EA030337B1 - Генетически модифицированные неопластические клетки, содержащие агонист tlr и экспрессирующие gm-csf, и их применение против неоплазии - Google Patents

Генетически модифицированные неопластические клетки, содержащие агонист tlr и экспрессирующие gm-csf, и их применение против неоплазии Download PDF

Info

Publication number
EA030337B1
EA030337B1 EA201291117A EA201291117A EA030337B1 EA 030337 B1 EA030337 B1 EA 030337B1 EA 201291117 A EA201291117 A EA 201291117A EA 201291117 A EA201291117 A EA 201291117A EA 030337 B1 EA030337 B1 EA 030337B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
tumor
cells
agonist
individual
immunogenic composition
Prior art date
Application number
EA201291117A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201291117A1 (ru
Inventor
Янг Дзун Ким
Дрю М. Пардол
Чарльз Джордж Дрэйк
Меган Дэвис
Цзуань Фу
Original Assignee
Дзе Джонс Хопкинс Юниверсити
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дзе Джонс Хопкинс Юниверсити filed Critical Дзе Джонс Хопкинс Юниверсити
Publication of EA201291117A1 publication Critical patent/EA201291117A1/ru
Publication of EA030337B1 publication Critical patent/EA030337B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7024—Esters of saccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/739—Lipopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/38—Stomach; Intestine; Goblet cells; Oral mucosa; Saliva
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/55—Glands not provided for in groups A61K35/22 - A61K35/545, e.g. thyroids, parathyroids or pineal glands
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5152—Tumor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины. Представлена композиция для индукции иммунного ответа на антигены неопластических клеток, а также вакцина для облегчения неоплазии, которые содержат некомпетентные по пролиферации генетически модифицированные неопластические клетки, экспрессирующие цитокин GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), и содержащие по меньшей мере один агонист TLR. Также изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит указанную выше композицию и фармацевтически приемлемый наполнитель. Кроме того, изобретение включает некомпетентную по пролиферации клетку, определенную выше. Изобретение относится также к способам использования композиции для индукции иммунного ответа, направленного на лечение или профилактику неоплазии, в частности лечение и профилактику рака шейки матки.

Description

Изобретение относится к области медицины. Представлена композиция для индукции иммунного ответа на антигены неопластических клеток, а также вакцина для облегчения неоплазии, которые содержат некомпетентные по пролиферации генетически модифицированные неопластические клетки, экспрессирующие цитокин ОМ-СЗР (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), и содержащие по меньшей мере один агонист ТЬК. Также изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит указанную выше композицию и фармацевтически приемлемый наполнитель. Кроме того, изобретение включает некомпетентную по пролиферации клетку, определенную выше. Изобретение относится также к способам использования композиции для индукции иммунного ответа, направленного на лечение или профилактику неоплазии, в частности лечение и профилактику рака шейки матки.
030337
Перекрестная ссылка на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет следующей предварительной заявки США № 61/328471, поданной 27 апреля 2010 г., содержание которой приведено в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме.
Положение относительно финансируемых из федерального бюджета исследований
Эта работа поддержана следующими грантами Ναΐίοηαΐ 1п81Ии1е8 о£ НеаИЬ, грант № ΝΙΗ К23ΌΕ018464-02. Правительство обладает определенными правами на изобретение.
Предпосылки изобретения
Для вакцин из летально облученных клеток опухолей, сконструированных для секреции СМ-С8Р (СУАХ), показана многообещающая эффективность на различных моделях меланомы, карциномы клеток почек, предстательной железы и немелкоклеточной карциномы легкого, карциномы поджелудочной железы, так же, как плоскоклеточной карциномы головы и шеи, однако из-за блокады многочисленных иммунологических контрольных точек, СУАХ в качестве монотерапии вряд ли является клинически эффективной при заболевании на поздних стадиях. Недавно обнаружили, что СУАХ обладает сомнительной эффективностью в исследовании фазы ΙΙΙ для невосприимчивого к гормонам рака предстательной железы на поздних стадиях. Неудача в преодолении критических механизмов ускользания опухоли от иммунологического надзора являлась основным ограничением иммунотерапевтических способов прошлого, разработанных для первичной стимуляции опухолеспецифических иммунных ответов хозяина. Среди многих определенных механизмов для уменьшения противоопухолевых иммунных ответов регуляторные Т-клетки (Тгед), супрессорные клетки миелоидного происхождения и дендритные клетки (ЭС) с приобретенной толерантностью выдвигали в качестве гипотетических негативных регуляторов, которые могут предотвращать успешную иммунотерапию. Одним из нижестоящих последствий для некоторых контрольных точек этих путей ускользания от иммунологического надзора является ограниченное количество активированных антигенпредставляющих клеток (АРС) в афферентном звене иммунной системы. Необходимы улучшенные вакцины из клеток опухолей, которые способны преодолевать критические механизмы ускользания клеток опухолей от иммунологического надзора.
Краткое изложение сущности изобретения
Как описано ниже, настоящее изобретение в целом относится к иммуногенным композициям, содержащим неопластические клетки, экспрессирующие цитокин (СМ-С8Р), составленные по меньшей мере с одним агонистом ТЬК, и к способам использования композиции для индукции или усиления иммунного ответа.
В одном из аспектов изобретение в целом относится к иммуногенной композиции, содержащей одну или несколько некомпетентных по пролиферации генетически модифицированных неопластических клеток, экспрессирующих рекомбинантный иммуностимулирующий цитокин, и по меньшей мере один агонист То11-подобного рецептора (ТЬК).
В другом аспекте изобретение в целом относится к вакцине для облегчения неоплазии у индивида, где вакцина содержит эффективное количество некомпетентных по пролиферации генетически модифицированных неопластических клеток, экспрессирующих рекомбинантный иммуностимулирующий цитокин, и эффективное количество экзогенного агониста То11-подобного рецептора (ТЬК) в фармацевтически приемлемом наполнителе.
В другом аспекте изобретение в целом относится к способу индукции специфического для антигена неопластических клеток иммунного ответа у индивида, страдающего неоплазией или обладающего предрасположенностью к развитию неоплазии, где способ включает введение индивиду эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей одну или несколько некомпетентных по пролиферации неопластических клеток, экспрессирующих рекомбинантный иммуностимулирующий цитокин, и содержащей экзогенный агонист То11-подобного рецептора (ТЬК) в количестве, достаточном для индукции специфического для антигена неопластических клеток иммунного ответа у указанного индивида.
В следующем аспекте изобретение в целом относится к некомпетентной по пролиферации неопластической клетке, содержащей вектор экспрессии, кодирующий СМ-С8Р, и по меньшей мере один агонист ТЬК.
В другом аспекте изобретение в целом относится к способу лечения или профилактики неоплазии у индивида, страдающего неоплазией или обладающего предрасположенностью к развитию неоплазии, где способ включает введение индивиду эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины, описанных в настоящем документе, в количестве, достаточном для индукции специфического для антигена неопластических клеток иммунного ответа у указанного индивида, таким образом лечения индивида.
В другом аспекте изобретение в целом относится к способу лечения или профилактики прогрессирования или метастазирования опухоли у индивида, страдающего неоплазией, где способ включает введение индивиду эффективного количества каких-либо из иммуногенных композиций или вакцин, описанных в настоящем документе, таким образом лечение или профилактика прогрессирования или метастазирования опухоли у индивида.
В другом аспекте изобретение в целом относится к способу лечения развившейся опухоли или про- 1 030337
филактики образования опухоли у индивида, где способ включает введение индивиду эффективного количества каких-либо из иммуногенных композиций или вакцин, описанных в настоящем документе, таким образом лечение развившейся опухоли или профилактику образования опухоли у индивида.
В другом аспекте изобретение в целом относится к способу лечения микрометастазирования или остаточного заболевания у индивида, страдающего микрометастазированием или остаточным заболеванием, где способ включает введение индивиду эффективного количества каких-либо из иммуногенных композиций или вакцин, описанных в настоящем документе, таким образом лечение микрометастазирования или остаточного заболевания у индивида.
В другом аспекте изобретение в целом относится к способу иммунизации индивида, где способ включает введение индивиду каких-либо из иммуногенных композиций или вакцин, описанных в настоящем документе.
В другом аспекте изобретение в целом относится к фармацевтической композиции для лечения неоплазии, содержащей эффективное количество каких-либо из иммуногенных композиций или вакцин, описанных в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый наполнитель.
В другом аспекте изобретение в целом относится к набору для лечения неоплазии, где набор содержит эффективное количество каких-либо из иммуногенных композиций или вакцин, описанных в настоящем документе, и руководство для использования набора, как в каком-либо из способов, описанных в настоящем документе.
В другом аспекте изобретение в целом относится к способу лечения или профилактики рака шейки матки у индивида, где способ включает введение индивиду эффективного количества каких-либо из иммуногенных композиций или вакцин, описанных в настоящем документе, таким образом лечение или профилактика рака шейки матки у индивида.
В другом аспекте изобретение в целом относится к способу лечения полиморфных дефицитов ТЬК у индивида, где способ включает введение индивиду эффективного количества каких-либо из иммуногенных композиций или вакцин, описанных в настоящем документе, таким образом лечение полиморфных дефицитов ТЬК у индивида.
В различных вариантах осуществления любого из вышеуказанных аспектов или любого другого аспекта изобретения, определенного в настоящем документе, цитокин представляет собой гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р). В другом варианте осуществления клетка содержит сравнимые количества по меньшей мере одного агониста ТЬК и ОМ-С8Р. В следующем варианте осуществления агонист ТЬК представляет собой агонист ТЬК4, ТЬК5, ТЬКб, ТЬК7 или ТЬК8, ТЬК9. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция содержит агонист ТЬК4 и агонист ТЬК7/8. В другом варианте осуществления агонист ТЬК4 представляет собой ЬР8, фрагмент ЬР8, или синтетический аналог глюкопиранозил-липида А, и аналог ТЬК7/8 представляет собой К848. В других вариантах осуществления клеткам придают некомпетентность по пролиферации посредством облучения. В конкретных вариантах осуществления неопластическая клетка выбрана из группы, состоящей из лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, рака предстательной железы, головы и шеи, плоскоклеточной карциномы, злокачественной опухоли языка, злокачественной опухоли гортани, злокачественной опухоли миндалин, злокачественной опухоли гортаноглотки, злокачественной опухоли носоглотки, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака легкого, меланомы, рака поджелудочной железы, глиобластомы и злокачественной опухоли мозга. В других вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 1 нг агониста ТЬК4 на 1х105 клеток-10 нг агониста ТЬК4 на 1х105 клеток. В следующих вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере приблизительно 3-5 нг на 5х105 клеток. В другом варианте осуществления клетка содержит агонист ТЬК в ассоциации с липофектамином или другими липосомальными векторами. В следующих вариантах осуществления клетка содержит ЬР8/липосомные мицеллы. В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит клетки, экспрессирующие один или несколько антигенов. В следующих вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит клетки, которые являются аутологичными или аллогенными.
В различных вариантах осуществления любых из вышеуказанных аспектов или любого другого аспекта по изобретению, описанного в настоящем документе, неопластическая клетка происходит из линии злокачественных клеток или происходит из опухоли. В другом варианте осуществления линия злокачественных клеток или опухоль выбрана из лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, рака предстательной железы, головы и шеи, плоскоклеточной карциномы, злокачественной опухоли языка, злокачественной опухоли гортани, злокачественной опухоли миндалин, злокачественной опухоли гортаноглотки, злокачественной опухоли носоглотки, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака легкого, меланомы, рака поджелудочной железы, глиобластомы и злокачественной опухоли мозга. В другом варианте осуществления иммуногенную композицию вводят системно или местно. В следующих вариантах осуществления иммуногенную композицию вводят внутримышечной инъекцией, внутривенной инъекцией, внутриопухолевой инъекцией или перитуморальной инъекцией. В дополнительных вариантах осуществления способы включают введение индивиду эффективного количества одного или нескольких химиотерапевтических средств. В конкретных вариантах осуществления одно или несколько химиотерапевтиче- 2 030337
ских средств выбраны из ацетата абиратерона, алтретамина, ангидровинбластина, ауристатина, бексаротена, бикалутамида, ВМ8184476, 2,3,4,5,6-пентафтор-Ы-(3-фтор-4-метоксифенил)бензолсульфонамида, блеомицина, ЦЫ-диметил-Г-валил-Г-валил-Ы-метил-Г-валил-Г-пролил-Г-пролин-т-бутиламида, кахектина, цемадотина, хлорамбуцила, циклофосфамида, 3',4'-дидегидро-4'-дезокси-8'-норвинкалейкобластина, доцетаксола, доксетаксела, циклофосфамида, карбоплатина, кармустина (ВСХЕ), цисплатина, криптофицина, циклофосфамида, цитарабина, декарбазина (ОТ!С), дактиномицина, даунорубицина, децитабина, доластатина, доксорубицина (адриамицина), этопозида, 5-фторурацила, финастерида, флутамида, гидроксимочевины и гидроксимочевинатаксанов, ифосфамида, лиарозола, лонидамина, ломустина (ССЫи), МИУ3100, мехлорэтамина (азотистого иприта), мелфалана, изетионата мивобулина, ризоксина, сертенефа, стрептозоцина, митомицина, метотрексата, таксанов, нилутамида, онапристона, паклитаксела, преднемустина, прокарбазина, КРК109881, фосфата страмустина, тамоксифена, тасонермина, таксола, третиноина, винбластина, винкристина, сульфата виндезина и винфлюнина. В дополнительных вариантах осуществления способы усиливают активацию дендритных клеток и/или увеличивают количество АН1-специфических цитотоксических Т-клеток или р15Е-специфических цитотоксических Т-клеток по сравнению с использованием только ОУАХ. В конкретных вариантах осуществления способы снижают или стабилизируют пролиферацию клеток опухоли, рост опухоли или выживаемость индивида по сравнению с использованием только ОУАХ. В следующих вариантах осуществления клетка происходит из лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, рака предстательной железы, головы и шеи, плоскоклеточной карциномы, злокачественной опухоли языка, злокачественной опухоли гортани, злокачественной опухоли миндалин, злокачественной опухоли гортаноглотки, злокачественной опухоли носоглотки, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака легкого, меланомы, рака поджелудочной железы, глиобластомы и злокачественной опухоли мозга или линии их клеток. В дополнительных вариантах осуществления клетка содержит агонист ТЕК.4 и ТЕК7/8. В других вариантах осуществления агонист ТЕК находится в ассоциации с липосомальным вектором.
Определения
"Цитокин" обозначает гормон, который действует местно и который модулирует иммунный ответ индивидуума.
"Генетически модифицированная неопластическая клетка" обозначает клетку или популяцию клеток, которые генетически модифицировали для экспрессии трансгена и вводят пациенту как часть терапии злокачественных опухолей. Иммуногенная композиция или вакцина по изобретению содержит неопластические клетки (например, клетки опухоли), которые являются "аутологичными" или "алогенными" для пациента, подвергаемого лечению, или "фоновые клетки", которые смешивают с клетками опухолей, взятыми у пациента. Как правило, генетически модифицированная неопластическая клетка принадлежит к тому же общему типу клеток опухоли, как и клетки, поражающие пациента. Например, пациенту, страдающему меланомой, как правило, вводят генетически модифицированные клетки, происходящие из меланомы. Вакцину из экспрессирующих ОМ-С8Е генетически модифицированных клеток опухоли можно обозначать в настоящем документе как "ОУАХ". Аутологичные и аллогенные клетки злокачественных опухолей, генетически модифицированные для экспрессии цитокина, например ОМС8Е, после повторного введения пациенту для лечения злокачественной опухоли описаны в патентах США Νο. 5637483, 5904920, 6277368 и 6350445 так же, как в публикации патента США Νο. 20100150946, содержание каждого из которых конкретно приведено в настоящем документе в качестве ссылки. Форма экспрессирующих ОМ-С8Е генетически модифицированных клеток злокачественных опухолей или "экспрессирующая цитокин клеточная вакцина" для лечения рака поджелудочной железы описаны в патентах США Νο. 6033674 и 5985290, содержание каждого из которых конкретно приведено в настоящем документе в качестве ссылки. Универсальная экспрессирующая иммуномодулирующие цитокины фоновая линия клеток описана в патенте США Νο. 6464973, содержание которого конкретно приведено в настоящем документе в качестве ссылки.
"Полипептид гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-С8Е)" обозначает цитокин или его фрагмент, обладающий иммуномодулирующей активностью и по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью аминокислотной последовательности с Νο. доступа в ОепВапк ААА52122.1.
Иллюстративная последовательность ОМ-С8Е (ХСВ! ААА52122.1) представлена ниже
1 ти1дз1111д ТОасзгзара гзрзрзкдри ек^пагдеаг г11п1згс1£а 8θΓηηθ£νθνί
61 зет£с11дер£ с1д£г1е1ук дд1гдз1£к1 кдр1£ттазк! укдксрркре £зса£дИ££
121 ез£кеп1кс1£ 11νίρ£άο«θ ρνде
Показано, что ОМ-С8Е индуцирует рост гематопоэтических клеток линий гранулоцитов и макрофагов. Кроме того, он также активирует функцию процессинга и представления антигена дендритными клетками, которые являются главными антигенпредставляющими клетками (АРС) иммунной системы. В одном из вариантов осуществления иммуногенная композиция содержит кодирующую последовательность ОМ-С8Е, функционально связанную с регуляторными элементами для экспрессии в клетках вакцины.
"Молекула нуклеиновой кислоты ОМ-С8Е" обозначает полинуклеотид, кодирующий полипептид
- 3 030337
СМ-С8Р.
Молекула нуклеиновой кислоты СМ-С8Р может кодировать СМ-С8Р мыши или человека и может находиться в форме геномной ДНК (см. публикацию патента США N0. 2006/0057127, содержание которого таким образом приведено в качестве ссылки в полном объеме) или кДНК (см. публикацию патента США N0. 2006/0057127, содержание которого таким образом приведено в качестве ссылки в полном объеме). В одном из вариантов осуществления кодирующая последовательность СМ-С8Р кодирует аминокислотную последовательность, описанную в публикации патента США № 2006/0057127, полное содержание которого таким образом приведено в качестве ссылки. Другие примеры кодирующих последовательностей ОМ-С8Р обнаружены в номерах доступа в ОепЪапк: ЛР373868, АС034228, АС034216, М10663 и NМ000758.
Иллюстративная кодирующая последовательность СМ-С8Р (АР373868) представлена ниже
1 дсад-Ьс-Ьд-ЬТ ТссЬассада сЬдддадсс-Ь саадддссаа аЬдЬдадддс садЬдддадд
61 дЬсссдЬЬЬа ссЬссссада асаддЬссЬд дЬдЬддаЬЬд дааадасЬЬд ЬЬдасЬдасЬ
121 дЬсЬдадсЬа ЬдасаасЬса ЬЬЬсЬаддад дааадЬдасс ЬЬсЬсЬссса даЬдддЬсаЬ 181 асаддсЬсЬс ЬдссЬсссЬд дссаЬсадсЬ даассасЬаЬ сЬаЬддсЬсс сЬЬсссЬдсс 241 сЬссадссЬс садддЬдсЬа ЬссаасасаЬ дЬдаЬаЬсЬа саЬдЬадЬаЬ ссаЬдЬссЬс 301 аЬсЬсЬсссс сдададсЬсс сЬддааадад сЬдадссаад дссЬЬдсааа аааддЬддад 361 ааадддссад ддссЬддаса Шса1д11с ссассссадс сЬддссасЬа ддадЬдЬЬсЬ 421 асдсаддсЬс адаЬддаЬдд ддсЬддссЬс асадЬддддЬ сЬддаддасЬ ааддЬЬЬддЬ 481 ЬЬсЬсЬаЬдс ааддЬсадаа ааасЬсссас адЬасаддда аасЬддссад ддсЬдсадас 541 Ьсадассаса дЬдсЬааадс саЬдаасЬсс ассЬдсЬсЬс ЬдааддсЬсд ссаассЬдад 601 Ьссадсадаа ЬдЬЬсЬсдсЬ ЬдЬдЬссаас сссасЬддЬЬ ЬаддсЬдааЬ садссЬсЬад 661 ддсссададд сасЬдсассЬ ддадЬаддда дсЬЬсЬссад ЬаЬсададЬс ассЬЬсадад 721 дссЬддадсс ЬЬЬсаЬааад саддЬаадад дасЬсааЬад аЬдсаЬсЬдс аЬддааааса 781 ЬссЬссссЬс Ьассаддсас сЬдЬаЬдЬас аассааЬсас адсадсасас аЬасасссад 841 аааЬдддсас дЬдЬдддссс асассссЬЬЬ адсЬаЬдааа сссаддсаЬд дддсадсЬЬд 901 адссадаЬас сЬЬдЬдсааа сасааасЬсд ЬдсЬдЬсЬЬс ЬсЬдаасЬсс аЬЬдЬдаааа 961 ЬсааасасЬЬ дЬсадссссЬ саададссЬЬ 1адаШсс1 асЬЬссасас ЬЬссасадаа
1021 аддссЬсЬдд адЬЬддддда ЬдсЬддддЬЬ аЬдЬаддааа ЬЬаадссЬдд адддссЬЬдс 1081 Ьддддаадсс аЬЬдЬсссЬд ЬассЬдадаЬ ддаЬдсадсс асадсссЬдд адссадссЬд 1141 аадсЬссЬдд ЬдЬсЬЬсЬдд дддсЬасаЬа ЬаддадЬдЬа дЬссдаассЬ сададдддса 1201 аассЬдсЬсЬ дсададддаа ЬсааддЬЬса саЬаассада даддддадЬс асЬсаддаад 1261 дЬддсЬссад адссаададЬ садасЬсЬдд дЬсссдасЬЬ дасссадсса сасссссЬсЬ 1321 даадсЬЬдсЬ дададЬддсЬ дсадЬсЬсдс ЬдсЬддаЬдЬ дсасаЬддЬд дЬсаЬЬсссЬ 1381 сЬдсЬсасад дддсаддддЬ ссссссЬЬас ЬддасЬдадд ЬЬдсссссЬд сЬссаддЬсс 1441 ЬдддЬдддад сссаЬдЬдаа сЬдЬсадЬдд ддсаддЬсЬд ЬдададсЬсс ссЬсасасЬс 1501 аадЬсЬсЬса садЬддссад адаададдаа ддсЬддадЬс адааЬдаддс ассадддсдд 1561 дсаЬадссЬд сссаааддсс ссЬдддаЬЬа саддсаддаЬ ддддадсссЬ аЬсЬаадЬдЬ 1621 сЬсссасдсс ссассссадс саЬЬссаддс саддаадЬсс ааасЬдЬдсс ссЬсададдд 1681 адддддсадс сЬсаддссса ЬЬсадасЬдс ссадддаддд сЬддададсс сЬсаддаадд 1741 сдддЬдддЬд ддсЬдЬсддЬ ЬсЬЬддааад дЬЬсаЬЬааЬ даааассссс аадссЬдасс 1801 ассЬадддаа ааддсЬсасс дЬЬсссаЬдЬ дЬддсЬдаЬа адддссадда даЬЬссасад 1861 ЬЬсаддЬадЬ ЬсссссдссЬ сссЬддсаЬЬ ЬЬдЬддЬсас саЬЬааЬсаЬ ЬЬссЬсЬдЬд 1921 ЬаЬЬЬаадад сШШдсс адЬдадссса дЬасасадад адаааддсЬа аадЬЬсЬсЬд 1981 даддаЬдЬдд сЬдсададсс ЬдсЬдсЬсЬЬ дддсасЬдЬд дссЬдсадса ЬсЬсЬдсасс 2041 сдсссдсЬсд сссадсссса дсасдсадсс сЬдддадсаЬ дЬдааЬдсса Ьссаддаддс 2101 ссддсдЬсЬс сЬдаассЬда дЬададасас ЬдсЬдсЬдад аЬддЬаадЬд ададааЬдЬд 2161 ддссЬдЬдсс Ьаддссассс адсЬддсссс ЬдасЬддсса сдссЬдЬсад сЬЬдаЬааса 2221 ЬдасаЬЬЬЬс сЬЬЬЬсЬаса дааЬдаааса дЬадаадЬса ЬсЬсадаааЬ дЬЬЬдассЬс 2281 саддЬаадаЬ дсЬЬсЬсЬсЬ дасаЬадсЬЬ Ьссадаадсс ссЬдсссЬдд ддЬддаддЬд 2341 дддасЬссаЬ ЬЬЬадаЬддс ассасасадд дЬЬдЬссасЬ ЬЬсЬсЬссад ЬсадсЬддсЬ 2401 дсаддаддад ддддЬадсаа сЬдддЬдсЬс аададдсЬдс ЬддссдЬдсс ссЬаЬддсад 2461 ЬсасаЬдадс ЬссЬЬЬаЬса дсЬдадсддс саЬдддсада ссЬадсаЬЬс ааЬддссадд
2521 адЬсассадд ддасаддЬдд ЬааадЬдддд дЬсасЬЬсаЬ дадасаддад сЬдЬдддЬЬЬ 2581 ддддсдсЬса сЬдЬдссссд адассаадЬс сЬдЬЬдадас адЬдсЬдасЬ асадададдс 2641 асададдддЬ ЬЬсаддааса асссЬЬдссс асссадсадд ЬссаддЬдад дссссасссс 2701 ссЬсЬсссЬд ааЬдаЬдддд ЬдададЬсас сЬссЬЬсссЬ ааддсЬдддс ЬссЬсЬссад 27 61 дЬдссдсЬда дддЬддссЬд ддсддддсад Ьдадаадддс аддЬЬсдЬдс сЬдссаЬдда 2821 садддсаддд ЬсЬаЬдасЬд дасссадссЬ дЬдссссЬсс саадсссЬас ЬссЬдддддс 2881 Ьдддддсадс адсааааадд адЬддЬддад адЬЬсЬЬдЬа ссасЬдЬддд сасЬЬддсса 2941 сЬдсЬсассд асдаасдаса ЬЬЬЬссасад дадссдассЬ дссЬасадас ссдссЬддад 3001 сЬдЬасаадс адддссЬдсд дддсадссЬс ассаадсЬса адддссссЬЬ дассаЬдаЬд 3061 дссадссасЬ асаадсадса сЬдсссЬсса ассссддЬда дЬдссЬасдд садддссЬсс 3121 адсаддааЬд ЬсЬЬааЬсЬа дддддЬдддд ЬсдасаЬддд дададаЬсЬа ЬддсЬдЬддс 3181 ЬдЬЬсаддас сссадддддЬ ЬЬсЬдЬдсса асадЬЬаЬдЬ ааЬдаЬЬадс ссЬссадада 3241 ддаддсадас адсссаШс аЬсссаадда дЬсададсса сададсдсбд аадсссасад 3301 -ЬдсЪссссад саддадсЪдс -Ьсс-Ьа-Ьсс-Ьд д1са11аЫд Ьса-Ыа'Ьдд-Ь Таа-Ьдадд-Ьс 3361 ададдТдадд дсааасссаа ддааас-ЬТдд ддссЕдссса аддсссадад даадТдссса 3421 ддсссаадЪд ссасс-ЬЪс-Ьд дсаддас-ЫЪ ссЬсЕддссс сасаЪдддд-Ь дс-Ыдаа-Ыд 3481 сададдаЪса аддаадддад дсЪас-Ыдда аЪддасаадд ассЪсаддса с!сс11сс1д
- 4 030337
3541 сдддааддда дсааадБББд БддссББдас БссасБссББ сБдддБдссс ададасдасс 3601 Бсадсссадс БдсссБдсБс БдсссБддда ссаааааддс аддсдБББда сБдсссадаа 3661 ддссаассБс аддсБддсас ББаадБсадд сссББдасБс БддсБдссас БддсададсБ 3721 аБдсасБссБ Бддддаасас дБдддБддса дсадсдБсас сБдасссадд БсадБдддБд 3781 БдБссБддад БдддссБссБ ддссБсБдад ББсБаададд садБададаа асаБдсБддБ 3841 дсББссББсс сссасдББас ссасББдссБ ддасБсаадБ дББББББаББ БББсББББББ 3901 Баааддааас ББссБдБдса асссадаББа БсассБББда аадБББсааа дадаассБда 3961 аддасБББсБ дсББдБсаБс сссБББдасБ дсБдддадсс адБссаддад Бдадассддс 4021 садаБдаддс Бддссаадсс ддддадсБдс БсБсБсаБда аасаададсБ адааасБсад 4081 даБддБсаБс ББддадддас сааддддБдд дссасадсса БддБдддадБ ддссБддасс 4141 БдсссБдддс сасасБдасс сБдаБасадд саБддсадаа дааБдддааБ аББББаБасБ 4201 дасадаааБс адБааБаБББ аБаБаБББаБ аБББББаааа БаБББаБББа БББаБББаББ 4261 БаадББсаБа ББссаБаБББ аББсаадаБд ББББассдБа аБааББаББа ББаааааБаБ 4321 дсББсБасББ дБссадБдББ сБадБББдББ БББаассаБд адсаааБдсс адБддБдссБ 4381 дссББсссаБ даддсадддд адддаддааа сддддаддБд дададддддс дддддссБсс 4441 саддсдББдд дсасБаБсса адддссааса сБдБсададс ададдддадд Бдададссдд 4501 дсаБаддБдс ддааББсБдс асассБддас дддсББсссд ддаБдсБсса дддсБсссас 4561 сссададааБ ддсБсБсаад ББсассБдда адБссаадБд ассадсссад ддаасБсББа 4621 Бсссададаа дддсассасс сББссБдддд аддссБдддд дББддсБддБ сасБддсБда 4681 асаддсссас БсБддсаБса ддсаааасас сБдсссБдБа даддссББдд ссссБдБдсс 4741 ссасдсссБд ссссБсасас БсБдадаБББ аассаББссд ааадБаааса дсааааБада 4801 сБаасБдББс аддддаааад ааассааасс асаддддБса садБдсадсд БаБББассаа 4861 асББдсссса аааБдддБда БсББааБсБс БдададБсад ааБдБааддБ саБааБББдБ 4921 БддБасаБдд сБдБадБдсс дсаБдБББсБ дааББддБББ ББаБББББас аБдаааББББ 4981 дааБсБааБс аддсасБББс сссБаааасБ саБддссБдс аддсБааааа сааадБаддс 5041 сБссБссББс БссББасБББ дасадсБддд сБсааддссБ БдББссБдаа ссБдББсссБ 5101 саБсБсссБс саддасБаБд аддаадБдда БдБдссссаа дБсББаддсд ддсадсаддд 5161 ссадсББсБс сББдасаддБ дддссБаадд аадсБддсББ дБддсадсББ БадссссБдс 5221 сБддсасБдБ сБдсадБсаБ дсдсссасса ссссБсББдс ББссБсБасБ БсадБсадса 5281 ссБдсадаса дсдссаддсс Бддссадада сссасБссаБ дсБсаБдсад ааадассдБд 5341 асББсаддБд БдаББасааа БаадаадБса дддБдаасдс БсаддаБдаа дссБдадБдБ 5401 садсасаддс аадааБссаБ даадБдБдсБ дБддББдББд ааааБдсаБд ааааБсасаБ 5461 сББдсссадс даБааддБсс БсБсБдБсББ ссдсдБаадс садБдаБдас БдаБаададд 5521 БББадсаБББ ссББадссБс асаБаБаБад дБассссБсБ ссасадаааБ дсБдссаадс 5581 ссадддсБсд дассадсББд дадБсассББ саадБааБас саБдсассБд БасдБдсБсс 5641 БддсБсаБдБ дсБсБддддд Бсадааадсс аББсББссса аБдааадБад ссасдаБаБс 5701 Бссссасдаа аадБасасад садБсБдБдс БдасаББсад ааадаасБсБ сддсБдасаа 5761 Баасасасас аадаБаадБс БдддБсБсса БсааасдББа ББББдсБсББ адБдссссББ 5821 БдБдсБссБд ассааБББсБ сБддсББссд дддБсссББс ааБаддсссс адаааассад 5881 БдаддБаада аасадсБдсс ссдддассББ БсаБассаса БББдаасадд дадададада
59411с1сасса§1 са§1§ссса§ §§аа§а§а!а асааса১§ а1а§1§§а§1 §а
"Агонист То11-подобного рецептора" обозначает средство, активирующее член семейства рецепторов ТЕК.
"Глюкопиранозил-липид А", или "гликопиранозил-липид А", или "гликопиранозил-липидный адъювант", или "ОЬА" обозначает новый, находящийся на стадии клинических испытаний, агонист 1о11подобного рецептора-4 (ТЬК-4) человека, описанный в патентной заявке США № 11/862122 и публикации патентной заявки США Νο. 20080131466, содержание которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме.
"ГОС-1005" обозначает смесь 1 мг/мл СЕЛ и 0,2 мг/мл К848 в присутствии стабильной эмульсии скваленовое масло-в-воде, содержащей фосфатидилхолин.
"Липосомальный вектор" обозначает любую композицию, которую можно использовать для доставки средств к клеткам посредством образования липосом, неограничивающим примером которой является липофектамин.
"К848" обозначает соединение имидазохинолина с молекулярной массой 314,17, которое является агонистом ТЕК, активирующим иммуноциты через ТЕК7/ТЕК8 МуБ88-зависимый путь передачи сигнала. К848 обладает следующей формулой: СпН22^О2; и структурой:
"ТБОУ7АХ" обозначает ОУАХ, дополнительно составленную с агонистом ТЕК.
"То11-подобный рецептор (ТБК)" обозначает член семейства белков То11-подобных рецепторов или его фрагмент, узнающий продукт микроорганизмов и/или инициирующий адаптивный иммунный ответ. В одном из вариантов осуществления ТЕК активирует дендритные клетки (ОС).
"То11-подобный рецептор 4 (ТБК4)" обозначает полипептид, обладающий по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с ΝΡ 612564 или его фрагментом и иммуномодулирующей активностью. Последовательность предшественника 1о11-подобного рецептора 4 ΝΡ 612564 представлена ниже:
- 5 030337
1 ттзазг1ад£ Ирата£1зс ντρεενίθρον θννρηί£γρε те1п£ук1рс! п1р£з£кп1с1 61 1з£пр1гк1д 5уз££з£ре1 ρνίάίετεθί дкхейдаудз 1зк1з£И1£ дпр1дз1а1д
121 а£зд1з51дк ΙνενθΕηΙεε 1еп£р1дк1к £1ке1г^а1т Идз£к1реу £εη1£η1θ1ι1 181 сЦззпкхдз! γοΕάΙτνΙΙιρ тр11п1з1с11 з1пртп£1др да£ке1г1кк 1£1гпп£с181 241 г^тк£с1дд1 ερΙθνΓτΙνΙ де£гпедп1е к£йкза1ед1 сп1£1ее£г1 εγίάγγίάάΐ 301 ίά1£ηε1£ην εεΐεΐνενΐί епгкс1£зуп£ дидЫеАпс к£дд£р£1к1 кз1кг1£££з 361 ιΑρρηεΙεθν сПрз1е£1с11 згпд1з£кдс сздзс!£д££з 1ку1с118£пд νίΐΓηεεηΙΙρ 421 1ед1ек1с1£д кзп1кдтзе£ ενίΐεΐτηΐί γΙάίεΙιΕΙιΕΓ νε£ηρί£ηρ1 εείθν^πιερ 481 пз£деп£1рс1 1££е1гп1££ 1сИздсд1ед 1зр£а£пз15 είρνίηπιείιη п££з1с1Е£ру 541 ^Ιηεΐηνίά уз1пк1т£зк кде1дк£рзз 1а£1п1£дпс1 £ас£секдз£ 1ди1кс1дгд1 601 ΙνθνθΓΐΐίθοε £рзс1кддггд^ 1з1п1£сдтп ^ϋρνενίε νίννεννενΐ νγΜγΙΠπιΙ 661 1адс1кудгд θηίγάε£νίγ зздс!ес1иллгп θΐν^ΐθθρν рр£д1с1куг άΐίρρνείεε 721 пИкедЕккз ^νίνννερίτ. £1дзгис1£е уе1ад£ид£1 ззгадИ£^ 1д^ек£11г 781 ςςνθίγτΐΐε гп£у1еиес1з νΙρτΙιίΐΜΤΓ 1гка11с1дкз ипред1^д£д спидеа£з1
"Облегчать" обозначает уменьшать, супрессировать, ослаблять, снижать, блокировать или стабилизировать развитие, или прогрессирование заболевания.
"Аналог" обозначает молекулу, которая не является идентичной, но обладает аналогичными функциональными или структурными свойствами. Например, аналог полипептида сохраняет биологическую активность соответствующего природного полипептида, в то же время обладая определенными биохимическими модификациями, улучшающими функцию аналога по сравнению с природным полипептидом. Такие биохимические модификации могут увеличивать устойчивость аналога к протеазам, проницаемость мембраны или время полужизни, без изменения, например, связывания лиганда. Аналог может содержать неприродную аминокислоту.
В настоящем описании "содержит", "заключающий", "содержащий" и "обладающий" и т.п. могут иметь значение, приписываемое им патентным законодательством США, и могут означать "включает", "включающий", и т.п.; "состоящий в основном из" или "состоит в основном из" сходным образом имеет значение, приписываемое патентным законодательством США, и термин является неограничивающим, позволяя присутствие более того, что перечислено, до тех пор, пока основные или новые характеристики того, что перечислено, не изменяются из-за присутствия более того, что перечислено, но исключает варианты осуществления предшествующей области техники.
"Заболевание" обозначает любое состояние или нарушение, которое нарушает нормальное функционирование клетки, ткани или органа или мешает ему.
"Эффективное количество" обозначает количество, достаточное для индукции или усиления иммунного ответа против неопластической клетки или специфического для антигена опухоли, для уменьшения или стабилизации роста опухоли, для улучшения выживаемости индивида, или для облегчения иным образом симптомов заболевания по сравнению с не подвергавшимся лечению пациентом. Эффективное количество активного соединения(соединений), используемое в практическом осуществлении настоящего изобретения для терапевтического лечения заболевания меняется в зависимости от способа введения, возраста, массы тела и общего состояния здоровья индивида. В конечном счете, лечащий врач или ветеринар принимает решение относительно подходящего количества и режима дозирования. Такое количество обозначают "эффективным" количеством.
"Фрагмент" обозначает часть полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты. Эта часть содержит предпочтительно по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% полной длины эталонной молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида. Фрагмент может содержать 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 нуклеотидов или аминокислот. В одном из вариантов осуществления фрагмент агониста Т1.Р4 содержит по меньшей мере приблизительно 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600 или 700 аминокислот из ЬРЗ или другого агониста ТНК4, что является достаточным для усиления иммунного ответа у индивида.
"Гибридизация" обозначает образование водородных связей, которые могут представлять собой уотсон-криковские, хугстиновские или обращенные хугстиновские водородные связи, между комплементарными нуклеотидными основаниями. Например, аденин и тимин являются комплементарными нуклеотидными основаниями, которые спариваются посредством образования водородных связей.
"Выделенный" обозначает материал, который является свободным до определенных степеней от компонентов, которые в норме сопутствуют ему, как он обнаружен в своем нативном состоянии. "Выделенный" обозначает степень отделения от природного источника или окружения.
"Выделенный полинуклеотид" обозначает нуклеиновую кислоту (например, ДНК), свободную от генов, которые в природном геноме организма, из которого происходит молекула нуклеиновой кислоты по изобретению, фланкируют ген. Термин, таким образом, включает в себя, например, рекомбинантную ДНК, которая встроена в вектор; в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус; или в геномную ДНК прокариоты или эукариоты; или которая существует в виде отдельной молекулы (например, кДНК или фрагмент геномной ДНК или кДНК, полученный посредством ПЦР или расщепления рестрикционными эндонуклеазами), независимо от других последовательностей. Кроме того, термин включает молекулу РНК, транскрибированную с молекулы ДНК, так же как рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительную полипептидную последовательность.
"Выделенный полипептид" обозначает полипептид по изобретению, отделенный от компонентов,
- 6 030337
сопутствующих ему в природе. Как правило, полипептид является выделенным, когда он составляет по меньшей мере 60 мас.%, свободен от белков и природных органических молекул, с которыми он связан в природе. Предпочтительно препарат составляет по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99 мас.% полипептида по изобретению. Выделенный полипептид по изобретению можно получать, например, выделением из природного источника, экспрессией рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей такой полипептид; или химическим синтезом белка. Чистоту можно измерять любым подходящим способом, например хроматографией на колонке, электрофорезом в полиакриламидном геле или посредством анализа НРЬС.
"Микрометастазирование" обозначает форму метастазирования, при которой вторичные опухоли являются слишком малыми для клинической детекции.
"Минимальное остаточное заболевание" обозначает небольшое количество клеток опухолей, которое остается у пациента во время лечения или после лечения.
"Неоплазия" обозначает заболевание, характеризующееся патологической пролиферацией клетки или ткани и ее последующей миграцией или инвазией в другие ткани или органы. Рост неоплазии, как правило, является неконтролируемым и прогрессирующим, и происходит в условиях, которые не стимулируют размножение или вызывают прекращение размножения нормальных клеток. Неоплазии могут поражать множество типов клеток, тканей или органов, включая, но без ограничения, орган, выбранный из группы, состоящей из мочевого пузыря, кости, головного мозга, молочной железы, хряща, пищевода, фаллопиевой трубы, желчного пузыря, сердца, кишечника, почки, печени, легкого, лимфатического узла, нервной ткани, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы, скелетной мускулатуры, кожи, спинного мозга, селезенки, желудка, яичек, тимуса, щитовидной железы, трахеи, мочеполовых путей, мочеточника, мочеиспускательного канала, матки и влагалища, или их ткань или тип клеток. Неоплазии включают злокачественные опухоли, такие как саркомы, карциномы, или плазмацитомы (злокачественные опухоли плазматических клеток).
Неопластические клетки могут осуществлять инвазию окружающей ткани или входить в кровоток или лимфатические узлы из вторичных опухолей или метастазов, на расстоянии от исходной опухоли. Неоплазию, которая метастазировала, более трудно лечить и часто она обладает худшим прогнозом. В зависимости от тяжести неоплазии (т.е. размера и инвазивности опухоли), приписывают номер стадии I, II, III или IV. Неоплазии стадии I находятся на самой ранней стадии и обладают наилучшим прогнозом. Неоплазии стадии II, как правило, включают более крупные опухоли и связаны с несколько худшим прогнозом. Неоплазии стадий III и IV распространены за пределы участка их возникновения и обладают наихудшим прогнозом.
Как используют в настоящем документе, "получение", как в "получении средства", включает синтез, закупку или получение средства другим образом.
Как используют в настоящем документе, "рекомбинантный" включает ссылку на полипептид, полученный с использованием клеток, экспрессирующих гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид. Клетки продуцируют рекомбинантный полипептид, поскольку их генетически изменяют посредством вставки подходящей выделенной последовательности нуклеиновой кислоты. Термин включает также ссылку на клетку, или нуклеиновую кислоту, или вектор, модифицированные введением гетерологичной нуклеиновой кислоты или изменением природной нуклеиновой кислоты до формы, не являющейся нативной для клетки, или ссылку на то, что клетка получена из модифицированной таким образом клетки. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не обнаружены в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, экспрессируют мутанты генов, обнаруженных в нативной форме, или экспрессируют нативные гены, которые иным образом аномально экспрессируются, обладают сниженной экспрессией или вообще не экспрессируются.
"Снижает" обозначает негативную регуляцию по меньшей мере на 10, 25, 50, 75 или 100%.
"Эталонный" обозначает стандартное или контрольное состояние.
"Эталонная последовательность" представляет собой определенную последовательность, используемую в качестве основы для сравнения последовательностей. Эталонная последовательность может представлять собой часть или целое из указанной последовательности; например фрагмент полноразмерной кДНК или последовательности гена или полную последовательность кДНК или гена. Для полипептидов длина эталонной полипептидной последовательности, как правило, может составлять по меньшей мере приблизительно 16 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 25 аминокислот и даже более предпочтительно приблизительно 35 аминокислот, приблизительно 50 или приблизительно 100 аминокислот. Для нуклеиновых кислот длина эталонной последовательности нуклеиновой кислоты, как правило, может составлять по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 60 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75 нуклеотидов и даже более предпочтительно приблизительно 100 или приблизительно 300 нуклеотидов или любое целое число поблизости или между ними.
"Специфически связывает" обозначает соединение или антитело, которое распознает и связывает полипептид по изобретению, но которое, по существу, не распознает и не связывает другие молекулы в
- 7 030337
образце, например в биологическом образце, который естественным образом содержит полипептид по изобретению.
Молекулы нуклеиновой кислоты, пригодные в способах по изобретению, включают любую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по изобретению или его фрагмент. Такие молекулы нуклеиновой кислоты не обязательно являются на 100% идентичными эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты, но, как правило, обладают существенной идентичностью. Полинуклеотиды, обладающие "существенной идентичностью" с эндогенной последовательностью, как правило, способны гибридизоваться по меньшей мере с одной цепью двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты. Молекулы нуклеиновой кислоты, пригодные для способов по изобретению, включают любую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по изобретению или его фрагмент. Такие молекулы нуклеиновой кислоты не обязательно являются на 100% идентичными эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты, но, как правило, обладают существенной идентичностью. Полинуклеотиды, обладающие "существенной идентичностью" с эндогенной последовательностью, как правило, способны гибридизоваться по меньшей мере с одной цепью двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты. Под "гибридизацией" понимают спаривание с формированием двухцепочечной молекулы между комплементарными полинуклеотидными последовательностями (например, гена, описанного в настоящем документе), или его фрагмента, в условиях различной жесткости (см., например, ναΙΤ О.М. апб З.Ь. Вегдег (1987) Мебюбк Еп/уто1. 152:399; Кттте1, Л.К. (1987) Мебюбк Еп/уто1. 152:507).
"В основном идентичный" обозначает полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью с эталонной аминокислотной последовательностью (например, с любой из аминокислотных последовательностей, описанных в настоящем документе) или с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты (например, с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты, описанных в настоящем документе). Предпочтительно такая последовательность является по меньшей мере на 60%, более предпочтительно на 80 или 85% и более предпочтительно на 90, 95 или даже 99% идентичной на уровне аминокислот или на уровне нуклеиновой кислоты с последовательностью, используемой для сравнения.
Идентичность последовательности, как правило, измеряют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей (например, пакета программного обеспечения для анализа последовательностей Сепебск СотрЩег Огоир, Итуегкйу оГ Χνίκεοηκίη Вю1есйио1о§у СеШег, 1710 Итуегкйу Луепие. Мабкоп, νίκ. 53705, программы ВЬАЗТ, ВЕ8ТРГТ, САР или Р1ЬЕиР/РРЕТТУВОХ). Такое программное обеспечение подбирает совпадения идентичных или сходных последовательностей посредством оценки степеней гомологии с различными заменами, делециями и/или другими модификациями. Консервативные замены, как правило, включают замены в пределах следующих групп: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин и фенилаланин, тирозин. В иллюстративном способе определения степени идентичности, можно использовать программу ВЬАЗТ, с уровнем значимости между е-3 и е-100, что указывает на близко родственную последовательность.
"Индивид" обозначает млекопитающего, включая, но без ограничения, человека или не относящееся к человеку млекопитающее, такое как бычьи, лошадиные, собачьи, овечьи или кошачьи.
"Опухоль", как используют в настоящем документе, относится к любому росту и пролиферации неопластических клеток, злокачественных или доброкачественных, и ко всем предзлокачественным и злокачественным клеткам и тканям.
Диапазоны, представленные в настоящем документе, понимают как сокращение для всех значений в пределах диапазона. Например, диапазон от 1 до 50 понимают как включающий любое число, комбинацию чисел или подгруппу из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50.
Как используется в настоящем документе, термины "лечить", лечение", "обработка" и т.п. относятся к уменьшению или облегчению нарушения и/или связанных с ним симптомов. Следует понимать, что, хотя это и не исключено, лечение нарушения или состояния не требует того, чтобы нарушение, состояние или ассоциированные с ними симптомы были полностью устранены.
Если конкретно не указано иначе или не очевидно из контекста, как применяют в настоящем документе, термин "или" понимают как охватывающий.
Если конкретно не указано иначе или не очевидно из контекста, как применяют в настоящем документе, термин "приблизительно" понимают как лежащий в пределах диапазона нормального допуска в данной области, например в пределах 2 стандартных отклонений от среднего. Приблизительно можно понимать как в пределах 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05 или 0,01% от указанного значения. Если из контекста явно не следует иного, все числовые значения, представленные в настоящем документе, дополнены термином приблизительно.
Перечисление списка химических групп в любом определении варианта в настоящем документе включает определения этих вариантов как любой отдельной группы или комбинации перечисленных групп. Перечисление вариантов осуществления варианта или аспекта в настоящем документе включает
- 8 030337
этот вариант осуществления как любой отдельный вариант осуществления или в сочетании с любыми другими вариантами осуществления или их частями.
Любые композиции или способы, представленные в настоящем документе, можно комбинировать с одним или несколькими из других композиций и способов, представленных в настоящем документе.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана доставка агониста ТЬК.4 в ОУАХ. Фиг. 1 представляет собой набор графиков РАС8, показывающих доставку агонистов ТЬК.4 в ОУАХ. Для оптимизации поглощения ЬР§ клетками вакцины ОУАХ концентрации липофектамина и конъюгата ΡΡδ-ΒΟΌΙΡΥ с флуорофором меняли, как указано. Клетки промывали 5 раз перед анализом проточной цитометрией. ЬР§ не поддавался детекции в конечном смыве с использованием анализа РАЬ до менее 0,125 ЕЭ/мл. Оптимальная адсорбция присутствовала через 6 ч инкубации с 40 мкг/мл липофектамина и 25 мкг/мл ЬР§ на 1х105 клеток. Эти условия использовали для количественного определения ЬР§ на основе клеток.
На фиг. 2А, 2Β и 2С показано, что ТЕОУАХ может индуцировать противоопухолевый ответ ίη νΐνο. Мышей С57ВЬ/6 после инокуляции Β16 (фиг. 2А), С3Н после инокуляции §ССРУП/8Р (фиг. 2В) и Ва1Ь/с после инокуляции СТ26 (фиг. 2С) обрабатывали соответствующим РВ§, ОУАХ или ТЕОУАХ перитуморально, как правило, с 3-5 суток после инъекции опухоли. Прогрессирование опухолей ίη νΐνο в группе ТЕОУАХ во всех исследованных моделях на мышах было статистически более медленным, чем прогрессирование в группе ОУАХ. Для моделей В16 и §ССРУП/8Р не присутствовало различий между обработанной ОУАХ группой и обработанной РВ§ группой. В модели СТ26 40-60% мышей в группе ТЕОУАХ испытывали регрессию доступных для пальпирования опухолей до не поддающегося детекции уровня на сутки 18. Для эквимолярного ЬР§, составленного в клетках 293Т, также не обнаружено различий в скорости роста по сравнению с обработанными контрольными мышами. Мышей, для которых показали регрессию опухолей, повторно заражали опухолью СТ26 (2х106) и не обнаружили роста опухолей. Во всех трех моделях на мышах сниженная скорость роста опухолей коррелировала с улучшенной выживаемостью для мышей в группе ТЕОУАХ по сравнению с мышами в группе ОУАХ.
На фиг. 3 показано, что улучшенный противоопухолевый ответ ίη νΐνο, обнаруженный для ТЕОУАХ, является зависимым от МуЭ88. С использованием модели В16 проводили определение скорости роста ίη νΐνο на нуль-мышах МуЭ88 с обработкой вакциной, проводимой внутри опухоли через 3-5 суток после инокуляции опухоли. Противоопухолевый ответ в обработанной ТЕОУАХ группе исчезал у нульмышей МуЭ88.
На фиг. 4А и 4В показано, что обработка ТЕОУАХ увеличивает инфильтрацию лимфоцитарных и антигенпредставляющих клеток в микроокружение опухоли. Фиг. 4А представляет собой набор микрофотографий иммуногистохимического окрашивания СЭ4+. СЭ8+. СЭ86+ и СЭ45+ клеток в опухоли СТ26 после контрольной обработки, обработки ОУАХ или ТЕОУАХ. Желтые клетки представляют совместно локализованное окрашивание СЭ4 или СЭ8 с СЭ45 на первых двух панелях. Третья панель представляет окрашивание одним конъюгатом СЭ86. Проводили формальное количественное определение этих клеток в 10 случайно выбранных полях на срез при 40Х увеличении. Фиг. 4В представляет собой графическое представление количественных данных, полученных посредством иммуногистохимии. Внутри опухоли после обработки ОУАХ или ТЕОУАХ, для каждых из количественно оцененных клеток СЭ4, СЭ8, СЭ86 и СЭ45 существовали статистические различия между двумя группами (Р<0,01).
На фиг. 5 показано, что обработка ТЕОУАХ увеличивает количество активированных дендритных клеток (ОС) дренирующих лимфатических узлов (ΌΡΝ). Несущих опухоль СТ26 мышей Ва1Ь/с обрабатывали РВ§ (не показано), ОУАХ или ТЕОУАХ перитуморально через 3 суток после инъекции опухоли. ОС выделяли из ΌΡΝ через 5-7 суток после обработки. Отбирали клетки В220+СО11с+, и окрашивание СЭ86, МНСС11 и СЭ80 анализировали, как показано. Для ТЕОУАХ присутствовало увеличенное количество СО86+МНСП+, так же как СЭ80+МНС11+ЭС в ΌΡΝ по сравнению с группой, обработанной ОУАХ.
На фиг. 6А и 6В показано, что обработка ТЕОУАХ увеличивает количеств опухолеспецифических СЭ8+ Т-клеток. Несущих СТ26 мышей Ва1Ь/с обрабатывали РВ§, ОУАХ или ТЕОУАХ перитуморально. Через 3 суток и 5 суток СЭ8+ клетки выделяли и очищали из селезенки и лимфатических узлов. Анализы ЕЬТЗРОТ проводили с использованием клеток 4Т1 в качестве АРС, и измеряли уровни пептида АН1 и ΙΡΝ. Фиг. 6А представляет собой график количества специфических для АН1 продуцирующих ΙΡΝ Тклеток, которое было статистически большим в группе ТЕОУАХ по сравнению с группой ОУАХ как в селезенке, так и в дренирующих ΡΝ (Р<0,01). Фиг. 6В представляет собой график специфического для АН1 уничтожения посредством СТЬ. Анализы СТЬ ίη νΐνο использовали для измерения процента уничтожения для специфических для АН1 СТЬ у несущих опухоль СТ26 мышей, обработанных в присутствии или в отсутствие ТЕОУАХ. Проводили совместную инъекцию -да1, меченных низким уровнем СР8Е, и АН1, меченных высоким уровнем СР8Е, клеток в группах наивных, несущих опухоль или несущих опухоль, обработанных ТЕОУАХ. Средняя величина специфического лизиса опухолей являлась более высокой в группе ТЕОУАХ по сравнению с необработанными группами (Р<0,07).
На фиг. 7 показано, что ОУАХ с эквимолярным ЬР§, инъецированные по отдельности без составления, не индуцируют противоопухолевый ответ. Несущих В16 мышей обрабатывали перитуморально
- 9 030337
ОУЛХ, ЬР§ или смесью ЬР§ и СУАХ без липосомного состава. Эквимолярные количества ЬР§, как использовали на фиг. 2, инъецировали перитуморально в этих экспериментах.
На фиг. 8 показано, что ТЕСУЛХ может также индуцировать системный противоопухолевый ответ. С использованием модели опухоли В16 мышей обрабатывали ТЕСУЛХ перитуморально или ТЕСУЛХ инъецировали в контралатеральную конечность от участка инокуляции опухоли. Для обеих групп ТЕСУАХ показана сходная скорость роста опухоли ίη νΐνο.
Фиг. 9 представляет собой график, показывающий, что комбинация СУ АХ, К.848 и СЬА предотвращала рост клеток опухоли меланомы. СVАX и ее составы с различными агонистами ТЬК. инъецировали через 3 суток после инокуляции опухоли В16. Опухоль не являлась доступной для пальпирования на время обработок вакцинами. Следили за относительной скоростью роста опухоли в каждой группе. Для опухоли В16, обработанной СУАХ, СЬА и К848, первоначально отметили меньший рост опухоли, чем в других группах, и у некоторых из этих мышей произошла регрессия этих опухолей.
Фиг. 10 представляет собой график, показывающий, что агонист ТЬК усиливал уменьшение посредством СУАХ скорости роста опухоли для прижившейся опухоли В16. Клетки опухоли В16 инъецировали в подушечку стопы, и как только опухоль становилась доступной для пальпирования, мышей обрабатывали вакцинными составами, как указано на чертеже. Вакцины инъецировали в контралатеральную конечность.
На фиг. 11 представлено несколько панелей, показывающих результаты анализа ЕЫ8РОТ и анализа СТЬ ίη νΐνο, показывающих, что мыши после обработки СУАХ/СЬА/К848 обладали наиболее высоким количеством р15Е-специфических Т-клеток, и что этот результат коррелировал со скоростью роста опухоли ίη νΐνο. Мышей, обработанных вакцинными составами, собирали через 1-2 недели после обработки, и в их селезенках анализировали опухолеспецифические Т-клетки.
На фиг. 12 представлены две панели, показывающие, что мыши после обработки СУАХ/СЬА/К848 обладали значительно усиленными активированными дендритными клетками.
На фиг. 13 представлен анализ РАС8, показывающий, что мыши после обработки СУАХ/СЬА/К848 обладали статистически значимым количеством С.Н11е+ клеток, экспрессирующих 11-12.
Фиг. 14 представляет собой график, показывающий эффекты различных составов СУАХ/СЬА/К848 на прижившиеся опухоли В16. ГОС-1005 представляет собой СЬА/К848 в присутствии носителя, содержащего стабильную эмульсию скваленовое масло-в-воде, содержащую фосфатидилхолин.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим неопластические клетки, экспрессирующие цитокин (СМ-С8Р), составленные по меньшей мере с одним агонистом ТЬК, и к способам использования композиции для индукции или усиления иммунного ответа.
Изобретение основано, по меньшей мере, частично на открытии, что добавление агонистов ТЬК к вакцине на основе клеток опухоли увеличивало эффективность вакцины посредством преодоления механизмов ускользания от иммунного ответа хозяина, присутствующих в ткани опухоли. В частности, как более подробно описано ниже, получена секретирующая сингенный СМ-С8Р вакцина из цельных клеток опухолей (СУАХ) с агонистом ТЬК4 (ТЕСУАХ для усиленной ТЬК СУАХ). Эффективность этой вакцины тестировали в трех различных терапевтических моделях на мышах, включая модель на мышах слабо иммуногенной меланомы В16. Иммуногистохимию, анализ проточной цитометрии, ЕЫ8РОТ и анализ СТЬ ίη νΐνο использовали для оценки как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа против ткани опухоли. Внутриопухолевое и системное введение ТЕСУАХ приводило к увеличенному противоопухолевому ответу ίη νΐνο по сравнению с одной СУАХ. Улучшенная противоопухолевая эффективность ТЕСУАХ не присутствовала у мышей МуИ88-/- с нарушением передачи сигнала ТЬК. В модели СТ26 на мышах у мышей Ва1Ь/с, для 40-60% мышей показали регрессию трансплантированной опухоли. При повторном заражении клетками опухоли СТ26, показали, что эти мыши являлись иммунизированными против опухоли. Для обработанных ТЕСУАХ опухолей показали увеличение количества инфильтрирующих СИ4 и СИ8 Т-клеток, так же как увеличенное количество СИ86+ клеток в ткани опухоли. Дренирующие лимфатические узлы от обработанных ТЕСУАХ мышей обладали увеличенным количеством активированных СИ86+МНСП+ и СИ80+МНСП+ дендритных клеток по сравнению с группой, обработанной СУАХ и группой с ложной обработкой. Анализ ЕЫ8РОТ, так же как анализ СТЬ ίη νΐνο показали увеличенное количество СТЬ, специфических для антигена опухоли АН1 у мышей, обработанных ТЕСУАХ. Вакцину на основе клеток можно составлять с агонистом ТЬК с улучшенным противоопухолевым ответом ίη νΐνο.
Агонисты ТЬК усиливают противоопухолевые иммунные ответы.
Во многих клинических исследованиях показано, что использование вакцин из клеток опухолей в качестве источника несмещенной выборки антигенов опухоли, является безопасным. Однако клиническая эффективность этого способа являлась ограниченной его умеренной повышающей регуляцией активированных антигенпредставляющих клеток, которые могут сдвигать ответ Т-клеток к противоопухолевому цитотоксическому ответу. В контексте инфекции, показано, что агонисты ТЬК придают активации дендритных клеток иммуногенность, в то время как отсутствие передачи сигнала ТЬК4 может приводить к толерантности (14). В1анбсг и Мсб/ΗίΙον показали, что фагоцитированные антигены микроорганизмов
- 10 030337
могут быть более эффективно представленными в присутствии ЬР§(17). В отсутствие передачи сигнала ТЬК4 в содержащей антиген фаголизосоме, комплексы пептид-МНС класса II неэффективно представлены на клеточной поверхности ОС. Значение этих исследований в том, что локализованная стимуляция ТЬК4 может усиливать противоопухолевый ответ при введении в качестве части комбинированной вакцины.
Одним из опасений при использовании каких-либо агонистов ТЬК является их токсичность, поскольку физиологическим лигандом для ТЬК4 является ЬР§, макромолекула, ответственная за сепсис. Активность ЬР§ агониста ТЬК4 выделена до липидного А компонента ЬР§, и различные формы нетоксичного липида А вводили пациентам со злокачественными опухолями (18). Другие авторы использовали ЬР§ в супрапирогенных дозах внутрикожно для пациентов со злокачественными опухолями без каких-либо свидетельств сепсиса и анафилаксии (19). Другим опасением является то, что рецепторы ТЬК4, экспрессированные на клетках опухолей, могут стимулировать канцерогенез (20).
Вакцина СУ АХ, содержащая генетически модифицированные клетки опухолей, экспрессирующие иммуномодулирующий цитокин СМ-С8Р, в настоящее время подвергают клиническим исследованиям для меланомы, рака молочной железы, поджелудочной железы и толстого кишечника. Как опубликовано в настоящем документе, комбинированная стимуляция ТЬК, местно-регионарная с СУАХ, может значительно усиливать иммуногенность вакцины СУАХ. Для минимизации проканцерогенной стимуляции ТЬК4 и для минимизации системной стимуляции ТЬК4, ЬР§ и другие агонисты ТЬК составляли в клетках СУАХ, и для этой новой комбинированной вакцины показали противоопухолевую эффективность в нескольких моделях на мышах.
Соответственно изобретение относится к терапевтическим композициям, содержащим агонист ТЬК, содержащим вакцины на основе неопластических клеток, и к способам использования таких вакцин на основе клеток для профилактики, уменьшения или прекращения инвазивности неопластических клеток (например, клеток рака молочной железы и меланомы) или для лечения иным образом неоплазии или ее симптома.
В одном конкретном варианте осуществления, изобретение относится к вакцине из аутологичных клеток злокачественных опухолей, состоящей из специфических для пациента клеток злокачественных опухолей, генетически модифицированных для секреции гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (СМ-С8Р), и дополнительно составленной, чтобы содержать агонист 1о11подобного рецептора. СМ-С8Р модулирует пролиферацию и дифференцировку множества гематопоэтических клеток-предшественников с некоторой специфичностью для стимуляции продукции лейкоцитов и может обращать индуцированные лечением нейтропении. Это средство стимулирует также представление антигена, обладает повышающей регуляцией антителозависимой клеточной цитотоксичности (АИСС), и увеличивает опосредованную интерлейкином-2 функцию активированных лимфокинами клеток-киллеров и может усиливать иммунитет хозяина против опухоли. Агонисты ТЬК действуют как адъюванты и увеличивают эффективность вакцины. Вакцины на основе клеток опухолей, составленные с агонистами ТЬК, увеличивали количество активированных местно-регионарных дендритных клеток, так же как увеличивали опухолеспецифический ответ СТЬ. Для безопасности клетки облучают перед вакцинацией.
Иммуногенные композиции.
Иммуногенные композиции по изобретению, включая противораковые вакцины, являются пригодными в качестве терапевтических и профилактических средств для лечения специфических типов опухолей. Преимущественно эти вакцины можно корректировать для лечения злокачественных опухолей конкретных индивидуумов, посредством получения вакцин, нацеленных на специфические антигены опухолей, экспрессирующиеся на опухоли у индивида. Вакцины по изобретению, как правило, содержат инактивированные клетки опухолей или клетки, экспрессирующие антигены опухолей, генетически модифицированные для экспрессии СМ-С8Р, где клетки дополнительно содержат агонист ТЬК4 или его фрагмент. Клетки по изобретению индуцируют для поглощения агониста ТЬК.4 посредством приведения их в контакт с агонистом ТЬК4 в сочетании с липофектамином или другими липосомальными носителями, например масляно/водной эмульсией липофильных молекул, с чем-либо, что может солюбилизировать эту липофильную молекулу, нецитотоксического, пассивного поглощения. Без намерения быть связанными теорией, агонист ТЬК или его биологически активный фрагмент приводят в контакт с липосомой в условиях, подходящих для формирования содержащих агонист ТЬК мицелл. Мицеллы неспецифически поглощаются экспрессирующими СМ-С8Р клетками опухолей, и эту составленную с агонистом ТЬК клеточную вакцину можно использовать для стимуляции иммунной системы индивида. В других вариантах осуществления, агонисты ТЬК поглощаются клетками в присутствии носителя. Одним из неограничивающих примеров пригодного носителя является стабильная эмульсия скваленовое масло-в-воде (например, эмульсия 10 мас.% масло-в-воде), содержащая фосфатидилхолин. Иммунная система отвечает на эту стимуляцию образованием иммунореактивных клеток, нацеленных на неоплазию. В конкретных вариантах осуществления, противораковые вакцины по изобретению желательно нацелены на не поддающиеся детекции клетки опухолей, такие как при микрометастазировании или остаточном заболевании, таким образом предотвращая рецидивы неоплазии. В отличие от вакцин против других заболеваний,
- 11 030337
предотвращающих возникновение заболевания, противораковые вакцины, как правило, вводят после идентификации индивида как страдающего неоплазией.
Вакцины из неопластических клеток получают с использованием клеточных композиций по изобретению, полученных, как описано в настоящем документе. Клетки делают некомпетентными по пролиферации и инъецируют пациенту, где инициированные опухолью антигены клеток стимулируют иммунный ответ. Желательно нацеливание иммунной системы на небольшую популяцию клеток злокачественных опухолей, несущих один или несколько антигенов, экспонированных на летально облученных клетках.
Экспрессия рекомбинантного полипептида.
Изобретение относится к клеткам, генетически модифицированным для экспрессии рекомбинантного полипептида ОМ-СЗР. Полипептиды ОМ-СЗР по изобретению получают с использованием практически любого способа, известного в научном сообществе. Как правило, рекомбинантные полипептиды получают посредством трансформации подходящей клетки-хозяина (например, клетки, происходящей из опухоли или из линии неопластических клеток) с помощью всей или части кодирующей полипептид ОМ-СЗР молекулы нуклеиновой кислоты или ее фрагмента в подходящем векторе экспрессии. Такие молекулы нуклеиновой кислоты можно доставлять в клетки, полученные от индивида, страдающего неоплазией, или в линию неопластических клеток ίη νίίτο. Молекулы нуклеиновой кислоты необходимо доставлять в клетки индивида в форме, в которой их можно поглощать, так что можно продуцировать терапевтически эффективные уровни белка ОМ-СЗР или его фрагмента.
Трансдукцию вирусных (например, ретровирусных, аденовирусных и аденоассоциированных вирусных) векторов можно использовать для доставки генов, особенно благодаря их высокой эффективности инфекции и стабильной интеграции и экспрессии (см., например, Сауоиейе с( а1., Нитап Оепе ТЬегару 8:423-430, 1997; Κίάο еί а1., Сиггеп: Еуе РехеагсЬ 15:833-844, 1996; В1оотег еί а1., 1оита1 о£ Уио1оду 71:6641-6649, 1997; №йййи еί а1., Зс1епсе 272:263-267, 1996 и М1уо8Ы еί а1., Ргос. №Й. Асай. Зс1. и.З.А. 94:10319, 1997). Например, полинуклеотид, кодирующий белок ОМ-СЗР, его вариант или фрагмент, можно клонировать в ретровирусный вектор, и экспрессией можно управлять с его эндогенного промотора, с ретровирусного длинного концевого повтора или с промотора, специфического для интересующего типа клеток-мишеней. Другие вирусные векторы, которые можно использовать, включают, например, вирус осповакцины, вирус папилломы крупного рогатого скота или вирус герпеса, такой как вирус Эпштейна-Барр (см. также, например, векторы из МШег, Нитап Оепе ТЬегару 15-14, 1990; Рпейтап, Заепсе 244:1275-1281, 1989; Ε§1ί:ίδ еί а1., ВюТесЬпкщех 6:608-614, 1988; ^ΗΦδ^ν еί а1., Сипей Оршюп ш Вю:есйпо1оду 1:55-61, 1990; ЗЬагр, ТЬе Ьапсе: 337:1277-1278, 1991; Согпейа е: а1., №с1ею Аай РехеагсЬ апй Мо1еси1аг Вю1оду 36:311-322, 1987; Апйегеоп, Заепсе 226:401-409, 1984; Моеп, В1оой Се11з 17:407-416, 1991; МШег е: а1., Вю:есЬпо1оду 7:980-990, 1989; Ье Оа1 Ьа За11е е: а1., Заепсе 259:988-990, 1993; и 1оЬп8оп, СЬе5( 107:77З-83З, 1995). Ретровирусные векторы являются особенно хорошо разработанными, и их использовали в клинических условиях (РохепЪегд е( а1., N. Еп§1. ί. Мей 323:370, 1990; Апйегхоп е( а1., Патент США №. 5399346). Наиболее предпочтительно вирусный вектор используют для введения полинуклеотида ОМ-СЗР в клетку по изобретению до, во время или после доставки агониста ТЬК4 в клетку.
Безвирусные способы также можно использовать для введения вектора, кодирующего ОМ-СЗР, в клетку, полученную от пациента, страдающего неоплазией, или происходящую из линии неопластических клеток. Например, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ОМ-СЗР, можно вводить в клетку посредством введения молекулы нуклеиновой кислоты в присутствии липофекции (Ре1дпег е( а1., Ргос. №Й. Асай. За. и.З.А. 84:7413, 1987; Опо е: а1., №иго8аепсе Ьейеге 17:259, 1990; ВйдЬат е: а1., Ат. ί. Мей. За. 298:278, 1989; ЗйиЪшдег е: а1., МеШоЙ8 ш Еп/уто1оду 101:512, 1983), асиалоорозомукоидполилизиновой конъюгации (Щи е: а1., 1оита1 о£ Вю1ощса1 СЬет18йу 263:14621, 1988; Щи е: а1., 1оита1 о£ Вю1ощса1 СЬет18йу 264:16985, 1989) или посредством микроинъекции в условиях хирургической операции (Що1££ е: а1., Заепсе 247:1465, 1990). Предпочтительно нуклеиновые кислоты вводят в сочетании с липосомами и протамином. Клетки можно обрабатывать липофектамином в сочетании с агонистом ТЬК4 во время, до или после трансфекции кодирующим ОМ-СЗР вектором.
Способы осуществления трансфекции ш νίίΐΌ включают использование фосфата кальция, ЭЕЛЕ декстрана, электропорации и слияния протопластов. Липосомы также могут быть потенциально преимущественными для доставки ДНК в клетку.
Экспрессией кДНК для использования в способах по изобретению можно управлять с любого подходящего промотора (например, с промоторов цитомегаловируса (СМУ) человека, вируса обезьяны 40 (ЗУ40), или металлотионеина), и регулировать ее посредством любого подходящего регуляторного элемента млекопитающих. Например, если желательно, энхансеры, известные как предпочтительно управляющие экспрессией гена в конкретных типах клеток, можно использовать для управления экспрессией нуклеиновой кислоты. Используемые энхансеры могут включать, без ограничения, энхансеры, охарактеризованные как тканеспецифические или клеточноспецифические энхансеры. Альтернативно, если геномный клон используют в качестве терапевтической конструкции, регуляцию можно опосредовать родственными регуляторными последовательностями или, если желательно, регуляторными последовательностями, происходящими из гетерологичного источника, включая любой из промоторов или регулятор- 12 030337
ных элементов, описанных выше.
Другой способ терапии, включенный в изобретение, включает введение рекомбинантного терапевтического средства, такого как клетка, секретирующая рекомбинантный белок СМ-С8Р, его вариант или фрагмент, либо непосредственно в участке потенциально или фактичесики пораженной заболеванием ткани (например, интертуморально, перитуморально) или системно (например, посредством любого общепринятого способа введения рекомбинантного белка). Доза вводимых клеток, экспрессирующих белок СМ-С8Р, зависит от ряда факторов, включая массу и состояние здоровья индивидуального пациента. Для каждого конкретного индивида, конкретные режимы дозирования необходимо регулировать с течением времени в соответствии с индивидуальной необходимостью и профессиональным суждением лица, вводящего композиции или руководящего введением композиции.
Аутологичные клетки.
Использование аутологичных генетически модифицированных клеток, экспрессирующих цитокин, например СМ-САР. и содержащих антиген ТЬК4, обеспечивает преимущества, поскольку опухоль каждого пациента экспрессирует уникальный набор антигенов опухолей, которые могут отличаться от антигенов, обнаруженных на гистологически сходных, совпадающих по МНС клетках опухолей от другого пациента; см., например, Каиакат! е! а1., I. 1ттипо1., 148, 638-643 (1992); Эаггслу е! а1., 1. 1ттипо1., 142, 3329-3335 (1989); и Нот е! а1., 1. 1ттипо1кег., 10, 153-164 (1991). В отличие от этого, совпадающие по МНС клетки опухолей обеспечивают то преимущество, что нет необходимости подвергать пациента хирургической операции для получения образца его опухоли для получения генетически модифицированных клеток опухоли.
В одном из вариантов осуществления способ лечения индивида, страдающего неоплазией, включает получение клеток опухоли от индивида; контакт клеток с вектором экспрессии, кодирующим СМ-САР; приведение в контакт клеток с агонистом ТЬК в условиях, обеспечивающих фагоцитоз или иным образом поглощение клеткой агониста ТЬК; придание клеткам некомпетентности по пролиферации (например, посредством облучения клеток) и введение клеток индивиду, от которого они были получены. Предпочтительно композицию вводят внутрикожно, подкожно или внутрь опухоли индивиду - млекопитающему.
В некоторых случаях отдельная аутологичная клетка опухоли может экспрессировать только СМСАР или СМ-С8Р в сочетании с одним или несколькими опухолеассоциированными антигенами. В других случаях, СМ-САР и один или несколько опухолеассоциированных антигенов могут экспрессировать различные аутологичные клетки опухолей. В одном аспекте по изобретению, аутологичную клетку опухоли модифицируют введением вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую СМ-С8Р, функционально связанную с промотором и экспрессирующими/контрольными последовательностями, необходимыми для ее экспрессии. В другом аспекте ту же самую аутологичную клетку опухоли или вторую аутологичную клетку опухоли можно модифицировать введением вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или несколько опухолеассоциированных антигенов, функционально связанную с промотором и экспрессирующими/контрольными последовательностями, необходимыми для ее экспрессии. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или несколько опухолеассоциированных антигенов, можно вводить в одну и ту же или в другую аутологичную клетку опухоли с использованием того же самого или другого вектора. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая один или несколько опухолеассоциированных антигенов, может дополнительно содержать или не содержать последовательность селективного маркера, функционально связанную с промотором. Желательно, чтобы аутологичная клетка опухоли экспрессировала высокие уровни СМ-САР и/или одного или нескольких ассоциированных с опухолями предстательной железы антигенов.
Аллогенные клетки.
В одном из вариантов осуществления генетически модифицированные аллогенные клетки, содержащие агонист ТЬК.4 (например, содержащие агонисты ТЬК в ассоциации с липосомальным носителем), могут усиливать иммуногенность опухоли. Как применяют в настоящем документе, "линия неопластических клеток" содержит клетки, первоначально полученные из опухоли или другой неопластической клетки. Такие клетки, как правило, обладают неопределенно долгим ростом в культуре. В одном из аспектов способ усиления иммунного ответа индивида включает в себя (а) получение линии неопластических клеток; (Ь) генетическую модификацию линии клеток для придания клеткам способности продуцировать увеличенный уровень цитокина, например СМ-САР; (с) приведение в контакт клеток с агонистами ТЬК в таких условиях, что клетки поглощают агонист; (б) придание модифицированной линии неопластических клеток некомпетентности по пролиферации и (е) введение линии неопластических клеток индивиду, страдающему неоплазией или обладающему предрасположенностью к развитию неоплазии того же типа, как тот, из которого получена линия неопластических клеток. В некоторых вариантах осуществления вводимые клетки являются аллогенными и являются или не являются совпадающими по МНС с индивидом. Такие аллогенные линии обеспечивают то преимущество, что их можно получать заранее, характеризовать, аликвотировать во флаконы, содержащие известное количество агониста ТЬК4, и продуцируя сравнимое количество цитокина, сохранять (т.е. замораживать), так что хорошо охарактеризо- 13 030337
ванные клетки доступны для введения индивиду. Способы получения генетически модифицированных аллогенных клеток описаны, например, в ΥΘ 00/72686, содержание которого конкретно приведено в настоящем документе в качестве ссылки.
Любой подходящий способ введения можно использовать для введения композиции аллогенной линии клеток пациенту, предпочтительно композицию вводят внутрикожно, подкожно или внутрь опухоли.
Агонисты ТЬК.
Любой подходящий агонист ТЬК, или комбинацию агонистов, можно использовать для получения иммуногенной композиции, представленной в настоящем документе, включая: К848, СЬА, бактериальный липопептид, бактериальный липопротеин, бактериальную липотейхоевую кислоту, микобактериальный липогликан, дрожжевой зимозан, порин, вирусную двухцепочечную РНК, липополисахарид, липид А, монофосфориллипид А (МРЬ®), АСР, флагеллин, вирусную одноцепочечную РНК, имидазохинолины, бактериальную ДНК, СрС ДНК, гемозоин, уропатогенные бактерии и профилин простейших. Эти агонисты ТЕК известны в данной области и описаны, например, в Кеей с1 а1., Ттепйз ίη 1ттипо1. 30:23-32, 2008, где, кроме того, приведен обзор адъювантов и носителей. Содержание приведенного выше приведено в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме.
Введение.
Неопластические клетки, которые были генетически модифицированы для экспрессии цитокина (например, СМ-С8Р), и которые содержат агонисты ТЕК, можно криоконсервировать перед введением. Предпочтительно такие клетки обрабатывают, чтобы сделать их неспособными к пролиферации ("некомпетентными по пролиферации"). Наиболее предпочтительно такие клетки делают некомпетентными по пролиферации посредством облучения, которое позволяет некомпетентность по пролиферации, но еще позволяет продукцию СМ-С8Р до окончательной гибели клеток. В одном из вариантов осуществления клетку по изобретению облучают при дозе от приблизительно 50 рад (0,5 Гр) до приблизительно 200 рад (2 Гр)/мин или от приблизительно 120 рад (1,2 Гр) до приблизительно 140 рад (1,4 Гр)/мин перед введением пациенту. Предпочтительно клетки облучают тотальной дозой, достаточной для ингибирования, по существу, у 100% клеток дальнейшей пролиферации. Желательно, чтобы клетки облучали тотальной дозой от приблизительно 10000 рад (100 Гр) до 20000 рад (200 Гр), оптимально приблизительно 15000 рад (150 Гр).
Как правило, более одного введения экспрессирующих цитокин (например, СМ-С8Р) клеток, содержащих агонисты ТЬК, проводят индивиду в курсе лечения. В зависимости от конкретного курса лечения, можно вводить множественные инъекции в одной временной точке с повторением обработки в различные временные интервалы. Например, за исходной или "примирующей" обработкой может следовать одна или несколько "бустер" обработок. Такие "примирующие" и "бустер" обработки, как правило, проводят одним и тем же способом введения и/или приблизительно в одном и том же участке. При введении множественных доз доза при первой иммунизации может быть выше, чем дозы при последующих иммунизациях. Например, за примирующей дозой 5х107-8 может следовать несколько бустер-доз 107-83х107-9 продуцирующих СМ-С8Р и антигены опухоли клеток.
Однократная инъекция генетически модифицированных клеток, содержащих агонисты ТЬК, составляет, как правило, между по меньшей мере приблизительно 105 и 109 клеток, например 1х106, 2х106,
3х106, 4х106, 5х106, 6х106, 7х106, 8х106, 9х106, 1х107
х108, х109 клеток. Количество продуцирую5х107
щих цитокин и антиген опухоли клеток можно регулировать в соответствии, например, с уровнем цитокина и/или антигена опухоли, продуцируемых данной клеточной иммунотерапевтической композицией. В предпочтительных вариантах осуществления модифицированные клетки инъецируют внутримышечно или внутривенно.
В некоторых вариантах осуществления продуцирующие цитокин клетки для клеточной иммунотерапии вводят в дозе, способной продуцировать по меньшей мере 1, 5, 10, 25, 75, 100, 200, 300, 400, 500 нг СМ-С8Р за 24 ч на 1 млн клеток. В некоторых вариантах осуществления иммуногенную композицию по изобретению вводят в дозе, способной продуцировать по меньшей мере 500 нг конкретного антигена опухоли за 24 ч на 1 млн клеток. Определение оптимальных дозы и соотношений клеток является предметом общепринятого определения и находится в пределах компетенции обычного практикующего специалиста в данной области, в свете описания, представленного в настоящем документе.
Клетки по изобретению обрабатывают для удаления большинства дополнительных компонентов, используемых при получении клеток. В частности, удаляют эмбриональную телячью сыворотку, компоненты бычьей сыворотки или другие биологические добавки в культуральную среду. В одном из вариантов осуществления клетки промывают, например, повторяющимся осторожным центрифугированием, в пригодном фармакологически совместимом наполнителе. Совместимые наполнители включают различные среды для культивирования клеток, изотонический солевой раствор, в присутствии или в отсутствие физиологически совместимого буфера, например фосфата или Нерез. и питательных добавок, таких как декстроза, физиологически совместимые ионы или аминокислоты, в частности ионы или аминокислоты, свободные от других иммуногенных компонентов. Композиция для введения ίη νίνο может содержать
- 14 030337
подходящие носители или разбавители, которые дополнительно могут быть фармацевтически приемлемыми. Например, можно использовать несущие реагенты, такие как альбумин и фракции плазмы крови, и неактивные загустители. Способы получения такой композиции описаны в данной области; см., например, РспипдЮп'х Рйагтасеийса1 Зс1еисе8 191Н еййюи, Сеиатго, А. Ей. (1995).
В фармацевтической лекарственной форме иммуногенные композиции, описанные в настоящем документе, можно использовать по отдельности или в подходящей ассоциации так же, как в комбинации, с другими фармацевтически активными соединениями, какие известны в данной области.
Терапевтические лекарственные средства.
Изобретение относится к вакцинам на основе неопластических клеток, которые являются пригодными для лечения неоплазии (например, некомпетентные по пролиферации неопластические клетки, экспрессирующие ОМ-СЗР и содержащие агонист ТЬК4 или его фрагмент). В одном конкретном варианте осуществления иммуногенные композиции по изобретению являются пригодными для индукции или усиления иммунного ответа против антигена, специфического для неоплазии или опухоли. Фраза "усиленный иммунный ответ", как используют в настоящем документе, обозначает, что можно детектировать поддающееся детекции увеличение специфической иммунной активации (например, увеличение ответа В-клеток и/или Т-клеток). Примером усиленного иммунного ответа является увеличение количества антитела, связывающего антиген, которое детектировали на более низком уровне до введения экспрессирующей цитокин-клеточной вакцины по изобретению. Другим примером является увеличенный клеточный иммунный ответ. Клеточный иммунный ответ включает Т-клетки, и его можно наблюдать ίη νίΐτο (например, измерять анализом высвобождения хрома) или ίη νίνο. Усиленный иммунный ответ, как правило, сопровождается увеличением специфической популяции иммуноцитов.
В другом варианте осуществления иммуногенные композиции по изобретению являются пригодными для ингибирования роста неопластических клеток. Фраза "ингибирование неопластического роста" относится к любому поддающемуся измерению уменьшению массы опухоли, объема опухоли, количества клеток опухоли или скорости роста опухоли. Поддающееся измерению уменьшение массы опухоли можно детектировать различными способами, известными специалистам в данной области. Они включают непосредственное измерение доступных опухолей, подсчет клеток опухолей (например, присутствующих в крови), измерения антигенов опухолей (например, специфического антигена предстательной железы (Р8А), альфафетопротеина (АРР) и различные способы визуализации (например, ЯМР, САТсканирование и рентгеновское излучение). Уменьшение скорости роста опухоли, как правило, коррелирует с более длительным временем выживаемости индивида со злокачественной опухолью. В других вариантах осуществления вакцины на основе клеток по изобретению являются подходящими для профилактики или уменьшения роста опухолей и/или стремления неопластических клеток к инвазии в окружающую или к метастазированию иным образом. Для терапевтических применений вакцины, описанные в настоящем документе, можно вводить системно, например составлять в фармацевтически приемлемом буфере, таком как физиологический солевой раствор, или местно. Предпочтительные способы введения включают в себя, например, интертуморальные, перитуморальные, подкожные, внутривенные, внутрибрюшинные, внутримышечные или внутрикожные инъекции, достаточные для индукции или усиления иммунного ответа. Лечение пациентов-людей или других животных можно проводить с использованием терапевтически эффективного количества лекарственного средства, указанного в настоящем документе в физиологически приемлемом носителе. Подходящие носители и их составление описаны, например, в Кетшдои'к РЬагтасеи11са1 Зшеисез Ьу Е.А. Майт. Количество лекарственного средства, подлежащее введению, меняется в зависимости от способа введения, возраста и массы тела пациента, и от клинических симптомов неоплазии. Как правило, количества лежат в диапазоне количеств, используемых для других средств, используемых для лечения других заболеваний, ассоциированных с неоплазией, хотя в конкретных случаях необходимы более низкие количества из-за увеличенной специфичности соединения.
Составление фармацевтических композиций.
Введение вакцин на основе клеток для лечения неоплазии можно проводить любыми подходящими способами, приводящими к такой концентрации вакцин, которая в комбинации с другими компонентами является эффективной для облегчения, уменьшения или стабилизации неоплазии. Вакцина может содержаться в любом подходящем количестве в любом подходящем веществе - носителе, и, как правило, присутствует в количестве 1-95 мас.% от общей массы композиции. Вакцину на основе клеток можно предоставлять в лекарственной форме, подходящей для способа парентерального введения (например, подкожного, внутривенного, внутримышечного или внутрибрюшинного). Предпочтительным способом введения является внутримышечная, внутриопухолевая или внутривенная инфузия. Фармацевтические композиции можно составлять согласно общепринятой фармацевтической практике (см., например, РетшдЮи: ТЬе Зшеисе аий Ргасйсе οί РЬаттасу (201П ей.), ей. А.К. Оеииато, Ырртсой Аййатз & Айктз, 2000 и Еисус1орей1а ок РЬагтасеи11са1 ТесЬио1оду. ей§. ί. 8\уагЬпск аий ЕС. Воу1аи, 1988-1999, Магсе1 Эеккег. Ыете Уогк).
- 15 030337
Парентеральные композиции.
Фармацевтическую композицию, содержащую вакцину на основе клеток, можно вводить парентерально посредством инъекции, инфузии или имплантации (подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутрибрюшинной или т.п.) в лекарственных формах, составах или посредством подходящих устройств для доставки или имплантатов, содержащих общепринятые, нетоксичные фармацевтически приемлемые носители и адъюванты. Составление и получение таких композиций хорошо известны специалистам в данной области фармацевтических составов. Составы можно найти в РеттДоп: Тйе 8с1еисе аиб Ргасйсе о£ Рйаттасу, выше.
Композиции для парентерального использования можно предоставлять в единичных дозированных формах (например, в ампулах с единичными дозами), или во флаконах, которые содержат несколько доз и в которые можно добавлять подходящий консервант (см. ниже). Композиция может находиться в форме раствора, суспензии, эмульсии, устройства для инфузии, или устройства для доставки для имплантации, или ее можно представлять в виде сухого порошка для разведения водой или другим подходящим носителем перед использованием. Помимо активного средства, уменьшающего или облегчающего неоплазию, композиция может включать пригодные приемлемые для парентерального введения носители и/или наполнители. Активное лекарственное средство (средства) можно заключать в микросферы, микрокапсулы, наночастицы, липосомы, или т.п. для контролируемого высвобождения. Более того, композиция может включать суспендирующие, солюбилизирующие, стабилизирующие, регулирующие рН средства, регулирующие тоничность средства и/или диспергирующие средства.
Как указано выше, фармацевтические композиции по изобретению могут находиться в форме, пригодной для стерильной инъекции. Для получения такой композиции пригодные лекарственное средство(средства) растворяют или суспендируют в пригодном для парентерального введения жидком носителе. Среди пригодных носителей и растворителей, которые можно использовать, присутствуют вода, вода, доведенная до подходящего рН добавлением соответствующего количества соляной кислоты, гидроксида натрия или подходящего буфера, 1,3-бутандиола, раствора Рингера и изотонического раствора хлорида натрия и раствора декстрозы. Водный состав может содержать также один или несколько консервантов (например, метил, этил или н-пропил-п-гидроксибензоат). В случаях, когда одно из соединений является лишь умеренно или слаборастворимым в воде, можно добавлять усиливающее растворение или солюбилизирующее средство, или растворитель может включать 10-60% (мас./мас.) пропиленгликоля или т. п.
Виды комбинированной терапии.
Необязательно, терапевтические средства на основе противораковой вакцины по изобретению можно вводить в сочетании с любым другим химиотерапевтическим средством; такие способы известны специалисту в данной области и описаны в РепипДоп'х РЪагтасеиЪса1 Заеисек Ъу Е.^. Майт. В частности, иммуногенную композицию по изобретению можно вводить в сочетании с любым одним или несколькими из ацетата абиратерона, алтретамина, ангидровинбластина, ауристатина, бексаротена, бикалутамида, ВМЗ184476, 2,3,4,5,6-пентафтор-Ы-(3-фтор-4-метоксифенил)бензолсульфонамида, блеомицина, ИК-диметил-Б-валил-Б-валил-К-метил-Б-валил-Б-пролил-Б-пролин-т-бутиламида. кахектина, цемадотина, хлорамбуцила, циклофосфамида, 3',4'-дидегидро-4'-дезокси-8'-норвин-калейкобластина, доцетаксола, доксетаксела, циклофосфамида, карбоплатина, кармустина (ВСЫИ), цисплатина, криптофицина, циклофосфамида, цитарабина, декарбазина (ЭТ1С), дактиномицина, даунорубицина, децитабина, доластатина, доксорубицина (адриамицина), этопозида, 5-фторурацила, финастерида, флутамида, гидроксимочевины и гидроксимочевинатаксанов, ифосфамида, лиарозола, лонидамина, ломустина (ССЫИ), МОУ3100, мехлорэтамина (азотистого иприта), мелфалана, изетионата мивобулина, ризоксина, сертенефа, стрептозоцина, митомицина, метотрексата, таксанов, нилутамида, онапристона, паклитаксела, преднемустина, прокарбазина, РРК109881, фосфата страмустина, тамоксифена, тасонермина, таксола, третиноина, винбластина, винкристина, сульфата виндезина и винфлюнина.
В видах комбинированной терапии по изобретению компоненты терапии вводят одновременно или в пределах 1, 3, 5, 7, 14, 21 или 28 суток друг от друга, в количествах, достаточных для ингибирования роста неоплазмы. В зависимости от типа злокачественной опухоли и стадии ее развития комбинированную терапию можно использовать для лечения злокачественной опухоли, для замедления распространения злокачественной опухоли, для замедления роста злокачественной опухоли, для уничтожения или ареста клеток злокачественных опухолей, которые могут распределяться к другим частям организма от исходной опухоли, для облегчения симптомов, вызванных злокачественной опухолью, или для предотвращения злокачественной опухоли в первом участке. Комбинированная терапия может также помогать людям жить более комфортабельно посредством уничтожения клеток злокачественных опухолей, которые вызывают боль или дискомфорт.
Введение комбинации по настоящему изобретению позволяет введение более низких доз каждого соединения, обеспечивая сходную эффективность и более низкую токсичность по сравнению с введением каждого соединения отдельно. Альтернативно, такие комбинации приводят к улучшенной эффективности при лечении неоплазий при сходной или сниженной токсичности.
- 16 030337
Наборы.
Изобретение относится к наборам для лечения или профилактики неоплазий. В одном из вариантов осуществления набор включает терапевтическую или профилактическую композицию, содержащую эффективное количество вакцины на основе клеток опухолей в единичной дозированной форме. В некоторых вариантах осуществления набор содержит стерильный контейнер, содержащий терапевтическую или профилактическую клеточную композицию; такие контейнеры могут представлять собой коробки, ампулы, бутыли, флаконы, пробирки, пакеты, мешки, блистерные упаковки или другие пригодные формы контейнеров и известны в данной области. Такие контейнеры могут быть изготовлены из пластика, стекла, ламинированной бумаги, металлической фольги или других материалов, подходящих для содержания лекарственных средств.
Если желательно, вакцину на основе клеток опухолей по изобретению предоставляют вместе с инструкциями для введения вакцины индивиду, страдающему злокачественной опухолью или подверженному риску развития злокачественной опухоли (например, меланомы, рака молочной железы). Инструкции, как правило, могут включать информацию относительно использования композиции для лечения или профилактики неоплазии. В других вариантах осуществления инструкции включают по меньшей мере одно из следующего: описание лекарственного средства; расписание дозирования и введение для лечения или профилактики ишемии или ее симптомов; меры предосторожности; предостережения; показания; противопоказания; информация о передозировке; неблагоприятные реакции; фармакология для животных; клинические исследования и/или ссылки. Инструкции могут быть отпечатаны непосредственно на контейнере (если он присутствует), или в виде этикетки, приложенной к контейнеру, или в форме отдельного листа, брошюры, карты или папки, поставляемых в контейнере или с контейнером.
В практике настоящего изобретения используют, если нет иных указаний, общепринятые способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые полностью находятся в компетенции специалиста в данной области. Такие способы полностью объяснены в литературе, такой как "Мо1еси1аг С1отп§: А ЬаЪогаЮгу Мапиа1", кесопЪ еЪШоп (ЕатЪгоок, 1989); "ОИдопис1еокке 8уп1ке818" (Сак, 1984); "Атта1 Се11 Сикиге" (Ргеккпеу, 1987); "Ме1кок8 ш Еп/уто1оду" "НапкЪоок о£ Е\рептеп1а1 1ттипо1оду" (\Ует 1996); "Сепе ТгатГег Уес1ог§ £ог МаттаИап Се1к" (МЪ1ег апк Са1о§, 1987); "Сиггеп! РгоЮсоЕ ш Мо1еси1аг Вю1оду" (Аи8иЪе1, 1987); "РСК: Тке Ро1утега§е Скат Кеаскоп", (Ми1к8, 1994); "Сиггеп! РгоЮсок т 1ттипо1оду" (Сокдап, 1991). Эти способы можно применять к получению полинуклеотидов и полипептидов по изобретению, и, как таковые, можно рассматривать при выполнении и практическом осуществлении изобретения. Особенно пригодные способы для конкретных вариантов осуществления обсуждают в последующих разделах.
Следующие примеры предложены для обеспечения специалиста в данной области полным раскрытием и описанием того, как выполнять и использовать анализы, скрининг и способы терапии по изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы изобретения рассматривают как свое изобретение.
Примеры
Пример 1. Составление усиленной агонистом ТЬК СУАХ (ТЕСУАХ).
Чтобы усилить местно-регионарную врожденную активацию иммуноцитов так же, как минимизировать системную токсичность стимуляции То11-подобного рецептора 4 (ТЬК4) и минимизировать стимуляцию ТЬК4К на клетках опухолей, липополисахарид (ЕР8) вводили в состав СУАХ (ТЕСУАХ - усиленная ТЬК4 СУАХ). Коммерчески доступный липосомальный вектор - липофектамин использовали для оптимизации поглощения ЬР§ клетками СУАХ до летального облучения. Для количественной оценки степени поглощения использовали флуорофор ЬР8-дипиррометен с дифторидом бора (ΒΟΌΙΓΥ) для тестирования различных условий для оптимизации, чтобы получать 98% клеток в составе с ΕΚΕ-ΒΟΟΡΥ (фиг. 1). Для количественной оценки общего количества ЬР8, поглощенного на клетку, использовали анализ лизат амебоцитов Ыти1и8 (ЕАЬ) (СатЪгех), чтобы показать, что 4,73+/- 0,2 нг ЬР§ было поглощено 5х105 клетками с помощью способа с липофектамином, оптимизирующего составление ЬР8. Для каждого из экспериментов ш νί\Ό с опухолями мышей аликвоты ТЕСУАХ тестировали с использованием анализа ЕАЬ так же, как анализа СМ-С8Р ЕЬ1§А для обеспечения сравнимого количества ЬР8 и СМС8Р в составе ТЕСУАХ. Типичный секретированный СМ-С8Р лежал в диапазоне 50-200 нг/мл/106 клеток/сутки.
Пример 2. ТЕСУАХ индуцирует противоопухолевый ответ ш νί\Ό во множестве моделей злокачественных опухолей на мышах.
Эффективность ТЕСУАХ первоначально тестировали в модели меланомы В16 на мышах, в соответствии с чем ТЕСУАХ вводили внутрь опухоли через 3-5 суток после инокуляции опухоли в терапевтической модели. Частью обоснования для внутриопухолевой инъекции являлось обеспечение нацеливания на местно-регионарные антигенпредставляющие клетки (АРС), циркулирующие между опухолью и дренирующими лимфатическими узлами. Эти временные точки были выбраны, потому что анергические и толерантные опухолеспецифические Т-клетки присутствовали настолько рано, как через 3 суток после инъекции В16. Как показано на фиг. 2, ТЕСУАХ уменьшала скорость роста опухоли В16 по сравнению с обработкой СУАХ. Эти статистически значимые различия в скорости роста переводили на различия в
- 17 030337
кривой выживаемости (фиг. 2). Однако у всех мышей С57В1/6, обработанных ΤΕΟνΑΧ, в конечном счете развивались большие опухоли в участке инъекции. С учетом измерения 4,73 нг ЬР§ на 5х105 клеток ΟνΑΧ, проводили контрольные эксперименты, в соответствии с чем эквимолярное количество ЬР8 инъецировали перитуморально, как в группе обработки ΤΕΟνΑΧ. У этих мышей не было различий в скорости роста или выживаемости, как у несущих опухоль мышей, обработанных ΟνΑΧ или РВ§ (фиг. 7). Для эквимолярного количества ЬР8, инъецированного вместе с ΟνΑΧ без липосомного состава, также не показали противоопухолевого ответа по сравнению с контрольной группой с РВ§, что позволяет предполагать, что получение состава с ЬР8 внутри клеток является важным для его противоопухолевого ответа (фиг. 7). ΤΕΟνΑΧ также индуцировала системный противоопухолевый ответ (фиг. 8). С использованием модели меланомы В16, мышей обрабатывали ΤΕΟνΑΧ либо перитуморально, либо в контралатеральную конечность от участка инокуляции опухоли, для обеих обработанных групп показали сходную скорость роста опухоли ίη νίνο (фиг. 8).
Для тестирования, можно ли для ΤΕΟνΑΧ показать также противоопухолевый ответ в других моделях опухолей на мышах, клетки ЗССРУП/ЗЕ подкожно инъецировали в бока сингенных мышей СЗР/НеОШ с ТЬК4К дикого типа (фиг. 2). Как только опухоль становилась доступной для пальпирования, опухоль обрабатывали ΤΕΟνΑΧ или ΟνΑΧ, полученными из клеток плоскоклеточной карциномы ЗССР'УП/ЗР мышей. Сопоставимо с экспериментами для ΤΕΟνΑΧ на модели В16, для ΤΕΟνΑΧ показали значительный противоопухолевый ответ. Вновь, у всех мышей, обработанных ΤΕΟνΑΧ, в конечном счете развились объемные опухоли, что потребовало эвтаназии. Ортотопическую инъекцию не проводили из-за неточностей, присущих измерению опухоли языка и дна ротовой полости в моделях ЗССТУП/ЗЕ на мышах.
Наконец, ΤΕΟνΑΧ тестировали также на модели карциномы ободочной кишки СТ26, для которой также показали противоопухолевый ответ, в результате которого скорость роста трансплантированной опухоли была статистически медленнее, чем у опухоли СТ26, обработанной только ΟνΑΧ (фиг. 2). В случае СТ26, 40-60% мышей, обработанных ΤΕΟνΑΧ, фактически обладали регрессией опухоли. Клетки СТ26 собирали от выживших мышей, и опухоли трансплантировали повторно, и ни у одной не выросла опухоль, что показывает полное иммунотерапевтическое излечение. В случае модели СТ26, тестировали также ЬР8, составленный с летально облученными клетками ΗΕΚ293 в эквимолярных количествах, как ΤΕΟνΑΧ. ЬР§ в составе вакцины на основе клеток без идентичного набора антигенов опухоли и ΟΜΟδΡ не вызывал противоопухолевого ответа в модели СТ26.
Пример 3. Противоопухолевый ответ на ΤΕΟνΑΧ является зависимым от ΜγΌ88.
Для верификации того, являлись ли противоопухолевые эффекты ίη νίνο, указанные выше, фактически обусловленными введением передачи сигнала ΤΒΚ4·, опухоль В16 инокулировали мышам С57В1/6, обладающим генотипом ΜγΌ88 -/-. Затем опухоль обрабатывали ΤΕΟνΑΧ или ΟνΑΧ. На фиг. 3 показано, что усиленный противоопухолевый ответ с добавлением агониста ΤΒΚ4·, составленного с клетками ΟνΑΧ является, фактически, вторичным по отношению к стимуляции ΤΈΚ.4. Слабые различия, отмеченные в начале в группе ΟνΑΧ, в конечном счете перекрывались с кривой роста в обработанной РВδ группе (фиг. 7). ΜγΌ88 является необходимым внутриклеточным медиатором передачи сигнала ΤΈΚ4, и в отсутствие передачи сигнала ΤΒΚ4· у ΜγΌ88 нуль-мышей более не показывали усиленного противоопухолевого ответа ίη νίνο, постоянно отмечаемого у мышей С57В1/6 дикого типа.
Пример 4. ΤΕΟνΑΧ индуцирует усиление инфильтрации Τ-клеток и ЛРС в микроокружении опухоли.
Для исследования потенциального механизма противоопухолевых ответов ίη νίνο благодаря обработке ΤΕΟνΑΧ ткань опухоли собирали после обработок и анализировали инфильтрацию лимфоцитов. Как показано на фиг. 4, опухоль, обработанная ΤΕΟνΑΧ, обладала количественно увеличенной инфильтрацией С.ГО4 и С.ГО8 по сравнению с опухолями после контрольной обработки и опухолями после обработки ΟνΑΧ. Более того, принимая во внимание гипотезу, что агонист ΤΒΚ4· стимулирует созревание местно-регионарных профессиональных ЛРС, проводили иммунологическое окрашивание с антителами против С.ГО86. и отмечали увеличение количества С.ГО86+ клеток в микроокружении опухолей, обработанных ΤΕΟνΑΧ. Исследовали также, было ли увеличено количество макрофагов в ткани опухоли, однако не обнаружили значительных различий в инфильтрации Ρ4+ макрофагов между группами обработки.
Пример 5. Усиление активации дендритных клеток в местных дренирующих лимфатических узлах.
Данные иммунологического окрашивания из фиг. 4 согласовывались с гипотезой, что клеточные вакцины, составленные с агонистом ΤΒΚ4, могут увеличивать количество активированных местнорегионарных дендритных клеток. ОС являются важными первичными антигенпроцессирующими клетками, которые могут диктовать, становится ли эффекторным клеткам толерогенными или цитотоксическими. Без желания быть связанными теорией, вероятно, ЬРБ, поглощенный ΟνΑΧ, фагоцитируется в инфильтрующие ИС в форме клеточного дебриса и мицелл с антигенами опухолей. Таким образом, кажется вероятным, что при обработке ΤΕΟνΑΧ может увеличиваться количество активированной популяции местно-регионарных ОС. Для тестирования этой гипотезы, дендритные клетки очищали из дренирующих лимфатических узлов от несущих опухоли мышей, обработанных РВБ, ΟνΑΧ или ΤΕΟνΑΧ и
- 18 030337
отбирали общепринятую популяцию БС с В220 и СБ11е. Многопараметрическое окрашивание маркеров активации БС СБ86, СБ80 и МНС11 в этих отобранных клетках показывает, что дендритные клетки из обработанной ТЕСУАХ группы обладают большей популяцией активированных БС (фиг. 5) по сравнению с обработанной СУАХ группой или группой после контрольной обработки.
Пример 6. Количество опухолеспецифических цитотоксических Т-клеток увеличено у мышей после обработки ТЕСУЛХ.
Одним из обоснований для изучения модели СТ26 в сочетании с 8ССРУП/8Р и моделью В16 являлась доступность реагентов для количественного определения АН1-специфических цитотоксических Тклеток. Для тестирования того, могут ли противоопухолевые ответы ίη νίνο на ТЕСУАХ, которая активирует местно-регионарные дендритные клетки, увеличивать стоящую ниже популяцию опухолеспецифических цитотоксических эффекторных клеток, проводили анализы ЕЬ18РОТ. С использованием иммуногенных рестрицированных по МНС класса I П1 пептидов АН1, Т-клетки из дренирующего лимфатического узла и селезенки собирали, и проводили скрининг продуцирующих ΙΡΝ цитотоксических Тклеток в присутствии пептидов АН1 (иммунодоминантного пептида для клеток СТ26, обученных АРС в анализе ЕЫ8РОТ. В то время как минимальное количество специфических для АН1 Т-клеток детектировали на сутки 5 после обработки ТЕСУАХ, на сутки 8 присутствовало статистически значимое количество специфических для АН1 Т-клеток в группе ТЕСУАХ как в дренирующих лимфатических узлах, так и в селезенке, как показано на фиг. 6А. Анализы ίη νίνο цитотоксических Т-лимфоцитов (СТЬ) также показали усиленное примирование цитотоксических Т-клеток для пептида АН1 в группе с обработкой ТЕСУАХ по сравнению с группой без обработки (фиг. 6В). Анализы СТЬ ίη νίνο с помощью специфических для р15Е Т-клеток из модели В16 также показал увеличенное количество р15Е-специфических Т-клеток в группе ТЕСУАХ.
Пример 7. Агонист ТЬК4 в сочетании с СУАХ уменьшали рост клеток опухоли и увеличивали количество АН1-специфических цитотоксических Т-клеток.
Как описано выше, ТЕСУАХ улучшала ответы опухолей ίη νίνο в трех отдельных моделях на мышах. В модели меланомы В16, моделях карциномы ободочной кишки СТ26, так же, как модели плоскоклеточной опухоли языка 8ССУН, ТЕСУАХ, инъецированная внутрь опухоли в прижившихся опухолях, уменьшала рост опухолей по сравнению с одной СУАХ. Системная обработка с использованием ТЕСУАХ после инокуляции опухолей также уменьшала скорость роста В16 ίη νίνο. Для исследования иммунологического механизма, индуцирующего противоопухолевые ответы, модель СТ26 на мышах использовали для исследования противоопухолевых ответов цитотоксических Т-клеток (СТЬ). С использованием хорошо охарактеризованного анализа ЕП^ю! и анализа СТЬ ίη νίνο, для обработанных ТЕСУАХ показали увеличенное количество АН1-специфических цитотоксических Т-клеток (СТЬ) к суткам 8 после обработки. В этих экспериментах скорость роста опухолей в доклинических моделях уменьшали посредством комбинации агониста ТЬК4 с СУАХ.
Пример 8. Синтетический агонист ТЬК4-аналог гликопиранозил-липида А (СЬА) - в сочетании с СУАХ и агонистом ТЬК7 и ТЬК8 (К848) значительно уменьшал рост клеток меланомы.
Для определения того, может ли более одного типа пути передачи сигнала ТЬК в микроокружении опухоли улучшать противоопухолевый ответ, другую форму агониста ТЬК4, СЬА, синтетический аналог гликопиранозил-липида А, использовали вместе с СУАХ. Составленную с СЬА СУАХ также комбинировали с агонистом К848, ТЬК7 и ТЬК8. Эксперименты по обработке опухолей проводили на мышах с меланомой В16. При использовании модели меланомы В16, комбинация СУАХ, СЬА и К848 предотвращала рост агрессивной опухоли В16 у мышей дикого типа (фиг. 9).
Вакцинные составы инъецировали через 2-4 суток после инокуляции опухолей. Как правило, СУАХ сама по себе не предотвращает рост В16 ίη νίνο для этих слабо иммуногенных клеток опухолей. Когда этим мышам повторно инъецировали линии клеток меланомы В16, зараженные клетки опухолей не росли. Как ЕЫ8РОТ, так и СТЬ анализы ίη νίνο проводили для количественной оценки специфических для р15Е СБ8+ Т-клеток, и мыши после обработки СУАХ, СЬА, К848 имели значительно больше специфических для р15Е СБ8+ Т-клеток, чем мыши после обработки только СУАХ.
Пример 9. Комбинация СУАХ/СЬА/К848 усиливала активацию дендритных клеток.
Для лечения организованной ткани опухоли состав СУАХ/СЬА/К848 использовали для лечения доступной для пальпирования опухоли В16. Вакцинный состав инъецировали через 7-10 суток после инокуляции опухолей в участке, отдаленном от доступной для пальпирования ткани опухоли. И вновь агонист ТЬК. усиливал уменьшение скорости роста опухоли посредством СУАХ (фиг. 10).
Анализ ЕЫ8РОТ и анализ СТЬ ίη νίνο проводили в каждой из групп для количественного определения уровня специфических для р15Е СТЬ, и результаты показали, что мыши после обработки СУАХ/СЬА/К848 имели наибольшее количество р15Е-специфических Т-клеток, что коррелировало со скоростью роста опухоли ίη νίνο (фиг. 11).
Принимая во внимание эти противоопухолевые ответы для состава СУАХ/СЬА/К848, выдвинули гипотезу, что усиленные агонистом ТЬК вакцины стимулировали дендритные клетки. Таким образом, собирали дренирующие лимфатические узлы и селезенку от каждой группы обработки, и исследовали статус активации дендритных клеток. С использованием маркеров активации СБ80 и СБ86 на клетках
- 19 030337
СЭ11с+ и Β220+, для обработанной СУАХ/СЬА/К848 группы показали значительное усиление активации дендритных клеток (фиг. 12).
Ткань опухолей из каждой группы обработки анализировали с использованием иммуногистохимии. Большее количество ί'.Ό4+. СЭ8+ и СЭ86+ клеток обнаружили в опухолях после обработки СУАХ/СЬА/К848. Наконец, исследовали цитокиновое окружение в каждой из групп обработки, чтобы определить, повышен ли уровень 11-12 у мышей после обработки агонистами ТЬК. Положительные по СЭ11с клетки собирали как в дренирующих лимфатических узлах, так и в селезенке, и уровень цитокинов 11-12 определяли для определения способности направлять репертуар Т-клеток к противоопухолевому ответу ТЫ (фиг. 13). Мыши после обработки СУАХ/СЬА/К848 имели статистически значимое количество СЭ11с+ клеток, экспрессирующих 11-12, который является первичным цитокином, направляющим окружение Т-клеток к ответу ТЫ. Это отмечено как в дренирующих лимфатических узлах, так и в селезенке.
В целом, эти результаты показывают, что комбинаторный подход с использованием платформы СУАХ с множеством агонистов ТЬК обладал увеличенной эффективностью в лечении солидных опухолей. Комбинация СУ АХ с агонистами ТЬК4 и ТЬК7/8 улучшает противоопухолевый ответ ίη νίνο. Улучшенный противоопухолевый ответ коррелирует с увеличенным количеством активированных дендритных клеток, увеличенным количеством опухолеспецифических СТЬ, и увеличенным количеством СЭ11с+, которые могут секретировать 11-12 в дренирующих лимфатических узлах и селезенке.
Пример 10. Конкретные периоды времени составления агонистов ТЬК с клеточной вакциной СУАХ улучшают эффективность противоопухолевой активности ш νίνο.
Оценивали эффекты времени инкубации агонистов ТЬК с СУАХ в ходе получения состава ТЕСУАХ на противоопухолевую активность. Панель из трех составов ТЕСУАХ, содержащих ОБА/К848 и СУАХ, получали таким образом, что продолжительность инкубации ОБА/К848 с СУАХ менялась в каждом составе (30 мин, 1 и 2 ч). Каждый из составов ТЕСУАХ вводили мышам, и относительный объем опухолей В1б измеряли через 24 суток (фиг. 14). В качестве контроля СУАХ и СЬА/К848 вводили без смешивания ("отдельно" на фиг. 14). Дополнительный контроль состоял из одного носителя. Когда СЬА и К848 в присутствии носителя смешивали с СУАХ менее чем через 30 мин до облучения, состав не обладал противоопухолевой активностью. Противоопухолевая активность также уменьшалась, когда СУАХ и агонисты ТЬК инкубировали в течение более 2 ч. Максимальную противоопухолевую активность наблюдали в составах ТЕСУАХ, когда СЬА и К848 в присутствии носителя смешивали с СУАХ в течение 1 ч (фиг. 14).
Результаты, описанные выше, получены с использованием следующих способов и материалов.
Линии клеток опухолей мышей.
Линии клеток плоскоклеточной карциномы головы и шеи 8ССРУП/8Р, меланомы В16-Р0 и В16-Р0, трансдуцированные для секреции СМ-С8Р, культивировали в среде КРМ1 1640, содержащей 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллин (100 Ед./мл) и стрептомицин (100 Ед./мл). Линию клеток колоректальной карциномы СТ26 культивировали сходным образом с добавлением заменимых аминокислот МЕМ (81дта, 8ΐ. Ьошк), 1 мМ пирувата натрия и 2 мМ Ьглутамина. Фоновые клетки Β78ΗΙ, трансдуцированные СМ-С8Р, культивировали в такой же среде, как СТ26, но с добавлением гигромицина В из 81гсрЮтусс5 кудгоксорюик (1 г/л) (Коске Арркек 8с1епсе, Ιηάίапарокк, ΙΝ). Все клетки инкубировали при 37°С в 5% увлажненном СО2. Для линий клеток вакцины СУАХ, тестированных на моделях вакцинации, для чего вакцины инъецировали за 10 суток до инокуляции опухолей, не показали роста опухолей для всех трех линий СУАХ.
Мыши.
Взрослых (в возрасте >50 суток) самок мышей С57ВЬ/6, Ва1Ь/С и С3Н/НеОШ закупали в .Тасккоп ЬаЬогаФгу и содержали согласно .Токпк Норкшк Ашта1 Саге апк Ике СоттШее. Мышей С57ВЬ/6 МуЭ88 -/- получали из Эг. Ргапск Ноиккеаи Покщ Норкшк ЬшуегЩу).
Составление ТЕСУАХ.
Реагент липофектамин (120 мкг/мл) и ЬР8 из ЕкскепсЫа сок 026:В6 (10-25 мкг/мл) объединяли в липосомальный комплекс.
Клетки для составления с липополисахаридом (ЬР8) рассевали с плотностью 5х105 клеток и через 24 ч их инкубировали с комплексом липосомы-ЬР8 в течение 6 ч, промывали 5 раз РВ8, и затем инъецировали мышам. Для количественной оценки ЬР8, включенного в клетки, проводили анализ лизат амебоцитов Ьипикщ (ЬАЬ) (СатЬгех) по инструкциям производителя. ЬР8 (23 ЕЭ/нг) от 0 до 3,0 ЕЭ/мл использовали в качестве стандартов. Перед летальным облучением, ТЕСУАХ культивировали для обеспечения роста жизнеспособных клеток. Окрашиванием аннексином не подтвердили доказательств апоптоза после составления.
Для состава ТЕСУАХ, содержащего СЬА/К848, носитель для поглощения агонистов ТЬК клетками СУАХ представлял собой стабильную эмульсию скваленовое масло-в-воде с фосфатидилхолином. Агонисты ТЬК получали в носителе с концентрацией 1 мг/мл СЬА и 0,2 мг/мл К848. Культивированные клетки СУАХ обрабатывали трипсином и промывали. После промывки проводили летальное облучение клеток 10000 рад (100 Гр). СЬА и К848 в присутствии носителя смешивали с облученными клетками
- 20 030337
СУАХ и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч перед инъекцией мышам. Как правило, 20 мкл клеток СУАХ и 20 мкл ОЬА/И848/носителя смешивали перед инъекцией.
Анализ обработки вакциной ш νί\Ό.
Мышам С57ВЬ/6 инъецировали подкожно в правый бок 5х104 клеток В16-Р0. От трех до пяти суток после инокуляции 106 летально облученных (150 Гр) В16 СМ-С8Р (СУАХ), 106 летально облученных (150 Гр) СУАХ, составленных с ЬР8 (состав ТЕСУАХ) или клеток 293 с поглощенным ЬР8 инъецировали перитуморально. В некоторых случаях вакцины инъецировали в контралатеральную конечность от конечности с инокулированной опухолью. Для мышей С3Н/НеОИ1 и мышей Ва1Ь/с использовали клетки 8ССРУП/8Р и клетки СТ26 соответственно с помощью подходящих способов.
Иммуногистохимия.
Замороженную опухоль СТ26 от мышей нарезали с толщиной 10 мкм и блокировали 1% В8А 30 мин при комнатной температуре. Антитела против СЭ45 мыши (еВюкаепсе) и против СЭ4 мыши с изотиоцианатом флуоресцеина (Р1ТС), СП8-Р1ТС, СЭ86-Е1ТС (ВО Рйагтшдеп), инкубированные при 4°С в течение 1 ч, использовали в качестве первичных антител. Анти-СО45-Су3 (1пу11годеп) использовали в качестве вторичных в некоторых случаях. ОЛР1 использовали для контрастного окрашивания в течение 10 мин. Подсчитывали клетки в 10 случайно выбранных полях при 40х увеличении. №коп ЕсПрке Р800 представлял собой микроскоп, №коп 08-ОПтс представляла собой камеру, и №8-Е1етеп1 АК 3.0 представляло собой программное обеспечение, использованные для этих экспериментов. Селезенки и дренирующие лимфатические узлы от зараженных опухолями мышей ВЬ/6 собирали через пять суток после обработки СУАХ и ТЕСУАХ. Срезы селезенки ферментативно расщепляли в среде, содержащей ДНКазу I (Косйе) и коммерчески доступную смесь ферментов для диссоциации тканей (ЫВЕКА8Е ВРЕЫП2УМЕ 2) (20000 Ед./мл по Мандл) (Косйе). Обогащенные ОС популяции получали истощением СЭ3+ и СЭ19+, и окрашиванием по СЭ11с+ и В220+. Отобранные СЭ11с+В220+ ОС оценивали многоцветным анализом РАС8 с использованием антител против СЭ80, СЭ86 и МНС11 от ВО Вюкаепсек.
Анализ ЕЫ8РОТ.
Планшеты для способа иммуноферментных пятен (ЕЬ18РОТ) (МиФ8сгеепНТ8 П11ег р1а!е, Мййроге) покрывали антителом против интерферона (ΙΡΝ)-γ мыши (АЬ) (МаЬТесй) в течение 24 ч, и клетки рака молочной железы 4Т1 обучали 10 мкг/мл пептида АН1 в течение ночи. На следующие сутки у мышей собирали селезенки и лимфатические узлы. Клетки 106 СЭ8а+ рассевали в трех повторах для совместного культивирования с 105 необученных клеток 4Т1, совместного культивирования с 105 обученных клеток 4Т1, или стимуляции 1 мкМ РМА и 10 нг/мл иономицина в качестве положительного контроля. На третьи сутки планшет инкубировали с биотинилированным АЬ против ΙΡΝ-γ мыши (МаЬТесй) с последующей инкубацией со стрептавидином-НКР для ЕЫ8РОТ (ВО). Планшет проявляли с использованием набора субстратов и реагентов АЕС для ЕЫ8РОТ (ВО) и анализировали с использованием считывателя для планшетов ЕЫ8РОТ (Пптипокро!).
Анализ СТЬ ш νί\Ό.
Коммерчески доступный реагент для отслеживания ш νί\Ό СеПТгасе™ СР8Е Се11 РгоШегайоп Κίΐ (Мо1еси1аг РгоЬек) использовали для тестирования процента уничтожения для СТЬ у зараженных опухолью СТ26 мышей, обработанных в присутствии или в отсутствие ТЕСУАХ. Спленоциты обрабатывали и обучали либо β-галактозидазой (β-^ηΐ), либо пептидом АН1 в концентрации 10 мкг/мл в течение 90 мин. Популяция β-βΐιΐ являлась меченной СР8Е на низком уровне (0,5 мкМ) и популяция АН1 являлась меченной диацетатом сложного сукцинимидильного эфира карбоксифлуоресцеина (СР8Е) (5 мкМ). После 10 мин инкубации те и другие меченные СР8Е клетки инъецировали по 10 клеток/мышь в трех группах мышей. Через 24 ч после инъекции клетки селезенки собирали и анализировали.
Статистический анализ.
Парный ΐ-критерий использовали для расчета двустороннего значения р для оценки статистической значимости различий между двумя группами обработки. Статистически значимые значения р помечали следующим образом: **р<0,01 и *р<0,05. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Ехсе1.
Другие варианты осуществления
Из предшествующего описания очевидно, что варианты и модификации могут быть выполнены для изобретения, описанного в настоящем документе, для его адаптации к различным применениям и условиям. Такие варианты осуществления также входят в объем следующей ниже формулы изобретения.
Перечисление списка элементов в любом определении переменной в настоящем документе включает определения этой переменной как любого отдельного элемента или комбинации (или субкомбинации) перечисленных элементов. Перечисление вариантов осуществления в настоящем документе включает эти варианты осуществления как любой отдельный вариант осуществления или в сочетании с любыми другими вариантами осуществления или их частями.
Содержание всех патентов и публикаций, упомянутых в этом описании, приведено в настоящем документе в качестве ссылки в такой же степени, как если бы было конкретно и отдельно указано, что содержание каждого независимого патента и публикации приведено в качестве ссылки.
- 21 030337
Перечень последовательностей
<110> ДЗЕ ДЖОНС ХОПКИНС ЮНИВЕРСИТИ
<120> Генетически модифицированные неопластические клетки, содержащие агонист ТЬК. и экспрессирующие ОМ-СБЕ, и их применение против неоплазии
<130> 87185ЕА2(71699)
<140> ЕА 201291117
<141> 2011-04-27
<150> РСТ/ИБ2011/034139
<151> 2011-04-27
<150> 61/328,471
<151> 2010-04-27
<160> 4
<170> РабепбГп чегзФоп 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> белок
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> описание искусственной последовательности: синтетический пептид рербФбе
<400> 1
ναι ναι ναι рго рго
1 5
<210> 2
<211> 144
<212> белок <213> Ното заргепз
<400> 2 О1п Бег 5 Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи О1у 10 ТЬг Уа1 А1а Суз Бег 15 11е
Меб 1 Тгр Ьеи
Бег А1а Рго А1а Агд Бег Рго Бег Рго Бег ТЬг О1п Рго Тгр О1и НФз
20 25 30
Уа1 Азп А1а 11е О1п О1и А1а Агд Агд Ьеи Ьеи Азп Ьеи Бег Агд Азр
35 40 45
ТНг А1а А1а О1и Меб Азп О1и ТЬг Уа1 О1и Уа1 11е Бег О1и Меб РЬе
50 55 60
Азр Ьеи О1п О1и Рго ТНг Суз Ьеи О1п ТЬг Агд Ьеи О1и Ьеи Туг Ьуз
65 70 75 80
О1п О1у Ьеи Агд О1у Бег Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьуз О1у Рго Ьеи ТЬг Меб
- 22 030337
85 90 95
МеС А1а Зег Н1з 100 Туг Ьуз С1п Н1з Суз 105 Рго Рго ТЬг Рго О1и 110 ТЬг Зег
Суз А1а ТНг О1п 11е 11е ТЬг РЬе О1и Зег РЬе Ьуз О1и Азп Ьеи Ьуз
115 120 125
Азр РНе Ьеи Ьеи Уа1 11е Рго РЬе Азр Суз Тгр О1и Рго Уа1 О1п О1и
130 135 140
<210> 3
<211> 5992
<212> ДНК
<213> Ното заргепз
<400> 3
дсадСсСдСС СссСассада сСдддадссС саадддссаа аСдСдадддс садСдддадд 60
дСсссдСССа ссСссссада асаддСссСд дСдСддаССд дааадасССд ССдасСдасС 120
дСсСдадсСа СдасаасСса СССсСаддад дааадСдасс ССсСсСссса даСдддСсаС 180
асаддсСсСс СдссСсссСд дссаСсадсС даассасСаС сСаСддсСсс сССсссСдсс 240
сСссадссСс садддСдсСа СссаасасаС дСдаСаСсСа саСдСадСаС ссаСдСссСс 300
аСсСсСсссс сдададсСсс сСддааадад сСдадссаад дссССдсааа аааддСддад 360
ааадддссад ддссСддаса СССсаСдССс ссассссадс сСддссасСа ддадСдССсС 420
асдсаддсСс адаСддаСдд ддсСддссСс асадСддддС сСддаддасС ааддСССддС 480
ССсСсСаСдс ааддСсадаа ааасСсссас адСасаддда аасСддссад ддсСдсадас 540
Ссадассаса дСдсСааадс саСдаасСсс ассСдсСсСс СдааддсСсд ссаассСдад 600
Сссадсадаа СдССсСсдсС СдСдСссаас сссасСддСС СаддсСдааС садссСсСад 660
ддсссададд сасСдсассС ддадСаддда дсССсСссад СаСсададСс ассССсадад 720
дссСддадсс СССсаСааад саддСаадад дасСсааСад аСдсаСсСдс аСддааааса 780
СссСссссСс Сассаддсас сСдСаСдСас аассааСсас адсадсасас аСасасссад 840
аааСдддсас дСдСдддссс асассссССС адсСаСдааа сссаддсаСд дддсадсССд 900
адссадаСас сССдСдсааа сасааасСсд СдсСдСсССс СсСдаасСсс аССдСдаааа 960
СсааасасСС дСсадссссС саададссСС СадаСССссС асССссасас ССссасадаа 1020
аддссСсСдд адССддддда СдсСддддСС аСдСаддааа ССаадссСдд адддссССдс 1080
Сддддаадсс аССдСсссСд СассСдадаС ддаСдсадсс асадсссСдд адссадссСд 1140
аадсСссСдд СдСсССсСдд дддсСасаСа СаддадСдСа дСссдаассС сададдддса 1200
аассСдсСсС дсададддаа СсааддССса саСаассада даддддадСс асСсаддаад 1260
- 23 030337
дбддсбссад адссаададб садасбсбдд дбсссдасбб дасссадсса сасссссбсб 1320
даадсббдсб дададбддсб дсадбсбсдс бдсбддабдб дсасабддбд дбсаббсссб 1380
сбдсбсасад дддсаддддб ссссссббас бддасбдадд ббдсссссбд сбссаддбсс 1440
бдддбдддад сссабдбдаа сбдбсадбдд ддсаддбсбд бдададсбсс ссбсасасбс 1500
аадбсбсбса садбддссад адаададдаа ддсбддадбс адаабдаддс ассадддсдд 1560
дсабадссбд сссаааддсс ссбдддабба саддсаддаб ддддадсссб абсбаадбдб 1620
сбсссасдсс ссассссадс саббссаддс саддаадбсс ааасбдбдсс ссбсададдд 1680
адддддсадс сбсаддссса ббсадасбдс ссадддаддд сбддададсс сбсаддаадд 1740
сдддбдддбд ддсбдбсддб бсббддааад дббсаббааб даааассссс аадссбдасс 1800
ассбадддаа ааддсбсасс дббсссабдб дбддсбдаба адддссадда даббссасад 1860
ббсаддбадб бсссссдссб сссбддсабб ббдбддбсас саббаабсаб ббссбсбдбд 1920
бабббаадад сбсббббдсс адбдадссса дбасасадад адаааддсба аадббсбсбд 1980
даддабдбдд сбдсададсс бдсбдсбсбб дддсасбдбд дссбдсадса бсбсбдсасс 2040
сдсссдсбсд сссадсссса дсасдсадсс сбдддадсаб дбдаабдсса бссаддаддс 2100
ссддсдбсбс сбдаассбда дбададасас бдсбдсбдад абддбаадбд ададаабдбд 2160
ддссбдбдсс баддссассс адсбддсссс бдасбддсса сдссбдбсад сббдабааса 2220
бдасаббббс сббббсбаса даабдаааса дбадаадбса бсбсадаааб дбббдассбс 2280
саддбаадаб дсббсбсбсб дасабадсбб бссадаадсс ссбдсссбдд ддбддаддбд 2340
дддасбссаб бббадабддс ассасасадд дббдбссасб ббсбсбссад бсадсбддсб 2400
дсаддаддад ддддАадсаа сбдддбдсбс аададдсбдс бддссдбдсс ссбабддсад 2460
бсасабдадс бссбббабса дсбдадсддс сабдддсада ссбадсаббс аабддссадд 2520
адбсассадд ддасаддбдд бааадбдддд дбсасббсаб дадасаддад сбдбдддббб 2580
ддддсдсбса сбдбдссссд адассаадбс сбдббдадас адбдсбдасб асадададдс 2640
асададдддб ббсаддааса асссббдссс асссадсадд бссаддбдад дссссасссс 2700
ссбсбсссбд аабдабдддд бдададбсас сбссббсссб ааддсбдддс бссбсбссад 2760
дбдссдсбда дддбддссбд ддсддддсад бдадаадддс аддббсдбдс сбдссабдда 2820
садддсаддд бсбабдасбд дасссадссб дбдссссбсс саадсссбас бссбдддддс 2880
бдддддсадс адсааааадд адбддбддад адббсббдба ссасбдбддд сасббддсса 2940
сбдсбсассд асдаасдаса ббббссасад дадссдассб дссбасадас ссдссбддад 3000
сбдбасаадс адддссбдсд дддсадссбс ассаадсбса адддссссбб дассабдабд 3060
дссадссасб асаадсадса сбдсссбсса ассссддбда дбдссбасдд садддссбсс 3120
адсаддаабд бсббаабсба дддддбдддд бсдасабддд дададабсба бддсбдбддс 3180
- 24 030337
кдкксаддас сссадддддк ккскдкдсса асадккакдк аакдаккадс сскссадада 3240
ддаддсадас адсссакккс аксссаадда дксададсса сададсдскд аадсссасад 3300
кдскссссад саддадскдс ксскаксскд дксаккаккд ксаккакддк каакдаддкс 3360
ададдкдадд дсааасссаа ддааасккдд ддсскдссса аддсссадад даадкдссса 3420
ддсссаадкд ссассккскд дсаддасккк сскскддссс сасакддддк дсккдааккд 3480
сададдакса аддаадддад дскасккдда акддасаадд ассксаддса сксскксскд 3540
сдддааддда дсааадкккд кддссккдас кссасксскк скдддкдссс ададасдасс 3600
ксадсссадс кдссскдскс кдссскддда ссаааааддс аддсдкккда скдсссадаа 3660
ддссаасскс аддскддсас ккаадксадд сссккдаскс кддскдссас кддсададск 3720
акдсасксск кддддаасас дкдддкддса дсадсдксас скдасссадд ксадкдддкд 3780
кдксскддад кдддссксск ддсскскдад ккскаададд садкададаа асакдскддк 3840
дскксскксс сссасдккас ссасккдсск ддасксаадк дккккккакк кккскккккк 3900
каааддааас кксскдкдса асссадакка ксасскккда аадккксааа дадаасскда 3960
аддаскккск дсккдксакс ссскккдаск дскдддадсс адкссаддад кдадассддс 4020
садакдаддс кддссаадсс ддддадскдс ксксксакда аасаададск адааасксад 4080
дакддксакс ккддадддас сааддддкдд дссасадсса кддкдддадк ддсскддасс 4140
кдссскдддс сасаскдасс скдакасадд сакддсадаа даакдддаак аккккакаск 4200
дасадааакс адкаакаккк акакакккак акккккаааа какккаккка кккакккакк 4260
каадкксака ккссакаккк акксаадакд ккккассдка акааккакка ккааааакак 4320
дсккскаскк дкссадкдкк скадкккдкк кккаассакд адсааакдсс адкддкдсск 4380
дсскксссак даддсадддд адддаддааа сддддаддкд дададддддс дддддссксс 4440
саддсдккдд дсаскаксса адддссааса скдксададс ададдддадд кдададссдд 4500
дсакаддкдс ддааккскдс асасскддас дддскксссд ддакдсксса дддсксссас 4560
сссададаак ддсксксаад кксасскдда адкссаадкд ассадсссад ддааскскка 4620
ксссададаа дддсассасс скксскдддд аддсскдддд дккддскддк саскддскда 4680
асаддсссас кскддсакса ддсаааасас скдссскдка даддссккдд сссскдкдсс 4740
ссасдссскд ссссксасас кскдадаккк аассаккссд ааадкаааса дсаааакада 4800
скааскдккс аддддаааад ааассааасс асаддддкса садкдсадсд какккассаа 4860
асккдсссса ааакдддкда ксккаакскс кдададксад аакдкааддк сакаакккдк 4920
кддкасакдд скдкадкдсс дсакдкккск дааккддккк ккакккккас акдааакккк 4980
даакскаакс аддсаскккс ссскааааск сакддсскдс аддскааааа сааадкаддс 5040
- 25 030337
сбссбссббс бссббасббб дасадсбддд сбсааддссб бдббссбдаа ссбдббсссб 5100
сабсбсссбс саддасбабд аддаадбдда бдбдссссаа дбсббаддсд ддсадсаддд 5160
ссадсббсбс сббдасаддб дддссбаадд аадсбддсбб дбддсадсбб бадссссбдс 5220
сбддсасбдб сбдсадбсаб дсдсссасса ссссбсббдс ббссбсбасб бсадбсадса 5280
ссбдсадаса дсдссаддсс бддссадада сссасбссаб дсбсабдсад ааадассдбд 5340
асббсаддбд бдаббасааа баадаадбса дддбдаасдс бсаддабдаа дссбдадбдб 5400
садсасаддс аадаабссаб даадбдбдсб дбддббдббд аааабдсабд аааабсасаб 5460
сббдсссадс дабааддбсс бсбсбдбсбб ссдсдбаадс садбдабдас бдабаададд 5520
бббадсаббб ссббадссбс асабабабад дбассссбсб ссасадаааб дсбдссаадс 5580
ссадддсбсд дассадсббд дадбсассбб саадбаабас сабдсассбд басдбдсбсс 5640
бддсбсабдб дсбсбддддд бсадааадсс аббсббссса абдааадбад ссасдабабс 5700
бссссасдаа аадбасасад садбсбдбдс бдасаббсад ааадаасбсб сддсбдасаа 5760
баасасасас аадабаадбс бдддбсбсса бсааасдбба ббббдсбсбб адбдссссбб 5820
бдбдсбссбд ассаабббсб сбддсббссд дддбсссббс аабаддсссс адаааассад 5880
бдаддбаада аасадсбдсс ссдддассбб бсабассаса бббдаасадд дадададада 5940
бсбсассадб садбдсссад ддаададаба асаасааддд абадбддадб да 5992
<210> 4
<211> 839
<212> белок <213> Ното зар1епз
<400> 4
Меб 1 Меб Зег А1а Зег 5 Агд Ьеи А1а О1у ТЪг 10 Ьеи 11е Рго А1а Меб 15 А1а
РЪе Ьеи Зег Суз Уа1 Агд Рго О1и Зег Тгр О1и Рго Суз Уа1 О1и Уа1
20 25 30
Уа1 Рго Азп 11е ТЪг Туг С1п Суз Меб О1и Ьеи Азп РЪе Туг Ьуз 11е
35 40 45
Рго Азр Азп Ьеи Рго РЪе Зег ТЪг Ьуз Азп Ьеи Азр Ьеи Зег РЪе Азп
50 55 60
Рго Ьеи Агд Н1з Ьеи С1у Зег Туг Зег РЪе РЪе Зег РЪе Рго О1и Ьеи
65 70 75 80
О1п Уа1 Ьеи Азр Ьеи Зег Агд Суз О1и 11е О1п ТЪг 11е О1и Азр О1у
85 90 95
- 26 030337
А1а Туг О1п Зег 100 Ьеи Зег Н1з Ьеи Зег 105 ТЪг Ьеи 11е Ьеи ТЪг 110 О1у Азп
Рго 11е О1п Зег Ьеи А1а Ьеи О1у А1а РЪе Зег О1у Ьеи Зег Зег Ьеи
115 120 125
О1п Ьуз Ьеи Уа1 А1а Уа1 О1и ТЪг Азп Ьеи А1а Зег Ьеи О1и Азп РЪе
130 135 140
Рго 11е О1у Н1з Ьеи Ьуз ТЪг Ьеи Ьуз О1и Ьеи Азп Уа1 А1а Н1з Азп
145 150 155 160
Ьеи 11е О1п Зег РЪе Ьуз Ьеи Рго О1и Туг РЪе Зег Азп Ьеи ТЪг Азп
165 170 175
Ьеи О1и Н1з Ьеи Азр Ьеи Зег Зег Азп Ьуз 11е О1п Зег 11е Туг Суз
180 185 190
ТЪг Азр Ьеи Агд Уа1 Ьеи Н1з О1п МеЬ Рго Ьеи Ьеи Азп Ьеи Зег Ьеи
195 200 205
Азр Ьеи Зег Ьеи Азп Рго МеЬ Азп РЪе 11е О1п Рго О1у А1а РЪе Ьуз
210 215 220
О1и 11е Агд Ьеи Н1з Ьуз Ьеи ТЪг Ьеи Агд Азп Азп РЪе Азр Зег Ьеи
225 230 235 240
Азп Уа1 МеЬ Ьуз ТЪг Суз 11е О1п О1у Ьеи А1а О1у Ьеи О1и Уа1 Н1з
245 250 255
Агд Ьеи Уа1 Ьеи С1у О1и РЪе Агд Азп О1и О1у Азп Ьеи О1и Ьуз РЪе
260 265 270
Азр Ьуз Зег А1а Ьеи О1и О1у Ьеи Суз Азп Ьеи ТЪг 11е О1и О1и РЪе
275 280 285
Агд Ьеи А1а Туг Ьеи Азр Туг Туг Ьеи Азр Азр 11е 11е Азр Ьеи РЪе
290 295 300
Азп Суз Ьеи ТЪг Азп Уа1 Зег Зег РЪе Зег Ьеи Уа1 Зег Уа1 ТЪг 11е
305 310 315 320
О1и Агд Уа1 Ьуз Азр РЪе Зег Туг Азп РЪе О1у Тгр О1п Н1з Ьеи О1и
325 330 335
Ьеи Уа1 Азп Суз Ьуз РЪе О1у О1п РЪе Рго ТЪг Ьеи Ьуз Ьеи Ьуз Зег
340 345 350
- 27 030337
Ьеи Ьуз Агд 355 Ьеи ТЪг РЪе ТЪг Зег 360 Азп Ьуз О1у О1у Азп 365 А1а РЪе Зег
О1и Уа1 Азр Ьеи Рго Зег Ьеи О1и РЪе Ьеи Азр Ьеи Зег Агд Азп О1у
370 375 380
Ьеи Зег РЪе Ьуз О1у Суз Суз Зег О1п Зег Азр РЪе О1у ТЪг ТЪг Зег
385 390 395 400
Ьеи Ьуз Туг Ьеи Азр Ьеи Зег РЪе Азп О1у Уа1 11е ТЪг МеЬ Зег Зег
405 410 415
Азп РЪе Ьеи О1у Ьеи О1и О1п Ьеи О1и Н1з Ьеи Азр РЪе О1п Н1з Зег
420 425 430
Азп Ьеи Ьуз О1п МеЬ Зег О1и РЪе Зег Уа1 РЪе Ьеи Зег Ьеи Агд Азп
435 440 445
Ьеи 11е Туг Ьеи Азр 11е Зег Н1з ТЪг Н1з ТЪг Агд Уа1 А1а РЪе Азп
450 455 460
О1у 11е РЪе Азп О1у Ьеи Зег Зег Ьеи О1и Уа1 Ьеи Ьуз МеЬ А1а О1у
465 470 475 480
Азп Зег РЪе О1п О1и Азп РЪе Ьеи Рго Азр 11е РЪе ТЪг О1и Ьеи Агд
485 490 495
Азп Ьеи ТЪг РЪе Ьеи Азр Ьеи Зег О1п Суз О1п Ьеи О1и О1п Ьеи Зег
500 505 510
Рго ТЪг А1а РЪе Азп Зег Ьеи Зег Зег Ьеи О1п Уа1 Ьеи Азп МеЬ Зег
515 520 525
Ηΐ3 Азп Азп РЪе РЪе Зег Ьеи Азр ТЪг РЪе Рго Туг Ьуз Суз Ьеи Азп
530 535 540
Зег Ьеи О1п Уа1 Ьеи Азр Туг Зег Ьеи Азп Н1з 11е МеЬ ТЪг Зег Ьуз
545 550 555 560
Ьуз О1п О1и Ьеи О1п Н1з РЪе Рго Зег Зег Ьеи А1а РЪе Ьеи Азп Ьеи
565 570 575
ТЪг О1п Азп Азр РЪе А1а Суз ТЪг Суз О1и Н1з О1п Зег РЪе Ьеи О1п
580 585 590
Тгр 11е Ьуз Азр О1п Агд О1п Ьеи Ьеи Уа1 О1и Уа1 О1и Агд МеЬ О1и
595 600 605
- 28 030337
Суз А1а 610 ТЬг Рго Зег Азр Ьуз 615 О1п О1у МеЬ Рго Уа1 620 Ьеи Зег Ьеи Азп
11е ТЬг Суз О1п МеЬ Азп Ьуз ТЬг 11е 11е О1у Уа1 Зег Уа1 Ьеи Зег
625 630 635 640
ναι Ьеи Уа1 Уа1 Зег Уа1 Уа1 А1а Уа1 Ьеи Уа1 Туг Ьуз РЬе Туг РЬе
645 650 655
Ηΐ3 Ьеи МеЬ Ьеи Ьеи А1а С1у Суз 11е Ьуз Туг О1у Агд О1у О1и Азп
660 665 670
11е Туг Азр А1а РЬе Уа1 11е Туг Зег Зег О1п Азр О1и Азр Тгр Уа1
675 680 685
Агд Азп О1и Ьеи Уа1 Ьуз Азп Ьеи О1и О1и О1у Уа1 Рго Рго РЬе О1п
690 695 700
Ьеи Суз Ьеи Н1з Туг Агд Азр РЬе 11е Рго О1у Уа1 А1а 11е А1а А1а
705 710 715 720
Азп 11е 11е Н1з О1и С1у РЬе Н1з Ьуз Зег Агд Ьуз Уа1 11е Уа1 Уа1
725 730 735
ναι Зег О1п Н1з РЬе 11е О1п Зег Агд Тгр Суз 11е РЬе О1и Туг О1и
740 745 750
Не А1а О1п ТЬг Тгр О1п РЬе Ьеи Зег Зег Агд А1а О1у 11е 11е РЬе
755 760 765
11е Уа1 Ьеи О1п Ьуз Уа1 О1и Ьуз ТЬг Ьеи Ьеи Агд О1п О1п Уа1 О1и
770 775 780
Ьеи Туг Агд Ьеи Ьеи Зег Агд Азп ТЬг Туг Ьеи О1и Тгр О1и Азр Зег
785 790 795 800
ναι Ьеи О1у Агд Н1з 11е РЬе Тгр Агд Агд Ьеи Агд Ьуз А1а Ьеи Ьеи
805 810 815
Азр О1у Ьуз Зег Тгр Азп Рго О1и О1у ТЬг Уа1 О1у ТЬг О1у Суз Азп
820 825 830
Тгр О1п О1и А1а ТЬг Зег 11е
835
- 29 030337

Claims (34)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Композиция для индукции иммунного ответа на антигены неопластических клеток, включающая одну или несколько некомпетентных по пролиферации генетически модифицированных неопластических клеток, содержащих по меньшей мере один экзогенный агонист То11-подобного рецептора (ТЬИ) и экспрессирующих рекомбинантный иммуностимулирующий цитокин, представляющий собой гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Р).
  2. 2. Иммуногенная композиция по п.1, где клетка содержит сравнимые количества агониста ТЬК и СМ-С8Р.
  3. 3. Иммуногенная композиция по п.1, где агонист ТЬК представляет собой агонист ТЬК4, ТЬК5, ΊΈΚ6, ТЬК7/8 или ТЬК9.
  4. 4. Иммуногенная композиция по п.1, где клетка содержит агонист ТЬК4 и агонист ТЬК7/8.
  5. 5. Иммуногенная композиция по п.4, где агонист ТЬК4 представляет собой ЬР8, фрагмент ЬР8 или синтетический аналог гликопиранозил-липида А и агонист ТЬК7/8 представляет собой К848.
  6. 6. Иммуногенная композиция по п.1, где некомпетентность клеток по пролиферации вызвана облучением.
  7. 7. Иммуногенная композиция по п.1, где неопластическая клетка является клеткой опухоли, выбранной из лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, рака предстательной железы, опухоли головы и шеи, плоскоклеточной карциномы, злокачественной опухоли языка, злокачественной опухоли гортани, злокачественной опухоли миндалин, злокачественной опухоли гортаноглотки, злокачественной опухоли носоглотки, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака легкого, меланомы, рака поджелудочной железы, глиобластомы и злокачественной опухоли мозга.
  8. 8. Иммуногенная композиция по п.1, где содержание агониста ТЬК4 составляет от 1 до 10 нг на 1х105 клеток.
  9. 9. Иммуногенная композиция по п.1, где содержание агониста ТЬК составляет приблизительно 3-5 нг на 5х105 клеток.
  10. 10. Иммуногенная композиция по п.1, где клетка содержит агонист ТЬК в ассоциации с липофектамином или липосомальными векторами.
  11. 11. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-10, где клетки являются аутологичными или аллогенными.
  12. 12. Вакцина для облегчения течения неоплазии у индивида, содержащая в фармацевтически приемлемом наполнителе эффективное количество некомпетентных по пролиферации генетически модифицированных неопластических клеток, содержащих по меньшей мере один экзогенный агонист То11подобного рецептора (ТЬК) и экспрессирующих рекомбинантный иммуностимулирующий цитокин, представляющий собой СМ-С8Р.
  13. 13. Вакцина по п.12, где клетки содержат агонист ТЬК4 и агонист ТЬК7/8.
  14. 14. Вакцина по п.13, где агонист ТЬК4 представляет собой ЬР8, фрагмент ЬР8 или синтетический аналог глюкопиранозил-липида А и агонист ТЬК7/8 представляет собой К848.
  15. 15. Вакцина по любому из пп.10-14, где клетки являются аутологичными или аллогенными.
  16. 16. Способ индукции специфичного иммунного ответа на антигены неопластических клеток у индивида, страдающего неоплазией или имеющего предрасположенность к развитию неоплазии, включающий введение индивиду эффективного количества иммуногенной композиции по любому из пп.1-11.
  17. 17. Способ лечения или профилактики неоплазии у индивида, страдающего неоплазией или имеющего предрасположенность к развитию неоплазии, включающий введение индивиду иммуногенной композиции или вакцины по любому из пп.1-15 в количестве, достаточном для индукции у указанного индивида специфичного иммунного ответа на антигены неопластической клетки.
  18. 18. Способ лечения или профилактики прогрессирования или метастазирования опухоли у индивида, страдающего неоплазией, включающий введение индивиду эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины по любому из пп.1-15.
  19. 19. Способ лечения развившейся опухоли или профилактики образования опухоли у индивида, включающий введение индивиду эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины по любому из пп.1-15.
  20. 20. Способ лечения микрометастазирования или остаточного опухолевого заболевания у индивида, которое может вызвать рецидив неоплазии, включающий введение индивиду эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины по любому из пп.1-15.
  21. 21. Способ индукции иммунного ответа на антигены неопластических клеток, включающий введение индивиду иммуногенной композиции или вакцины по любому из пп.1-15.
  22. 22. Способ по п.18-20, где опухоль выбрана из лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, рака предстательной железы, опухоли головы и шеи, плоскоклеточной карциномы, злокачественной опухоли языка, злокачественной опухоли гортани, злокачественной опухоли миндалин, злокачественной опухоли гортаноглотки, злокачественной опухоли носоглотки, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака легкого, меланомы, рака поджелудочной железы, глиобластомы и злокачественной опухоли мозга.
    - 30 030337
  23. 23. Способ по любому из пп.18-20, где иммуногенную композицию вводят системно или местно.
  24. 24. Способ по п.23, где иммуногенную композицию вводят внутримышечной инъекцией, внутривенной инъекцией, внутриопухолевой инъекцией или перитуморальной инъекцией.
  25. 25. Способ по п.23 или 24, дополнительно включающий введение индивиду эффективного количества одного или нескольких химиотерапевтических средств.
  26. 26. Способ по п.25, где одно или несколько химиотерапевтических средств выбраны из ацетата абиратерона, алтретамина, ангидровинбластина, ауристатина, бексаротена, бикалутамида, ВМ8184476, 2,3,4,5,6-пентафтор-Ы-(3-фтор-4-метоксифенил)бензолсульфонамида, блеомицина, Ν,Ν-диметил-Ьвалил-Е-валил-К-метил-Е-валил-Е-пролил-Е-пролин-т-бутиламида, кахектина, цемадотина, хлорамбуцила, циклофосфамида, 3',4'-дидегидро-4'-дезокси-8'-норвин-калейкобластина, доцетаксола, доксетаксела, циклофосфамида, карбоплатина, кармустина (ВСКИ), цисплатина, криптофицина, циклофосфамида, цитарабина, декарбазина (ЭТ1С), дактиномицина, даунорубицина, децитабина, доластатина, доксорубицина (адриамицина), этопозида, 5-фторурацила, финастерида, флутамида, гидроксимочевины и гидроксимочевинатаксанов, ифосфамида, лиарозола, лонидамина, ломустина (ССКИ), МОУ3100, мехлорэтамина (азотистого иприта), мелфалана, изетионата мивобулина, ризоксина, сертенефа, стрептозоцина, митомицина, метотрексата, таксанов, нилутамида, онапристона, паклитаксела, преднемустина, прокарбазина, КРК109881, фосфата страмустина, тамоксифена, тасонермина, таксола, третиноина, винбластина, винкристина, сульфата виндезина и винфлюнина.
  27. 27. Некомпетентная по пролиферации генетически модифицированная неопластическая клетка, содержащая вектор экспрессии, кодирующий ОМ-С8Р, и по меньшей мере один агонист ТЕК.
  28. 28. Неопластическая клетка по п.27, полученная из опухоли, выбранной из лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, рака предстательной железы, опухоли головы и шеи, плоскоклеточной карциномы, злокачественной опухоли языка, злокачественной опухоли гортани, злокачественной опухоли миндалин, злокачественной опухоли гортаноглотки, злокачественной опухоли носоглотки, рака молочной железы, рака толстого кишечника, рака легкого, меланомы, рака поджелудочной железы, глиобластомы и злокачественной опухоли мозга или из линий клеток указанных опухолей.
  29. 29. Неопластическая клетка по п.27, содержащая агонист ТЕК4 и агонист ТЕК7/8.
  30. 30. Неопластическая клетка по п.27, содержащая агонист ТЕК в ассоциации с липосомальным вектором.
  31. 31. Фармацевтическая композиция для лечения неоплазии, содержащая эффективное количество иммуногенной композиции по любому из пп.1-11 и фармацевтически приемлемый наполнитель.
  32. 32. Набор для лечения неоплазии, содержащий эффективное количество иммуногенной композиции или вакцины по любому из пп.1-15 и инструкции для применения набора в способе по любому из пп.2026.
  33. 33. Способ лечения или профилактики рака шейки матки у индивида, включающий введение индивиду эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины по любому из пп.1-15.
  34. 34. Способ лечения полиморфных дефицитов ТЕК у индивида, включающий введение индивиду эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины по любому из пп.1-15.
    1 час инкубации 6 час инкубации
    10 мкг/мл Ι.Ρ3 25 мкг/мл ЬР5 50 мкг/мл ЬР5 25 мкг/мл Ι.Ρ5
    -►
    1.Ρ5-ΒΟΟΙΡΥ
EA201291117A 2010-04-27 2011-04-27 Генетически модифицированные неопластические клетки, содержащие агонист tlr и экспрессирующие gm-csf, и их применение против неоплазии EA030337B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32847110P 2010-04-27 2010-04-27
PCT/US2011/034139 WO2011139769A2 (en) 2010-04-27 2011-04-27 Immunogenic compositions and methods for treating neoplasia

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201291117A1 EA201291117A1 (ru) 2013-04-30
EA030337B1 true EA030337B1 (ru) 2018-07-31

Family

ID=44861853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201291117A EA030337B1 (ru) 2010-04-27 2011-04-27 Генетически модифицированные неопластические клетки, содержащие агонист tlr и экспрессирующие gm-csf, и их применение против неоплазии

Country Status (11)

Country Link
US (2) US9248170B2 (ru)
EP (1) EP2563384B1 (ru)
JP (2) JP6042802B2 (ru)
KR (1) KR20130122902A (ru)
CN (1) CN103118697A (ru)
AU (1) AU2011248583B2 (ru)
BR (2) BR112012027745A2 (ru)
CA (2) CA2798074A1 (ru)
EA (1) EA030337B1 (ru)
NZ (1) NZ603786A (ru)
WO (2) WO2011136828A1 (ru)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6042802B2 (ja) * 2010-04-27 2016-12-14 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ 新生物（腫瘍）を治療するための免疫原性組成物及び方法。
CA2849259A1 (en) * 2011-09-19 2013-03-28 The Johns Hopkins University Cancer immunotherapy
KR20140103122A (ko) * 2011-11-17 2014-08-25 넨키 인스티튜트 오브 익스페리멘탈 바이올로지 신경교종을 치료하기 위한 조성물 및 방법
DK2785349T4 (da) * 2011-11-30 2023-01-09 Astrazeneca Ab Kombinationsbehandling af cancer
AU2013271375B2 (en) 2012-06-08 2018-03-22 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for cancer immunotherapy
MX361680B (es) 2012-12-13 2018-12-13 Aduro Biotech Inc Composiciones que comprenden dinucleótidos de purina cíclicos que tienen estereoquímicas definidas y métodos para su preparación y uso.
ES2982836T3 (es) 2013-04-29 2024-10-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Composiciones y métodos para alterar la señalización de segundos mensajeros
ES2822584T3 (es) 2013-05-03 2021-05-04 Univ California Inducción de dinucleótidos cíclicos del interferón tipo I
AU2014268836B2 (en) 2013-05-18 2018-08-02 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene"-dependent signalling
US9549944B2 (en) 2013-05-18 2017-01-24 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for inhibiting “stimulator of interferon gene”—dependent signalling
US9463198B2 (en) * 2013-06-04 2016-10-11 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for reducing or preventing metastasis
CA2919268C (en) 2013-07-25 2023-09-05 Exicure, Inc. Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use
WO2015017652A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Sting crystals and modulators
US9149521B2 (en) 2013-09-25 2015-10-06 Sequoia Sciences, Inc. Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
US9504743B2 (en) 2013-09-25 2016-11-29 Sequoia Sciences, Inc Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
US9149522B2 (en) 2013-09-25 2015-10-06 Sequoia Sciences, Inc. Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
US9017698B2 (en) 2013-09-25 2015-04-28 Sequoia Sciences, Inc. Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
KR102290205B1 (ko) 2014-06-04 2021-08-20 엑시큐어, 인크. 예방 또는 치료 용도를 위한 리포솜성 구형 핵산에 의한 면역 조절인자의 다가 전달
JP2018501322A (ja) 2015-01-12 2018-01-18 チルドレンズ メディカル センター コーポレーション トール様受容体４アンタゴニストの炎症促進性およびアジュバント機能
EP4019040A1 (en) * 2015-01-21 2022-06-29 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Use of trl agonist and anti-cd47 agent to enhance phagocytosis of cancer cells
EP3280448B1 (en) 2015-04-10 2020-12-30 Capsugel Belgium NV Abiraterone acetate lipid formulations
EP3316874A4 (en) * 2015-06-30 2019-03-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania TOPICAL AND INJECTABLE REYQUIMOD COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF NEOPLASTIC SKIN DISEASES
AU2016366680B2 (en) 2015-12-09 2021-06-24 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Benzothiophene-based selective estrogen receptor downregulators
US11697851B2 (en) 2016-05-24 2023-07-11 The Regents Of The University Of California Early ovarian cancer detection diagnostic test based on mRNA isoforms
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
WO2018081168A2 (en) 2016-10-24 2018-05-03 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Benzothiophene-based selective mixed estrogen receptor downregulators
JP7229162B2 (ja) 2017-01-06 2023-02-27 ジー１ セラピューティクス， インコーポレイテッド 癌の治療に対する併用療法
FR3072880A1 (fr) * 2017-10-30 2019-05-03 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Formulation liposomale et son utilisation en therapie anti-tumorale
BR112021015577A8 (pt) * 2019-02-08 2021-10-05 Research & Business Found Sungkyunkwan Univ Complexo-colesterol agonista do receptor toll-like 7/8, composição de nanopartícula, composição adjuvante, composição de vacina, composição para regular uma função imunológica, composição farmacêutica e uso do complexo
JP2022525608A (ja) * 2019-03-14 2022-05-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ワクチンアジュバントとしてのｔｌｒ４およびｔｌｒ７リガンド製剤
CN111773381A (zh) * 2020-07-06 2020-10-16 贵阳市第二人民医院 一种靶向tem-1基因疫苗及其构建与应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637483A (en) * 1991-10-04 1997-06-10 Whitehead Institute For Biomedical Research Irradiated tumor cell vaccine engineered to express GM-CSF
US5904920A (en) 1991-10-04 1999-05-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Regulation of systemic immune responses utilizing cytokines and antigens
US6033674A (en) 1995-12-28 2000-03-07 Johns Hopkins University School Of Medicine Method of treating cancer with a tumor cell line having modified cytokine expression
US6277368B1 (en) 1996-07-25 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Cancer immunotherapy using autologous tumor cells combined with cells expressing a membrane cytokine
AU741602B2 (en) 1998-02-02 2001-12-06 Johns Hopkins University School Of Medicine, The A universal immunomodulatory cytokine-expressing bystander cell line and related compositions and methods of manufacture and use
AU5458500A (en) 1999-06-02 2000-12-18 Cell Genesys, Inc. Regulation of systemic immune responses utilizing cytokines and antigens
US20030044393A1 (en) * 2001-07-06 2003-03-06 Annie-Chen Tran Method for increasing tumor cell immunogenicity using heat shock protein
US20040197312A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-07 Marina Moskalenko Cytokine-expressing cellular vaccine combinations
US20050013812A1 (en) * 2003-07-14 2005-01-20 Dow Steven W. Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes
GB0321615D0 (en) * 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
US20060057127A1 (en) 2004-09-10 2006-03-16 Pocheng Liu Cytokine-expressing cellular vaccines for treatment of prostate cancer
KR101205064B1 (ko) * 2005-04-26 2012-11-27 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 암 면역요법을 위한 조성물과 방법
EP1979488A4 (en) * 2006-01-09 2009-05-27 Univ California IMMUNOSTIMULATORY COMBINATIONS OF TNFRSF, TLR, NLR, RHR, PURINERGIC RECEPTOR AND CYTOKINE RECEPTOR AGONISTS USED FOR VACCINES AND ANTI-TUMOR IMMUNOTHERAPY
ES2657392T3 (es) 2006-09-26 2018-03-05 Infectious Disease Research Institute Composición de vacuna que contiene un adyuvante sintético
US8840881B2 (en) * 2008-08-28 2014-09-23 Aduro Gvax Inc. Methods and compositions for treating prostate cancer or inducing a humoral immune response against prostate cancer
CN102597222B (zh) 2009-10-27 2015-07-15 因缪尼卡姆股份公司 用于增殖抗原特异性t细胞的方法
JP6042802B2 (ja) * 2010-04-27 2016-12-14 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ 新生物（腫瘍）を治療するための免疫原性組成物及び方法。
CA2849259A1 (en) * 2011-09-19 2013-03-28 The Johns Hopkins University Cancer immunotherapy

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DECKER, W.K., Bioimmunoadjuvants for the treatment of neoplastic and infectious disease: Coley's legacy revisited, Cytokine Growth Factor Rev, Epub 04 August 2009, Vol. 20, No. 4, p. 271-281, see abstract and p. 277-278 (Epub 7-8) *
FUKUZONO, S. et al., Granulocyte colony-stimulating factor negatively regulates Toll-like receptor agonist-induced cytokine production in human neutrophils, Arch Biochem Biophys, Epub 12 January 2010, Vol. 495, No. 2, p. 144-151, see the whole document *
JINUSHI, M. et al., MFG-E8 mediated uptake of apoptotic cells by APCs links the pro- and antiinflammatory activities of GM-CSF, J. Clin. Invest., 2007, Vol. 117, No. 7, pages 1902-1913, see abstract, fig. 7, 9 and p. 1907, 1910-1911. *
SCHAEFER, T.M. et al., Toll-like receptor (TLR) expression and TLR-mediated cytokine/chemokine production by human uterine epithelial cells, Immunology, 2004, Vol. 112, No. 3, p. 428-436, see abstsract *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2563384A4 (en) 2014-03-12
US20160193313A1 (en) 2016-07-07
JP6042802B2 (ja) 2016-12-14
NZ603786A (en) 2015-07-31
US20130177625A1 (en) 2013-07-11
EP2563384A2 (en) 2013-03-06
AU2011248583B2 (en) 2017-01-19
KR20130122902A (ko) 2013-11-11
WO2011136828A1 (en) 2011-11-03
US9248170B2 (en) 2016-02-02
EP2563384B1 (en) 2018-04-25
BR112012027747A2 (pt) 2017-01-10
WO2011139769A3 (en) 2012-04-05
EA201291117A1 (ru) 2013-04-30
BR112012027745A2 (pt) 2017-01-10
JP2013525450A (ja) 2013-06-20
AU2011248583A1 (en) 2012-12-13
CA2798074A1 (en) 2011-11-03
JP6095227B2 (ja) 2017-03-15
JP2013529192A (ja) 2013-07-18
WO2011139769A2 (en) 2011-11-10
CA2797842A1 (en) 2011-11-10
CN103118697A (zh) 2013-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA030337B1 (ru) Генетически модифицированные неопластические клетки, содержащие агонист tlr и экспрессирующие gm-csf, и их применение против неоплазии
JP5239041B2 (ja) 癌の治療剤
ES2780176T3 (es) Inmunoterapia mediante la utilización de células capaces de co-expresar un antígeno diana y CD1d y pulsadas con un ligando de CD1d
CN110520438A (zh) 溶瘤病毒疗法
US20150086639A1 (en) Tumor vaccine and method for producing the same
US20130177595A1 (en) Nano-vehicle derived from tumor tissue, and cancer vaccine using same
EA018457B1 (ru) Композиция опухолеассоциированных пептидов и относящаяся к ним противораковая вакцина
EP2364163B1 (en) Composition comprising in vitro expanded t-lymphocytes and vessel formation inhibitors suitable in the treatment of cancer
JP2021038225A (ja) ネコ用がんワクチン
ES2397854T3 (es) Inmunoterapia para pacientes con inmunosupresión
JP2015520129A (ja) 多価乳がんワクチン
Liu et al. Synthetic MUC1 breast cancer vaccine containing a Toll‑like receptor 7 agonist exerts antitumor effects
EA015510B1 (ru) Способ увеличения количества мононуклеарных клеток у субъекта, страдающего раком, и используемая для этого фармацевтическая комбинация
US20200237904A1 (en) Methods and Compositions Useful for Treating Cancer
CA3043687A1 (en) Pharmaceutical composition for use in the treatment of cancer
KR20090047289A (ko) 엑소좀 및 이를 함유한 암 백신 조성물
JP2006509830A (ja) 癌予防用ハイブリッド細胞ワクチンの調製および投与
US20230181633A1 (en) Methods of treating cancer using a combination of tumor membrane vesicles and metformin
Triozzi et al. Antitumor activity of the intratumoral injection of fowlpox vectors expressing a triad of costimulatory molecules and granulocyte/macrophage colony stimulating factor in mesothelioma
WO2024094043A1 (zh) 一种改造的外泌体制剂、其制备方法及应用
Fan et al. Lipopolyplex-formulated mRNA cancer vaccine elicits strong neoantigen-specific T cell responses and antitumor activity
KR100522526B1 (ko) 면역 치료용 수지상 세포의 제조방법
KR100530576B1 (ko) 수지상세포를 이용한 암 면역 치료방법
Verbekea et al. Messenger RNA vaccination with α-galactosylceramide induces antitumor immunity by boosting cytotoxic and natural killer T cells
TW201707715A (zh) 用於治療ｈｅｒ－２陽性癌症之組合免疫療法及放射線療法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU