CN102791670A - 基于定向于线粒体的抗氧化剂的药物物质 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制药和药物领域,且特别涉及基于定向于线粒体的化合物的药物物质的生产和应用。本发明公开了定向于线粒体的抗氧化剂的合成、纯化和贮存方法,从而能够生产满足对药物制剂的活性成分-药物物质的要求的形式和质量的所述物质。本发明还公开了具有指定特性的新定向于线粒体的抗氧化剂的制备和筛选方法。
Description
发明领域
本发明涉及制药和药物领域,特别涉及基于定向于线粒体的化合物的药物物质的生产和应用。
发明背景
迄今为止公布的数据清楚地显示一类新的生物活性物质-基于‘斯库拉切夫-离子(Skulachev-ion)’(Green D.E.创造的术语:“Theelectromechanochemical model for energy coupling inmitochondria”,1974,Biochem.Biophys.Acta.,346:27-78)的定向于线粒体的抗氧化剂(MAA)的良好的药物前景(参见SkulachevV.P.(2005),IUBMB Life.,57:305-10;Skulachev V.P.(2007)Biochemistry(Mosc).,72:1385-96;Antonenko Yu.N.等人(2008),Biochemistry(Mosc).,73:1273-87,Skulachev V.P.等人(2009),Biochim Biophys Acta.,1787:437-61,Smith R.A.等人(2008),Ann.N.Y.Acad.Sci.,1147:105-11;另外参见WO2007046729,WO2009005386,US6331532,EP1047701,EP1534720)。
上述举出的来源公开了MAA在实验室条件下-体外或在动物模型中的研究结果。然而,为了将任意的化合物用作活性药物成分(所谓的药物物质),该化合物必须满足一定的要求,即:
1.与相应文件、药典专著中概括的国家管理要求完全一致。主要的要求有:可靠性、杂质含量、重金属含量、含水量、残留有机溶剂含量、无菌性、化合物的定量测定方法、包装、标记和运输方法。
2.管理文件中列举的化合物的特征和药物活性必须保持在规定的贮存期限时间过程中的规定的限度内。
对指向杂质总含量和单一杂质含量应特别注意。特别地,不能被分别鉴定和完全表征的单一杂质不应构成杂质总含量的绝大部分比例(在大部分情况中-超过1%)。
MAA作为药物物质的实际应用的另一个显著困难在于如下事实:在本发明涉及MAA的描述中(参见上文),已经公开了大量请求保护为定向于线粒体的抗氧化剂的化合物。然而,实验结果(例如,参见Antonenko Yu.N.等人(2008),Biochemistry(Mosc).,73:1273-87)包括临床试验显示所公开的定向于线粒体的化合物具有不同的(有时甚至是相反的)生物活性。在这方面,开发设计具有适合于化合物特定应用的充分确定的、预定的特性的生物活性物质的方法仍然具有紧迫性。另外紧迫的是预测基于斯库拉切夫-离子的MAA的特性和生物活性(首先-临床活性)。
定义
药物物质-为作为药物制剂成分并且满足药典要求的应用制备的物质。
斯库拉切夫-离子-能够通过线粒体膜透入的亲脂性阳离子和阴离子。
定向于线粒体的抗氧化剂(MAA)-可以靶向地蓄积入线粒体并且具有抗氧化活性的化合物。
本发明的描述
本发明的方面如下:
I.本发明致力于生产基于定向于线粒体的抗氧化剂(MAA)的药物物质、最佳地相当于相关临床任务的特定MAA的设计和筛选。特别地,本发明涉及MAA化合物,其包含通过连接基与亲脂性阳离子(‘斯库拉切夫-离子’)连接的抗氧化剂。这些MAA可以描述为如下所示的式(I):
式(I):如下结构的化合物
其中A是效应物部分;L-连接基,n-1至20的整数;B-将化合物靶向递送入线粒体的靶向基团;
其中A可以是式(II)的抗氧化剂
和/或其还原形式
其中m-1至3的整数;Y-选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;或两个邻位的Y彼此连接,使得它们形成结构(III):
和/或其还原形式
其中R1和R2是选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;
L-连接基,包含:
a)任选包含一个或多个双键或三键、或醚键、或酯键、或C-S、或S-S、或肽键的直链或支链烃链;且其任选被一个或多个优选选自烷基、烷氧基、卤素、酮基、氨基的取代基取代;
b)或天然异戊二烯链;
B-靶向基团,包含:
a)斯库拉切夫-离子Sk:
Sk+Z-
其中Sk-亲脂性阳离子;
Z-药学可接受的阴离子;
b)或能够以其阳离子形式透入线粒体的两亲性两性离子。
c)此外,作为B的成分的Sk+还可以是亲脂性金属-有机化合物,特别是优选具有如下结构的亲脂性金属卟啉:
其通过命名为R1、R2、R3或R4的部分包括在式(I)化合物的组成上;其余取代基R1、R2、R3或R4可以根据化合物的所需特性筛选,特别是为了增加或降低分子的疏水性;Me+表示优选选自Mn、Fe、Co、Cu、Mg或Zn的金属离子。
属于式(I)的MAA的生物活性化合物的实例如下方案中所示。
SkQ1(质体醌基-癸基-三苯基磷鎓(PDTP)溴化物)
在一些情况中,在本发明的一个实施方案中,适合的是使用式(I)的化合物,其中促氧化剂用作效应物部分A,特别是描述为如下结构的去甲氧基泛醌或紫罗兰醇:
式(I)的相应化合物将是定向于线粒体的促氧化剂。
II.筛选方法和手段
本发明的另一个方面在于特定的定向于线粒体的化合物的设计和/或筛选方法。
II.a新的线粒体抗氧化剂的设计方法
所述化合物的化学、物理化学和生物学特性研究能够提出一项设计属于化合物(I)类型的化合物的新方法。使用所提出的模型能够设计具有预定特性的新的定向于线粒体的抗氧化剂的结构。
一般描述所提出的本发明化合物设计模型的化合物的设计方案如下方案中所示:
新的定向于线粒体的抗氧化剂的设计模型方案
其中:
P1-负责化合物稳定性和生物活性的位置。如果该碳原子不带有取代基,则这种物质作为抗氧化剂的效力是最大的,但相对不稳定。抗氧化效力10倍于MitoQ的SkQ1是一个实例,然而,MitoQ上P1位上存在甲基使得它比SkQ1更稳定。连接基‘Link’的组成也可以影响物质的稳定性。例如,可以通过引入酯键、肽键、硫基或‘连接基(Link)’的其他反应基团改变物质的稳定性。
P2和P3位负责调节与线粒体呼吸链的相互作用。如果这些碳原子之一不带有取代基,则这种物质不能被线粒体呼吸链还原,这是因为化合物被转化成促氧化剂。如果在该位置上的取代基之一或两者不能使得呼吸链还原和/或氧化相应的化合物,则可以实现相同的效应。
相同位置P2和P3上的取代基可以影响化合物的促氧化与抗氧化特性之比。在P2和P3位上存在氧可以导致与抗氧化剂还原或部分还原(醌醇或半醌)形式的醌醇的OH基的氢原子形成内部氢键。这种氢键可以阻碍与自由基和活性氧物质反应中的OH基的氧化,而这种氧化与其中在P2和P3位上不存在氧(例如存在甲基)的化合物相比显著地降低了抗氧化特性。这可以解释SkQ1和MitoQ中这些特性之间的差异。
P4-负责生物活性物质透入能力的位置。透入线粒体的能力依赖于化合物的电荷和疏水性。例如,有关人造膜的实验显示在P4位上具有三苯基磷鎓的化合物比在该位置上存在更多疏水性阳离子-罗丹明G部分的物质的透入能力低。
‘连接基(Link)’-也能够显著影响化合物特性的结构单元。连接基‘Link’的长度和组成可以影响化合物的透入能力(图2)。减小连接基的长度和增加其亲水性将降低该化合物的透入能力。此外,改变连接基‘Link’的组成可以改变该化合物的稳定性-将酯键、肽键、其他稳定性低于C-C键的键引入连接基可以使得该化合物易于受到细胞酶例如酯酶、肽酶的破坏。此外,改变这种单元的长度可以改变双层膜内分子(抗氧化剂部分)的疏水部分的位置,而它是决定化合物与线粒体呼吸链的相互作用可能性的重要因素。
因此,本发明的一个方面涉及生成具有预定的生物活性的定向于线粒体的化合物的结构(设计)的方法。将生物活性定义为对生物系统及其模型(即人造的不含细胞的系统、亚细胞部分和细胞器、细胞、组织和器官区域或整个生物体)的影响,其包含抗氧化效应、促氧化效应、对线粒体的解偶联效应、生物膜特性的改变、在不同水平上通过不同信使的调效应(调节基因表达、调节蛋白质活性、调节生物体的激素分布等)。
II.b使用组合库设计化合物的方法
本发明的另一个方面涉及定向于线粒体的化合物的组合库和来自该库中的富有希望的化合物的研究和筛选方法。所述库是一组式(I)的化合物,实际上它们能够靶向地蓄积入线粒体。可以合成该库的化合物,包括基于一般的部分,其为与具有‘活化的’残基的连接基(连接基部分)连接的亲脂性阳离子,所述的残基例如是卤素,通过它可以连接化合物的可变部分。换句话说,可以通过使非定向的低分子量化合物与所述库的亲脂性阳离子连接得到定向于线粒体的化合物库。
II.c本发明的另一个方面在于测试所述库的化合物的生物活性的方法(包括如果该方法是自动的或半自动的),以便筛选具有期望活性的化合物。该方法包括下列步骤:
1)能够从所述库中筛选一组候选物的试验;
2)基于筛选的物质及其修饰(如果有的话)构建组合子库;
3)测试子库以筛选具有最显著期望的生物活性的化合物;
4)重复步骤1-3,直到试验化合物的所有可能的变量或直到得到期望的生物活性为止。
应注意,可以显著地降低人造物结果的概率的在步骤1和3时测试生物活性的几种方法的组合是最有效的。可以由生物化学、生物物理学、生物能学、微生物学、分子生物学、细胞生物学领域或其他基于有关使用本发明说明书中列举的组合库和方法的工作方法的公众可得到的文献数据的现代生物学领域的合格专家改变特定的试验方法(参见试验方法、结果解释方法、实验例部分)。在适合的部分中给出的实验例是‘在各试管’中测试定向于线粒体的化合物活性的方法并且易于适合于通过使用标准方法的高产量方法测试组合库。
III.测试方法
本发明的另一个方面在于一组用于测试式(I)的新的定向于线粒体的化合物的生物活性的试验方法。可以分别和作为组合库的组成部分研究测试化合物。所述的试验方法组包含下列方法:
1)体外测试式(I)的化合物的氧化还原特性和稳定性;
2)测试定向于线粒体的化合物在人造黑膜上的穿透能力;
3)使用包含短杆菌肽通道的人造模型膜测试定向于线粒体的化合物对膜蛋白质的防护或损伤效应;
4)测试定向于线粒体的化合物对分离的线粒体的抗氧化或促氧化效应;
5)测试定向于线粒体的化合物在动物、植物、细菌或酵母细胞培养物中的抗氧化或促氧化作用;
6)测试定向于线粒体的化合物在细胞培养物中的抗细胞凋亡或抗坏死或促细胞凋亡或促坏死活性;
7)测试定向于线粒体的化合物在细胞中的蓄积;
8)测试定向于线粒体的化合物的比活性,将所述比活性定义为活化或抑制某些代谢途径的能力,其依次可以显示如下:某些基因在转录水平上的活化、mRNA稳定性或翻译、蛋白质水平的修饰,包含磷酸化或去磷酸化、蛋白酶解、糖基化、羰基化和改变蛋白质或蛋白质复合物活性的其他方式;活化或抑制代谢途径还可以显示为细胞其他生理参数的改变,例如:呼吸频率的改变、某些代谢物产生速率的改变、某些底物消耗速率的改变、外膜、线粒体膜或其他细胞器膜上膜电位的改变、一种或多种所述膜的离子导电率的改变、某些离子浓度的改变包括细胞质或其他细胞区室中pH的改变、生物分子、囊泡和细胞器的胞内运输的改变、细胞周期过程中的改变、导致细胞分裂、细胞转化、细胞死亡或可逆地至其存活的改变;
9)测试式(I)的化合物在动物或植物的体内生物活性,所述测试不适合于最初测试组合库的步骤且仅可以适合于有限数量的化合物研究。
因此,本发明的方面在于适合于研究式(I)的新化合物的特性的所述各试验,包括预测所述化合物的前途。将所述前途定义为所述化合物在药物、生物技术、化妆品技术中的实际应用的前途。
IV.结果的解释方法
本发明的另一个方面在于在测试式(I)的化合物的过程中得到的结果的解释方法,以预测候选化合物在药物、生物技术、化妆品技术中的实际应用的前途和为了筛选最富有希望的化合物。
所述方法的主要要素在于比较测试候选化合物的结果与实验例中列举的测试化合物SkQ1的结果。因此,有关SkQ1的数据可以被视为起点、固定点、用于预测式(I)的其他化合物的有效性的标准,因为SkQ1是具有相当有效性的生物活性化合物并且可以应用于药物、生物技术、化妆品技术(参见专利申请PCT/RU2006/000394、PCT/RU2006/000546、PCT/RU2006/000547和其他涉及SkQ1的公开文献)。
化合物SkQR1、MitoQ、MitoVitE、DMMQ可以用作比较活性的其他标准。使用线粒体呼吸链还原的测试化合物的可能性是优选的,优选使用呼吸链的酶和辅酶,且在测试化合物中抗氧化特性的控制力明显超过促氧化特性。
因此,化合物MitoVitE和DMMQ是一类‘负’固定点,并且在筛选最富有希望的化合物-抗氧化剂时,应消除具有类似生物活性的化合物(从对线粒体的测试水平开始)。化合物MitoQ也是‘负’固定点。
在基于其特性试验筛选新化合物时,应筛选那些在其活性方面相对于MitoQ更接近于SkQ1的化合物。首先,将活性定义为在低和超低浓度下显示抗氧化特性的能力。具有增加剂量的定向于线粒体的抗氧化剂对不同的生物体具有强的促氧化作用(参见实验例,还参见Doughan A.K.,Dikalov S.I.(2007),Antioxid.Redox Signal.9:1825-36)。在较低剂量下,这些化合物显示抗氧化特性。
因此,化合物-定向于线粒体的物质的最重要特征是所谓的‘应用窗’,即已经显示抗氧化特性的物质的最低浓度(剂量)与显示促氧化特性的物质的最低浓度(剂量)之间的差异。显而易见,超过后者的浓度(剂量)在该物质的实际应用中是极为不期望的并且可能显著地限制这种应用的可能性。评价不同水平的‘应用窗’的方法在实验例部分中给出。一对化合物SkQ1-MitoQ可以用作评价测试化合物前途的良好固定点,因为SkQ1具有足够的‘应用窗’,而MitoQ没有。
测试化合物的结果的解释方法如下所示。将该方法分成几个阶段:
1)基于体外测试物质特性的结果(试验方法部分的试验1、2、3),可以评估测试化合物的抗氧化和促氧化特性;这能够预测其在使用抗氧化剂或促氧化剂的领域的适用性;体外试验还能够确定候选化合物通过生物膜透入的能力且由此预测化合物的生物利用度、其克服生物体中不同屏障(例如血-脑屏障)的能力及其稳定性;
2)属于本发明方面的试验结果的解释实例在实验例部分中给出,基于所述实例和相应的解释,生物化学、生物物理学、生物能学、微生物学、分子生物学、细胞生物学领域或其他现代生物学领域的合格专家可以正确地评价测试候选化合物的结果并且筛选在所需实际应用中最富有希望和最适合的化合物。
为了证实本发明的可行性和所提出的模型的正确性,合成了新的定向于线粒体的抗氧化剂SkQ3、SkQ4、SkQ5和SkQB1。
V.其前途由本发明预测的化合物的实例:
SkQ3:
预测说明:化合物必须更稳定,而且具有比SkQ1低显著性的抗氧化特性。该化合物可以用于植物生物技术、真菌学和微生物学。
SkQ4:
说明:较低的(与SkQ1相比)通过生物膜透入的能力。因此,制剂的生物利用度和副作用严重性必定降低。
SkQ5:
说明:‘斯库拉切夫-离子’与抗氧化剂之间的连接基的长度下降降低了化合物的疏水性并且可以影响化合物通过膜的透入率。
一系列SkQB化合物-与SkQ1相比具有增强的透入能力。所述系列包含所有的化合物,其中天然化合物,例如小檗碱用作‘斯库拉切夫-离子’。SkQB系列的化合物(例如SkQB1,其通式如下所示)具有增强的透入能力且由此从制药观点来看更富有希望,它们具有更大的克服血-脑屏障和血-眼屏障的能力。此外,SkQB系列的化合物应该具有较低的副作用,因为小檗碱(和巴马亭)是植物来源的天然化合物。
SkQB1A
SkQB1B
一般而言,基于小檗碱的SkQB可以表示为下式:
SkQB:
其中m-0至3的整数(优选-2,即式的左侧是质体醌部分),‘L’-具有1-50个单元长度的连接基,包含:
1)任选包含一个或多个双键或三键、或醚键、或酯键、或C-S、或S-S、或肽键的直链或支链烃链;且其任选被一个或多个优选选自烷基、烷氧基、卤素、酮基、氨基的取代基取代;
2)天然异戊二烯链。
优选‘L’是癸烷部分。化合物通式的右侧是通过其组成原子之一与连接基‘L’连接的小檗碱部分。连接可以通过C-C、C-O、C-N、C-S键(包括酯键、肽键、二硫键)进行。包括,连接可以通过替代小檗碱的甲氧基之一经醚键进行。
在SkQB系列的化合物中,巴马亭可以替代小檗碱。
另外优选的基于小檗碱和巴马亭的化合物是下列化合物:
SkQB1:
SkQP1:
SkQB5:
SkQP5:
所述化合物的合成方法和化学特性和生物活性的描述如实验例部分中所示。
VI.基于定向于线粒体的抗氧化剂的药物物质。
本发明的一个方面在于能够在医学实践中使用基于MAA的药物物质的管理文件的参数,特别是包含下列指标:
1.特别通过下列方式确定的可靠性:
a.在指定波长范围的分光光度法和与MAA样品的分光光度测定研究结果的比较;
b.IR光谱法。通过Frustrated全内反射方法采集的物质的红外光谱的吸收带必须在带的位置和强度上与包括的光谱的吸收带具有一致性;
c.与溴化物反应。氯仿层应变成黄色。
2.通过HPLC方法测定的杂质含量。每种单一杂质的含量不超过1.5%。总杂质含量不超过4.0%。
3.重金属含量(不超过0.001%)。
4.残留有机溶剂含量(例如乙醇、甲醇和氯仿这样的溶剂)。
5.无菌性。
6.物质的定量。
7.包装、标记和贮存。
8.建立的有效期。
实际上,已知的包含醌的定向于线粒体的化合物,包括物质SkQ1、SkQR1、MitoQ等(参见上文)主要是一种氧化(醌)形式。在正常条件下,该氧化形式可以部分被还原成醌醇形式(参见图12)。因此,当使用MAA作为药物物质时,其含量可以达到5-8%及以上的主要杂质是的MAA还原形式。这种形式的分离和详细研究因其高化学不稳定性和发生复杂的氧化还原转变的趋向而是一项困难的任务。
另一方面,通过用于色谱纯化的标准方法生产不含还原(醌醇)形式的醌形式的药物物质MAA因这些化合物的相似性而是困难的。
在所述系列MAA制剂的纯化方法中遇到的第二个问题在于需要保持特征性的抗衡离子,例如溴离子。用于离子交换或高效液相色谱法(HPLC)的常用条件就所述不稳定化合物而言过于粗糙并且无法保证对起始结构上的抗衡离子提供保护。
因此,用于分离和纯化MAA系列制剂的现存方法和技术无法提供用于这种类型药物物质的必要纯度参数。
在本发明中,所述问题可以通过下列方法解决:
方法1.非标准的HPLC在不含盐的无缓冲流动相系统中和最终阶段时的应用-制备物的高浓缩溶液的凝胶过滤。
方法2.试剂形式的MAA的还原形式的‘分子阱’在非极性溶剂中的的应用,它在醌-醌醇平衡中作为氧化的有效诱导物或醌形式的竞争性取代基发挥作用。
因此,本发明的另一个方面在于适合于药物物质的形式的MAA的生产方法并且包含方法1和/或方法2。
VII.本发明的另一个方面在于基于醌类的MAA的改进的合成方法。这种改进的方法能够以工业化方式使用较为低廉和更易于得到的成分生产(合成)MAA,特别是就合成质体醌基-癸基-三苯基磷鎓(PDTP)溴化物和质体醌的前途衍生物而言,2,3-二甲基苯酚而非二甲基氢醌可以用作起始试剂。
合成包含下列步骤:
1.使用琼斯试剂将2,3-二甲基苯酚(1)氧化成2,3-二甲基-1,4-苯醌(2)。
2.通过形成(10-羧基-癸基)三苯基膦溴化物(4)连接11-溴-十一酸(3)与三苯基膦。
3.通过使产生的化合物(4)与2,3-二甲基-1,4-苯醌(2)在硝酸银和过硫酸铵的存在下反应形成期望的化合物(5)。
一般合成方案如图13中所示。更详细而言,合成描述在实验例8中。
附图简述
图1.式(I)的化合物被氧(A)或通过黄嘌呤氧化酶与黄嘌呤反应形成的超氧化物(B)氧化的能力。
图2.结构(I)的化合物通过双层膜并且形成膜电位的能力比较。为了比较,理想地透入的单阳离子的估计值(根据能斯特方程式)由黑线表示。
图3.使用包含短杆菌肽通道的人造模型膜测试定向于线粒体的化合物对膜蛋白的防护或损伤效应。通过酞菁光敏剂(A)或FeSO4、抗坏血酸盐和叔丁基过氧化氢的混合物(B)的光活化刺激对短杆菌肽通道的损伤。
图4.使用TPP+电极测定的SkQ1和SkQ5在线粒体中蓄积。
图5.线粒体依赖于呼吸链成分活性的还原或氧化SkQ1的能力。
图6.SkQ1在硫酸亚铁与抗坏血酸钾的混合物导致的氧化性应激条件下保护线粒体。
图7.SkQ1和MitoQ防止细胞发生H2O2(300μM)诱导的死亡。将细胞与SkQ1或MitoQ一起温育7天、然后接种用于实验。
图8.HeLa细胞与SkQR1的短期预温育(2小时)降低了H2O2(300μM)诱导的氧化性应激水平。估计(B)基于具有低水平氧化性应激的细胞数量的细胞荧光光度术数据(A)。基于7次实验进行估计。关于位于低DCF-DA荧光区域中的示意图上的一组对照细胞(50%群体)估计数据,将该组细胞定为100%且相对于该组估计每种作用的指标。
图9.用SkQ1(20nM)将细胞处理7天防止了HeLa细胞发生H2O2(300μM)诱导的氧化性应激。
图10.在过氧化氢(100μM)和百草枯(100μM)的存在下大肠杆菌MG1655 pLUX::PsoxS的发光感应。
图11.过氧化氢(500μM)和百草枯(100μM)在SkQ1(10μM)的存在下诱导soxS启动子。
图12.定向于线粒体的抗氧化剂的醌和醌醇形式的平衡。连接亲脂离子(‘斯库拉切夫-离子’)的R-连接基。
图13.定向于线粒体的抗氧化剂PDTP的改进合成方法的方案。
实验例
下面是预以示例将本发明应用于开发新的定向于线粒体的化合物的可能性的实验例。实验(试验)结果也是用于由使用本发明研究新的定向于线粒体的化合物的领域的专家评价所开发的新化合物(或选自组合库)的起点。在这方面,实验例称作‘试验’,因为它们是用于测试新化合物的方法。
实验例1.式(I)的化合物的氧化还原特性和稳定性的体外测试
筛选相当于结构(I)的化合物的第一步在于测试其氧化还原特性。即在该步骤时,可以选择具有预定的促氧化或抗氧化特性的物质。选择具有潜在抗氧化特性的化合物的最便利的方式在于测试其被氧或在黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应中形成的超氧化物氧化的能力。通过分析使用双束Pye Unicam SP 1100光谱仪(England)记录的所述化合物在240-310nm范围内的绝对吸收光谱研究SkQ1和MitoQ还原形式随时间推移的稳定性。在开发的方法中,使用四氢硼酸钠在包含20mMMOPS-KOH,pH=7.6的介质中还原醌衍生物。参比比色池既不含SkQ1,也不含MitoQ,将还原剂加入到两个比色池中,在释放氢后进行测定。根据通过称量法得到的峰面积大小评价醌类的还原程度,测定在267nm的最大吸收的绝对值用于比较。数据显示,当接触氧时,SkQ1的还原(醌醇)形式比MitoQ更耐受大气氧的氧化(图1A)。因此,SkQ1较不易于自发地与氧发生相互作用和形成可能指示它对细胞的毒性较低的基团。另一方面,当化合物未被氧氧化、但被黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应中形成的超氧化物氧化时,SkQ1的氧化比MitoQ的氧化更有效(图1B)。这可以表示SkQ1作为抗氧化剂更有效,且其还原(活性)形式比MitoQ更耐受大气氧的自发性氧化并且对超氧化物自由基具有较高的亲和力。
实验例2.定向于线粒体的化合物对人造黑膜的透入能力测试
为了测试结构(I)的定向于线粒体的化合物的透入能力,提出了使用基于离子通过沿浓度梯度运动的双层磷脂膜透入的能力的方法。双层膜分离了充满水溶液的两个室并且将测试物质加入到室之一中。如果带电荷的物质可以渗透通过双层膜,则其快速扩散出具有高浓度物质的室而到达具有低浓度物质的室,且由此生成膜电位差。就携带一种电荷且能够易于通过膜透入的离子而言,10-倍浓度梯度能够生成60mV电位(根据能斯特方程式)。
所述方法用于有关离子通过膜脂质双层的能力的各种研究并且在Starkov AA,Bloch DA,Chernyak BV,Dedukhova VI,Mansurova SA,Symonyan RA,Vygodina TV,Skulachev VP,1997,Biochem.BiophysActa,1318,159-172的论文中详细描述。使用所述方法,测试了几种结构(I)的物质,例如SkQ1、SkQ 3、SkQR1和MitoQ。证实SkQ3和SkQR1在5×10-6-5×10-4M(对于SkQ 3)和5×10-6-5×10-5M(对于SkQR1)的浓度范围完全符合能斯特方程式。在高于5×10-5M的浓度下,SkQR1停止符合能斯特方程式,这可能是因其在高浓度时损伤膜的能力所致。SkQ1和MitoQ梯度开始根据能斯特方程式以高浓度(5×10-5-5×10-4M)生成电位。因此,基于该数据,可以推断SkQ1和MitoQ具有低于SkQ3或SkQR1的透入能力。这种相对简便的方法在提出的结构(I)的定向于线粒体的化合物的初步筛选阶段是理想的,因为它能够快速筛选具有最高透入能力(即可能具有更高的生物利用度)的化合物。
还分析了化合物SkQB1和SkQBP1的透入能力。结果显示所述化合物的高透入能力(其能力不低于SkQ1)。
实验例3.使用包含短杆菌肽通道的人造模型膜测试定向于线粒体的化合物对膜蛋白的防护或损伤效应
在我们的实验室中,开发了能够研究化合物在由双层膜、导电蛋白质短杆菌肽和光敏剂组成的简单系统(Mito Tracker Red,三倍的磺化酞菁铝或酞菁锌)中的抗氧化活性的方法。该方法在于光敏剂分子光活化生成的活性氧损害短杆菌肽通道、导致双层膜导电能力急剧下降的能力。除光敏剂外,对短杆菌肽通道的损害可以通过启动芬顿反应(Fenton reaction)诱导,导致形成例如羟基自由基这样的高活性氧(芬顿反应由FeSO4、抗坏血酸盐和叔丁基过氧化氢的混合物启动)。使用所述方法,测试化合物SkQ1、SkQ3和MitoQ。图3A显示短闪光对酞菁的光活化因双层膜中的短杆菌肽通道受损而导致膜电导的显著下降。膜电导的下降有效地被叠氮化钠(俘获单态氧的高度有效系统)和超氧化物歧化酶(其催化超氧化物转化成相对低活性的过氧化氢)阻断。叠氮化钠和超氧化物歧化酶都不能完全防止双层膜的电导下降。这一事实显示酞菁的光活化与单态氧和超氧化物的生成相关。在这种模型中,SkQ1是最有效的,因为SkQ1是防止各种活性氧的广谱抗氧化剂。在另一种模型中,其中由FeSO4、抗坏血酸盐和叔丁基过氧化氢的混合物促进损害短杆菌肽通道,SkQ1也是最有效的,而MitoQ和SkQ3显示是较低有效性的抗氧化剂(图3B)。
用于测试合成化合物的抗氧化能力的方法是高度有效的,并且不仅能够评价化合物的抗氧化活性,而且能够测定化合物对具体活性氧的特异性。作为所述方法的参比物,正确的是将SkQ1用作最有效的化合物,其显示对宽范围活性氧的抗氧化活性。
实验例4.定向于线粒体的化合物地对分离的线粒体的抗氧化或促氧化作用测试
存在许多研究目的在于线粒体的方法。我们已经选择了最有益的方法,它们以高度的确定性测定了式(I)的定向于线粒体的化合物的潜在生物活性。
i)式(I)的化合物在线粒体中的蓄积能力的测试
使用四苯基磷鎓-选择性电极测试式(I)的化合物在线粒体中的蓄积能力。所述方法仅可以用于式(I)的化合物,其中亲脂性阳离子四苯基磷鎓用作靶向基团。使用这种电极,可以测定四苯基磷鎓阳离子(或包含该阳离子的化合物)在线粒体基质与介质之间的分布。图4显示SkQ1在15-20min内蓄积在线粒体中。氧化磷酸化解偶联剂FCCP导致的线粒体膜电位下降导致相对少量的SkQ1从线粒体中释放。由于SkQ1是亲脂性阳离子(SkQ1的辛醇/水分布比是20000/1),所以大量SkQ1蓄积在线粒体膜中,不依赖于线粒体的增能程度。如果亲脂性较低的SkQ5用于替代SkQ1,则不依赖于能量的蓄积水平显著降低。所述方法能够研究式(I)的化合物在线粒体中的蓄积效力、其蓄积速率对线粒体功能态的依赖性和预测测试化合物的潜在生物利用度。
ii)式(I)的化合物被线粒体呼吸链还原的能力的测定
本发明提出的定向于线粒体的抗氧化剂的关键优势在于其被线粒体呼吸链还原的能力。为了研究式(I)的化合物被线粒体呼吸链还原,测定在大鼠肝线粒体的分离介质中在呼吸底物的存在下化合物的氧化与还原形式之间比例改变的速率。测定在线粒体的存在下进行。实验显示SkQ1可以被线粒体呼吸链还原。不同底物在氧化中的应用显示SkQ1可以被复合物I(线粒体被谷氨酸盐和苹果酸盐供能)和复合物II(用于氧化的底物是琥珀酸盐)还原(图5A)。为了消除内源性底物的影响,使用复合物I抑制剂鱼藤酮和复合物II抑制剂丙二酸盐。丙二酸盐在鱼藤酮的存在下抑制复合物II刺激可能是复合物III导致的SkQ1氧化。粘液噻唑抑制复合物III由此防止了该氧化,其证实复合物III氧化SkQ1的能力(图5B)。复合物III氧化SkQ1远比其被复合物I和复合物II还原更为缓慢(图5B)。这些数据显示在供能的线粒体中,SkQ1大部分是还原态(醌醌形式),其中它显示抗氧化特性。
因此,所述方法能够研究式(I)的化合物被线粒体呼吸链还原的能力,此外,基于该数据可以预测测试化合物的促氧化或抗氧化特性。
iii)式(I)的化合物在FeSO4和抗坏血酸盐混合物诱导的线粒体氧化性应激条件下的抗氧化活性的测试
最广泛应用的测定线粒体、细胞培养物或组织中的氧化性应激的方法之一是用于定量测定丙二醛的方法。在这些情况中的氧化性应激可以通过各种方式由叔丁基过氧化氢、过氧化氢枯烯、过氧化氢、黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶、硫酸亚铁和抗坏血酸钾混合物等诱导。为了启动实验中的氧化性应激,使用硫酸亚铁和抗坏血酸钾混合物。已知在线粒体代谢中,形成一定量的H2O2,其在生理条件下因被不同的抗氧化剂系统快速利用而并不危险。将硫酸亚铁与抗坏血酸钾的组合添加到包含线粒体的介质中导致亚铁离子与H2O2反应(芬顿反应),形成高度反应性的羟基自由基(Fe2++H2O2→Fe3++·OH+-OH)。由此羟基自由基与在膜中的不饱和脂肪酸反应并且刺激其自由基氧化,最终导致丙二醛蓄积。这种模型充分适合于研究不同抗氧化剂(包括式(I)的化合物)的有效性。图6显示SkQ1的抗氧化活性测试结果。正如可以观察到的,SkQ1的最高抗氧化活性已经在20-50nM浓度下显示。将粘液噻唑(复合物III抑制剂)添加到线粒体混悬液中防止了SkQ1被显著改善SkQ1抗氧化能力的复合物III氧化。结果证实SkQ1的抗氧化能力,此外,显示待被线粒体呼吸链还原的抗氧化剂的能力的意义。
因此,具有高度精确性的丙二醛定量测定方法能够预测测试化合物的促氧化或抗氧化特性和测试其有效浓度。
实验例5.定向于线粒体的化合物在动物、植物、细菌或酵母细胞培养物中的抗氧化或促氧化作用测试
由于给出了测试化合物在细胞培养物中的生物活性的大量方法,所以这部分将仅描述那些最适合于初步测试式(I)的化合物的方法,因为它们具有简易性和有益性。
a.定向于线粒体的化合物在动物细胞培养物中的作用测试
将人子宫癌细胞系HeLa和来源于肺和皮肤的正常人二倍体成纤维细胞选作用于测试式(I)的化合物的抗氧化能力的模型。使用细胞荧光光度术和荧光显微镜检查测试化合物的抗氧化能力。在对每一细胞培养物进行的预实验中,选择导致不具有可见的坏死征兆的显著的(60-80%)细胞凋亡的最佳H2O2浓度。为了测定在凋亡细胞中出现的染色质凝聚和碎片化,使用荧光染料烟酸己可碱(Hoechst)。在温育30分钟结束时将1μg/ml浓度的该染料加入到活的或固定的细胞中。为了确定坏死,将2μg/ml浓度的荧光染料碘化丙啶(PI)加入到未固定细胞中。通过分别计数具有碎片化核的细胞和可透过碘化丙啶的细胞的数量测定凋亡和坏死细胞的百分比。
在使用透入定向于线粒体的抗氧化剂的实验中,需要了解根据化合物透入能力的不同,其蓄积在来自细胞培养物的线粒体中所必须的时间可能不同。
特别地,我们证实,如果将细胞与它们一起温育5-7天,则SkQ1和MitoQ仅增加细胞对H2O2的抗性。导致线粒体膜电位下降的氧化磷酸化解偶联剂FCCP阻止了SkQ1和MitoQ的保护效应。这是一种重要的控制,其显示测试化合物实际上是定向于线粒体的。为定向于线粒体的抗氧化剂的SkQ1和MitoQ在极低浓度时发挥作用。特别地,SkQ1甚至在0.2nM浓度下也发挥其保护效应(图7)。图7显示SkQ1以远比MitoQ更有效的方式防止细胞发生死亡,即SkQ1是更有效的抗氧化剂。类似于任意的抗氧化剂,SkQ1和MitoQ具有有限的浓度,高于这些浓度,则它们显示促氧化活性,特别是在高于0.5μM的SkQ1和MitoQ浓度下,它们显示促氧化活性,导致刺激H2O2诱导的细胞死亡。
为了测定H2O2刺激的氧化性应激水平,用荧光染料DCF-DA(2′,7′-二氯-二氢荧光素二乙酸酯)染色细胞,然后用细胞荧光光度仪测定染料的荧光水平。使用这种方法,证实将细胞与SkQ1或MitoQ一起温育1-5小时不会防止细胞中H2O2-诱导的氧化性应激。同时,具有较高透入能力的SkQR1(疏水阳离子-罗丹明G部分用作替代四苯基磷鎓的靶向基团)已经在指定时间窗内和低于SkQ1的浓度下具有抗氧化活性(图8A,B)。SkQ1(图9)和MitoQ(未显示)仅在与细胞一起温育5-7天后显示其抗氧化特性。得到的时间依赖性与SkQR1、SkQ1和MitoQ的透入能力充分相关(这些阳离子的透入能力可以描述为如下顺序:SkQR1>SkQ1>MitoQ)。
因此,所述方法能够测定式(I)的化合物防止细胞发生氧化性应激导致的死亡的能力。此外,所述方法可以有助于预测治疗剂量和基于式(I)的化合物的制剂的定时给药。
b.定向于线粒体的化合物在大肠杆菌细胞中的作用测试
为了测试式(I)的定向于线粒体的化合物的促氧化和抗氧化特性,开发了用于测定在大肠杆菌细胞中的氧化性应激的方法。为了这一目的,创造了基于编码细菌萤光素酶的luxAB基因的生物传感器系统以研究透入离子对细菌细胞中氧化性应激的效应。萤光素酶目前广泛应用于对分子遗传学(报道基因)、生化测定(例如测定痕量的ATP)、遗传工程工作(筛选)、生物技术和生态学(生物传感器)等的研究。高灵敏性、使用发光计或闪烁计数器检测光信号的便利性、几个数量级内的萤光素酶量与生物发光强度之间的直接正比性、体外和体内测定的可能性(不损伤细胞)和其他有益性支持了萤光素酶基因在不同遗传和生化试验中的应用。在所开发的方法中,使用编码来自陆生细菌发光杆菌(Photorhabdus luminescens)的萤光素酶的基因[1]。革兰氏阴性菌发光杆菌是昆虫病原线虫的共生生物。来自发光杆菌的萤光素酶的特征在于有利于应用lux基因作为报道基因的高热稳定性(它在最高达45℃的温度下仍然保持活性)。
为了测试在水、土壤、食品、空气等中的化学污染物(毒物),lux-生物传感器目前以两种变化形式应用:
1)基于毒物导致的生物发光猝灭;
2)基于毒物导致的生物发光强度诱导(增加)。
涉及第一种变化形式的方法包括对细胞代谢、主要是对呼吸链应用毒性物质抑制作用机制,它可以间接影响萤光素酶反应,导致细胞混悬液的生物发光强度降低。
涉及第二种变化形式的方法基于毒物诱导的细胞生物发光强度诱导(增加)。这些方法包括应用细菌在进化过程中发出的并且对环境中存在的特定化学物质特异性起响应的特异性调节元件的各种选择。上述举出组的生物传感器提供了特异性和高度选择性,因为它们基于受体蛋白(阻抑物或激活物)与化学化合物的相互作用。在细菌中,可以区分与对如下成分起作用的毒物特异性反应的调节系统:1)细胞膜;2)蛋白质;3)染色体(DNA);和4)诱导细胞中的氧化性应激。此外,细菌具有与重金属和砷离子发生特异性反应的调节系统。grpE:PgrpE启动子可以用作对细胞蛋白起作用的毒物(例如苯酚衍生物、醇类)的生物传感器。所述启动子位于热休克基因的细菌基因组上游并且仅在修饰的、变性的蛋白质出现在细胞中时被活化。PrecA SOS启动子用作DNA-向性剂(丝裂霉素C、甲磺酸甲酯、二噁英类和紫外线和电离辐射)的生物传感器。LexA蛋白质是阻抑物。PrecA启动子仅在诱导损伤基因组(即损伤DNA分子)时被活化。为了检测诱导细胞中氧化性应激的物质(在细胞中形成羟基自由基(OH·)、超氧化物离子-基团(O2 -)、过氧化氢(H2O2)),使用PkatG和PsoxS启动子。PkatG启动子(激活物OxyR)与过氧化氢、有机过氧化氢等发生特异性反应。当超氧化物离子-基团出现在环境中时,PsoxS启动子被活化。基于所述的可诱导的启动子,开发了lux-生物传感器。
用于所开发的方法的具有相应调节区的所有启动子通过使用特异性合成的引物的PCR方法获自大肠埃希氏杆菌K12 MG1655细菌的基因组。具有pBR322复制子和负责抗氨苄西林的bla基因(选择标记)的非-启动子载体用作载体。在EcoRI-BamHI位点将启动子区包埋入质粒。将由5种基因luxCDABE组成的发光杆菌的lux操纵子选作lux弹夹。
测试全部生物传感器与式(I)的定向于线粒体的抗氧化剂一起起作用的适合性。
结果是式(I)的定向于线粒体的抗氧化剂、特别是SkQ1和MitoQ最有可能具有对无论任何情况下都与氧化性应激相关的生物传感器的高度特异性,因为其结构包含醌衍生物且它们以高效力蓄积在带电荷的膜内。因此,pLUX::PkatG和pLUX::PsoxS生物传感器的应用显然是最佳的。当使用pLUX::PrecA生物传感器时,氧化性应激中的DNA损伤固定和透入离子对该过程的效应是可能的。pLUX::PgrpE和pLUX::Plac生物传感器显然会用作阳性对照和阴性对照。
在测试的第一阶段,选择用于氧化性应激的条件,此时出现最大的发光诱导。图10显示H2O2和百草枯诱导生物传感器的生物发光的能力。大肠杆菌MG1655pLUX::PkatG在H2O2的存在下的发光诱导在15分钟内变得明显并且达到最大值1小时(图10A)。对照组细胞与诱导细胞之间的发光强度之比在最佳H2O2浓度下为1/80。大肠杆菌MG1655pLUX::PsoxS在百草枯的存在下的发光诱导在15-20分钟内变得明显并且达到最大值2小时(图10B)。对照组细胞与诱导细胞之间的发光强度之比在最佳H2O2浓度下为1/100。
在下一个阶段,变成可以测试式(I)的化合物的促氧化或抗氧化能力。借助于pLUX::PkatG和pLUX::PsoxS生物传感器,测试在大肠杆菌中的氧化性应激的条件下SkQ的抗氧化特性。证实10μM SkQ有效地防止细胞受到过氧化氢诱导的氧化性应激产生的超氧阴离子基团影响,其中所述SkQ浓度对百草枯诱导的氧化性应激无可感觉到的效应(图11)。这种偏差可能是因过氧化氢和百草枯生成活性氧的不同方式所致。由于使用了过氧化氢,所以氧化性应激被诱导了短时间(H2O2被细胞中抗氧化剂防御酶有效地分解),而使用百草枯时,氧化性应激持续长得多的时间。此外,证实在大肠杆菌细胞中,向细胞外部输出正阳离子的多药抗药性(MDR)系统有效地起作用。这些酶的活性显著地降低了SkQ1及其类似物的效力。因此,由于使用了H2O2,所以SkQ1具有防止细胞发生氧化性应激的时间,然后被MDR蛋白输出到细胞外部,而在使用百草枯时,SkQ1不再有效。
结果显示所开发的测试方法是可靠的和快速的测试式(I)的化合物的促氧化或抗氧化能力的工具。
实验例6.式(I)的化合物在动物和植物中的体内生物活性测试
在动物或植物体内对式(I)的化合物的测试仅可以应用于那些已经通过所有试验的预先部分并且具有显著的潜在生物活性的化合物。这是由于如下事实:为了准备体内实验,必需要拥有有关药物作用的潜在靶标的完整信息,而该信息是开发应由研究人员为得到最有益结果所使用的模型所必需的。就体内实验的预先选择阶段而言,必须使用能够评价药物具有生物活性的重要可能性的最简单方法。为了这一目的,小的无脊椎动物例如甲壳类动物Ceriodaphnia affinis可以用作模型对象。这种对象,特别是浮游动物生物体用作评估环境污染、研究材料提取物、食品、药物制剂的生物效应的通用测试目标。在巨大数量的应用中,使用短期实验进行评估,这些实验考虑到了测试目标的存活、行为和对某些生理功能的违背。为了鉴定长期模式中弱影响的效应,除所述参数外,例如生长和繁殖这样的各整体参数也在控制下。
在长期模式中化学试剂对测试目标的量化效应中,称作毒性效应的阶段特征的现象(即潜在毒物导致的生物功能活性的抑制和刺激或结构单元的发育的改变)显现。因此,许多潜在毒物在确定浓度时对某些功能和测试目标的整体具有短暂的刺激效应。因此,制剂的有利效应的重要标准是生物体的全部寿命,因为在这种情况下,可以排除处于制剂实际上是毒性的有利期的风险。
使用特别对制剂刺激效应的关注研究制剂SkQ1在不同浓度下对甲壳类动物Ceriodaphnia affinis在其透入生命期限中的基本生命功能的效应。
在第一系列实验(每一系列中的动物数量为20个体)中,在乙醇(0.79mg/l)的存在下甲壳类动物存活率没有不同于对照组(图4)。在5.5和0.55nM SkQ1浓度下,甲壳类动物的存活率高于对照组,而在55nM浓度下,存活率较低。在0.55和5.5nM SkQ1浓度下,甲壳类动物的固定群体中的死亡时间在整个观察期限过程中增加,而50%中的死亡时间分别超过对照组参数2和1.4倍(表1)。
表1.SkQ1导致的Ceriodaphnia affini死亡的固定时间(天)
浓度 | LT25% | LT50% | LT75% |
对照组 | 16 | 18 | 29 |
乙醇,0.79mg/l | 14 | 18 | 25 |
SkQ1,0.55nM | 22 | 36 | 45 |
SkQ1,5.5nM | 18 | 26 | 46 |
SkQ1,55nM | 9 | 12 | 17 |
在0.55和5.5nM SkQ1浓度下,甲壳类动物的平均寿命高于对照组,在55nM SkQ1浓度下,甲壳类动物的平均寿命较低,这些差异具有统计学显著(表2)。
表2.SkQ1导致的Ceriodaphnia affinis的平均寿命
浓度 | M±m | td | %对照组 |
对照组 | 20.2±4.99 | ||
乙醇,0.79mg/l | 19.55±5.26 | 0.18 | 96.78 |
SkQ1,0.55nM | 33.55±6.21 | 3.28* | 166.09 |
SkQ1,5.5nM | 31.25±8.11 | 2.27* | 154.7 |
SkQ1,55nM | 12.85±2.79 | 2.52* | 63.61 |
*-差异具有统计学显著性。
因此,结果显示SkQ1对小的无脊椎动物生命活动的有益效果,导致其寿命增加的能力。此外,选择对生物体具有有益效果的化合物的浓度,其可以用于实验以测试式(I)的测试制剂在高级动物中的生物活性。
实验例7.使用‘分子阱’的定向于线粒体的抗氧化剂的纯化方法
1.使用乙醇-氯仿(1:9)系统的硅胶预处理后的起始技术产物PDTP(5g)具有约85%的纯度。还原形式的含量为8%。
为了除去碱性杂质,使用HPLC法。C18柱,500×45mm。流动相-不含盐的无缓冲的水-乙醇溶液。梯度模式。系统A-15%乙醇,系统B-40%乙醇。
在采集中心级分后,制剂的纯度约为92%。还原形式的含量为6%。
起始和纯化产物与溴化物的对比定性反应显示色谱纯化后溴离子保留。
在0.05%三氟乙酸的65%乙腈水溶液的系统中的C18柱250×4.6mm的分析型HPLC还显示起始和纯化产物的近似相同的溴离子峰强度(在色谱图开始时)。
2.通过HPLC纯化(3.8g)、溶剂蒸发和高真空干燥后,产物具有浓稠、澄清油状物形式,颜色为深棕色。为了使制剂的还原形式的含量最小化,使用‘分子阱’的方法的变化形式。
向烧瓶的油状物中倾入200ml己烷,然后加入5ml丙酮,将该混合物用磁搅拌器剧烈搅拌30min。然后谨慎倾析出溶剂层。制备溶剂和残留油状物的倾析部分的色谱对照品。溶剂的HPLC色谱图包含小的丙酮峰,且仅包含还原形式的强度峰;主要的氧化形式不存在。
期望产物的色谱图清楚地显示还原形式的含量下降。
为了进一步将还原形式的含量最小化,可能需要重复该操作几次。
能够以自动化形式实施该方法,其中连续进料新鲜部分的溶剂并且处置使用的溶液。
重要的是要注意使用所述的方法不会损耗碱性物质。保护了溴离子。
产物纯度约为97%。还原形式的含量不超过1.0%。
2.使用乙醇溶液的凝胶色谱法
这种纯化方法适合于作为制剂浓溶液按剂量装瓶、干燥和进入贮存前的最终阶段。
将约3.7g制剂溶于5-6ml乙醇,进行使用绝对乙醇(光谱光度测量级)预平衡的Sephadex LH-20的600×10mm柱的色谱。
加热,弃去尾级分。主要级分的纯度至少为98%。还原形式的含量为0.8-0.9%。制剂的浓度可以达到150-200mg/ml。该溶液对制备等分部分和干燥最终形式的物质而言是便利的。
实验例8.质体醌基-癸基-三苯基磷鎓(PDTP)溴化物的合成
合成包含下列步骤:
1)用琼斯试剂将2,3-二甲基苯酚(1)氧化成2,3-二甲基-1,4-苯醌(2)。
2)通过形成(10-羧基-癸基)三苯基膦溴化物(4)连接11-溴-十一酸(3)与三苯基膦。
3)通过产生的化合物(4)与2,3-二甲基-1,4-苯醌(2)在硝酸银和过硫酸铵的存在下反应形成期望的化合物(5)。
合成方案如图2中所示。
2,3-二甲基-1,4-苯醌(2)的合成
在搅拌下将琼斯试剂(110g(0.37mol)Na2Cr2O7×2H2O在157ml水和70ml浓硫酸混合物中的溶液)加入到20g(0.16mol)2,3二甲基苯酚在230ml乙醚中的溶液中,将该混合物搅拌24小时。用乙醚萃取该混合物,洗涤合并的乙醚萃取物,然后用煅烧的硫酸镁干燥,用旋转蒸发器除去溶剂后,对残余物进行使用氯仿的硅胶快速色谱。黄色结晶物质形式的化合物2的收率为8.7g(40%)。
TCX:Rf(CHCl3)=0.46;HPLC:τ=17.4min(0-90%B持续26.4min;A:10mM H3PO4,B:AcCN),m.p.58℃(56.5-57.5℃)1;UV(CH3OH):λmax 209nm,256nm,344nm;ESI MS:m/z的计算值C8H8O2 136.15;测定值136.2。
(10-羧基-癸基)三苯基膦溴化物(4)的合成
将588mg(2.24mmol)三苯基膦加入到530mg(2mmol)11-溴-十一酸中,在85℃将该混合物保持在密封的试管中12小时。然后将该混合物进行使用氯仿-甲醇(9:1)系统的硅胶柱分离。澄清油状物形式的化合物4的收率为895mg(85%)。
TCX:Rf 0.52(氯仿-甲醇,4:1);HPLC:τ=7.28min(5-95%B持续11.5min;A:0.1%TFA;B:0.1%TFA的乙腈溶液);UV光谱(0.1%TFA-乙腈,38:62):λmax200nm,224nm,268nm;ESI MS:C29H36OP的计算值:447.6;测定值m/z 448.2(MH+;100%)。
[10-(4,5-二甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯-1-基)癸基]-三苯基磷鎓溴化物,PDTP溴化物(5)的合成
在80-90℃下,将228mg(1mmol)过硫酸铵在5ml水中的溶液加入到135mg(1mmol)2、526mg(1mmol)4和85mg(0.5mmol)硝酸银在40ml乙腈和水(1:1)的混合物中的溶液中。将该混合物在搅拌下在相同温度下加热12小时。用水稀释该混合物,用二氯甲烷萃取。蒸发二氯甲烷至小体积后,用乙醚沉淀产物。从沉淀中倾析溶液,再沉淀沉淀物几次。结束时,用使用二氯甲烷-乙醇(9:1的比率)混合物的硅胶柱纯化沉淀。[10-(4,5-二甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯-1-基)癸基]-三苯基磷鎓溴化物(PDTP溴化物)的收率为35%。
TCX:Rf(CHCl3-CH3OH,4:1)=0.66;HPLC:τ=10.1min(5-95%B持续12min;A:0.05%TFA,B:0.05%TFA的AcCN溶液);UV(CH3OH):λmax 198nm,226nm,260nm(ε260=18652cm-1*M-1),352nm;ESI MS:m/z的计算值C36H42O2 537.69;测定值537.3。
实验例9.定向于线粒体的化合物-富有希望的定向于线粒体的抗氧化剂的合成
小檗碱和巴马亭SkQ衍生物的结构:
9,10-二甲氧基-13-[7-(4,5-二甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯-1-基)庚氧羰基-甲基]-5,6-二氢苯并[g]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯[5,6-a]喹啉鎓溴化物,1(13-[7-(4,5-二甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯-1-基)庚氧羰基-甲基]小檗碱溴化物)的合成方案
基于小檗碱硫酸氢盐(5)生产化合物1,用硼氢化钠的吡啶溶液在室温下还原小檗碱硫酸氢盐(5)30min,从水中结晶后,产生具有91%收率的化合物6。用溴乙酸甲酯使化合物6烷基化(1小时,100℃),然后用硼氢化钠还原中间体化合物(30min,室温),得到化合物7,将化合物7通过用乙醚从水溶液中萃取来分离(80%收率)并用1%硼氢化锂的水-甲醇溶液经沸腾1.5小时皂化,得到化合物8。从水中结晶后,化合物8的收率显示为61%。将化合物8转化成铯盐,将其与预先合成的2,3-二甲基-1,4-苯醌9的衍生物在60℃缩合48小时。用N-溴琥珀酰亚胺(NBS)的二氯甲烷溶液氧化化合物10 1小时,接着通过用水洗涤有机相及干燥除去过量的NBS,蒸发该混合物,用乙醚沉淀最终化合物1。通过HPLC(C18)、用包含0.05%TFA的乙腈在0.05%TFA水溶液中的溶液梯度30-80%的梯度纯化化合物1。在最后的两步后,总收率显示为50%。
类似地生产化合物2-4。
所生产的化合物的特征。
13-[7-(4,5-二甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯-1-基)庚氧羰基-甲基]小檗碱:TCX:Rf(氯仿-甲醇,65:10)=0.16;Rf(氯仿-甲醇,4:1)=0.39。HPLC:τ=8.98min(5-95%B持续11min;A:0.05%TFA,B:0.05%TFA的MeCN溶液;Luna C18(2)′0.46×15cm,5μm,1ml/min)。UV(乙醇):λmax 262nm,350nm(ε350=23850cm-1*M-1),430nm(ε430=5278cm-1*M-1)。ESIMS:m/z C37H40NO8的计算值626.72;测定值626.69。
13-[7-(4,5-二甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯-1-基)庚氧羰基-甲基]巴马亭:TCX:Rf(氯仿-甲醇,65:10)=0.16;Rf(氯仿-甲醇,4:1)=0.39。UV(乙醇):λmax 262nm,350nm,430nm。ESIMS:m/z C38H44NO8的计算值642.76;测定值642.29。
13-[4-(4,5-二甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯-1-基)丁氧羰基-甲基]小檗碱:TCX:Rf(氯仿-甲醇,65:10)=0.23;Rf(氯仿-甲醇,4:1)=0.39。HPLC:τ=7.71min(5-95%B持续11min;A:0.05%TFA,B:0.05%TFA的MeCN溶液;Luna C18(2)′0.46×15cm,5μm,1ml/min)。UV(乙醇):λmax 262nm,350nm,430nm。ESI MS:m/z C34H34NO8的计算值584.64;测定值584.22。
13-[4-(4,5-二甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯-1-基)丁氧羰基-甲基]巴马亭:TCX:Rf(氯仿-甲醇,65:10)=0.23;Rf(氯仿-甲醇,4:1)=0.39。HPLC:τ=7.73min(5-95%B持续11min;A:0.05%TFA,B:0.05%TFA的MeCN溶液;Luna C18(2)′0.46×15cm,5μm,1ml/min)。UV(乙醇):λmax 262nm,350nm,430nm。ESI MS:m/z C35H38NO8的计算值600.68;测定值600.87。
Claims (16)
1.式(I)的定向于线粒体的化合物、抗氧化剂或促氧化剂的筛选方法
其中A是效应物部分;L-连接基,n-1至20的整数;B-将所述化合物靶向递送入线粒体的靶向基团,且其中
A可以是式(II)的抗氧化剂
和/或其还原形式
其中m-1至3的整数;Y-选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;或两个邻位的Y彼此连接,使得它们形成结构(III):
和/或其还原形式
其中R1和R2是选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;
L-连接基,包含:
a)任选包含一个或多个双键或三键、或醚键、或酯键、或C-S、或S-S、或肽键的直链或支链烃链;且其任选被一个或多个优选选自烷基、烷氧基、卤素、酮基、氨基的取代基取代;
b)或天然异戊二烯链;
B-靶向基团,包含:
a)斯库拉切夫-离子Sk:
Sk+Z-
其中Sk-亲脂性阳离子;
Z-药学可接受的阴离子;
b)或能够以其阳离子形式透入线粒体的两亲性两性离子;
作为B的成分的Sk+还可以是亲脂性金属-有机化合物,特别是优选具有如下结构的亲脂性金属卟啉:
其通过命名为R1、R2、R3或R4的部分包括在式(I)化合物的组成上;其余取代基R1、R2、R3或R4可以根据化合物的所需特性筛选,例如为了增加或降低分子的疏水性;Me+表示优选选自Mn、Fe、Co、Cu、Mg或Zn的金属离子,
该方法包括下列步骤:
a)基于定向于线粒体的抗氧化剂的初步预测特性设计化合物的结构;
b)合成相当于所述结构式的化合物或分离和纯化相当于所述结构式的化合物,条件是它或其密切类似物实际存在;
c)使用一组包含一种和/或多种选自如下的试验的试验测试化合物的生物活性:
i)体外测试式(I)的化合物的氧化还原特性和稳定性;
ii)测试定向于线粒体的化合物在人造黑膜上的穿透能力;
iii)在不含细胞的模型系统中测试定向于线粒体的化合物对膜脂质和蛋白质的防护或损伤效应;
iv)测试定向于线粒体的化合物对分离的线粒体的抗氧化或促氧化效应;
v)测试定向于线粒体的化合物在动物、植物、细菌或真菌细胞培养物中的抗氧化或促氧化作用;
vi)测试定向于线粒体的化合物在细胞培养物中的抗细胞凋亡或抗坏死或促细胞凋亡或促坏死或抗氧化或促氧化作用;
vii)测试定向于线粒体的化合物在细胞中的蓄积;
viii)测试定向于线粒体的化合物活化或抑制期望的代谢途径的能力,该能力显示如下:转录水平上的基因活化、mRNA稳定性或翻译、蛋白质水平的修饰,特别包含磷酸化或去磷酸化、蛋白酶解、糖基化、羰基化和蛋白质或蛋白质复合物活性的其他改变;活化或抑制代谢途径还可以显示为细胞的其他生理参数的改变,包括呼吸频率的改变、代谢物产生速率的改变、底物消耗速率的改变、外膜、线粒体膜或其他细胞器膜上膜电位的改变、一种或多种所述膜的离子导电率的改变、离子浓度的改变包括细胞质或其他细胞区室中pH的改变、生物分子、囊泡和细胞器的胞内运输的改变、细胞周期过程中的改变、导致细胞分裂、细胞转化、细胞死亡或可逆地至细胞存活的改变;
ix)测试式(I)的化合物在动物或植物的体内生物活性,包括测试化合物在疾病模型中的生物活性;
d)解释测试化合物的结果和筛选大部分相当于所需参数的最富有希望的化合物;
e)筛选期望的定向于线粒体的抗氧化剂或促氧化剂。
2.一种以上相当于式(I)的定向于线粒体的化合物的集合的组合库:
其中A是效应物部分;L-连接基,n-1至20的整数;B-将化合物靶向递送入线粒体的靶向基团,且其中
A可以是式(II)的抗氧化剂
和/或其还原形式
其中m-1至3的整数;Y-选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;或两个邻位的Y彼此连接,使得它们形成结构(III):
和/或其还原形式
其中R1和R2是选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;
L-连接基,包含:
a)任选包含一个或多个双键或三键、或醚键、或酯键、或C-S、或S-S、或肽键的直链或支链烃链;且其任选被一个或多个优选选自烷基、烷氧基、卤素、酮基、氨基的取代基取代;
b)或天然异戊二烯链;
B-靶向基团,包含:
a)斯库拉切夫-离子Sk:
Sk+Z-
其中Sk-亲脂性阳离子;
Z-药学可接受的阴离子;
b)或能够以其阳离子形式透入线粒体的两亲性两性离子;
作为B的成分的Sk+还可以是亲脂性金属-有机化合物,特别是优选具有如下结构的亲脂性金属卟啉:
其通过命名为R1、R2、R3或R4的部分包括在式(I)化合物的组成上;其余取代基R1、R2、R3或R4可以根据化合物的所需特性筛选,例如为了增加或降低分子的疏水性;Me+表示优选选自Mn、Fe、Co、Cu、Mg或Zn的金属离子。
3.权利要求1的方法,用于分析权利要求2中所述的化合物的组合库。
4.使用权利要求1或3中所述的方法筛选或设计的定向于线粒体的抗氧化剂,具有促氧化与抗氧化特性之间的指定比例,并且描述为式(I)
和/或其还原形式
其中m-1至3的整数;Y-选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;或两个邻位的Y彼此连接,使得它们形成结构(III):
和/或其还原形式
其中R1和R2是选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;
L-连接基,包含:
a)任选包含一个或多个双键或三键、或醚键、或酯键、或C-S、或S-S、或肽键的直链或支链烃链;且其任选被一个或多个优选选自烷基、烷氧基、卤素、酮基、氨基的取代基取代;
b)或天然异戊二烯链;
B-靶向基团,包含:
a)斯库拉切夫-离子Sk:
Sk+Z-
其中Sk-亲脂性阳离子;
Z-药学可接受的阴离子;
b)或能够以其阳离子形式透入线粒体的两亲性两性离子;
作为B的成分的Sk+还可以是亲脂性金属-有机化合物,特别是优选具有如下结构的亲脂性金属卟啉:
其通过命名为R1、R2、R3或R4的部分包括在式(I)化合物的组成上;其余取代基R1、R2、R3或R4可以根据化合物的所需特性筛选,例如,特别是为了增加或降低分子的疏水性;Me+表示优选选自Mn、Fe、Co、Cu、Mg或Zn的金属离子;
包括SkQB1、SkQB1A、SkQB1B、SkQBP1、SkQB5、SkQBP5及其药学可接受的盐。
5.使用权利要求1或3中所述的方法筛选或设计的定向于线粒体的促氧化剂,具有促氧化与抗氧化特性之间的指定比例,并且描述为式(I)
其中A是效应物部分;L-连接基,n-1至20的整数;B-将化合物靶向递送入线粒体的靶向基团,且其中A可以是式(II)的促氧化剂
和/或其还原形式
其中m-1至3的整数;Y-选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;或两个邻位的Y彼此连接,使得它们形成结构(III):
和/或其还原形式
其中R1和R2是选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基,且其中A优选选自分别具有如下结构的去甲氧基泛醌或紫罗兰醇:
L-连接基,包含:
a)任选包含一个或多个双键或三键、或醚键、或酯键、或C-S、或S-S、或肽键的直链或支链烃链;且其任选被一个或多个优选选自烷基、烷氧基、卤素、酮基、氨基的取代基取代;
b)或天然异戊二烯链;
B-靶向基团,包含:
a)斯库拉切夫-离子Sk:
Sk+Z-
其中Sk-亲脂性阳离子;
Z-药学可接受的阴离子;
b)或能够以其阳离子形式透入线粒体的两亲性两性离子,作为B的成分的Sk+还可以是亲脂性金属-有机化合物,特别是优选具有如下结构的亲脂性金属卟啉:
其通过命名为R1、R2、R3或R4的部分包括在式(I)化合物的组成上;其余取代基R1、R2、R3或R4可以根据化合物的所需特性筛选,例如为了增加或降低分子的疏水性;Me+表示优选选自Mn、Fe、Co、Cu、Mg或Zn的金属离子。
6.式(I)的定向于线粒体的抗氧化剂的生产方法:
其中A是效应物部分;L-连接基,n-1至20的整数;B-将化合物靶向递送入线粒体的靶向基团,且其中A可以是式(II)的抗氧化剂
和/或其还原形式
其中m-1至3的整数;Y-选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;或两个邻位的Y彼此连接,使得它们形成结构(III):
和/或其还原形式
其中R1和R2是选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;
L-连接基,包含:
a)任选包含一个或多个双键或三键、或醚键、或酯键、或C-S、或S-S、或肽键的直链或支链烃链;且其任选被一个或多个优选选自烷基、烷氧基、卤素、酮基、氨基的取代基取代;
b)或天然异戊二烯链;
B-靶向基团,包含:
a)斯库拉切夫-离子Sk:
Sk+Z-
其中Sk-亲脂性阳离子;
Z-药学可接受的阴离子;
b)或能够以其阳离子形式透入线粒体的两亲性两性离子,作为B的成分的Sk+还可以是亲脂性金属-有机化合物,特别是优选具有如下结构的亲脂性金属卟啉:
其通过命名为R1、R2、R3或R4的部分包括在式(I)化合物的组成上;其余取代基R1、R2、R3或R4可以根据化合物的所需特性筛选,例如为了增加或降低分子的疏水性;Me+表示优选选自Mn、Fe、Co、Cu、Mg或Zn的金属离子;
该方法包括合成定向于线粒体的抗氧化剂,条件是该方法包括至少一种如下步骤:
a)由可得到的成分,特别是由2,3-二甲基苯酚生产2,3-二甲基-1,4-苯醌;
b)生产与连接基连接的亲脂性阳离子,优选生产亲脂性阳离子的羧基烷基衍生物,特别优选10-羧基癸基三苯基磷鎓。
7.式(I)的定向于线粒体的抗氧化剂的纯化方法:
其中A是效应物部分;L-连接基,n-1至20的整数;B-将化合物靶向递送入线粒体的靶向基团,且其中A可以是式(II)的抗氧化剂
和/或其还原形式,
其中m-1至3的整数;Y-选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;或两个邻位的Y彼此连接,使得它们形成结构(III):
和/或其还原形式
其中R1和R2是选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;
L-连接基,包含:
a)任选包含一个或多个双键或三键、或醚键、或酯键、或C-S、或S-S、或肽键的直链或支链烃链;且其任选被一个或多个优选选自烷基、烷氧基、卤素、酮基、氨基的取代基取代;
b)或天然异戊二烯链;
B-靶向基团,包含:
a)斯库拉切乔夫-离子Sk:
Sk+Z-
其中Sk-亲脂性阳离子;
Z-药学可接受的阴离子;
b)或能够以其阳离子形式透入线粒体的两亲性两性离子;作为B的成分的Sk+还可以是亲脂性金属-有机化合物,例如优选具有如下结构的亲脂性金属卟啉:
其通过命名为R1、R2、R3或R4的部分包括在式(I)化合物的组成上;其余取代基R1、R2、R3或R4可以根据化合物的所需特性筛选,特别是为了增加或降低分子的疏水性;Me+表示优选选自Mn、Fe、Co、Cu、Mg或Zn的金属离子;
该方法包括至少一种如下步骤:
a)使用梯度反相色谱法、在不含盐的无缓冲的流动相系统中纯化;
b)使用凝胶过滤色谱法在乙醇中纯化;
c)除去定向于线粒体的抗氧化剂的氧化形式;
d)优选使用所述通式的定向于线粒体的抗氧化剂的还原形式的‘分子阱’除去定向于线粒体的抗氧化剂的还原形式,其中将‘分子阱’定义为具有酮基-或醌-样部分的化合物并且优选易溶于惰性溶剂优选庚烷或己烷中,所述的酮基-或醌-样部分具有在中性pH下优选不低于0.2V的氧化感应电位。
8.定向于线粒体的抗氧化剂的还原形式的‘分子阱’,其为具有酮基-或醌-样部分的化合物并且优选易溶于惰性溶剂优选庚烷或己烷中,并且能够从合成的定向于线粒体的抗氧化剂中除去还原形式,所述的酮基-或醌-样部分具有在中性pH下优选不低于0.2V的氧化感应电位。
9.式(I)的定向于线粒体的抗氧化剂的生产方法:
其中A是效应物部分;L-连接基,n-1至20的整数;B-将化合物靶向递送入线粒体的靶向基团;A可以是式(II)的抗氧化剂
和/或其还原形式,
其中m-1至3的整数;Y-选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;或两个邻位的Y彼此连接,使得它们形成结构(III):
和/或其还原形式
其中R1和R2是选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;
L-连接基,包含:
a)任选包含一个或多个双键或三键、或醚键、或酯键、或C-S、或S-S、或肽键的直链或支链烃链;且其任选被一个或多个优选选自烷基、烷氧基、卤素、酮基、氨基的取代基取代;
b)或天然异戊二烯链;
B-靶向基团,包含:
a)斯库拉切夫-离子Sk:
Sk+Z-
其中Sk-亲脂性阳离子;
Z-药学可接受的阴离子;
b)或能够以其阳离子形式透入线粒体的两亲性两性离子;作为B的成分的Sk+还可以是亲脂性金属-有机化合物,特别是优选具有如下结构的亲脂性金属卟啉:
其通过命名为R1、R2、R3或R4的部分包括在式(I)化合物的组成上;其余取代基R1、R2、R3或R4可以根据化合物的所需特性筛选,例如为了增加或降低分子的疏水性;Me+表示优选选自Mn、Fe、Co、Cu、Mg或Zn的金属离子;
所述的式(I)的定向于线粒体的抗氧化剂为药物物质形式,且该方法包括权利要求6和7中所述的方法之一。
10.基于式(I)的定向于线粒体的抗氧化剂的药物物质:
其中A是效应物部分;L-连接基,n-1至20的整数;B-将化合物靶向递送入线粒体的靶向基团;且其中A可以是式(II)的抗氧化剂
和/或其还原形式,
其中m-1至3的整数;Y-选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;或两个邻位的Y彼此连接,使得它们形成结构(III):
和/或其还原形式
其中R1和R2是选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;
L-连接基,包含:
a)任选包含一个或多个双键或三键、或醚键、或酯键、或C-S、或S-S、或肽键的直链或支链烃链;且其任选被一个或多个优选选自烷基、烷氧基、卤素、酮基、氨基的取代基取代;
b)或天然异戊二烯链;
B-靶向基团,包含:
a)斯库拉切夫-离子Sk:
Sk+Z-
其中Sk-亲脂性阳离子;
Z-药学可接受的阴离子;
b)或能够以其阳离子形式透入线粒体的两亲性两性离子;作为B的成分的Sk+还可以是亲脂性金属-有机化合物,特别是优选具有如下结构的亲脂性金属卟啉:
其通过命名为R1、R2、R3或R4的部分包括在式(I)化合物的组成上;其余取代基R1、R2、R3或R4可以根据化合物的所需特性筛选,例如为了增加或降低分子的疏水性;Me+表示优选选自Mn、Fe、Co、Cu、Mg或Zn的金属离子;
其中氧化与还原形式之比为氧化形式占0.2%-99.8%的范围,且其中将定向于线粒体的抗氧化剂的氧化与还原形式之比维持在经历特定贮存条件的贮存期限的自始至终。
11.权利要求10中所述的药物物质,其中氧化与还原形式之比更优选为氧化形式占50%-99.5%的范围。
12.权利要求12中所述的药物物质,其中氧化与还原形式之比更优选为氧化形式占97.5%-99.5%的范围。
13.权利要求10-12中所述的药物物质,其中定向于线粒体的抗氧化剂的氧化与还原形式之比持续至少1个月。
14.权利要求10-12中所述的药物物质,其中定向于线粒体的抗氧化剂的氧化与还原形式之比持续至少6个月。
15.权利要求10-12中所述的药物物质,其中定向于线粒体的抗氧化剂的氧化与还原形式之比持续至少2年。
16.药物物质,其为式(I)的化合物:
其中A是效应物部分;L-连接基,n-1至20的整数;B-将化合物靶向递送入线粒体的靶向基团;且其中A可以是式(II)的抗氧化剂
和/或其还原形式,
其中m-1至3的整数;Y-选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;或两个邻位的Y彼此连接,使得它们形成结构(III):
和/或其还原形式
其中R1和R2是选自低级烷基或低级烷氧基的相同或不同的取代基;
L-连接基,包含:
a)任选包含一个或多个双键或三键、或醚键、或酯键、或C-S、或S-S、或肽键的直链或支链烃链;且其任选被一个或多个优选选自烷基、烷氧基、卤素、酮基、氨基的取代基取代;
b)或天然异戊二烯链;
B-靶向基团,包含:
a)斯库拉切夫-离子Sk:
Sk+Z-
其中Sk-亲脂性阳离子;
Z-药学可接受的阴离子;
b)或能够以其阳离子形式透入线粒体的两亲性两性离子;作为B的成分的Sk+还可以是亲脂性金属-有机化合物,特别是优选具有如下结构的亲脂性金属卟啉:
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该药物物质使用权利要求1、3、6、7、9中的至少一种方法生产并且满足药典要求。
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