 500 505 510 Thr Phe Trp Gln Trp Phe Asp Gly Val Leu Asp Leu Thr Lys Arg Cys 515 520 525 Leu Arg Ser Tyr Trp Ser Asp Arg Leu Ile Ile Gly Phe Ile Ser Lys 530 535 540 Gln Tyr Val Thr Ser Leu Leu Leu Asn Glu Pro Asp Gly Thr Phe Leu 545 550 555 560 Leu Arg Phe Ser Asp Ser Glu Ile Gly Gly Ile Thr Ile Ala His Val 565 570 575 Ile Arg Gly Gln Asp Gly Ser Pro Gln Ile Glu Asn Ile Gln Pro Phe 580 585 590 Ser Ala Lys Asp Leu Ser Ile Arg Ser Leu Gly Asp Arg Ile Arg Asp 595 600 605 Leu Ala Gln Leu Lys Asn Leu Tyr Pro Lys Lys Pro Lys Asp Glu Ala 610 615 620 Phe Arg Ser His Tyr Lys Pro Glu Gln Met Gly Lys Asp Gly Arg Gly 625 630 635 640 Tyr Val Pro Ala Thr Ile Lys Met Thr Val Glu Arg Asp Gln Pro Leu 645 650 655 Pro Thr Pro Glu Leu Gln Met Pro Thr Met Val Pro Ser Tyr Asp Leu 660 665 670 Gly Met Ala Pro Asp Ser Ser Met Ser Met Gln Leu Gly Pro Asp Met 675 680 685 Val Pro Gln Val Tyr Pro Pro His Ser His Ser Ile Pro Pro Tyr Gln 690 695 700 Gly Leu Ser Pro Glu Glu Ser Val Asn Val Leu Ser Ala Phe Gln Glu 705 710 715 720 Pro His Leu Gln Met Pro Pro Ser Leu Gly Gln Met Ser Leu Pro Phe 725 730 735 Asp Gln Pro His Pro Gln Gly Leu Leu Pro Cys Gln Pro Gln Glu His 740 745 750 Ala Val Ser Ser Pro Asp Pro Leu Leu Cys Ser Asp Val Thr Met Val 755 760 765 Glu Asp Ser Cys Leu Ser Gln Pro Val Thr Ala Phe Pro Gln Gly Thr 770 775 780 Trp Ile Gly Glu Asp Ile Phe Pro Pro Leu Leu Pro Pro Thr Glu Gln 785 790 795 800 Asp Leu Thr Lys Leu Leu Leu Glu Gly Gln Gly Glu Ser Gly Gly Gly 805 810 815 Ser Leu Gly Ala Gln Pro Leu Leu Gln Pro Ser His Tyr Gly Gln Ser 820 825 830 Gly Ile Ser Met Ser His Met Asp Leu Arg Ala Asn Leu Ser Trp 835 840 845 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT6 1-30, mitochondria targeting sequence <400> 2 Met Ser Leu Trp Gly Leu Val Ser Lys Met Pro Pro Glu Lys Val Gln 1 5 10 15 Arg Leu Tyr Val Asp Phe Pro Gln His Leu Arg His Leu Leu 20 25 30 <210> 3 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT6 624-698, transmembrane domain <400> 3 Ala Phe Arg Ser His Tyr Lys Pro Glu Gln Met Gly Lys Asp Gly Arg 1 5 10 15 Gly Tyr Val Pro Ala Thr Ile Lys Met Thr Val Glu Arg Asp Gln Pro 20 25 30 Leu Pro Thr Pro Glu Leu Gln Met Pro Thr Met Val Pro Ser Tyr Asp 35 40 45 Leu Gly Met Ala Pro Asp Ser Ser Met Ser Met Gln Leu Gly Pro Asp 50 55 60 Met Val Pro Gln Val Tyr Pro Pro His Ser His 65 70 75

Claims

미토콘드리아 내부 표적 도메인 및 미토콘드리아 막 투과 도메인을 포함하는 STAT6 (Signal transducer and activator of transcription 6) 단백질을 유효성분으로 함유하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 미토콘드리아 내부 표적 도메인은,
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 미토콘드리아 막 투과 도메인은,
서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 미토콘드리아 막 투과 도메인은,
상기 미토콘드리아 내부를 표적하는 STAT6 단백질을 미토콘드리아 외막에 위치시키는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서
상기 STAT6 단백질은,
미토콘드리아 외막에 축적될 때, 미토콘드리아의 절편화(fragmentation)를 유도하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서
상기 STAT6 단백질은,
미토콘드리아 외막에 축적될 때, 종양 형성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 STAT6 단백질은,
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환은,
허혈성 뇌질환 또는 허혈성 심질환, 뇌졸증, 편두통, 빈혈증, 파킨슨병, 알츠하이머, 근위축성측색경화증(ALS), 미토콘드리아뇌근증, 간경변, 판코니 증후군, 비정형 페닐케톤뇨증, 천식, 당뇨병, 동맥경화, 고혈압, 고콜레스테롤증, 시신경 질환, 비만, 우울증 및 암 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
미토콘드리아 내부 표적 도메인 및 미토콘드리아 막 투과 도메인을 포함하는 STAT6 (Signal transducer and activator of transcription 6) 단백질을 유효성분으로 함유하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 9 항에 있어서,
상기 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환은,
허혈성 뇌질환 또는 허혈성 심질환, 뇌졸증, 편두통, 빈혈증, 파킨슨병, 알츠하이머, 근위축성측색경화증(ALS), 미토콘드리아뇌근증, 간경변, 판코니 증후군, 비정형 페닐케톤뇨증, 천식, 당뇨병, 동맥경화, 고혈압, 고콜레스테롤증, 시신경 질환, 비만, 우울증 및 암 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능 장애 관련 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.