KR102229177B1

KR102229177B1 - 로즈마리 추출물 및 대두 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 감소증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102229177B1
Application number: KR1020190176238A
Authority: KR
Inventors: 김남득; 성보경; 이승호; 최영현
Original assignee: 부산대학교 산학협력단; (주)카인즈 바이오틱스
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2021-03-18

Abstract

본 발명은 천연 추출물을 이용한 근육 감소증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 로즈마리 추출물 및 대두 추출물의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 로즈마리 추출물 및 대두 추출물의 혼합 추출물은 근 위축을 억제하고, 근 분화를 촉진시킴으로써 근육 감소증, 근 위축증 등 근육 감소와 관련된 질환을 효과적으로 예방, 개선, 또는 치료할 수 있다.

Description

로즈마리 추출물 및 대두 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 감소증 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING SARCOPENIA COMPRISING EXTRACT OF ROSEMARY AND SOYBEAN}

본 발명은 로즈마리 추출물 및 대두 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 감소증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

근육 감소증(Sarcopenia)은 노화에 따른 근육량의 감소만을 의미하는 용어로 사용되었으나, 최근에는 질적인 기능 저하, 즉 근력의 저하를 포함한 개념으로 확대되었으며, 이는 보행, 이동 능력 장애 등 각종 신체장애를 야기하는 것으로 알려져 있다. 또한 근육 감소증은 비만, 당뇨, 고혈압과 같은 만성 퇴행성 질환과 같이 2016년 10월 1일부터 질병코드(M62.84)가 부여되었으며, 잠재적으로 사망과도 밀접한 관계가 있는 것으로 알려졌다.

근 위축(Muscle Atrophy)은 노화, 중증 질병, 영양 공급 장애 등으로 인해 오랫동안 움직일 수 없는 상태로 근육을 사용하지 않음으로써 발생하는 근육 조직의 손실 또는 근육 자체의 병 또는 근육을 지배하는 신경의 손상으로 정의할 수 있다. 일반적으로는 근육을 사용하지 않음으로써 심각한 근육 강도 손실이 발생해 점차 근 위축으로 진행하게 되는 경우가 있으며, 근 위축은 대부분의 경우 근력 약화를 동반한다.

이러한 근육 감소, 근 위축과 같은 근육 질환의 근본적인 발병원인이 아직 명확하게 규명되지 않았기에, 현재 이에 따른 치료법에 대해 다양한 연구가 진행 중인 상태이다. 초고령화 사회로 들어가고 있는 우리나라의 고령층이 늘어나는 만큼 이러한 근육 질환들의 치료제 개발이 더욱 주목받고 있고, 이에 근육 감소 또는 근 위축에 효과가 있는 천연물의 발굴은 매우 큰 의미가 있다고 여겨진다.

한국등록특허 제10-0891393호 (2009.04.02. 공고)

본 발명의 목적은 천연물을 이용한 근육 감소와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 천연물을 이용한 근육 감소와 관련된 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명에 따른 근육 감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물은 로즈마리 추출물 및 대두 추출물의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 근육 감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 로즈마리 추출물 및 대두 추출물의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 로즈마리 추출물 및 대두 추출물의 혼합 추출물은 근 위축을 억제하고, 근 분화를 촉진시킴으로써 근육 감소증, 근 위축증 등 근육 감소와 관련된 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로서 활용할 수 있다.

상기 로즈마리 추출물, 대두 추출물과 같은 천연물을 이용함으로써, 부작용이 적고 안전하며, 효과적으로 근육 감소증 등을 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실험예에 따른 로즈마리 추출물에 대한 실험 결과로, 도 1A는 로즈마리 추출물의 세포 독성을 확인한 것이고, 도 1B는 로즈마리 추출물 투여에 의한 근관 직경 변화를 확인한 것이며, 도 1C는 상기 도 1B에 따른 근관 직경 변화를 로즈마리 추출물을 투여하지 않은 대조군의 근관의 직경을 100%로 설정하여 정량화하여 나타낸 것이다. 도 1D는 웨스턴 블로팅 분석 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른 AICAR (5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)의 세포 독성을 확인한 것으로, 도 2A는 현미경을 이용하여 세포의 수를 측정한 결과이고, 도 2B는 MTT 법을 이용하여 AICAR의 세포 독성을 확인한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 AICAR에 의한 근 위축 효과 확인한 것으로, 도 3A는 현미경을 이용하여 근관 두께를 관찰한 것이고, 도 3B는 근관의 직경을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른 AICAR 유도 근 위축에 대한 로즈마리 추출물의 근관세포 보호 효과를 확인한 것으로, 도 4A는 현미경을 이용하여 관찰한 결과이고, 도 4B는 근관의 직경을 측정한 결과이며, 도 4C는 이들의 세포 독성을 확인한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실험예에 따른 로즈마리 추출물의 근 위축 억제 기전을 확인한 것으로, 도 5A는 AMPK와 ACC의 웨스턴 블로팅 분석 결과이고, 도 5B는FoxO3a, MAFbx/atrogin-1, MuRF1, MyoD 및 미오게닌의 웨스턴 블로팅 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실험예에 따른 로즈마리 추출물과 대두 추출물의 병용처리에 의한 근 위축 억제 효과를 확인한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실험예에 따른 로즈마리 추출물과 대두 추출물의 병용처리에 의한 근 위축 억제 기전을 확인한 것으로, 도 7A는 AMPK와 ACC의 웨스턴 블로팅 분석 결과이고, 도 7B는 FoxO3a, MAFbx/atrogin-1, MuRF1, MyoD 및 미오게닌의 웨스턴 블로팅 분석 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자는 로즈마리 추출물과 대두 이소플라본 추출물의 혼합 추출물에서 근 분화 촉진 유도, 근 위축 억제 효과 등의 근육 보호 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서, "예방"이란, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물의 투여에 의해 근육 감소증, 또는 근육 감소와 관련된 질환의 적어도 하나 이상의 증상의 발생을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 재발을 예방하거나 방지하기 위해 상기 질병에 차도가 있는 대상의 치료를 포함한다.

본 명세서에서, "치료"란, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 근육 감소증, 또는 근육 감소와 관련된 질환의 적어도 하나 이상의 증상을 완화, 감소, 또는 소멸시키는 등 그 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서, "개선"이란, 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물의 섭취에 의해 근육 감소증, 또는 근육 감소와 관련된 질환의 적어도 하나 이상의 증상이 완화, 감소, 또는 소멸시키는 등 그 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서, "약학 조성물"이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물로, 본 발명의 목적상 근육 감소증, 또는 근육 감소와 관련된 질환의 적어도 하나 이상의 증상을 예방하거나 또는 치료하기 위해 투여되는 것을 의미한다.

본 명세서에서, "건강기능식품"이란, 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 포함하며, 영양 공급 외에도 본 발명의 목적상 근육 감소증과 같이 근육 감소와 관련된 질환의 예방, 생체 방어, 면역, 회복 등의 생체 조절 기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 높은 식품을 의미한다.

본 발명은 로즈마리 추출물 및 대두 추출물의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 "로즈마리(Rosemary)"는 '바다의 이슬' 이란 뜻의 남유럽이 원산지인 온대성에 자라는 다년생의 허브로, 항산화 성분뿐만 아니라 항균 및 살균 효과가 우수하다.

상기 "대두(Soybean)"는 콩과 식물의 종자로, 단백질(34.4%), 탄수화물(30%), 지질(18.6%) 등과 각종 무기질, 비타민을 함유한다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 로즈마리 추출물은 상기 로즈마리 중량 대비 6 내지 10배 중량, 바람직하게는 8배 중량의 65 내지 85 부피%, 바람직하게는 75 부피% 에탄올 수용액으로 추출된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 대두 추출물은 상기 대두 중량 대비 6 내지 10배 중량, 바람직하게는 8배 중량의 10 내지 30 부피%, 바람직하게는 20 부피% 에탄올 수용액으로 추출된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 대두 이소플라본 분획물일 수 있다.

상기 "이소플라본(isoflavone)"은 대두에 함유된 피토케미컬(phytochemical)로, 여성 호르몬인 에스트로겐과 유사한 기능을 담당하여 '식물성 에스트로겐'이라고도 한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 로즈마리 추출물 또는 대두 추출물의 단일 추출물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 로즈마리 추출물 및 대두 추출물의 혼합 추출물을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 로즈마리 추출물 및 대두 추출물을 1:5의 중량비로 혼합한 혼합 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 중량비로 혼합되었을 때, 가장 우수한 근 위축 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 추출물은 근 위축을 억제하고 근 분화를 촉진시킬 수 있다.

상기 추출물은 AMPK(AMP-activated protein kinase), ACC((acety-CoA carboxylase) 또는 FoxO3a(Forkhead box O3a)의 인산화를 억제하고, 근 위축 관련 인자이자 근 단백질 분해 효소인 MuRF-1 또는 MAFbx/atrogin-1의 발현을 감소시키며, 근 분화 인자인 MyoD 또는 미오게닌(myogenin)의 발현을 증가시킬 수 있다.

상세하게는, 상기 추출물은 근 단백질 분해 신호전달경로와 관련된 AMPK, ACC 또는 FoxO3a의 인산화를 억제하고, 근 단백질 분해 효소인 MuRF-1 또는 MAFbx/atrogin-1의 발현을 감소시킴으로써, 근 단백질 분해를 억제하고 근 단백질 합성을 유도할 수 있다. 또한, 상기 추출물은 근아세포(myoblast)의 분화 마커인 MyoD 또는 미오게닌의 발현을 증가시킴으로써 근 분화를 촉진시킴을 확인할 수 있다.

상기와 같은 효과로, 본 발명에 따른 혼합 추출물은 근육 감소증 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로 사용될 수 있다. 상기 근육 감소증은 노화에 따른 근육 감소증 뿐만 아니라, 근육 감소의 증상을 포함하는 근육 질환, 예를 들어, 근 손실에 따른 근 위축증 등을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 천연 추출물의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D₃ 등을 더 첨가할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.

상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 근육 감소증이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여할 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 피하, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 근육 감소증 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 로즈마리 추출물 및 대두 추출물의 혼합 추출물 유효성분으로 함유하는 근육 감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 혼합 추출물은 상기 로즈마리 추출물과 상기 대두 추출물이 1:5의 중량비로 혼합된 것일 수 있고, 이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 추출물은 근 위축을 억제하고 근 분화를 촉진시킴으로써 근육 감소증 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물로 사용될 수 있다. 상기 근육 감소증은 노화에 따른 근육 감소증 뿐만 아니라, 근육 감소의 증상을 포함하는 근육 질환, 예를 들어, 근 손실에 따른 근 위축증 등을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 근육 감소증 예방 또는 개선 목적으로, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 음료 및 각종 드링크, 과실 및 그의 가공식품(과일통조림, 잼 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(햄, 베이컨 등), 빵류 및 면류, 쿠키 및 스낵류, 유제품(버터, 치즈 등) 등이 가능하며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함할 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품학적으로 허용 가능한 식품 첨가제(식품 첨가물) 및 적절한 기타 보조 성분을 더 포함하여 제조될 수 있다. 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

상기 기타 보조 성분은 예를 들어, 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품에 함유된 상기 추출물의 유효 용량은 근육 감소증 예방 또는 개선 등 그 사용 목적에 따라 적절하게 조절될 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 식품을 원료로 하여 일반 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 근육 감소증 예방 또는 개선을 위한 보조제로 섭취될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<준비예 1> 시약 및 항체

5-아미노이미다졸-4-카르복사미드 리보뉴클레오티드(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide; AICAR)와 β-액틴(β-actin) 단일 클론 항체를 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 로즈마리 추출물(rosemary extract; RE)은 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해시킨 후, 사용 전까지 -20℃에서 저장하였으며, 배양 배지로 희석하여 사용하였다.

3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheny tetrazolium bromide; MTT]는 Amresco (Solon, OH, USA)에서 구입하였으며, MyoD, 미오게닌(myogenin), phospho-AMPK, AMPK, phospho-FoxO3a, FoxO3a, MuRF 및 MAFbx/atrogin-1에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified eagle's medium; DMEM)는 Welgene Inc. (Daegu, Korea) 에서 구입하였으며, 말 혈청(horse serum; HS)은 Gibco (Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였다. 또한, 태아소혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)은 HyClone (Logan, UT, USA)에서 구입하여 사용하였다.

<실시예 1> 로즈마리 추출물 제조

로즈마리 1kg에 시료 중량 대비 8배 중량의 75 부피% 에탄올을 가하고, 70℃에서 12시간 동안 추출하여 추출물을 제조하였다. 수득한 추출물에 대해서는 여과하여 불순물을 제거하고 60℃의 진공 조건하에서 고형분이 50 중량%가 될 때까지 농축한 뒤 이를 다시 분무건조를 통해 0.04kg의 분말을 제조하였다.

<실시예 2> 대두 추출물의 제조

대두(콩) 1kg에 시료 중량 대비 8배 중량의 20 부피% 에탄올을 가하고, 95℃에서 3시간씩 3회 반복 추출하여 추출물을 제조하였다. 수득한 추출물에 시료 중량 대비 6배 중량의 정제수를 가한 후 95℃에서 2시간 살균하고 살균한 대두 추출물을 26℃로 냉각한 후 효모 배양액을 투입하여 36℃에서 3주간 발효하였다. 발효를 마친 대두 발효액은 95℃에서 2시간 멸균하고 원심분리 후 스티렌계 흡착수지로 충진된 칼럼에 충전시키고 정제수를 사용하여 칼럼을 통과시켜 세척하고 다시 10 부피% 에탄올과 60 부피% 에탄올로 각각 동일한 방법으로 칼럼에 통과시켜 이소플라본 비배당체가 함유된 분획물을 얻었다. 수득한 분획물에 대해서는 여과하여 불순물을 제거하고 60℃의 진공 조건하에서 고형분이 50 중량%가 될 때까지 농축한 뒤 이를 다시 분무건조를 통해 0.15kg의 분말을 제조하였다.

<실험예 1> 로즈마리 추출물의 근관 분화 촉진능 확인

1. 세포 생존율 분석

근아세포에 대한 세포 생존능은 MTT assay로 확인하였다. MTT assay는 세포의 증식과 세포의 살아있는 정도를 간접적으로 측정하는 것으로써 대사과정이 온전한 세포의 경우, 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의하여 노란색의 수용서 기질인 MTT 테트라졸륨(tetrazolium)을 청자색을 띠는 비수용성의 MTT 포르마잔(formazan) 결정으로 환원시킨다. 생성된 MTT 포르마잔의 흡광도는 540nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 따라서 각 well에 존재하는 세포 생존 수와 비례한다.

성장배지(growth medium; GM)에서 배양된 C2C12 세포에 DMEM 분화배지(differentiation medium; DM)로 교체 후 배양하여 근 분화를 유도하였다. 분화 중인 C2C12 세포에 다양한 농도의 로즈마리 추출물을 함유한 분화배지를 투여하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 0.5mg/ml MTT 시약이 함유된 배지를 첨가하고 2시간 동안 37℃ 배양기에서 반응시켰다. 그 후 배지를 제거하고 형성된 MTT 포르마잔 결정을 용해시키기 위해 DMSO를 2ml씩 분주하고 5 내지 10분간 반응시켜 마이크로플레이트 리더기로 540mm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.

그 결과, 도 1A와 같이, 로즈마리 추출물은 40μg/ml까지 유의한 세포 독성이 나타나지 않았다.

2. 생쥐 근아세포(C2C12) 배양 및 근관 분화 유도

생쥐 근아세포주인 C2C12 세포를 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 불활성화된 10% 태아소혈청(FBS), 100 U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신이 포함된 DMEM을 성장배지로 이용하여 37℃, 5% CO2 및 95% 공기가 함유된 습한 대기 조건에서 2일에 한 번씩 계대하여 세포주를 유지하였다.

또한, 분화를 위해서는 세포를 6-웰(well) 플레이트에 2.5×10⁵ cell/well로 접종하여 세포 밀도가 90%가 될 때 배지를 제거하고 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 세척 후, 2% 말 혈청(HS)이 첨가된 DMEM을 분화배지로 사용하여 배양하였다. 그 후 이틀에 한 번씩 배지를 교환하였다. 근관 분화를 확인 후, 분화배지에 로즈마리 추출물을 10, 20, 40μg/ml 농도로 첨가하여 근관 분화 촉진효과를 검토하였다.

그 결과, 도 1B 및 도 1C와 같이 현미경 상에서 로즈마리 추출물 투여에 의해 근관의 직경이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다.

3. 웨스턴 블로팅 분석

로즈마리 추출물의 근 분화 촉진능을 평가하기 위해 근 분화 조절 단백질인 MyoD 및 미오게닌(myogenin)의 발현 조절 효과를 확인하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행하였다.

일정량 단백질이 포함된 세포 배양물과 겔 로딩 완충액 (0.125M Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 10% 2-메르캅토에탄올, 0.2% 브롬페놀블루)을 혼합한 후 5분간 끓였다. 각각의 시료(100mg)를 10~15% 소듐 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아마이드 미니-겔에서 1시간 3분간 110V에서 전기영동 시켰다. Towbin 완충액 (25mM Tris-Cl, 192mM 글리신, 20% MeOH)을 이용하여 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인에 전이시키고, 비 특이적 단백결합을 차단하기 위해 멤브레인을 5% 탈지유를 함유하는 세정 완충액 (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% tween-20)에서 1시간 동안 교반시킨 후 세정 완충액으로 1회 세척하고 미오게닌 및 MyoD 1차 항체와 실온에서 각각 5시간 동안 반응시켰다. 그 후 세정 완충액으로 3회 세척하고 호스래디시 퍼옥시데아제(horseradish-peroxidase)가 결합된 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세정 완충액으로 4회 세척한 후 ECL 검출시약을 가하여 생성되는 인광을 이용하여 시그널을 확인하였으며, Pre-stained markers를 이용하여 분자량을 확인하였다.

그 결과, 도 1D와 같이 농도 의존적으로 로즈마리 추출물 투여에 의해 MyoD와 미오게닌의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다.

<실험예 2> AICAR에 의한 근 위축 효과 확인

1. AICAR에 의한 세포생존율 감소 분석

생쥐 근아세포주인 C2C12 세포를 분화배지로 사용하여 6일간 배양하여 분화를 유도하였다. 분화배지는 이틀에 한 번씩 배지를 교환하였다. 분화 6일째, 분화된 근관세포에 AMPK의 활성제인 AICAR를 함유한 분화배지를 처리하였다.

처리 24시간 후 트립신을 이용하여 세포를 플레이트에서 분리하여 원심분리 후, 트리판 블루(trypan blue)로 염색하여 현미경 하에서 살아있는 세포의 수를 계수하여 ml당 세포수로 계산하였다. 또한 상기 실험예 1과 같은 MTT 방법을 이용하여 AICAR의 세포 독성을 확인하였다.

그 결과, 도 2A와 같이 현미경을 통해 AICAR 농도에 따라 세포의 수가 감소함을 확인할 수 있었고, 도 2B와 같이 MTT 방법을 통해서도 AICAR의 세포 독성을 확인할 수 있었다. 1mM 농도까지 유의한 세포 독성이 나타나지 않았다.

2. 분화된 생쥐 근관세포에서의 AICAR에 의한 근 위축 효과 측정

분화 6일째인 근관세포에 AMPK의 활성제인 AICAR를 함유한 분화배지를 처리하였다. 배양 24시간 후, 근 위축 과정 중 나타나는 형태 변화를 확인하기 위하여 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Gottingen, Germany)을 이용하여 200배의 배율로 관찰한 다음 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였으며, 근 위축 유발 정도를 확인하기 위하여 근관의 직경을 측정한 다음 image analysis program을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 3A와 3B에서와 같이 유의한 독성을 보이지 않는 1mM 농도까지의 AICAR 처리 후, 현미경 관찰 결과 농도 의존적으로 근관의 두께가 감소함을 확인할 수 있었다.

<실험예 3> AICAR에 의한 근 위축에 대한 로즈마리 추출물의 근 위축 억제 효과 확인

분화된 근관세포에 10, 20 및 40μg/ml의 로즈마리 추출물 또는 1mM AICAR를 단독 포함하거나, 로즈마리 추출물과 AICAR가 포합된 분화배지를 처리하였다. 배양 24시간 후, 현미경 관찰과 MTT 법을 이용하여 AICAR 유도 근 위축에 대한 로즈마리 추출물의 근관세포 보호 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 4A와 4B에서와 같이 AICAR 단독 처리에 의해 근관의 직경이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 한편, 로즈마리 추출물을 함께 투여한 세포군에서는 AICAR 단독 처리군에 비해 근관의 직경 감소가 로즈마리 추출물 농도 의존적으로 완화됨을 확인할 수 있었다. 또한, AICAR와 로즈마리 추출물 병용 투여시의 세포 생존율을 조사한 결과, 상기 실험조건은 근관세포의 생존율에 영향을 주지 않아 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

<실험예 4> 로즈마리 추출물의 근 위축 억제 기전 확인

분화된 근관세포에 10, 20 및 40μg/ml의 로즈마리 추출물 또는 1mM AICAR를 단독 포함하거나, 로즈마리 추출물과 AICAR가 포합된 분화배지를 24시간 처리 후 세포를 수집하고 단백질을 추출하여 상기 실험예 1에 제시된 방법으로 웨스턴 블로팅 분석을 수행하여 로즈마리 추출물에 의한 근육 단백질 분해 신호전달경로를 확인하였다.

그 결과, 도 5A와 같이 AICAR에 의해 근육 단백질 분해경로를 활성화시키는 AMPK와 그 하위단계에서 작용하는 ACC가 인산화 되는 것을 확인하였으며, 로즈마리 추출물의 투여는 농도 의존적으로 AMPK와 ACC의 인산화를 저해함을 확인할 수 있었다.

또한, 로즈마리 추출물은 도 5B에서와 같이 AICAR에 의해 활성화된 근육 단백질 분해경로 조절 전사인자인 FoxO3a의 인산화와 근육-특이적 유비퀴틴 리가아제(muscle-specific ubiquitin ligases)인 MAFbx/atrogin-1과 MuRF1의 발현 증가를 감소시켰으며, AICAR에 의해 감소된 근 분화 조절인자 MyoD 및 미오게닌의 발현을 회복시키는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 5> 로즈마리 추출물과 대두 추출물의 혼합에 의한 근 위축 억제 효과 확인

로즈마리 추출물과 대두 추출물의 병용처리에 의한 근 위축 억제 효과를 확인하기 위해 로즈마리 추출물과 대두 추출물의 농도는 각각 최소의 근 위축 억제효과를 보이는 10μg/mL과 50μg/mL 농도를 실험에 사용하였으며, 로즈마리 추출물의 농도는 10μg/mL로 고정, 대두 추출물의 농도를 증가시키면서 분화된 근관세포에 처리하여하고 AICAR 처리에 의한 근관 두께의 변화를 상기 실험예 1과 같이 현미경 관찰로 근 위축의 정도를 측정하였다.

그 결과, 도 6에서와 같이 AICAR에 의해 감소한 근관의 두께는 각각 추출물의 단독 처리에 비해 두 추출물 혼합 처리시 우월한 근관 두께 회복 효과가 관찰되었다.

<실험예 6> 로즈마리 추출물의 근 위축 억제능에 대한 대두 추출물 병용 효과의 기전 확인

분화된 근관세포에 로즈마리 추출물 10μg/mL, 대두 추출물은 50μg/mL까지 각각 단독 또는 대두 추출물의 농도를 증가시키면서 처리하고 AICAR 처리를 하여 24시간 동안 배양 후 세포를 수집하여 상기 실험예 1에 제시된 방법으로 웨스턴 블로팅 분석을 수행하여 근육 단백질 분해 신호전달경로에 대한 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 7A와 같이 로즈마리 추출물 10μg/mL과 대두 추출물 50μg/mL 농도의 단독처리는 AICAR로 유도한 AMPK와 ACC의 활성화에 영향을 주지 않았으나, 로즈마리 추출물(10μg/mL)에 대두 추출물 병용처리시 대두 추출물 농도 의존적으로 저해됨을 관찰하였다.

또한, 도 7B와 같이 근 위축에 관여하는 MuRF-1, MAFbx의 발현과 FoxO3a의 인산화에서도 로즈마리 추출물과 대두 추출물의 혼합이 근 위축 관련 인자들의 발현과 활성화를 억제하고, 근육 분화 유전자 MyoD와 myogenin의 발현은 증가시킴을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

로즈마리 추출물 및 대두 이소플라본 분획물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 근육 감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 혼합물은 상기 로즈마리 추출물과 상기 대두 이소플라본 분획물이 1:5의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 근육 감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 혼합물은,
근 위축을 억제하고, 근 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 근육 감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 혼합물은,
AMPK, ACC 또는 FoxO3a의 인산화를 억제하고, 근 위축 관련 인자인 MuRF-1 또는 MAFbx/atrogin-1의 발현을 감소시키며, 근 분화 인자인 MyoD 또는 myogenin의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 근육 감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
로즈마리 추출물 및 대두 이소플라본 분획물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 근육 감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로서,
상기 혼합물은 상기 로즈마리 추출물과 상기 대두 이소플라본 분획물이 1:5의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 근육 감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
삭제